血清蛋白电泳-醋纤电泳圆盘电泳ppt课件.ppt

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1、实验二血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳带电粒子在电场中移动的现象称为电泳。电泳技术即是利用样品中各种带电粒子的带电性质、分子大小、形状等的差异，在电场中的迁移速度不同，从而对样品分子进行分离、鉴定、纯化和制备。在生物医学领域，该技术多用于分离，纯化、鉴定蛋白质、核酸等大分子物质。一、电泳技术电泳速度:带电粒子在电场中运动时，单位电场强度内粒子运动的速度，以u表示，即V—粒子运动的速度X—电场强度Q—粒子所带电荷r—粒子的半径η—介质的粘度影响电泳速度的因素1、影响电泳迁移率的外界因素：电场强度溶液的pH值溶液的离子强度电渗现象2.影响电泳迁移率的内在因素：样品所带净电荷的量样品的大小和形状

2、掌握电泳法分离血清蛋白质的原理掌握血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的操作方法及临床意义二、实验目的本实验是以醋酸纤维素薄膜作为支持体的区带电泳。方法是将少量新鲜血清用点样器点在浸有缓冲液的乙酸纤维素薄膜上，薄膜两端经过滤纸与电泳槽中缓冲液相连，所用缓冲液pH值为8.6，血清蛋白质在此缓冲液中均带负电荷，在电场中向正极泳动。由于血清中不同蛋白质带有的电荷数量及分子量不同而泳动速度不同。带电荷多及分子量小者泳动速度快；带电荷少及分子量大者泳动速度慢，从而彼此分离。三、实验原理经醋酸纤维素薄膜电泳可将血清蛋白按电泳速度分为5条区带，从正极端依次为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白及γ球蛋白

3、，经染色可计算出各蛋白质的百分含量。γβα2α1清蛋白人血清蛋白质的等电点及分子量1.实验材料：未溶血的人血清2.实验试剂：巴比妥缓冲液氨基黑10B0.5％染色液漂洗液透明液3.实验器材：醋酸纤维薄膜（2×8cm）常压电泳仪镊子点样器玻棒粗滤纸培养皿吸量管直尺及铅笔四、试剂及器材1.准备醋酸纤维素薄膜的预处理：将薄膜小心放入盛有缓冲液的培养皿内，使其漂浮在液面；用镊子轻压，使其全部浸入缓冲液内。待膜完全浸透（约半小时）后取出，夹在清洁的滤纸中间，轻轻吸去多余的缓冲液，同时分辨出光滑面和粗糙面。标记：在粗糙面上用铅笔距薄膜条一端1.5cm处划线即为点样线并作好标记。五、试验方法电泳槽

4、的准备电泳槽有两个互相隔离的槽，各自装有缓冲液，接不同的电极，红色为正极，黑色为负极。每个槽上都有一根可移动的横杆，滤纸或纱布的一头搭在横杆上，另一头浸入缓冲液中，形成了滤纸桥。根据电泳槽膜支架的宽度，裁减尺寸合适的率纸条，放入电泳槽，待滤纸条湿润后，用玻璃棒挤压排气，使滤纸紧贴膜支架。2.点样（关键）取出浸透的薄膜，平放在滤纸上(无光泽面向上)，用滤纸轻轻吸去多余的缓冲液，薄膜的粗糙面向上平放在点样模板上，底边对齐，点样区距负极1.5cm。点样时，用磨光的玻片蘸取血清后，均匀的涂抹在点样区，使血清完全渗透至薄膜内，形成一定宽度、粗细均匀的直线。（见图）注意：点样时动作要轻、稳，用

5、力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。另外操作过程要防止指纹污染。3.电泳将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上。要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂，使膜平衡10min。连接好电泳仪。在室温下电泳，打开电源开关，调节电流强度0.3mA/cm膜宽度。通电10min-15min后，调节电流强度0.5mA/cm膜宽度，电泳时间50min。电泳后，调节旋钮使电流为零，关闭电泳仪切断电源。点样端1.滤纸桥2.电泳槽3.醋酸纤维素薄膜4.电泳槽膜支架5.电极室中央隔板4.染色电泳完毕立即取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5min

6、。5.漂洗用漂洗液漂洗，不停摆动薄膜条，每10min左右换一次液，连续更换数次，直至背景颜色脱去。将膜夹在干净滤纸中，吸去多余溶液。操作中，注意控制染色和漂洗的时间，防止背景过深或某些区带太浅。6.记录和分析实验结果漂洗完毕后将薄膜取出,放在滤纸上。将薄膜上的5条色带根据其颜色深浅、形状、大小及相对位置进行描述、记录在实验本上，并判断分析其结果。清蛋白121、洗脱法：剪下各蛋白区带0.02mol/LNaOH洗脱将洗脱液用分光光度计比色结果计算每种蛋白质占总蛋白质量的相对含量=该种蛋白管光密度读数各管光密度读数之和×100%六、各蛋白组分的定量2、光密度计扫描法清蛋白

7、12清蛋白12血浆蛋白是血浆最主要的固体成分，含量60～80g/L绝大部分由肝脏合成，仅γ球蛋白由浆细胞合成正常值：白蛋白57％~72％，α1球蛋白2％~5％α2球蛋白4％~9％，β球蛋白6.5％~12％γ球蛋白12％—20％血浆蛋白的主要功能:维持血浆胶体渗透压调节血浆pH值,维持酸碱平衡运输营养物质,代谢物,激素,药物及金属离子等免疫作用七、临床意义急慢性肾炎、肾病综合征、肾功能衰竭：白蛋白降低，α1、α2和β球蛋白升高；慢性活动性肝炎、肝硬化：白