过表达oTLR4转基因绵羊抗布鲁氏菌病能力的评估及其机制研究.docx

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1、过表达oTLR4转基因绵羊抗布鲁氏菌病能力的评估及其机制研究Toll样受体4(Toll-likereceptor4,TLR4)是一种重要的免疫识别受体,在单核巨噬细胞,DC细胞等多种细胞中广泛表达,它识别布鲁氏菌在内的革兰氏阴性菌的LPS,引发炎症反应,在侵入病原体的感知与清除中发挥着重要作用。过表达oTLR4(ovisariesTLR4)的转基因绵羊在爆发布鲁氏菌病的疫区表现出良好的抗病潜力,因此本实验通过人工感染实验来验证过表达oTLR4转基因绵羊是否有更好的抗布鲁氏菌病的能力。通过PCR和SouthernBlo

2、t方法,对来源于3只转基因公羊的F1代群体共计289只进行了过表达TLR4基因的检测,共鉴定出阳性绵羊119只,外源基因的遗传率为41.18%,转基因阳性绵羊TLR4mRNA能够稳定高表达(平均比非转基因个体高出1.5倍)。根据遗传背景、品种、个体发育和转基因与否挑选20只转基因羊和20只非转基因羊,分成四个攻毒剂量组。利用结膜接种的方式感染布鲁氏菌16M,通过28天的综合检测来评估过表达oTLR4转基因绵羊在布鲁氏菌病急性期的抗病表现。结果低剂量(10~5和10~6CFU)和高剂量组(107,108CFU)间在急性

3、期临床表现有较大的差别。低剂量组临床症状表现不明显,个别羊出现体温升高和白细胞增多;但高剂量组,攻毒后体温出现剧烈上升,运动量出现显著下降,WBC,淋巴细胞数等相关指标在第7天后出现显著增多,其中108剂量组在第14天检测到白细胞数和淋巴细胞数转基因组显著高于非转基因组。检测外周血单核细胞的细胞因子表达量,结果显示低剂量组在攻毒后0.5天、1天、2天、3天、7天,14天和28天所有时间点均无显著变化,而高剂量组中,炎症因子升高,其中108组,攻毒后7天和14天转基因组外周血单核巨噬细胞IL6、TNFα、IL1α和IL

4、1β等炎症相关细胞因子的极显著高于非转基组,7天时趋化因子IL8也表现出转基因组的显著升高。结合肝脏,肾脏,脾脏和淋巴结等组织的病理切片,结果显示随着感染剂量的增加,实验羊的免疫反应逐渐增强,且转基因组的增强幅度大于非转基因组,在高剂量攻毒时带来了更严重的组织损伤。通过虎红检测和微量凝集实验,主要脏器和淋巴结的细菌分离,确定各组的感染情况,结果显示在10~5和10~6CFU攻毒剂量组,转基因组布鲁氏菌感染数(1/10)要少于非转基因组(3/10),通过比较载菌量和感染范围,10~5和10~6组转基因羊感染程度显著低于

5、非转基因组。而在高剂量组中,转基因羊(8/10)布鲁氏菌感染数则要高于非转基因羊的感染数(7/10)。转基因组的感染程度要高于非转基因组。通过绵羊的单核巨噬细胞侵染实验,发现M0I50时侵染后1h转基因个体载菌量极显著高于非转基因个体,显示过表达TLR4提高了巨噬细胞对布鲁氏菌的吞噬能力。IFNg、IL6、TNFα、Nos2和IL1β等炎症因子表达量极显著高于非转基因组,说明在感染过程中过表达TLR4提高了巨噬细胞的炎症反应程度。本研究验证了在低剂量侵染时,过表达oTLR4通过提高巨噬细胞吞噬能力和炎症反应程度增强了

6、抵抗布鲁氏菌病的能力,而在高剂量侵染时,过表达TLR4导致更严重的组织损伤而加重了实验羊的感染程度。