大鼠视上核和室旁核神经元钾离子氯离子共转运体2表达探讨.doc

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1、大鼠视上核和室旁核神经元钾离子氯离子共转运体2表达探讨作者：王徳广，张静，陈菲菲，郑殿杰，陈幽婷【摘耍】目的观察神经元特界性标记物钾离子氯离子共转运体2在成年大鼠下丘脑视上核和室旁核的表达。方法成年SD大鼠，4%多聚甲醛灌注固定，取脑，冰冻切片，下丘脑部进行钾离子氯离子共转运体2和神经细胞核抗原免疫荧光染色，激光共聚焦显微镜观察。结果钾离子氯离子共转运体2在视上核和室旁核神经元中表达很弱。结论下丘脑视上核和室旁核部分神经元缺少神经特界性的钾离子氯离子共转运体2表达。【关键词】下丘脑；视上核；室旁核；钾离子氯离子共转运体2Abstract:ObjectiveToobservetheneuron

2、alspecificexpressionofpotassiumchlorideioncotransporter2inadultratsupraopticandparaventricularnuclei.MethodsTheadultSDratsweresacrificedandfixedwith4%paraformaldehydetoremovethebrainforfrozen-sectioning.Theexpressionofpotassiumchlorideioncotransporter2andNeuNrevealedbyimmunof1uorescencewerestudiedi

3、nthephotostakenunderlaserconfocalmicroscope・ResultsTheexpressionofpotassiumchlorideioncotransporter2wasabsentfromthesupraopticandparaventricularnuclei.ConclusionTheneuronalspecificpotassiumchlorideioncotransporter2isabsentinthesupraopticandparaventricularnuclei・Keywords:hypothalamus;supraopticnucle

4、us；paraventricularnucleus；potassiumchlorideioncotransporter2钾离子氯离子共转运体2(potassiumchlorideioncotransporter2,KCC2)是成年哺乳动物脑内神经元特异性表达的膜蛋白［1-2］,其对成熟神经元胞内的氯离子外排作用是维持成熟神经元胞内低氯离子浓度的重要因素，而神经元胞内低氯离子浓度的维持是抑制性神经递质Y-氨基丁酸(Y-aminobutyricacid,GABA)离子型受体发挥抑制性作用的前提［3-4］。我们以前的研究表明，成年哺乳动物脑内的缰内侧核缺少KCC2蛋白的表达，同时缺少GABA的A型

5、(GABAA)受体信号系统介导的抑制性作用［5］。正常脑功能的维持需要保持脑内兴奋性和抑制性神经元活动的稳态平衡［6］,GABAA受体介导的抑制作用是中枢神经系统内主耍的抑制性信号系统。下丘脑的视上核和室旁核的神经元既具有神经元的特点，也具有分泌神经递质这一不同于神经元的特点，他们分泌的催产索和加压索对调节生殖器官活动和水电介质平衡等起到重要作用。本研究使用免疫荧光双标并结合激光共聚焦显微镜成像技术检测神经元特异性的KCC2在下丘脑视上核和室旁核中的表达。1材料和方法1.1实验动物和切片制备雄性SD大鼠,体重230-250g(徐州医学院实验动物中心提供)。动物用0.4%戊巴比妥钠麻醉（60m

6、g/kg）,开胸，经升主动脉向心插管，先灌注100ml生理盐水，随后以4%冷多聚甲醛（0.1mol/L磷酸缓冲液配制，pH7.4）灌流周定，取整脑后固定6h,15%和30%蔗糖溶液各浸泡12h,30mn冰冻切片，收取含视上核和室旁核的切片置于0.01mol/L磷酸盐缓冲液中（pH7.4）o1.2免疫荧光化学反应参照文献［5］方法。主要步骤为：冰冻切片使用5%的正常羊血清室温孵育30min；第一抗体为兔抗KCC2的多克隆抗体（1:200,Upstate）和鼠抗NeuN的单克隆抗体（1:500,Upstate）,4°C孵育48h；第二抗体为驴抗鼠（FITC标记，Rockson公司，1：200）或

7、驴抗兔（Cy5标记,Rockson公司，1：200）的荧光标记二抗，在二抗孵育时加入Nissl红色荧光染料（1：400,Invitrogen）,室温孵育2h；PBS洗片,贴片，无色指甲油封片，4°C保存备观察。阴性对照切片使用PBS代替一抗孵育，其他步骤同上。1.3激光共聚焦显微镜观察以阴性对照片确定染色背景，可以观察到NeuN阳性染色为绿色，KCC2阳性染色为蓝色，Nissl阳性染色为红色荧光。2结果借助N