烟草青枯病2014

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1、烟草青枯病黄俊斌教授刘海龙黎妍妍研究背景烟草是一种重要的经济作物，是烟区人民脱贫致富的主要经济来源，但是烟草的病害发生严重，尤其是烟草青枯病，几乎分布于世界上所有烤烟种植区。烟草青枯病是由茄科雷尔氏菌（Ralstoniasolanacearum）引起,1864年在印度尼西亚首先报道。该病在我国长江流域及其以南烟区普遍发生，其中以广东、福建、台湾、湖南、湖北、江西、广西东部、安徽南部、四川及贵州局部烟区为害严重，个别年份常常暴发流行，造成毁灭性损失。一、症状正常萎蔫典型症状是叶片萎蔫，部分叶片变黄，茎上出现长形黑褐色条斑，有的条斑扩展到病株顶部，根部变黑

2、腐烂。枯萎茎干变褐叶肉病变茎干变褐研究内容二、病原菌的分离和鉴定1.病原菌的分离采用稀释划线分离法。将烟草病株基部的茎杆表面用清水洗净晾干，75％的酒精表面消毒，在含有无菌水的培养皿中研磨病组织。用移菌环蘸取少量菌液在TTC培养基（青枯菌选择培养基）上划线，30℃培养48h。TTC平板培养48h后青枯菌菌株的菌落形态TTC培养基：NA培养基中加入三苯基四氮唑（TTC）.烟草青枯菌分离菌株来源菌株烟草品种地理来源菌株烟草品种地理来源XE1-1云烟87宣恩县晓关镇XF3-1毕纳1号咸丰县忠堡镇XE1-2云烟87宣恩县晓关镇XF3-2毕纳1号咸丰县忠堡镇XE

3、2-1毕纳1号宣恩县晓关镇RS1-1云烟87巴东县大支坪镇XE2-3毕纳1号宣恩县晓关镇RS1-2云烟87巴东县大支坪镇XE2-4毕纳1号宣恩县晓关镇RS1-3云烟87巴东县大支坪镇XE3-2云烟87宣恩县晓关镇RS1-4云烟87巴东县大支坪镇XE3-3云烟87宣恩县晓关镇RS2-1云烟87恩施市盛家坝乡XE3-4云烟87宣恩县晓关镇RS2-2云烟87恩施市盛家坝乡XE4-1云烟87宣恩县晓关镇RS3-2云烟87恩施市三岔乡XE4-2云烟87宣恩县晓关镇RS3-3云烟87恩施市三岔乡XE5-1云烟87宣恩县晓关镇RS4-1云烟87恩施市盛家坝乡XE5-

4、2云烟87宣恩县晓关镇RS4-2云烟87恩施市盛家坝乡XE5-3云烟87宣恩县晓关镇RS6-1云烟87恩施市龙凤镇LC1-2云烟87利川市柏杨坝镇RS6-2云烟87恩施市龙凤镇LC1-4云烟87利川市柏杨坝镇RS6-3云烟87恩施市龙凤镇LC1-5云烟87利川市柏杨坝镇RS5-1云烟87来凤县旧司乡LC1-6云烟87利川市柏杨坝镇RS5-2云烟87来凤县旧司乡LC2-1云烟87利川市柏杨坝镇RS5-3云烟87来凤县旧司乡LC2-2云烟87利川市柏杨坝镇RS5-4云烟87来凤县旧司乡LC2-3云烟87利川市柏杨坝镇RS7-1云烟87鹤峰县燕子乡LC2-4

5、云烟87利川市柏杨坝镇RS7-2云烟87鹤峰县燕子乡XF1-1毕纳1号咸丰县忠堡镇RS7-3云烟87鹤峰县燕子乡XF1-2毕纳1号咸丰县忠堡镇RS7-4云烟87鹤峰县燕子乡XF1-3毕纳1号咸丰县忠堡镇RS8-1鄂烟1号建始县高坪镇XF2-1毕纳1号咸丰县忠堡镇RS8-2鄂烟1号建始县高坪镇XF2-2毕纳1号咸丰县忠堡镇RS8-3鄂烟1号建始县高坪镇XF2-3毕纳1号咸丰县忠堡镇RS8-4鄂烟1号建始县高坪镇2病原菌的纯化和保存从TTC培养基上挑取呈不规则圆形，中心淡粉红色，周围白边较宽，流动性强的单菌落进行纯化，2-3次后，用接种环挑取少量细菌于灭菌

6、水中20℃保存。3青枯菌的分子鉴定通过常规PCR，利用青枯菌种的特异性引物759／760，对分离获得的菌株进行分子鉴定，根据扩增结果来确定是否为青枯菌。引物序列：759：GTCGCCGTCAACTCACTTTCC760：GTCGCCGTCAGCAATGCGGAATCGPCR扩增采用25μL反应体系，其中10×PCRbuffer2.5μL，Taq酶2U，MgCl21.5mM，dNTPs200µM，引物759和760各1µL，DNA5µL。反应程序为：95℃2min；94℃20s，3068℃30s，72℃30s；72℃延伸10min。3.青枯菌的分子鉴定结

7、果扩增结果表明：所有分离获得的供试青枯菌菌株均可扩增得到280bp左右的特异性片段。分离菌株的特异性PCR鉴定结果注：1-22、24-46分离的烟草青枯菌；23：阴性对照；M：1000bpMarker（自上而下片段大小分别为：1000bp，700bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp）280bp280bp280bp三、烟草青枯菌菌系分化研究1.青枯菌生理小种鉴定供试菌株：从湖北恩施地区烟草青枯病病株上分离的54个青枯菌菌株。鉴别寄主：烟草、番茄、茄子、马铃薯、花生和辣椒接种方法：1mL细菌悬浮液（浓度为108cfu／mL），注

8、射到5-7叶期的寄主茎基部。培养条件：温度30℃，相对湿度80%以上。小种划分：接种7天后，调