干细胞示踪技术进展ppt课件.pptx

《干细胞示踪技术进展ppt课件.pptx》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、干细胞示踪技术进展吴海东干细胞示踪技术进展大量动物和临床研究均表明干细胞移植确实能改善心、脑和肝等器官功能，干细胞移植治疗器官功能缺损性疾病如缺血性心脏病、心力衰竭（心衰），脑血管疾病、脑损伤、肝硬化或肝功能衰竭，神经损伤等级已成为21世纪医学的标志性成果。然而，评价细胞植入、分布、存活、迁移、分化和功能的干细胞标记示踪研究明显滞后于整体功能改善的观察，成为干细胞治疗机制探讨的瓶颈因素和新的研究热点。示踪方法体外示踪（病理学示踪）体内示踪：MR、核素显像、光学成像病理学示踪移植前体外预先标记培养的干细胞，包括荧光染料标记（标记细胞核或细胞膜）核素标记方法

2、Y染色体标记报告基因转染细胞核标记物5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）标记DAPI标记Hoechst染色BrdU标记BrdU是DNA前体胸腺嘧啶核苷的同类物，能与内源性胸腺嘧啶竞争性地参与1期细胞单链DNA合成从而标记细胞核，细胞核免疫荧光染色后利用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜发射一定波长紫外光激发后观察，亦可通过免疫组化染色识别BrdU鉴定移植细胞。BrdU标记BrdU标记DAPI标记DAPI荧光染料化学名称为4’，6联脒-2-苯基吲哚（4’‘6-diamidino-2-phenylindole,dihydrochloride,DAPI）,能与富含

3、A-T碱基对DNA专一结合从而标记细胞核，紫外光激发下发出浅蓝色荧光。DAPI标记优点：（1）荧光保持时间较长、专一性强、灵敏度高；（2）标记技术简单，标记效率高。缺点：细胞分裂将导致DAPI标记强度降低、灵敏度下降。仅适于短期定量分析。且标记的细胞死亡后可释放出DAPI，将周围未标记的细胞标记从而产生假阳性。DAPI标记Hoechst染色Hoechst是能与DNAA-T碱基对特异性结合的双苯并咪唑荧光染料，细胞核着色，紫外光激发下发出蓝色荧光。优点：染色快（1~3h），标记率100%，可标记成体干细胞，常用的有Ho33342和Ho33258。存在的问题

4、主要是部分干细胞对该染料拒染。Hoechst染色细胞膜标记Dil标记：是一种亲脂性碳花青染料，以类似于磷脂的方式与脂蛋白结合嵌进生物质膜内，并在膜内做定向扩散运动从而标记整个细胞。其特点是特异性强，灵敏度高。CM-Dil作为膜标记物存在把标记物转移到未标记细胞的现象，10umol/L标记浓度10d是安全的，之后就开始转移到非标记细胞；40umol/L浓度1周就开始转移，而且活细胞之间、活细胞与死细胞之间都有转移现象。因此，CM-Dil比较适合短期的标记示踪。CM-Dil膜标记PKH26、PKH67标记PKH26、PKH67分别是红色、绿色的亲脂性碳花青荧

5、光染料，与细胞膜的脂质区域能稳定结合，清晰地显现细胞的结构。因荧光染料会随着随干细胞的增生和分化、时间的流失而稀释淬灭，在一定时间将检测不到标记的细胞，PKH26、PKH67被应用于体内外的短期细胞追踪研究PKH26标记荧光染料标记方法优点：化学性结合，容易操作，对细胞的增殖和分化基本没有影响。缺点：1.随着干细胞的增生和分化而稀释，随时间的流失而淬灭，以至于最终完全不能检出，因而不适合做长时期的体内标记追踪。2.细胞在受体内是否存活难以证明，因为标记细胞凋亡或死亡后可释放标记物标记周围细胞造成假阳性，而且被巨噬细胞吞噬后，细胞碎片在巨噬细胞内也可以有荧

6、光表达。3.此类荧光标记只能判断细胞的存在，无法观察细胞形态。核素标记—可用于体内外示踪目前常用来示踪标记的核素有3H-、125I-、14C-、99mTc、32P-等，其中以氚标记脱氧胸腺嘧啶核苷（3H-TDR）应用最为广泛，主要用于检测干细胞的细胞动力学和增殖研究。细胞增殖时需摄取各种嘧啶核苷，3H-TDR作为DNA补救合成的前体，可较特异地在S期掺入细胞DNA中。干细胞分裂增殖快，3H-TDR易被掺入标记。核素标记干细胞移植治疗后在同一张切片上作放射自显影+免疫组化也可观察移植细胞在体内的分布、迁移情况。核素示踪灵敏度高，可以稳定长期地示踪。存在的问

7、题是有一定的放射性污染，检测复杂。Y染色体标记目前国际上比较认可的Y染色体标记细胞追踪移植细胞技术是选用雄性供体和雌性宿主，利用Y染色体作为标志物。优点：标记技术简单，且标记效率很高，利用荧光原位杂交（FISH）技术进行追踪荧光标记的细胞能清楚地观察到，适合长期体内试验定量分析。存在的问题是不能观察自体细胞移植研究，且追踪异体移植细胞时需要雄性供体，雌性宿主，有较大的局限性。Y染色体报告基因转染利用基因载体将标志基因导入干细胞中，通过筛选获得表达标志基因的细胞，然后通过荧光显微镜可直接观察移植细胞在体内的生物学情况，此类标志基因主要有绿色荧光蛋白（gre

8、enfluorescentprotein,GFP）、B-半乳糖苷酶等，以GFP应