无缝克隆,同源重组克隆.doc

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1、1.1.1Gibsonassembly简介（INTRODUCTION）原理：Gibsonassembly是一种onestep,onepot的快速基因组装方法。它只需要将基因片段和需要的三种酶混合在同一个管内在50°C下培养15-60min就可以得到组装好的DNA。装配原理基于DNA片段间的重叠区域，过程依赖于三种酶：DNA外切酶（T5exonuclease）,高保真DNA聚合酶。（Phusionpolymerase）和耐热DNA连接酶（TaqDNAligase）的共同作用。首先，T5核酸外切酶消化DNA片段的链方向是从5’到3’.每个DNA片段

2、分别形成一个单链的突出部分，由于着这两个相邻的突出片段有一部分具有同源性能够互补，所以DNA片段退火，互补的序列重新配对连接。然后，在空缺的部分DNA聚合酶以另一条DNA单链为模板，沿3'方向将对应的脱氧核苷酸连接到单链上，填补缺口。最后，连接酶将两条DNA单链黏合起来，密封裂缝。这样具有重叠区域的DNA片段就组装成一整条DNA分子了。下面是组装的示意图。材料（MATERIALS）r试剂（REAGENTS）NAD，H2O，1MMgCl2，1MDTT，10mMdNTPmix，1MTris-HClpH7.5，50%PEG-8000，2.7mg/mL

3、Tagligase，0.85μg/mLT5_ExO，Phusion(1×)、LB培养基、抗生素（据载体而定）、LB平板（相应抗性）r实验前准备（SETUP）于冰水浴中配制如下反应体系。如果不慎将液体粘在管壁，可通过短暂离心使其沉入管底。4xisothermalassemblybufferNAD20mgH2O300μL1MMgCl2300μL1MDTT300μL10mMdNTPmix600μL1MTris-HClpH7.53mL50%PEG-80003mL加水到7.5mL，每管分500μL存于-20°C或-80°C冰箱,够3000个反应2×ass

4、emblymix:bestcombination:100reaction1mL2.7mg/mLTagligase10μL0.85μg/mLT5_ExO100μLPhusion(1×)25μL4×G.A.buffer500μL加水365μL，存于-20°C冰箱，有效期1年。实验步骤（PROCEDURE）1.设计引物通过PCR的方法在DNA片段的两端加上同源片段，NEB推荐同源片段的长度为15-40bp，同时要求这部分对应的退火温度高于4°C。2.进行DNA纯化：PCR产物进行琼脂糖电泳，胶回收。或者PCR产物回收试剂盒回收。3.进行重组反应，以2

5、0μL反应体系为例：组分加入量IsothermalassemblyMasterMix10μL线性化载体10-100ng(1-2μL)插入片段8-9μL(3-5×载体)SterilizedddH2O补足至20μL50°C反应15-60min4.反应产物转化、涂板及克隆鉴定同传统分子克隆方法。针对性建议1.在选择克隆位点时，应避免选择克隆位点上下游50bp内有重复序列的区域。当克隆位点上下游20bp区域内GC含量均在40%～60%范围之内时，重组效率将达到最大。如这部分区域GC含量高于70%或者低于30%，重组效率会受到较大影响。2.Gibson组

6、装克隆法缺点之一是适用与长度超过200bp的片段的组装；缺点之二是如果黏性末端形成稳定的二级结构，如发夹结构或者茎环结构，那么成功率会大受影响。