黑皮质素4型受体在神经病理性疼痛中的作用

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1、黑皮质素4型受体在神经病理性疼痛中的作用青岛大学医学院附属医院麻醉科褚海辰引言神经病理性疼痛的形成机制神经元神经胶质细胞引言一直以来，“神经元论”在神经病理性疼痛机制的研究中占据了统治地位。近年来，对星形胶质细胞的深入研究表明，其细胞膜上存在着大量离子通道、神经递质的受体，且其激活后能够产生和释放多种神经活性物质，在慢性疼痛的发展过程中起着重要的作用。引言外周神经损伤星形胶质细胞激活可能是疼痛神经递质、神经调质、趋化因子如EAAs、ATP、P物质、CGRP、NO、PGs、fractalking？HS014是一种选择性4-

2、型黑皮质素受体(MC4R)拮抗剂。近年来研究表明，黑皮质素肽类（MC）参与神经病理性疼痛的调节，且其主要是通过MC4R实现的。引言引言研究表明，在多种神经病理性疼痛实验中，外周或中枢（包括鞘内和脑室内）给予MC4R激动剂α-MSH和ACTH可致痛觉过敏。而其拮抗剂HS014和SHU9119则可产生抗痛觉过敏作用。引言MC4R神经病理性疼痛具体机制？引言随着星形胶质细胞在神经病理性疼痛中的重要作用的认识，且神经元和星形胶质细胞既表达MC4R也分泌其内源性激动剂α-MSH。引言神经病理性疼痛MC4R调节星形胶质细胞的活性以及

3、促炎性因子的表达推测：为了证明以上推测：我们分别从细胞水平和动物水平在脊髓和脑（主要是中脑导水管周围灰质,PAG）两个部位对MC4R在胶质细胞的激活及其伤害性物质的释放中的作用进行了研究。实验设计分两部进行：实验一：从细胞方面研究了黑皮质素4型受体在大鼠脊髓星形胶质细胞释放兴奋性氨基酸中的作用实验二：从动物水平研究了中脑导水管周围灰质（PAG）4型黑皮质素受体在慢性坐骨神经压迫损伤引起胶质细胞激活及炎性因子分泌中的作用观察MC4R拮抗剂HS014对对肿瘤坏死因子α(TNF-α)激活的脊髓AST和吗啡慢性处理的脊髓AST释

4、放EAA的影响，以期阐明HS014在抑制疼痛和吗啡耐受与戒断反应过程中可能的作用机制。实验一第一部分：脊髓星形胶质细胞的体外原代培养及鉴定第三部分：HS014对被激活的星形胶质细胞释放兴奋性氨基酸的影响第二部分：高效液相-串联四级杆质谱(HPLC-MS/MS)方法检测兴奋性氨基酸释放第四部分：HS014对吗啡慢性处理的星形胶质细胞释放谷氨酸的影响主要研究内容实验动物1-2天新生Wistar大鼠，每批3-5只，清洁Ⅱ级。主要试剂DMEM/F12Hyclone公司，美国胰蛋白酶SIGMA公司，美国Neurobasal无血清培

5、养液Gibco公司，美国B27神经营养生长因子Gibco公司，美国10%特优胎牛血清民海生物工程有限公司单克隆兔抗鼠GFAP抗体武汉博士德生物工程有限公司封闭用正常山羊血清北京中杉FITC标记山羊抗兔IgG北京中杉多聚赖氨酸Sigma公司，美国谷氨酸标准品Dr.Ehrenstorfer公司，德国天门冬氨酸标准品Dr.Ehrenstorfer公司，德国乙腈Merk公司，色谱纯试剂醋酸铵ACROS公司，分析纯试剂纳洛酮Sigma公司，美国吗啡沈阳第一制药厂肿瘤坏死因子（TNF-α）Peptotech公司，美国HS014Pho

6、enixPharmaceutical公司，美国脊髓星形胶质细胞原代培养及鉴定原代培养的Wistar大鼠脊髓AST接种后，细胞贴壁很固，突击光滑粗大，胞体较大，胞质较丰富，形状不规则，折光性差，细胞边界清楚，随着细胞数目增多细胞间相互交叉呈网状，但细胞立体性不强，所以镜下层次感不强。星形胶质细胞免疫荧光鉴定细胞高表达星形胶质细胞的标志性蛋白—(GFAP)，发绿色荧光，蓝光是DAPI复染的细胞核。HPLC-MS/MS方法检测EAA建立了一种快速测定星形胶质细胞上清中兴奋性氨基酸释放的高效液相-串联四级杆质谱（HPLC-MS/

7、MS）方法。使用高效液相-串联四极杆质谱的多反应监测（MRM）模式快速测定星形胶质细胞（AST）兴奋性氨基酸（EAAs）的释放量。按照拟定的检测方法，检测结果如下：图1混合对照品TIC(1-天门冬氨酸，2-谷氨酸)HS014对被激活的星形胶质细胞释放兴奋性氨基酸的影响组别谷氨酸天门冬氨酸C组3.105±0.5310.336±0.047T组10.133±0.823*1.184±0.091*TH0.1组6.921±0.777#0.720±0.093#TH1组2.912±0.4333#0.427±0.053#TH10组2.28

8、5±0.375#0.237±0.029#与C组比，*P＜0.01，与T组比，#P＜0.01表2各组细胞兴奋性氨基酸的释放量（μmol/L，n=6，±s）HS014对被激活的星形胶质细胞释放兴奋性氨基酸的影响采用液相质谱联用法（HPLC-MS/MS）检测上清液中兴奋性氨基酸的含量结果见表2,与C组比较，T组Glu和As