纳米氧化铁对柑橘缺铁黄化病的矫治作用及效果评价

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（申请医学硕士学位论文）纳米氧化铁对柑橘缺铁黄化病的矫治作用及效果评价培养单位：化学化工与生命科学学院学科专业：药学研究生：胡静指导教师：李俊丽副教授2017年5月 分类号密级UDC学校代码10497学位论文题目纳米氧化铁对柑橘缺铁黄化病的矫治作用及效果评价英文题目TheImpactsofIronOxideNanoparticlesontheCorrectionofIron-deficitChlorosisofCitrusSeedlings研究生姓名胡静姓名李俊丽职称副教授学位博士指导教师单位名称化学化工与生命科学学院邮编430070申请学位级别硕士学科专业名称药学论文提交日期2017年3月论文答辩日期2017年5月学位授予单位武汉理工大学学位授予日期答辩委员会主席谢浩教授评阅人2017年5月 中文摘要铁是植物生长所必需的微量元素，缺铁会使植物产生黄化症状从而危害健康。柑橘属植物具有很高的营养价值和药用价值，但是极易发生缺铁黄化，使其产量和品质下降。纳米氧化铁相比于传统铁肥，具有很多新特性如强吸附性、缓释性及穿透性等，有可能补充柑橘所需的铁元素，从而矫治果树缺铁并促进生长。本文通过根施和叶喷20、50和100mg/L纳米氧化铁和Fe3+处理柑橘属植物——柚子幼苗，比较和分析它们所引起的生理和分子应答，从而评价纳米氧化铁对柑橘缺铁黄化病的矫治作用。1、根施下纳米氧化铁在柑橘中的吸收转运及生理影响纳米氧化铁可以进入柑橘根细胞，但是没有向上转运到叶。和对照组相比，20mg/L纳米氧化铁对植物生长没有明显影响。50mg/L纳米氧化铁显著增加叶绿素含量23.2%和根系活力23.8%。但是100mg/L纳米氧化铁显著增加丙二醛含量，减少叶绿素含量和根系活力。尽管Fe3+可以被植物利用并促进叶绿素的合成，但是Fe3+比纳米氧化铁表现出更高的毒性。RT-PCR分析表明纳米氧化铁对AHA基因表达没有影响。50mg/L纳米氧化铁和Fe3+显著提高FRO2基因的表达水平，并且它们的三价铁还原酶活性比对照组和Fe(II)-EDTA高。纳米氧化铁和Fe3+的Nramp3基因表达水平明显低于对照组，说明纳米氧化铁和Fe3+可以向柑橘幼苗提供铁并被吸收利用。2、叶喷下纳米氧化铁与柑橘叶片的相互作用及生理影响叶喷的纳米氧化铁和Fe3+对柑橘幼苗生长没有明显影响。在柑橘叶中，20和50mg/L纳米氧化铁没有引起氧化应激，但是100mg/L纳米氧化铁可能开始引起了氧化应激但随后被植物自身防御系统修复。柑橘叶中铁含量与纳米氧化铁和Fe3+的浓度呈正相关。但是没有观察到铁从叶向根运输。纳米氧化铁的FRO2和Nramp3基因表达下调，表明植物处于铁充足状态。此外，100mg/L纳米氧化铁和20-100mg/LFe3+的蜡质含量高于对照组，而蜡质合成相关基因WIN1和运输相关基因ABCG12的表达均下调或无明显变化，表明蜡质的合成和运输是协同的、多基因控制的过程。综上所述，在不同施加方式下，纳米氧化铁对柑橘的作用效果差异较大。根施的纳米氧化铁对植物生长的影响与处理浓度有关，适宜浓度的纳米氧化铁通过根处理植物可以有效改善幼苗黄化症状。而叶面喷施的纳米氧化铁对柑橘幼苗生长没有明显影响，但是纳米氧化铁由于其强吸附性可以减少营养流失。I 此外，纳米氧化铁处理柑橘根没有发生向上转运，处理柑橘叶也没有发生向下运输。因此，在农业生产中结合根施和叶喷两种方式，有可能提高铁肥利用率，从而有效改善植物缺铁黄化病。本研究将为今后纳米添加剂在农业生产中的推广及应用奠定基础。关键词：纳米氧化铁，柑橘，缺铁黄化，生理影响，基因表达II AbstractIronisessentialforplantgrowth,andirondeficiencymaycausechlorosisinplantleavesanddamageplantgrowth.Citrushasveryhighnutritionalvalueandmedicinalvalue,however,whichispronetoirondeficiencyandappearschlorosissymptoms,leadstothedecreaseofyieldandquality.Comparedtotraditionalironfertilizer,ironoxidenanoparticles(γ-Fe2O3NPs)haveseveralnewfeaturessuchasstrongadsorption,slowreleaseeffectandpenetrability,etc.Therefore,γ-Fe2O3NPshavethepotentialtoprovideirontocitrusplants,andpromotethegrowthofplants.ThisstudycomprehensivelycomparedandanalyzedthephysiologicalandmolecularchangesofCitrusmaximaplantsasaffectedby20,50and100mg/Lofγ-Fe2O3NPsandFe3+viarootandfoliarapplications,thusevaluatingtheimprovementofchlorosisofγ-Fe2O3NPsoncitrusplants.1.Uptake,translocationandthephysiologicalimpactofγ-Fe2O3NPsonCitrusmaximaplantsviarootapplicationγ-Fe2O3NPscouldenterplantrootsbutnotranslocationfromrootstoshootswasobserved.20mg/Lγ-Fe2O3NPshadnoimpactonplantgrowth.50mg/Lγ-Fe2O3NPssignificantlyenhancedchlorophyllcontentby23.2%androotactivityby23.8%ascomparedwithcontrol.However,100mg/Lγ-Fe2O3NPsnotablyincreasedMDA(malonaldehyde)formation,decreasedchlorophyllcontentandrootactivity.AlthoughFe3+ionscouldbeusedbyplantsandpromotedthesynthesisofchlorophyll,theyappearedtobemoretoxicthanγ-Fe2O3NPs.RT-PCRanalysisshowedthatγ-Fe2O3NPshadnoimpactonAHAgeneexpression.50mg/Lγ-Fe3+2O3NPsandFesignificantlyincreasedexpressionlevelsofFRO2geneandcorrespondinglyhadahigherferricreductaseactivitycomparedtobothcontrolandFe(II)-EDTAexposure.RelativelevelsofNramp3geneexpressionexposedtoγ-Fe3+2O3NPsandFeweresignificantlylowerthancontrol,indicatingthatallγ-Fe3+2O3NPsandFetreatmentscouldsupplyirontoCitrusmaximaseedlings.2.Interactionofγ-Fe2O3NPswithCitrusmaximaleavesandthecorrespondingphysiologicaleffectsviafoliarapplicationγ-Fe3+2O3NPsandFeexposureviafoliarsprayhadaninconsequentialeffectonIII plantgrowth.Intheshoots,20and50mg/Lγ-Fe2O3NPsdidnotinduceoxidativestresswhile100mg/Lγ-Fe2O3NPsdidinitiallybutdealtwithitbyplantdefensesystem.Furthermore,therewasapositivecorrelationbetweenthedosagesofγ-Fe2O3NPsandFe3+andironaccumulationinshoots.However,theaccumulatedironinshootswasnottranslocateddowntoroots.Weobserveddown-regulationofFRO2andNramp3geneexpressionexposedtoγ-Fe2O3NPstreatments,suggestingthatplantswereiniron-repletestatus.Although100mg/Lγ-Fe2O3NPsand20-100mg/LFe3+ledtohigherwaxcontent,genesassociatedwithwaxformation(WIN1)andtransport(ABCG12)weredownregulatedorunchangedcomparedtothecontrol,indicatingthatthebiosynthesisandtransportofwaxisacollaborativeandmultigenecontrolledprocess.Overall,γ-Fe2O3NPsshowedsignificantlyvariousimpactsonCitrusmaximaplantsbyrootapplicationandfoliarspray.Theimpactsofrootappliedγ-Fe2O3NPsonplantgrowthwasincorrelationwiththeconcentrationsofNPs.Inthissituation,γ-Fe2O3NPsatproperconcentrationcouldeffectivelyimproveiron-deficitchlorosisofCitrusmaximaplants.Ontheotherhand,foliarsprayedγ-Fe2O3NPshadnoobviousimpactsonplantgrowth,butγ-Fe2O3NPscanreducenutrientlossduetotheirthestrongadsorptionability.Inaddition,noupwardtranslocationofrootappliedγ-Fe2O3NPsandnodownwardtransportoffoliarsprayedγ-Fe2O3NPswasobserved.Therefore,acombinationofbothapplicationmethodsmayimprovetheeffectivenessofironfertilizationandeffectivelyimproveiron-deficitchlorosisinagriculturalproduction.Thisstudywilllaythefoundationforthefutureapplicationsofnano-metricadditivesinagriculture.Keywords:γ-Fe2O3NPs,Citrusmaxima,iron-deficitchlorosis,physiologicalimpact,geneexpressionIV 目录中文摘要..........................................................................................................................................IAbstract...........................................................................................................................................III第1章绪论....................................................................................................................................11.1铁在植物生长发育中的作用...........................................................................................11.1.1铁参与叶绿素的合成...........................................................................................11.1.2铁参与氧化还原反应和电子传递.......................................................................11.1.3铁是多种酶的重要组成成分...............................................................................11.2柑橘的缺铁现象及现有矫治办法...................................................................................21.2.1柑橘的缺铁失绿症...............................................................................................21.2.2柑橘缺铁的矫治方法...........................................................................................31.3纳米材料在农业生产中的应用.......................................................................................41.3.1纳米材料的定义及特性.......................................................................................41.3.1.1小尺寸效应...............................................................................................51.3.1.2表面效应...................................................................................................51.3.1.3量子尺寸效应...........................................................................................51.3.1.4宏观量子隧道效应...................................................................................61.3.2纳米材料在农业上的应用...................................................................................61.3.3纳米氧化铁矫治植物缺铁的效果.......................................................................71.4植物吸收铁的途径...........................................................................................................81.4.1根部吸收...............................................................................................................81.4.1.1植物吸收铁的机理I.................................................................................81.4.1.2植物吸收铁的机理II...............................................................................91.4.2叶面吸收.............................................................................................................101.5研究意义及研究目标.....................................................................................................101.6预期的研究成果和创新点.............................................................................................11第2章根施下纳米氧化铁在柑橘中的吸收转运及生理影响...................................................132.1引言.................................................................................................................................132.2实验材料和方法.............................................................................................................142.2.1纳米氧化铁的表征.............................................................................................142.2.2种子萌发及幼苗处理.........................................................................................152.2.3纳米氧化铁中Fe3+的释放曲线.........................................................................162.2.4根长和生物量的测定.........................................................................................162.2.5脂质过氧化作用的测定.....................................................................................162.2.6可溶性蛋白质含量的测定.................................................................................162.2.7抗氧化酶活性的测定.........................................................................................172.2.7.1超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定.................................................17 2.2.7.2过氧化氢酶（CAT）活性的测定..........................................................172.2.7.3过氧化物酶（POD）活性的测定.........................................................172.2.8叶绿素含量的测定.............................................................................................172.2.9铁含量分析.........................................................................................................182.2.10根系活力的测定...............................................................................................182.2.11三价铁还原酶活性的测定...............................................................................182.2.12柑橘幼苗根TEM成像.....................................................................................182.2.13基因表达调控...................................................................................................192.2.14统计分析...........................................................................................................192.3结果与讨论.....................................................................................................................202.3.1纳米氧化铁中Fe3+的动态释放.........................................................................202.3.2纳米氧化铁和Fe3+处理柑橘苗的生长分析......................................................202.3.3柑橘的脂质过氧化作用和可溶性蛋白质含量.................................................212.3.4柑橘的抗氧化酶活性.........................................................................................232.3.5柑橘的叶绿素含量及铁分布情况.....................................................................242.3.6柑橘根的活力及三价铁还原酶活性.................................................................272.3.7柑橘根的TEM图...............................................................................................282.3.8柑橘根的基因表达分析.....................................................................................292.4小结.................................................................................................................................30第3章叶喷下纳米氧化铁与柑橘叶片的相互作用及生理影响...............................................323.1引言.................................................................................................................................323.2实验材料和方法.............................................................................................................333.2.1种子萌发及幼苗处理........................................................................................333.2.2生物量的测定.....................................................................................................333.2.3叶绿素含量的测定.............................................................................................343.2.4可溶性蛋白质含量的测定.................................................................................343.2.5根系活力的测定.................................................................................................343.2.6丙二醛含量的测定.............................................................................................343.2.7抗氧化酶活性的测定.........................................................................................343.2.7.1超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定.................................................353.2.7.2过氧化氢酶（CAT）活性的测定..........................................................353.2.7.3过氧化物酶（POD）活性的测定.........................................................353.2.8铁含量分析.........................................................................................................353.2.9蜡质含量的测定.................................................................................................353.2.10基因表达调控...................................................................................................363.1.11统计分析...........................................................................................................363.3结果与讨论.....................................................................................................................373.3.1纳米氧化铁和Fe3+对柑橘生长的影响..............................................................373.3.2柑橘的脂质过氧化作用和抗氧化酶活性.........................................................39 3.3.3柑橘体内铁分布及铁相关基因表达.................................................................413.3.4柑橘叶蜡质含量及蜡质相关基因表达.............................................................433.4小结.................................................................................................................................44第4章结论..................................................................................................................................46致谢............................................................................................................................................48参考文献........................................................................................................................................49攻读硕士期间获得与学位论文相关的科研成果.........................................................................59 第1章绪论1.1铁在植物生长发育中的作用铁作为最早被发现的植物必需营养元素，它在植物体内的含量虽然很少，但它参与植物体的诸多生理代谢过程，如光合作用、呼吸作用、蛋白质和核酸的合成、固氮作用等，并且在这些过程中发挥着十分重要的作用[1]。1.1.1铁参与叶绿素的合成虽然铁并不是叶绿素的组成成分，但是铁参与叶绿素的合成。植物中大部分的铁都存在于叶绿体，这一点在许多植物中都得到证实，例如菠菜中75%的铁都集中在叶绿体[2]。许多双子叶植物在缺铁时都会出现新叶黄化的现象，这通常是由于植物缺铁从而导致叶绿素的合成受阻。James[3]观察到，缺铁时叶片会发黄，叶绿体的基粒数目下降，严重时还会发生叶绿体解体。Spiller等[4]也发现缺铁不仅干扰叶绿素的合成，还会影响叶绿素蛋白复合体、叶绿体膜、反应中心等的合成。因此，铁对于植物体叶绿素的合成十分重要。1.1.2铁参与氧化还原反应和电子传递二价亚铁离子和三价铁离子二者的化合价变化和电子转移就是铁参与植物细胞内的氧化还原反应和电子传递的实质[2]。无机铁盐氧化还原能力较弱，当铁结合某些有机物形成铁血红素，或者是进一步形成铁血红素蛋白时，无机铁盐的氧化还原能力就可以提高很多倍。例如植物体内的铁氧还蛋白、豆血红蛋白以及各种细胞色素等含铁的有机物，具有很强的还原能力，通常作为细胞活动中重要的催化剂或电子传递者，参与植物细胞的各种代谢活动。1.1.3铁是多种酶的重要组成成分过氧化氢酶、过氧化物酶、细胞色素氧化酶等这些与呼吸作用有关的酶都含有铁；固氮酶、硝酸还原酶和亚硝酸还原酶等参与氮代谢有关的酶也都含有铁[5]。由于铁通常位于酶结构的活性部位上，因此植物缺铁会影响这些酶的活性，导致植物体内的各种氧化还原作用减弱，使电子传递异常，呼吸作用受到阻碍，1 ATP（adenosinetriphosphate,三磷酸腺苷）的合成减少，最终影响植物的正常生长发育及产量[2]。1.2柑橘的缺铁现象及现有矫治办法1.2.1柑橘的缺铁失绿症根据统计，在全世界大约有1/3的土壤是石灰性土壤，大约有40%的土壤缺铁。缺铁会引起植物叶片失绿，产生黄化症状，并进一步导致作物的产量和品质下降，因此目前植物缺铁黄化已经成为了广受关注的世界性营养失调问题[2]。1845年，Gris发现石灰性土壤上葡萄叶片黄化病与缺铁有关，此后人们一直都十分重视植物缺铁失绿的研究[6]。土壤中的铁通常都是氧化形式的铁，因此在水中溶解度非常低，植物很难吸收[7]。植物缺铁时会出现叶片脉间失绿，叶肉变黄甚至发白，叶片萎缩变小，当植物缺铁严重时，会导致生长停滞甚至死亡，最终给农业生产带来严重损失[8]。果树作为重要的经济作物，由于其一旦栽培在土壤中就很多年不会移动，具有明显的缺铁积累效应，因此缺铁造成的产量和品质损失相比一年生作物来说要严重得多[8]。柑橘在我国南方经济地位最重要、栽培面积最广，在许多亚热带地区及国家均有种植。柑橘在植物学中泛指芸香科柑橘属类，它包括柑、橘、柚、甜橙、酸橙、金橘、枸橼、柠檬等。根据《尚书·禹贡》的记载，柑橘至今已有超过4000年的种植历史。作为我们生活中的常用果品，柑橘的营养价值极高，含有丰富的糖分、有机酸、纤维素、矿物质、蛋白质、胡萝卜素、氨基酸和多种维生素，特别是维生素C含量比其他水果都高很多。根据测定，无核蜜橘的含糖量为9.3%，每100克橘汁中含维生素C的量为2.39毫克；金橘皮中的维生素C含量特别高，每100克橘皮中含维生素C的量为200毫克[9]。此外，柑橘属植物的药用价值也受到了广泛关注。如柑橘属植物的青皮、陈皮、枳壳、枳实以及化橘红等常作为中药材，具有健脾理气、宽中行气、消积化滞、破气除痞等功效[10]。我国柑橘产区大多数分布在地理位置和土壤条件较差的山地区域，由于养分淋失严重或土壤酸碱度不适，导致柑橘苗难以吸收养分。近年来，长江中上游、浙南-闽西-粤东、赣南-湘南-桂北等优势主产地区，柑橘出现极为普遍且日益严重的缺素症状，并且随着结果年数的增加，陆续表现出大面积的叶片缺素2 黄化、叶脉肿大甚至爆裂现象[11]。在石灰性土壤种植的柑橘出现缺铁黄化症状是我国目前柑橘生产中普遍存在的问题，陈华林[12]发现，缺铁黄化在一定程度上会导致柑橘减产，并严重制约了柑橘的发展。柑橘缺铁的典型症状是叶片失绿，这一点首先在新梢上发生，主要表现为叶片开始褪绿，叶肉部分发黄，但是叶脉保持绿色，通常是淡绿色叶片上呈现出绿色的细网状叶脉；随着症状的加剧，叶片变薄、变白或呈淡黄色，出现褐色的斑点以及坏组织；之后随着叶片成熟，在淡黄色叶肉和绿色叶脉之间的界限变得更为明显，并且失绿严重的叶片表现出除主叶脉呈绿色外全部发黄[13]。缺铁失绿的柑橘幼苗如下图所示：图1-1不同黄化程度的柑橘幼苗1.2.2柑橘缺铁的矫治方法铁在土壤中容易被固定，而在树体内又不易移动，因此矫治柑橘缺铁较为困难。目前，有以下几种较为理想的矫治办法[13]：（1）增施有机肥，如堆猪牛栏粪肥、渣肥等是最有效的矫治柑橘缺铁方法。（2）选择适宜的砧木品种进行靠接。（3）叶面喷施0.2%柠檬酸铁、硫酸亚铁或0.8%尿素铁加0.05%黏着剂可以得到局部矫治效果。Barney等[14]发现硫酸亚铁喷布效果较好，并且加入粘着剂可以增强铁肥的效力。但叶面喷施除了在风梨上应用比较成功以外，大多数都只得到了局部或暂时的矫治效果[15]。（4）用15%尿素铁埋瓶，有一定地效果；也可以将柑橘树的细根折断后，浸入在装有6%硫酸亚铁与4%柠檬酸铁的混合溶液中，铁可以通过折断根的伤口吸入。3 （5）土壤施加酸性肥料，不仅可以改良土壤，还可以增强土壤铁的有效性。（6）施用EDTA、EDDHA等螯合铁制剂作为专用铁肥。（7）控制锌、铜、磷、锰及石灰性肥料的用量，以避免这些营养元素过量从而对铁产生颉颃作用。（8）防止柑橘园积水使土壤过湿缺氧，从而影响铁的吸收。对于土壤施肥和叶面施肥这两种施加铁肥方法而言[16]：土壤施用无机铁肥时，它的农艺有效性不佳。这主要是因为施加的铁很大部分会快速地变成极为难溶的铁化合物，导致所施加的铁相比于土壤中原有的铁来说并不能提供给植物更多的可溶性铁。现在研究者们都普遍认为螯合铁肥土壤施用效果较好，但是由于螯合铁的高成本、螯合剂的质量不稳定，土培和液培试验的反应不一致，不同植物品种及环境、地域条件的敏感性，及其分布和相对效应的不可预测性，大大限制了目前对螯合铁肥的应用[15]。最有效、最快速地矫正作物缺铁失绿的方法该首推叶面喷施铁肥，然而其维持时间短，需多次喷施，并且其有效程度随植物品种不同差别很大。此外，传统的铁肥主要为二价铁盐，由于受到土质的影响，雨水冲刷后损失极大，很多情况下效果不显著，对果树的黄化症状没有较好的改善作用。因此，至今尚未发现一种真正既经济又有效的施铁方法。随着纳米功能材料和纳米结构材料的不断发展，以及纳米材料与技术在各领域的全面推广应用，制备新型地纳米铁肥很有可能解决上述问题。在果树生产中，利用纳米铁添加剂来补充柑橘等果树所需的铁元素，因其强的吸附性、缓释性及穿透性，有可能起到矫治果树缺铁，同时还能促进果树生长的作用。1.3纳米材料在农业生产中的应用1.3.1纳米材料的定义及特性纳米材料作为一种新型材料，由于其优异的理化性质在很多领域都有着广泛地应用。目前，大量含有纳米材料的产品已经投入使用，如涂料、油漆、催化剂、润滑剂、建筑材料、电子设备、汽车零部件、抗菌服装、电池、化妆品、药品、清洁剂等[17]。纳米尺度范围为1-100nm，广义地讲，纳米材料指的是在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围或由它们作为基本单元所构成的材料[18]。纳米材料具有小尺寸效应、表面效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应4 等基本特性，因而显现出了许多传统材料所不具备的奇异特性。如铜原本导电，但是到某一纳米级界限就不导电，相反，原来绝缘的晶体、二氧化硅等，它们在某一纳米级界限时就开始导电[19]。纳米材料在很多方面，如机械性能、磁、电、光、热等，与普通材料具有很大不同，表现出辐射、吸附、催化、吸收以及二元协同性等新特性[20]，正因为这些显著优势，纳米材料和科技越来越引起世界各国政府和科学家们的高度关注。1.3.1.1小尺寸效应小尺寸效应指的是由颗粒尺寸变小引起的宏观物理性质的变化。当超细微粒的尺寸与德布罗意波长、光波波长、透射深度、超导态的相干长度等物理特征尺寸差不多或更小时，将会破坏晶体周期性的边界条件，并减小非晶态纳米微粒的表面层附近原子密度，在光、声、电磁、热力学等方面表现出新的小尺寸效应[21]。当纳米颗粒的尺寸变小，比表面积会显著增加，使其在很多方面，如光学性质、热学性质、力学性质、磁学性质等，产生一系列奇特的性质。如金属纳米粒子表现出对光的吸收效果显著增加；直径为2nm的银和金纳米粒子的熔点分别降为100℃和330℃[22]。1.3.1.2表面效应纳米材料的表面效应是指纳米粒子的表面原子数与总原子数的比值随着粒径的变化而急剧增大所引起的性质上的变化[23]。对球形颗粒而言，它的体积与直径的立方成正比，表面积与直径的平方成正比，因此它的比表面积（表面积/体积）与直径成反比。当颗粒的直径变小时，它的比表面积将会显著增加，这表明表面原子所占总原子数的比例将会显著地增加。当颗粒的直径大于0.1μm时，对它的表面效应可以忽略不计，而当直径小于0.1μm时，它的表面原子百分数会急剧增长，1克纳米颗粒的表面积总和甚至高达100m2，这时的表面效应将不容忽略[21,24]。1.3.1.3量子尺寸效应对大块材料而言，它的能带可以认为是准连续的。而对纳米尺度范围的材料而言，它的能带将分裂为分立的能级，也就是能级的量子化，在能级之间的间距会随着颗粒尺寸减小而增大[21,22]。当能级间距太大，超过热能、光子能量、磁场能以及电场能等的平均能级间距时，会表现出一系列与大块材料截然不同5 的反常特性，通常把这种效应作为量子尺寸效应[22]。如颗粒含有的电子数目奇偶性关系到它的比热和磁化率，通常情况下纳米颗粒在含有奇数或偶数电子时会呈现不同的催化性质[25]。1.3.1.4宏观量子隧道效应隧道效应指的是微观粒子具有穿越势垒的能力。近年来，一些宏观的物理量，比如电荷、微颗粒的磁化强度还有量子相干器件中的磁通量等被人们发现也具有隧道效应，它们可以穿越宏观系统的势垒并引起变化[22]。对基础研究及应用而言，研究宏观量子隧道效应具有重要意义，该效应对磁带、磁盘进行信息贮存的时间极限进行了限定。未来微电子器件的基础会将量子隧道效应与量子尺寸效应结合在一起，这两个效应确定了现存微电子器件进一步微型化的极限[21]。1.3.2纳米材料在农业上的应用在农业生产中，化学肥料的大量施用导致了肥料利用率低、水体污染、臭氧层破坏和温室效应加剧等环境问题。因此，如何合理、高效地施用化肥，并且提高肥料利用效率，是当前亟需解决的重要问题。目前已有较多研究将纳米添加剂、纳米增效剂应用到肥料中，研究其对作物生长的影响。李淑敏等[26]研究发现，不同尿素添加纳米碳可以提高大豆苗期相对生长速率，增加大豆干物质积累量，最终使大豆产量显著增加。钱银飞等[27]发现纳米碳肥料增效剂能减缓氮肥释放速度，减少肥料流失，增加了晚稻对肥料的总吸收量，增强光合作用，使干物质积累量增加，氮素吸收利用效率增强。此外，还有研究发现在玉米种植过程中，添加纳米碳可以显著提高肥料吸收和利用效率，减少肥料的损失，节肥的作用明显[28]。纳米材料因其特殊的理化性质，有可能更为有效地促进肥料的利用率，并促进植物生长。与此同时，含有植物所需营养元素的纳米材料还有可能为植物补充养分。已有许多研究表明含铁的纳米粒子可以为植物提供铁元素，促进植物生长，并且效果往往优于传统的二价铁盐。如Rui等[29]发现纳米氧化铁可以增加花生的根长度、植株高度、生物量以及叶绿素含量，说明纳米氧化铁可以在花生的栽培中取代传统铁肥。此外，Ghafariyan等[30]还发现纳米四氧化三铁可以有效缓解水培大豆的缺铁黄化症状，并能显著提高叶绿素含量，且没有表现出任何毒性。6 Liu等[31]发现，5-20mg/L的铁纳米粒子显著促进莴苣地上部分伸长12-26%，这说明此浓度范围的铁纳米粒子对莴苣幼苗没有表现出毒性作用反而促进植物的生长，说明适宜浓度的铁源可以向植物提供微量元素铁促进生长。Delfani等[32]研究了铁纳米粒子叶面喷施豇豆的效果，发现豇豆叶绿素含量增加，产量提高，并且叶喷的铁纳米粒子比常规二价铁盐对植物生长的促进作用更为显著。因此，开展纳米材料在农业上对植物生长的影响的研究具有重要意义。1.3.3纳米氧化铁矫治植物缺铁的效果作为目前研究和应用最为广泛的纳米材料之一，纳米氧化铁（γ-Fe2O3NPs）具有许多新性能，如较大的比表面积，固有的生物相容性以及超顺磁性等，因此广泛应用于各领域，如医疗诊断、药物控释、分离技术以及环境工程等[33-35]。之前已有很多研究报道过纳米氧化铁对植物产生的积极作用。如Alidoust和Isoda[36]发现纳米氧化铁对大豆的生长没有任何不良影响，并且在土壤施肥后对根的伸长有明显的促进作用。Li等[37]和Ren等[38]观察到纳米氧化铁可以促进西瓜和绿豆种子的萌发，根的生长，以及提高叶绿素含量。刘秀梅等[39]研究了纳米氧化铁的施用效果，发现纳米氧化铁显著地促进花生的生长发育，提高叶绿素含量并增强光合能力；并能促进花生对氮、钾、磷的吸收和利用。这些研究表明纳米氧化铁可以较好的解决植物缺铁的问题，但是由于实验结果受到多种因素的影响，如纳米粒子的浓度和粒径、生长条件、处理时间、植物品种等，目前也有部分研究发现纳米氧化铁对植物生长产生了毒害作用。例如，Martínez-Fernández等[40]发现在水培条件下，50和100mg/L的纳米氧化铁（平均粒径20-100nm）减少向日葵地上部分Ca、K、Mg、S的浓度，减少叶绿素含量以及损害植物根功能。由于目前纳米氧化铁对植物的缺铁黄化矫治效果不一，因此还需开展大量相关实验，以阐明其机制。本课题组前期研究结果表明：将纳米氧化铁与不同植物共同培养，对这些植物的缺铁现象都有一定的矫正作用，但是各种植物表现出来的生理变化却明显不同于用硫酸亚铁溶液矫正的。如用同一浓度的纳米氧化铁和硫酸亚铁溶液根灌缺铁处理的西瓜幼苗，我们观察到用纳米氧化铁处理的西瓜幼苗恢复的更快一些。而采用叶面喷施两种铁肥，叶片复绿速度均很慢，但是后期新叶的黄化程度有差别，纳米氧化铁可能具有缓释效果，在处理后期还可以持续起到作用。进一步通过水培盆栽还原这些现象，发现在缺铁胁迫下，以施加硫酸亚铁或EDTA铁盐为对照，不同尺寸、不同浓7 度纳米氧化铁处理幼苗后，在根生物量、铁含量和吸收效率上都存在显著差异，具有一定的浓度和尺寸效应。这种差异应该认为是纳米材料特有的性质及尺寸和浓度不同影响了植物对铁的吸收和转运方式。纳米氧化铁如果能有效缓解植物缺铁症状，那么这种影响是通过什么来实现的呢？这其中的生理和分子生物学机制还不清楚。因此，很有必要从植物对铁的吸收机制上进行深入研究来探讨纳米氧化铁对植物生长产生的影响。1.4植物吸收铁的途径1.4.1根部吸收根是植物吸收水、无机离子的主要途径。目前植物根吸收铁的机理已经研究的较为清楚，一般来说，植物吸收铁的机理主要分为以下两种。1.4.1.1植物吸收铁的机理I双子叶和非禾本科单子叶植物都属于机理I植物，如西瓜、大豆、花生等，本实验研究对象柑橘也是双子叶植物，属于机理I植物。这类植物对铁的吸收包括根际酸化、Fe[III]还原、Fe[II]转运。表现在生理反应上主要包括质子的分泌作用、有机物质（如酚类化合物、核黄素及有机酸等）的分泌作用、根表或根际铁的还原作用三个方面[41]。（1）根际酸化与AHA基因机理I植物吸收铁的第一步是通过根系质膜上H+-ATPase向根际分泌H+，从而降低根系周围pH，并酸化土壤，可以提高根际可溶性铁浓度[42]。H+-ATPase由AHA基因编码，该基因属于P型ATPase超级基因家族，现在已经从拟南芥和水稻中分离到22个相关的基因[1]。在缺铁胁迫下，AHA基因表达会上调以便泵出更多的H+到细胞膜外，促进根际铁的溶解[43]。（2）Fe3+还原与FRO2基因机理I植物吸收铁的第二步是通过根部特异的三价铁螯合物还原酶（ferric-chelatereductase,FRO）将根周围的Fe3+-螯合物还原，从而使根系表面的Fe3+被还原为Fe2+。一般认为，此类植物主要以Fe2+的形式吸收铁，因此根系周围的Fe3+必须由还原酶还原为Fe2+后，植物才能对其进行吸收利用。有研究表明，编码Fe3+还原酶的基因是FRO基因家族中的一员，在特异的细胞或不同的8 器官中，该基因表达的产物可能参与铁的转运[1]。1997年，Robinson等[44]首先在处于缺铁应激下的拟南芥根系cDNA文库中进行筛选并得到了三价铁螯合物还原酶基因——FRO2基因。在缺铁胁迫下，FRO2基因表达上调，并且可以增强三价铁螯合物还原酶活性，促进Fe3+螯合物的还原。（3）Fe2+转运与IRT1基因最后，在Fe3+被还原后，通过位于根系质膜上的Fe2+转运蛋白转运Fe2+到细胞中。1996年，Eide等[45]从拟南芥中克隆出了第1个Fe2+转运蛋白基因——铁转运蛋白（iron-regulatedbroad-rangemetaltransporter,IRT1）基因。IRT1编码的转运蛋白是ZIP金属转运蛋白家族的一员，主要负责跨越根部的细胞质膜将Fe2+转运进根细胞[45,46]。然而，迄今为止，尚未在柑橘属植物中发现IRT1基因的同源序列。值得一提的是，自然抵抗相关巨噬细胞蛋白（naturalresistance-associatedmacrophageprotein,Nramp）金属转运蛋白家族是后来发现的另一组与铁吸收有关的基因。目前已经发现Nramp蛋白可以转运许多金属离子，如Cd、Co、Cu、Ni、Zn、Mn、Fe、Pb等[1]。Nramp3蛋白位于液泡膜上，可以转运Fe2+，缺铁时Nramp3基因的表达上调，从而使液泡中转运出更多的Fe2+到细胞质中，供植物生长发育所利用。1.4.1.2植物吸收铁的机理II机理II植物包括禾本科单子叶植物，如高粱、玉米、小麦、水稻等，在缺铁胁迫下，相比于机理I植物，二者的应答存在很大的区别。机理II植物在缺铁胁迫下，它的根系中作为铁载体的非结构蛋白氨基酸的合成和释放会增加。这类植物可以适应pH高的土壤，处于缺铁胁迫下可以通过释放大量的植物高铁载体-麦根酸类来增加根际铁的有效性，被根系质膜上的特异性膜受体识别后被转运吸收，这类植物是以Fe3+-植物高铁载体络合体的形式直接吸收铁[41]。以上两种机理主要是植物根系吸收土壤中铁元素（如难溶性的三价铁化合物）的机理。已有许多学者报道纳米级的铁可以被植物根吸收并转运，如Ghafariyan等[30]发现四氧化三铁纳米粒子可以进入大豆根，并穿过木质部转运到叶中。Cifuentes等[47]发现磁性碳包被的纳米粒子（含铁和氧化铁纳米粒子）可以很容易地进入豌豆、向日葵、西红柿和小麦的根，到达维管束，并通过木质部的蒸腾流向地上部分移动。Zhu等[48]用含磁性纳米氧化铁的培养基种植南瓜，20天后在南瓜的叶片中检测到了强烈的磁信号，并在茎中检测到较弱的磁信号，他们认为磁性纳米氧化铁可以被南瓜根吸收并在其组织中迁移和蓄积。然而，9 在这些过程中，植物吸收转运含铁纳米粒子的潜在的机制并不清楚。因此研究纳米氧化铁对植物生长的影响，有必要进一步研究纳米氧化铁处理下植物吸收铁的机理，以及与铁吸收转运相关基因的表达水平，这将有助于弄清植物对纳米氧化铁的吸收利用情况，以及纳米氧化铁改善植物缺铁黄化的相关机制。1.4.2叶面吸收除根外，植物叶也可以吸收营养物质。在农业生产中，通常把叶面施肥作为根部施肥的补充。在叶面喷施时，为提高肥液效力，常添加助剂与肥液一起喷施，助剂可以提高肥液在植物叶片上的粘附力，从而促进肥料的吸收。纳米氧化铁由于其强吸附性和穿透性，叶面喷施纳米氧化铁很有可能达到矫治植物缺铁黄化病的效果。当前关于纳米粒子和植物相互作用的研究主要集中在植物根细胞对纳米颗粒的吸收、转运与蓄积，而叶面吸收与迁移的相关研究则较少，相关机制也尚不清楚。当纳米粒子暴露于植物叶表面时，有研究人员观察到植物也可以通过叶片吸收纳米粒子。Corredor等[49]报道碳包被的铁纳米粒子能够进入南瓜叶片，并且可以迁移到其他植物组织。Larue等[50]也发现，通过叶面喷施，银纳米粒子可以有效进入莴苣叶并被细胞吸收。植物叶片表皮细胞外覆盖着角质层，假设叶片吸收纳米粒子及其溶质有两种途径[50]：对于亲水性化合物，主要通过角质层的水溶性孔道和气孔进入；对于亲脂性化合物则主要通过扩散穿过角质层。由于纳米粒子具有较大的比表面积，蜡中的脂质可以很快吸附在纳米粒子的表面，先将纳米粒子阻截在角质层蜡质中，随后在粒子穿过角质层后，扩散到叶组织中[51]。当前已有研究表明纳米粒子既可以通过植物根进入细胞，也可以通过植物叶被吸收。研究纳米氧化铁对柑橘的缺铁黄化矫治作用有必要研究纳米氧化铁通过柑橘根及叶与植物的相互作用，通过在生理和分子水平上研究纳米氧化铁对植物的影响，有助于弄清不同施加方式下纳米氧化铁改善植物缺铁黄化病的不同效果及其相应地机制，有助于弄清纳米氧化铁作为潜在纳米铁肥的适宜浓度及施加方式。1.5研究意义及研究目标铁是植物生长必不可少的微量元素，植物缺铁容易产生黄化症状从而危害植物健康。作为重要的经济作物，果树由于其一旦栽培在土壤中很多年都不会10 移动，所有具有明显的缺铁积累效应，因而缺铁造成的产量损失相比一年生作物而言要严重得多。然而至今尚未发现一种真正既经济又有效的施铁方法。纳米氧化铁相比于传统铁肥，具有很多新特性，如强的吸附性、缓释性及穿透性等。在果树生产中，利用纳米氧化铁通过根或叶作用于植物，来补充柑橘等果树所需的铁元素，有可能达到矫治果树缺铁并促进果树生长的目的。植物对铁的吸收主要有两种途径，即根部吸收和叶面吸收。本课题以纳米氧化铁和柑橘为研究对象，旨在研究纳米氧化铁对柑橘缺铁黄化病的矫治作用，有助于弄清纳米添加剂对药用植物柑橘的生长及生理影响，并阐明纳米氧化铁在柑橘根部及叶片角质层上的传输机制，将纳米材料生物学效应的研究推向前进，为今后纳米添加剂的推广与使用奠定基础。具体研究目标如下：（1）纳米氧化铁以根部和叶面施加两种方式处理柑橘幼苗，研究纳米氧化铁对柑橘缺铁黄化的矫治作用。（2）研究纳米氧化铁在柑橘根和叶角质层上的传输，阐明不同施加方式下，柑橘对纳米氧化铁吸收、转运及蓄积的不同机制。（3）通过分子机制研究，初步总结出植物-纳米氧化物相互作用的某些规律，丰富人们对纳米氧化物添加剂在高等植物体内的运输机制的认识，为今后纳米氧化铁的安全使用和拓展其在纳米添加剂等功能应用方面提供理论依据和技术途径。1.6预期的研究成果和创新点本课题采用不同浓度的纳米氧化铁以根施和叶面喷施两种方式处理柑橘，可以获得纳米氧化铁作用于柑橘幼苗后，对幼苗生长发育的影响较系统的相关数据，确定适宜柑橘幼苗生长的纳米氧化铁浓度以及补给方式；弄清两种施加方式下柑橘根及叶片吸收纳米氧化铁的基本途径以及纳米氧化铁在组织之间的转运、蓄积规律；通过实时聚合酶链反应（real-timepolymerasechainreaction,RT-PCR）技术，从分子水平上弄清柑橘吸收、转运纳米氧化铁的相关分子机制，以及纳米氧化铁对叶片角质层蜡质合成及转运相关基因表达的影响。主要创新点如下：（1）纳米氧化铁的比表面积大、吸附性强，可以更好的吸附在植物表面，有可能更有效的被作物吸收，来提高它的使用效率。目前很少有研究系统地比较纳米材料在根部及叶面两种施加方式下对植物产生的不同生理生化效应。本11 课题结合在植物缺铁防治上存在的问题，将纳米技术引入到农业的矿质营养研究中来，以易缺素的药用植物柑橘为对象，来研究并对比根部及叶面施加纳米氧化铁对柑橘缺铁黄化病的矫治作用。（2）当前研究主要集中在植物根细胞对纳米颗粒的吸收、转运与蓄积，而叶面吸收与迁移的研究则较少，相关机制也尚不清楚。目前植物叶面吸收纳米材料的报道较少，并且几乎没有从叶片角质层的角度报道纳米氧化铁的传输。本课题对纳米氧化铁在柑橘叶片角质层上的吸附及跨膜过程展开研究，这是纳米颗粒与植物相互作用的一种新途径，具有明显的新意和原创性。12 第2章根施下纳米氧化铁在柑橘中的吸收转运及生理影响2.1引言铁在植物生理生长尤其是光合作用中起着重要的作用。植物缺铁会直接导致叶绿素减少，随后降低净光合作用效率。由于铁容易转变为植物不可利用的三价铁形式，以及铁在植物体内的不可移动性，向缺铁的土壤中施加无机铁肥往往效果不好[52]。根是植物吸收水分、无机离子的主要途径。目前，很多研究已证明纳米粒子可以被植物根细胞吸收并利用。纳米氧化铁作为一种广泛应用的材料，具有许多优越的特性，如生物相容性、结构稳定性等，因而有可能作为纳米肥料改善植物缺铁黄化病。纳米氧化铁主要从三方面作用于于植物生长：第一，纳米氧化铁有可能通过参与Fenton反应并产生羟基引起植物毒性[53]；其次，纳米粒子团聚并积累在植物根表面，可能抑制水和其他营养成分的传输[38]；最后一点就是，纳米氧化铁可以转化并作为微量元素铁被植物吸收。这三方面中，哪一个占主导地位取决于纳米氧化铁的浓度范围[31]。因此，本章实验采用不同浓度的纳米氧化铁作用于柑橘，通过透射电子显微镜（TEM）观察纳米氧化铁是否进入柑橘幼苗根细胞以及所引起的细胞内活动和细胞器的变化，并通过检测代表性参数如生物量、根长、可溶性蛋白含量、脂质过氧化作用、叶绿素含量、铁含量、抗氧化酶活性、根三价铁还原酶活性以及根系活力，来研究柑橘幼苗对不同浓度的纳米氧化铁的应答。此外，本章实验还研究了不同浓度的纳米氧化铁在柑橘植物体内引起的分子应答，即分析了与铁吸收转化有关的基因表达。通常来说，植物利用三价铁氧化物需要三步：质子化、螯合和还原[42]。H+-ATPase（AHA）调节植物根分泌质子，从而降低根际pH，提高可溶性铁浓度。三价铁螯合物还原酶由FRO2基因编码，在根表面还原铁并运送铁穿过质膜。铁转运蛋白IRT1负责转运还原的铁（Fe2+）穿过质膜进入根细胞，但是柑橘中目前没有发现IRT1基因的同源序列。Nramp金属离子转运蛋白是另一类与铁吸收转运有关的蛋白。Nramp3蛋白位于液泡膜上，可以转运Fe2+，铁缺乏时Nramp3基因表达上调。在本章实验中，为了深入研究纳米氧化铁在柑橘幼苗根的吸收转运情况，通过RT-PCR技术在分子水平上分析了与铁吸收转运有关的基因（AHA、FRO2和Nramp3）的转录调13 节。另一方面，纳米氧化铁对植物产生的作用是由纳米粒子本身还是释放出的离子所引起的尚不明确。很多研究试图弄清纳米粒子造成影响的来源，但是得到的结果在一定程度上是相互矛盾的。Kim等[54]报道说Ag纳米粒子中含有浓度几乎可以忽略的Ag+，因此细胞毒性主要是由Ag纳米粒子造成的氧化应激所引起，与Ag+无关。Kawata等[55]则认为Ag纳米粒子和Ag+都有助于毒性效应。迄今为止，还没有研究说明纳米氧化铁对植物生长产生影响究竟是纳米粒子本身还是释放的离子引起的。本章实验通过测定纳米氧化铁中Fe3+的释放曲线，在生理和分子水平上研究柑橘幼苗对纳米氧化铁和Fe3+的应答，期望弄清纳米氧化铁的作用机制及其改善柑橘缺铁黄化的效果。实验结果与缺铁处理组（对照组）和螯合铁肥Fe(II)-EDTA处理组进行对比。2.2实验材料和方法2.2.1纳米氧化铁的表征图2-1（A）纳米氧化铁分散在去离子水中的TEM图（B）纳米氧化铁在去离子水中的粒径分布（C）纳米氧化铁在去离子水中的Zeta电势14 本实验所选用的纳米氧化铁为γ-Fe2O3纳米粒子(nanoparticles,NPs)，其纯度为99.5%，平均粒径为20nm，购自麦克林公司（中国上海）。根据生厂商提供的数据，该纳米粒子为立方晶型，真密度为5.15g/cm3。纳米粒子的形状和粒径由TecnaiG220TWIN透射电子显微镜（FEI，美国）测定，水动力学直径和zeta电势由ZetasizerNanoZS90动态光散射仪（Malvern，英国）测定。纳米氧化铁的相关表征见图2-1，图2-2。如图2-1A所示，纳米氧化铁呈球形，平均直径为20.2±2.7nm。纳米氧化铁的平均水动力学直径和Zeta电势分别为164.5±11.3nm和-11.7±0.1mV（图2-1B和C）。纳米氧化铁在1/2缺铁霍格兰营养液中的的平均水动力学直径和Zeta电势分别为267.8±18.7nm和-10.9±0.2mV（图2-2）。图2-2纳米氧化铁在1/2缺铁霍格兰营养液中的（A）粒径分布（B）Zeta电势2.2.2种子萌发及幼苗处理本实验采用柑橘属植物——柚子（Citrusmaxima）作为研究对象，种子来源于华中农业大学园林学院。将柑橘种子播种于去离子水浸泡过的珍珠岩中，在28℃下恒温萌发。待柑橘幼苗长至两叶一心时，选取长势一致的幼苗于去离子水培盆中，每盆18株幼苗，适应处理一周后，再用1/2缺铁霍格兰营养液培养，分别用20、50和100mg/L的纳米氧化铁和Fe3+（由FeCl3·6H2O溶解），以及50μMFe(II)-EDTA处理柑橘幼苗，对照组为1/2缺铁霍格兰营养液培养的柑橘幼苗。一共8个处理组，每个水培盆种有18株柑橘幼苗。其中，设置Fe3+处理组是为了研究Fe3+对植物的毒害作用；Fe(II)-EDTA处理组是采用常用的适宜浓15 度下的螯合铁肥，在这里作为阳性对照。Fe3+的浓度实际上是根据同一浓度下纳米氧化铁的含铁量计算得来，因此同一浓度的纳米氧化铁和Fe3+是表示两个处理下的含铁量相等。柑橘幼苗生长在人工气候箱中，昼夜温度设为28℃/18℃，光暗时间为16h/8h，光照强度为2000lx。通气泵每3小时向水培系统中通入30分钟空气。营养液每5天更换一次，处理20天后，检测相关生理指标及基因表达水平。3+2.2.3纳米氧化铁中Fe的释放曲线通过测定纳米氧化铁中释放出的Fe3+含量，可以为弄清纳米氧化铁对柑橘幼苗产生影响的主要原因是纳米粒子本身还是释放出的离子提供依据。具体操作如下：将悬浮在1/2缺铁霍格兰营养液中的100mg/L的纳米氧化铁分别加到6个10mL离心管中，铁释放实验进行的条件与植物培养所处条件一致。轻轻摇晃溶液，12小时后，其中1个离心管在4000rpm离心15分钟，上清液中的铁含量用AvantaM原子吸收分光光度计（GBC，澳大利亚）测得。其余的5管纳米氧化铁悬液随后每隔24小时测一管。2.2.4根长和生物量的测定在培养20天后，从水培系统中小心移出柑橘幼苗。幼苗的根长用直尺测量，鲜重用FA1004C电子分析天平（上海越平科学仪器有限公司）称量。2.2.5脂质过氧化作用的测定柑橘幼苗根和叶的脂质过氧化作用参照Heath和Packer[56]的方法测定。0.3g根和叶组织在2.0mL10%三氯乙酸中研磨，混合物在4000rpm离心10分钟。取1mL上清液加入2.0mL0.6%硫代巴比妥酸中，沸水浴15分钟后冷却至室温。4000rpm离心10分钟后，用UV−752N分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）分别测450、532和600nm三个波长下的吸光度。2.2.6可溶性蛋白质含量的测定可溶性蛋白质含量通过考马斯亮蓝G250染色法测定[57]。考马斯亮蓝G250溶液的制备：室温下称取100mg考马斯亮蓝G250，加入50mL95%乙醇和10016 mL85%（w/v）磷酸，用去离子水定容至1000mL。在10mL0.05M磷酸缓冲液（pH7.8）中研磨0.3g新鲜的柑橘叶片，混合液在4000rpm离心10分钟。取上清液0.1mL，去离子水0.9mL，加入到5mL0.1%考马斯亮蓝G250中，混匀。静置5分钟后，在595nm波长下测定上层清液吸光度。2.2.7抗氧化酶活性的测定取0.3g根或叶组织，分别在10mL0.05M磷酸缓冲液（pH7.8）中研磨均匀，混合液在4000rpm离心10分钟后，储存在4℃冰箱备用。2.2.7.1超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定SOD活性的测定是依据其对氮蓝四唑（NBT）光化学还原的抑制能力[58]。反应混合液包括：0.5mL之前准备好的上清液，0.5mL130mM甲硫氨酸，0.5mL750μMNBT，0.5mL100μMEDTA-Na2，0.5mL20μM核黄素，3.5mL0.05M磷酸缓冲液（pH7.8）。另准备一管磷酸缓冲液（pH7.8）代替上清液的样本，作为光照对照管。将完全混合的样本光照20分钟，参比样本用磷酸缓冲液（pH7.8）代替上清液，置于暗处。反应结束后，全部移入暗处，以不照光的对照管作空白，分别在560nm处测定其他各管的吸光度。2.2.7.2过氧化氢酶（CAT）活性的测定取0.4mL上清液，加入到3mL含有0.1%H2O2和100mM磷酸缓冲液（pH7.0）的溶液中。立即在240nm下测定吸光度，每30s记录一个数值，共270s。2.2.7.3过氧化物酶（POD）活性的测定采用愈创木酚比色法测定POD活性[59]。POD反应液的制备：加入28μL愈创木酚至50mL100mM磷酸缓冲液（pH7.0）中，待其完全溶解并冷却至室温后，加入19μL30%H2O2，混匀。取0.1mL上清液，0.9mL100mM磷酸缓冲液（pH7.0），加入到3mL上述POD反应液中，混匀后立即在470nm处测定吸光度，每30s记录一个数值，共270s。2.2.8叶绿素含量的测定叶绿素含量是根据Lichtenthaler[60]的测定方法进行改良后所测。取0.1g新17 鲜的叶组织，剪成碎片后，加入到10mL95%的乙醇中，在黑暗处放置14小时后，分别在649和665nm处测定吸光度。2.2.9铁含量分析处理20天后，将根组织在超声清洗器（KQ2200B，100W，40kHz，昆山市超声仪器有限公司）中超声5s，以去除吸附在根表面的纳米氧化铁。根和叶用去离子水清洗数次后，置于60℃烘箱中烘48小时。取100mg烘干的根或叶分别置于3mL浓硝酸中于100℃热锅中消解2-5小时。待冷却至室温后，向其中加入0.5mL30%H2O2，100℃消解0.5小时。铁含量通过原子吸收分光光度计测定。2.2.10根系活力的测定根系活力是根据氯化三苯基四氮唑（TTC）法的改良方法测定[61]。称取0.3g新鲜的根组织于10mL离心管中，加入3mL4%TTC和3mL1/15M磷酸缓冲液（pH6.89）。摇匀后37℃放置2小时，加入2mL1M硫酸使反应停止。吸出离心管中液体，加入6mL甲醇，室温下放置24小时，此步反应是为了提取三苯基甲瓒（TPF）。测定根系活力，实际上是测定根细胞脱氢酶的活性。在脱氢酶的催化下，氢从各种呼吸物质中脱离出来，遇到加入的无色TTC溶液，产生红色物质，即TPF。在485nm下可测得TPF的吸光度。2.2.11三价铁还原酶活性的测定三价铁还原酶是通过2,2’-联吡啶法测定[37]。称取0.1g根置于15mL离心管中，向其中加入10mL含有0.1mMFe(III)-EDTA和0.4mM2,2’-联吡啶的溶液，于暗处25℃反应2小时，每隔15分钟摇晃一次。在520nm波长下测定吸光度。2.2.12柑橘幼苗根TEM成像TEM样本的制作方法参照Li等[62]。取出50mg/L纳米氧化铁处理20天的柑橘幼苗，将根用去离子水冲洗数次后，固定在含有2.5%戊二醛的0.1M磷酸缓冲液（pH7.4）中4小时（4℃）。再在室温下将根固定在1%四氧化锇中2小18 时。随后将根浸泡在梯度乙醇中脱水并包埋。柑橘根样本在LeicaEMUC6超薄切片机切片后用于电镜观察。2.2.13基因表达调控使用Trizol试剂（Invitrogen，美国）分离柑橘根总RNA。通过琼脂糖凝胶电泳和吸收分光光度法（A260/A280>1.8）鉴定RNA的质量和数量。本实验以NCBI基因库的可用序列为基础，使用PrimerQuest（IntegratedDNATechnologies，Coralville，IA）设计所测基因的引物，引物序列见表2-1。柑橘Actin基因作为内参基因，反映正常基因的表达水平。1μg总RNA用于合成cDNA，cDNA是使用含有基因组DNA污染清除步骤的PrimeScript™RTMasterMix（PerfectRealTime）试剂盒（Takara，China）合成。引物的底物特异性由GeneAmpPCRSystem9700（ABI，USA）进行鉴定，以及通过肉眼观察溴化乙锭对1.5%琼脂糖凝胶染色进行鉴定。实时荧光定量PCR（RT-PCR）分析用ABI7500PCR(ABI，USA)及附带的软件进行。反应混合物包括：2μLcDNA，1μL0.2μM相应的正向和反向引物，25μL2×UltraSYBRMixture(withROX)试剂盒(CWBIO，China)，加处理过RNA酶的水使反应体系终体积为50μL。反应步骤如下：预变性，95℃，10分钟；变性，95℃运行40个循环，15s；退火，60℃，1分钟。反应完后，得到溶解曲线。每个处理组的柑橘幼苗检测的每个基因都重复测定三组结果。相对量（2−ΔΔCt法）用于计算不同处理条件下的相对基因表达水平[63]。表2-1根施实验所测基因的引物序列基因引物序列（正向-5'-3'）引物序列（反向-5'-3'）ActinCAGCTGTGGAGAAGAGCTATGCGATCATGGATGGTTGGAAGAAHATGACAAGTTCTGCCCTTTCTACCATCCATACCAGCTCCTTTCTCFRO2GTGTCTGTTGAAGGACCCTATGGCTCGCGGACTATGGAAATAANramp3GCGTGTTGATTGCTACTGTTATTGATGAGCACGCCAACTAGAA2.2.14统计分析每个处理都进行三组重复实验，结果用平均值±标准偏差表示。使用IBMSPSSStatistics22软件的邓肯多重比较的单因素方差分析（p<0.05）对实验数据进行统计分析。19 2.3结果与讨论3+2.3.1纳米氧化铁中Fe的动态释放图2-3100mg/L纳米氧化铁溶解的Fe3+释放曲线从100mg/L纳米氧化铁中释放的Fe3+的溶出曲线见图2-3。如图所示，Fe3+的释放在0-2天逐渐增加，随后达到平衡。Fe3+的终释放量约为14.2±0.9μg/L，即释放的铁含量占纳米氧化铁悬液中存在的总铁含量的量级为10-6，说明从纳米氧化铁中释放的Fe3+很少。1/2缺铁霍格兰营养液的高离子强度可能导致纳米粒子的聚集，从而减少纳米粒子的有效表面积，最终限制了Fe3+的释放[64]。值得一提的是，纳米氧化铁悬液的离子释放曲线是在没有植物根生长的条件下进行。在实际情况中，植物根系会影响纳米氧化铁中Fe3+的释放，如通过增强AHA基因的表达水平等。3+2.3.2纳米氧化铁和Fe处理柑橘苗的生长分析不同浓度的纳米氧化铁和Fe3+对柑橘幼苗生长的影响见图2-4，图B、C中小写字母不同，表示差异极显著（p<0.05）。在图2-4A中，可以看到100mg/L的Fe3+对柑橘根产生了明显的毒害作用。此外，可以清楚地看到大量纳米氧化铁聚集在根表面，并且纳米氧化铁的积累随着纳米粒子浓度的增加而增加。在图2-4B中，除100mg/L的Fe3+处理组外，其他处理对柑橘幼苗的鲜重没有明显影20 响。虽然100mg/L的纳米氧化铁和对照组的差异不明显，但是其鲜重含量比Fe(II)-EDTA处理低15.4%。至于根长，除100mg/L的Fe3+处理组比对照组低8.9%外，其他处理组都没有表现出明显的差异（图2-4C）。一般来说，纳米粒子的植物毒性随着悬液浓度的增加而增加[36]。然而所有浓度的纳米氧化铁对柑橘幼苗的生长没有表现出明显的抑制作用。低浓度的Fe3+处理组也没有对植物表现出明显的毒害作用，而100mg/L的Fe3+处理组对幼苗生长产生抑制，其原因可能是在该处理条件下，游离的铁离子含量过高，从而通过Fenton反应生成了大量具有细胞毒性的羟自由基[43,53]，从而对柑橘根系产生的强烈的毒害作用，并显著减少根长和幼苗生物量。图2-4（A）不同处理下柑橘幼苗根的生长情况（B）不同处理下柑橘植株的鲜重（C）不同处理下柑橘的根长2.3.3柑橘苗的脂质过氧化作用和可溶性蛋白质含量脂质过氧化作用是检测细胞氧化损伤的重要指标，可以直接用丙二醛含量表示。丙二醛含量高说明植物细胞膜脂过氧化的程度高，细胞膜受到的损伤严重。如图2-5A所示，图中大、小写字母不同，表示差异极显著（p<0.05）。对柑橘根而言，20和50mg/L的纳米氧化铁对丙二醛含量没有产生显著影响，而100mg/L的纳米氧化铁比对照组的丙二醛含量高44.7%。可以看到，所有Fe3+21 处理组的丙二醛含量都比对照组高。然而和Fe(II)-EDTA相比，所有纳米氧化铁和Fe3+处理组的丙二醛含量没有升高。Fe(II)-EDTA作为最广泛使用的铁补充剂之一，常用于改善铁对植物的有效性。根据Fe(II)-EDTA的高丙二醛含量，可以认为，其对柑橘根产生了毒性作用。已有报道说明铁和配体通常是以不等比例分别被吸收的[65]。1957年，Burström和Tullin[66]证实根细胞内存在螯合效应。Fe(II)-EDTA处理下柑橘根的高丙二醛含量可能是由游离的螯合剂的毒性效应造成的。对柑橘叶而言，和对照组与Fe(II)-EDTA相比，20mg/L的纳米氧化铁对丙二醛含量没有显著影响。但是50和100mg/L的纳米氧化铁处理组的丙二醛含量分别比对照组增加38.1%和43.1%。此外，20-100mg/L的Fe3+处理组的丙二醛含量也显著增加。丙二醛含量的增高表明植物中可能发生了氧化损伤。脂质过氧化是细胞膜完整性的特征参数，活性氧的形成被认为是通过脂质过氧化作用导致细胞膜损伤的主要因素[67]。过量的活性氧和脂质过氧化作用的增强有关。结果表明，除20mg/L的纳米氧化铁外，其余纳米氧化铁和Fe3+处理组均对根或叶产生了氧化损伤。20mg/L的纳米氧化铁处理组没有引起膜损伤可能是此浓度下的纳米粒子没有引起活性氧形成，或者是植物的解毒途径足以补救引起的氧化应激[68]。图2-5（A）不同处理下柑橘幼苗根和叶丙二醛的含量（B）不同处理下柑橘叶的可溶性蛋白质含量可溶性蛋白质是植物活性物质的一个重要组成部分，植物中可溶性蛋白质的积累有利于抗氧化酶、解毒酶、代谢酶以及一些功能因子的形成，从而清除在应激条件下植物体内产生的自由基[69]。例如，Ge和Zhang[70]发现在四溴双酚22 A胁迫下，可溶性蛋白质含量的增加伴随着SOD、CAT和POD的激活。如图2-5B所示，图中小写字母不同，表示差异极显著（p<0.05）。20-100mg/L的纳米氧化铁和Fe3+处理组的可溶性蛋白质含量比对照组高36%-90%，但是相比于Fe(II)-EDTA，它们的可溶性蛋白质含量并没有增加。可溶性蛋白质的积累可以看作一种抵御氧化应激的自我保护反应。可溶性蛋白质含量增加有利于抗氧化酶的产生，从而修复引起的应激。2.3.4柑橘苗的抗氧化酶活性图2-6（A）纳米氧化铁应激下植物细胞中抗氧化酶激活示意图（B）不同处理下柑橘幼苗根和叶的SOD活性（C）不同处理下柑橘幼苗根和叶的CAT活性（D）不同处理下柑橘幼苗根和叶的POD活性SOD、CAT和POD是植物抗氧化防御系统中的关键酶。金属酶SOD可以加快O•−[71]2转化为H2O2，而CAT和POD可以催化H2O2分解。纳米粒子可以通过产生活性氧引起氧化应激，从而在植物体内激活抗氧化防御系统，如图2-6A23 所示，图中ROS代表活性氧。如图2-6所示，图B-D中大、小写字母不同，表示差异极显著（p<0.05）。和对照组相比，纳米氧化铁对柑橘根的SOD活性没有显著影响（图2-6B）。与此相似，20-100mg/L的纳米氧化铁对玉米根的SOD活性也没有明显影响[62]。同时，可以看到Fe3+处理组的根SOD活性明显比对照组低。这可能是因为活性氧大量产生使柑橘失去了调节SOD活性的能力，导致SOD活性降低[72]。另一方面，除了20mg/L的纳米氧化铁处理的柑橘叶SOD活性没有明显影响外，其他纳米氧化铁和所有Fe3+处理组的SOD活性都明显低于对照组，表明产生的较强的氧化应激破化了植物对SOD活性的调节。Fe(II)-EDTA的根和叶SOD活性都处于较低水平。在图2-6C中，纳米氧化铁对柑橘根和叶CAT活性都没有明显影响。20mg/L的Fe3+处理组的根CAT活性比对照组高，但是50和100mg/L的Fe3+处理组的CAT活性和对照组相比差异不明显。此外，所有纳米氧化铁和Fe3+处理组的根CAT活性都比Fe(II)-EDTA低。对柑橘叶而言，20-100mg/L的Fe3+处理组的CAT活性比对照组高1.6-2.9倍。增高的CAT活性有助于清除H2O2。在图2-6D中，20mg/L的纳米氧化铁处理的柑橘根POD活性与对照组没有差异，而50和100mg/L的纳米氧化铁处理组的根POD活性明显比对照组高。升高的POD活性说明柑橘增强了其抗氧化防御系统来清除产生的大量活性氧。20和50mg/L的Fe3+处理组的根POD活性明显比对照组高，但是100mg/L的Fe3+的根POD活性与对照组差别不大。对柑橘叶而言，所有纳米氧化铁和Fe3+处理组的POD活性都比对照组高。增强的POD活性有助于清除过量的活性氧。此外，Fe(II)-EDTA处理组的柑橘根和叶的CAT和POD活性都较高。SOD、CAT和POD活性的研究说明纳米氧化铁和Fe3+都在柑橘幼苗体内诱导产生了抗氧化防御。尽管结果表明Fe(II)-EDTA在植物中产生了氧化胁迫，但是图2-7B和C的结果表明，Fe(II)-EDTA可以向植物供铁，并增加叶绿素含量。铁的螯合物，如Fe-EDTA被认为是最广泛使用的补充剂之一，常用于改善铁对植物的有效性。然而合成的螯合铁肥对环境有直接或间接的影响[73]，并且可以导致重金属和放射性金属的移动性[74-76]。因此，有必要研究新方法来缓解植物缺铁黄化症状并增强铁肥在农业系统中的功效，如研发新型纳米铁肥[31]。2.3.5柑橘苗的叶绿素含量及铁分布情况纳米氧化铁和Fe3+处理的柑橘幼苗叶片生长情况如图2-7A所示。可以看到，24 图2-7（A）不同处理下柑橘幼苗叶的生长情况（B）不同处理下柑橘叶的叶绿素含量（C）不同处理下柑橘根和叶的铁含量50mg/L的纳米氧化铁可以在一定程度上改善叶片的缺铁黄化。虽然20-100mg/L的Fe3+处理组的柑橘叶片明显比对照组叶片更绿，但是也可以看到明显的植物毒性现象，如叶片萎蔫、畸形，尤以100mg/L的Fe3+处理组的现象最为明显。与预期结果相同，Fe(II)-EDTA处理的柑橘幼苗叶片比其他处理组生长得更健康。不同处理组的柑橘叶片叶绿素含量见图2-7B，图中小写字母不同，表示差异极显著（p<0.05）。作为重要的光合色素，叶绿素含量可以作为检测植物毒性的一个重要指标[77]。叶绿素含量的结果与柑橘叶片的图所表现出的情况基本上一致。和对照组相比，20mg/L的纳米氧化铁对叶绿素含量没有明显影响，而50mg/L的纳米氧化铁处理的柑橘叶绿素含量比对照组高23.2%，100mg/L的纳米氧化铁处理的叶绿素含量则比对照组低19.7%。纳米氧化铁很容易团聚并且溶解度低，由于重力作用会导致其沉淀[36]。并且本实验所用的纳米氧化铁为γ-Fe2O3纳米粒子，具有磁性，研究表明磁性纳米粒子的稳定性和转运受静电结合作用和磁性相互作用影响，磁性相互作用会增强纳米粒子的聚集[78]。100mg/L的纳米氧化铁处理组叶绿素含量的降低可能是由于在高浓度下，大量纳米粒子在根表面的聚集和积累，这一点可以被图2-4A证明。有研究表明，吸附在根表面的纳米粒子会阻碍水分向叶的运输[79]。另一方面，金属纳米粒子可能和叶绿体相25 互作用使其产生氧化应激，最终破坏叶绿素的合成或导致叶绿素的降解[67]。50mg/L的纳米氧化铁尽管诱导了氧化应激，但是也增加了叶绿素含量，并且该处理下的叶铁含量（见图2-7C）尽管相比对照组增加了但是在统计学上差异并不明显，表明50mg/L的纳米氧化铁处理下叶绿素含量的增加可能存在另一种机制，这需要在细胞水平上进一步实验来弄清相关机制。另一方面，20、50和100mg/L的Fe3+处理组的叶绿素含量分别比对照组高42.1%、125.9%和23.3%。这说明虽然Fe3+对植物具有毒害作用，但是它们能向植物提供铁，从而有助于叶绿素的合成。与预期相符，Fe(II)-EDTA处理组的叶绿素含量较高，但是低于50mg/L的Fe3+的叶绿素含量。纳米氧化铁和Fe3+处理后的柑橘体内铁分布结果如图2-7C所示，图中大、小写字母不同，表示差异极显著（p<0.05）。20mg/L的纳米氧化铁处理的柑橘根铁含量和对照组相比没有明显差异，而50和100mg/L的纳米氧化铁处理组的铁含量高于对照组15倍多。Gui等[80]发现，粒径小于50nm的纳米氧化铁可以穿过细胞膜，在水稻根表皮细胞积累。纳米氧化铁在柑橘根的积累说明纳米粒子可以进入柑橘根细胞。有趣地是，100mg/L的纳米氧化铁的铁含量比50mg/L的纳米氧化铁低，这可能是因为高浓度的纳米氧化铁容易团聚成簇，从而堵塞植物多孔细胞壁[38]，减少纳米粒子的吸收。对柑橘叶而言，纳米氧化铁对其铁含量并没有明显影响，表明纳米粒子在柑橘幼苗体内并没有发生向上转运。许多研究都报道了纳米粒子被植物吸收，但是没有发生转运[72,81,82]。有研究表明，纳米粒子可以和水、营养物质共享植物的维管系统，在被根吸收后可以通过蒸腾作用向上运输，但是由于纳米粒子可能团聚甚至堵塞维管系统，或者进入到附近的组织和细胞，从而导致纳米粒子几乎没有转运[72,83]。另一方面，Fe3+处理组的柑橘根铁含量都处于较高水平，尤其是100mg/L的Fe3+处理组。高浓度的铁由于参与Fenton反应可能会产生毒性，因此，100mg/L的Fe3+产生了较强的植物毒性，并抑制柑橘幼苗的生长。此外，20、50和100mg/L的Fe3+处理组的叶铁含量分别比对照组高1.64,7.85和2.20倍。50mg/L的Fe3+处理的柑橘叶中的高铁含量极大地促进了叶绿素的合成，使其叶绿素含量处于很高水平（见图2-7B）。Fe(II)-EDTA处理的柑橘根铁含量与对照组没有明显差异，但是其叶铁含量显著增加62.2%。毫无疑问，Fe(II)-EDTA可以有效地向植物提供铁营养。26 2.3.6柑橘根的活力及三价铁还原酶活性图2-8不同处理下柑橘根的（A）根系活力（B）三价铁还原酶活性柑橘根的根系活力和三价铁还原酶活性如图2-8所示，图中小写字母不同，表示差异极显著（p<0.05）。脱氢酶活性是根系活力的综合评价指标，反映了代谢活动水平和根吸收营养和水分的能力[84]。50mg/L的纳米氧化铁处理组的根系活力比对照组高23.8%，但是和Fe(II)-EDTA相比差异不显著（图2-8A）。20mg/L的纳米氧化铁对柑橘的根系活力影响不大，而100mg/L的纳米氧化铁处理组的根系活力明显低于对照组。Wang等[85]曾报道氧化的多壁碳纳米管可以显著增强小麦幼苗根脱氢酶活性，这反过来又增强了幼苗的水吸收能力。因此，50mg/L的纳米氧化铁处理组的根系活力升高说明此浓度下的纳米氧化铁能有效增强植物水吸收，从而促进根代谢水平。尽管如此，纳米粒子增加根系活力的机制尚不清楚。较低的根系活力可能是由于100mg/L的纳米氧化铁引起的氧化损伤造成的，这一点可以被该处理下柑橘根的高丙二醛含量证实（图2-5A）。此外，如前文所述，高浓度的纳米粒子很容易团聚成簇。并且磁性作用还会增强磁性纳米粒子(纳米氧化铁)的团聚[78]。Martínez-Fernández等[40]用纳米氧化铁短期处理水培向日葵根，来研究植物水分关系与吸附在根表面的纳米粒子的相关性。他们发现，纳米粒子减少根水分传导率，说明根功能受损。柑橘根的图片（图2-4A）和铁含量结果（图2-7C）表明100mg/L的纳米氧化铁处理下大量纳米粒子吸附在根表面。基于此，可以得出结论，即100mg/L的纳米氧化铁27 影响根部水分吸收，从而对根活力产生不利影响。由于根中铁含量过高会产生毒性，因此Fe3+处理组对根系活力没有促进作用。其中，由于50mg/L的Fe3+处理组的大部分铁从根转运到柑橘叶中，它的根系活力比20和100mg/L的Fe3+处理组要高。不同处理下柑橘根的三价铁还原酶活性如图2-8B所示。在柑橘植株中，Fe[III]要先被三价铁还原酶还原，生成的Fe[II]通过质膜运输从而被植物利用[86]。通常情况下，当植物缺铁时，还原系统会被强烈激活[87]。Fe(II)-EDTA的三价铁还原酶活性很低，并且显著低于对照组。50mg/L的纳米氧化铁处理组的三价铁还原酶活性比对照组高63.3%，这可能是因为三价铁还原酶活性提高可以促进铁的还原和利用。但是100mg/L的纳米氧化铁处理组的三价铁还原酶活性比对照组低59.2%，这可能是由该处理下引起的氧化损伤造成的，并且大量纳米粒子吸附在根表面，从而使柑橘根功能受损。此外，20和50mg/L的Fe3+处理组的三价铁还原酶活性分别比对照组高71.4%和308.2%，说明植物可以还原和利用Fe3+。但是100mg/L的Fe3+处理组的三价铁还原酶活性减少了72.4%，这可能是因为该处理下根中铁含量过高（图2-7C），对根造成损伤并干扰根生理功能，从而导致三价铁还原酶活性降低。2.3.7柑橘根的TEM图图2-9（A）对照组（B、C）50mg/L的纳米氧化铁处理的柑橘根细胞TEM图为检测纳米氧化铁是否被柑橘幼苗根细胞吸收，通过TEM对柑橘根横切进行了观察。可以看到，相比于对照组（图2-9A），图2-9B中观察到根细胞液泡中有大块团聚的黑点，这很可能是内化的纳米氧化铁。图2-9C进一步证实，纳米粒子的内化过程是通过根细胞旺盛的内吞作用进行的。植物根细胞通过内吞28 作用吸收纳米粒子已被Shukla等[88]证实，他们发现金纳米粒子通过内吞作用进入细胞。此外，还可以发现在图2-9B中，根细胞中线粒体的数量远比对照组高。线粒体在植物细胞的能量转换中发挥着关键作用[89]。根细胞中观察到的大量线粒体将快速持续地为纳米氧化铁的吸收供能。同时，线粒体可以减少氧浓度，从而保护细胞免受氧化损伤[90]。和我们观察到的纳米氧化铁进入柑橘根细胞液泡相似，之前也有研究报道TiO[91]2纳米粒子主要进入小麦根液泡，NiO纳米粒子聚集在番茄根细胞的液泡中[92]。2.3.8柑橘根的基因表达分析图2-10（A）不同处理下柑橘根AHA基因的表达（B）不同处理下柑橘根FRO2基因的表达（C）不同处理下柑橘根Nramp3基因的表达（D）植物根中铁吸收和转运过程示意图植物吸收Fe[III]氧化物的生理过程包括：AHA基因编码的H+-ATPase泵出H+增强根际酸化；根系分泌酚类物质和有机酸与铁螯合；通过FRO2基因编码的三价铁还原酶将Fe[III]还原为Fe[II]；最后通过IRT1基因编码的转运蛋白将Fe2+运输到细胞内（图2-10D）。此外，Nramp蛋白位于液泡膜上，植物缺铁时可以将转运Fe2+到细胞质。柑橘根中与铁吸收转运有关的基因表达见图2-10，图A-C中小写字母不同，表示差异极显著（p<0.05）。如图2-10A所示，所有纳米氧化铁处理组AHA基因含量都比对照组低（但不低于对照组的0.5倍）或差别不大，因此认为纳米粒子的存在对AHA基因的表达没有影响。分子生物学29 中通常认为基因相对表达水平相差不到0.5倍，都被认为是差异不显著。已知缺铁时H+-ATPase向膜外泵出质子，从而使根际溶解更多的铁[43]。然而纳米氧化铁处理的柑橘根AHA基因的表达水平并未发生明显变化，说明纳米粒子处理的植物处于铁充足状态。在图2-10B中，50mg/L的纳米氧化铁和Fe3+处理组的FRO2基因的相对表达量分别比对照组高66.3%和40.8%。FRO2基因编码三价铁还原酶，超表达的FRO2基因会产生更强的三价铁还原酶活性，从而进一步促进铁的利用并增强柑橘幼苗对缺铁的耐受性。相应地，这两组处理下三价铁还原酶活性比对照组和Fe(II)-EDTA都要高。需要注意的是，100mg/L的Fe3+处理样本的FRO2基因的表达受到抑制，这是说明100mg/L的Fe3+毒性效应的另一个证据。Nramp是铁调节金属蛋白的一员，它存在于从细菌到人类的不同生物中，在金属离子稳态中起着重要作用[93]。如图2-10C所示，所有纳米氧化铁和Fe3+处理的柑橘根中Nramp3基因表达的相对量明显低于对照组。Nramp铁转运蛋白系统可以使植物对铁需求的细小变化产生快速应答。例如，缺铁时Nramp转录上调，铁充足时Nramp转录下调到较低水平[94]。这里，下调的Nramp3基因表达说明所有的纳米氧化铁和Fe3+处理组都可以向柑橘幼苗供铁。此外，100mg/L的纳米氧化铁和Fe3+处理组的Nramp3基因表达相对量比Fe(II)-EDTA高2.8-5.1倍，这可能是因为高浓度纳米氧化铁的团聚作用和Fe3+的毒性引起的。有研究称缺铁时Nramp3的超表达可以通过液泡铁的释放增强细胞铁可用性[95]。根据前面的结果，高浓度的纳米粒子大量团聚在根表面，影响根水分的吸收，造成根损伤；同时，高浓度的Fe3+也会对根造成损伤，损害根功能和活力。因此，100mg/L的纳米氧化铁和Fe3+处理组的Nramp3基因表达的增强是植物自己调节的结果。总的来说，基因表达结果说明纳米氧化铁和Fe3+都可以激活植物根的分子应答从而转化和吸收外部铁。与此对应，铁含量的结果表明，除20mg/L的纳米氧化铁的根铁含量在数值上比对照组高但是无显著性差异外，其他纳米氧化铁和Fe3+处理组均使根中铁含量显著增加（图2-7C）。研究纳米氧化铁和Fe3+在分子水平上对柑橘的应答有助于人们更好地理解纳米氧化铁或Fe3+与植物的相互作用。2.4小结本章实验通过根施不同浓度的纳米氧化铁和Fe3+处理柑橘幼苗，研究根部施加下纳米氧化铁对柑橘缺铁黄化的矫治情况以及相应的生理和分子应答，小结30 如下：（1）纳米氧化铁可以被植物根吸收，并且主要积累在根细胞的液泡中。但是并没有发生向上运输。纳米氧化铁进入柑橘根也引起了机理I植物吸收转运铁相关基因表达的变化。根据生理检测和基因表达的结果，发现植物可以利用纳米氧化铁和Fe3+这两种形式的铁。（2）和对照组相比，20mg/L的纳米氧化铁对植物生长没有明显影响，50mg/L的纳米氧化铁显著增加叶绿素含量和根系活力。由于高浓度的纳米氧化铁大量团聚积累在根表面，使水和其他营养物质的运输受到抑制，导致100mg/L的纳米氧化铁增强脂质过氧化作用，减少叶绿素含量及根系活力。说明适宜浓度的纳米氧化铁通过根施植物有可能改善植物缺铁黄化症状。（3）所有Fe3+处理组的叶绿素含量均增加，但是它们的丙二醛含量均较高，并且对植物根造成了损伤。100mg/L的Fe3+对植物产生较大毒性，如减少生物量和根长。这说明虽然Fe3+可以在一定程度上向植物提供铁元素，改善植物缺铁并促进叶绿素的合成，但是需要控制Fe3+的浓度，以避免对植物产生较大的毒性。（4）综合来看，纳米氧化铁对植物造成的损伤比Fe3+少。根据纳米氧化铁释放的Fe3+和铁分布结果，认为纳米氧化铁引起的柑橘幼苗生理和分子应答是纳米氧化铁和释放的Fe3+共同造成的结果。31 第3章叶喷下纳米氧化铁与柑橘叶片的相互作用及生理影响3.1引言根是植物吸收水和无机离子主要路径，纳米粒子可以通过根被植物吸收，也可以作用于叶进入植物。作为所有陆生植物最为重要的保护层之一，角质层覆盖在植物地上部分最表层，它能够保护地上组织使其适应各种非生物和生物逆境，在植物适应外界环境作用方面起重要作用[96]。当纳米粒子作用于植物叶面时，由于纳米粒子比表面积大，粒子可能先被阻截在角质层蜡质中，随后在穿过角质层后，扩散到叶组织中。因此，研究叶面喷施下纳米氧化铁对植物的生长影响有必要研究纳米氧化铁与叶角质层蜡质的相互作用。已有研究结果表明，蜡质层在植物角质膜中十分重要，起最主要地作用。植物叶表皮蜡质成分复杂，通常认为蜡质是一类有机物质的混合物，主要由饱和极长链脂肪酸及其衍生物组成，成分多样性表明蜡质的产生是由许多基因控制的结果[97]。植物蜡质合成和运输是在表皮细胞完成的一个非常复杂的过程，需要多种酶和编码这些酶的基因参与。植物角质层蜡质的合成是以极长链脂肪酸为前体，主要分为两个合成途径[98]：一是乙酰还原途径，主要生成伯醇和酯；二是脂肪酸脱羧途径，主要生成醛、烷烃、酮类和仲醇。合成的产物由ABC转运蛋白（ATP-bindingcassettetransporter）输送出细胞质膜，最终由脂转运蛋白运至植物角质层。Broun等[99]在2004年克隆了乙烯反应因子型转录因子基因WIN1，在转基因拟南芥中对WIN1基因进行超强表达，其叶片中的蜡质含量达到对照组4.5倍以上，茎中蜡质含量也有显著增长。许多与蜡质合成相关的基因如CER1、KCS1和CER2均受到WIN1诱导，可能是因为WIN1增强了某些蜡质合成途径中基因的表达水平[98]。此外，已经在拟南芥中发现的与蜡质合成有关的部分基因有：CER1基因与脱羰途径有关[100]；CER2是从拟南芥中发现的第1个蜡质合成基因[101]；也有研究发现CER3基因与蜡质合成有关[102]；CER4基因与植物表皮细胞初级醇的合成有关[103]；CER6基因编码长链脂肪酸β-酮脂酰辅酶A合成酶[104]；CER10基因编码烯酰辅酶A还原酶，该酶是长链脂肪酸合成所必需的酶[105]。目前发现的与蜡质运输有关的基因有：从拟南芥中克隆的CER5基因编码的ABC转运蛋32 白可能具有转运蜡质到细胞外的功能[106]；从玉米种克隆的GLOSSY1基因可能与蜡质成分的运输有关[107]。由于目前柑橘属植物的基因尚未测序完全，以上基因在柑橘属植物中只找到了WIN1基因，以及与CER5基因有同源序列的ABCG12基因。Alabdallat等[108]报道WIN1基因可以调节蜡质积累并增强番茄植株对干旱的抗性。ABCG12转运蛋白是ABC转运蛋白家族的一员，Mcfarlane等[109]发现ABCG12基因与脂质从表皮细胞运送到角质层有关。目前还没有研究报道叶面应用的纳米粒子对角质层蜡质含量及相关基因表达的影响。本章实验为深入研究纳米氧化铁和角质层蜡质在柑橘叶面的相互作用，在分子水平上分析了蜡质含量及蜡质合成和转运相关基因的表达。此外，本章实验研究了叶面喷施的纳米氧化铁对植物产生的生理生长影响，测定了代表参数如生物量、叶绿素含量、可溶性蛋白含量、根系活力、脂质过氧化作用、以及抗氧化酶活性。并在分子水平上测定了纳米氧化铁通过叶面被植物吸收涉及到的与铁吸收转运有关基因（如FRO2和Nramp3）的表达。3.2实验材料和方法3.2.1种子萌发及幼苗处理柑橘种子播种于去离子水浸泡过的珍珠岩中，在28℃下恒温萌发。待柑橘幼苗长至两叶一心时，选取长势一致的幼苗于去离子水培盆中，每盆18株幼苗，适应处理一周后，改用1/2缺铁霍格兰营养液培养。当幼苗长有两片真叶后，分别用喷雾器于清晨向柑橘叶面喷施50mL去离子水（对照组），20、50和100mg/L3+（由FeCl纳米氧化铁悬液，20、50和100mg/LFe3·6H2O溶解）溶液，以及50μMFe(II)-EDTA。每5天喷一次。所有植株每1小时用去离子水喷洒一次，共10小时，以避免溶液的蒸发以及溶质沉降在叶表面。柑橘幼苗生长在人工气候箱中，昼夜温度设为28℃/18℃，光暗时间为16h/8h，光照强度为2000lx。通气泵每3小时向水培系统中通入30分钟空气。营养液每5天更换一次，培养30天后，检测相关生理指标及基因表达水平。3.2.2生物量的测定处理30天后，小心从水培盆中移出柑橘幼苗。柑橘幼苗的鲜重用FA1004C电子分析天平（上海越平科学仪器有限公司）称量。33 3.2.3叶绿素含量的测定叶绿素含量通过乙醇浸提法测定[60]，取0.1g新鲜的叶组织，剪成碎片后，加入到10mL95%乙醇中，在黑暗处放置14小时后，用UV−752N分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）分别在649和665nm处测定吸光度。3.2.4可溶性蛋白质含量的测定可溶性蛋白质含量采用考马斯亮蓝G250染色法测定[57]。考马斯亮蓝G250溶液的制备：室温下称取100mg考马斯亮蓝G250，加入50mL95%乙醇和100mL85%（w/v）磷酸，用去离子水定容至1000mL。在10mL0.05M磷酸缓冲液（pH7.8）中研磨0.3g新鲜的柑橘叶片，混合液在4000rpm离心10分钟。取上清液0.1mL，去离子水0.9mL，加入到5mL0.1%考马斯亮蓝G250中，混匀。静置5分钟后，在595nm波长下测定上层清液吸光度。3.2.5根系活力的测定TTC法测定根系活力[61]。称取0.3g新鲜的根组织于10mL离心管中，加入3mL4%TTC和3mL1/15M磷酸缓冲液（pH6.89）。摇匀后37℃放置2小时，加入2mL1M硫酸使反应停止。吸出离心管中液体，加入6mL甲醇，室温下放置24小时，此步反应是为了提取三苯基甲瓒（TPF）。测定根系活力，实际上是测定根细胞脱氢酶的活性。在脱氢酶的催化下，氢从各种呼吸物质中脱离出来，遇到加入的无色TTC溶液，产生红色物质，即TPF。在485nm下可测得TPF的吸光度。3.2.6丙二醛含量的测定柑橘幼苗根和叶的丙二醛含量参照Heath和Packer[56]的方法测定。0.3g根和叶组织在2.0mL10%三氯乙酸中研磨，混合物在4000rpm离心10分钟。取1mL上清液加入2.0mL0.6%硫代巴比妥酸中，沸水浴15分钟后冷却至室温。4000rpm离心10分钟后，分别测450、532和600nm三个波长下的吸光度。3.2.7抗氧化酶活性的测定取0.3g根或叶组织，分别在10mL0.05M磷酸缓冲液（pH7.8）中研磨均34 匀，混合液在4000rpm离心10分钟后，储存在4℃冰箱备用。3.2.7.1超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定SOD活性的测定是依据其对氮蓝四唑（NBT）光化学还原的抑制能力[58]。反应混合液包括：0.5mL之前准备好的上清液，0.5mL130mM甲硫氨酸，0.5mL750μMNBT，0.5mL100μMEDTA-Na2，0.5mL20μM核黄素，3.5mL0.05M磷酸缓冲液（pH7.8）。另准备一管磷酸缓冲液（pH7.8）代替上清液的样本，作为光照对照管。将完全混合的样本光照20分钟，参比样本用磷酸缓冲液（pH7.8）代替上清液，置于暗处。反应结束后，全部移入暗处，以不照光的对照管作空白，分别在560nm处测定其他各管的吸光度。3.2.7.2过氧化氢酶（CAT）活性的测定取0.4mL上清液，加入到3mL含有0.1%H2O2和100mM磷酸缓冲液（pH7.0）的溶液中。立即在240nm下测定吸光度，每30s记录一个数值，共270s。3.2.7.3过氧化物酶（POD）活性的测定采用愈创木酚比色法测定POD活性[59]。POD反应液的制备：加入28μL愈创木酚至50ml100mM磷酸缓冲液（pH7.0）中，待其完全溶解并冷却至室温后，加入19μL30%H2O2，混匀。取0.1mL上清液，0.9mL100mM磷酸缓冲液（pH7.0），加入到3mL上述POD反应液中，混匀后立即在470nm处测定吸光度，每30s记录一个数值，共270s。3.2.8铁含量分析将柑橘叶片用去离子水冲洗，以去除表面残留的纳米氧化铁。随后将根、叶样本于60℃烘箱中干燥48小时。取100mg烘干的根或叶分别置于3mL浓硝酸中于100℃热锅中消解2-5小时。待冷却至室温后，向其中加入0.5mL30%H2O2，100℃消解0.5小时。铁含量通过AvantaM原子吸收分光光度计（GBC，澳大利亚）测定。3.2.9蜡质含量的测定表皮蜡质含量的测定采用氯仿萃取法[110]。在直径90mm的培养皿中倒入2035 mL氯仿，将叶片浸入5s后取出叶片。将培养皿放在通风橱中在干燥的空气流下蒸发，随后将含残留物的培养皿在室温下干燥24小时，称重得到蜡质含量。3.2.10基因表达调控使用Trizol试剂（Invitrogen，美国）分离柑橘根总RNA。通过琼脂糖凝胶电泳和吸收分光光度法（A260/A280>1.8）鉴定RNA的质量和数量。本实验以NCBI基因库的可用序列为基础，使用PrimerQuest（IntegratedDNATechnologies，Coralville，IA）设计所测基因的引物。本章实验所测FRO2、Nramp3、ABCG12和WIN1基因的引物序列见表3-1，其中，Actin基因作为内参基因，反映正常基因的表达水平。1μg总RNA用于合成cDNA，cDNA是使用含有基因组DNA污染清除步骤的PrimeScript™RTMasterMix（PerfectRealTime）试剂盒（Takara，China）合成。引物的底物特异性由GeneAmpPCRSystem9700（ABI，USA）进行鉴定，以及通过肉眼观察溴化乙锭对1.5%琼脂糖凝胶染色进行鉴定。实时荧光定量PCR（RT-PCR）分析用ABI7500PCR(ABI，USA)及附带的软件进行。反应混合物包括：2μLcDNA，1μL0.2μM相应的正向和反向引物，25μL2×UltraSYBRMixture(withROX)试剂盒(CWBIO，China)，加处理过RNA酶的水使反应体系终体积为50μL。反应步骤如下：预变性，95℃，10分钟；变性，95℃运行40个循环，15s；退火，60℃，1分钟。反应完后，得到溶解曲线。每个处理组的柑橘幼苗检测的每个基因都重复测定三组结果。表3-1叶喷实验所测基因的引物序列基因引物序列（正向-5'-3'）引物序列（反向-5'-3'）ActinCAGCTGTGGAGAAGAGCTATGCGATCATGGATGGTTGGAAGANramp3GCGTGTTGATTGCTACTGTTATTGATGAGCACGCCAACTAGAAFRO2GTGTCTGTTGAAGGACCCTATGGCTCGCGGACTATGGAAATAAABCG12GGAAGGGCTGGAAATTGAAATCGCCCAGTAATATCCCACATCTCWIN1GCTCCTCATCATCATCACCTACGCCTCAGACAAGTCATAGAAGG3.2.11统计分析每个处理都进行三组重复实验，结果用平均值±标准偏差表示。使用IBMSPSSStatistics22软件的邓肯多重比较的单因素方差分析（p<0.05）对实验数据36 进行统计分析。3.3结果与讨论3+3.3.1纳米氧化铁和Fe对柑橘苗生长的影响图3-1（A）不同处理下柑橘叶片生长情况图（B）不同处理下柑橘叶的叶绿素含量（C）不同处理下柑橘植株的鲜重（D）不同处理下柑橘叶片可溶性蛋白质含量（E）不同处理下柑橘根的根系活力纳米氧化铁和Fe3+对柑橘苗生长的影响如图3-1所示，图B-E中小写字母不同，表示差异极显著（p<0.05）。20-100mg/L的纳米氧化铁和它们对应的Fe3+溶液对柑橘叶片生长的影响如图3-1A所示。可以看到，所有处理组对柑橘叶片都没有表现出明显的毒性，它们的生长情况类似，黄化症状没有得到改善。在37 图3-1B中，所有处理组的叶绿素含量都没有表现出明显差异。虽然纳米氧化铁、Fe3+处理的柑橘叶铁含量比对照组及Fe(II)-EDTA高（图3-3B），但是纳米氧化铁、Fe3+、对照组及Fe(II)-EDTA的叶绿素含量没有表现出明显差异。可能铁主要用于其他生理反应，因此叶绿素含量没有发生明显变化。需要注意的是，在柑橘根施实验中，纳米氧化铁和Fe3+处理的叶绿素含量与它们浓度有关，50mg/L的纳米氧化铁和所有Fe3+处理组显著增加叶绿素含量，并且Fe(II)-EDTA与对照组相比，叶绿素含量也很高（图2-7B）。然而，叶面喷施的纳米氧化铁、Fe3+以及Fe(II)-EDTA，对叶绿素含量都没有明显的促进作用，并且没有改善黄化症状。这说明叶面喷施没有根施效果好。相反，Alidoust和Isoda[36]观察到叶面喷施纳米氧化铁比土壤处理对大豆的生理指标有着更显著的促进作用。他们的实验和本章实验有很多差别，如γ-Fe2O3NP粒径和浓度，培养条件，处理时间以及植物品种等都不同，这些不同之处可能是两个实验得到相反结果的原因。在图3-1C中，除50mg/L的Fe3+处理组的鲜重比对照组高15.4%外，其他所有纳米氧化铁和Fe3+处理组的鲜重含量都和对照组没有显著差异。另一方面，和Fe(II)-EDTA处理组相比，所有纳米氧化铁和Fe3+处理组的鲜重都没有表现出促进作用。其中，50和100mg/L的纳米氧化铁，以及100mg/L的Fe3+的鲜重分别减少22.1%、18.7%和14.3%。此外，除20mg/L的纳米氧化铁的可溶性蛋白质含量较低外，其他纳米氧化铁和Fe3+处理组的可溶性蛋白质含量都和对照组、Fe(II)-EDTA无明显差异（图3-1D）。植物可以通过产生可溶性蛋白质作为渗透调节物质[111]，抗氧化物或清除剂（用于清除植物体内的自由基）[69]，从而使其自身适应不同的生物或非生物应激。不同的非生物应激会导致植物体内产生过量的具有高活性并且有毒的活性氧，最终导致氧化应激和蛋白质损伤[112]。在本章实验中，基于丙二醛含量和抗氧化酶活性结果（图3-2），可以发现20mg/L的纳米氧化铁并没有在植物体内诱导产生氧化应激，说明此处理的低可溶性蛋白质含量可能是另一机制引起的，而不是活性氧的过量产生造成的蛋白质受损。与此同时，其他处理组差别不大的可溶性蛋白质含量可能是植物自我调节的结果。如图3-1E所示，与对照组和Fe(II)-EDTA相比，所有叶喷的纳米氧化铁和Fe3+处理组的根系活力都没有显著变化。Fe(II)-EDTA是一种最广泛使用的肥料，常用于改善植物铁利用率。但是叶面喷施的Fe(II)-EDTA对植物生长没有表现出明显的促进作用。同时，纳米氧化铁也没有在矫治缺铁黄化上表现出其优越性。38 3.3.2柑橘苗的脂质过氧化作用和抗氧化酶活性图3-2（A）纳米氧化铁激活植物体内抗氧化酶清除过量活性氧（ROS）示意图（B）不同处理下柑橘根和叶的丙二醛含量（C）不同处理下柑橘根和叶的SOD活性（D）不同处理下柑橘根和叶的CAT活性（E）不同处理下柑橘根和叶的POD活性纳米氧化铁在植物细胞内引起氧化应激，以及随后被SOD、CAT、POD清除活性氧的过程如图3-2A所示。通常情况下，纳米粒子进入植物细胞后，引起39 氧化应激，具体表现在：脂质过氧化作用增强，线粒体、叶绿体膜损伤，细胞内产生过多的活性氧（ROS），从而使植物产生氧化胁迫。随后植物通过激活抗氧化酶防御系统来清除多余的活性氧。如图3-2所示，图B-E中大、小写字母不同，表示差异极显著（p<0.05）。图3-2B中，对柑橘叶而言，纳米氧化铁处理组的丙二醛含量和对照组及Fe(II)-EDTA相比都没有增加。20和100mg/L的Fe3+处理组的丙二醛含量分别比对照组高26.0%和49.1%。并且100mg/L的Fe3+处理组的丙二醛含量也比Fe(II)-EDTA高33.2%。此外，所有处理组的柑橘根丙二醛含量都没有明显差异。与对照组及Fe(II)-EDTA相比，所有纳米氧化铁和Fe3+处理组根和叶的SOD活性都没有增加（图3-2C）。在图3-2D中，所有处理下柑橘根的CAT活性都没有显著变化。纳米氧化铁处理的柑橘叶CAT活性在数值上随纳米粒子的浓度增加而增加。从统计分析上看，20和50mg/L的纳米氧化铁的叶CAT活性与对照组和Fe(II)-EDTA无明显差异，而100mg/L纳米氧化铁的CAT活性分别比对照组高35.4%，比Fe(II)-EDTA高21.1%。Fe3+处理的叶CAT活性与对照组无明显差异，但是100mg/L的Fe3+处理组的CAT活性比Fe(II)-EDTA低31.0%。在图3-2E中，纳米氧化铁和Fe3+处理的柑橘根POD活性未受影响，与对照组和Fe(II)-EDTA相比都没有显著差异。与对照组相比，20和50mg/L的纳米氧化铁以及20mg/L的Fe3+处理的柑橘叶POD活性未受影响，而100mg/L的纳米氧化铁、50和100mg/L的Fe3+处理组的POD活性则显著增强。此外，所有纳米氧化铁和Fe3+处理组的POD活性和Fe(II)-EDTA相比，都没有增加。可以看到，纳米氧化铁处理组在叶中的丙二醛含量没有上升，说明叶面喷施的纳米氧化铁没有引起脂质过氧化作用，或者是植物的解毒路径足以处理并修复引起的氧化应激[68]。20和50mg/L的纳米氧化铁处理组的抗氧化酶活性不受影响，而100mg/L的纳米氧化铁显著增加CAT和POD活性。CAT和POD活性高有助于过量H[71]。考虑到丙二醛和抗氧化酶的检测结果，显2O2的解毒作用然，20和50mg/L的纳米氧化铁在植物叶中没有引起氧化应激，而100mg/L的纳米氧化铁可能开始导致活性氧形成但是随后植物的防御系统修复了引起的应激。另一方面，20和100mg/L的Fe3+处理组的叶丙二醛含量较高，而50mg/L的Fe3+的丙二醛含量与对照组没有差异。但是并没有观察到20mg/L的Fe3+处理组的三种抗氧化酶活性的增加，说明此处理下丙二醛含量的增加是个异常的结果。结合柑橘叶中50和100mg/L的Fe3+处理组的丙二醛含量及较高的POD活性来看，可以推断出50mg/L的Fe3+处理的柑橘可以修复引起的氧化应激，而40 100mg/L的Fe3+处理的柑橘不能处理并修复高浓度的Fe3+引起的应激。所有处理组的柑橘根中丙二醛含量和抗氧化酶活性均无显著差异，说明植物根中并没有发生氧化应激。3.3.3柑橘苗体内铁分布及铁相关基因表达图3-3（A）植物叶铁吸收和转运过程示意图（B）不同处理下柑橘根和叶铁含量（C）柑橘根中FRO2基因的表达（D）柑橘根中Nramp3基因的表达柑橘叶中铁吸收和转运过程示意图见图3-3A。首先由三价铁还原酶将Fe[III]还原为Fe[II]，随后由细胞膜上的转运蛋白将Fe2+转运到细胞内。Nramp3蛋白位于液泡膜上，可以转运Fe2+。缺铁时Nramp3基因表达上调从而将Fe2+转运到细胞质供植物利用。如图3-3B所示，图中大、小写字母不同，表示差异极显著（p<0.05）。在柑橘叶中，纳米氧化铁和Fe3+处理组的铁含量随浓度增加而急骤增加。20、50和100mg/L的纳米氧化铁处理组的叶铁含量分别比对照组高1.34、3.78和6.77倍，Fe3+处理组的叶铁含量分别增加2.33,4.38,8.62倍。可以看到，不同浓度的纳米氧化铁处理的柑橘叶中铁含量表现出剂量依赖关系。纳41 米氧化铁处理的叶中较高的铁含量说明铁被吸收。有研究表明纳米氧化铁在水培系统中可以通过根进入植物[62,113]，但是目前很少有人研究叶面应用的纳米氧化铁能否进入植物叶并转运到根。这里观察到铁被柑橘叶吸收，但是所有处理组根的铁含量与对照组相比都没有明显差异，说明在柑橘幼苗中没有发生铁的向下转运。在根施实验中，发现纳米氧化铁也没有从根向上转运。说明单独叶喷或根施纳米氧化铁不能满足整株植物的需求。将这两种施肥方法结合可以在农业和园艺生产中增强铁肥的效力。通常情况下，植物缺铁时，会发生新叶萎黄，幼嫩的侧根表现出典型的缺铁应激反应机制：增强Fe[III]还原能力，根尖肿胀，并酸化根际[114]。之前的研究也表明叶片的叶肉细胞也表现出质膜三价铁还原酶活性[114,115]。当植物缺铁时，FRO2基因编码的三价铁还原酶被强烈激活。图3-3C和D中小写字母不同，表示差异极显著（p<0.05）。如图3-3C所示，对照组FRO2基因的表达处于较高水平。纳米氧化铁和Fe3+处理组柑橘根的FRO2基因表达量比对照组低29.4-91.4%。尤其是50mg/L的Fe3+，该处理组的FRO2基因表达水平较低，且低于其他处理组。说明柑橘可以利用叶喷的纳米氧化铁和Fe3+提供的铁。同时，Fe(II)-EDTA处理的FRO2基因表达水平也比对照组低，但是高于纳米氧化铁和Fe3+处理组。如图3-3D所示，20-100mg/L的纳米氧化铁处理组的Nramp3基因相对表达量比对照组低62.5-81.7%。所有纳米氧化铁处理组的低Nramp3基因表达也说明植物处于铁充足状态。但是100mg/L的Fe3+处理组比对照组Nramp3基因表达量高1.58倍。此外，Fe(II)-EDTA的Nramp3基因表达量相当高，远高于其他处理组。100mg/L的Fe3+和Fe(II)-EDTA处理组的Nramp3基因表达比对照组高说明Fe(II)-EDTA和高浓度的Fe3+不能通过叶喷减轻植物缺铁症状。据报道，螯合铁肥在土壤中应用比叶面喷施更为有效，并且认为叶面螯合铁肥不能有效控制植物缺铁[116]。已有研究表明，纳米氧化铁是一种合适的吸附剂，可以有效地提取环境中的污染物[117]。鉴于此，纳米氧化铁的强吸附性有助于它们牢固地吸附在叶表面，从而进一步被植物吸收。在农业生产中，大多数化肥由于被光解、淋洗、水解、分解作用，很容易流失[118]，发展以纳米材料为基础的肥料很有必要，可以减少肥料的养分流失并提高作物产量。就这一点而言，纳米氧化铁有可能作为一种有效的纳米肥料，并减少施肥过程中及施肥后的养分流失。42 3.3.4柑橘叶蜡质含量及蜡质相关基因表达铁含量分析结果表明，纳米氧化铁可以紧紧地吸附在叶表面，被柑橘叶吸收（图3-3B）。角质层蜡质是叶表皮的保护屏障，可以吸附并拦截进入的纳米粒子。一旦纳米粒子穿过角质层，就可以扩散进叶组织。纳米氧化铁与叶表皮蜡质相互作用及蜡质合成和分泌过程的示意图如图3-4A所示。纳米粒子首先与位于叶片表层、细胞壁外的蜡质相互作用，被阻截在角质层蜡质中，随后在穿过角质层后，进入到叶组织中。柑橘叶细胞内WIN1基因参与蜡质合成的，ABCG12基因调控细胞膜上ABCG12转运蛋白，将蜡质运输到细胞壁外。图3-4（A）纳米粒子与角质层蜡质相互作用及蜡质合成和分泌过程示意图（B）不同处理下柑橘叶的蜡质含量（C）柑橘叶中WIN1基因的表达（D）柑橘叶中ABCG12基因的表达如图3-4所示，图B-D中小写字母不同，表示差异极显著（p<0.05）。和对照组相比，20和50mg/L的纳米氧化铁对蜡质含量没有影响，而100mg/L的纳米氧化铁处理组的蜡质含量增加了2.1倍（图3-4B）。20、50和100mg/L的Fe3+处理组的蜡质含量分别比对照组高1.17、1.04和1.57倍。蜡质含量的增加可以阻碍植物对高浓度的纳米粒子和离子铁（Fe3+）的吸收。Zhou等[119]报道蜡质含量和植物的应激抗性密切相关。根据脂质过氧化作用和抗氧化酶（图3-2）的结果，Fe3+在植物叶中引起了氧化应激。因此，Fe3+处理的柑橘叶的高蜡质含量可能是抗应激的结果。Birbaum等[81]报道大的团聚体会被拦截在表面蜡质，而小43 的粒子可以被叶片吸收。100mg/L的纳米氧化铁在叶中很高的铁含量说明大部分纳米粒子由于团聚成簇被拦截在表皮蜡质。Fe(II)-EDTA的蜡质含量处于很高水平，比其他所有处理组都高。所有纳米氧化铁和Fe3+处理组的WIN1基因相对表达量都比对照组低，但是不低于Fe(II)-EDTA（图3-4C）。在图3-4D中，纳米氧化铁和Fe3+处理组的ABCG12基因的表达比对照组低或无显著影响。但是Fe(II)-EDTA处理组的ABCG12基因表达量比其他处理组都高。可以看到，尽管Fe(II)-EDTA处理组的蜡质含量也很高，但是Fe(II)-EDTA处理组的WIN1基因表达量很低，而ABCG12基因表达量很高。Fernández等[116]报道称喷施的铁螯合物可以通过角质层被吸收。Fe(II)-EDTA的高蜡质含量可能是一种防御外来物质的机制。除WIN1基因外，有很多基因参与表面蜡质的合成与分泌。如CUT1是拟南芥角质层蜡质合成所需的基因，它编码蜡质合成前体——极长链脂肪酸缩合酶[104]。可以说，蜡质的生物合成是一个协同和复杂的过程。这可以解释为什么100mg/L的纳米氧化铁和20-100mg/L的Fe3+处理组的蜡质含量高，但是WIN1和ABCG12的表达量都较低，以及为什么Fe(II)-EDTA的WIN1基因表达量低但是蜡质含量高。Jetter等[120]认为角质层蜡质通常是一个由几十种具有不同的碳氢链或环结构的化合物形成的复杂的混合物。每个蜡质化合物对角质层蜡质的整个生物功能的影响还有很多未知之处。因此，需要进一步探索弄清纳米粒子和角质层蜡质相互作用的潜在过程和机制。3.4小结本章实验通过研究叶面喷施下，不同浓度的纳米氧化铁和Fe3+对柑橘幼苗生长生理的影响，从而探讨叶面喷施纳米氧化铁对柑橘缺铁黄化的矫治效果，同时研究了纳米氧化铁与叶片角质层的相互作用，小结如下：（1）叶喷的纳米氧化铁和Fe3+对柑橘幼苗生长几乎没有影响，如叶绿素含量、鲜重、根系活力等都与对照组无显著差异。说明直接叶喷纳米氧化铁可能并不能直接改善植物缺铁黄化症状，但是由于纳米氧化铁的强吸附性，将纳米氧化铁与传统铁肥共用施肥，有可能达到补铁的效果，同时减少肥料的流失。（2）铁含量分析结果表明，所有含铁的处理组，都没有发生铁从叶向根的转运。柑橘叶中铁吸收及转运相关基因的表达结果说明纳米氧化铁处理的植物处于铁充足状态。（3）所有纳米氧化铁处理组的脂质过氧化作用和对照组相比没有显著变44 化。结合抗氧化酶结果来看，20和50mg/L的纳米氧化铁没有诱导氧化应激，而100mg/L的纳米氧化铁可能一开始引起了氧化应激，但是之后被植物自身的防御系统处理并修复了。（4）100mg/L的纳米氧化铁的蜡质含量高于对照组会阻碍高浓度纳米粒子的吸收。而WIN1和ABCG12基因表达结果说明蜡质的生物合成是一个协同、复杂的过程，并且此过程涉及到一个以上的基因。结果表明植物表皮细胞外的角质层确实对外来物质起到了一定的拦截作用，但是由于目前柑橘基因组测序不完全，今后还需筛选更多与柑橘叶片角质层蜡质合成与运输有关的基因，进一步弄清纳米氧化铁与柑橘叶角质层相互作用的机制。45 第4章结论本文通过根施和叶喷两种不同施加方式研究不同浓度的纳米氧化铁和Fe3+对柑橘幼苗的生长生理影响，从分子水平研究铁的吸收转运情况以及纳米氧化铁和角质层蜡质相互作用的情况，从而探究了纳米氧化铁作为补铁剂代替植物生长过程中施加的传统铁肥的可行性。通过这两个实验，我们发现：（1）不同施加方式下，柑橘对纳米氧化铁和Fe3+的吸收利用具有较大差异。通过对相关生理生长指标的检测，发现根施的纳米氧化铁和Fe3+对植物生长的影响与处理浓度有关。并且适宜浓度的纳米氧化铁通过根处理植物，可以改善柑橘幼苗缺铁黄化症状。而叶面喷施的纳米氧化铁和Fe3+对柑橘幼苗生长都没有明显影响，不过纳米氧化铁由于其强吸附性可以减少施肥过程中及施肥后的营养流失。（2）通过对铁元素的定量分析，发现根施的纳米氧化铁没有发生向上转运，而叶喷的纳米氧化铁也没有发生向下转运。因此，在农业生产中，结合两种施加方式，将叶面施肥作为根部施肥的补充方式，可以提高铁肥的有效利用率。（3）在根施和叶喷条件下，铁吸收转运相关基因的表达结果都说明植物处于铁充足状态。并且柑橘根TEM图表明根施的纳米氧化铁主要积累在根细胞的液泡中。分子水平研究表明机理I植物吸收纳米氧化铁会引起AHA、FRO2和Nramp3基因表达水平的变化，说明植物对含铁化合物的吸收机制大体相同。（4）纳米氧化铁在柑橘叶角质层上的传输结果表明，高浓度的纳米氧化铁由于团聚成簇，会被角质层蜡质拦截。WIN1和ABCG12基因的表达水平以及蜡质含量之间不能互相对应，说明蜡质的生物合成是一个协同的、复杂的、多基因参与的过程。这需要更进一步地研究，通过在柑橘植物中筛选出更多的与角质层蜡质合成分泌有关的基因，从分子水平上弄清纳米氧化铁和植物叶角质层蜡质的之间的相互作用。综上所述，本研究阐明了根部施肥和叶面喷施两种施加方式下，纳米氧化铁矫治柑橘缺铁的不同效果。显然，纳米氧化铁由于其强的吸附性和穿透性可以进入植物。结果表明，根施处理下，适宜浓度的纳米氧化铁可以改善柑橘的缺铁黄化作用。但是在实验浓度下的叶喷处理中，纳米氧化铁并未显示出其对柑橘幼苗生长的促进作用。并且低浓度的纳米粒子也没有对植物表现出毒害作46 用以及氧化应激。因此，在农业生产中，可以将低浓度的纳米氧化铁与传统的二价铁肥共同作用于植物，结合根施和叶喷两种施加方式，由于纳米氧化铁的强吸附性，可以减少铁肥的流失，有可能达到很好的补铁效果。但是当前实验尚有部分机制未弄清楚，如纳米氧化铁促进叶绿素合成的机制，纳米氧化铁在柑橘叶角质层上传输时其他相关基因的表达水平等，这需要今后从分子和细胞水平上进一步开展实验进行研究。47 致谢本论文的完成，首先要感谢我的导师李俊丽老师。感谢您对我的指导与培养，关怀和鼓励。您既是我的导师，也是我的好朋友，不论遇到任何问题，您都会耐心细致的为我解答。感谢您对我无私的帮助！感谢本实验室的师弟师妹们，你们对我的学习和科研给予了很大的帮助和支持，在此表示深深的谢意。最后，我要感谢我的父母和男朋友叶光洲，没有你们的关心和支持，我无法走到今天。感谢所有帮助过我的老师、同学、朋友们，祝你们快乐、幸福！48 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