基因克隆与表达课件.ppt

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1、基因的克隆与表达张静静2019-09-24基因克隆(genecloning)RACE技术服务基因表达(geneexpression)-原核基因表达-真核基因表达基因克隆GeneCloning概述克隆载体受体细胞体外重组的策略基因克隆工作流程一、概述确定了遗传信息的携带者揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理提出了中心法则和操纵子学说，破译了遗传密码概述1973年Cohen完成第一个基因工程实验经体外重组获得杂合DNA杂合子转化入大肠杆菌所需元件：限制性内切酶连接酶载体受体细胞----通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大

2、量子代分子的过程。基因克隆（分子克隆molecularcloning）基因克隆的核心-----体外重组(Recombination):人工将一段目的DNA插入一个载体的过程。基因克隆的技术路线目的基因载体体外重组重组子（杂合DNA）转化受体细胞筛选阳性克隆大量扩增，获得子代DNA二、克隆载体复制基因(replicator)选择性记号克隆位点三、受体细胞1、定义：外源DNA导入的细胞，是重组体扩增的场所。2、要求：易于接纳外源DNA无特异的内源性核酸内切酶载体复制、扩增不受阻与载体有互补性四、体外重组的策略粘-粘连接：最有效、最快捷4、T-A克隆T-vector两条链的5’端含有

3、一个游离的TPCR过程中，普通的Taq酶可在产物的3’端多加一个A五、基因克隆的工作流程（一）目的基因的获得（二）体外重组（三）转化—Cacl2法、电击法（四）重组子的筛选及鉴定1、筛选：平板法（抗生素、蓝白斑）2、鉴定：长度鉴定：酶切、PCR（五）测序样品的要求目标基因序列（最好附原始测序报告）；克隆模板（包括：菌液、质粒、PCR扩增产物、RT-PCR扩增产物、从其他质粒上酶切得到的DNA片段等）及检测结果和背景资料；载体及其图谱（常用载体可由我方免费提供）；注明克隆要求，克隆使用的酶切位点。服务流程载体构建流程为：酶切、凝胶回收、连接、转化、鉴定、测序。完成时间2周内完成。

4、最终产品构建好的重组质粒，不少于1μg；含有重组质粒的菌株；电泳图谱，测序图谱，酶切图。快速扩增cDNA末端—RACE技术背景RACE的基本概念不同厂家RACE试剂盒的介绍RACE技术的关键环节存在的问题及解决办法最终产品的要求技术背景得到某基因的片段、全长或近全长cDNA的方法：建立和筛选cDNA和DNA文库。利用GenBank数据库中的表达序列标签(expresssequencetags,ESTs)拼接出全长或近全长cDNA。是多聚酶链式反应即PCR。cDNA末端快速扩增(RACE)技术。用RNase保护、S1核酸酶谱和引物延伸等方法来保证mRMA5′末端的获取，但又需要大

5、量的mRNA。RACE的优点此方法是通过PCR实现的，无需建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有利用价值的信息；节约了实验所花费的经费和时间；只要引物设计正确，在初级产物的基础上可以获得大量的感兴趣基因的全长；RACE的基本概念cDNA末端快速扩增(rapidamplificationofcDNAends,RACE)技术是基于PCR技术由已知的部分cDNA序列来获得完整cDNA序列的一种方法，为Frohman在1985年首次报道。3’RACE和5’RACE基本原理和方法利用Oligo(dT)对mRNA进行反转录的同时在两头加上通用接头(引物)，从而可利用基因特异的引物(ge

6、nespecificprimer，GSP)通过PCR反应快速获得目的序列的5′端和3′端。?T重复寡核苷酸只有胸腺嘧啶组成的核苷酸链3’RACE原理示意图RACE产物的鉴定和全长cDNA的获得3′或5′双链cDNA限制性内切酶酶切克隆3′和5′重叠序列的连接RACE产物的3′和5′末端序列的分析合成相应引物PCR获得全长cDNA样品要求不同厂家RACE试剂盒的介绍clontechSMARTRACEInvitrogenGeneRacerTMKitBDSMARTTMRACE(SwitchingMechanismAt5'endoftheRNATranscript)RACE技术的关键环

7、节RACE技术的关键环节有2个：1.3个连续的酶促反应（逆转录、TdT加尾、PCR扩增）TdT加尾反应是用脱氧核糖核酸末端转移酶（TDT）催化，它可将dT依次加在寡核苷酸的3’端2.RACE的引物即使3个酶促反应均平稳顺利进行，但结果也通常会出现一些非特异性产物或非全长的产物背景。存在的问题及解决办法反转录RNA的质量有高质量的不被核糖核酸酶降解的RNA，RNA的完整性至关重要。一旦RNA降解就要重新提取，免得后期工作没有结果既浪费时间又浪费试剂，给试验带来麻烦。反转录提前终止模板中有特殊的