石蜡切片和冷冻切片.doc

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1、石蜡切片和冷冻切片——傻傻分不清楚系列在组织实验中，组织切片和冷冻切片是最常见的两种切片方法，两种优缺点明显，在实验的应用上也大有不同。而两个实验的相同点都是应用免疫学基本原理——即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内蛋白质，对其进行定位、定性及相对定量的研究。一、石蜡切片 组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。1、固定

2、：将新鲜组织切成小块，固定于4%多聚甲醛过夜。凝固组织中的物质成分，尽可能保持其活体时的结构。同时能使组织硬化，有利于切片的进行。2、脱水：为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行经70%、85%、95%直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1小时。固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响后期的染色效果。3、透明：常用的透明剂有二甲苯，二甲苯是石蜡的溶剂。纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的溶剂，替换出组织内的酒精。材料块在透明剂浸渍过程称透明。4、浸蜡：先把组织材料块放

3、在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1小时。先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍1小时左右。5、包埋：以少许热蜡液将其底部迅速贴附于包埋盒内上，然后置于速冻台，让石蜡固定。6、切片：切片刀的锐利与否、蜡块硬度是否适当都直接影响切片质量，可将蜡块至于冷水中改变蜡块硬度。通常切片厚度为5微米，用毛笔轻托轻放在37度水浴中展片。7、贴片与烤片：将水浴中展片捞至玻片上铺正，然后将载玻片放入37℃温箱中干燥。8、切片脱蜡及水化：干燥后的切片置于二甲苯中进行脱蜡，然后依次使用从高浓度到低浓度递减的顺序进行经纯酒精、95%、85%、70%进行水化

4、。9、染色：经典的苏木精和伊红：细胞核被苏木精染成紫蓝色，多数细胞质及非细胞成分被伊红染成粉红色。实验操作简单。免疫组化：指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应。一、冰冻切片：冰冻切片是一种在低温条件下使组织快速冷冻到一定的硬度，然后进行切片的一种方法。制作过程较石蜡切片快捷、简便，因多应用于手术中的快速病理诊断。一、取材：应尽可能快地采取新鲜的材料，防止组织发生死后变化。二、速冻：1、将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm）。2、如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特

5、制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内。3、当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。4、在制成冻块后，即可置入恒冷箱切片机冰冻切片。5、若需要保存，应快速以铝箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱贮存备用。三、固定：1、样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，4℃冰箱预冷5-10min让OCT胶浸透组织。2、取下组织置于锡箔或者玻片上，样品托速冻。3、组织置于样品托上，其上再添一层OCT胶，以完全覆盖为宜，速冻架（PE）上30min。四，切片：1、恒温冰冻切片机为

6、较理想的冰冻切片机，其基本结构是将切片机置于低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至5-10μm。2、切片时，低温室内温度以-15℃~ -20℃为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动。3、切好室温放置30min后，入4℃丙酮固定5-10min，烘箱干燥20min。PBS洗5min×3。4、进行抗原热修复，微波热修复也可，室温自然冷却。可用3%H2O2孵育5-10min，消除内源性过氧化物酶的活性。五、免疫荧光染色：1、冰冻切片室温晾干15min，可用含10%正常

7、山羊血清的PBS室温封闭切片1小时（此步可不洗）。2、滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液（抗体的量视组织大小而定，原则是可以均匀覆盖组织面，且保证整个过程中不会使组织干涸）。3、将切片放在加了PBS的免疫组化湿盒，室温孵育2小时或4℃过夜。4、第二天先将湿盒放到37℃回温1h，然后吸取片上的一抗进行回收，将切片插入到小染缸PBS冲洗。5、滴加用PBS稀释好的二抗（避光）置于分子杂交箱中37℃孵育1小时。回收二抗，切片置于染缸内，PBS洗5min×3次。6、滴加DAPI工作液染核，室温10-20min（工作浓度0.1%染色15m

8、in）。7、回收DAPI，滴加5-10μl抗荧光衰减封片剂或中性树胶，用处理干净的盖玻片封片，即可到荧光显微镜或者共聚焦显微镜下观察拍照。8、做好的切片放在切片盒内，置于4℃冰箱，可保存一周左右。对比：石蜡切片冷冻切片应用对象广泛应用常规制片手术中的快速病理诊断保持时间持久保