菌落pcr资料66534

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1、菌落PCR资料66534菌落PCR资料.txt偶尔要回头看看，否则永远都在追寻，而不知道自己失去了什么。男人掏钱是恋人关系，女人掏钱是夫妻关系，男女抢着掏钱是朋友关系。男人爱用眼睛看女人，最易受美貌迷惑；女人爱用心看男人，最易受伤心折磨。菌落PCR资料.txt28生活是一位睿智的长者，生活是一位博学的老师，它常常春风化雨，润物无声地为我们指点迷津，给我们人生的启迪。不要吝惜自己的爱，敞开自己的胸怀，多多给予，你会发现，你也已经沐浴在了爱河里。菌落PCR（ColonyPCR）方法作者：未知来源：生物秀时间：2007-7-2

2、1菌落PCR（ColonyPCR）可不必提取基因组DNA，不必酶切鉴定，而是直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，省时少力。建议使用载体上的通用引物。通常利用此方法进行重组体的筛选或者DNA测序分析。最后的PCR产物大小是载体通用引物之间的插入片断大小。具体方法：1、PCR混合物的制备Taqbuffer（10×）20uldNTP（2.5mM）5ulPrimerForward（50mM）10ulPrimerReverse（50mM）10ulddH2O147ulTaq（2U/ul）8ultotal200ul将上述

3、溶液混匀，10ul每管分装于200ulPCR管中。2、常温下随机挑选转化板上的转化子，用灭菌的牙签或枪头挑取少量菌体，在LB琼脂糖平板上轻点，做一拷贝；然后将沾有菌体的牙签或枪头置于相应的装有PCR混合物的PCR管中洗涤数下（管子做好记号，如平板上点的是1＃，则管子上也标1＃，以便筛选到克隆后的扩到培养），盖紧管子。3、将混有菌体的PCR混合物置于PCR仪中，按常规条件扩增。电泳检测是否得到目的片断。如有则为阳性克隆。4、将已经接种有菌落的平板置37℃培养箱培养过夜，使菌落扩增；次日挑选阳性克隆做进一步筛选或培养。步骤2

4、也可以不点板，直接接种摇菌，如果早上做PCR的话，下午就可以提质粒，得到重组载体。注意事项：设计引物很关键。一般如果是定向克隆，用载体上的通用引物即可；如pET系列可用T7通用引物。如果是非定向克隆（如单酶切或平末端连接），一条引物用载体，一条引物用目的基因上的，这样就可以比较方便的鉴定了，而且错误概率很低。PCR条件的选择接近最佳，同时挑取的菌体不宜太多，否则会有非特异性扩增。ColonyPCRAmplifySSLPmarker(CER454202)from51MO5Agrostreaks.E.coli51M5stre

5、akusedaspositivecontrol.AgroandE.colistreakof79E22usedasnegativecontrol.1.Mix10μlNEBTaqbuffer+90μlH2O.Aliquot10μlofthemixintoPCRtubes.Labelwiththesamplename.ToucheachstreakwithtoothpickandtransfercellstothebufferinthePCRtubes.2.PreparePCRmixonice:________________

6、_________________________________________ForeachsampleyouneedFor8samplemix___________________________________________________________________17μlH2O17μlH2O4μlNEBTaqbuffer32μlNEBTaqbuffer5μl2.5mMdNTPs40μlmMdNTPs7μlCER454202Fprime(3μM)56μlCER454202Fprime(3μM)*7μlCE

7、R454202Rprime(3μM)56μlCER454202Rprime(3μM)**0.2μlTaqpolymerase(NEB)1.6μlTaqpolymerase(NEB)___________________________________________________________________Add38μlofthemixtoeachPCRtubeandmixgentlybypipetting.3.RunPCR:95℃5min95℃30sec,52℃30sec,72℃1min,40cycles72℃1

8、0min*2.1μlCER454202Fprime(3μM)16.8μlCER454202Fprime(3μM)**2.1μlCER454202Rprime(3μM)16.8μlCER454202Rprime(3μM)菌落PCR资料菌落PCR菌落PCR与我们通常的普通DNA的PCR的不同在于，直接以单个菌作为模板。是