小鹅瘟诊断技术.doc

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1、小鹅瘟诊断技术1范围本标准规定了小鹅瘟诊断技术要求。本标准所规定的病毒分离方法适用于小鹅瘟病毒分离；琼脂扩散试验、中和试验和酶联免疫吸附(EIASA)试验等血清学诊断方法适用于病毒分离株的鉴定、鹅群检疫、流行病学调查和免疫鹅群抗体水平的检测。2病毒分离鉴定2.1材料准备2.1.1以无菌手术取患病雏鹅或死亡雏鹅的肝、胰、脾、肾、脑等内脏器官病料放置灭菌的玻瓶冻结保存，作为病毒分离材料。2.1.2先将病料组织剪碎、磨细，用灭菌生理盐水，或灭菌PH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)作(1：5)-(1：10)稀释，经300

2、0r/min离心30min，取上清液加入抗生素，使每毫升组织液含有2000IU青霉素和2000μg链霉素，于37℃温箱作用30min，作为病毒分离材料2.1.3将上述离心的上清液按4：1加入分析纯三氯甲烷充分混匀后放37℃温箱作用60min，或4℃冰箱过液，经3000r/min离心30min，取上清液加入抗生素，使之每毫升含有2000IU青霉素和2000μg链霉素，于37℃温箱作用30min，作为病毒分离材料。2.2病毒分离2.2.1鹅胚接种将上述病毒分离材料接种5枚12日龄无小鹅瘟抗体的鹅胚，每胚尿囊腔接种

3、0.2ml，置37℃-38℃孵化箱内继续孵化每天照胚2-4次，观察9d，-般经5d-7d大部分胚胎死亡。72h以前死亡的胚胎废弃，72h以后死亡的鹅胚取出放置4℃-8℃冰箱内过夜冷却收缩血管。用无菌手续吸取尿囊液保存和作无菌检验，并观察胚胎病变。无菌的尿囊液冻结保存作传代及检验用。2.2.2番鸭胚接种将上述病毒分离材料接种5枚12日龄无小鹅瘟抗体的番鸭胚，每胚尿囊腔接种。2ml，置37℃-38℃孵化箱内继续孵化，每天照胚2-4次，观察9d，-般经5d-7d大部分胚胎死亡。在72h以前死亡的胚胎废弃，72h以后

4、死亡的番鸭胚取出放置4℃-8℃冰箱内过夜冷却收缩血管。用无菌手续吸取尿囊液保存和作无菌检验，并观察胚胎病变。无菌的尿囊液冻结保存作传代和检验用。接种后7d内未见死亡的鹅胚或番鸭胚取出后入4℃-8℃冰箱内过夜冷却收缩血管。用灭菌手续吸取尿囊液育传-次。2.2.3病变由本病毒致死的鹅胚和番鸭胚具有相同的大体肉眼病变。绒尿膜增厚，全身皮肤充血，翅尖、趾、胸部毛孔、颈、喙旁均有较严重出血点，胚肝充血及边缘出血，心脏和后脑出血，头部皮下及两肋皮下水肿接种后7d以上死亡的鹅胚和番鸭胚胚体发育停顿，胚体小。2.3病毒鉴定用

5、鹅胚绒尿液分离病毒与已知抗小鹅瘟病毒标准血清，或抗小鹅瘟病毒单克隆抗体，在无小鹅瘟抗体的鹅胚中作中和试；用已知抗小鹅瘟病毒标准血清在易感雏鹅作保护试验；也可应用琼脂扩散试验和ELISA等方法鉴定病毒。3琼脂扩散试验3.1材料准备3.1.1标准阳性血清、抗小鹅瘟病毒单克隆抗体、标准阴性血清。3.1.2标准琼扩抗原。3.1.3被检血清，无菌手续采取血液，分离血清，按0.01%量加入硫柳汞防腐，冻结保存待检。3.1.4被检抗原：制备方法见附录A。3.1.5琼脂板：取1.0g优质琼脂或琼脂粉加100mlPH7.8的8

6、%氯化钠溶液，加热使其完全溶解后，加入1ml1%的硫柳汞溶液混匀制成3mm厚的平板。3.2操作方法3.2.1检测抗体3.2.1.1打孔将制备好的琼脂板按模板用打孔器打孔，并挑出孔中的琼脂。中心1孔，周围6孔，孔径3mm，孔距4mm，用熔化琼脂补孔底。3.2.1.2加样：中央孔加入标准琼扩抗原，1，4孔加入标准阳性血清，其他孔分别加入被检血清，或1孔加入标准阳性血清，其他孔分别加入倍增稀释被检血清。各孔均以加满不滋出为度。将加样后的琼脂板放入填有湿纱布的盒内，置20℃-25℃室温或37℃温箱，24h初判，72h

7、终判。3.2.1.3结果判定：A)当标准阳性血清孔与抗原孔之间形成清晰沉淀线时，被检血清孔与抗原孔之间也出现沉淀线，且与标准阳性血清沉淀线末端相吻合，即被检血清判为阳性。b)当标准阳性血清孔与抗原孔之间形成清晰沉淀线时，而被检血清孔与抗原孔之间无沉淀线出现时，即被检血清判为阴性。c)当被检血清最高稀释度孔与抗原孔之间形成清晰沉淀线时，即判为被检血清琼扩效价。3.2.2检测抗原3.2-2.1打孔：同3.2.1.1。3.2.2.2加样：中央孔加标准阳性琼扩血清，1、4孔加入标准琼扩抗原，其他孔加被检抗原(见附录A

8、)。各孔均以加满不溢出为度。将加样后的琼脂板放入填有湿纱布的盒内，置20℃-25℃室温或37℃温箱，24h初判，72h终判。3.2.2.3结果判定：当标准抗原孔与阳性血清孔之间形成清晰沉淀线时，被检抗原孔与阳性血清孔之间也出现沉淀线，且与标准抗原沉淀线末端相吻合，即被检抗原判为阳性。当标准抗原孔与阳性血清孔之间形成清晰沉淀时，被检抗原孔与阳性血清孔之间无沉淀线出现，即被检抗原判为阴性。4中和试验(鹅