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《GBT 19915.5-2005 猪链球菌 2型多重 PCR检测方法》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、ICCS5307.100.30霭黔中华人民共和国国家标准GB/T19915.5-2005猪链球菌z型多重PCR检测方法ProtocolofmultiplexPCRidentificationofStreptococcussuistype22005-09-27发布2005-11-01实施率督冒瞥臀瓣譬壕臀臀暴发“GB/T19915.5-2005前片习本标准的附录A为规范性附录。本标准由国家标准化管理委员会提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标准由中国检验检疫科学研究院负责起草。本标准主要起草人：韩雪清、林祥梅、吴绍强、刘建、贾广乐、梅琳、陈国强、张敬友、姜众、唐泰山。本标准为首
2、次发布。GB/T19915.5-2005猪链球菌2型多重PCR检测方法1范围本标准规定了猪链球菌2型多重PCR检测的操作方法。本标准适用于检测生猪拭子、增菌培养物、疑似病料及猪组织样品（猪淋巴结、扁桃体、肉品等）中的猪源链球菌及猪链球菌2型。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682-1992分析实验室用水规格和试验方法。3术语和定义下列术语和定义适
3、用于本标准。3.1猪链球菌2型Streptococcussuestype2猪链球菌是属于链球菌属的一种细菌，根据其荚膜多糖抗原的差异，可分为1-34及1/2共35个血清型。猪链球菌2型是猪链球菌的一个血清型，不仅对猪致病性很强，而且可以感染特定的人群，是一种重要的人畜共患病病原菌。3.2多皿聚合阵链式反应（多皿PCR)multiplexpolymerisechainreaction多重PCR又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系中加上两对以上引物，同时扩增出多个核酸片断的PCR反应。4缩略语本标准采用下列缩略语：PCR聚合酶链式反应DNA脱氧核糖核酸dNTP脱氧核酸三磷酸
4、by碱基对5试荆和材料除另有规定外，所用生化试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682-1992的灭菌双蒸水或超纯水。5.1猪链球菌2型多重PCR反应混合物PCR缓冲液（含Mg"),2fzL;dNTP,1.6IL；引物1,0.6tLL；引物2,0.6IL；引物3,0.6juL；引物4,0.6fL；菌液1.5IiL;酶0.2KL；水12.3pL；总体积20IL,5.2TaqDNA聚合酶5.310XPCR缓冲液100mmol/LKCI，160mmol/L（NH4)ZSO4，20mmol/LMgS04，200mmol/LTris-HCIGB/T19915.5-2005(pH8.8)，1％Trito
5、nX-100，lmg/mLBSA,5.4dNTP混合液（各2.5mmol/L)5.5琼脂糖：电泳级5.6澳化乙锭5.7DNA分子量标准5.8TE缓冲液10mmol/LTris-HCl(pH8.0)，1mmol/l.EDTA,5.9核酸电泳缓冲液Tris碱242g，冰乙酸57.1mL,O.5mol/LEDTA100mL，加蒸馏水至1000mL，使用时10倍稀释。5.10电泳加样缓冲液0.25％澳酚蓝，40蔗糖。5.11样品对照猪链球菌2型菌DNA提取物分别作为阳性对照，马链球菌兽疫亚种DNA提取物为阴性对照。6仪器和设备6.1台式冷冻高速离心机（X13000r/min).6.2DNA热循环仪
6、。6.3核酸电泳仪和水平电泳槽。6.4凝胶成像系统（或紫外透射仪）。6.5可调移液器一套：10pL、20pL,200pL和1000pL,6.6恒温水浴箱。7操作方法7.1方法概要取培养菌液或从组织中提取的基因组DNA作为模板，加人到扩增猪链球菌和猪链球菌2型的PCR反应混合液中，进行PCR扩增；或直接将待检细菌培养进行PCR扩增。最后通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，与DNA标准分子量进行比较，来确定扩增产物的大小，在此基础上判定样品的检测结果。7.2样品采集在实验室生物安全柜中操作，将采集的组织样本剔除包膜和其他结缔组织，选取内部实质部分，冻存于一20℃备用。7.3组织样本DNA的制备采
7、用商品化的组织基因组DNA提取试剂盒，按说明书进行操作。7.4多孟PCR扩增将培养的细菌纯培养物样品（不经过离心）1.2yL、或者将制备的各样品DNA以及阳性和阴性对照DNA各l.5j.L分别加人到含有猪链球菌2型菌的PCR反应混合液的相应PCR反应管中〔缓冲液（含Mg2+),2pL;dNTP,1.6p.L；引物1,0.6IiL，引物2,0.6t.L，引物3,0.6I.L，引物4,0.6(AL;酶0.2tLL；加水至总体
