木霉-黄瓜互作过程中抗病信号传递途径分析

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分类号：Q815密级：公开UDC：579编号：201421508008河北工业大学硕士学位论文木霉-黄瓜互作过程中抗病信号传递途径分析论文作者：徐文学生类别：全日制学科门类：工学硕士学科专业：生物化工指导教师：黄亚丽职称：研究员资助基金项目：河北省应用基础研究计划重点基础研究项目(15962904);国家“水体污染控制与治理”专项(2015ZX07204-007) DissertationSubmittedtoHebeiUniversityofTechnologyforTheMasterDegreeofBiochemicalengineeringANALYSISOFRESISTANCESIGNALINGPATHWAYSOFTHEINTERACTIONBETWEENTRICHODERMAANDCUCUMBERbyXuWenSupervisor:Prof.HuangYaliMay2017ThisworksupportedbytheHebeiappliedbasicresearchprogramfocusedonbasicresearchprojects(15962904);Majornationalwaterpollutioncontrolprojects(2015ZX07204-007). 摘要由灰葡萄孢菌（Botrytiscinerea）引起的灰霉病是世界范围内危害最为严重、也是最难于防治的真菌性病害之一，能够侵染包括番茄、黄瓜、草莓等蔬菜水果在内的200多种植物。木霉（Trichodermaspp.）属于半知菌亚门、丝孢目、从梗孢科、木霉属，是防治灰霉病最具生防潜力的真菌。木霉防治灰霉病的作用机制研究是木霉生防研究的重点领域，特别是木霉-植物-灰霉菌互作是该领域的研究热点和难点。因此，本研究以筛选具有灰霉防治和黄瓜促生能力的木霉菌株为基础，通过建立的木霉-黄瓜-灰霉三方互作系统并测定三方互作过程中黄瓜叶片中激素合成相关基因的表达情况和激素含量并进行转录组和蛋白组的分析，最终构建木霉诱导黄瓜产生灰霉病抗性的信号传递途径模型。1.采用平板对峙培养法和水培促生法筛选出一株木霉菌株H9，其对灰霉病具有较强拮抗作用且能促进黄瓜生长，通过对H9菌落形态观察、显微形态观察和分子生物学鉴定相结合的方法对木霉H9进行了鉴定，最终确定木霉H9属于木霉属的长枝木霉（T.longibrachiatum）。2.在水培黄瓜根部接种木霉、叶部注射接种灰霉，建立木霉-黄瓜-灰霉三方互作体系，在该体系下病原菌接种4d、8d、12d时木霉H9对灰霉的防效分别为49.62%、55.85%、56.70%，说明木霉H9能够诱导黄瓜产生对灰霉的系统抗病性。通过透射电镜观察木霉H9在黄瓜根部的定殖情况，发现木霉能够在黄瓜根外吸附生长和根内部定殖，定殖部位为黄瓜根外皮层的细胞间隙。3.采用Real-timePCR和HPLC-MS/MS方法测定了木霉-黄瓜-灰霉互作过程中黄瓜叶片中茉莉酸、乙烯和水杨酸相关合成基因LOX1、AOS、LOX2、EIN2、ACC、PAD4的表达情况以及茉莉酸和水杨酸的含量，结果表明木霉诱导处理96h可以使黄瓜叶片中茉莉酸、乙烯、水杨酸合成相关基因上调表达，茉莉酸、水杨酸含量显著提高，表明在木霉-黄瓜-灰霉三方互作过程中诱导抗性信号通过茉莉酸/乙烯和水杨酸信号途径传递。4.对木霉-黄瓜-灰霉三方互作系统中黄瓜叶片转录组进行分析，结果可知木霉诱导处理96h使黄瓜叶片中茉莉酸生物合成途径和乙烯生物合成途径相关基因整体呈现一种上调表达的趋势，水杨酸生物合成途径包括莽草酸途径和异分支酸途径，而实验结果显示莽草酸途径中的苯丙氨酸解氨酶（PAL）相关的基因表达上调，表明木霉-黄III 瓜-灰霉三方互作过程是茉莉酸/乙烯途径和水杨酸途径共同调节。5.对木霉-黄瓜-灰霉三方互作系统中黄瓜叶片蛋白组进行分析，结果表明木霉诱导处理96h使黄瓜叶片中茉莉酸参与的途径中的大部分蛋白表达上调，且乙烯参与的途径中所有蛋白都上调，与水杨酸合成相关的苯丙氨酸解氨酶（PAL）相关蛋白上调表达。6.通过对木霉-黄瓜-灰霉三方互作系统中激素含量、基因表达、转录组和蛋白组的分析结果可以推测，在长枝木霉H9通过与黄瓜互作后引起的灰霉病系统抗性系统受茉莉酸/乙烯途径和水杨酸途径共同调节，且以茉莉酸/乙烯途径为主。关键词：木霉黄瓜互作茉莉酸水杨酸激素转录组蛋白组IV ABSTRACTBotrytiscinereaisoneofthemostdestructivepathogensintheworld.Thispathogenhasawidehostrangethatincludescucumber,tomatoandstrawberry.TrichodermaisthemostusefulbiocontrolfungiwhichcancontrolBotrytiscinerea.ThestudyonthebiocontrolmechanismaboutTrichodermaagainstBotrytiscinereaisthekeyfieldofTrichodermaresearch.However,thereisalotofunknownfieldabouttheinteractionmechanismamongTrichoderma-plant-Botrytiscinerea.So,basedontheTrichodermawhichcanantagonismBotrytiscinereaandpromotecucumbergrowth,theexpressionsituationofhormonesynthesisrelatedgene,theamountofhormone,theanalysisoftranscriptomeandproteomeweredeterminedintheinteractionsystemamongTrichoderma-plant-Botrytiscinerea.1.TrichodermastrainH9whichcanantagonismBotrytiscinereaandpromotecucumbergrowthwasisolatedthroughthedualculturemethodandhydroponicmethod.TheH9strainwasidentifiedasTrichodermalongibrachiatumbasedonmorphologyandgenesequenceanalysis.2.TheinteractionsystemofTrichoderma-plant-BotrytiscinereawasestablishedaccordingtothemethodthatTrichodermawasinoculatedintotherootandBotrytiscinereawasinoculatedintotheleavesofcucumber.Inthissystem,thebiocontrolefficacytograymolddiseasewere49.62%、55.85%、56.70%at4dpi、8dpiand12dpirespectively.Inthisprocess,thehyphaofTrichodermacancolonizationintherootofcucumber.3.TheexpressionsituationofhormonesynthesisrelatedgeneincludeLOX1、AOS、LOX2、EIN2、ACC、PAD4andtheamountofJA,SAintheinteractionsystemweredetermined.Theresultsshowedthatallthehormonesynthesisrelatedgenedetectedwereup-regulatedexpressionandthecontentofJA,ET,SAincucumberleafwereincreasedat96hduringtheinteractionsystem.4.Theresultsoftranscriptomeintheinteractionsystemshowedthatallthesynthesisgenerelatedtojasonicacid,ethyleneandshikimicacidpathwaygenerelatedtoSAsynthesiwereup-regulated.5.Theresultsofproteomeintheinteractionsystemshowedthatmostproteinrelatedjasonicpathwayandalltheproteinrelatedethylenewereup-regulated.OnlythePALrelatedproteinexpressioninntheSApathwayareup-regulated.V 6.Basedonthedataofhormonecontent,geneexpressionsituation,transcriptomeandproteomeanalysis,wecandeducedthatthesignalpathwayinplantresponsingtoTrichodermainduceincludedthejasmonicacid/ethyleneandsalicylicacidpathway.Theformerwasthemainpathwayinthisprocess.KEYWORDS:TrichodermacucumberinteracitonjasmonicacidsalicylicacidhormonetranscriptomeproteomeVI 目录第一章绪论.............................................................................................................................11.1木霉防治灰霉的直接生防机制...................................................................................................11.1.1木霉的重寄生作用...............................................................................................................11.1.2木霉的抗生作用...................................................................................................................21.1.3木霉的竞争作用....................................................................................................................31.2木霉防治灰霉的间接生防机制....................................................................................................31.2.1木霉在植物表面及内部的定殖........................................................................................31.2.2木霉与植物互作过程中植物的表征变化......................................................................51.2.3木霉与植物互作过程中植物的激素变化......................................................................51.2.4木霉与植物互作过程中植物的转录水平变化.............................................................61.2.5木霉与植物互作过程抗性相关蛋白的变化..................................................................71.3课题的意义........................................................................................................................................8第二章功能木霉菌株的筛选与鉴定................................................................................................92.1引言.....................................................................................................................................................92.2实验材料............................................................................................................................................92.2.1供试菌株.................................................................................................................................92.2.2供试植物.................................................................................................................................92.2.3供试培养基.............................................................................................................................92.2.4仪器设备...............................................................................................................................102.2.5主要试剂...............................................................................................................................112.2.6溶液配方...............................................................................................................................122.3实验方法...........................................................................................................................................122.3.1拮抗木霉菌株的筛选.........................................................................................................122.3.2具有促生作用的木霉菌株的分离..................................................................................132.3.3功能木霉菌株的形态学鉴定...........................................................................................132.3.4功能木霉菌株的分子生物学鉴定..................................................................................132.3.4.1木霉H9菌液的制备.......................................................................................................132.3.4.2木霉基因组DNA的提取............................................................................................132.3.4.3ITS序列的PCR扩增....................................................................................................13VII 2.3.4.418SrDNA序列的PCR扩增........................................................................................142.3.4.5TEF-1α序列的PCR扩增.............................................................................................152.3.4.6PCR产物序列分析及系统发育树构建......................................................................152.4结果与分析......................................................................................................................................152.4.1拮抗灰霉菌的木霉菌株筛选...........................................................................................152.4.2木霉菌株对黄瓜促生长作用...........................................................................................162.4.3木霉菌株H9的菌种鉴定.................................................................................................172.4.3.1木霉H9在不同培养基的生长形态...........................................................................172.4.3.2木霉的显微形态鉴定.....................................................................................................172.4.3.3木霉H9菌株的分子生物学鉴定.................................................................................192.5小结...................................................................................................................................................20第三章木霉H9与黄瓜互作引起黄瓜系统抗性的研究...........................................................233.1引言...................................................................................................................................................233.2实验材料............................................................................................................................................233.2.1供试菌株................................................................................................................................233.2.2供试植物................................................................................................................................233.2.3供试营养液............................................................................................................................243.3实验方法............................................................................................................................................243.3.1黄瓜幼苗的培养...................................................................................................................243.3.2菌种的培养及孢子液制备................................................................................................243.3.2.1木霉H9孢子液的制备...................................................................................................253.3.2.2灰霉的培养及孢子液制备............................................................................................253.3.3木霉H9对黄瓜的诱导接种............................................................................................253.3.4灰霉的挑战接种.................................................................................................................253.3.5木霉与黄瓜互作防治灰霉病的效果..............................................................................253.3.6木霉在黄瓜根部定殖的透射电镜观察.........................................................................263.3.7黄瓜植株内激素相关基因的表达情况.........................................................................273.3.7.1实验处理及所用引物序列............................................................................................273.3.7.2实时荧光定量检测与茉莉酸、乙烯、水杨酸相关标记基因的表达...............283.3.8黄瓜叶片中植物激素的检测...........................................................................................293.3.8.1实验处理............................................................................................................................293.3.8.2样品处理............................................................................................................................293.3.8.3激素的提取........................................................................................................................29VIII 3.3.8.4JA、SA标准溶液的配制...............................................................................................293.3.8.5液相条件............................................................................................................................303.3.8.6质谱条件............................................................................................................................303.3.8.7样品中激素含量的计算.................................................................................................303.3.8.8数据处理............................................................................................................................303.4结果与分析......................................................................................................................................303.4.1木霉H9与黄瓜互作防治灰霉病的效果.....................................................................303.4.2木霉H9在植物根部的定殖............................................................................................313.4.3茉莉酸、乙烯、水杨酸相关基因的表达情况...........................................................313.4.3.1茉莉酸相关基因的表达................................................................................................313.4.3.2乙烯相关基因的表达.....................................................................................................333.4.3.3水杨酸相关基因的表达................................................................................................343.4.4黄瓜内茉莉酸和水杨酸激素含量..................................................................................353.5小结....................................................................................................................................................35第四章木霉-黄瓜互作转录组分析.................................................................................................374.1引言....................................................................................................................................................374.2实验材料............................................................................................................................................374.2.1供试菌株................................................................................................................................374.2.2供试植物................................................................................................................................374.2.3植物营养液............................................................................................................................384.3实验方法............................................................................................................................................384.3.1实验设计................................................................................................................................384.3.2样品处理................................................................................................................................394.3.3RNA提取质检.....................................................................................................................394.3.4转录组测序..........................................................................................................................394.3.5数据预处理..........................................................................................................................394.3.6基因组比对..........................................................................................................................394.3.7基因表达定量和差异基因筛选......................................................................................394.3.8差异基因的富集分析........................................................................................................504.4结果与分析......................................................................................................................................504.4.1RNA质量分析.....................................................................................................................514.4.2测序质量分析......................................................................................................................514.4.3基因表达定量和差异基因筛选结果分析....................................................................51IX 4.4.4GO和KEGG富集分析结果............................................................................................524.4.5转录组分析总结..................................................................................................................554.5小结.....................................................................................................................................................50第五章木霉-黄瓜互作蛋白组学研究.............................................................................................515.1引言.....................................................................................................................................................515.2实验材料............................................................................................................................................515.2.1供试菌株................................................................................................................................515.2.2供试植物................................................................................................................................515.2.3植物营养液............................................................................................................................525.3实验方法............................................................................................................................................525.3.1实验处理...............................................................................................................................535.3.2样品处理...............................................................................................................................535.3.3蛋白提取方法......................................................................................................................535.3.4LC-MS/MS质谱检测条件................................................................................................535.3.4.1LC-MS/MS质谱设备规格.............................................................................................535.3.4.2LC-MS/MS缓冲液..........................................................................................................535.3.4.3LC-MS/MS的液相方法.................................................................................................545.4结果与分析......................................................................................................................................545.4.1蛋白质鉴定............................................................................................................................545.4.2Proteinpilot搜索参数.........................................................................................................545.4.3鉴定结果统计......................................................................................................................555.4.4蛋白覆盖分布......................................................................................................................555.4.5蛋白组数据分析..................................................................................................................555.4.5.1Unique肽段分步..............................................................................................................555.4.5.2肽段长度分布...................................................................................................................655.4.5.3差异蛋白质功能注释.....................................................................................................565.4.5.4GO注释..............................................................................................................................575.4.5.5代谢通路分析...................................................................................................................585.4.5.6茉莉酸、乙烯和水杨酸途径中差异蛋白的GO富集..........................................625.4.5.7茉莉酸通路的差异蛋白表达情况..............................................................................625.4.5.8乙烯通路的差异蛋白表达情况...................................................................................635.4.5.9水杨酸通路的差异蛋白表达.......................................................................................635.5小结.....................................................................................................................................................63X 第六章结论.........................................................................................................................................656.1结论.....................................................................................................................................................656.2展望.....................................................................................................................................................65参考文献..................................................................................................................................................67攻读学位期间所取得的相关科研成果............................................................................................73致谢...........................................................................................................................................................75XI 第一章绪论植物病害是指植物在病原微生物的侵害或者恶劣环境影响的情况下自身生理机能失调、植物组织受到破坏，其发生和蔓延是植物和病原微生物相互作用的结果。植物病害的发生会给人们生活造成严重影响，带来经济损失。而在防治植物病害的众多技术中，生物防治是一种可持续发展的逐渐代替化学防治的良好措施。由灰葡萄孢菌引起的灰霉病是世界范围内危害最为严重的真菌性病害，能够侵染包括番茄（Solanumlycopersicum）、黄瓜（CucumissativusLinn）、草莓（FragariaananassaDuch）等蔬菜水果在内的200多种植物。灰葡萄孢菌（B.cinerea）为死体营养型病原真菌，可以产生多种植物毒素和细胞壁水解酶来杀死植物寄主细胞，由于灰葡萄孢菌（B.Cinerea）具有多种侵染模式且菌核在植物残体上长期存活并产生抗药性，导致灰霉病难于防治。据统计，每年世界上用于防治灰霉病的费用超过十亿元，即使如此该病仍给农业带来了数十亿的经济损失。与此同时，用于灰霉病防治的化学农药大量进入环境和食物，带来了严重的环境污染和人体伤害。因此，进行灰霉病的安全高效防治是目前亟待解决的问题。木霉菌Trichoderma属半知菌亚门、从梗孢目、从梗孢科，是一种分布广泛的土壤习居菌，也是一种高效的拮抗、促生菌。木霉属包括大量具有生物性能、能够适应各种环境的菌株，同时也是土壤中分离频率最高的真菌。目前，已经对防治灰霉的木霉菌株的筛选、应用及生防机制进行了大量而深入研究。木霉的生防机制分为直接生防机制和间接生防机制，前者主要指木霉与灰霉病菌直接作用过程中所涉及的重寄生、抗生和营养竞争，后者是木霉通过诱导植物产生系统抗性来防治灰霉。1.1木霉防治灰霉的直接生防机制1.1.1木霉的重寄生作用木霉能够通过重寄生对病原菌进行识别、接触、缠绕和穿透等一系列作用来抑制或溶解寄主菌丝，是木霉最重要且存在最为广泛的生防机制之一。Druzhinina等[1]对木霉属中75个种的1100个菌株进行验证发现，所有的菌株都具有对灰霉的重寄生能力。Card等显微观察了深绿木霉（T.Atroviride）W132对灰霉病菌的拮抗作用，观察到木霉菌丝沿着灰霉平行或缠绕生长以及随后的灰霉菌丝崩解死亡的过程[2]。不同1 菌株产生细胞壁降解酶类的能力不同，重寄生能力较强的绿色木霉（T.virens）和深绿木霉（T.atroviride）产生的细胞壁降解酶类较多，而重寄生能力弱的里氏木霉（T.reesei）产生的细胞壁降解酶类较少[3]。木霉产生包括β−1,3−葡聚糖酶、β−1,6−葡聚糖酶、蛋白酶等在内的过种细胞壁降解酶类，无病原菌存在时这些酶类低量组成型表达，当有灰霉存在的情况下，β−1,3−葡聚糖酶[4]、β−1,6−葡聚糖酶以及蛋白酶的活性均上升[5]。Yang等的研究结果也发现，灰霉菌能够诱导哈茨木霉（T.harzianum）EST323产生多种细胞壁降解酶类，引起灰霉菌细胞壁的降解和菌丝崩解[6]。同样，在灰霉菌存在的情况下，棘孢木霉（T.asperellum）T32中ɑ−1,3−葡聚糖酶的大量表达[7]。MukherjeePK等分析绿色木霉（T.virens）、深绿木霉（T.atroviride）以及里氏木霉（T.reesei）与灰葡萄孢菌（B.cinerea）的重寄生过程发现，木霉与病原菌相互识别、接触的初级阶段灰霉细胞壁被木霉的细胞壁降解酶降解且释放低聚物，这些低聚物会诱导木霉细胞壁降解酶类的大量产生，进一步加快了对灰霉细胞壁的降解，导致菌丝崩裂[8]。通过分析木霉与灰霉互作过程中的转录组测序发现，灰霉对木霉细胞壁降解酶基因的诱导表达开始于二者直接接触之前[9]。总之，木霉能产生较为全面的细胞壁降解酶系，这些物质在灰霉菌存在时大量诱导表达。木霉产生的这些酶类除了能够导致寄主菌丝细胞壁降解外还能够诱导木霉寄生于灰霉的菌丝之中、阻止灰霉生长，对灰霉起到防治的作用。1.1.2木霉的抗生作用抗生作用是木霉防治灰霉的另一种重要的直接生防机制，该作用是通过产生多种具有抗生活性的次级代谢产物来实现，目前已经发现木霉所产生的抗生物质分为两大类，一类是易挥发性的小分子物质，该类物质对包括灰霉在内的大多数病原真菌具有抑制活性[8]。另一类物质是大分子代谢产物，包括Peptailbols、酶类等。Peptaibols是木霉最主要的活性抗生物质，目前发现的317种Peptaibols大多由木霉产生[10]，是一种短链的非核糖体多肽[11]。Chugh等研究发现，Peptaibols的两亲性质使其能够结合到双跨膜的灰霉细胞壁的低聚体离子通道上，使细胞渗漏和死亡[12]。Schirmbock等研究发现，灰霉细胞壁可以诱导哈茨木霉（T.harzianum）中TrichorzianineA1和A2的产生，这两种Peptailbols可以抑制灰霉孢子萌发和菌丝延长[13]。木霉与灰霉作用过程中还产生一些没有细胞壁降解酶活性，但在生防过程中起重要作用的酶类。如Yang等从哈茨木霉（T.harzianum）ETS323的分泌蛋白中分离到了一种L−氨基酸氧化酶（LAAOs）同聚体[14]，LAAOs是一种黄素酶，可以特异性催化L−氨基酸的主体氧化2 脱氨生成α−酮酸，同时释放过氧化氢和氨，引起灰霉菌丝的细胞凋亡[15,16]。木霉生长过程中会产生众多不同类型的具有抗生活性的次级代谢产物，这些代谢产物通过抗生作用抑制灰霉孢子萌发、阻止菌丝生长、进行菌丝的裂解，达到防治灰霉病的作用。1.1.3木霉的竞争作用木霉是一种环境适应性强、生长速度快的真菌，在与其他微生物在同一生态位存在时能够迅速占领营养和空间，使得竞争作用成为木霉的一种重要的拮抗机制。木霉的竞争作用主要表现为对生存空间和营养的竞争。王勇等通过平皿对峙法筛选到了2株高效拮抗灰霉菌的木霉菌株，这两个菌株的生长速度为灰霉菌生长速度的1.5倍左右，能够通过营养和空间竞争抑制灰霉的生长[17]。在自然环境中，灰霉菌丝侵入植物组织的位点为营养丰富的植物伤口、衰老的组织以及气孔、皮孔等自然孔口，侵入植物细胞之前需要依赖植物表面的营养才能萌发和生长，木霉在这些位点迅速萌发和生长会与灰霉进行营养竞争，导致灰霉孢子萌发率降低、芽管伸长变慢，从而降低和阻止灰霉的侵染，减少病原菌发病点的数目和植物坏死面积[18,19]。Card等通过显微观察的方法发现深绿木霉（T.atroviride）通过营养竞争抑制灰霉在草莓叶片上生长，木霉处理过的草莓叶片上的灰霉孢子萌发的芽管长度比未处理组短25%[2]。前期研究表明，木霉能够通过直接抑制灰霉生长达到良好的生防效果，木霉的直接生防机制包括重寄生、抗生和竞争作用，这些作用在有些菌株中同时存在、不分伯仲，在另一些菌株中则以一种为主，明确木霉的直接生防机制为我们有的放矢的防治灰霉病提供了理论指导。1.2木霉防治灰霉的间接生防机制1.2.1木霉在植物表面及内部的定殖木霉有较高的定殖能力，能够定殖于双子叶和单子叶植物的叶、根的表面和内部，并引起植物诱导系统抗性起到对多种病原菌防治的作用。王革等[20]利用扫描电镜观察了木霉菌株在烟草叶面的定殖情况，发现木霉在烟草叶片的定殖位点主要在气孔周围、腺毛基部及叶片凹陷处，可能与这些位点的分泌物或水分较多相关。Zhang等[21]观察哈茨木霉TrichodermaharzianumT−E5在水培黄瓜根部的定殖情况发现，接种初期木霉菌丝密集地覆盖在黄瓜根表面，之后逐渐延伸进入黄瓜根部的皮层组织内，在根部的表皮和外皮层可长期存活。在木霉定殖于植物根3 部的过程中，木霉菌丝缠绕在植物根上，形成类似附着孢的结构，最后穿透根系皮层，在植物表皮和皮层的细胞间生长，而且主要限制在第一、二细胞层之间。黄亚丽等[22]用哈茨木霉Tr−92的分生孢子液处理黄瓜幼苗根部，通过观察根部切片组织也得到了相似的结果。总之，木霉作为一个植物根际定殖者能够适应根际环境，与植物根部实现溶质转移以及养分摄取。然而，不同木霉菌株定殖能力不同，一些菌株仅定殖于植物根系局部，而另一些菌株则能通过根部定殖于植物其他组织。例如，Yang等[23]采用棉花为试验材料研究绿色木霉TrichodermavirideLTR22，LR，Q1，Q2和康宁木霉TrichodermakoningiiTk7a的定殖情况发现木霉不仅可以在根表和根的皮层组织定殖，还能够通过维管束的传输作用定殖于棉花的地上组织部分。木霉在植物表面或内部定殖是一个复杂的过程，在这个过程中木霉会产生多种物质以协助自身完成在植物表面和内部的生长和繁殖，其中以蛋白和多肽类物质居多，包括几丁质酶、蛋白酶、纤维素酶、β−1,3−葡聚糖酶等，这些酶类可以降解植物细胞壁以帮助木霉侵入和定殖。如哈茨木霉分泌的纤维素酶可以降解植物的细胞壁，从而使其进入到玉米根部的皮层组织中，纤维素酶的持续产生加速了木霉的定殖过程[24]。在互作过程中木霉还会产生一系列特殊的蛋白，疏水蛋白是真菌细胞外层细胞壁的疏水性小分子蛋白质，在木霉识别、黏附在植物根部的过程中起重要作用，是木霉粘附在根表面的介质，如棘孢木霉T.asperellum与植物互作过程中会产生疏水蛋白TasHyd1，该蛋白能够保护木霉菌丝不被植物产生的化合物所破坏，从而促进了木霉菌丝的生长和在根部的定殖[25]。另外，木霉完成在植物中的定殖后还产生一系列的物质来激活植物的系统抗性。如长枝木霉T.longibrachiatum分泌的纤维素酶可以进入到甜瓜子叶中，激活乙烯和水杨酸信号传导途径相关的植物系统抗性[26]。另外，Slavica等[27]提纯、验证了一个来自绿色木霉T.viride的蛋白激发子sm1，该蛋白激发子在木霉与植物互作时的表达和分泌量增加，该激发子可以诱导玉米局部和系统抗性基因的表达，同时还结合另外一种疏水蛋白Epl1作为诱导系统抗性的诱导剂。粘绿木霉T.virens菌丝分泌的Sm1和深绿木霉T.atroviride菌丝分泌的Epl1，在木霉与棉花或者玉米互作过程中作为茉莉酸（Jamsonicacid，JA）诱导系统抗性ISR的诱导剂[28]。此外，木霉产生的肽蛋白也会对植物信号通路产生影响，由木霉属产生的肽蛋白通过JA信号通路诱导利马豆中挥发性有机化合物的合成，同时也使水杨酸（Salicylicacid，SA）的生物合成增加[28]，SA含量的增加减少了依赖于JA的挥发性有机化合物的产生，改变了植物对病原体的防御通路。4 1.2.2木霉与植物互作过程中植物的表征变化木霉作用于植物会表现出促进植物生长、提高植物抗病和抵抗非生物胁迫等良好的效果，目前已有关于木霉对辣椒、黄瓜、豌豆、花生、长春花和菊花等多种植物促生效应的研究。Chang[29]用哈茨木霉T-203的分生孢子液处理胡椒、长春花、菊花等植物的种子或根部后，发现胡椒的发芽率提高了，长春花的花期提前，菊花的数量增多，并且这些植物的株高及鲜重都增加了，而西红柿、黄瓜以及胡椒的干重也有明显的增加。曾华兰[30]等用哈茨木霉T23处理花生种子后，发现花生出苗提前、植株健壮、产量提高。李卫平等[31]用绿色木霉处理黄瓜后，发现黄瓜叶片的颜色变深、株高增加。木霉对植物的促生现象明显，这种促生作用不仅来自于木霉对土壤及根际微生物群落的改变，也来自于木霉与植物的相互作用，这一直是人们研究的热点。在悉生条件下的研究发现木霉确实具有促进植物生长的作用，但在复杂的田间条件下木霉是否可以通过与植物互作来促进植物生长还需进一步深入研究。木霉对植物病害的防治能力已经得到了广泛的认可，具有生防作用的木霉制剂也得到了广泛的应用。Elad等[32]用哈茨木霉、赵蕾[33]用绿色木霉防治黄瓜灰霉病Botrytiscinerea，其防治效果均达80%以上。然而，木霉不仅仅具有直接的生防作用，它还能够通过与植物互作提高植物的抗病能力，从而达到抑制病害的效果。黄亚丽等[4]用哈茨木霉Tr−92孢子液处理黄瓜根部，间隔24h后叶面喷施灰霉Botrytiscinerea孢子液，实验结果表明木霉Tr−92的诱导防病效果为53.7%。由此可见木霉与植物互作增强了植物的抗病性。非生物胁迫经常是限制农作物生长和产量的主要因素，一般非生物胁迫能够使农[34，35]作物减产达到50%左右。研究表明，木霉能够减轻非生物胁迫因子对植物的影响，哈茨木霉T.harzianumT22处理过的植物种子在渗透压、盐度及温度胁迫的环境下，其发芽速度、整齐度均提高。施用哈茨木霉T.harzianumT22和抗氧化剂谷胱甘肽具有相似的正面效果。最近的研究表明，哈茨木霉T.harzianumT22能够通过加强植物的抗氧化防御机制和增强抗坏血酸盐谷胱甘肽还原酶的活性提高番茄苗对干旱环境的抗性[36]。木霉对植物促生、抗病和对非生物胁迫的耐性现象已经得到了证实，木霉与植物互作过程中发生的植物表征变化的内部影响因子也是接下来探究的重点。1.2.3木霉与植物互作过程中植物的激素变化对植物体内激素的研究表明，木霉与植物互作使植物体内一系列激素发生明显的变化，包括生长素、水杨酸、茉莉酸、乙烯等。Contreras-Cornejo等[37]发现，绿色木霉和深绿木霉与拟南芥互作使野生型拟南芥生长加速、侧根增多，该过程与生长素含量增加有关。另外，在绿色木霉与拟南芥互作研究中测定水杨酸、茉莉酸和乙烯的含5 量发现，茉莉酸和乙烯的含量都有所增加[38]。不仅在木霉与拟南芥互作中有激素的变化，在木霉与番茄的互作系统中也有相似的发现，木霉处理的番茄植株内茉莉酸含量增加水平高于水杨酸，且当挑战接种灰霉时，茉莉酸继续积累，而水杨酸的含量逐渐降低[39]。木霉在诱导植物激素发生变化的过程中，茉莉酸和水杨酸途径是两大主要通路，关于木霉施用后引起植物信号通路反应的时间进行了大量工作。如粘绿木霉与黄瓜互作的研究中发现SA和JA途径是在木霉施加到黄瓜根部48h后激活的[40]。另外棘孢木霉与黄瓜的互作研究发现，在黄瓜根部接种木霉24h后检测到SA标记的苯丙氨酸氨裂解酶基因的表达，48h后表达量最高，在24-48h之间JA标记的氢过氧化物裂解酶基因表达升高[41]。可见同一植物与不同的木霉菌株互作对激素产生不同的影响，那不同植物与同一木霉菌株互作又会怎样，最近的一项研究表明，钩状木霉TrichodermaHamatumT382接种到拟南芥根部48h后，GO分析显示已经出现了明显的SA信号反应，而JA/ET没有明显的信号反应[42]。在钩状木霉T382与西红柿互作的结果发现ET代谢途径被激活，JA合成相关基因也显著上调[43]。对拟南芥和西红柿与木霉互作过程中激素变化情况比较表明供试植物不同，互作中激素变化也存在差异。Michelina[44]的研究表明，长枝木霉处理番茄后，在番茄感应木霉的初期阶段水杨酸大量积累，含量多于茉莉酸，在这一阶段水杨酸起主导作用，后期茉莉酸含量有所增加，说明在木霉与番茄互作过程中会先后激活番茄的水杨酸和茉莉酸途径。对木霉−拟南芥互作系统的研究表明，木霉在拟南芥根部定殖后，拟南芥叶片中同时产生了大量的茉莉酸和水杨酸[45]，这一现象说明了水杨酸途径和茉莉酸途径都是木霉−拟南芥互作反应中的信号传递途径。1.2.4木霉与植物互作过程中植物的转录水平变化植物体内激素变化通常与基因转录调控有关，因此进一步探讨木霉与植物互作过程中相关基因转录水平的变化可以更深入了解木霉与植物的互作过程及信号传递途径。研究表明，木霉诱导植物产生诱导抗性反应与大量基因的共同转录调节相关，WRKYDNA结合转录因子对调节木霉与植物互作过程中相关基因的转录中起着重要的作用。Yariv等[46]通过微阵列分析和实时荧光定量检测木霉属Trichodermaasperelloides菌株T203处理拟南芥根部时植株内转录子和基因的表达情况发现，木霉通过改变WRKY18和WRKY40转录子来调控茉莉酸阻遏子JAZ，通过抑制JAZ阻遏蛋白刺激了JA信号通路，与氧脂素生物合成相关的基因OPR3、AOS、OPCL1、LOX2、LOX3和LOX4都上调，促进了茉莉酸的生物合成。木霉诱导植物产生系统抗性与病程相关蛋白的转录、翻译水平直接相关，因此研6 究者对植物与木霉互作所诱导表达的一些病程相关蛋白的转录情况进行了深入的研究。Jacobs等[47]在拟南芥根部接种哈茨木霉T34，在第24h测定基因转录情况时发现水杨酸依赖系统抗性相关的基因FMO1和PR−1都出现了下调现象。Yoshioka[48]将棘孢木霉SKT−1接种到拟南芥根部后，其叶片中SA诱导的PR1、PR2、PR5基因以及JA/ET诱导的PDF1.2a等基因都出现了上调。转录组结果进一步证明了植物体内相关激素变化情况。Tan等[49]的研究显示，油棕根部接种哈茨木霉后叶片中的2型核糖体失活蛋白、防卫素及金属硫蛋白等的表达量均出现上调现象。为了进一步明确根部的防卫相关蛋白的转录情况，Tan等[50]将浓度为1～9×108cfu/mL的哈茨木霉孢子液喷施在油棕叶部，在喷施后的3、6、12周测定根部的病程相关蛋白的转录组结果发现，在接种第6周和12周时EgDHN、EgGRBP和EgIFR三个基因的表达量上调，这三个基因的表达量上调预示着油棕树根系中植物抗毒素含量上升，植物的抗病性和抗逆性增强。1.2.5木霉与植物互作过程抗性相关蛋白的变化木霉与植物互作导致的植物激素及基因转录水平的变化势必会引起相关蛋白含量的变化。庄敬华等[51]用绿色木霉菌T23处理黄瓜后，黄瓜体内苯丙氨酸解氨酶、过氧化物酶、多酚氧化酶以及过氧化氢酶四种防御酶的活性都有所增加，且与对照组相比存在显著性差异。黄亚丽等[4]用哈茨木霉Tr−92孢子液处理黄瓜幼苗根部后，黄瓜叶片组织中的POD、PPO、SOD等病程相关蛋白的含量增加。Jai等[52,53]用棘孢木霉T42和荧光假单胞菌OKC处理豌豆，在对抗豌豆白粉病时发现植株中Gα1和Gα2出现了大量的积累，Gα亚基调节茉莉酸相关的基因，激活茉莉酸参与的微生物抵抗病原菌的机制。Contreras-Cornej等[54,55]发现木霉还可以激活促分裂原活化蛋白激酶MPK6的活性，增强植物的系统抗性。由此可见，木霉在与植物互作后植物体内多种防御蛋白以及信号传导相关的蛋白含量及活性会有所增加。最近几年，利用蛋白组方法分析了木霉和不同植物互作所引起的植物蛋白表达变化情况，例如MichalShoresh[56]采用蛋白组学研究方法测定了木霉在玉米根部定殖所引起的植株中蛋白谱的变化，发现共有114个上调蛋白，50个下调蛋白，其中上调蛋白主要与植物的糖代谢以及光合作用相关。Palmieri用哈茨木霉T39喷施在葡萄叶片后进行蛋白组分析发现叶片中脂质转移蛋白（LTP）含量增加，LTP有多种生物功能，其中之一为参与植物的防御反应[50]。通过蛋白组学的研究，可以更系统的描述木霉与植物互作过程中蛋白的总体反应，并推测其信号传递途径。7 1.3课题的意义木霉是灰霉病的重要防治真菌，其对灰霉病的防治存在多机制性，包括重寄生、抗生及竞争的直接拮抗作用以及诱导植物系统抗性的间接拮抗作用。目前，对木霉直接防治灰霉的机制研究已经比较深入，但由于植物的参与使木霉间接防治灰霉的机制较为复杂而未能明确。例如：木霉诱导植物产生系统抗性的信号传导途径受到多种因素影响，常因木霉的种类、菌株、寄主植物的不同而变化，木霉诱导植物产生系统抗性时也存在明显的时效性和剂量性等。生防机制不明会造成木霉制剂的不正确使用并造成木霉生防效果的波动。因此，明确木霉的生防机制并指导木霉制剂的合理应用是进一步稳定和提高木霉制剂防效的关键。然而，到目前为止，对植物响应木霉诱导产生系统抗性的生防机制研究仅包括少数木霉菌株和植物种类，而且这种互作研究也主要集中于木霉诱导植物产生的植物病程相关蛋白、激素等的研究，关于木霉-植物-灰霉三者互作过程中植物的基因组、转录组和蛋白组的分析较少。随着第三代测序技术的成熟，从组学水平上研究木霉-植物-病原菌的互作更为经济可行、数据可靠，因此本研究以本课题组保存的生长迅速、对立枯丝核菌和镰刀菌有拮抗作用的5株木霉菌为基础，进行对灰霉病具有拮抗作用、促进黄瓜生长的木霉菌株的筛选，以此菌株为试验菌株，进行木霉-黄瓜-灰霉病菌的三方互作研究，明确木霉在诱导黄瓜产生系统抗性进行灰霉病防治过程中，木霉在黄瓜根部的定殖情况、黄瓜叶片激素含量变化，并进行三方互作过程中黄瓜转录组和蛋白组质组分析，以明确木霉菌株通过与黄瓜互作引起的植物激素变化并进行信号传导途径推导。通过该研究的进行可以进一步明确木霉-黄瓜-灰霉的三方互作机制，为木霉制剂的推广和应用提供理论基础，为农业上广泛稳定地使用木霉提供了更可靠的理论支持。8 第二章功能木霉菌株的筛选与鉴定2.1引言木霉是一种广泛的环境习居菌，在土壤及其他基物中广泛存在，具有生存能力强、适应性广的特点[57]。早在1937年就发现了木霉的拮抗作用，通过近80年研究木霉的拮抗能力、促长作用及产生多种功能酶类已经被广泛认知，木霉制剂在世界50多个国家和地区推广使用。由于木霉重要的应用价值，对木霉的研究一直是微生物界的研究热点，截至到目前国际上已记录的木霉菌共有104种，在中国发现并报道的木霉菌有20余种，Zhao等[58]从东北地区保护地中分离到11个木霉种，章初龙和徐同[59]对中国河北、浙江、云南及西藏地区的木霉菌标样进行分离获得72株木霉菌，其中中国新记录种4个。即使如此，进行功能木霉菌株资源的开发和应用仍是木霉生物防治研究的重点。本研究以本课题组前期筛选的生长快、且对立枯丝核菌和镰刀菌有拮抗性的5株木霉菌株为基础，以黄瓜灰霉菌为指示菌株，以黄瓜为供试植物，进行具有拮抗和促长功能的木霉菌株的筛选，并采用菌落形态学、显微形态学观察和分子生物学方法相结合的方法进行鉴定，明确其分类。2.2实验材料2.2.1供试菌株菌株编号为H9、木-16-20、9-24、9-25、2-9-1木霉菌株5株（本课题组分离保存），灰霉菌为河北农业大学邢继红老师馈赠。2.2.2供试植物黄瓜品种为津绿小菜园。2.2.3供试培养基PDA培养基：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂12g，水1000mL。200g去皮土豆切成块，加水1000mL，沸水煮30min，用4层纱布趁热在烧杯上过滤，滤渣弃去，滤液补充水到1000mL，加入20g葡萄糖。分装到500mL的锥9 形瓶中，每个锥形瓶分装300mL滤液，加入3.6g琼脂粉，115℃高温高压灭菌30min。PD培养基：配方同PDA，不加琼脂粉。PSA培养基：土豆200g，蔗糖4g，琼脂12g，水1000mL。200g去皮土豆切成块，加水1000mL，沸水煮30min，用4层纱布趁热在烧杯上过滤，滤渣弃去，滤液补充水到1000mL，加入4g蔗糖。分装到500mL的锥形瓶中，每个锥形瓶分装300mL滤液，加入3.6g琼脂粉，115℃高温高压灭菌30min。CMD培养基：玉米粉20g，葡萄糖0.4g，琼脂12g，水1000mL。20g玉米粉加水1000mL，沸水煮30min，用4层纱布趁热在烧杯上过滤，滤渣弃去，滤液补充水到1000mL，加入0.4g葡萄糖。分装到500mL的锥形瓶中，每个锥形瓶分装300mL滤液，加入3.6g琼脂粉，115℃高温高压灭菌30min。小麦汁培养基：小麦粒200g，蔗糖4g，琼脂12g，水1000mL。200g小麦粒加水1000mL,沸水煮30min，用4层纱布趁热在烧杯上过滤，滤渣弃去，滤液补充水到1000mL，加入0.4g蔗糖。分装到500mL的锥形瓶中，每个锥形瓶分装300mL滤液，加入3.6g琼脂粉，115℃高温高压灭菌30min。2.2.4仪器设备表2.1主要仪器及生产厂家Table2.1Maininstrumentsandmanufacturers仪器名称生产公司全自动超纯水仪Thermo全自动高压灭菌锅三洋（日本）低温冷冻离心机Sigma-80℃超低温冰箱Thermo显微镜LEICA透射电镜日立H-7650PCR仪Bio-Rad7500RealtimePCRAppliedBiosystems制冰机Grant电泳仪Bio-Rad凝胶成像系统Bio-Rad10 2.2.5主要试剂表2.2主要试剂及生产厂家Table2.2Mainreagentsandinstruments所用试剂生产厂家Na2CO3天津市永大化学试剂公司NaHCO3天津市永大化学试剂公司Tween-20北京索莱宝科技有限公司KH2PO3天津市永大化学试剂公司NaCl天津市永大化学试剂公司TrisAMRESCOβ-巯基乙醇SigmaKNO3天津市永大化学试剂公司Ca(NO3)2·4H2O天津市永大化学试剂公司MgSO4·7H2O天津市永大化学试剂公司KH2PO4天津市永大化学试剂公司FeSO4·7H2O天津市永大化学试剂公司EDTA天津市永大化学试剂公司MnCl2·4H2O天津市永大化学试剂公司ZnSO4·H2O天津市永大化学试剂公司11 2.2.6溶液配方表2.3植物营养液Table2.3Nutrientsolutionformula溶液成分含量KNO3102g/LSolutionACa(NO3)2·4H2O236g/LH2O1000mLSolutionBMgSO4·7H2O98g/LH2O1000mLSolutionCKH2PO427.2g/LH2O1000mLFeSO4·7H2O5.57g/LSolutionDEDTA7.45g/LH2O1000mLMnCl2·4H2O1.81g/LZnSO4·H2O0.22g/LSolutionECuSO4·5H2O0.08g/LH3BO32.86g/L(NH4)6Mo7O24·4H2O0.09g/LH2O1000mLA、B、C、D、E按体积比1.25：1.25：1.25：1.25：1（mL）加入到1LddH2O中，121℃灭菌15min。2.3实验方法2.3.1拮抗木霉菌株的筛选以前期筛选出的5株菌株为供试木霉菌株，采用平板对峙培养法，在直径90mm的PDA平板培养基上相距两端各1cm的地方分别接入木霉菌块和灰霉菌块（菌块直径为0.5cm），以单独培养的供试木霉菌块为对照，置于25℃恒温培养箱培养，每个12 菌株平板设置3个重复。48h后测量菌落直径，计算各供试菌株对灰霉菌生长的抑制率，计算公式如下[60]：R−R12抑制率=×100%R1式中：R1为灰霉单独培养菌落直径；R2为对峙培养灰霉菌落直径。2.3.2具有促生作用的木霉菌株的分离将洗去包衣的黄瓜种子播种在37℃恒温培养箱中催芽48h，挑取长势一致的发芽种子栽植到水培盒的带孔泡沫板上，每个水培盒20株，待幼苗两片真叶展平后进行木霉接种，将5株木霉的孢子液分别加入到不同水培盒的营养液中使其终浓度为106cfu/mL，以不接种木霉的水培黄瓜为对照，每处理3个重复，待木霉接种14d后测定各处理中黄瓜的根长、株高，并称量鲜种[61]。用SPSS17.0统计学软件，以均值±标准差（x±s）表示计量资料，以P≤0.05时为差异有统计学意义。2.3.3功能木霉菌株的形态学鉴定将筛选出同时具有拮抗和促生作用的木霉菌株H9接种到PDA、PSA、CMD以及小麦汁培养基上，28℃恒温培养，观察并测定该菌株在不同培养基上菌落形态、生长速度、色素产生情况，并利用光学显微镜进行木霉菌丝及孢子和分生孢子的形态的观察[62,63]，参照《真菌鉴定手册》和《木霉分类与鉴定》进行木霉初步鉴定。2.3.4功能木霉菌株的分子生物学鉴定2.3.4.1木霉H9菌液的制备将保存的木霉H9接种到PDA平板上进行活化，30℃恒温培养箱培养4-5d直至产深绿色孢子，向平板中加入5mL无菌水洗下孢子，用移液器吸取1mL孢子悬浮液接种到盛有20mLPD培养基的100mL三角瓶中，30℃、200r/min震荡培养48h[64]。2.3.4.2木霉基因组DNA的提取采用北京索莱宝试剂盒进行木霉基因组DNA的提取，具体步骤为：（1）取1-2mL培养好的菌液，离心收集，弃上清，加入200µl溶液A，加入20µl的RNaseA，再加入100mg玻璃珠，在高速振荡器上震荡5min。（2）加入20µl的蛋白酶K（10mg/mL），充分混匀，55℃水浴消化30min，消化期间可颠倒离心管混匀数次。12000rpm离心2min。将上清转移到一个新的离心管中。13 （3）在上清中加入200µl的溶液B，充分混匀。（4）再加入200µl的无水乙醇，充分混匀，加入到吸附柱中，放置2分钟。（5）12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。（6）向吸附柱中加入600µl的漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中（重复2次）。（7）12000rpm离心2min，将吸附柱置于室温或50℃温箱放置数分钟，将残余的漂洗液除去。（8）将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50-200µl经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置5min，12000rpm离心1min.（9）离心所得洗脱液再加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心2min，得到高质量的基因组DNA。2.3.4.3ITS序列的PCR扩增以提取的木霉H9基因组DNA为模板，以ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'、ITS6：5'-GAAGGTGAAGTCGTAACAAGG-3'为引物进行木霉核糖体DNA中ITS区域的扩增。PCR反应条件及体系如下：PCR反应条件：预变性94℃，5min；变性94℃，1min，退火53℃，30s延伸72℃，1min，33个循环；充分延伸72℃，10min。PCR反应体系：10×buffer2µl模板1µldNTP2µlITS41µlITS61µlr-Tap酶0.2µlddH2O12.8µl2.3.4.418SrDNA序列的PCR扩增以提取的木霉H9基因组DNA为模板，以NS5:5'-AACTTAAAGGAATTGACGGAAG-3'、NS6:5'-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3'为引物进行木霉18SrDNA序列的扩增。PCR反应条件及体系如下：PCR反应条件：预变性94℃，4min；变性95℃，1min，退火50℃，1min，延伸72℃，1min，30个循环；充分延伸72℃，10min。14 PCR反应体系：10×buffer2µl模板1µldNTP2µlNS51µlNS61µlr-Tap酶0.2µlddH2O12.8µl2.3.4.5TEF-1α序列的PCR扩增以提取的木霉H9基因组DNA为模板，以IEf728:5'-CATCGAGAAGTTCGAGAAGC-3'、Tef1αR:GCCATCCTTGGGAGATACCAGC-3'为引物进行木霉TEF-1α的扩增。PCR反应条件及体系如下：PCR反应条件：预变性94℃，5min；变性94℃，30s，退火55℃，1min，延伸72℃，1min，35个循环；充分延伸72℃，7min。PCR反应体系：10×buffer2µl模板1µldNTP2µlIEf7281µlTef1αR1µlr-Tap酶0.2µlddH2O12.8µl2.3.4.6PCR产物序列分析及系统发育树构建取2µlPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将目的条带正确的PCR产物送至生工生物有限公司测序。将测序得到的序列在GeneBank数据库中并利用TrichoBlast程序与木霉序列进行比对，选择其中合适序列利用ClustalX1.83进行分析，利用MEGA4.1软件进行系统发育树的构建。2.4结果与分析2.4.1拮抗灰霉菌的木霉菌株筛选通过平板对峙法发现，5株木霉菌均对灰霉菌的生长具有一定的抑制作用，培养15 48h后可观察到木霉菌株对灰霉菌丝生长的影响，之后灰霉菌落停止生长，而木霉菌株仍可在灰霉菌菌落上继续生长，直至对灰霉完全覆盖（以灰霉平板为对照）。计算木霉对灰霉菌的抑制作用发现，所选5株木霉对灰霉菌丝生长的抑制能力都超过30%，其中H9的抑制能力最强为54.10%。表2.4木霉菌株对灰霉菌菌丝生长的抑制情况Table2.4Trichodermastraininhibitionrate菌株病原菌趋向直径（cm）抑制率（%）H93.58±0.0154.10木-16-203.78±0.0051.549-244.10±0.0347.442-9-14.18±0.0146.419-254.59±0.0241.15H9木-16-209-249-25灰霉2-9-1图2.1木霉-灰霉对峙培养Fig.2.1ThepairedcultureofTrichodermaandBotrytis2.4.2不同木霉菌株对黄瓜生长作用的影响采用水培法测定了不同木霉菌株对黄瓜生长的影响（表2.5），实验结果表明5株木霉对黄瓜生长均有一定的促生作用，其中菌株H9、木-16-20和9-24对黄瓜根长、16 株高、鲜重都显著的促进作用，以H9的促长效果最为明显，与对照均存在显著差异。表2.5木霉菌株对黄瓜的促生长作用Table2.5ThegrowthpromotingeffectofTrichodermastrainsoncucumber菌株根长（mm）增幅（%）株高（mm）增幅（%）鲜重（g）增幅（%）H974.61±0.01a48.6837.89±0.02a10.8248.63±0.01a27.44木-16-2069.53±0.02ab38.5636.33±0.00ab6.25945.13±0.02a18.279-2466.41±0.00ab32.3434.25±0.03b0.17539.80±0.00a4.2982-9-152.54±0.03b4.70334.82±0.01b1.84239.03±0.03b2.2809-2551.89±0.01b3.40834.61±0.00b1.22838.20±0.00b0.105CK50.18±0.02b-----34.19±0.00b-----38.16±0.01b-----2.4.3木霉菌株H9的菌种鉴定2.4.3.1木霉H9在不同培养基的生长形态图2.2为木霉H9在PDA、PSA、CMD和小麦汁等四种培养基上的生长情况，由图可以看出不同的培养基对木霉菌生长、菌落形态及孢子产生情况有明显的影响，将接种木霉H9的PDA培养基于35℃培养12h后肉眼可见气生菌丝且伴有黄色色素产生，培养3d菌落呈放射状生长至整个平板，培养5d时呈地毯状绿色，产孢区形成明显的同心圆环，平板背面由淡黄色转变为黄褐色。在PSA、CMD和小麦汁培养基上，木霉H9生长缓慢，菌丝稀疏、产孢数量少，在PSA培养基上接种24h后在培养基上可见萌发的菌丝，平均生长速度为1.0cm/d，后期有黄色色素产生；在CMD培养基上接种36h后可见菌丝，生长速度为0.8cm/d，后期可见黄色色素产生；在小麦汁培养基上接种48h后产生菌丝，菌丝生长缓慢，无黄色色素产生。图2.2木霉菌株H9在PDA、PSA、CMD、小麦汁培养基上的生长形态Fig.2.2ThegrowthconditionofTrichodermaH92.4.3.2木霉的显微形态鉴定如图2.3所示，显微镜下观察到木霉H9的分生孢子梗长而直，次级分枝呈直角17 对生，朝主枝略有弯曲。上部次级分支短，越到基部次级分枝越长，瓶梗呈圆柱状，顶部明显变细。分生孢子单细胞椭圆形（如图2.4），光滑，大小约为2-6µm。以上特征与长枝木霉相似，因此将木霉H9鉴定为T.longibrachiatum。图2.3光学显微镜下木霉H9菌株的分生孢子梗的形态Fig.2.3MicroscopicviewoftheconidiosporeofTrichodermaH9图2.4光学显微镜下木霉H9的孢子形态Fig.2.4MicroscopicviewoftheconditionofrichodermaH9通过对木霉H9平板培养形态和显微形态观察，对照《真菌鉴定手册》和《木霉分类与鉴定》进行鉴定发现，该木霉从形态上与长枝木霉和哈茨木霉较为相似。下一步通过分子生物学方法进一步明确木霉的种属。18 2.4.3.3木霉H9菌株的分子生物学鉴定以提取的H9基因组DNA为模板，以相应的引物进行了木霉ITS序列、TEF基因序列和18SrDNA序列进行了扩增，电泳图见图2.5，由图2.5可以看出：木霉ITS序列长度约为500-700bp之间、18SrDNA基因序列长度约为550-750bp、TEF序列长度约为500-600bp，与预期结果相同。将扩增正确PCR产物进行测序，所得序列进行Genbank和Trichoblast比对，并构建系统发育树。由图2.6、2.7、2.8可知，利用木霉ITS序列、TEF序列和18SrDNA序列均与长枝木霉亲缘关系最近，聚集于一个分支。结合形态学鉴定的结果，确定本研究所筛选出的具有拮抗和促生功能的H9菌株为一株长枝木霉。Marker123Marker1232000bp2000bp1000bp1000bp750bp750bp500bp500bp图2.5PCR产物电泳图Fig.2.5PCRamplification注：图中A：H9菌株ITS区PCR产物电泳图；B：H9菌株18SrDNAPCR产物电泳结果；C：TEF1-α基因序列PCR产物电泳图；Marker代表：Marker2000；1、2、3代表:木霉H9。图2.6菌株H9基于ITSrDNA序列同源性构建的系统发育树Fig.2.6PhylogenetictreeofStrainH9basedonITSrDNAsequenceshomology19 图2.7菌株H9基于18srDNA序列同源性构建的系统发育树Fig.2.7PhylogenetictreeofStrainH9basedon18srDNAsequenceshomology图2.8菌株H9基于TEF-1α序列同源性构建的系统发育树Fig.2.8PhylogenetictreeofStrainH9basedonTEF-1αsequenceshomology20 2.5小结（1）通过平板对峙培养法和水培促生实验进行筛选，从5株木霉菌株筛选出一株对灰霉拮抗效果好且促长作用明显的木霉菌株H9。（2）通过平板形态学、显微形态学和分子生物学的方法进行木霉H9菌株的鉴定，最终确定具有灰霉拮抗作用和对黄瓜促生作用的木霉H9为长枝木霉。21 22 第三章木霉H9与黄瓜互作引起黄瓜系统抗性的研究3.1引言木霉对植物病害的防治能力已经得到了广泛的认可，具有生防作用的木霉制剂也得到了广泛的应用。近期研究表明，木霉不仅能够直接防治黄瓜灰霉病，而且能够通过改变植物来起到防治灰霉。木霉与植物互作过程中，首先是木霉在植物中定殖，在这一过程中，木霉菌丝缠绕在植物根上，形成类似附着胞的结构，最后穿透根系皮层，在植物表皮和皮层的细胞间生长[65,66]。因此，对木霉与植物的互作研究首先要确定木霉是否能够在植物根系表面定殖。木霉在植物根部的定殖会引起植物体内一系列反应，茉莉酸、乙烯和水杨酸是植物中非常重要的两种內源激素，也是植物防御反应的信号分子[67]，在植物信号传导过程中具有重要作用，不同激素含量的多少决定了植物系统抗性的传递途径，因此对植物激素合成相关基因的表达情况和激素含量进行检测，对明确木霉诱导植物的信号传导途径具有重要的意义。因此，本研究以筛选出的木霉菌株H9为材料，在确定菌株具有诱导黄瓜系统抗性和能够在黄瓜根部定殖后，对水杨酸和茉莉酸合成基因的表达情况和激素含量进行检测，以期初步明确木霉H9引起的黄瓜系统抗性的信号途径。3.2实验材料3.2.1供试菌株长枝木霉H9（本课题组分离保存），灰霉菌为河北农业大学邢继红老师馈赠。3.2.2供试植物黄瓜品种为津绿小菜园。23 3.2.3供试营养液表3.1植物营养液Table3.1Nutrientsolutionformula溶液成分含量SolutionAKNO3102g/LCa(NO3)2·4H2O236g/LH2O1000mLSolutionBMgSO4·7H2O98g/LH2O1000mLSolutionCKH2PO427.2g/LH2O1000mLSolutionDFeSO4·7H2O5.57g/LEDTA7.45g/LH2O1000mLMnCl2·4H2O1.81g/LZnSO4·H2O0.22g/LSolutionECuSO4·5H2O0.08g/LH3BO32.86g/L(NH4)6Mo7O24·4H2O0.09g/LH2O1000mLA、B、C、D、E按体积比1.25：1.25：1.25：1.25：1（mL）加入到1LddH2O中，121℃灭菌15min。3.3实验方法3.3.1黄瓜幼苗的培养挑选出籽粒饱满的黄瓜种子用蒸馏水洗去包衣，经55℃恒温水浴浸泡10~15min，75%的酒精表明消毒30s，无菌水冲洗3次，用纱布包好并平铺在培养皿中，置于30℃恒温箱催芽，待种子露白时即可播种。将露白的黄瓜种子播种于盛有植物营养液的水培盒中，在人工植物培养室中进行培养，培养条件为：光照黑暗（12h:12h），温度为25±2℃。24 3.3.2菌种的培养及孢子液制备3.3.2.1木霉H9的培养及孢子液的制备将保存的H9菌种接种到PDA平板上28℃恒温培养。将培养5-6d的木霉平板用无菌水冲洗，收集孢子液进行适当稀释，显微镜下用血球计数板计数并调整终浓度为108cfu/mL。3.3.2.2灰霉的培养及孢子液制备将低温保存的灰霉菌接种到PDA平板，置于22℃恒温培养箱中培养，将培养8-10d的灰霉病原菌平板用无菌水冲洗，将洗脱下的孢子液用四层纱布过滤去除菌丝，显微镜下用血球计数板计数并调整终浓度为108cfu/mL。3.3.3木霉H9对黄瓜的诱导接种黄瓜幼苗长到3片真叶后，将1mL浓度为108cfu/mL的木霉孢子悬浮液注入到装有99mL培养黄瓜的水培盒中，使木霉最终浓度为106cfu/mL，进行木霉诱导处理。3.3.4灰霉的挑战接种木霉诱导处理的第24h时进行灰霉的挑战接种，接种方法为：用10mL无菌的注射器（无针头）将制备好的灰霉孢子液注射到到黄瓜植株叶面背部并在25℃下保湿48h。3.3.5木霉与黄瓜互作防治灰霉病的效果试验共设三个处理，分别为木霉组（营养液中加入木霉孢子液）、木霉-灰霉组（木霉孢子液诱导接种和灰霉病菌挑战接种）、灰霉组（灰霉孢子液挑战接种），以未接种微生物植株为空白对照。将处理后的水培黄瓜在植物培养室中进行培养，培养条件为：温度20℃、湿度RH≥90%、光暗周期为12h:12h。每天定时对不同处理灰霉发病情况进行统计，待灰霉处理组叶面普遍发病后，按照黄瓜灰霉病病情分级标准记录各处理发病情况，计算出病情指数和防病效果。黄瓜灰霉病病情分级标准[68]如下：0级：无病症；1级：接种叶出现少量病斑；2级：病斑面积占叶面积的1/3；25 3级：病斑面积占叶面积的1/3-1/2；4级：病斑面积占叶面积的1/2-2/3；5级：病斑面积占叶面积的2/3以上。病情指数％=（各级病叶数×病级数）/(调查总叶数×最高病级数)×100。防病效果％=（对照病情指数－处理病情指数）/对照病情指数×100。3.3.6木霉在黄瓜根部定殖的透射电镜观察（1）取材采集经木霉诱导处理4d后的黄瓜幼苗根组织，用锋利的剪刀取黄瓜幼苗的根部新鲜组织，用PBS缓冲液将根部表面冲洗干净，立即放入浓度为2.5%的戊二醛溶液中浸泡。取材要新鲜，位置要准确，在3~5s内迅速完成；（2）前固定将4%戊二醛固定2~4h以上；（3）1/15M磷酸缓冲液浸洗3次以上或过夜；（4）1%锇酸固定1~2h，由于根具有细胞壁所以延长时间至3h至组织变黑；（5）1/15M磷酸缓冲液（PBS）浸洗两次，每次20min；（6）丙酮逐级脱水，50%、70%、80%、90%和100%，100%重复两次。每次脱水时间10~15min。第二次100%丙酮脱水回到室温，其他步骤再4℃冰箱中进行；（7）浸透1:1（纯丙酮：包埋剂）3h；1:3（纯丙酮：包埋剂）3h以上或过夜37℃；纯包埋剂浸透5h以上37℃；（8）包埋向包埋模具中加入少量的包埋剂，放入样品，再加入包埋剂，并及时调整样品方向和位置最后置于60℃烘箱中烘烤过夜，形成包埋块（48~72h）；（9）修块与切片将包埋块夹在手中，用刀削去表面包埋剂，露出组织，在组织四周以和水平面成45°的角度削去包埋剂，形成锥形体；（10）超薄切片厚度为50nm左右；将切下的片子用镊子或吸管转移到干净的事先滴有蒸馏水的载玻片上，在酒精等下加温，使切片展开；直到干燥，使材料固定在载玻片上（以防后续操作中材料被冲走）；（11）染色用醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色法进行染色。将制好的黄瓜根部片子放在型号为日立H-7650的透射电镜下进行观察，通过与对照组对比找出木霉在根部的定殖位点。26 3.3.7黄瓜植株内激素相关基因的表达情况3.3.7.1实验处理及所用引物序列本实验共设3个处理，以未接种木霉和灰霉的为对照（表3.2），具体处理方法同第三章3.3.5，每个处理3次重复。表3.2实验处理Table3.2Experimentaltreatment序号处理处理1木霉诱导处理+灰霉接种处理（3个平行实验）处理2灰霉接种处理（3个平行实验）处理3木霉诱导处理（3个平行实验）对照营养液对照（3个平行实验）表3.3引物序列Table3.3PrimersequencePrimer序列（5'to3'）LOX1fTTGGAGGAAACAAAATCAAAGGGALOX1rTGGCACTAATGAGTTGGAAAGAAALOX2fCCTAAGAGCAAACTTGACCCALOX2rCAATGCCTCAGCAACTGTAAGAOSfATCAACCATTCGCAACAAGAGAOSrAAAGTTCAACCACCATAAGCCEIN2fACAAAAGGGGCACCAGCEIN2rCCAACTCTCAGTAGAAGGCAAACCfAGAACACATAGCCAGCAAAGGACCrGGAGATGACGGAGGAAGAAAGPAD4fAGAACAGCAAGCAGAATAGGAC27 PAD4rCTTGAAGCAATCGTAGTAACCC3.3.7.2实时荧光定量检测与茉莉酸、乙烯、水杨酸相关标记基因的表达在木霉诱导接种后的第48h、72h、96h采集各处理第3片黄瓜叶片，准确称取叶片0.5克并进行液氮研磨，将研磨后的黄瓜叶片加入1mL离心管中，加入1000µl的RNAisoTMPlus静置5min，12000g、4℃离心5分钟，上清转移至新的1.5mL离心管中，加入200µlRNAisoTMPlus体积量的氯仿（冰箱储存），振荡混匀后室温静置5分钟，12000g4℃离心15分钟，将上清液转移至新的离心管中加入与上清液等体积（400µl）的异丙醇（冰箱储存），-20℃静置过夜，12000g4℃离心10分钟，向沉淀中加入1mL的由DEPC水配置的75%乙醇（冰箱取出）清洗沉淀(两次)；倒掉液体再加入乙醇再离心，12000g4℃离心5分钟。弃上清保留沉淀干燥10min，溶解于25µl的DEPC处理水中（在冰上溶解）10-15min，进行Real-timePCR，具体过程如下：（1）基因组DNA去除反应5×gDNAEraseBuffer2µlgDNAErase1µlTotalRNA(1µg/c=V)*10^31µlddH2O6µl将以上反应体系放入RT-PCR仪的反应槽中进行反应，42℃、2min去除RNA中的DNA成分。（2）RNA的反转录5×gDNAEraseBuffer24µlPrimeScriptRTEnzymemix11µlRTPrimerMix1µlddH2O4µl将以上反应体系加入到10µl除去了DNA的RNA中，37℃保温15min。（3）Real-timePCR将反转录获得的cDNA稀释10倍为模板进行Realtime-PCR，反应体系和条件如下：模板5µlSYPR10µl28 上游引物0.8µl下游引物0.8µlROX0.4µlddH203µlRealtimePCR条件：95℃15s；95℃，5s，60℃，34s，40cycles。3.3.8黄瓜叶片中植物激素的检测3.3.8.1实验处理本实验共设3个处理，以未接种木霉和灰霉的为对照（表3.4），具体处理方法同第三章3.3.5，每个处理3次重复。表3.4实验处理Table3.4Experimentaltreatment序号处理处理1木霉诱导处理+灰霉接种处理（3个平行实验）处理2灰霉接种处理（3个平行实验）处理3木霉诱导处理（3个平行实验）对照营养液对照（3个平行实验）3.3.8.2样品处理在木霉诱导处理96h后分别采集各处理的黄瓜叶片，用锡箔纸包好并标号迅速放入液氮1min，并于-80℃冰箱中保存30min，进行茉莉酸和水杨酸的激素提取工作。3.3.8.3激素的提取（1）准确称量约1g植物样品，于液氮中研磨至粉碎；（2）向粉末中加入10mL异丙醇／盐酸提取缓冲液，4℃震荡30min；（3）加入20mL二氯甲烷，4℃震荡30min；（4）4℃，13000rpm离心5min，取下层有机相；（5）避光，以氮气吹干有机相，以400µl甲醇（0.1%甲酸）溶解；（6）过0.22µm滤膜，进行HPLC-MS/MS检测。3.3.8.4JA、SA标准溶液的配制以甲醇（0.1%甲酸）为溶剂配制梯度为0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、200ng/mL的SA、JA标准溶液。29 3.3.8.5液相条件色谱柱：poroshell120SB-C18反相色谱柱（2.1×150，2.7µm）；柱温：30℃；流动相：A：B=（甲醇/0.1%甲酸）：（水/0.1%甲酸）；洗脱梯度：0-2min，A=20%；2-4min，A递增至50%；4-10min，A递增至80%；10-11min，A=80%；11.1min，A递减至20%；11.1-15min,A=20%；进样体积：2µl。3.3.8.6质谱条件气帘气：15psi；喷雾电压：4500v；雾化气压力：65psi；辅助气压力：70psi；雾化温度：400℃。3.3.8.7样品中激素含量的计算样品中激素含量(ng/g)=检测浓度(ng/mL)×体积系数(mL)/质量系数(g)。3.3.8.8数据处理用SPSS17.0统计学软件，以均值±标准差（x±s）表示计量资料，分析方法采用单因素分析，利用LSD检验分析显著性差异，以P≤0.05时为差异有统计学意义。3.4结果与分析3.4.1木霉H9与黄瓜互作防治灰霉病的效果表3.5木霉H9诱导黄瓜对灰霉病的防治效果Table3.5TheeffectionofinducedcucumbersystemresistenceofGreymouldbyTrichodrmaH9接种天数处理组4d8d12d病情指数防病效果%病情指数防病效果%病情指数防病效果%H0.339——0.465——0.530——CK0——0——0——M0——0——0——M-H0.267*49.620.234*55.850.213*56.7注：H代表黄瓜只接种灰霉；CK代表不加微生物的对照组；M代表只接种木霉；M-H代表黄瓜接种木霉和灰霉。通过表3.5可知，与对照组相比木霉H9能够使黄瓜叶片的灰霉病的发病率降低，30 表明木霉对黄瓜的抗病作用为诱导系统抗性，与对照相比随着时间延长木霉对黄瓜的诱导抗病性加强。由上述结果可知，木霉通过与黄瓜植株互作达到了防治黄瓜灰霉病的效果。3.4.2木霉H9在植物根部的定殖采用透射电子显微镜观察长枝木霉H9接种4天后黄瓜根切片发现，大量木霉菌丝（T）在根表面发育，有一些木霉菌丝可以穿透根表皮（EP）组织，进入皮质区（CA）（见图3.1）。通过对多个根组织切片观察发现，木霉菌丝主要在细胞间生长，引起细胞壁增厚，不进入植物细胞内。EPTCA图3.1木霉在黄瓜根部的定殖情况Fig.3.1ColonizationofTrichodermaincucumberRoots3.4.3木霉诱导茉莉酸、乙烯、水杨酸信号传递途径相关基因的表达情况3.4.3.1茉莉酸相关基因的表达情况在木霉诱导处理黄瓜后的不同时间测定茉莉酸相关基因的表达情况，由图3.2、3.3和3.4可知，长枝木霉H9诱导处理黄瓜根部可引起黄瓜叶片内与茉莉酸相关的基因LOX1、AOS、LOX2的表达改变，诱导处理96h后出现明显上调。与其他处理相比，木霉与灰霉共同处理黄瓜时基因LOX1、AOS、LOX2的表达上调情况最为显著。31 图3.2茉莉酸生物合成关键基因LOX1的表达情况Fig.3.2ExpressionofjasmonicacidrelatedgenesLOX1图3.3茉莉酸生物合成关键基因AOS的表达情况Fig.3.3ExpressionofjasmonicacidrelatedgenesAOS32 图3.4茉莉酸生物合成关键基因LOX2的表达情况Fig.3.4ExpressionofjasmonicacidrelatedgenesLOX23.4.3.2乙烯相关基因的表达情况Realtime-PCR结果显示长枝木霉H9施加在黄瓜根部96h后可引起黄瓜叶片内与乙烯相关的基因EIN2、ACC的表达上调。且木霉单独处理黄瓜时，基因EIN2、ACC的表达比木霉、灰霉共同处理黄瓜时的表达上调明显（见图3.5和3.6）。图3.5乙烯生物合成关键基因EIN2的表达情况Fig.3.5ExpressionofethylenerelatedgenesEIN233 图3.6乙烯生物合成关键基因EIN2的表达情况Fig.3.6ExpressionofethylenerelatedgenesEIN23.4.3.3水杨酸相关基因的表达Realtime-PCR结果显示长枝木霉H9施加在在黄瓜根部72h后可引起黄瓜叶片内与水杨酸相关的基因PAD4的表达上调，96h时上调更明显，且在96h时木霉与灰霉共同处理组的基因PAD4的表达比木霉单独处理黄瓜时的表达上调明显（见图3.7）。图3.7水杨酸生物合成关键基因PAD4的表达情况Fig.3.7ExpressionofsalicylicacidrelatedgenesPAD4由Realtime-PCR结果可知黄瓜体内与茉莉酸、乙烯、水杨酸这三种激素相关的基因在木霉诱导96h后表达均上调，初步推测长枝木霉H9诱导黄瓜的信号传导途径为34 茉莉酸/乙烯和水杨酸共同调节。3.4.4黄瓜内茉莉酸和水杨酸激素含量通过液质联用检测木霉接种后96h不同处理黄瓜叶片中JA和SA的含量，由表3.6可知木霉的诱导作用使黄瓜植株内水杨酸和茉莉酸的含量均增加，且茉莉酸的含量比水杨酸含量增加明显。比较不同处理组间水杨酸的含量可知，木霉-黄瓜二者互作时水杨酸的含量比木霉-黄瓜-灰霉三方互作时水杨酸含量略高；而茉莉酸含量则相反，木霉-黄瓜-灰霉-三方互作时茉莉酸含量比木霉-黄瓜二者互作时茉莉酸含量要高。表3.6处理组间的激素含量Table3.6Hormonecontentintreatmentgroup处理SA(ng/g)JA(ng/g)CK104.24±0.315689.48±0.5237木霉137.29±1.8120**151.45±0.0403**灰霉105.06±0.4875100.24±0.0332*木霉-灰霉121.06±1.0612*167.75±1.1811**3.5小结（1）通过对不同处理的黄瓜叶部接种灰霉的病情进行统计与分析，发现在黄瓜根部施加长枝木霉H9后能够降低黄瓜叶片灰霉病发病率，表明木霉H9具有诱导黄瓜产生系统抗性的作用。（2）透射电子显微镜观察发现，长枝木霉H9能够在黄瓜根部能够成功定殖，由最初在根部的表面附着逐渐进入到根部细胞皮层，最终在细胞间隙定殖，木霉在根部的定殖是发挥诱导系统抗性的基础。（3）通过Realtime-PCR实验确定木霉接种后96h黄瓜叶片内茉莉酸、乙烯和水杨酸相关的关键基因表达明显上调。（4）通过HPLC-MS/MS测定了木霉根部诱导处理黄瓜96h时黄瓜叶片中的茉莉酸和水杨酸的含量，经过木霉的处理水杨酸含量和茉莉酸含量都增加。35 36 第四章木霉-黄瓜互作转录组分析4.1引言转录组（transcriptome）是指某一生理条件下，细胞内所有转录产物的集合，包括RNA、转运RNA及非编码RNA等，通过测定转录组能够全面快速地获得某一物种特定组织或器官在某一状态下的几乎所有转录本序列信息，随着第三代测序技术的成熟，转录组成为研究基因表达的主要手段。比较不同处理条件下转录组的差异可以确定不同处理对基因表达的影响。通过测定木霉-黄瓜互作过程中的激素含量和基因表达情况可以初步推测，木霉的诱导信号可以通过茉莉酸和水杨酸途径进行传递。然而，对其他可能参与的途径还不清楚。因此，为了进一步验证和发现木霉诱导黄瓜所涉及的转录差异表达情况，本研究在实时荧光定量检测与茉莉酸、乙烯、水杨酸相关标记基因上调的基础上进一步进行木霉-黄瓜互作、木霉-黄瓜-灰霉三方互作以及不加微生物三个处理的黄瓜叶片转录组测序分析，从转录水平来确定木霉诱导黄瓜产生的信号传导途径。4.2实验材料4.2.1供试菌株长枝木霉H9（本课题组分离保存），灰霉菌为河北农业大学邢继红老师馈赠。4.2.2供试植物黄瓜品种为津绿小菜园。37 4.2.3植物营养液表4.1植物营养液Table4.1Nutrientsolutionformula溶液成分含量KNO3102g/LSolutionACa(NO3)2·4H2O236g/LH2O1000mLSolutionBMgSO4·7H2O98g/LH2O1000mLSolutionCKH2PO427.2g/LH2O1000mLFeSO4·7H2O5.57g/LSolutionDEDTA7.45g/LH2O1000mLMnCl2·4H2O1.81g/LZnSO4·H2O0.22g/LSolutionECuSO4·5H2O0.08g/LH3BO32.86g/L(NH4)6Mo7O24·4H2O0.09g/LH2O1000mLA、B、C、D、E按体积比1.25：1.25：1.25：1.25：1（mL）加入到1LddH2O中，121℃灭菌15min。4.3实验方法4.3.1实验设计本实验设木霉+灰霉处理、木霉处理，以不接种微生物的水培黄瓜为对照，每处理三个重复。试验方法与第三章3.3.5相同。38 表4.2实验处理Table4.2Experimentaltreatment序号处理第一组木霉诱导处理+灰霉接种处理（3个平行实验）第二组木霉诱导处理（3个平行实验）第三组营养液对照（3个平行实验）4.3.2样品处理采集木霉诱导处理96h时，采集各处理黄瓜幼苗的第三片和第四片叶片，准确称量500mg，放入封口袋迅速加入液氮放到-80℃冰箱冷冻30min，用干冰封存后送往上海伯豪生物技术有限公司，进行转录组测序，空白对照组也同时进行样品的采集。4.3.3RNA提取质检将叶片取出放置于提前装有液氮的研钵内，在液氮环境下研磨成粉末状，采用RNAisoPlusTotalRNAextractionreagent按照标准流程进行抽提工作。抽提的RNA使用RNACleanXPKit和RNase-FreeDNaseSet纯化。4.3.4转录组测序合格的RNA样品由上海伯豪生物科技有限公司进行测序文库构建,按照实验操作说明对纯化后的TotalRNA进行mRNA的分离、片段化、第一链cDNA合成、第二链cDNA合成、末端修复、3’末端加A、连接接头、富集等步骤，完成测序样本文库构建。所建文库使用Qubit®2.0Fluorometer检测浓度，Agilent2100检测文库的大小。合格的文库利用IlluminaHiSeqXTen高通量测序平台对文库进行转录组测序,利用basecalling将测序后得到的原始图像数据转化为序列数据，即原始序列数据(rawreads)。4.3.5数据预处理测序得到RawReads中可能含有总体质量较低、含有测序引物、末端质量偏低等不合格的Reads，这些不合格的Reads很有可能对分析质量造成一定的影响，所以必须对其进行过滤，得到可用于数据分析的cleanReads，应用Seqtk进行过滤，主要步骤如下：（1）去除reads中所含有的接头序列；（2）去除3’端质量Q低于20的碱基，即碱基错误率小于0.01，其中，39 Q=-10logerror_ratio；（3）去除长度小于25的reads；（4）去除所属物种的ribosomeRNAreads。4.3.6基因组比对应用TopHat（version:2.0.9）的splicedmapping算法对预处理后的reads进行Genomemapping，这种算法允许将不能全长匹配的reads分割进行mapping，较适用于真核(有内含子间区)转录组测序数据；比对允许2个错配，每个reads允许multihits<=2。Mapping生成的比对结果为BAM文件，见：0原始数据。采用基因组版本为Chineselongv2，下载地址为：ftp://www.icugi.org/pub/genome/cucumber/Chinese_long/v2/。4.3.7基因表达定量和差异基因筛选我们首先应用HTSeq对TopHat比对后每个基因的Fragments数进行计数，然后用TMM（trimmedmeanofMvalues）法进行归一化，最后利用perl脚本计算出每个基因的FPKM值。公式如下：AFPKM=B×C式中：A为totalexonFragments；B为mappedreads(Millions)；C为exonlength(KB)。其中：totalexonfragments代表比对到基因exon上的fragment数目；exonlength代表为基因exon的总长度；mappedreads代表比对到参考基因组的总reads数目。4.3.8差异基因的富集分析将差异的基因比对至GO数据库（www.geneontology.org）和KEGG数据库（www.genome.jp/kegg），根据富集结果分析差异基因主要参与的生化代谢功能和信号转导途径。40 4.4结果与分析4.4.1RNA质量分析RNA采用Aglient2100质检，根据质检结果（图4.1）显示，9个样本RNA均可见明显的28S和18S两条主条带，样本RNA完整性较好，且样本OD值均位于1.8-2.2区间，样本纯度较高，可以用于后续测序实验。图4.1Agilent2100RNA电泳结果图Fig.4.1TheresultstotheRNAsbyAgilent21004.4.2测序质量分析9个样本测序所得数据如表4.3，所有数据均符合后续数据分析要求。表4.3测序所得数据质量结果Table4.3TheresultofthetranscriptomesequencingdataqualityQ30ratiorRNAMappingSampleIDRawreadsCleanreadsMappedreads(%)trimedratioCK154,607,26290.6051,239,58651,145,37348,235,68494.31%CK273,064,96090.8468,979,02368,879,66765,516,59595.12%CK369,831,96091.9365,952,99465,884,12862,186,94294.39%木霉155,824,36292.4253,055,89152,975,51849,861,32094.12%木霉298,496,52290.6092,913,01892,819,95588,021,49694.83%木霉372,629,34893.1269,039,73368,878,92864,518,72993.67%木霉-灰霉148,934,24891.9546,337,98446,181,43443,305,29493.77%木霉-灰霉250,783,58491.3548,552,51848,451,95645,845,99194.62%木霉-灰霉352,007,69492.5749,253,98749,154,68546,098,10493.78%41 4.4.3基因表达定量和差异基因筛选结果分析将处理后的数据在黄瓜基因组数据库进行比对，共检测出23249个基因，应用edgeR进行样本间差异基因分析，将差异基因阈值设置为q-value≤0.05，Fold-change≥2筛选差异基因。结果显示，与对照组相比，木霉诱导处理组有3765个差异基因，其中2304个基因上调，1461个基因下调，木霉+灰霉处理组有4583个差异基因，其中2387个基因上调，2196个基因下调。木霉+灰霉接种处理组与木霉诱导处理组有750个差异基因，其中382个基因上调，368个基因下调。由此表明，木霉处理能够引起更多的差异基因的表达。根据样本FPKM值，我们得到样本间相关性系数（图4.2），根据相关系数分析，结合差异基因筛选结果，我们看出经过木霉诱导处理或者木霉诱导处理加灰霉接种处理后，叶片的mRNA表达情况发生了明显变化。图4.2组间相关性heatmapFig.4.2Heatmapofcorrelationbetweengroups4.4.4差异表达基因的GO和KEGG富集分析结果将差异基因映射到GO数据库，计算每个条目所包含差异基因数目，再与整个基因组比较，得到明显富集的GOterm。木霉诱导处理组与营养液对照组差异基因共富集到791个GOterm，其中生物过程（biologicalprocess）的GOterm560个，细胞成分（cellularcomponent）的GOterm55个，分子功能（molecularfunction）的GOterm176个。木霉42 诱导处理加灰霉接种处理组与营养液对照组差异基因共富集到832个GOterm,其中生物过程（biologicalprocess）的GOterm581个，细胞成分（cellularcomponent）的GOterm63个，分子功能（molecularfunction）的GOterm188个。根据对差异基因的GO富集，我们发现差异基因在酰基辅酶A氧化酶活性，亮氨酸代谢过程，光系统等功能上明显富集（如图4.3和图4.4）。图4.3木霉诱导处理组与营养液对照组GO富集结果Fig.4.3ResultsofGOenrichmentinTrichodermainducedtreatmentgroupandcontrolgroup43 图4.4木霉诱导处理加灰霉接种处理组与营养液对照组GO富集结果Fig.4.4TheresultsofGOenrichmentinthetreatmentgroupandthecontrolgroup此外，应用与GO富集相同的原理同样可以对差异基因进行KEGGpathway富集分析。分析结果表明，木霉诱导处理组与营养液对照组差异基因共富集到278个pathway条目上面，木霉诱导处理加灰霉接种处理组与营养液对照组差异基因共富集到286个条目上，分析这些条目我们发现，差异基因在光合作用信号转导通路，α-亚麻酸代谢通路等方面富集程度较高（如图4.5和图4.6）。44 图4.5木霉诱导处理组与营养液对照组KEGG富集结果Fig.4.5ResultsofKEGGenrichmentinTrichodermainducedtreatmentgroupandcontrolgroup图4.6木霉诱导处理加灰霉接种处理组与营养液对照组KEGG富集结果Fig.4.6TheresultsofKEGGenrichmentinthetreatmentgroupandthecontrolgroup45 4.4.5诱导系统抗性相关信号通路的差异表达基因分析通过KEGG分析信号通路中差异表达基因的分析，如茉莉酸信号通路和乙烯信号转导通路。茉莉酸生物合成途径相关的KOID：k00454，k01723，k10525，k05894，k10526，k00232，k10527，k07513对应的基因表达上调，而且与乙烯生物合成途径KOID：k00789，k20772，k05933相对应基因表达也上调。通过GO分析，黄瓜叶片中和水杨酸途径相关的差异基因有609个。有83个基因与水杨酸诱导黄瓜植株的系统抗性相关，其中54个上调，29个基因下调。82个基因与水杨酸代谢过程相关，其中53个上调，29个基因下调。71个基因与水杨酸生物合成过程相关，其中45个上调，26个基因下调。115个基因与细胞应答水杨酸信号相关，其中82上调，33个基因下调。113个基因与水杨酸介导的信号转导通路相关，其中81个上调，32个基因下调。141个基因与水杨酸应答反应相关，其中上调102个，39个基因下调。4个基因调控水杨酸代谢过程相关，3个基因上调，1个基因下调。WRKY转录因子参与了植物防御基因的表达调控。转录组结果表明WRKY12，WRKY21，WRKY14，WRKY23，和WRKY22表达显著上调，这表明木霉诱导效应增强了黄瓜植株的防御系统。KEGG分析表明，茉莉酸合成相关的信号通路参与调控基因的表达。T.longibrachiatumH9的诱导效应增加了黄瓜基因的上调表达。诱导茉莉酸系统抗性的4个基因Csa_6G518290,Csa_6G518040,Csa_4G630010,Csa_3G727990全都表达上调，茉莉酸生物合成相关的基因有71个，其中55个表达上调，茉莉酸代谢过程相关的75个基因中有58个表达上调，响应茉莉酸的169个基因中有130个表达上调，茉莉酸参与信号途径相关的103个基因中有76个基因表达上调。而且，和茉莉酸合成相关的其他基因如：Csa_7G449420，Csa_4G286960，Csa_7G075590，Csa_5G644020，Csa_1G595890，Csa_4G653450，Csa_3G731060，Csa_2G003610，Csa_3G133140，Csa_2G129150表达都上调。和乙烯各种途径相关的基因大多数也都是上调的，和乙烯生物合成途径相关的基因39个全都表达上调，有43个基因与乙烯激活信号通路相关，其中38个表达上调，响应乙烯途径的105个基因中有86个表达上调，黄瓜植株细胞响应乙烯途径的43基因中有38个表达上调。GO网站搜索水杨酸生物合成的GO：0009697根据显示的genebankID进入NCBI找出相应的黄瓜的基因，对应的csa基因号从转录组数据库找出相应基因的FPKM。水杨酸的合成来自不同的前体和途径，一个是在细胞质中以苯丙氨酸为合成前体的莽草酸途径/苯丙氨酸解氨酶途径，另一个则是在叶绿体中进行的异分支酸途径。莽草酸的转化产物苯丙氨酸，经过苯丙氨酸解氨酶（PAL）合成反式肉桂酸，再转化为香豆酸或苯甲醛，而这两个物质都可以转化为水46 杨酸。而异支化酸途径中的异分支酸合酶（ICS）通过异构化作用合成水杨酸。而测序结果显示PAL相关的基因表达上调，和ICS相关的基因如ICS2等的表达并没有明显变化。图4.7茉莉酸生物合成途径Fig.4.7Jasmonicacidbiosynthesispathway表4.4茉莉酸在黄瓜内合成相关基因的表达Table4.4Expressionofjasmonicacidbiosynthesisgenesincucumber对照木霉灰霉表达趋势木霉处理组KO_IDgenenameGenesymbol组处理组（处理vsFPKMFPKMFPKM对照）K00454Csa_7G449420LOC1012049528.2222.6294.96上调K00454Csa_4G286960LOC1012163187.3554.61443.63上调K01723Csa_7G075590HPL13.0651.5974.47上调K10525Csa_5G644020LOC10121382612.7618.3121.50上调K05894Csa_1G595890LOC10120759329.3744.33235.45上调K10526Csa_4G653450LOC10122139630.8464.6596.67上调K00232Csa_3G731060LOC10120918146.51149.06210.67上调K10527Csa_2G003610LOC10120935946.15190.71328.00上调K07513Csa_3G133140LOC1012177107.34104.30145.50上调K07513Csa_2G129150LOC10121230178.28313.61514.65上调47 图4.8茉莉酸在黄瓜内合成相关基因的表达情况Fig.4.8Expressionofjasmonicacidbiosynthesisgenesincucumber图4.9乙烯合成途径Fig.4.9Ethylenesynthesispathway48 表4.5乙烯在黄瓜内合成相关基因的表达Table4.5Expressionofethylenebiosyntheticgenesincucumber木霉处木霉灰表达趋势对照组KO_IDGenenameGenesymbol理组霉处理（处理vsFPKMFPKM组FPKM对照）K00789Csa_7G419610LOC10121461753.43128.57132.60上调K00789Csa_7G419650LOC10121525111.6348.2936.97上调K00789Csa_UNG024770LOC1054344137.0248.7734.44上调K20772Csa_6G006800CS-ACS10.083.1563.80上调K20772Csa_4G049610CS-ACS20.243.47106.13上调K05933Csa_6G421630CS-ACO129.21136.42341.82上调K05933Csa_6G160180LOC1012216531124.261395.98974.44/图4.10乙烯在黄瓜体内合成相关基因的表达Fig.4.10Expressionofethylenebiosyntheticgenesincucumber表4.6水杨酸在黄瓜内合成相关基因的表达Table4.6ExpressionofsalicylicacidbiosynthesisgenesincucumberGenenameGenesymbol对照组木霉木霉+灰霉趋势Csa_4G496760PAD49.9789.2161.64上调Csa_1G006320EDS122.8119.9913.27/Csa_1G008580ICS235.9640.5920.07/Csa_4G063470NPR327.7338.6539.36/Csa_3G790460NLA17.3618.0627.26/49 4.5小结木霉诱导黄瓜的抗性反应是非常复杂的，由转录组分析可知，木霉诱导黄瓜产生了茉莉酸、乙烯、水杨酸等植物激素介导的信号通路的变化，使茉莉酸、乙烯、水杨酸通路相关的基因表达上调，可初步判断木霉诱导黄瓜产生系统抗性是由茉莉酸/乙烯信号通路和水杨酸通路的莽草酸途径共同调节。50 第五章木霉-黄瓜互作蛋白组学研究5.1引言蛋白质组学是对基因调节的一个动态描述，是从蛋白质水平对基因表达进行定量的测定。本章从蛋白组学水平对木霉H9诱导黄瓜产生系统抗性的信号传导途径中差异蛋白进行研究，通过蛋白组测序对茉莉酸、乙烯、水杨酸相关的蛋白表达情况进行分析，最终确定木霉H9与黄瓜互作的信号传导途径是由茉莉酸/乙烯和水杨酸共同调节。5.2实验材料5.2.1供试菌株长枝木霉H9（本课题组分离保存），灰霉菌为河北农业大学邢继红老师馈赠。5.2.2供试植物黄瓜品种为津绿小菜园。51 5.2.3植物营养液表5.1植物营养液Table5.1Nutrientsolutionformula溶液成分含量KNO3102gSolutionACa(NO3)2·4H2O236gH2O1000mLSolutionBMgSO4·7H2O98gH2O1000mLSolutionCKH2PO427.2gH2O1000mLFeSO4·7H2O5.57gSolutionDEDTA7.45gH2O1000mLMnCl2·4H2O1.81g/LZnSO4·H2O0.22g/LSolutionECuSO4·5H2O0.08g/LH3BO32.86g/L(NH4)6Mo7O24·4H2O0.09g/LH2O1000mLA、B、C、D、E按体积比1.25：1.25：1.25：1.25：1（mL）加入到1LddH2O中，121℃灭菌15min。5.3实验方法5.3.1实验处理本实验设木霉+灰霉处理、木霉处理，以不接种微生物的水培黄瓜为对照，每处理三个重复。试验方法与第三章3.3.5相同。52 表5.2实验处理Table5.2Experimentaltreatment序号处理第一组木霉诱导处理+灰霉接种处理（3个平行实验）第二组木霉诱导处理（3个平行实验）第三组营养液对照（3个平行实验）5.3.2样品处理采集木霉诱导处理96h的黄瓜幼苗的第三片和第四片叶片准确称量2g,放入封口袋速加入液氮放到-80℃冰箱冷冻30min后送往北京奥维森生物有限公司，进行木霉诱导黄瓜系统抗性的蛋白组测序，空白对照组也同时进行样品的采集。[69]5.3.3蛋白提取方法（1）取出-80℃冰箱保存的样品用200µl的TEAB溶解；（2）15min超声破碎，120000r/min离心20min取上清；（3）加入4倍体积的冷丙酮沉淀2h；（4）保留经过120000r/min离心20min后的沉淀；（5）将800µl的从冰箱取出的丙酮溶液加到上述沉淀中；（6）再继续离心18min保留并风干沉淀；（7）将沉淀进行溶解加。5.3.4LC-MS/MS质谱检测条件5.3.4.1LC-MS/MS质谱设备规格质谱仪是ABSCIEXnanoLC-MS/MS（TripleTOF5600plus），分析柱是ABSCIEX分析柱。5.3.4.2LC-MS/MS缓冲液各种缓冲液的配方如下：A：0.1%甲酸，5%乙腈；B：0.1%甲酸，95%乙腈；LoadingBuffer:0.1%甲酸，3%乙腈。53 5.3.4.3LC-MS/MS的液相方法LC-MS/MS的液相方法以90min为例，上样5µl。表5.3上样缓冲液Table5.3SamplebufferTime065708080.1859090A%9570502020209595B%53050808080555.4结果与分析5.4.1蛋白质鉴定本次实验采用基于质谱方法的蛋白质组鉴定基本流程，即对MS/MS质谱数据经过系列优化处理后与数据库进行相似性比较打分从而进行蛋白质鉴定。5.4.2Proteinpilot搜索参数Proteinpilot搜索参数请参见表5.4：表5.4Proteinpilot搜索参数Table5.4ProteinpilotSearchparametersItemValueTypeofsearchItraq8plex(Peptide)EnzymeTrypsinCysAlkylationIodoacetamideInstrumentTripleTOF5600BiasCorrectionTRUEBackgroundCorrectionTRUEIDfocusBiologicalmodificationsSearchEffortThoroughIDProteinMassUnrestrictedDatabaseUniprotCucumissativus54 5.4.3鉴定结果统计本次实验中，质谱产生的二级谱图数、解析的二级谱图数分别为368190、142788（表5.5）。表5.5蛋白质鉴定信息统计总表Table5.5Statisticalsummaryofproteinidentificationinformation样品名总谱图数鉴定图谱数*谱图鉴定率鉴定肽段数*鉴定蛋白数Unique-2**ALL36819014278838.78%2410141703345注：*表示可信度至少为95%，**表示至少含有2个unique肽段的鉴定蛋白质数目5.4.4蛋白覆盖分布蛋白质所包含的肽段数目越多则就说明此蛋白鉴定的结果可信度就越高，对我们的实验越有意义。因此，蛋白质的鉴定覆盖度也能间接反映鉴定结果的整体准确性。图5.1说明了不同鉴定范围的蛋白质在进行蛋白质鉴定中所占的比例（以百分比表示）。从图中可以看到，本项目鉴定覆盖度在[0-10%]范围内的蛋白质百分比为39.33%，覆盖度大于等于20%的蛋白占总蛋白的36.62%，平均蛋白质的鉴定覆盖度为19.01。图5.1蛋白鉴定覆盖度分布图Fig.5.1Distributionmapofproteinidentificationcoverage5.4.5蛋白组数据分析5.4.5.1Unique肽段数分布Unique肽段为仅在一个蛋白质中存在的肽段，由这类肽段的存在，可以唯一的确定相应蛋白质的存在。图为本次实验鉴定到的所有蛋白所包含的Unique肽段数的双坐标分布图，至少包含2个Unique肽段的蛋白数为3345，占总蛋白数的80.22%。55 图5.2鉴定蛋白中的Unique肽段数分布图Fig.5.2NumberofUniquePeptides5.4.5.2肽段长度分布每种质谱仪都有自身的测量范围，因此可鉴定到的肽段也有一定的长度限制。本次实验鉴定到的肽段平均长度为13.63，符合肽段长度合理范围。图5.3肽段长度分布Fig.5.3PeptidesLength5.4.5.3差异蛋白质功能注释由于背景数据库的局限性，在一些数据库中，并不是所有的蛋白质都具有注释信息，GO功能注释到的蛋白质最多，为4020个蛋白，COG注释到2546个蛋白质，KEGG注释到2215个蛋白质。GO总共有三个本体，分别描述基因的分子功能，细胞组分，参与的生物过程。根据蛋白的GO富集做出如下统计图。56 图5.4不同功能注释结果统计图Fig.5.4FunctionalAnnotationStatistics5.4.5.4GO注释GeneOntology（GO）总共有三个本体，分别描述基因的分子功能（molecularfunction）、细胞组分（cellularcomponent）、参与的生物过程（biologicalprocess）。我们针对鉴定出的所有蛋白进行GO功能注释分析并做出统计图，如下图。图5.5基因的分子功能注释Fig.5.5Molecularfunction图5.6细胞组分统计图Fig.5.6Cellularcomponent57 图5.7生物过程统计图Fig.5.7Biologicalprocess为了更加清楚的分析差异蛋白质的功能，我们对上调和下调差异蛋白质进行独立的功能注释分析，以木霉对照CK的486个差异蛋白（256个显著上调差异蛋白质和230个显著下调差异蛋白质）对比分析两者的GO注释结果，如图5.8。通过图5.8可以明显看到上调和下调差异蛋白质在GO功能分类上有较大差异，如下调蛋白质中存在“moleculartransduceractivity”（活动分子传感器）功能，而在上调蛋白质的GO注释结果中并未出现此功能，并且此外，在功能富集上也有明显的差异。图5.8差异蛋白质GO功能注释结果统计柱状图Fig.5.8GOtermofdifferentialprotein5.4.5.5代谢通路分析在生物体内不同蛋白相互协调行使其生物学行为，基于代谢途径的分析有助于更进一步了解其生物学功能，通过代谢途径分析能确定蛋白质参与的最主要生化代谢途径和信号转到途径。58 表5.6主要代谢通路Table5.6MaiorMetabolicpathwaysPathwaycountPathwayIDBiosynthesisofsecondarymetabolites501ko01110MAPKsignalingpathway232Ko04010alpha-Linolenicacidmetabolism129ko00592Plant-pathogeninteraction193ko04626Carbonfixationinphotosyntheticorganisms157ko00710Photosynthesis56ko00195Phenylalaninemetabolism51ko00360针对木霉诱导黄瓜的主要代谢通路，具体分析MAPK信号代谢通路（图5.9）、α-亚麻酸代谢途径（图5.10）、植物-病原菌互作代谢途径（图5.11）以及光合系统中的碳固定途径（图5.12），由不同的代谢通路分析相关蛋白，这些关键蛋白参与茉莉酸、乙烯以及水杨酸的代谢途径，因此在此基础上进一步进行茉莉酸、乙烯、水杨酸参与的信号传导途径的深入分析。图5.9MAPK信号代谢通路图Fig.5.9MAPKsignalingpathway59 图5.10α-亚麻酸代谢途径Fig.5.10α-Linolenicacidmetabolism60 图5.11植物-病原菌互作代谢途径Fig.5.11Plant-pathogeninteraction图5.12光合系统中的碳固定Fig.5.12Carbonfixationinphotosyntheticorganisms61 5.4.5.6茉莉酸、乙烯和水杨酸途径中差异蛋白的GO富集分析表5.7差异蛋白的GO富集Table5.7DifferentialproteinsinenrichmentofgeneontologyGeneOntologytermClusterfrequencyProteinfrequencyofuseP-valueEthylenemetabolicprocess7outof451genes,12outof3522genes,0.00023951131.6%0.3%Ethylenebiosyntheticprocess7outof451genes,12outof3522genes,0.00023951131.6%0.3%Jasmonicacidbiosynthetic12outof451genes,38outof3522genes,0.001957658process2.7%1.1%ResponsetoJasmonicacid16outof451genes,67outof3522genes,0.008717602stimulus3.5%1.9%Jasmonicacidmediatedsignaling11outof451genes,39outof3522genes,0.007803862pathway2.4%1.1%Salicylicacidbiosynthetic12outof451genes,38outof3522genes,0.001957658process2.7%1.1%Responsetosalicylicacid15outof451genes,60outof3522genes,0.007039481stimulus3.3%1.7%Salicylicacidmediatedsignaling13outof451genes,48outof3522genes,0.005772639pathway2.9%1.4%将差异蛋白的GO富集分析汇总（表5.7）结合差异蛋白Pathway富集分析（表5.6），通过KEGG数据库中的PathwayID找出每条通路对应的差异蛋白。5.4.5.7茉莉酸通路的差异蛋白表达情况对整体差异蛋白富集的通路图进行分析比较找出和茉莉酸相关的通路，其中与茉莉酸生物合成相关的上调蛋白分别是trlA0A0A0LHX3lA0A0A0LHX3_CUCSA、trlA0A0A0LMD3lA0A0A0LMD3_CUCSA、trlA0A0A0LNB2lA0A0A0LNB2_CUCSA，对应的基因分别是Csa_2G003610、Csa_2G395815、Csa_2G129150。与茉莉酸介导的信号途径相关的上调蛋白有trlA0A0A0LHY2lA0A0A0LHY2_CUCSA、trlA0A0A0KVM4lA0A0A0KVM4_CUCSA，对应的基因分别是Csa_3G836450、Csa_5G601560。下调蛋白有trlA0A0A0KZ66lA0A0A0KZ66_CUCSA、trlA0A0A0L3P3lA0A0A0L3P3_CUCSA、trlA0A0A0LM10lA0A0A0LM10_CUCSA，对应的基因分别是Csa_4G500330、Csa_3G002780、Csa_2G381850。与茉莉酸代谢途径相关的上调蛋白有trlA0A0A0LHX3lA0A0A0LHX3_CUCSA、trlA0A0A0LMD3lA0A0A0LMD3_CUCSA、trlA0A0A0LNB2lA0A0A0LNB2_CUCSA，对应的基因分别是Csa_2G003610、Csa_2G395815、Csa_2G129150。响应茉莉酸激活途径的相关上调蛋白有trlA0A0A0KVM4lA0A0A0KVM4_CUCSA、62 trlK9JCZ2lK9JCZ2_CUCSA、trlA0A0A0LHY2lA0A0A0LHY2_CUCSA，对应的基因分别是Csa_5G601560、GSH1、Csa_3G836450，下调蛋白有trlA0A0A0KZ66lA0A0A0KZ66_CUCSA、trlA0A0A0L3P3lA0A0A0L3P3_CUCSA、trlA0A0A0LM10lA0A0A0LM10_CUCSA，对应的基因分别是Csa_4G500330、Csa_3G002780、Csa_2G381850。5.4.5.8乙烯通路的差异蛋白表达情况对整体差异蛋白富集的通路图进行分析比较找出和乙烯相关的通路，其中与乙烯代谢途径相关的上调蛋白有trlA0A0A0KHD6lA0A0A0KHD6_CUCSA、trlA0A0A0LEK8lA0A0A0LEK8_CUCSA、trlA0A0A0KGY2lA0A0A0KGY2_CUCSA，trlA0A0A0LVC4lA0A0A0LVC4_CUCSA、trlA0A0A0K6U7lA0A0A0K6U7_CUCSA，对应的基因分别为Csa_6G507310、Csa_3G889160、Csa_6G160180、Csa_1G031770、Csa_7G043630。响应乙烯激活途径相关的上调蛋白有trlA0A0A0KHD6lA0A0A0KHD6_CUCSA、trlA0A0A0K9F9lA0A0A0K9F9_CUCSA、trlA0A0A0LGL9lA0A0A0LGL9_CUCSA、trlA0A0A0M0U0lA0A0A0M0U0_CUCSA、trlA0A0A0K6U7lA0A0A0K6U7_CUCSA、trlA0A0A0LZK4lA0A0A0LZK4_CUCSA，对应的基因分别是Csa_6G507310、Csa_7G448900、Csa_3G775240、Csa_1G701990、Csa_7G043630、Csa_1G596520。与乙烯介导的信号途径相关的上调蛋白有trlA0A0A0KHD6lA0A0A0KHD6_CUCSA、trlA0A0A0K9F9lA0A0A0K9F9_CUCSA、trlA0A0A0K6U7lA0A0A0K6U7_CUCSA，对应的基因分别是Csa_6G507310、Csa_7G448900、Csa_7G043630。5.4.5.9水杨酸通路的差异蛋白表达情况对整体差异蛋白富集的通路图进行分析比较找出和水杨酸相关的通路，其中与水杨酸生物合成途径相关的上调蛋白有trlA0A0A0LHY2lA0A0A0LHY2_CUCSA、trlA0A0A0KVM4lA0A0A0KVM4_CUCSA、trlA0A0A0LMD3lA0A0A0LMD3_CUCSA，对应基因分别为Csa_3G836450、Csa_5G601560、Csa_2G395815。下调蛋白有trlA0A0A0KZ66lA0A0A0KZ66_CUCSA、trlA0A0A0L3P3lA0A0A0L3P3_CUCSA、trlA0A0A0LM10lA0A0A0LM10_CUCSA、trlA0A0A0LNS8lA0A0A0LNS8_CUCSA，对应的基因分别是Csa_4G500330、Csa_3G002780、Csa_2G381850和Csa_1G002890。5.5小结通过蛋白组测序结果可知木霉诱导的黄瓜植株内与茉莉酸、水杨酸、乙烯这三条信号途径相关蛋白的表达情况。与茉莉酸通路相关的上调蛋白较下调蛋白多，整体呈63 现一种上调表达的现象，与乙烯途径相关的蛋白全部上调，而与水杨酸途径相关的蛋白既有上调也有下调，但与苯丙氨酸解氨酶（PAL）Csa_4G00870对应的蛋白trlA0A0A0KT58lA0A0A0KT58_CUCSA也上调表达。此结果与转录组测序结果相对应，由此可确定长枝木霉H9诱导黄瓜的信号通路为茉莉酸/乙烯和水杨酸共同调节。由以上实验结果我们可以初步推测出长枝木霉H9与黄瓜互作产生的抗病信号传导途径是通过茉莉酸/乙烯和水杨酸共同调节，这与粘绿木霉-黄瓜互作时水杨酸和茉莉酸途径被激活的结论相类似，将木霉H9-黄瓜互作的激素检测结果与绿色木霉-拟南芥互作结果进行比较，可知，不同的木霉菌株诱导处理不同的植物时，植物内相关激素的含量会有不同的变化，而棘孢木霉-黄瓜互作时，前期水杨酸含量高于茉莉酸，因此即使同一植物被不同木霉菌株诱导，激素含量也会有不同的变化。如绪论中提到的哈茨木霉T34与拟南芥互作，转录组结果显示与水杨酸相关的基因出现了下调，而我们实验结论中的转录组结果显示与水杨酸草莽酸途径相关的基因表达上调，且茉莉酸乙烯相关的基因也都出现了上调，这与棘孢木霉-拟南芥互作的结论中水杨酸、茉莉酸、乙烯相关的基因上调相似，我们更加确定植物抗病信号传导途径会因植物种类、不同的菌株以及其它一些环境因素而产生不同的结果。深入了解具体木霉菌株与具体植物间互作的机理可以更好更加稳定地推广使用木霉进行生物防治。我们也将以此实验结果为基础继续进行茉莉酸/乙烯途径和水杨酸途径中相关功能基因的验证，通过突变体验证木霉-黄瓜互作机理，将木霉H9在大田广泛推广使用。64 第六章结论和展望6.1结论1、通过平板对峙培养从5株木霉菌株中选出一株拮抗灰霉效果最好的菌株H9，与黄瓜植株互作观察其对黄瓜植株具有明显的促生作用，确定其为木霉-黄瓜互作机理研究的木霉菌株，进行形态学鉴定和分子生物学鉴定，该木霉菌株为长枝木霉H9。2、通过木霉诱导接种和灰霉的挑战接种完成木霉-黄瓜-灰霉三方互作系统，对木霉拮抗黄瓜灰霉病进行病情统计，确定木霉H9对黄瓜的诱导作用。进一步通过透射电子显微镜观察木霉在黄瓜根部的定殖情况确定木霉在黄瓜根部定殖96h为互作机理研究的最佳取样时间。3、在木霉处理黄瓜根部96h取样进行Realtime-PCR实验，结果显示与茉莉酸/乙烯以及水杨酸信号通路相关的基因上调表达，取样进行黄瓜叶片内水杨酸和茉莉酸含量的激素检测，激素检测结果显示水杨酸和茉莉酸的含量相比对照组均上升。4、通过转录组测序进一步确定木霉H9诱导黄瓜的信号通路中与茉莉酸和乙烯相关的基因上调表达，而与水杨酸的分支-莽草酸途径/苯丙氨酸氨裂解酶途径相关的基因上调表达，这与Realtime-PCR的实验结果是一致的。5、蛋白组测序结果显示与茉莉酸/乙烯、水杨酸途径相关的蛋白上调表达，与转录组测序结果相结合可以最终确认木霉H9诱导黄瓜的信号通路为茉莉酸/乙烯和水杨酸共同调节。6.2展望木霉是应用最为广泛、生防能力最强的真菌生防因子之一，在化学农药的替代化和减量化方面起着重要的作用，木霉生防机制的研究一直是生防工作的热点。木霉对灰霉的防治存在多机制性，包括重寄生、抗生及竞争的直接拮抗作用以及诱导植物系统抗性的间接拮抗作用，木霉的田间防效常常是多种机制协同作用的结果。随着研究的深入，发现木霉的生防机制非常复杂，常因木霉的种类、菌株、寄主植物的不同而变化，木霉诱导植物产生系统抗性时也存在明显的时效性和剂量性，生防机制不明会引起木霉的不正确使用并造成木霉生防效果的波动。因此，明确木霉的生防机制并指65 导木霉制剂的合理应用是进一步稳定和提高木霉制剂防效的关键。然而，到目前为止，对木霉拮抗机制的研究特别是涉及木霉植物−−灰霉三方互作研究仅涉及少数木霉菌株和拟南芥（A.thaliana）、番茄(S.lycopersicum)和莴苣（Lactucasativa）等少数植物，关于木霉诱导植物产生灰霉病抗性的基因组、转录组和蛋白组分析的报道也很少。随着蛋白组学和生物信息学的发展，特别是第三代测序技术的建立，对木霉植物灰霉−−三方互作的研究会越来越深入，并且三方互作系统中有用序列越来越多，这也会加深我们对木霉植物灰霉三方互作机制的认识，为木霉的田间应用提供更多的理论依据。−−66 参考文献[1]DruzhininaIS,Seidl-SeibothV,Herrera-EstrellaA,etal.Trichoderma:thegenomicsofopportunisticsuccess[J].NatureReviewsMicrobiology,2011,9(10):749-759.[2]CardSD,WalterM,JaspersMV,etal.TargetedselectionofantagonisticmicroorganismsforcontrolofBotrytiscinereaofstrawberryinNewZealand[J].AustralasianPlantPathology,2009,38(2):183-192.[3]KubicekCP,Herrera-EstrellaA,Seidl-SeibothV,etal.ComparativegenomesequenceanalysisunderscoresmycoparasitismastheancestrallifestyleofTrichoderma[J].GenomeBiology,2011,12:R40.[4]MukherjeePK,HorwitzBA,Herrera-EstrellaA,etal.Trichodermaresearchinthegenomeera[J].AnnualReviewofPhytopathology,2013,51(1):105-129.[5]VosCMF,DeCremerK,CammueBPA,etal.ThetoolboxofTrichodermaspp.inthebiocontrolofBotrytiscinereadisease[J].MolecularPlantPathology,2015,16(4):400-412.[6]YangHH,YangSL,PengKC,etal.InducedproteomeofTrichodermaharzianumbyBotrytiscinerea[J].MycologicalResearch,2009,113(9):924-932.[7]SanzL,MonteroM,RedondoJ,etal.Expressionofanα-1,3-glucanaseduringmycoparasiticinteractionofTrichodermaasperellum[J].FEBSJournal,2005,272(2):493-499.[8]MukherjeePK,HorwitzBA,KenerleyCM.SecondarymetabolisminTrichodermagenomicperspective[J].Microbiology,2012,158(1):35-45.[9]SeidlV,SongLF,LindquistE,etal.TranscriptomicresponseofthemycoparasiticfungusTrichodermaatroviridetothepresenceofafungalprey[J].BMCGenomics,2009,10(1):567.[10]宋晓妍,张玉忠,王元秀.木霉peptaibols抗菌肽的研究进展[J].微生物学报,2011,51(4):438-444.[11]潘顺,刘雷,王为民.哈茨木霉发酵液中peptaibols抗菌肽的鉴定及活性研究[J].中国生物防治学报,2012,28(4):528-536.[12]ChughJK,WallaceBA.Peptaibols:modelsforionchannels[J].BiochemicalSocietyTransactions,2001,29(4):565-570.[13]SchirmböckBM,LoritoM,WangYL,etal.Parallelformationandsynergismofhydrolyticenzymesandpeptaibolantibiotics,molecularmechanismsinvolvedintheantagonisticactionofTrichodermaharzianumagainstphytopathogenicfungi[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology,1995,60(12):67 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72 攻读学位期间所取得的相关科研成果1.徐文,黄媛媛,黄亚丽,等.木霉−植物互作机制的研究进展[J].中国生物防治学报,2017,已接收.2.徐文,贾振华,黄亚丽,等.木霉防治灰霉病作用机制的研究进展[J].微生物学通报,2017,已接收.73 74 致谢在论文完成之际，首先感谢导师黄亚丽研究员，在学习和生活上给予无微不至的关怀和帮助。在课题研究整个过程中，黄亚丽老师兢兢业业、工作认真负责、诲人不倦的敬业精神以及谦和的待人态度，令学生受益匪浅，终生难忘；黄亚丽老师以身作则，严谨的科研态度，坚持不懈的奋斗精神，一直鼓舞着学生。在此特向尊敬的黄亚丽老师表示崇高的敬意和衷心的感谢。感谢黄亚丽老师给予的悉心指导和无私帮助，黄老师在论文选题、实验设计等方面都给予了我很多悉心地指导和帮助。谨以此表示我对黄老师最诚挚的谢意。论文课题的研究工作是河北省科学院生物研究所完成的，特别感谢生物所所有成员。感谢生物工程室的宋水山老师、贾振华老师、赵芊老师、黄媛媛老师、马宏老师、刘昆昂老师、刘昱老师、任鹏举老师、李尧老师、敦泽胜老师、张翔老师、宋聪老师、刘方老师、曹向宇老师和张立文老师。感谢他们在实验和生活中提供的诸多帮助和热情的指导。同样感谢师兄谢晨星、师姐张肖晗、靳晓阳，同样感谢同学孙文、侯正欣、胡彦婷、赵燕肖、候鹏飞、金伟伟、成璐，还有师妹王叶对我的关心和帮助在此一并表示诚挚的谢意。感谢母校河北工业大学及河北省科学院生物研究所对我的培养，给我提供了一个宽广的学习平台。感谢河北工业大学化工学院生物系的诸多老师们的教导和关怀，感谢他们在学术上和理论上给我的指导。感谢所有的老师和同学以及所有帮助过我的朋友，最后，特别感谢在百忙之中抽出时间对本文进行评审并提出宝贵意见的各位专家老师。75