脐带间充质干细胞对CIA大鼠炎症因子的干预课件.ppt

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2、验分为3组，建立Ⅱ型胶原诱导的类风湿性关节炎模型大鼠，脐带间充质干细胞组于造模后第4周经大鼠尾静脉注射脐带间充质干细胞，模型组注射生理盐水。引言类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis，RA)时白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素18、肿瘤坏死因子a(tumornecrosisfactor-a，TNF-a)等炎症因子相互作用形成了一个细胞因子网络。其主要功能是促进B细胞增殖与分化，促进类风湿因子的合成，促进肝细胞合成急性期蛋白，从而增强炎症过程，加重关节病变。它们亦可直接损伤内皮细胞，激活血小板，影响纤溶系统等，同时诱导内皮细胞、白细胞等合成释放各种炎症

3、递质、黏附分子扩大炎症反应，加重免疫炎性血管和关节损伤，促进血液呈高凝性改变。脐带间充质干细胞(umbilicalcordmesenchymalstemcells，Uc-MSC)表达多种胚胎干细胞的特有分子标志，具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便、不受道德伦理限制等特征受到临床关注。课题以CIA大鼠为观察对象，探讨RA炎症黏附因子水平变化及Uc-MSC对其的干预作用。材料和方法设计：随机对照动物实验。时间及地点：实验于2009-09/2010-06在扬州大学医学院完成。材料：雌性近交系SD大鼠30只，清洁级，4~6周龄，体质量为(162±20)g，购于南京

4、医科大学实验动物中心。主要试剂试剂及仪器来源鸡Ⅱ型胶原Sigma公司冰乙酸(分析纯)中国恒利试剂厂L-DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶美国Gibco公司大鼠白细胞介素1、大鼠白细胞美国RD公司介素6、大鼠白细胞介素18ELISA试剂盒、大鼠TNF-aELISA试剂盒、大鼠血管细胞黏附分子1(vascularcelladhesionmolecule-1，VCAM-1)ELISA试剂盒、FITCMouseAnti-RatCD11b、FITCMouselgA实验方法Uc-MSC的制备：将人的脐带剪成组织块后贴壁培养72h，去除未消化的组织块，将原代脐带间充质干细胞用胰蛋白酶消化后

5、加入含有体积分数10%胎牛血清的L-DMEM培养基终止消化，反复吹打，移入离心管中离心10min后，去掉上清液，加入培养基后吹打，移入培养瓶中，37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养，至第3代消化、离心后用生理盐水将Uc-MSC细胞浓度调至2×109L-1，4℃保存备用。CIA大鼠模型建立：雌性近交系SD大鼠，随机分为正常组(见图1a)、模型组(见图1b)、Uc-MSC组，每组10只。制备0.01mol/L乙酸溶液中溶解的鸡源性Ⅱ型胶原(质量浓度为5g/L)，充分溶解后与完全弗氏佐剂(CFA)等体积混合，并充分乳化成Ⅱ型胶原乳剂。予20只大鼠右后足跖皮内注以0.1mL免

6、疫大鼠，第21天时再次以每只0.1mL的剂量同部位皮内多点激发注射免疫大鼠，建立Ⅱ型胶原诱导的类风湿性关节炎大鼠模型。各组大鼠处理：取Uc-MSC2×109L-1，于造模后第4周Uc-MSC组经大鼠尾静脉注射，模型组注射生理盐水0.5mL。Uc-MSC表型鉴定：采用流式细胞术对CD14、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105及HLA-DR表面标记进行表型分析，其中CD44、CD73、CD90和CD105阳性，阳性率>95%；CD14、CD34、CD45和HLA-DR阴性，阳性率<2%，确认为Uc-MSC细胞。指标检测：模型组和Uc-MSC组分别于第

7、7天及第35天每组各取5只大鼠麻醉，于腹主静脉取血5mL，分别置肝素抗凝管和血清管中，检测中性粒细胞表面CD11b(FCM法)和血清白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素18、TNF-a、VCAM-1水平(ELISA法)。流式细胞术检测各组大鼠中性粒细胞表面CD11bMFI表达。主要观察指标：①各组大鼠血清白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素18、TNF-a、VCAM-1水平。②各组大鼠中性粒细胞CD11b的表达水平。③各组大鼠中性粒细胞表面CD11bMFI表达。统计学分析：采用SPSS10.0及Excel2003统计学软件完成。组间比