石蜡切片和免疫组化方法

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1、石蜡切片步骤取材：将目标组织样按要求修剪至一定大小。固定：用10%的福尔马林溶液固定组织样4-6h。脱水：梯度酒精50%2h70%2h80%2h95%2h95%2h100%40min100%40min透明：二甲苯Ⅰ8min二甲苯Ⅱ5min（观察组织，透明度较好为宜）浸蜡：（蜡温保持在60℃）软蜡Ⅰ50min软蜡Ⅱ50min硬蜡Ⅰ50min硬蜡Ⅱ50min硬蜡包埋切片：组织化学切片4μm常规切片5μm烘片：65℃脱蜡至水：二甲苯Ⅱ5min二甲苯Ⅰ5min梯度酒精至水100%3min100%3min95%3min95%3min80%3min70%3min5

2、0%3min染色：1.常规HE染色苏木素10min自来水洗5min盐酸酒精分化10s自来水洗返蓝10min伊红1min自来水洗5mins蒸馏水1mins2.免疫组织化学染色1.抗原的修复：柠檬酸缓冲液95℃。time2.消除内源性过氧化物酶：3%的H2O2的甲醇溶液孵育3min。PBS（10mM磷酸钠，150mM的氯化钠，pH7.4）洗涤3*3min3.封闭：5%BSA封闭30min。洗涤3*3min4.加生物素标记的凝集素：用生物素标记的凝集素溶在大约2-20μg/ml（梯度稀释的以找到最合适的浓度）的PBS中，加在切片上然后在室温下孵育30min。

3、TPBS洗涤3*3min。1h混合ABC5.ABC试剂孵育30min。（现配）TPBS洗涤3*3min。6.加辣根过氧化物酶标的亲和素：加在切片上后在室温下孵育30min。TPBS洗涤3*3min。7.显色DAB：含3%的H2O2的DAB显色10min。TPBS洗涤3*3min。结合镜下观终止反应，蒸馏水冲洗。苏木精衬染10min蒸馏水洗涤5min盐酸酒精分化10s（视颜色而定）自来水返蓝4min梯度酒精脱二甲苯水透明封片光镜下染色计数，清洁，封片。梯度酒精脱水：50%2min70%2min80%2min90%2min95%2min100%2min10

4、0%2min透明：二甲苯Ⅰ3min二甲苯Ⅱ3min封片：中性树胶显微镜计数：数据统计：结论分析与讨论：试剂均用双蒸水溶解苏木精的配置（Ehrlich）苏木精2g95%乙醇100ml溶解后依次加入蒸馏水100ml纯甘油100ml甲矾3g冰醋酸10ml上液混合后呈淡红色。将瓶口用纱布包好经常摇动，两周成熟，此时为暗红色的液体。此液体中的冰醋酸有防止组织过染的作用，同时使得溶液易保存。优点性能稳定染色均匀，不发生沉淀，可长期使用。伊红的配置1.水溶性伊红伊红5-10g蒸馏水1000ml冰醋酸10滴2.酒溶性伊红5-10g70%-90%乙醇1000ml冰醋酸1

5、0滴盐酸酒精的配置（1%）浓盐酸1ml70%乙醇99ml磷酸盐缓冲液的配置ANaH2PO4.12H2O31.2g溶于1000mlH2OBNa2HPO4.12H2O71.63g溶于1000mlH2O工作液：同时取A液19ml+B液81ml稀释至1000ml加入9gNaCl0.5928gNaH2PO4.12H2O5.8gNa2HPO4.12H2O8.5gNaCl溶于1L水中pH6.0的柠檬酸钠修复液的配置A（0.1M柠檬酸）21.01g，溶于1000mlB（0.1M柠檬酸钠）29.41g，溶于1000ml工作液：9mlA+41mlB+H2O450ml=50

6、0ml工作液生物素标记的大豆凝集素的配置1mgSBA稀释于200μl水中。取适量稀释至10μg/ml。5μl稀释液+2495μlH2O配置2500μl封闭液的配置BSA5%+卵白素？DAB试剂的配置30μgImmPACTDABChromogen+1mlImmPACTDiluent充分混匀。ABC试剂的配置2滴（100μl）试剂A+10ml缓冲溶液，于ABC试剂混合瓶中。2滴（100μl）试剂B置于混合瓶中。立即混合均匀。充分反应30min后进行使用。