DB44∕T 1866-2016 香蕉种苗枯萎病菌分子检测与鉴定技术规程.pdf

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1、ICS65.020.99B16备案号：53101-2017DB44广东省地方标准DB44/T1866—2016香蕉种苗枯萎病菌分子检测与鉴定技术规程ProtocolsforMolecularDetectionandIdentificationofFusariumoxysporumf.sp.cubenseonBananaSeedlings2016-09-08发布2017-01-01实施广东省质量技术监督局发布DB44/T1866—2016前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由广东省农业厅提出并归口。本标准起草单位

2、：华南农业大学，广东省农业有害生物预警防控中心。本标准主要起草人：李敏慧，习平根，王琳，姚挺，姜子德，李华平。ⅠDB44/T1866—2016香蕉种苗枯萎病菌分子检测与鉴定技术规程1范围本标准规定了香蕉枯萎病菌分子检测与鉴定的程序和方法。本标准适用于香蕉组培苗和吸芽苗实施香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种的分子检测与鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T29397-2012香蕉枯萎病菌4号小

3、种检疫检测与鉴定。3术语和定义3.1生理小种Race同种病原物在形态上没有什么差别，而在生理生化特性、培养性状、致病性等方面存在差异的不同群体。不同生理小种对同种作物不同品种（或不同种、属）之间的致病性不同。3.2分子鉴定MolecularIdentification通常是应用某生物物种特异性的DNA片段或基因片段，对待鉴定的物种进行PCR扩增，再通过是否能得到相同碱基序列或是相同大小的PCR扩增产物来判断是否是目标物种。4现场检验和抽样4.1现场检验对于香蕉组培苗，若地上部分表现附录A所述症状，剖开其根部和假茎基部，观察维管束组织的

4、颜色变化情况；若地上部无明显症状，则随机抽取部分植株，观察其根部及假茎部位维管束组织的颜色变化情况。对于香蕉吸芽苗剖开其根部和假茎基部，观察维管束组织的颜色变化情况。将现场调查结果记入《香蕉种苗产地/销售地枯萎病调查记录表》(见附录B)。4.2抽样方法根据现场检验的情况，对有明显症状的疑似发病种苗进行定点取样（症状见附录A）；对地上部分没有明显外部症状的香蕉种苗，采用随机抽样方式取样。取样方法按照国家标准《香蕉枯萎病菌4号小种检疫检测与鉴定》（GB/T29397-2012）进行。同时填写《香蕉种苗枯萎病抽样记录表》(见附录C)。1DB

5、44/T1866—20165实验室检验5.1疑似样品组织块的病原菌检验将现场抽取的样品切成1cm~2cm长的组织块，用自来水冲洗掉表面的泥土杂物后，在75％的酒精溶液中浸泡１min，经灭菌水洗涤晾干后置于25℃~30℃条件下保湿培养1d~3d，如样品组织块上长出白色絮状菌丝体，显微镜镜检可见附录A中的病菌形态特征，则采用水琼脂培养基（WA）对病原菌进行单孢分离，得到单孢菌株，为下一步进行分子检测准备材料；如样品组织块上没有长出菌丝体或有菌丝体但经镜检后没有发现附录A中的病原菌形态特征，则直接抽取植物样品DNA进行进一步分子检测。5.2

6、病组织分离培养检验选取发病香蕉种苗组织，切成小块（3×3mm），将小块组织先放于70％乙醇（酒精）溶液中浸10s~30s、再转入0.1％升汞或3%次氯酸钠溶液中浸泡1min~2min进行表面消毒处理，然后用无菌水漂洗3次，将消毒处理和漂洗后的小块组织置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）平板上恒温（28℃）培养3d~5d，如组织块周围长出白色絮状菌落，菌落背面呈淡紫色或淡紫红色，则采用本文件5.1所描述的方法获得单孢菌株，为下一步进行分子检测准备材料；如样品组织块上没有长出菌丝体或有菌丝体但经镜检后没有发现附录A中的病原菌形态特征，则直

7、接抽取植物样品DNA进行进一步分子检测。5.3PCR检测按照附录D所列要求对疑似病原菌DNA和植物样品DNA进行PCR检测。6结果判定6.1以分离病原菌DNA为模板进行PCR检测的结果判定当1号生理小种特异性引物的PCR检测结果为阳性，扩增片段大小为354bp，同时通用引物的PCR检测结果呈阳性，扩增片段大小为729bp，且阴性对照没有扩增条带，则可鉴定该菌株为香蕉枯萎病菌1号生理小种；若4号生理小种特异性引物的PCR检测结果为阳性，扩增片段大小为593bp，同时通用引物的PCR检测结果呈阳性，且阴性对照没有扩增条带，则可鉴定该菌株为

8、香蕉枯萎病菌4号生理小种。若只有通用引物的PCR扩增到大小为729bp的DNA片段，特异性引物的PCR没有扩增产物，则不能判定为香蕉枯萎病菌1号或4号生理小种。6.2以待检香蕉苗总DNA为模板进行PCR检测的结果判定如果