茉莉酸信号途径在小麦抗白粉病反应中的作用

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河南农业大学硕士学位论文题目茉莉酸信号途径在小麦抗白粉病反应中的作用学位申请人姓名吕桂珍导师姓名牛吉山研究员学科专业遗传学研究方向植物分子遗传学中国郑州2013年5月 分类号密级河南农业大学硕士学位论文论文题目：茉莉酸信号途径在小麦抗白粉病反应中的作用英文题目：Theroleofjasmonicacidsignalpathwayinwheatpowderymildewresistance学位申请人：吕桂珍导师：牛吉山研究员专业：遗传学研究方向：植物分子遗传学论文提交学位授予日期：日期： 河南农业学学位论文独创性声明、使用授权及识产权属承诺书＿Ｐ￥￥＾￣￣学位ｉ仑茉莉酸信号途径在小麦抗学位白粉病反应中的作｜｜硕士ｔ顧用级别学生ａｔｔｉＡ，学科、虫杜料导师吕桂珍｜｜遗传学牛吉山！姓名专业姓名｜如需保密，解密时间是否保密独创性声明本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料一同工作的同志对本研究所做的任何贡献，指导教师对此进行了审定。与我。均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意特此声明。研究生签名：各称＿导师签名：ｆ邊办Ｈ期：ＫＧ年（月曰曰期年／月曰／，学位论文使用授权及知识产权归属承诺本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷本和电子版本，并提供目录检索和阅览服务，可以釆用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同、媒体上发表传播学位论文的全部或部分内容。本人完全了解《河南农业大学知识产权保护办法》的有关规定，在毕业离一幵河南农业业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第署名单位业为河南农大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河南农注大学所有，否则，承担相应的法律责任。：研：保密学位论文在解密后适用于本授权书。究生签名：其导师签名：学院领导签名ｆ曰期：月ｊ曰曰期：知丨＾月曰曰期少冷年＾ 致谢本论文是在我的导师牛吉山研究员的亲切关怀和悉心指导下完成的。牛老师以其严谨求实的治学态度、深厚广博的学术造诣、高度的敬业精神、兢兢业业、孜孜以求的工作作风和勤劳的工作精神对我产生了重要影响，从研究课题的设计、实施到数据的处理、论文的写作和定稿都倾注了大量的心血和精力，衷心感谢牛老师在生活上对我的关心。河南农业大学生命科学学院吴建宇教授、汤继华教授、刘文轩教授，河南农业大学国家小麦工程技术研究中心的郭天财教授、尹钧教授、李巧云老师、牛洪斌老师、李冬兵博士、冯雅岚博士、马超博士和河南农业科学院经济作物所赵付安博士等为我的研究进行了指导、给予了帮助，在此表示感谢。师姐倪永静、刘靖，师兄王正阳、马文斌、同门王丽、师妹邢晓川，师弟沈椿才、秦召、段宗彪以及实习生宁存、杨文化、勾慧娟、李素梅、刑付浩、胡平、张海旭、邢杨菲、毕燕在实验中给予支持，在生活中给予帮助。在此表示诚挚的谢意！三年的时间让我们之间建立了深厚的友谊。本研究部分实验在河南省出入境检验检疫局技术中心理化实验室完成，感谢局领导和技术中心郭俊峰老师、孙武勇老师、实验员赵冰琳、孙转莲、张丽在实验过程中给予大量帮助和支持，为实验方案提出了宝贵的意见。还要感谢生命科学院生物化学系张晓霞老师、郭红祥老师在仪器使用上提供的帮助。感谢河南农业大学生命科学学院的各位老师3年以来对我的培养。感谢10级的全体硕士研究生，感谢他们在学习和生活中给我的大量支持和帮助。感谢我的家人和好友们在学习、生活上对我的支持、照顾和帮助，是他们强有力的支持，才使我顺利地完成了学业。最后，对参加本论文评议、评阅及对本论文提出宝贵意见的所有专家表示最诚挚的谢意。吕桂珍2013年5月于郑州 目录摘要...................................................................................................................................................11文献综述.........................................................................................................................................21.1植物抗病机制......................................................................................................................21.1.1病原菌致病的分子基础...........................................................................................21.1.2植物的防卫系统.......................................................................................................21.1.2.1植物的抗病基因和防卫基因.......................................................................31.1.2.2病程相关蛋白................................................................................................31.1.3植物的诱导抗性.......................................................................................................41.1.4茉莉酸类物质与植物抗病反应的关系...................................................................41.1.4.1JAs的生理作用及其对逆境胁迫的抗性作用..............................................41.1.4.2茉莉酸信号途径与其他信号途径的联系....................................................51.2小麦白粉病及其抗病机制研究现状.................................................................................61.2.1小麦质量和数量抗白粉病遗传...............................................................................61.2.2茉莉酸与小麦抗白粉关系研究进展......................................................................71.3相关研究技术......................................................................................................................71.3.1小麦叶片内源茉莉酸测定方法研究......................................................................71.3.1.1液相色谱质谱质谱法技术概述....................................................................71.3.1.2液相色谱质谱质谱技术基本术语................................................................81.3.2小麦基因组测序研究进展......................................................................................82引言...............................................................................................................................................93材料与方法...................................................................................................................................103.1供试材料............................................................................................................................103.1.1植物材料.................................................................................................................103.1.2小麦白粉菌菌株.....................................................................................................103.2主要仪器及供试试剂........................................................................................................103.2.1仪器.........................................................................................................................103.2.2试剂.........................................................................................................................103.3试验方法............................................................................................................................103.3.1茉莉酸甲酯处理.....................................................................................................103.3.2白粉病菌诱导处理.................................................................................................113.3.3白粉病鉴定.............................................................................................................113.3.4小麦叶片内源JA的提取与测定..........................................................................123.3.4.1小麦叶片JA提取和甲酯化........................................................................12I 3.3.4.2小麦叶片JA检测........................................................................................123.3.4.3标准曲线的的建立......................................................................................133.3.4.4液相色谱质谱-质谱法方法评价................................................................133.3.5小麦叶片RNA的提取和cDNA合成................................................................133.3.5.1小麦叶片RNA提取...................................................................................133.3.5.2小麦叶片cDNA第一条链的合成..............................................................143.3.6实时荧光定量PCR................................................................................................143.3.6.1PCR引物的设计..........................................................................................143.3.6.2荧光定量PCR.............................................................................................153.4数据分析方法....................................................................................................................154结果与分析...................................................................................................................................164.1外源茉莉酸对小麦白粉病抗性的诱导作用...................................................................164.2小麦叶片总RNA的质量检测.........................................................................................174.3实时荧光定量PCR扩增效果..........................................................................................174.4外源茉莉酸对小麦抗病相关基因表达的诱导作用.......................................................194.5茉莉酸诱导抗性与抗病相关基因表达间的关系...........................................................224.6白粉菌侵染对小麦叶片内源茉莉酸含量的影响...........................................................234.6.1茉莉酸甲酯标准曲线的的建立............................................................................234.6.2接种白粉病菌后各种小麦幼苗叶片内源JA含量变化......................................244.7白粉菌侵染对小麦白粉病抗性的诱导作用...................................................................264.8白粉菌侵染后内源MeJA与抗病相关基因表达间的关系...........................................305结论与讨论...................................................................................................................................315.1结论....................................................................................................................................315.2讨论....................................................................................................................................31参考文献...........................................................................................................................................34II 茉莉酸信号途径在小麦抗白粉病反应中的作用摘要小麦白粉病是由小麦白粉病菌（Blumeriagraminisf.sp.tritici）引起的小麦病害之一，可致小麦减产13%～34%。研究抗小麦白粉病的主要信号分子途径有助于了解小麦的抗病分子机制，开拓小麦的抗病遗传改良新途径，从而提高小麦抗病性，保证小麦稳产高产。本试验通过研究外源茉莉酸、白粉菌诱导后抗病相关基因表达和内源茉莉酸含量变化来了解小麦茉莉酸信号途径在小麦抗白粉病反应中的作用，为小麦抗病育种提供理论依据。主要结果如下：1、以不同类型感、抗白粉病小麦品种Chancellor（不携带任何抗白粉病基因）、Asosan/8Cc（Pm3a）和PIC427（Pm21）为材料，外施1.0mmol/L茉莉酸甲酯对小麦幼苗叶片进行诱导，通过离体叶段培养法接种白粉菌进行抗性鉴定、采用荧光定量PCR分析抗病相关基因表达，结果表明茉莉酸诱导可显著激活PR1、PR2、PR3、PR4、PR5、PR9、PR10、Ta-JA2等抗病相关基因的表达，对Ta-GLP2a的表达影响很小；PR2、PR3、PR4、PR10在3种感、抗小麦白粉病品系中起主要抗病作用。2、小麦白粉菌侵染携带显性抗病基因的高抗品种09X15（Pm21）、PIC419（Pm13）、09M5（Pm45）和携带隐性抗病基因的高抗品种兰考90（6）（PmLK906），用优化的液相色谱质谱-质谱法检测接种白粉病菌后小麦幼苗叶片内源茉莉酸含量变化，结果表明白粉菌侵染后高抗白粉病小麦叶片内源茉莉酸含量达差异水平且都有所提高，在0～12h快速上升，在2～4h出现峰值，随之下降，且各种不同显、隐性高抗白粉菌材料的内源茉莉酸含量变化趋势一致；用荧光定量PCR分析，证明小麦白粉菌侵染后可显著激活抗病相关基因PR1、PR2、PR3、PR4、PR5、PR9、PR10、Ta-JA2的表达，对Ta-GLP2a的表达作用很小；Ta-JA2、PR4、PR3、PR5、PR9、Ta-GLP2a在4种高抗小麦白粉病品系中起重要抗病作用，在显性免疫小麦白粉菌品系中Ta-JA2都起了一定重要抗病作用，在隐性抗白粉病小麦品系中起主要抗病作用的是PR9。3、抗病相关基因的表达变化与不同来源的小麦专化识别关系大。4、PR3、PR4在小麦抗白粉病反应中抗病作用最大。5、内源茉莉酸含量峰值出现在接种白粉病菌后2～4h，抗病相关基因的表达峰值出现在12～48h，推测白粉菌侵染激活了茉莉酸信号转导途径，进而激活了抗病相关基因的表达。综上试验结果表明，外源茉莉酸和白粉菌诱导都可激活抗病相关基因的表达；白粉菌侵染小麦致使内源JA含量增加，可能会诱导小麦启动茉莉酸信号传导途径，JA信号放大，激活抗病相关基因的表达，从而使小麦产生诱导防御机制。试验证明JA是小麦白粉病抗性反应的信号分子，PR3、PR4在小麦抗白粉病反应中起主要抗病作用。关键词：小麦；白粉菌；茉莉酸（JA）；抗性；液相色谱质谱-质谱1 2013年河南农业大学硕士毕业论文1文献综述1.1植物抗病机制2005年Altpeter等[1]指出植物抗病是一个极其复杂的事件，受复杂的信号网络控制，涉及的基因很多，表型很多。植物抗病性的表现是在长期的进化过程形成的，是在特定的环境影响下寄主植物的抗病性基因和病原物的致病基因相互作用的结果。所以，植物的抗病性不仅决定于植物的种类（即本身的基因型），而且取决于病原物的基因型。在寄主和病原物相互作用中，植物的抗病性表现程度有阶梯性差异，可以分为轻度抗病、中度抗病、高度抗病或完全免疫。一种植物或一个植物品种的抗病性，一般都由综合性状构成，基因控制每一性状。在病原物侵染寄主植物前和整个侵染过程中，植物以多种因素、多种方式、多道物理和化学防线来防御病原物的侵染。植物抗病性的常用分类方法有：①按侵染程序分为避病、抗病（包括抗侵入、抗扩展、抗繁殖）、耐病（耐损害）和抗再侵染（获得抗病性）。②按抗病性因素和机制分为既存抗病性状（侵染前已形成或存在的性状），即形态抗病性、组织抗病性、生理生化抗病性等，以及保卫反应（植物受侵染后被诱导而产生的抵抗反应），即过敏性坏死反应、产生植保素、木栓化反应、溶菌反应等。③按控制抗病性的基因数分为单基因抗病性、寡基因抗病性和多基因抗病性；或按基因的效应分为主效基因抗病性（单基因或寡基因抗病性）和微效基因抗病性（多基因抗病性）。④按对病原物小种的专化性分为小种专化抗病性和非小种专化抗病性，前者又称垂直抗病性，指植物只能抗病原物的某些小种，而不抗其他小种，后者又称水平抗性，指植物对病原物不同小种的抗性没有显著的差异。1.1.1病原菌致病的分子基础植物对病原菌的反应有两大类：抗病和感病。抗病反应又称非亲和反应，主要特征是寄主抗病和病原菌无毒，寄主抑制、排斥病原菌，使病害不发生或受到限制；感病反应又称亲和反应，主要特征是病原菌有毒和寄主感病，使植物发病严重[2]。研究发现，致病基因决定寄主与病原菌之间亲和互作关系的建立，从而影响植物正常生长。致病基因主要包括三大类：（1）毒性基因，该类基因调控病害的发生和发展。有些毒性基因直接编码致病因子，如胞外多糖和胞外降解毒素；有些毒性基因的产物与病原菌侵染过程中的生长发育和代谢调控有关；另一些毒性基因的产物目前还不清楚，但其在病原菌侵染过程中发挥重要作用。（2）寄主范围决定基因，该类基因能决定和扩大病原菌的寄主范围，使本来抗病的植株也变成易感植株。（3）无毒基因，该类基因对带有相应抗病基因的寄主表现出特异不亲和性。它不仅决定病原菌小种特异性，还在更高水平上决定病原菌致病变种的特异性[3～4]。1.1.2植物的防卫系统植物在生长过程中总是受到大量潜在病原物的危害。在长期的进化中，植物形成了一套复杂的抗病体系。由于植物没有循环系统，因此，即使细胞间的防卫是部分或系统协调的，每一个细胞都必须具备一定的防卫能力[5]。植物的防卫系统可分为两大类：预存的防卫系统（如木质素、角质、小分子抗病原物）和诱导防卫系统（分为局部获得抗性、系统获得抗性、诱导的系统抗性），其中诱导防卫系统属于植物主动的抗病反应。2 茉莉酸信号途径在小麦抗白粉病反应中的作用1.1.2.1植物的抗病基因和防卫基因寄主对病原物识别、启动限制病原物侵染的防卫能力决定植物的抗病性[6]。从广义上讲，植物抗病基因与防卫反应基因都是在植物抗病反应过程中起防御病菌侵染及扩展的相关基因。植物的抗病基因，是Flor经典遗传学基因对基因假说中所指的与病原菌无毒基因相对应的，存在于植物特定品种中，在植物生长的整个周期或其中某个阶段为组成型表达的植物抗病品种所特有的一类基因。植物防卫反应基因的特点是在抗病和感病品种中均存在，只是感病植株中的防卫基因相对抗病植株被激活得慢和表达微弱，其差异主要体现在基因表达的时间、空间及产物含量的不同，为组成型或诱导型表达的一类基因。有的防卫基因产物对病原菌增殖起抑制作用，有的参与木质素、植保素等化学防卫物质的生物合成。还有一些诱导性的防卫反应实则是原有蛋白的激活而不是基因的诱导表达[7]。有些防卫基因在抗病基因的下游起作用，通过一个或多个信号转导途径调控植株的抗病机制[8]。还有些防卫基因是组成型表达的或病原菌诱导的。值得注意的是，抗病基因与感病基因是相对的。事实上抗病与感病基因都是植物正常生长代谢所必需的，只是在病原菌侵染植株后二者才表现出这种对立的功能。1.1.2.2病程相关蛋白1970年，Loon和Vankammen在烟草花叶病毒（TMV）侵染的烟草叶片中检测到与过敏性反应（HR）相关的蛋白，命名为病程相关蛋白（Pathogenesis—relatedproteins），简称为PRs。之后，PR蛋白在广泛植物品种中得到深入的研究，包括病程相关蛋白的种类、在植物细胞中的分布、物理化学性质及分子生物学功能等方面的研究，以此了解其在植物防卫中的机制从而为研究者提供新的增强植物抗性的工具[9]。目前，PR蛋白包括“在病理的和相关条件下诱导的所有植物蛋白，它们被依照一级结构、血清学关系、酶学或生物学活性划分为不同的家族”[6]。病程相关蛋白是由植物寄主基因编码，在病原菌侵染后产生的一类蛋白质。植物类病毒、病毒、细菌、真菌、能诱导类似胁迫条件的化合物都可以诱导病程相关蛋白的合成。到目前为止，已在30多种植物中发现病程相关蛋白能在一定程度上抑制病原菌的生长、繁殖和扩散。病程相关蛋白按照其生物学活性、血清学关系和（或）酶、氨基酸序列进行分属，每一种或每一个品种按照它们在SDS-PAGE中的迁移率进行编号，病程相关蛋白的编码基因仍按照植物基因命名委员会规则命名。对于大多数PR家族成员，其功能是已知的或能够根据其蛋白结构和酶特性推导出来的。PR1是病原或水杨酸（salicylicacid，SA）诱导的最重要的一类病程相关蛋白，通常作为系统获得抗性（SAR）的标志。尽管PR1是最早分离和鉴定的，但其功能仍不清楚。PR2是内源ß-1,3葡聚糖苷酶，能作用于真菌细胞壁，故具有抗真菌功能。PR3，4，8，11均为内源几丁质酶，能水解真菌细胞壁结构，故具有抗真菌功能。PR5为类甜蛋白，具有葡聚糖酶活性，能与真菌细胞壁成分ß-1,3葡聚糖苷酶结合并将其降解。研究报道一个马铃薯的PR5（22kDa），与肌动蛋白和碱性几丁质酶（32kDa）结合，推测该蛋白复合体参与胞质凝集，参与马铃薯晚疫病的抗病反应[10]。PR6为蛋白酶抑制剂，暗示能防御昆虫和其他食草类、微生物类和线虫。PR7至今仅在番茄中发现，是主要的PR蛋白，为内源蛋白酶。因水解真菌细胞壁常需降解细3 2013年河南农业大学硕士毕业论文胞壁、水解几丁质和葡聚糖，故PR7有助于抗真菌。PR9为过氧化物酶，在催化木质化强化植物细胞壁中起作用，从而抵抗微生物的攻击。PR10的结构与核糖核酸酶相似，这些胞外型PRs可能具有抗病毒活性[11～12]。PR12为植物防卫素，是植物防卫反应的重要成分，具有抗真菌活性。PR13为硫堇蛋白，碱性的富含胱氨酸的毒性小分子蛋白，通过影响病原菌的细胞膜通透性来达到抗菌效果。PR14为脂转移蛋白，是一类分泌蛋白，曾被认为是在体外膜间进行脂质转移的蛋白，因其作用对象很广泛，所以又称非特异性LTP（non-specificlipidtransferproteins,nsLTPs）。许多研究发现nsLTPs可能参与多方面的植物细胞与生理生化反应包括参与角质层的合成和胚胎的发育、适应各种胁迫环境、抗病原菌等。在小麦中，水杨酸、2,6-二氯异烟酸（2,6-dichloro-isonicotianicacid,INA）、苯并噻唑类制剂[如benzo（1,2,3）thiadiazole-7-carbothioicacidS-methylester（BTH）]诱发一组完全不同于双子叶植物的PR基因，这些被称为WCI的基因（wheatchemicallyinducedgenes）编码脂氧合酶及富含硫元素的蛋白，WCI基因表达与小麦白粉病抗性产生密切相关，大麦新的PR家族中的两个成员与其中的某些有同源性，可能成为PR15[13]。1.1.3植物的诱导抗性植物具有很好的通过特殊的和可诱导的防御反应来应答外界胁迫的机制。植物在病原菌或非病原菌如机械伤害、化学制剂等胁迫后产生的抗性称为诱导抗性。植物对病原菌的诱导抗性可分为三大类：（1）局部获得抗性（localacquiredresistance,LAR）描述的是植物识别非亲和病原菌（非寄主或小种专化抗性），与病原菌直接接触的细胞程序化过敏死亡，导致启动近于广谱的防卫反应。这种过敏反应使植株获得几种形式的诱导抗性，包括局部获得抗性和系统获得抗性[14]。大麦在非寄主或非亲和白粉菌诱导下即可产生局部抗性[15]。（2）系统获得抗性（systemicacquiredresistance,SAR）描述的是植物在最初局部侵染点以外产生的抗性[16]，是植物抗病性的一种重要表现形式。系统获得抗性具有系统性（表现在植株的非诱导因子处理部位）、持久性（可维持几周甚至几个月）、广谱性（抑制病毒、细菌、真菌等病原菌所致的病害）等三大特点。SAR涉及病程相关蛋白的产生。（3）诱导的系统抗性（InducedSystemicResistance,ISR）由促进植物生长的根际细菌诱导的系统抗性。ISR是由ET和JA敏感途径产生的，不涉及PR蛋白的表达，没有对应的PRs积累和不依赖与SA的积累，与寄主抗性相关[17]。目前，对ISR的研究还很少[18]。1.1.4茉莉酸类物质与植物抗病反应的关系1.1.4.1JAs的生理作用及其对逆境胁迫的抗性作用以JA和MeJA为代表的茉莉酸类（JAs）广泛存在于高等植物体内，具有调节植物生长发育、光合特性、逆境胁迫抗逆反应等重要作用。许多研究表明，JAs在逆境胁迫反应中是启动植物防卫基因表达的信号传递的必要组成部分[19～20]。JAs能抑制植物生长，抑制种子和花粉粒的萌发，促进4 茉莉酸信号途径在小麦抗白粉病反应中的作用叶片和果实的衰老，加速细胞的分裂和膨大，促进气孔的关闭，诱导禾本科植物的颖花开放；此外还能调节植物的光合作用和呼吸作用及保护酶活性[21～22]。MeJA主要是在外部起作用，诱导邻近植株的防御反应。而JA负责植物体内长距离的信号转导，诱导防卫基因的表达，产生防卫蛋白，诱导参与反应的次生物质和物理防御结构的合成；同时调节其他信号途径，减弱防卫反应中活性氧等对细胞造成的损伤，同时增强协同抗性。外施不同浓度的MeJA，在不同植物体内均测得了防卫蛋白的积累，主要是碱性的防卫蛋白。最近的研究表明JA是一种创伤诱导的内源信号分子，不仅影响植株的生长发育，还参与植物在机械伤害、病虫害、病原菌、干旱、高盐、低温等胁迫条件下与抗逆相关基因的表达，从而增强植物的抗性[23]。当植物受到伤害时，体内的JA含量明显增加，由它通知未受伤部位和邻近植株进入警戒状态，以防御害虫和病原菌的入侵。JA能启动植物体内抗病防卫基因的表达，从而调控植物体内一系列连锁抗病反应。Perumal等[24]报道拟南芥的内源JA在病原菌侵染时，含量升高从而激活相关基因编码抗性蛋白，以产生抗病作用。几丁质酶是一种与发病机理有关的蛋白质，水解作为真菌细胞壁主要成分的壳质。水稻生长两周后，其幼苗叶片、叶鞘及根部组织经外源JA诱导后24～48h内几丁质酶活性明显上升[25]。JA是植物在遭受昆虫和病害攻击后产生的激活植物防卫基因的信号。植物中这些信号的扩大将诱导有毒物质合成和防御蛋白的增加[26]。徐涛等[27]采用RT-PCR的方法，对JA信号转导途径在水稻虫害诱导防御中的作用进行研究，发现虫害可诱导水稻启动JA信号转导途径，从而使之产生诱导防御机制。低水平的JA/MeJA能诱导许多PR基因表达，主要包括编码木瓜蛋白酶抑制因子、半胱氨酸蛋白酶抑制因子、丝氨酸蛋白酶抑制因子等蛋白酶抑制因子的基因，倍半二萜生物合成酶（羟甲基戊二酰辅酶A还原酶）、脂加氧酶（LOX）的基因亮氨酸氨肽酶、苏氨酸脱氨酶和类黄酮生物合成酶类（苯基苯乙烯酮合成酶和苯丙氨酸氨解酶、4-肉桂酰辅酶A连接酶）的基因，抗真菌蛋白硫素、渗透素的基因，一种富含脯氨酸和一种核糖失活蛋白的细胞壁蛋白质等的基因[28～30]。Xiquan等[31]发现玉米中ZmLOX6编码脂肪酸氢过氧化物酶，由植物激素和病原侵染唯一调控，经Northernblot分析发现该酶受茉莉酸诱导，但受脱落酸、水杨酸、乙烯的抑制，不对机械伤害和虫害有反应。MeJA还可诱导多酚氧化酶、蛋白酶抑制剂、过氧化物酶等相关防卫蛋白的合生[32]。用外源MeJA处理西瓜幼苗可增加壳聚糖酶的活性，从而提高植株对西瓜茎部腐烂病、白粉病和镰刀菌萎蔫病的抗性[33]。MeJA处理还可诱导植物产生尼古丁、芥子油苷、苜蓿碱、异类黄酮等生物碱和酚类次生物质[34]。MeJA诱导合成的次生物质与蛋白质结合，影响营养物质的吸收，并且由于本身或代谢物为有毒的腈、硫氰酸，干扰植食动物神经信号的传递，阻断电子传递链，对昆虫或病原菌产生毒害作用，延缓其发育[35]。1.1.4.2茉莉酸信号途径与其他信号途径的联系由于JA和脱落酸（ABA）在结构上和生理作用很相似，它们之间存在协同作用，能抑制植物生长、促进衰老和逆境胁迫。外源ABA、JA均能诱导植物某些逆境反应蛋白的形成，植物在虫害、病原菌、干旱胁迫等逆境时体内JA和ABA明显升高，但是二者含量的增加是各自独立的过程[36]。报道显示大豆叶片水分胁迫处理后，ABA与JA含量明显增加，而且JA比ABA积累早1～2h，并在短时间内比ABA含量维持较高[21]。5 2013年河南农业大学硕士毕业论文大多研究认为寄主植物是通过JA受体COI1来启动依赖于JA的防御反应，产生对非活体营养型真菌的抗性[37]，而水杨酸介导寄主对活体营养型真菌的抗性。茉莉酸与水杨酸二者之间存在相互抑制的拮抗作用，但也有一定的协同作用。最近很多研究发现植物JA有抵御活体（小麦白粉病菌）和非活体营养型真菌侵染的作用，MeJA诱导后感白粉病小麦叶片内的防卫反应基因表达上调[38～39]。Christopher等[37]发现某些活体营养真菌种类也可以激活茉莉酸介导的反应，缺失JA的突变体对某些活体营养真菌病原体的易感性增加，茉莉酸和SA是分别与诱导抗虫和抗病关系密切的信号物质。用拟南芥的CeV1突变种研究SA和JA的关系时表明，SA能抑制PDF1.2的表达，增强PR1的表达，但JA则无此效应[40]。拟南芥中调控植保素合成的基因可以被JA或活性氧强烈的诱导表达，但SA及其类似物不能诱导该基因的表达，这说明拟南芥中存在着受JA而不受SA调控的防卫基因[41]。Wang等[42]报道蛋白激酶MPK4诱导JA/ET信号转导，抑制SA介导的防御反应。JA属于植物防卫反应信号转导网络中的一员，既能独立介导防御反应，又能与其他病原菌诱导的信号转导途径相互作用，共同诱导PR基因的表达。JA能诱导乙烯（Ethylene，ET）的合成，JA和ET共同作用能诱导渗透素的高水平表达，但两者独自作用效应都很差[43]。植物防卫反应的信号转导是多个途径调控的，JA不能诱导全套的PR基因表达[44]，因此也不能介导所有的防卫反应。尽管JA和病原真菌Magnaporthegrisea与病原细菌黄单孢菌（Xanthomonascampestris）都能诱导水稻PR基因（PR1、PR2、PR3、PR5、PR9）在mRNA和蛋白质水平的增加，但这两种病原微生物都不能诱导JA的合成，JA也不能诱导水稻对这两种病原微生物的SAR[29]。Ronishree等[45]报道巨桉中EgrPR2与SA诱导相关，EgrPR3、EgrPR4、EgrLOX与MeJA诱导相关。1.2小麦白粉病及其抗病机制研究现状小麦（TriticumaestivumL.）是第二大粮食作物，小麦白粉病是世界性的小麦重要病害之一，常给产量造成严重的损失。小麦白粉病是由白粉病菌（Blumeriagraminisf．sp．tritici）引起的小麦叶部病害，是世界范围内小麦的主要病害之一。小麦白粉菌属子囊菌亚门白粉菌目，是专性寄生菌，只能在活的寄主组织上生长发育，且寄主性很专化，有不同的生理小种，且生理小种变异很快。白粉菌以菌丝寄生在寄主表面，并以分枝状的吸器伸入到寄主表皮细胞内吸取营养。菌丝上垂直长出短的分生孢子梗和分生孢子。分生孢子为单细胞，无色，呈长椭圆形，成串着生于分生孢子梗上，自顶端向下成熟脱落，由气流传播引起再侵染。分生孢子寿命较短，侵染力只能维持3～4天。白粉病的发病情况在潮湿和温暖地区更加严重。在病害发生的一般年份可使小麦减产5％～19％，严重年份减产高达30％[46]。1.2.1小麦质量和数量抗白粉病遗传根据小麦对白粉菌抗性的表现可将抗性分为两大类型：质量抗性和数量抗性。根据数量抗性的表现特点又可分为部分抗性、慢粉性、成株抗性、田间抗性、持久抗性、残留抗性等。此外，与小麦抗白粉病反应相关的还有感病和抗病基因的抑制基因等。（1）质量抗性质量抗性由小种专化抗性基因控制，从幼苗就可观察其对病原菌的抗性。这种抗性表现为对某一特异的白粉菌生理小种有效，而对其它的小种无效，即符合Flor的“基因对基因”假说[47～48]，命名为“Pm”（Powderymildew），根据抗小麦白粉病基因与白粉菌生理小种的互作反应和抗病基6 茉莉酸信号途径在小麦抗白粉病反应中的作用因鉴定的先后依次被命名。小麦对白粉菌的质量抗性是由单基因控制的。目前已正式命名的抗小麦白粉病主效基因有57个（包括复等位基因），定位于47个抗白粉病基因位点上（Pm1～Pm47）。其中至少有41个基因位点的57个抗白粉病基因被标记和作图，这些不同类型的分子标记为人们的生产应用提供了极大的便利。虽然小麦质量抗白粉病性的遗传均符合孟德尔的单因子独立分配规律，但在抗性表现上却存在差异，主要体现在抗病性表现的时期和抗性程度上。质量抗性表现类型大体可以分为：①全生长期均表现抗性，抗性完全（这类基因在幼苗期就表现出很高的抗性，抗性鉴定为免疫或近免疫，离体培养抗性鉴定的侵染型是“0”级或“0；”级，大多数质量抗病基因属于这种类型，如Pm21、Pm45等）；②在苗期抗性弱，成株期表现最好的抗性，如Pm5、Pm6、Pm17等；③在苗期不表现抗性，在成株期可以鉴定其抗性，如Pm7等。（2）数量抗性数量抗性是在无质量抗性基因或质量抗性基因已被克服的品种中检测到的抗性。因此，这种现象是在这个品种的遗传背景下，由一个或多个未加鉴定的抗病基因所决定。这种“背景”抗性通常在成株期表现，但在苗期或成株期或两个时期均有。在小种专化抗性丧失后表现背景抗性。由于这种抗性延缓病原菌的侵染、发育和繁殖，因此是部分的，常称为成株抗性、慢粉性或部分抗性[49]。1.2.2茉莉酸与小麦抗白粉关系研究进展近年来，关于茉莉酸的抗病研究很活跃，而且植物抗病信号网络相当复杂。茉莉酸、水杨酸、脱落酸信号转导途径既有拮抗，又有协同作用。茉莉酸在抵御非活体和活体胁迫中都扮演着一个非常重要的角色。对于它们在抗小麦白粉病机制方面的研究需要进一步加深，以揭示抗病分子机理。尹姣等[50]研究报道喷施茉莉酸能提高小麦植株对小麦白粉病菌的抵抗能力，大大降低小麦白粉病的发病级别和病斑数量。用MeJA诱导小麦幼苗能够提高幼苗的诱导抗性[51]，能提高PR基因的表达[52]，但未有茉莉酸与小麦抗白粉病关系的深入研究。茉莉酸诱导的小麦抗性提高与小麦相关病程蛋白间是否存在联系，白粉菌诱导处理的小麦幼苗内源茉莉酸是否发生变化都未得到证实，茉莉酸对不同白粉病抗性小麦内抗病相关基因的诱导作用是否一致也没报道。1.3相关研究技术1.3.1小麦叶片内源茉莉酸测定方法研究关于测定植物内源MeJA方法的报道已有很多，本试验是参考Engelberth等（2003）的方法略做改进的，利用液相色谱质谱-质谱法检测小麦幼苗中叶片内源茉莉酸甲酯[53～55]。1.3.1.1液相色谱质谱-质谱法技术概述色谱法（Chromatography）于1906年由俄国植物学家茨维特（Tswett）在用碳酸钙分离植物色素时发现的，后来逐渐发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。气相色谱法具有操作方便、分析速度快、分离能力高、灵敏度高等优点，但鉴于技术条件的限制，热稳定性差或沸点太高的物质都难以利用其进行定性分析。而高效液相色谱法不受样品挥发性的限制，不需气化，却只要求样品能制成溶液，且灵敏度高。所以热稳定性差、高沸点、相对分子大的有机物（这些物质几乎占有机物总数的75%～80%）基本都可用高效液相色谱法进行分离、定7 2013年河南农业大学硕士毕业论文性分析。据统计，能用气相色谱分析的已知化合物约占20%，能用液相色谱分析的约占70%～80%。20世纪70年代，色谱质谱联用技术简化了样品的前处理过程，将色谱的分离能力与质谱的定性功能结合起来，实现待测物的定量和定性分析。液相色谱的优点是分离的高效性，质谱仪的优点是高灵敏度和高专属性，因此巧妙地将它们结合起来具有扬长补短的效果。与传统的液相色谱法相比，得到了比日本、欧盟等国法规要求更快的分析速度、更低的检出限和更高的分辨率、灵敏度[56]。液质联用技术不论在科学研究领域，还是在分析应用领域（环境分析、食品、医药、刑侦科学等）都已成为一种强有力的分析工具。简单来说，液质联用的原理就是利用液相色谱的分离技术，将混合的东西分离成单一的物质，依次进入质谱，打成碎片，然后从物质的结构分析，可以大体判断键的断裂方式，然后通过质荷比、对照相应的对照图库，大概判断碎片的分子结构，从而对待测物质定性。1.3.1.2液相色谱质谱质谱技术基本术语（1）质谱图：质谱图一般都采用“条图”，或称为棒状图。在图中横轴表示质荷比（m/z，因为Z接近于1，故实际上m/z多为离子的质量）；纵轴表示峰的相对强度（RA,相对丰度）。（2）峰：质谱图中的离子信号。（3）基准峰：质谱图中，指定质荷比范围内强度最大的离子峰称基峰，该离子峰的峰高为100%，而以对它的百分比来表示其它离子峰的强度。（4）质荷比：离子质量（以相对原子量单位计）与它所带电荷（以电子电量为单位计）的比值，写作m/z。（5）离子丰度：检测到的离子信号强度。峰越高，形成的离子越多，即谱线的强度与离子的多少成正比。（6）总离子流图：在选定的质量范围内，所有离子强度的总和对扫描次数或时间所作的图，也称TIC图。1.3.2小麦基因组测序研究进展由于普通小麦基因组大而复杂（是水稻基因组的40倍），85%以上序列为重复序列，致使基因组测序研究进展缓慢。2012年，研究人员采用全基因组“鸟枪测序”技术对小麦基因组进行了测序，将有助于创制更适应环境变化的品种[57]。2013年，《自然》在线报道中国首次完成了小麦A基因组的测序和草图绘制，对未来深入和系统研究麦类植物结构与功能基因组学，以及进一步推动栽培小麦的遗传改良具有重要意义。研究团队利用新一代测序技术，对二倍体乌拉尔图小麦G1812系的基因组进行测序、组装、注释及相关分析。鉴定出34879个编码蛋白基因，与已知禾本科作物基因组比较分析，鉴定出3425个A基因组特异基因和24个新小RNA，并发现含NB-ARC功能域的抗病基因在小麦A基因组明显增多。通过同源基因的比对和关联分析，还鉴定出一批控制重要农艺性状的基因。此外，该研究还筛选出大量遗传分子标记，将有助于重要数量农艺形状基因的克隆及基因组选择，促进小麦的分子育种研究[58]。8 茉莉酸信号途径在小麦抗白粉病反应中的作用2引言小麦是世界第二大粮食作物，小麦白粉病是由小麦白粉病菌引起的最严重的叶部病害之一，可造成小麦产量13%～34%的损失[59]。由于小麦白粉病菌生理小种多，适应范围广，变异快，单基因控制的抗性极易丧失，导致推广品种的抗病基因不断被新的毒性基因所克服。这已成为抗病品种应用中一个突出的问题。所以，研究小麦抗白粉病的主要信号转导途径有助于了解小麦的抗病分子机理，开拓小麦的抗病遗传改良新途径，从而提高小麦抗病性，保证小麦稳产高产[60～61]。植物的主动抗病性包括基因对基因介导的抗性和诱导的抗性[62～63]。水杨酸途径和茉莉酸途径是植物基因对基因介导的抗性和诱导抗性中的2条重要信号途径[64～65]。虽然有关茉莉酸及其衍生物在植物对病原的基础和诱导抗性中的作用，以及JA信号途径与SA和ET依赖的信号传导途径间的关系已有较多的研究报道[51,66～72]，但关于JA在小麦抗白粉病反应中作用的研究几乎是空白。牛吉山等[72]在小麦品系“兰考906”抗白粉病分子机理研究中，克隆了1个茉莉酮酸酯诱导蛋白基因Ta-JA2，提示JA途径在小麦抗白粉病反应中起作用。用外源茉莉酸甲酯处理感病小麦幼苗，证明外源MeJA可以提高小麦对白粉病的抗性[51～52]。茉莉酸作为植物抗病信号分子已被大量研究，但茉莉酸与抗小麦白粉病反应的关系不清。本文拟通过研究不同类型感、抗白粉病小麦在外源茉莉酸甲酯和白粉菌分别诱导后PR1、PR2、PR3、PR4、PR5、PR9、PR10、Ta-JA2、Ta-GLP2a抗病相关基因的表达情况和测定接种白粉病菌后叶片内源茉莉酸的含量变化，探索不同类型小麦中JA信号途径的作用规律，推进小麦抗白粉病机理研究，为抗病育种提供理论基础。9 2013年河南农业大学硕士毕业论文3材料与方法3.1供试材料3.1.1植物材料高感小麦白粉菌品种：中国春、Chancellor（不携带任何抗白粉病基因）；显性中抗品种：Asosan/8Cc（Pm3a）；携带显性抗病基因的高抗品种：PIC427（Pm21）、09X15（Pm21）、PIC419（Pm13）、09M5（Pm45）和携带隐性抗病基因的高抗品种兰考90（6）（PmLK906）。其中所用的易感和中抗试验材料属于近等基因系，背景相似，只有一个基因的差别。抗白粉病小麦品系“09X15”，由本实验室培育而成，具有很好的抗病性，田间表现为对小麦白粉菌免疫。抗白粉病小麦品系“09M5”由南京农业大学马正强老师赠予，小麦兰考90（6）系列品系由河南省兰考县农华种业公司培育。其余种子由河南农业大学国家小麦工程技术研究中心繁育保存。3.1.2小麦白粉菌菌株用国家小麦工程技术研究中心分离保存的小麦白粉菌单孢堆分离菌株11B1和11B4以及混合菌株分析小麦幼苗的白粉病抗性遗传。3.2主要仪器及供试试剂3.2.1仪器MVS-1旋涡混合器、JY5000型电脑三恒多用电泳仪、EppendorfPCR仪、恒温水浴锅、超净工作台、琼脂糖水平电泳槽、Bio-Imagingsystem凝胶成像仪、紫外检测仪、Biofuge高速冷冻离心机、Biofuge高速台式离心机、UV/ViSspectrophotometer紫外分光光度计（美国Beckman公司）、荧光定量PCR仪（北京伯乐科技有限公司）、串联四级杆线性离子阱高性能质谱仪4000QTRAP（AB公司）、氮吹仪N-EVAP266（Organomation公司）、快速混匀器Sk-1（江苏金坛市医疗仪器厂）、超纯水仪Q-Grandient（Millipore公司）、低速离心机CT6E（日本日立公司）、高速离心机CF15RXII（日本日立公司）、超声波清洗器B52210c-mt（BRANSON公司）、电子天平PB403-S/FACT（METTLERTOLEDO公司）、高纯氮（河南正源科技发展有限公司）等。3.2.2试剂茉莉酸甲酯（sigma公司）、TRNZOL（Invitrogen）、氯仿、异丙醇、乙醇、氯仿、GoTaq®qPCRMasterMix荧光定量PCR试剂盒（Promega）、2×TaqMasterMix（康为世纪）、ddH20、DL2000DNAMarker、琼脂糖（Invitrogen）、6-苄氨基腺嘌呤、DEPC（焦碳酸-7,酯）、硅胶吸附剂Psa（Agilent）、石墨化碳黑（Agilent）、色谱纯乙酸乙酯（Fisher）、色谱纯甲醇（Fisher）、色谱纯正己烷（Fisher）、色谱纯丙酮（Fisher）、分析纯无水乙醚（洛阳昊华化学试剂有限公司）、分析纯冰乙酸（洛阳昊华化学试剂有限公司）、纯度≥95%茉莉酸甲酯（sigma）、滤膜（0.22um）（德国MEMBRANA公司）等。标准储备液（100μg/mL）：用电子天平准确称取0.01g（精确到0.0001g）茉莉酸甲酯标准品，用甲醇定容于100mL容量瓶中，-18℃避光保存。使用时再根据需要配制成不同浓度的标准溶液。3.3试验方法3.3.1茉莉酸甲酯处理10 茉莉酸信号途径在小麦抗白粉病反应中的作用茉莉酸甲酯购自sigma公司，用蒸馏水配成浓度为1.0mmol/L的MeJA溶液（含体积分数为0.01%的Tween20和体积分数为0.25%的乙醇）。待幼苗长至1叶1心时将MeJA溶液喷洒到叶片上，直到液滴从叶片上往下滴为止；以喷蒸馏水（含体积分数为0.01%的Tween20和体积分数为0.25%的乙醇）的样品为对照。在MeJA处理后12、24、48、72、96h分别在对照组和处理组剪取3～4cm叶子进行白粉病抗性鉴定，其余叶片在液氮中冷冻，用于基因表达分析。3.3.2白粉病菌诱导处理选取籽粒饱满的健康种子各1000粒，用体积分数为75%酒精消毒1min，蒸馏水冲洗5遍后，再用体积分数为0.5%的氯化汞消毒5min，蒸馏水冲洗10遍后，摆放于有湿润滤纸的培养皿中，50粒/皿，黑暗培养24h后，20℃/18℃，光照/黑暗，12h光周期，培养至1叶1心期时，均匀接种新鲜的单孢堆白粉菌孢子，分别取病菌侵染后0（未接种对照）、2、4、6、12、24、48、72、96h的第一片叶子，去除叶尖，精确称取1g置于50mL离心管中，每样品重复4次，液氮冷冻30min后置于备用。剩下叶片经液氮冷冻，保存于-80℃冰箱中，用于基因表达分析。3.3.3白粉病鉴定采用离体叶段培养法鉴定白粉病抗性。白粉病菌株为本室分离的单孢堆分离株11B1和11B4。在合适的培养皿中放置2层中性滤纸，用40mg/L的6-苄氨基腺嘌呤充分湿润滤纸。剪取MeJA处理后的小麦叶片3～4cm，每个处理取10个叶片重复，按编号放在滤纸上。采用抖落法均匀接种小麦白粉病菌。保持滤纸湿润，在光照培养箱内培养，18℃，每天光照12h，7d后进行白粉菌抗性鉴定。统计每个叶片的发病严重度、各级的病叶数，通过计算病情指数来表示白粉病发病程度。叶片发病严重度采用10级法，分级标准是：发病现象级别无1<1%21%～3%34%～5%46%～10%511%～15%616%～25%726%～50%851%～75%976%～100%10病情指数计算公式如下：式中：Gi为严重度级别，Ni为病叶数，I=0，1，2……k，GK为最高级别。11 2013年河南农业大学硕士毕业论文3.3.4小麦叶片内源JA的提取与测定3.3.4.1小麦叶片JA提取和甲酯化在Engelberth等[54]方法基础上作修改。将保存于50mL离心管中的样品在液氮中研磨，加入10mL丙酮/柠檬酸（50mmol/L）（V（丙酮）：V（柠檬酸）=7：3），混匀后再加入10mL乙酸乙酯，振荡混匀3min后，超声处理15min促进JA提取。在6700g离心10min，取上层液于另1个50mL离心管中，分别加入石墨化碳黑（安捷伦）和硅胶吸附剂PSA（乙二胺-N-丙基，安捷伦）各0.6g，振荡5min，在2700g离心5min，吸取10mL上清液于10mL带刻度的离心管中，冰水水浴中氮气吹干，即获得叶片中的JAs。加入1mL乙醚/甲醇（V（乙醚）：V（甲醇）=9：1）和40μL2mmol/L的三甲基硅烷化重氮甲烷（溶于正己烷）溶解，混匀后放置30min进行甲酯化。加入40μL2mol/L冰乙酸（溶于正己烷），混匀后放置30min，终止反应。冰水水浴中氮气吹干，加入体积分数为0.1%甲酸/甲醇（V（甲酸）：V（甲醇）=3：1）定容至1mL，过0.22μm的水相滤膜即获得MeJA样品，转移至进样瓶中待测。3.3.4.2小麦叶片JA检测采用液相色谱质谱-质谱法检测小麦白粉菌诱导处理后小麦叶片内源茉莉酸含量的变化，检测条件参考Wei等[53]报道，采用标准品添加法进行试验，响应值标准品茉莉酸甲酯和小麦内源茉莉酸甲酯均按3倍信噪比计算。根据茉莉酸甲酯标准品的峰形、峰面积的线性关系以及保留时间等指标逐步确定上机的各项分析条件，再通过加标样品与空白样品的比对，对各条件进行摸索。用液相色谱质谱联用仪（AB4000QTRAP）检测，色谱柱ACQUITYUPLCRBEHC18（WATERS，2.1×50mm，1.7µm）；进样量10µL，柱温30℃；流动相A为甲醇，B为体积分数为0.1%甲酸水溶液。等度洗脱条件见表1。表1MeJA液相色谱等度洗脱条件Table1ElutionparametersforMeJAinliquidchromatography流动相（%）时间（min）流速（mL/min）MobilephaseTimeFlowrateA甲醇B0.1%甲酸MethanolFormicacid00.3653560.36535检测方式：多反应监测扫描模式（MRM）；离子化温度（TEM）：500℃；正离子模式；雾化气（Gas1）：35.0psi；辅助气压力（Gas2）：35.0psi；气帘气（CUR）：25.0psi；碰撞气（CAD）：8psi；喷雾电压（IS）：5500V；电子能量70eV；质谱条件：电喷雾离子源（ESI）。12 茉莉酸信号途径在小麦抗白粉病反应中的作用表2优化的质谱条件Table2Optimizedparametersofthemassspectrometer分析物母离子/psi去簇电压/V碰撞室入口电压/子离子/psi碰撞能/eV碰撞室出口电压/VAnalyteParentionDPVEPSub-ionionCECXP150.918.012.0茉莉酸甲酯Methyl225.050.010.0132.922.06.0jasmonate147.120.07.03.3.4.3标准曲线的的建立取标准储备液（100μg/mL）用0.1%甲酸/甲醇（体积比=3：1）流动相分别配置成0、1、5、10、20、50、100、200、500ng/mL的标准溶液，过0.22μm的水相滤膜后备用。按照色谱质谱条件，待色谱仪基线平稳后按浓度梯度由低向高进样，每个浓度标准溶液进样3次，测出各浓度水平所对应的峰面积。以浓度为横坐标，峰面积平均值为纵坐标，得回归方程和相关系数。根据相关系数得出标准溶液的线性范围。3.3.4.4液相色谱质谱质谱法方法评价对所建立的方法进行评价，主要以方法的灵敏度（以最低检出浓度表示）、准确度（以标准添加回收率来衡量）和精确度（以重复性来衡量）来衡量测定方法的好坏，为测定小麦叶片内源茉莉酸提供方法支持。采用外标-标准曲线法定量测定，用茉莉酸甲酯色谱峰保留时间定性、峰面积定量。按下列公式计算样品中茉莉酸甲酯含量：V1000X=cm1000X——待测样品中被测组分含量，单位为ng/g；C——从标准曲线中得到的样品溶液中被测组分的浓度，单位为ng/mL；V——待测样品溶液定容体积，单位为mL；m——待测样品溶液所代表的试样质量，单位为g。注：计算结果需将空白值扣除。3.3.5小麦叶片RNA的提取和cDNA合成3.3.5.1小麦叶片RNA提取实验前准备：预先配制0.1%的DEPC水（ddH2O中含体积分数为0.1%DEPC，37℃过夜处理12h），高温灭菌后，用DEPC水配制体积分数为75%乙醇，研钵、量筒、试剂瓶等需200℃灭菌至少4h，所用枪头和枪盒均为进口。采用Trizol（Invitrogen）法提取总RNA，步骤如下：（1）取0.5g叶片，经液氮研磨成粉末状，置于1.5mL离心管中，加1mLTRIZol，用力摇15s，室温放置5min；（2）4℃，12,000g离心10min，去除沉淀；13 2013年河南农业大学硕士毕业论文（3）取400μL上清液于新的1.5mL离心管中，分别加0.2mL氯仿，盖盖，用力摇15s，4℃温育3min；（4）4℃，12,000g离心15min，分层：上层水相含RNA、中层含蛋白质、下层含DNA；（5）将上层水相移至新的1.5mL离心管中（应避免吸到中间层），加入0.4mL异丙醇沉淀RNA，在-20℃放置30min以上；（6）4℃，10,000g离心10min，管底可见白色沉淀；（7）弃上清，加1mL体积分数为75%的乙醇涡旋振荡，8000g，4℃，离心5min，洗涤3次；（8）倒掉75%的乙醇，短时离心2-3s，吸出残留的乙醇；（9）打开管口，使乙醇挥发5min，不要过于干燥；（10）加30μLDEPC水，反复吸打，使其充分溶解，室温静置2min，然后于-80℃保存。用0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性，用DΜ800核酸蛋白分析仪测定其OD260和OD280值、RNA浓度和纯度。3.3.5.2小麦叶片cDNA第一条链的合成（1）基因组DNA的去除反应试剂使用量（μL）5×gDNAEraserBuffer2gDNAEraser1TotalRNA5.0RNaseFreedH2Oupto10.0↓42℃2min4℃（2）反转录反应试剂使用量（μL）5×PrimeScript®Buffer2（forRealTime）4PrimeScript®RTEnzymeMixI1RTPrimeMix1（1）的反应液10RNaseFreedH2Oupto20.0↓37℃15min85℃15s4℃3.3.6实时荧光定量PCR3.3.6.1PCR引物的设计14 茉莉酸信号途径在小麦抗白粉病反应中的作用按照RealTimePCR引物设计原则，使用PrimerPremier5.0软件设计扩增效率高、反应特异性强的引物，引物由北京华大基因公司合成（PAGE级别）。设计的10对荧光定量PCR引物、基因查询号、引物序列和扩增产物大小见表3。表3实时定量PCR中所用的引物序列Table.3Theprimersequencesusedinrealtime-QRT-PCR基因符号查询号上游引物序列下游引物序列产物长GeneGeneBankPrimersequences（5'-3'）FPrimersequences（5'-3'）R度（bp）symbolAccessionProductPR1AJ007348.1CTGGAGCACGAAGCTGCAGCGAGTGCTGGAGCTTGCAGT76PR2Y18212.1CTCGACATCGGTAACGACCAGGCGGCGATGTACTTGATGTTC119PR3AB029934AGAGATAAGCAAGGCCACGTCGGTTGCTCACCAGGTCCTTC116PR4AJ006098CGAGGATCGTGGACCAGTGGTCGACGAACTGGTAGTTGACG128PR5AF442967ACAGCTACGCCAAGGACGACCGCGTCCTAATCTAAGGGCAG91PR9X56011GAGATTCCACAGATGCAAACGAGGGAGGCCCTTGTTTCTGAATG102PR10CA684431TTAAACCAGCACGAGAAACATCAGATCCTCCCTCGATTATTCTCACG158Ta-JA2EU035635AAGAAGGTGAGTGGGCTATTGCGAAGGCTCTGTGAA159TaGLP2aAJ237942AACAAAGGTGATGTGTTCGTCTTCGAGCCGGTCTATTGTATTCTTTTCC213Actingi:48927617GTTCCAATCTATGAGGGATACACGCGAACCTCCACTGAGAACAACATTACC4223.3.6.2荧光定量PCR实时荧光定量PCR使用伯乐公司的iQTM5多重实时荧光定量PCR仪进行扩增，以小麦Actin基因作内参基因，每个反应包括上游和下游引物各10μΜ、5μL2×SYBRGreenI、50ng的cDNA，最后加ddH2O补充至10μL。PCR反应液的配置如下：反应组分体积（μL）ddH2O3.22×GoTaq®qPCRMasterMix5.0上游引物（10μΜ）0.4下游引物（10μΜ）0.4cDNA1.0总体积10.0PCR反应程序为：95℃2min；40个循环的95℃15s，60℃30s；接着从60℃升到95℃，进行融解曲线的设置。使用相对定量法进行基因的表达分析，2-△△Ct法进行数据分析，MicrosoftExcel进行数据处理。3.4数据分析方法用SPSS19对相关数据进行单因素方差分析、相关性分析、显著性分析。使用相对定量法进行基因的表达分析，用2-△△Ct法进行数据分析，用MicrosoftExcel进行数据处理。15 2013年河南农业大学硕士毕业论文4结果与分析4.1外源茉莉酸对小麦白粉病抗性的诱导作用植物中茉莉酸和甲基酯-茉莉酸甲酯合称为茉莉酮酸酯，是脂肪酸衍生的环戊酮信号分子[65]。牛吉山等[51]报道用MeJA诱导小麦幼苗，分别在处理后24h和48h剪取叶片进行白粉病抗性鉴定，发现低浓度的MeJA对小麦的白粉病抗性诱导效果不明显，高浓度MeJA具有明显的诱导作用。因此，本文选用1.0mmol/LMeJA对小麦白粉病抗性进行诱导研究，利用离体叶段法来进行白粉菌抗性鉴定（图1）。外施MeJA后，Chancellor和Asosan/8Cc的病情指数在早期迅速下降，后期逐渐回升，12h病情指数最低；而PIC427病情指数始终很低。结果表明，显性易感小麦白粉菌品种Chancellor、显性中抗品种Asosan/8Cc、显性高抗品种PIC427在MeJA处理12h内白粉病抗性显著提高，12h诱导抗性达到峰值，随后抗病性下降，诱导抗病水平变化趋势一致（图2）。说明茉莉酸对小麦白粉病的抗性诱导具有时间性。推测MeJA诱导一定时间后致使抗病相关基因表达水平达到峰值，抗病水平也达到最高水平。但随着时间的推移，外源MeJA在植物体内的浓度逐渐下降，诱导的抗病相关基因表达水平也随之下降，诱导的抗病性水平也随之下降。所以，要保持持久的诱导抗病性需设法维持JA在植物体内有一定浓度。ChancellorAsosan/8CcPIC427图1离体叶段法Fig.1Wheatleavesinvitroculture图2喷施MeJA后不同时间点“Chancellor”、“Asosan/8Cc”和“PIC427”的病情指数Fig.2Thediseaseindexesof‘Chancellor’,‘Asosan/8Cc’and‘PIC427’atdifferenttimepointsafterMeJAspraying16 茉莉酸信号途径在小麦抗白粉病反应中的作用4.2小麦叶片总RNA的质量检测提取得到RNA溶液后，需要对RNA进行相关的质量检测，以确定是否符合后续实验的要求。RT-PCR实验对RNA完整性要求较高，并且对酶反应抑制物残留要求严格。用分光光度计法来检测RNA纯度，实验中测得OD260/OD280的值均在1.9～2.1之间，可以认为RNA纯度较好。用0.8%琼脂糖凝胶电泳来检测RNA的完整性，琼脂糖凝胶上可以清晰地看到28S和18S的rRNA，28SrRNA的量约为18SrRNA的2倍，说明RNA的完整性较好（见图3）。测得总RNA的纯度及完整性均适于下一步实验。图3小麦叶片总RNA电泳结果Fig.3ElectrophoresispatternofthetotalRNAofthewheatleafsamples4.3实时荧光定量PCR扩增效果本研究用小麦内标基因Actin和9个待测基因的引物进行荧光定量PCR扩增。荧光定量PCR融解曲线原始图和融解曲线单峰图见图4。在整个PCR结束后，融解曲线图上只有单峰，说明荧光定量PCR扩增过程中产物没有非特异性扩增。融解曲线原始图Actin融解曲线单峰图PR117 2013年河南农业大学硕士毕业论文PR2PR3PR4PR5PR918 茉莉酸信号途径在小麦抗白粉病反应中的作用PR10Ta-JA2Ta-Glp2a图4荧光定量RT-PCR分析基因的熔点曲线图Fig.4Themelting-curverepresentativeoftheamplifiedproduct4.4外源茉莉酸对小麦抗病相关基因表达的诱导作用一些病程相关蛋白基因（PRs）的表达，如PR1、PR2、PR5在植物中广泛作为SAR的标志基因[73]，PR3、PR4在植物中广泛作为JAR的标志基因[74]。小麦PR1、PR5可作为小麦抗白粉病的标志基因[38]。为了研究JA诱导抗白粉病反应与小麦抗病相关基因表达间的关系，对MeJA处理后“Chancellor”、“Asosan/8Cc”和“PIC427”叶片中9个抗病相关基因的表达进行了定量分析（图5），以喷蒸馏水（含体积分数为0.01%的Tween20和体积分数为0.25%的乙醇）的样品为对照。结果表明，在“Chancellor”和“Asosan/8Cc”中上调的基因皆有PR1、PR2、PR3、PR4、PR5、PR9、PR10和Ta-JA2，下调的基因都为Ta-GLP2a；而“PIC427”中所试验抗病相关基因均上调。MeJA处理对PR4、PR9的诱导作用最强，可达30倍以上；对PR1、PR2、PR3、PR5、PR10的诱导作用强可达10～30倍，对Ta-JA2的诱导作用达2～10倍，而MeJA处理后Ta-GLP2a的表达水平非常低。结果表明，MeJA对9个抗病相关基因的激活作用不同，出现峰值时间和增强幅度也存在差异。外源MeJA在不同小麦品种中对同一抗病相关基因的表达调控作用也存在较大差异。PR1在“Chancellor”中的增幅约为5倍，48h出现高峰，之后该基因的表达水平下降；在“Asosan/8Cc”、“PIC427”中增幅分别为20倍、3倍，处理24h时达到最高，随之表达水平急速下降，处理96h后基本恢复到处理前的表达水平。从表达量来看，该基因在“Asosan/8Cc”中的表达远远高于其他219 2013年河南农业大学硕士毕业论文个品种。PR2在“Chancellor”、“Asosan/8Cc”中的增幅约为11倍、5.5倍，两者皆在处理早期表达量快速增加，并于12h时出现高峰，之后该基因的表达水平缓慢下降，处理96h后基本恢复到处理前的表达水平；相比之下在“PIC427”中为22.1倍，处理后12～24h其表达量快速增加，处理24h时达到最高，随之表达水平急速下降。从表达量来看，该基因在“PIC427”中的表达远远高于其他2个品种。PR3在“Chancellor”中增幅约为7.7倍，处理后其表达量逐渐增加，12h达到最高峰，之后该基因的表达水平下降，72h后基本恢复到处理前的表达水平；在“Asosan/8Cc”中为11.1倍，处理12h时达到最高，12～48h表达量下降，48～72h表达量有较小增加，随之表达水平又下降；在“PIC427”中为45.7倍，处理后表达水平一直持续快速升高，96h后表达量仍比处理前高8倍。从表达量来看，该基因在“PIC427”中的表达远远高于其他2个品种，外源茉莉酸处理对该品种中PR3的表达有很大影响作用。PR4在“Chancellor”中的增幅约为31.8倍，处理后其表达量逐渐增加，12h达到最高峰，之后该基因的表达水平下降；在“Asosan/8Cc”中为10倍，处理12h时达到最高，之后表达水平急速下降，72h后基本恢复到处理前的表达水平；在“PIC427”中为19.1倍，12～48h表达量急速增加，处理24h时达到最高，随之表达水平急速下降。从表达量来看，该基因在“Chancellor”中的表达远远高于其他2个品种。PR5在“Chancellor”中的增幅约为12.6倍，处理后其表达量逐渐增加，12h达到最高峰，之后该基因的表达水平下降；在“Asosan/8Cc”中为5.9倍，12～48h表达量急速增加，处理24h时达到最高，随之表达水平急速下降；在“PIC427”中为3.4倍，处理后缓慢增加，处理24h时达到最高，之后表达水平缓慢下降。从表达量来看，该基因在“Chancellor”中的表达远远高于其他2个品种。PR9在“Chancellor”中的增幅约为22.5倍，处理后48h内一直处于高效表达水平，24h时达到最高，之后缓慢下降；在“Asosan/8Cc”中为34.5倍，12h内表达量快速增加，随之下降；在“PIC427”中为16.6倍，12h内表达量快速增加，处理24h时达到最高，之后表达水平快速下降。从表达量来看，该基因在3个品种中的表达量都很高。PR10在“Chancellor”中的增幅约为4.9倍，在“PIC427”中为12.3倍，两者皆在处理12h内其表达量快速增加，12h时达到最高峰，之后该基因的表达水平缓慢下降，处理96h后基本恢复到处理前的表达水平；在“Asosan/8Cc”中为6倍，处理24h内其表达量快速增加，24h时达到最高，随之表达水平急速下降，72h后基本恢复到处理前的表达水平。从表达量来看，该基因在“PIC427”中的表达远远高于其他2个品种。Ta-JA2在“Chancellor”中的增幅约为4.75倍，处理后快速增加，12h达到高峰，之后快速下降，72h恢复到处理前的表达水平；在“Asosan/8Cc”中为2倍，12～48h表达量较高，其余时间段表达很低；在“PIC427”中为2.2倍，处理后缓慢增加，处理24h时达到最高，之后表达水平快速下降，72h后基本恢复到处理前的表达水平。从表达量来看，该基因在3个品种中的表达量都20 茉莉酸信号途径在小麦抗白粉病反应中的作用较低，“Chancellor”在三者中相对高些。Ta-GLP2a在“Chancellor”中的增幅约为0.88倍，在“Asosan/8Cc”中为0.11倍，在“PIC427”中为1.4倍，增幅都很小，在高抗材料“PIC427”中相对高些。21 2013年河南农业大学硕士毕业论文图5抗病相关基因在MeJA处理后“Chancellor”、“Asosan/8Cc”和“PIC427”中的表达谱Fig.5Expressionpatternsofdiseaseresistancerelatedgenesinpowderymildewsusceptiblewheat‘Chancellor’,‘Asosan/8Cc’and‘PIC427’withMeJAtreatment4.5茉莉酸诱导抗性与抗病相关基因表达间的关系从图2与图5比较可见，MeJA对“Chancellor”、“Asosan/8Cc”和“PIC427”白粉病抗性22 茉莉酸信号途径在小麦抗白粉病反应中的作用诱导的病情指数变化曲线和MeJA对9个抗病相关基因（PR1、PR2、PR3、PR4、PR5、PR9、PR10、Ta-JA2、Ta-GLP2a）的诱导表达变化之间存在高度的一致性，即抗病相关基因表达在MeJA处理后12～48h达到最大值（多数在24h），而在MeJA处理12h后再接种白粉病菌的植株抗病水平表现最高，此时9个抗病相关基因的表达量达到并保持较高。随着时间的推移，抗病相关基因表达量逐步降低，处理后96h恢复到较低水平；相应地，接菌的“Chancellor”、“Asosan/8Cc”和“PIC427”小麦白粉病抗性也降低。可见,诱导抗病性的高低与诱导的抗病相关基因表达水平的高低之间存在高度的一致性，证明了小麦白粉菌抗病性增强与抗病相关蛋白基因的表达有关。值得注意的是，“Chancellor”和“Asosan/8Cc”分别为易感和中抗小麦白粉菌材料，两者是近等基因系，背景相似，只有一个基因的差别。但两者的抗病相关基因表达谱不相同，基因的表达强度和幅度差别大。根据MeJA诱导后病情指数与抗病相关基因表达谱之间的相关性分析可以看出，9个基因表达变化与3个品种的病情指数大部分呈负相关（表4）。病情指数高表示感病程度高，抗病性低。9个抗病相关基因的表达对MeJA诱导的小麦白粉菌抗病性均有不同程度抗病的作用。在“Chancellor”中PR2、PR4、PR10、PR3、PR9起主要抗病作用，在“Asosan/8Cc”中PR2、PR3、PR9、PR4、PR10起主要抗病作用，在“PIC427”中Ta-JA2、Ta-GLP2a、PR10起主要抗病作用。Ta-JA2在“Chancellor”和“PIC427”中起到了一定抗病作用，但在“Asosan/8Cc”中却几乎不显作用。由此分析可得，在外源茉莉酸诱导后PR2、PR3、PR4、PR10在3个品种中的增幅都很大，与小麦的白粉病抗性呈正相关，推测是JA信号途径激活抗白粉病的主要抗病相关基因。而Ta-GLP2a在3个品种中增幅不大，存在一定相关性，但有明显差别，该基因在感病材料“Chancellor”和“Asosan/8Cc”中与小麦白粉病抗性正相关，说明Ta-GLP2a抑制感病材料抗病；但在“PIC427”与小麦白粉病抗性负相关，说明Ta-GLP2a诱导抗病材料抗病。由以上结果分析可见，茉莉酸诱导后各种感、抗白粉病小麦品系抗性均有所提高，但在各种材料中对白粉菌抗性贡献大的PR基因类型和强度不同，可能与各种小麦本身抗病基因和性状有关。表4病情指数与抗病相关基因表达量的相关性Table.4ThecorrelationsbetweendiseaseindexesandexpressionpatternsofdiseaseresistancerelatedgenesPR1PR2PR3PR4PR5PR9PR10Ta-JA2Ta-GLP2aChancellor-0.182-0.925*-0.868**-0.946*-0.247-0.696-0.973*-0.640.436Asosan/8Cc-0.467-0.972*-0.978*-0.884**-0.213-0.929*-0.743-0.0650.456PIC427-0.253-0.157-0.139-0.1980.221-0.178-0.361-0.466-0.491*：p<0.05**：p<0.014.6白粉菌侵染对小麦叶片内源茉莉酸含量的影响4.6.1茉莉酸甲酯标准曲线的的建立标准曲线和线性范围:取标准样品，按色谱-质谱条件，每个浓度的标准品进样3次，记录峰面积（图7）。以浓度为横坐标，峰面积平均值为纵坐标，得到标准曲线方程，y=（9.21e+003）x+2.03e+0.03（其中e是科学计数；x是自变量时间），相关系数r=0.9999，线性范围1～500μg/L，最低检测限为1μg/L。23 2013年河南农业大学硕士毕业论文图6标准曲线Fig.6Standardcurve精密度：取20μg/L的茉莉酸甲酯溶液，按液相色谱质谱-质谱条件连续进样6次，以峰面积计算相对标准偏差，结果为RSD=1.97%（n=6）。回收率：准确称取10份“中国春”叶片各1.0g，在其中5份中分别加入20μL质量浓度为10mg/L的茉莉酸甲酯标准品，按样品处理方法检测，计算峰面积后减去空白样品JA含量平均值，得到回收率93.8%～104.2%，平均回收率为97.57%，相对标准偏差RSD=3.84%（n=5）。重复性：准确称取6份“中国春”叶片各1.0g，按照建立的样品提取、甲酯化和液相色谱质谱-质谱测定方法检测，计算小麦叶片内源茉莉酸甲酯含量，结果RSD=3.08%（n=6），表明测定重复性好（图7）。图7小麦叶片内源茉莉酸甲酯（3.8ng/g（鲜重））多反应监测选择离子流色谱图Fig.7LiquidchromatographyprofileofMeJAderivedfromJAsinwheatleaves（3.8ng/gfreshweight）4.6.2接种白粉病菌后各种小麦幼苗叶片内源JA含量变化用上述方法检测接种白粉病菌后“09X15”、“PIC419”、“09M5”、“兰考90（6）”4种高抗白粉菌小麦幼苗叶片内源JA含量的变化（图8）。24 茉莉酸信号途径在小麦抗白粉病反应中的作用图8接种白粉病菌后小麦幼苗叶片内源茉莉酸甲酯的含量变化Fig.8ConcentrationfluctuationofJAsinwheatseedlingleavesafterinoculationwithBgt由图8可见，接种白粉病菌后12h内小麦叶片JA含量剧烈变化。在接种白粉菌前高抗白粉病小麦品系幼苗“09X15”、“PIC419”、“09M5”、“兰考90（6）”叶片内源MeJA含量维持在较低水平，接菌早期均含量增加，之后随病菌侵染时间的推移而降低。接菌前“09M5”JA含量最高，“兰考90（6）”含量次之，“09X15”和“PIC419”含量相当；接菌后，所试验材料幼苗叶片内源MeJA含量均迅速增加，在2h时的含量是接菌诱导前的4～10倍，其中“09M5”叶片内源MeJA含量增长倍数最小（相对0h的含量仅增加4倍），“兰考90（6）”小麦幼苗叶片内源MeJA含量增幅较低（相对0h的含量增加了5倍，但此时已达到高峰，增加量最大，达到24.6ng/g（鲜重）），“09X15”小麦幼苗叶片内源MeJA含量增幅较高（相对0h含量增加了8倍），“PIC419”小麦幼苗叶片内源MeJA含量增幅最大（相对0h含量增加10倍，增长量也较大，达到20.4ng/g（鲜重））；之后4个小麦品种幼苗叶片内源MeJA含量继续增高，在4h时均达到高峰（除了“兰考90（6）”在2h已达到高峰），其中“09X15”的含量最高，增幅最大（达到24.6ng/g（鲜重），是0h时的14.3倍），“PIC419”含量相对0h变化很大，增加了12.5倍，“兰考90（6）”和“09M5”含量增幅最小，分别增加了5.3、4.5倍；随后“PIC419”和“09X15”小麦幼苗叶片中内源MeJA含量快速下降，而MeJA含量在“兰考90（6）”和“09M5”中缓慢下降；“09M5”小麦幼苗叶片中内源MeJA含量在72h后与接菌前的含量水平相近；“PIC419”小麦幼苗叶片中内源MeJA含量在6h后急速下降，24h时含量仅剩3.4ng/g（鲜重）；“09X15”小麦幼苗叶片中内源MeJA含量在12h后急速下降，96h时含量仅剩0.3ng/g（鲜重）；“兰考90（6）”小麦幼苗叶片中内源MeJA含量在6h后急速下降，72h时含量与接菌前的含量水平相近。以上数据显示：4个小麦品系在接菌处理后，其幼苗叶片内源MeJA含量变化都很大，并表现出相近的先升后降的单峰规律，但出现峰值和恢复侵染前的含量水平时间点不一样。规律大概是：白粉菌侵染后，4个高抗小麦白粉菌品种幼苗叶片内源MeJA含量急剧增加，在2～4h达到峰值，之后快速下降，在6～24h仍维持在相当高水平，之后持续下降，“兰考90（6）”在72h时恢复白粉菌侵染前的含量，而“09M5”和“09X15”则在72～96h恢复白粉菌侵染前的含量。4个小麦品种间同时存在背景差异，“09M5”在未接菌诱导前含量最高，“09X15”和“PIC419”25 2013年河南农业大学硕士毕业论文接菌诱导后增幅大，白粉菌侵染24h内其小麦幼苗叶片内源MeJA含量始终维持在相对较高的水平，在72～96h恢复白粉菌侵染前的含量，这与其对小麦白粉菌完全免疫的抗性性质一致；“兰考90（6）”在接菌处理前含量相对适中，接菌诱导后短时间内（2h）含量急剧增加，变化趋势最大，2h已经达到峰值（达到峰值的时间比另外3个品种靠前），之后又急速下降，下降趋势最快（72h时已恢复白粉菌侵染前的含量水平），表明“兰考90（6）”内MeJA含量积累最少，这与“兰考90（6）”对小麦白粉菌具有良好抗性相一致。白粉病菌侵染后2h叶片内茉莉酸含量迅速增加，4h后达到高峰，随后快速下降。用SPSS19对试验数据进行单因素方差分析（表5）。结果表明，未被病菌侵染的小麦幼苗叶片（0h）茉莉酸含量与侵染后（2～12h）小麦幼苗叶片茉莉酸含量达差异水平，表明小麦叶片内源茉莉酸含量的变化是由白粉菌诱导引起的；白粉菌诱导处理24h后这种差异性缩小，或差异未达显著性水平，表明白粉菌诱导具有时间性。随着时间的推移，小麦叶片内源茉莉酸含量并不持续积累。表5白粉菌诱导处理后96h内4个小麦品种内源茉莉酸含量方差分析Table5ANOVAofendogenousjasmonicacidconcentrationinwheatleavesoffourcultivarsbefore96hafterinoculationwithBgt小麦品种时间/hTimeWheatcultivars0246122448729609X151.72d17.65ab24.55a19.24ab12.33bc5.21cd4.39cd3.65cd0.28dPIC4191.77e20.43b22.05a15.34c5.83d3.43de---09M55.14g21.24b23.21a15.48c10.48d8.90e7.35ef6.45fg2.46h兰考90（6）3.78f24.60a20.05b17.98c8.75d5.00e4.76ef3.91ef3.44f注：不同字母表示相同处理不同时间差异显著水平（p＜0.05）。Note:Thelowercaselettersindicatesignificanceat5％levelsduringthedifferentperiodsatthesametreatment.4.7白粉菌侵染对小麦白粉病抗性的诱导作用为了研究小麦白粉菌诱导抗白粉病反应与小麦抗病相关基因表达间的关系，对白粉菌处理后“Chancellor”、“Asosan/8Cc”、“PIC427”、“09X15”、“PIC419”、“09M5”、“兰考90（6）”叶片中9个抗病相关基因的表达进行了定量分析（图9），以不接菌为对照。结果表明，白粉菌侵染后在“09X15”、“PIC419”、“09M5”、“兰考90（6）”中试验相关抗病基因均上调，而在“Chancellor”、“Asosan/8Cc”、“PIC427”中除了Ta-GLP2a基因下调外其余基因均上调。白粉菌侵染对PR1、PR2、PR4的诱导作用最强，可达15倍以上；对PR3、PR5、PR10的诱导作用强可达5～15倍，对Ta-JA2的诱导作用达2～5倍，而Ta-GLP2a的表达非常低。结果表明，白粉菌对9个不同抗病相关基因的激活作用不同，增强幅度和到达峰值的时间也存在差异。白粉菌在不同小麦品种中对同一抗病相关基因的表达调控作用存也在较大差异。PR1在“Chancellor”、“Asosan/8Cc”中的增幅分别约为7.3倍、1.4倍，处理后其表达量逐渐增加，24h达到最高峰，之后该基因的表达水平下降；在“PIC427”、“09X15”、“PIC419”、“09M5”中增幅分别为9.3、27.8、1.8、1.7倍，处理后其表达量快速增加，处理24h时达到最高，随之表达水平急速下降；在“兰考90（6）”中为17.4倍，诱导后缓慢增加，48h达到高峰，之后急速下26 茉莉酸信号途径在小麦抗白粉病反应中的作用降。从表达量来看，该基因在“09X15”中的表达远远高于其他6个品种，“Asosan/8Cc”、“PIC419”、“09M5”表达偏低。PR2在“Chancellor”中的增幅约为1.9倍，表达水平偏低，呈波浪趋势变化，处理后24h达到高峰；在“Asosan/8Cc”中为2.8倍，处理12h内其表达量快速增加，12h时达到最高峰，之后该基因的表达水平急速下降，处理96h后基本恢复到处理前的表达水平；在“PIC427”、“09X15”、“09M5”、“PIC419”中增幅分别为19.3、7.9、16.5、12.9倍，处理24h内其表达量快速增加，处理24h时达到最高，随之表达水平急速下降；在“兰考90（6）”中为32.5倍，一直处于高效表达水平，处理24h时达到最高，处理96h后表达量还处于诱导前的22.5倍。从表达量来看，该基因在“兰考90（6）”中的表达远远高于其他6个品种。PR3在“Chancellor”中的增幅约为3.1倍，处理后其表达量逐渐增加，48h达到最高峰，之后该基因的表达水平下降；在“Asosan/8Cc”、“PIC427”、“兰考90（6）”、“09M5”、“09X15”中增幅分别为2.3、9.1、13.9、6.2、5.8倍，处理24h内表达量快速增加，24h达到高峰，随之下降；在“PIC419”中增幅为15.1倍，诱导12h内表达量快速增加，12h达到高峰，随之缓慢下降。从表达量来看，该基因在“PIC419”中的表达远远高于其他6个品种。PR4在“Chancellor”中的增幅约为15.8倍，诱导12h内快速表达量快速增加，12h达到高峰，随之缓慢下降；在“Asosan/8Cc”、“PIC427”、“PIC419”、“兰考90（6）”、“09M5”、“09X15”中增幅分别为4.8、2.2、5.4、10.6、6.8、12.3倍，处理24h内表达量快速增加，24h达到高峰，随之下降。从表达量来看，该基因在“Chancellor”中的表达远远高于其他6个品种。PR5在“Chancellor”、“Asosan/8Cc”、“09M5”、“兰考90（6）”、“09X15”中的增幅约为11.9、4.0、3.4、9.8、2.5倍，处理后其表达量逐渐增加，24h达到最高峰，之后该基因的表达水平缓慢下降；在“PIC427”中为1.8倍，12h内表达量急速增加，处理12h时达到最高，随之表达水平缓慢下降；在“PIC419”中为3.3倍，处理12h内快速增加，处理12h时达到最高，之后表达水平缓慢下降。从表达量来看，该基因在“Chancellor”中的表达远远高于其他6个品种。PR9在“Chancellor”、“09M5”、“09X15”中的增幅分别约为3.0、4.4、12.5倍，处理24h内表达量快速增加，24h时达到最高，之后缓慢下降，而“Chancellor”表达量在72h略有上升，随之又下降；在“Asosan/8Cc”、“PIC427”、“兰考90（6）”中增幅分别约为3.4、8.4、5.7倍，12h内表达量快速增加，24h时达到最高，随之急速下降；在“PIC419”中为8.6倍，诱导48h内表达量快速增加，48h时达到最高，之后表达水平快速下降。从表达量来看，该基因在“09X15”中的表达远远高于其他6个品种。PR10在“Chancellor”、“PIC427”、“09X15”、“PIC419”、“09M5”、“兰考90（6）”中的增幅分别约为2.6、14.9、18.3、8.1、8.3、11.2倍，诱导后24h内表达量快速增加，24h时达到最高，随之表达水平急速下降；在“Asosan/8Cc”中增幅分别约为3.8倍，处理12h内其表达量快速增加，12h时达到最高峰，之后表达水平急速下降。从表达量来看，该基因在“09X15”中的表达远远高于其他6个品种。Ta-JA2在“Chancellor”、“PIC427”、“PIC419”中的增幅分别约为1.5、3.0、4.8倍，处理27 2013年河南农业大学硕士毕业论文24h内表达量快速增加，24h达到高峰，之后快速下降；在“Asosan/8Cc”、“09X15”、“09M5”中增幅分别约为1.2、2.1、3.0倍，处理12h内其表达量快速增加，12h时达到最高峰，之后表达水平下降，其中“Asosan/8Cc”、“09M5”在处理24h时出现最低表达水平，之后又上升，变化趋势表现为二次波浪；在“兰考90（6）”中为3.3倍，诱导24h内表达量快速增加，处理24～48h时达到最高，之后表达水平快速下降。从表达量来看，该基因在7个品种中的表达量都较低，“PIC419”相对高些。Ta-GLP2a在“Chancellor”、“兰考90（6）”、“PIC419”中的增幅分别约为0.4、1.3、1.1倍，变化趋势没规律；在“Asosan/8Cc”、“PIC427”、“09X15”增幅分别约为0.7、0.3、0.7倍，一直处于低表达水平；在“09M5”中为1.2倍，处理24h内其表达量缓慢增加，24h时达到高峰，之后表达水平下降。从表达量来看，该基因在7个品种中的表达量都较低，在“兰考90（6）”和“09M5”相对高些。28 茉莉酸信号途径在小麦抗白粉病反应中的作用图9抗病相关基因在白粉菌侵染后“Chancellor”、“Asosan/8Cc”、“PIC427”、“09X15”、“PIC419”、“09M5”、“兰考90（6）”中的表达谱Fig.9Expressionpatternsofdiseaseresistancerelatedgenesinpowderymildewsusceptiblewheat‘Chancellor’,‘Asosan/8Cc’,‘PIC427’,‘09X15’,‘PIC419’,‘09M5’and‘LANKAO90（6）’withBgttreatment29 2013年河南农业大学硕士毕业论文4.8白粉菌侵染后内源MeJA与抗病相关基因表达间的关系从图8与图9比较可见，小麦白粉菌侵染“09X15”、“PIC419”、“09M5”、“兰考90（6）”后幼苗叶片内源MeJA变化趋势和小麦白粉菌对9个抗病相关基因PR1、PR2、PR3、PR4、PR5、PR9、PR10、Ta-JA2、Ta-GLP2a的诱导表达变化之间存在高度的一致性。抗病相关基因表达在小麦白粉菌处理后12～48h达到最大值（多数在24h），而在小麦白粉菌侵染2～4h植株的内源MeJA含量最多，此时9个抗病相关基因的表达量达到并保持有较高值。随着时间的推移，抗病相关基因表达量逐步降低，处理后96h恢复到较低水平，相应地，接菌的“09X15”、“PIC419”、“09M5”、“兰考90（6）”内源MeJA含量也降到较低。可见，白粉菌诱导抗性材料中内源MeJA含量变化与诱导的抗病相关基因谱存在高度的一致性，证明了小麦内源MeJA含量与抗病相关蛋白基因的表达有关。值得注意的是，“09X15”、“PIC419”、“09M5”均是携带显性抗病基因的高抗小麦白粉菌品系，基因组内分别含白粉病抗病基因Pm21、Pm13、Pm45；而“兰考90（6）”是携带隐性抗病基因的高抗小麦白粉菌品系，基因组内含白粉病抗病基因PmLK906。4种高抗白粉菌小麦品系的抗病相关基因表达谱不相同，基因的表达强度和幅度差别大。从白粉菌诱导后内源茉莉酸含量与抗病相关基因表达谱之间的相关性分析可以看出，9个基因表达变化与4个品种的内源茉莉酸含量大部分呈正相关（表6）。按理推断，茉莉酸含量越高，抗病性越高。9个抗病相关基因的表达对白粉菌诱导的小麦白粉菌抗病性均有不同程度的作用。在“09X15”中Ta-JA2、PR4、PR3起主要抗病作用，在“PIC419”中PR5、Ta-JA2、Ta-GLP2a起主要抗病作用，在“09M5”中Ta-GLP2a、PR4、PR5、PR10、Ta-JA2起主要抗病作用，在“兰考90（6）”中PR9、PR3、PR4起主要抗病作用。在显性免疫小麦白粉菌品系中Ta-JA2都起了一定重要抗病作用，但此基因在隐性抗白粉病小麦品系中却作用很低；在隐性抗白粉病小麦品系中起主要抗病作用的是PR9。由此分析可得，在白粉菌侵染后Ta-JA2、PR4、PR3、PR5、PR9、Ta-GLP2a在4个小麦品系中的增幅都很大，与小麦的白粉病抗性呈正相关，推测是JA信号途径激活抗白粉病的主要抗病相关基因。由以上结果分析可见，白粉菌诱导后各种高抗白粉病小麦品系内源茉莉酸含量均有所增加，但抗病相关基因在各种材料中对白粉菌抗性贡献大的PR基因类型和强度不同，可能与各种小麦本身抗病基因和性状有关。表6小麦白粉菌诱导后内源MeJA变化与抗病相关基因表达量的相关性Table.6ThecorrelationsbetweenendogenousjasmonicacidconcentrationinwheatandexpressionpatternsofdiseaseresistancerelatedgenesPR1PR2PR3PR4PR5PR9PR10Ta-JA2Ta-GLP2a09X15-0.0070.3810.6490.7440.4270.4020.0030.952*0.341PIC419-0.048-0.0640.1880.2230.930*0.2240.1550.427-0.33909M50.3920.1590.3480.7960.6680.4890.5330.5050.893**兰考90（6）-0.178-0.1880.3850.304-0.1650.934*-0.1890.0340.024*：p<0.05**：p<0.0130 茉莉酸信号途径在小麦抗白粉病反应中的作用5结论与讨论茉莉酸信号转导途径（又称类十八烷信号转导途径）是亚麻酸经脂氧合酶、丙二烯氧化合成酶等一系列酶促反应，最终生成植物体内重要信号转导物质茉莉酸及其衍生物茉莉酸甲酯的生物合成途径，与植物化学防御物质的产生有密切关系。病程相关蛋白是植物抗病虫害的重要成分，目前已经在禾谷类作物中命名了14个家族（PR1～PR14），在抗病、感病品种中均存在，只是在感病植株中相对抗病植株被激活得慢和表达微弱，基因表达的时空和产物含量有差异，这些蛋白多具有抗真菌和杀虫活性[75]。5.1结论本研究选取了9个典型的小麦PR基因和公认的其他抗病相关基因，采用荧光定量PCR和液相色谱质谱-质谱方法,对茉莉酸信号传导途径在小麦白粉菌诱导防御中的作用进行研究，结果表明：（1）外施茉莉酸甲酯可以诱导提高不同类别小麦对白粉菌的抗性，可显著激活抗病相关基因PR1、PR2、PR3、PR4、PR5、PR9、PR10、Ta-JA2的表达，对Ta-GLP2a的表达作用很小；PR2、PR3、PR4、PR10在3种感、抗小麦白粉病品系中起主要抗病作用。（2）白粉菌侵染后内源茉莉酸含量快速增加，在0～4h最高，随之下降；可显著激抗病相关基因PR1、PR2、PR3、PR4、PR5、PR9、PR10、Ta-JA2的表达，对Ta-GLP2a的表达作用很小；Ta-JA2、PR4、PR3、PR5、PR9、Ta-GLP2a在4种高抗小麦白粉病品系中起重要抗病作用，在显性免疫小麦白粉菌品系中Ta-JA2都起了一定重要抗病作用，而在隐性抗白粉病小麦品系中起主要抗病作用的是PR9。抗病相关基因表达峰值在12～48h出现，推测茉莉酸含量增加到一定水平启动了茉莉酸信号转导途径，进而激活相关抗病基因的表达来防御病菌侵染。（3）外施茉莉酸甲酯、接种小麦白粉菌处理均对抗病相关基因的表达有相似的诱导作用,但茉莉酸诱导相关抗病基因的表达强度比白粉菌强约10倍；同一处理下各个基因在各种小麦品系中的表达强度和幅度各不相同，而且基因的表达变化与小麦品种的专化性识别关系大。（4）综合外源茉莉酸和白粉菌诱导下抗病相关基因的表达与小麦的白粉病抗性得出，MeJA是小麦抗白粉菌反应的信号分子，PR3、PR4在小麦抗白粉病反应中起主要抗病作用。5.2讨论几十年来，在研究植物是通过怎样的复杂机制防御生物和非生物因素胁迫方面取得了很大的进步。其中证明了SA、JA和ET等3种植物激素在不同抗病信号传导中起重要作用[62,64,76]。这3条信号途径在植物应答特定病原的复杂网络中可能是互相促进或相互制约的。普遍认为SA在激活对活体营养病原的抗性中起主要作用，而JA和ET则常对激活非活体营养病原的抗性相关。并且，SA与JA/ET防卫途径是相互拮抗的[64]。但本文发现JA能提高植株中活体营养病菌（小麦白粉菌）的抗性，而且在外源茉莉酸诱导后，与SA信号转导途径相关的PR1、PR5基因表达也有很大提高。在小麦白粉病抗性中JA与SA途径不是相互拮抗的，有一定关系，它们都是小麦抗白粉病反应的信号分子。茉莉酸诱导后小麦中编码几丁质酶的PR2、PR3、PR5基因和编码过氧化酶的PR9基因表达水平大大提高，与文献报道的茉莉酸能启动许多PR基因表达调控植物体内一系列连锁抗病反应一致。SA在小麦抗病中的作用也已经得到证明[77]。向阳等[78]研究分别用病原体感染、激素处理诱导小麦jacalin相关的凝集素样基因JRL表达，用水杨酸生物合成抑制剂多效唑、茉莉酸生物合成抑31 2013年河南农业大学硕士毕业论文制剂分别抑制JRL表达，还通过病毒将转TaJRLL1拟南芥中JRL基因沉默，发现植株对病原真菌禾谷镰刀菌和真菌活体营养病原体白粉菌的易感性增加，显示JRLL1是对SA和JA依赖防御信号转导通路的一个组成部分。本实验室通过外施SA，鉴定诱导后的小麦白粉病抗性变化和SA诱导后病程相关蛋白基因的表达变化，证明SA是小麦抗白粉病反应的信号分子[38]。目前，JA信号途径与小麦抗病关系的研究很少，但已有报道显示JA可以显著诱导提高小麦对叶锈病的抗性[79]，JA/ET信号传导可能介导小麦对赤霉病的抗性反应[71]。尹姣等[50]研究发现在喷施茉莉酸后能提高小麦对白粉病菌的抵抗能力，大大降低小麦白粉病的发病级别和病斑数量。本实验室对小麦外施茉莉酸甲酯，发现茉莉酸甲酯可以提高小麦对白粉病的抗性；茉莉酸甲酯对抗病性的诱导需要一定的浓度，外施1.0mmol/L以上的茉莉酸甲酯具有明显的诱导作用；茉莉酸甲酯诱导的抗病性仅能维持一段较短的时间，约48～96h，因此要持久保持高水平的诱导抗性，就需要保持植株体内较高茉莉酸甲酯浓度。在本文研究中无论哪种小麦，在茉莉酸含量提高的条件下，它们中的PR3、PR4（提高几丁质酶活性）都与小麦抗白粉病关系最大，在病菌侵染胁迫下植株迅速加固自身的物理和化学屏障，以抵御外侵。内源茉莉酸峰值出现在2～4h，相关基因的表达峰值出现在12～48h，推测白粉菌侵染致使小麦内源茉莉酸含量增加，启动了茉莉酸信号转导途径，激活了相关基因表达，从而调控小麦体内一系列抗病反应。因此，要想方设法维持小麦体内茉莉酸的含量，从而提高抗病相关基因的表达量来防御病菌侵染。本研究还发现在茉莉酸和白粉菌诱导后，抗病相关基因在每一种显、隐性感、抗白粉病小麦品系中的表达都有差异，与小麦对白粉病菌和不同来源的小麦的专化识别关系大，推测这与小麦遗传背景有关。这些材料除抗病基因不同外，其它性状也存在明显差异，可能对基因的表达模式有影响；另外由于外源茉莉酸作用时间有限，因而对其在不同生育期的效应，特别是在田间的效应需要继续研究。由于本文只监测了9个抗病相关基因的表达，因此是否就是其中的几个基因起关键作用尚需要进一步研究。由于病情指数变化曲线和基因表达检测0～12h的时间点少，小麦基因组大且复杂，冗余序列多，抗病性涉及的基因多而复杂，发病程度受环境影响较大（发病条件已受到严格控制），内源茉莉酸测定方法受材料本身和温度影响大，各抗病相关基因表达谱与病情指数变化曲线、内源茉莉酸表达之间的相关性，并不能完全准确反映其在抗病反应的作用，但已明确证明了所试验的9个抗病相关基因在小麦抗白粉病反应中均有一定的积极抗病作用。研究虽已证明SA和JA均可诱导小麦对白粉病的抗性，是小麦抗白粉病的信号分子，但SA和JA信号途径之间激活的关键基因以及下游其它防卫基因是否相同？小麦体内SA和JA含量是否在哪种水平会处于协调抗病状态？是否乙烯信号分子也与小麦抗白粉病相关？JA信号途径在小麦抗白粉病反应中的关键基因是哪些？小麦的抗病基因与JA途径关键基因有什么关系？JA是否还能提高其他小麦病害（例如赤霉病、纹枯病、黑胚病）抗性？这些问题仍有待进一步研究。一旦明确了JA和其它信号分子在小麦抗白粉病反应信号网络中的确切作用和相互关系，就有可能通过调节JA合成途径关键基因的表达来控制这2种植物激素的含量[80～81]，达到合理提高小麦抗病性的目32 茉莉酸信号途径在小麦抗白粉病反应中的作用的。33 2013年河南农业大学硕士毕业论文参考文献[1]AltpeterF,BaisakhN,BeachyR,etal.Particlebombardmentandthegeneticenhancementofcrops:Mythsandrealities[J].MolBreed,2005,15:305-327.[2]王金生.植物抗病的分子机制[J].植物病理学报.1995,25(4):289-295.[3]何晨阳.试论病原物的致病基因[J]．植物病理学报.1994,24(2):97-99.[4]张德水,陈受益.植物抗病的分子生物学研究进展[J].植物病理学报.1997,27(2):97-103.[5]MichelmoreRW,MeyerBC.Clustersofresistancegenesinplantsevolvebydivergentselectionandabirth-and-deathprocess[J].GenomeResearch,1998,8:1113-1130.[6]YunDJ,BressanRA,HasegawaPM.PlantantifungalproteinsinPlantBreedingReviews[M].Iulesjanick,JohnWiley&Sons.1997,Vol.14,pp.39.[7]余叔文,汤章城.植物生理与分子生物学(第二版)[M].科学出版社,1998,pp.784-807.[8]FarisJD,LiWL,LiuDJ,etal.Candidategeneanalysisofquantitativediseaseresistanceinwheat[J].TAG,1999,98:219-225.[9]JacobsAK,DryIB,RobinsonSP.Inductionofdifferentpathogenesis-relatedcDNAsingrapevineinfectedwithpowderymildewandtreatedwithethephon[J].PlantPathology,1999,48:325-36.[10]TakemotoD,FuruseK,DokeN,etal.Identificationofchitinaseandosmotin-likeproteinasactin-bindingproteinsinsuspension-culturedpotatocells[J].PlantCellPhysiol.1997,38:441-448.[11]VanLC.TheNomenclatureofpathogenesis-relatedproteins[J].PhysiolMo1.PlantPathol,1990,(37):229-30.[12]VanLC，PierpointWS,BollerT,etal.Recommendationsfornamingplantpathogenesis-relatedproteins[J].PlantMolecularBiologyReporter,1994,12(3):245-264.[13]VanLC,VanStrienEA.Thefamiliesofpathogenesis-relatedproteins,theiractivities,andcomparativeanalysisofPR-1typeproteins[J].PhysiologicalMolecularPlantPathology,1999,55:85-97.[14]GrahamTL,GrahamMY.Roleofhypersensitivecelldeathinconditioningelicitationcompetencyanddefensepotentiation[J].PhysMolPlantPath,1999,55:13-20.[15]SchweizerP,HunzikerW,MÖsingerE.cDNAcloning,invitrotranscriptionandpartialsequenceanalysisofmRNAsfromwinterwheat(TriticumaestivumL.)withinducedresistancetoErysiphegraminisF.sp.tritici[J].PlantMolBiol,1989,12:643-654.[16]HammerschmidtR.Induceddiseaseresistance:howdoinducedplantsstoppathoges?[J].PhysMolPlantPath,1999,55:77-84.[17]VanS,LuijendijkM,SmoorenburgI,etal.Rhizobacteria-mediatedinducedsystemicresistance(ISR)inArabidopsisisnotassociatedwithadirecteffectonexpressionofknowndefense-relatedgenesbutstimulatestheexpressionofthejasmonate-induciblegeneAtvspuponchallenge[J].PlantMol.Biol,1999,41:537-549.[18]GrahamTL,GrahamMY.Roleofhypersensitivecelldeathinconditioningelicitationcompetency34 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茉莉酸信号途径在小麦抗白粉病反应中的作用TheroleofJasmonicacidsignalpathwayinwheatpowderymildewresistanceSupervisor:Prof.NiuJishanMasterCandidate:LvGuizhenABSTRACT:PowderymildewcausedbyBlumeriagraminisf.sp.Tritici,isoneofthemostseverewheatdiseases.Itcanreducethewheatyieldof13%~34%.Investigationonthemainsignalmoleculesandsignalingpathwayofwheatresistancemayunderstandthemolecularmechanismofdiseaseresistanceinwheat,soastoexplorenewwaystoimprovewheatdiseaseresistanceandcontroltheepidemicofwheatdiseases.Studyonthechangesofresistancerelatedgenesandendogenousjasmonicacidinwheatafterjasmonictreatmentandwheatpowderymildewinfectionrespectivelyistounderstandtheresistancemechanismofwheatandprovidetheoreticalbasisforwheatresistancebreeding.Theresultsareasfollows:1.Powderymildewsusceptiblecultivars‘Chancellor’(noPowderyMildewresistancegenes),‘Asosan/8Cc(Pm3a)’andresistantcultivar‘PIC427(Pm21)’wereusedtostudywheatpowderymildewresistanceactivatedby1.0mmol/Lmethyljasmonate(MeJA).Thereactiontypesofpowderymildewwereevaluatedbydetachedleafassay.WithrealtimequantitativeRT-PCR,wefoundthattheexpressionpatternsofdiseaseresistancerelatedgenesofPR1,PR2,PR3,PR4,PR5,PR9,PR10,Ta-JA2increasedsignificantlyandTa-GLP2achangedlittle.PR2,PR3,PR4,PR10playedamajorroleinthosewheatswithsusceptible/resistancetopowderymildew.2.TheJAindominantresistantvarieties‘09X15’(Pm21),‘PIC419’(Pm13),‘09M5’(Pm45)andrecessiveresistantvarieties‘LNAKAO90(6)’(PmLK906)afterinoculationwithBlumeriagraminisf.sp.triticiwasextractedbyoptimizedprotocolandmeasuredbyparameteroptimizedLiquidchromatographyMass-Massspectrometer.TheJAsconcentrationincreasedsignificantlyat0~12hafterpathogeninfection,reachedthepeakat2~4h,thendecreasedrapidly.WithrealtimequantitativeRT-PCR,wefoundthattheexpressionpatternsofdiseaseresistancerelatedgenesofPR1,PR2,PR3,PR4,PR5,PR9,PR10,Ta-JA2increasedsignificantlyandTa-GLP2achangedlittle.Ta-JA2,PR4,PR3,PR5,PR9,Ta-GLP2awereimportantinresistantwheatlines.Ta-JA2playedanimportantroleindominantresistantwheatlines.PR9playedanimportantroleinrecessiveresistantwheatlines.3.Thechangesofresistancerelatedgeneshadgreateffectondifferencesofwheatcultivars.4.PR3,PR4hadthemostinfluenceonpowderymildewresistancewithwheat.Theresultsshowedthat:jasmonictreatmentandwheatpowderymildewinfection39 2013年河南农业大学硕士毕业论文couldactivatetheexpressionofrelatedgenes.Inoculatedwithpowderymildewmaystartjasmonicacidsignaltransductionpathway,thenamplifysignalandactivatetheexpressionofrelatedgenestoinduceresistancemechanisminwheat.TheseresultssuggestedthatjasmonatemaybeplayaroleindefenceagainstBlumeriagraminisf.sp.tritici.PR3,PR4hadthemostinfluenceonpowderymildewresistancewithwheat.Keywords:wheat;powderymildew;jasmonicacid(JA);resistance;geneexpression;LiquidchromatographyMass-Massspectrometer40