【精品】PCR扩增实验

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1、PCR扩增实验原理：利用特异的引物，以重组质粒pGEX-4T-1（His）6-C-X为模板扩增X基因。扩增反应1）扩增引物2）模板：重组质粒pGEX-4T-1（His）6-C-X3）PCR反应试剂盒（购置）4）50×TAE缓冲液：242gTris碱57.1ml冰醋酸100ml0.5MEDTAH2O补充至1000ml5）6×凝胶加样缓冲液：0.25％溴酚兰，0.25%二甲苯青FF，40%蔗糖，4℃保存6）溴化乙锭保存液：10mg／ml，避光保存7）0.8％琼脂糖凝胶：0.8克琼脂糖加热溶于100ml1×TAE。1.材料1)按以下次序，将各成分在0.5ml灭菌离心管内混合：(100ul)ddH2

2、O79ul10×扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物，2ul(终浓度为0.2mmol／L)MgCl26ul(终浓度为1.5mmol／L)引物11ul(终浓度为50pmmol／L)引物21ul(终浓度为50pmmol／L)模板DNA1ul2)100℃加热反应混合液10分钟，冰浴5′，使DNA完全变性。3)将1ulTaqDNA聚合酶(5单位/ul)，加入反应混合液中。4)用100ul石蜡油覆盖于反应混合液之上，防止样品在反复加热-冷却的过程中蒸发。2.操作步骤5）按以下方法进行PCR反应：常用循环参数：①变性：94℃1分钟、②退火：55℃1分钟、③延伸：72℃1分30个循环。6)制备1.5％琼脂

3、糖凝胶板：将1.5％琼脂糖凝胶置微波炉中溶化,稍等冷却，倒入制胶槽中，充分凝固后拔出样品梳；7)将凝胶板放人电泳槽，加入1×TAE缓冲液，使液面略高于凝胶。8)从反应混合液中取出DNA扩增产物2ul并加1ul6×凝胶加样缓冲液，混匀后全部加入凝胶板的样品孔中进行电泳。9)电泳100V约1小时；10)在500ml水中加入溴化乙锭保存液,(EB终浓度0.5-1ug/ml),混匀；11)将疑胶轻轻滑入染色液，染色20-30分钟；12)取出凝胶，用水稍漂洗；13)紫外灯下确定DNA区带。由于PCR能够使DNA分子大量扩增，所以应当注意防止反应体系被痕量DNA模板污染(Kwok和Higuchi，198

4、9)。尤其在待扩增靶序列浓度低的情况下，更有必要采取防备措施。注意事项1)在装有紫外灯的层流式工作台内吸加PCR试剂和进行反应。不用时应打开紫外灯。工作台内应配置有PCR专用的微量离心机、一次性手套、整套移液器和其他必需品。自动移液器的管部是常见的污染源，配液和移液时应当使用一次性吸头和活塞的正向排液式移液器。所有缓冲液、吸头和离心管使用前必须经过高压处理。2)准备成套试剂，分装为小份，在靠近工作台的冰箱中设立专门位置来保存。配制试剂时，用从未接触过任何DNA的新玻璃用具、塑料用具和移液器。使用后将这一小份全部废弃，不得重新置存。3)装有PCR试剂的微量离心管打开之前，应先在专用工作台内的微

5、量离心机上作瞬时离心(10秒)。使液体沉积于管底，减少污染的机会。4)加完所有其他反应成分、包括防止蒸发用的矿物油后才吸加模板DNA。模板加入微量离心管后