肠毒素大肠杆菌K88适配体的筛选及其应用研究.pdf

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1、分类号学校代码】Q曼璺至密级学号一200814020057肠毒素大肠杆菌K88适配体的筛选及其应用研究TheseIectionandappI．cationofaptamersagainstETECK88指导教师姓名、职称墅巫塾撞湖南师范大学学位评定委员会办公室二零一一年五月摘要产肠毒素大肠杆菌(ETEC)K88所引起的仔猪腹泻是一种十分常见的疾病，给仔猪和人类的健康带来极大的威胁，并且能造成十分严重的世界范围的经济损失。菌体表面的黏附性菌毛是ETECK88致病的主要原因，ETECK88通过菌毛吸附宿主肠道黏膜上皮细胞的相应受体，定居在该吸附区域，进而进行繁殖并产生毒素，损伤宿主小肠黏膜，

2、引起宿主吸收分泌功能失常，导致腹泻。适配体是一段核酸序列，通过指数富集配基的系统进化技术(SELEX)，从体外人工合成的ssDNA或RNA随机序列库中，循环筛选获得，多种多样的空间构象是其与靶分子相互结合的基础。适配体具有价格低廉，易合成，分子小，多样性广等特点，能特异性地结合细胞内与细胞外的靶分子物质，广泛的应用于基础研究，临床诊断治疗，药物研发和分子检测等领域。本论文主要包括以下内容：通过体外SELEX技术，以ETECK88菌毛蛋白作为靶分子，采用BSA作为反筛选靶分子进行反筛，从库容量为4∞的随机ssDNA文库当中筛选获得了一组能够高特异性、高亲和性结合ETECK88菌毛蛋白的适配

3、体，这是国内外ETECK88菌毛蛋白适配体的首例报道。利用软件对筛选得到的适配体进行一级结构同源性和二级结构相似性分析，将适配体划分为四个家族。随机从四个家族中挑选四条序列分析其与ETECK88菌毛蛋白的亲和力，由于荧光具有高灵敏性，我们采用荧光仪作为检测仪器。四条适配体中具有最高亲和力的一条被用来进一步分析其与ETECK88的结合能力。由于只有ETECK88能够表达ⅣETECK88菌毛蛋白，ETECK88菌毛蛋白的适配体成功的实现对ETECK88的定性和定量检测。这一检测方法不仅能够用于检测ETECK88，也为其他细菌的快速、实时检测提供了一种新的思路。关键词：指数富集配基的系统进化技

4、术，肠毒素大肠杆菌K88，适配体ⅣAbstractIthasbeenreportedthattheenterotoxigenicEscherichiacoli(ETEC)K88strainsmaycausediarrhealdiseaseinfarminganimals．Itisahugethreatforthehealthofhumanbeingsandanimals．FimbriaeplayanessentialroleinthepathogenesisofETECK88infectionbymediatingadhesiontoepithelialcells．ETECK88adhe

5、retohost’Scellbyfimbriaerecognizingtheirreceptor，andlocalizeinlocaltissueandproducetoxinordestroytissue，leadingtodiarrhea．Aptamersare01igonucleotides(DNAorRNA)whichobtainedbySELEX(Systematicevolutionof1igandsbyexponentialenrichment)．SELEXwasonthebasisofthefactthatsomeuniqueRNA／DNAmoleculescanbind

6、tothetargetmoleculeswithhighaffinityandspecificity．ItisappliedtoidentifytheseuniqueRNA／DNAmoleculesfromverylargepopulationofrandomsequenceoligomers．Theinteractionbetweenoligonucleotidesandthetargetmoleculesisbasedonthediversityinthree—dimensionalstructuresof01igonucleotidesintheiibrary．Withtheirl

7、owcost，easyandquickpreparation，smallsizeandversatility，aptamersareidealtoolsfortheassayofintracellularandextracellulartargets．Aptamershavebeenwidelyusedinthefieldsofbasicresearch，clinicaldiagnosis，drugdevelopmentandthe