稳定转染细胞株的制备.doc

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1、稳定转染细胞株的制备带质粒的大肠杆菌的激活和扩增（1）取-80℃冻存的带有质粒的大肠杆菌在室温解冻，或者放置37℃恒温水中约2min,待冰完全融解即可使用。（2）LB培养基的制备按照如下配方配制胰蛋白胨(Tryptone)10g/L酵母提取物(Yeastextract)5g/L氯化钠(NaCl)10g/L用NaOH调节该培养基的pH,使其达到7.4，高温高压灭菌后室温保存，使用时加入氨苄青霉素(浓度为0.1mg/ml)（3）LB固体培养基的制备到200mlLB液体培养基加入3g琼脂混匀后高温高压灭菌，待冷却至约

2、55℃时在无菌条件下加入氨苄青霉素摇匀，分别倒入6-7个培养皿中，用封口膜封边，并倒置放于4℃保存。（4）扩增用接种环按照四线法将解冻后的工程菌涂布接种到LB固体培养基上，待凉干后，用封口膜将培养皿封闭，然后倒置于37℃恒温箱中培养过夜(不能摇晃)，根据情况可适当延长培养时间。观察培养基上的单克隆工程菌，待长出后，用接种环将一个单克隆工程菌转移接种到10mlLB液体培养基中，放入掁荡培养箱中37℃摇荡培养过夜，第二天观察，待LB液体培养基变浑浊后，4℃冰箱保存，以待进行下一步质粒的提取。质粒的提取准备质粒提取盒

3、和扩增的带质粒大肠杆菌培养液（1）取75ml扩增变浑浊的LB液体培养基置于试管中。（2）5,000×g离心10分钟，弃去上清液，将试管倒置在滤纸上空干。（3）取出质粒提取盒，用3ml细胞重悬浮液对试管中的细胞进行重悬浮。（4）加入3ml细胞裂解液，轻轻摇晃试管混匀，室温下孵育3分钟，产生白色絮状沉淀，然后加入5ml中和液混匀（5）将ClearingColumn(兰色)放入一新的50ml离心管，将上述试管中裂解后的液体倒入兰管，孵育2分钟，1500×g离心5分钟，效果不佳的话可再离心一次，离心液待用。（6）将Bi

4、ndingColumn(白色)放入一新的50ml离心管，取上述离心液倒入白管，1500×g离心3分钟，弃去离心液。（7）在白管中加入5ml内毒素清洗液(需加异丙醇)，1500×g离心3分钟，弃去离心液，在白管中再加20ml柱洗液(含有乙醇)，1500×g离心5分钟，弃去离心液后，继续1500×g离心10分钟，以保证彻底除去乙醇。（8）取出白管，在滤纸上轻敲白管顶端的尖嘴，以保证去除试管中的乙醇，并用滤纸擦去白管外壁上的乙醇。（9）把白管放入一个新的50ml离心管中，加入600μl无核酸酶的水(要把水加到白管中的

5、DNA结合膜上),然后1500-2000×g离心5分钟（10）收集离心管中的滤液，并转到1.5mlEP管中，密封，-20℃保存。提取质粒的DNA电泳鉴定（1）制胶取0.15g琼脂糖，15ml1×TAE混匀，微波炉加热20分钟，使之熔化，待自然冷却60-70℃时，加入0.25μlEB,轻轻混匀。（2）将冷却至约60℃的凝胶倒入准备好的胶床内，厚度约5mm,室温静置1h,待胶固化后，置于电泳槽中，样品端位于负极。（3）倒入1×TAE缓冲液，覆盖住胶面，拔起梳子（4）在样品中按1：6体积比加入上样缓冲液，混匀。（5）

6、在加样孔中分别加入Marker和样品。（6）盖上电泳槽，通上电，电压80v,时间约20-25min,开始电泳。（7）电泳结束，取出凝胶，照相后观察。提取质粒后浓度的测定（1）取EP管，标上记号。（2）其中一个加双重蒸馏水80μl，其余加样品80μl(样品按:提取质粒2μl，双重蒸馏水78μl混匀而成).（3）用核酸计算器测定，并记录结果。（4）经测定，PCI-neo-PDCD重组质粒的浓度为764ng/μl,PCI-neo-空质粒的浓度为524ng/μl.稳定转染细胞株的筛选（1）G418配制取1gG418,加

7、入10mlPBS溶液，浓度为100mg/ml,完全溶解后，过滤分装到1mlEP管中，密封，-20℃保存。（2）浓度梯度试验确定G418的最佳筛选浓度用培养基把G418稀释成100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/mll、700μg/ml、800μg/ml、900μg/ml、1000μg/ml不同筛选浓度。选对数期DU145细胞消化后稀释成1000-2000cell/ml细胞悬液，铺24孔板，每孔1ml，过夜使之贴壁，然后换液，换成含不同浓度G418的

8、培养基，培养10-14天，每3天换一次液，在筛选10～14天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度，筛选时比该浓度再高一个级别，维持培养时使用筛选浓度的一半（3）细胞转染。取对数期前列腺癌DU145细胞，消化后用无双抗10％血清培养液制成细胞悬液(2000cell/ml)，接种到35mm培养皿中过夜，培养到70%汇合率，进行转染。取出培养皿，吸去培养皿中的培养液，并每皿加