核酸纯度检测.doc

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1、最近重新研读了分子克隆第三版，有一个有趣的小发现，好像过去没听人说过。一般测核酸浓度都是用260nm的光吸收值来决定，同时用260/280的比值来判断有无蛋白质污染。理想的比值是1.8~2.0左右。分子克隆第三版专门提到这种判断核酸纯度的办法是不可靠的。原因在于蛋白质在260nm的消光系数比核酸小很多，即使有相当多的蛋白质污染，这个比值还是接近于理想的比值。另外，260/280比值尤其不能用于评判寡聚核甘酸的纯度，因为嘌呤的消光系数比嘧啶大好多，寡聚核甘酸嘌呤嘧啶组成很可能不平均，所以很可能出现很纯的样品260/280比值却比较小的情况。 你所说的‘

2、消光系数‘，是否就是吸光值的意思？如果你用连续波长测过核酸的吸光度时，就会发现，OD260,恰好是核酸吸光值最大的时候，从200-750,是一条曲线，260时是波峰，而280时，刚好是曲线下降到一半左右时的吸光值。而恰好280又是蛋白质的最佳吸收值。如果纯的核酸，那曲线就是标准的，260/280就是1.8-2.0之间，如果混有蛋白质，多肽，酚之类的杂质，那280时的吸收峰就变高了，曲线随之发生变形，而260时的吸收峰不变。就如你所说的“原因在 于蛋白质在260nm的消光系数比核酸小很多”，因此260的吸收峰几乎不变。但280时却不一样。这时相反，核酸

3、的消化系数比蛋白质小的多，因此，一旦有污染，280上升很快。因此260/280在有污染的情况下就会变小。所以，用260/280的方法，还是比较可靠的。当然更可靠的，就是用200-750的波长，连续扫描。直接观察核酸的整条曲线，那比光靠260,280两个吸收值，肯定要准确很多。其实平时在我们检测时，我们也会检测230,320,两个值。至于这两值的作用，我稍后再说。其实有230,260,280,320,这四个点。基本上也能确定下这条曲线的该一段的形状了。A260/A280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280nm。纯净的样品，比值大于1.8

4、（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品，A320一般是0。（320差不多也就是那条曲线刚下降到0的时候）。所以，当我们检测260/280后，如果比值在1.8-2.0之间时，我们可以说其纯度可以，那OD260的值就有效。否则，OD260的值判为无效。你说的嘌噙与嘧啶的吸光值，确实没错。但一般情况下，我们测的都是基因组、tRNA，mRNA、cD

5、NA，所以其CG含量都比较均匀。都适用于这种方法。然而，在测某些CG含量明显不均匀的情况下，比如人工合成的寡核苷酸、引物，在CG含量过大或者过小的情况下，我们就不能用260/280的方法了。不过一般自已合成的引物，都能保证纯度的，买来的引物，或者托公司合成的寡核苷酸，也不需要我们用OD值方法重新测一下。因为产品包装上写着多少个OD，序列长度，都非常详细，纯度也是有保证的。当OD260/OD280值=1.8说明所提的DNA质粒的纯度比较高，所含的RNA或蛋白质污染很少，当OD260/OD280值>1.8，说明有RNA污染，当OD260/OD280值<1

6、.8时,说明所提的DNA中有蛋白质或者是抽提时用的苯酚未除净，楼主所体的质粒DNA的260/280在2.0左右，说明有一定的RNA污染，在提质粒DNA中，一般是在提完质粒后，加入TE溶液时加入一定量的RNA酶。抽提1.5ml大肠杆菌过夜菌液时，最后加入20ul的TE溶液时加入1.5ul浓度为10mg/ml的RNA酶，一般就可以完全去除质粒中所含的RNA污染有关RNA的吸光度说明如下：260nm、320nm、230nm、280nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度)、盐浓度和蛋白质等有机物的吸光度值。OD260/OD280（R）体现了RNA中的

7、蛋白质等有机物的污染程度，质量较好的RNA的R值应在1.8～2.0之间，当R<1.8时，溶液中的蛋白质等有机物的污染比较明显；当R>2.2时，说明RNA已经被水解成了单核苷酸。在对核酸进行吸光度检测时，需要注意稀释液应使用TEBuffer。