PCR常见问题、原因分析及其对策课件.ppt

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1、PCR技术常见问题、原因分析及其对策淮北师范大学生命科学学院朱秀云内容提高PCR反应特异性的策略3PCR技术简介1PCR常见问题、原因分析及对策2PCR技术的简介什么是PCR?PCR:Polymerasechainreaction，即聚合酶链反应是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术PCR技术的简介PCR技术的发展历史关于PCR的文章首次由美国科学KaryMullis等人在《Science》杂志上发表1989《Science》杂志报道了耐热性DNA多聚酶Taq酶（生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到的一种耐热的DNA聚合酶）的发现,预示着分子时代的到来。12月《Sc

2、ience》杂志将PCR和它所使用的聚合酶命名为第一个“年度分子”。1993KaryMullis因PCR的发明获得诺贝尔化学奖。PCR技术的简介PCR原理的简介PCR的扩增过程模拟体内DNA的天然复制过程，利用一种从水生栖热菌ThermusAquaticus（Taq）中分离出的具有热稳定性的DNA聚合酶，及碱基互补配对原则。通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段的多次循环,最终使基因扩增形成特异区段的DNA带，实现DNA在体外的特异性扩增。PCR技术的简介1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~35轮目的D

3、NA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR的常见问题、原因分析及对策PCR常见问题无扩增产物非特异性扩增拖尾假阳性PCR的常见问题、原因分析及对策PCR常见问题之一：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无；模板:含有抑制物，含量低Buffer对样品不合适引物设计不当或者发生降解反应条件：退火温度太高，延伸时间太短原因对策纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量更换Buffer或调整浓度重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物降低退火温度、延长延伸时间PCR的常见问题、原因

4、分析及对策PCR常见问题之二：非特异性扩增现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。PCR的常见问题、原因分析及对策非特异性扩增引物特异性差模板或引物浓度过高酶量过多Mg2+浓度偏高退火温度偏低循环次数过多原因对策重新设计引物或者使用巢式PCR适当降低模板或引物浓度适当减少酶量降低镁离子浓度适当提高退火温度或使用二阶段温度法减少循环次数PCR的常见问题、原因分析及对策PCR常见问题之三：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。M12PCR的常见问题、原因分析及对策拖尾模板不纯Buffer不合适退火温度偏低酶量

5、过多dNTP、Mg2+浓度偏高循环次数过多原因对策纯化模板更换Buffer适当提高退火温度适量用酶适当降低dNTP和镁离子的浓度减少循环次数PCR的常见问题、原因分析及对策PCR常见问题之四：假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况)现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交叉污染对策：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。提高PCR反应特异性的策略四种策略：巢式PCR（Nest-PCR）递减PCR（Touc

6、hDownPCR）热启动PCR（HotStartPCR）使用PCR增强剂提高PCR反应特异性的策略策略之一：巢式PCR（Nest-PCR）P1P2P3P4巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5'RACE）的特异性。提高PCR反应特异性的策略策略之二：递减PCR（TouchDownPCR）递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2℃,直到退火温度低于Tm

7、5℃。特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析。提高PCR反应特异性的策略策略之三：热启动PCR（HotStartPCR）热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。现在有很多公司都有HotStartTaq酶出售，该酶具有热启动的性能，使用简单方便，适合于高通量应用。热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。提高PCR反应特异性的策略策略之四：使用PCR增强剂甲酰胺，DMSO，甘油，