分子生物学实验II.doc

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1、分子生物学实验II（蛋白质的表达、纯化及检测）实验一：外源基因在大肠杆菌中的诱导表达【实验目的】通过本实验了解外源基因在原核细胞中诱导表达情况。【实验原理】将外源基因克隆在使用含有lac操作子的启动子的表达载体中，让其在E.coli中表达。首先在不加诱导剂的条件下培养宿主菌，lacI基因表达的产生的阻遏蛋白LacI与lac操作子结合，从而不能进行外源基因的表达；然后向培养基中加入诱导物IPTG，此时LacI阻遏蛋白变构失活，不能与lac操作子结合，外源基因表达。【实验仪器、材料与试剂】实验仪器：超净工作台、试管、摇床、离心机等。菌株和质粒：菌株：大肠杆菌BL21；重组质粒pET-

2、30a-X：基因X与pET-30a重组。主要试剂l50mg/ml卡那霉素配10ml，用0.22μm滤膜过滤除菌，分成10份，贮存于-20℃。l1MIPTG：将2.4gIPTG溶于10mLddH2O中，用0.22μm滤膜过滤除菌，每份1ml，贮存于-20℃。lLB液体培养基胰蛋白胨（tryptone）10g酵母酵母膏（yeastextract）5gNacl10g摇动容器直至溶质完全溶解,用NaOH(1M)调节PH至7.0，加入去离子水至总体积为1L，121℃湿热灭菌20分钟。【实验步骤】1．种子液的制备挑取LB固体平板上的大肠杆菌BL21（pET-30a-X）单菌落，接种于含5μl

3、卡那霉素的5mlLB液体培养基的试管中，37℃，200rpm振荡培养过夜。(注意取菌株要在超净工作台上操作，一定注意无菌).2．转接培养取50μl菌液分别转接到两支含有5μl卡那霉素的5mlLB液体培养基试管中（1%接种量），37℃、200rpm转接培养。3.IPTG诱导表达当培养2.5小时，使其OD600值达0.6左右，开始向一支试管中加入5ul1M的IPTG（终浓度为1mM）进行诱导表达6小时，另一支试管作为对照不加IPTG。4.取样诱导表达后，取1.5ml菌液，12000rpm离心1分钟，弃上清，收集菌体沉淀。-20℃保存。实验二：蛋白质变性SDS-PAGE电泳分离实验目的

4、：分离不同分子量的蛋白质实验原理：蛋白质电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一，电泳是指带电粒子在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象。根据所采用的支持物不同，有琼脂糖凝胶电泳，淀粉凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳等。其中，聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用，样品用量少(1-100μg)，分辨率高，可检出10-9-10-12mol的样品，凝胶机械强度大，重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广泛的应用。SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。其分离原理是根据蛋白质

5、分子量的差异，因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中若含有SDS和巯基乙醇(2-ME)或二硫苏糖醇(DTT)，可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构，SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级及三级结构，并与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构；电泳样品加入样品缓冲液后，要在沸水中煮3-5分钟使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物，SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时，蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化，蛋白质也完全变性和解聚，稳定地存在于均一的溶液中，SDS与蛋白质结合后使SDS

6、-蛋白质复合物上带有大量的负电荷，平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子，这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖，远远超过其原来所带的电荷，从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计，消除了不同分子之间原有的电荷差别，其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小，这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基。样品处理液中通常加入溴酚蓝染料，溴酚蓝指示剂分子较小，可以自由通过凝胶孔径，所以它显示着电泳的前沿位置，当指示剂到达凝胶底部时，即可停止电泳（200V，45min左右）。实验材料：实验一中的诱导/未诱导表达的大肠杆菌BL21（pET-X）实验仪器:垂直板电泳仪主要试剂：蛋白质Marker3

7、0％Acr/Bis（丙烯酰胺溶液）：29.2gAcr+0.8gBis，缓慢倒入双蒸水20ml，以玻璃棒缓慢搅拌促进溶解。玻璃棒搅动幅度不要太大以免溶液底部的双丙烯酰胺浮起并扩散到空气中。完全溶解的溶液应清澈无色透明。待溶解完全后补加双蒸水至100mL，倒入无色玻璃试剂瓶中，4℃冰箱可保存10个月。1.5MTris-HCl（pH8.8）：20ml将3.63gTris碱溶于10ml去离子水中，用盐酸调pH值至8.8，用去离子水定容至20ml,贮存于4℃。0.5MTris-Hcl（PH