血库实验指导.doc

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1、广州华兴康复医院医院血库实验指导实验一ABO血型鉴定一、正定型法【目的】通过用标准血型抗体鉴定红细胞膜上ABO血型系统抗原，掌握盐水介质法进行ABO血型系统正定型的基本操作方法和结果判断。【原理】根据IgM类特异性血型抗体与红细胞膜上特异性抗原结合能够出现凝集反应的原理，用已知IgM类特异性标准抗血清与被检红细胞在盐水介质中反应（室温），若出现凝集现象，表明被检红细胞膜上有与血型抗体相对应的抗原，从而判断和鉴定被检者的血型。【器材】小试管、尖滴管、载玻片（或有凹槽的玻璃板）或白瓷板、离心机、记号笔、蜡笔、显微镜。【试剂】标准抗A、抗B血清，生理盐水。【标本】外周血或静脉血。

2、【操作】5％被检红细胞生理盐水悬液制备：抗凝血离心或红细胞自然沉降后取下层红细胞2滴于小试管中，加人生理盐水2ml，用尖滴管将红细胞与生理盐水充分混匀，2500r/min离心3min后弃去上清液，重复洗涤3次后自管底吸取1滴压积红细胞加入19滴生理盐水中，此即为5％的红细胞生理盐水悬液。（一）玻片法1．标记玻片或白瓷板取洁净的载玻片或白瓷板1块，用蜡笔画出小格，做好编号分别标记抗A、抗B。2．加标准抗血清在玻片或白瓷板已标记的区域内分别滴加抗A,抗B标准抗血清各1滴。3．加被检红细胞悬液在滴加抗A,抗B标准抗血清的小格中分别加被检者5％红细胞生理盐水悬液各1滴，不断摇动玻片

3、或白瓷板，使血清与红细胞充分混匀，室温放置15～30min。4．观察结果先轻轻摇动玻片，肉眼观察有无颗粒状凝集及凝集程度，再用低倍镜观察，判定阴性、阳性和阳性程度。5．判断结果(1)凝集结果判断标准：①凝集判断标准：红细胞呈均匀分布，无凝集颗粒，显微镜下红细胞分散存在，无凝集靠拢现象为阴性；红细胞出现凝集为阳性。②凝集强弱程度判断标准：有助于A、B亚型，类B抗原的发现，在低倍镜下凝集程度强弱判断标准如下。1)呈一片或几片凝块，仅有少数单个游离红细胞为（4+）。2)呈数个大颗粒状凝块，有少数单个游离红细胞为（3+）。3)数个小凝集颗粒和一部分微细凝集颗粒，游离红细胞约占1/2

4、为（2+）。4)肉眼可见无数细沙状小凝集颗粒，周围有较多的游离红细胞，于镜下观察，每个凝集团中有5-8个以上红细胞凝集为（1＋）。5)可见数个红细胞凝集在一起，周围有很多的游离红细胞（士）。6)可见极少数红细胞凝集，而大多数红细胞仍呈分散分布为混合凝集外观（mixedfield，MF)。7)镜下未见细胞凝集，红细胞均匀分布为（一）。(2)血型结果判定标准：见表1。表1ABO血型正反定型结果判定正定型被检者血型反定型抗A抗BA型红细胞B型红细胞O型红细胞十一A一＋一一十B十一一一一O十＋一十十AB一一一（二）试管法1．标记试管取小试管2支，分别标记抗A、抗Bo2．加标准抗血清

5、分别加人抗A、抗B标准血清各1滴于相应标记的试管中。3．加入红细胞悬液分别加人被检者5％红细胞生理盐水悬液1滴于各试管中，混匀，立即以1OOOr/min离心lmino4．观察结果先观察上层液有无溶血现象，再斜持试管轻轻摇动或轻轻弹动，使管底的红细胞慢慢浮起，肉眼观察有无凝集、再用低倍镜观察凝集强弱程度，如轻微凝集或不见凝集，必须将反应物倒于玻片上，再以低倍镜观察。5．判断结果(1)判断标准：①凝集判断标准：完全凝集的管，上层液体清亮、无色，底部有红细胞凝块，管底细胞呈花边状，轻弹试管凝块不散开。完全不凝的管，上层液体清亮、无色，血细胞均匀地沉到管底，边缘整齐，用手指轻弹试管

6、，红细胞像一缕烟似的立即上升，随即成为均匀的悬液。②凝集强弱程度：判断标准与玻片法一致。(2)血型结果判定标准：见表1。【注意事项】1．严格标记，摇动玻片动作要轻。2．所用器材必须干燥清洁、防止溶血；为避免交叉污染，试管、尖滴管均一次性使用。3．标准血清的质量、性能要符合要求。标准血清从冰箱取出待其平衡至室温后再用，用毕后应尽快放回冰箱保存，减少细菌污染机会。4．操作应按规定的程序进行，一般先加血清，然后再加红细胞悬液，以便核实是否漏加血清。5．玻片法定型时，注意防止悬液干涸，否则易将玻片边缘干涸引起的红细胞凝集误认为抗原抗体反应凝集。6．理论上IgM抗A和抗B与相应红细胞

7、的反应温度以4℃最强，但为了防止冷凝集现象的干扰，一般在室温（20-24℃）内进行试验，37℃可使反应减弱。7．观察结果时应注意红细胞呈特异性凝集、继发性凝集以及缗钱状形成的区别，明确凝集和溶血的意义是一样的。8．登记结果及发报告时应仔细记录、严格核对、避免笔误。9．幼儿红细胞抗原未发育完全、老年体弱者抗原性较弱，最好采用试管法鉴定血型。白血病、恶性肿瘤等严重疾病时，红细胞上的抗原可能减弱甚至消失，要结合反定型综合判断血型。亚型红细胞（如A3型）的抗原性较弱，有时会出现混合外观现象（即凝集与不凝集细胞相混合的现象）