《牛源致病性大肠杆菌K99对小鼠肠绒毛生长及ITF和TGF-β1+mRNA表达的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
分类号S852.3学校代码10129UDC591.2学号2015202160002牛源致病性大肠杆菌K99对小鼠肠绒毛生长及ITF和TGF-β1mRNA表达的影响EffectofPathogenicE.coliK99fromBovineonGrowthofIntestinalMucosaandExpressionofITFandTGF-β1mRNAinMice申请人：张丽霞学生类别：学术型硕士学科门类：农学学科专业：基础兽医学研究方向：动物病理学指导教师：王凤龙教授论文提交日期：二〇一八年六月 内蒙古农业大学研究生学位论文独创声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究用成果，也不包括为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使一贡献均已在过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何论文中作了明确的说明并表示谢意。一申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担切相关责任。：日论文作者签名麵更期：士綱Ｗ内蒙古农业大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解内蒙古农业大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属内蒙古农业大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为内蒙，古农业大学，且导师为通讯作者通讯作者单位亦署名为内蒙古农业大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电。学校子文档，允许论文被查阅和借阅可以公布学位论文的全部或部、分内容（保密内容除外），釆用影印缩印或其他手段保存论文。ｒ论文作者签名：液由餐、指导教师签名：日Ｉ期：別中科剛 摘要大肠杆菌（Escherichiacoli，E.coli）为动物正常肠道菌群的组成部分，一般无致病性，但肠致病性大肠杆菌（EnteropathogenicEscherichiacoli，EPEC）及产肠毒素大肠杆菌（EnterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC）是引起初生犊牛腹泻和败血症的主要病原菌，也是造成规模化奶牛场内犊牛死亡的主要病原菌之一，其中以K99菌毛致病菌株致病率最高。大肠杆菌病是现如今一种多的，普遍的动物很常见的一种病，由致病性大肠杆菌引起的肠道或肠道外感染疾病，影响也较大，而且是人畜共患病。目前，对致病性大肠杆菌的研究在病原、诊断、治疗方面的研究较多，而对致病机理的相关研究较少，比如：肠黏膜损伤，肠上皮细胞修复和再生及相关细胞因子方面的研究较少。为了解决这个问题，本课题通过牛源致病性E.coliK99感染，建立小鼠肠道损伤模型。将初步揭示牛源致病性E.coliK99对小鼠肠绒毛生长和ITF及TGF-β1mRNA表达的影响，以探讨牛源致病性E.coliK99感染与肠黏膜上皮细胞损伤和再生的相互关系。本实验采用108cfu/mlE.coliK99菌液作用于6～8周龄Balb/c小鼠，随机分成空白对照组，细胞标记物Brdu组（Brdu）和Ecoli感染组（Brdu+Ecoli）三组，并于不同时间点（6h、12h、24h、30h、36h、48h、60h）采集小鼠十二指肠、空肠和回肠组织。应用HE染色观察病理组织学变化并测量肠绒毛长度和隐窝深度；应用免疫组化染色检测肠黏膜上皮细胞中细胞标记物Brdu阳性信号的迁移距离；应用PAS染色统计杯状细胞数；应用qRT-PCR法检测肠黏膜组织中ITF和TGF-β1mRNA表达水平。结果表明：(1)空白对照组小鼠肠组织结构无明显变化，Brdu组小鼠6h～60h肠组织结构正常，肠绒毛排列整齐，肠隐窝轮廓清晰；E.coli感染小鼠肠组织6h～36h后，十二指肠、空肠绒毛萎缩或崩解成碎片脱落，隐窝变长；其他时间未见明显变化。回肠的各项指标没有显著差异。(2)测量肠绒毛隐窝和上皮细胞中Brdu阳性信号的迁移距离：空白对照组只做阴性对照，未出现阳性细胞；E.coli感染组于6h～36h在十二指肠、空肠、回肠绒毛中Brdu阳性信号在上皮细胞中的移动距离极显著高于Brdu组（p<0.01）；其他时间无显著差异（p>0.05）。(3)PAS染色结果显示：E.coli感染小鼠后6h～60h，十二指肠、空肠、 回肠中的杯状细胞数均显著低于空白对照组和Brdu组（p<0.01），且12h～36h持续降低，48h～60h逐渐升高。(4)荧光定量PCR（qRT-PCR）结果显示：E.coli感染小鼠后6h～36h，小肠组织中ITFmRNA的表达极显著低于空白对照组和Brdu组（p<0.01），其他时间无显著差异（p>0.05）。E.coli感染小鼠后30h，小肠组织中TGF-β1mRNA的表达极显著高于空白对照组和Brdu组（p<0.01），其他时间无显著差异（p>0.05）。牛源致病性E.coli感染小鼠后，既可以引起小肠黏膜上皮细胞的损伤和抑制ITFmRNA的表达，也能够促进小肠绒毛上皮细胞的生长和TGF-β1mRNA的表达。关键词：小鼠；致病性大肠杆菌；肠三叶因子；转化生长因子-β1 EffectofPathogenicE.coliK99fromBovineonGrowthofIntestinalMucosaandExpressionofITFandTGF-β1mRNAinMiceAbstractEscherichiacoli(E.coli)isanintegralpartofthenormalintestinalfloraofanimalsandisgenerallynon-pathogenic，butenteropathogenicescherichiacoli(EPEC)andenterotoxigenicescherichiacoli(ETEC)isthemainpathogencausingprimarycowdiarrheaandsepsis，anditisalsooneofthemajordiseasescausingthedeathofcalvesinlarge-scaledairyfarms.Amongthem，thepathogenicityofstrainsofK99fimbriaeisthehighest.E.colidiseaseisadiseasethatiscommoninmanyandcommonanimalstoday.ItisalsocausedbypathogenicE.coli.Ithasagreaterimpactonintestinalorextraintestinalinfectionsandisazoonoticdisease.Atpresent,therearemanyresearchesonpathogenicE.coliinpathogens,diagnosis,andtreatment.Therearefewrelatedstudiesonpathogenicmechanisms,suchasintestinalmucosalinjury,pathogenicE.coliinfectionandinjury,Therearefewstudiesontherepairandregenerationofintestinalepithelialcells.Inordertosolvethisproblem,thisstudyestablishedamousemodelofintestinalinjurybyinfectingwithpathogenicE.coliK99.TheeffectofbovinepathogenicE.coliK99ongrowthofintestinalvilliandexpressionofITFandTGF-β1mRNAinmicewasinitiallyrevealedtoinvestigatethepathogenicE.coliK99infectionandintestinalmucosalepithelialcellinjuryandregenerationinbovineorigin.Relationships.Intestinetissueincludingduodenum，jejunum，ileuminmicewhichweredividedintocontrolgroup，Brdugroup(Brdu)andE.coli-infectiongroup(E.coli+Brdu)wascollectedat6h，12h，24h，30h，36h，48h，60hposttreatment.Histopathologicalchanges，thelengthofintestinalvilliandcrypts，thelocationofBrdupositivecellsandthepopulationofgobletcellsweremeasuredbyhistopathologicalobservation，immunohistochemicalstaining，PASstainingandqRT-PCR，respectively.Theresultsshowedthat:(1)AtrophiedvillusandcellsfragmentswereobservedinE.coligroupintestinetissueaftertreatmentfor6h～36h，whiletherewasnochangesbetweencontrolandBrdugroup.Therewerenochangesinilealindicators. (2)MeasuremigrationdistanceofBrdupositivesignalinintestinalvilluscryptsandepithelialcells:controlgrouponlyhadnegativecontrol，nopositivecellsappeared;significantlyhighermigrationlengththancontrolandBrdugroupduring6h～36hafterE.coliinfection(p<0.01).therewasnosignificantdifferenceinothertime(p>0.05).(3)TheresultsofPASstainingshowedthatthepopulationofgobletcellsdecreaseddramaticallyafterE.coliinfectionfrom6h～60h，andcontinuedtodecreasefrom12h～36h，andgraduallyincreasedfrom48h～60h.(4)TheqRT-PCRresultsshowedthemRNAexpressionofITFinE.coligroupwassignificantlylowerthancontrolandBrdugroupfrom6h～36h(p<0.01).Therewasnosignificantdifferenceatothertimes(p>0.05).TheexpressionofTGF-β1mRNAinintestinaltissuewassignificantlyhigherinE.coliinfectedmicethaninblankcontrolgroupandBrdugroup(p<0.01)30hafterinfection.Therewasnosignificantdifferenceinothertime(p>0.05).ItisdemonstratedthatintestinalmucosalepithelialcellsinjuryandthegrowthofintestinalvillusepithelialcellsandtheexpressionofTGF-β1mRNA.wereinducedbypathogenicE.coli，whichinhibitedtheexpressionofITFmRNA.Keywords:Mice;PathogenicE.coli;IntestinalTrifoliationFactor;Transforminggrowthfactor-β1Directedby:Prof.WANGFenglongAppliantforMasterdegrree:ZHANGLixia（masterofBasicVet.sci）（collegeofVterinaryMedicine，InnerMongoliaAgriculturalUniversity，Hohhot010018，China） 目录1引言................................................................................................................................11.1大肠杆菌与肠道致病性的关系....................................................................11.1.1大肠杆菌的生物学特征.........................................................................11.1.2大肠杆菌的抗原结构和血清型...........................................................11.1.3大肠杆菌的致病性..................................................................................11.1.4大肠杆菌与疾病......................................................................................21.2小肠的结构与功能...........................................................................................31.2.1小肠的结构................................................................................................31.2.2小肠的功能................................................................................................41.2.3小肠黏膜的更新......................................................................................51.3致病性大肠杆菌与肠组织杯状细胞的相互关系....................................51.3.1肠组织杯状细胞的概述.........................................................................51.3.2肠组织杯状细胞的形态及分布...........................................................51.3.3肠组织杯状细胞的发育与来源...........................................................61.3.4肠组织杯状细胞的结构与功能...........................................................71.3.5肠组织杯状细胞与肠道疾病................................................................81.4肠三叶因子.........................................................................................................91.4.1ITF的研究进展........................................................................................91.4.2ITF的结构.................................................................................................91.4.3ITF的生物学特性.................................................................................101.4.4ITF与疾病..............................................................................................111.4.5ITF在临床上的研究............................................................................111.5转化生长因子-β...........................................................................................121.5.1TGF-β的研究进展.............................................................................121.5.2TGF-β亚型.............................................................................................121.5.3TGF-β在肠道上皮的分布..................................................................131.5.4TGF-β1在肠道损伤中的作用..........................................................131.5.5TGF-β与疾病.........................................................................................141.6实验研究的目的和意义................................................................................142实验研究....................................................................................................................162.1材料....................................................................................................................162.1.1实验菌株及实验动物.........................................................................16 2.1.2主要试剂与药品..................................................................................162.1.3主要仪器设备......................................................................................162.2方法....................................................................................................................172.2.1E.coli感染小鼠实验..........................................................................172.2.2小鼠肠道的病理组织观察..................................................................172.2.3免疫组化法检测肠绒毛上皮细胞中Brdu阳性信号的迁移距离....................................................................................................................................182.2.4PAS染色法统计杯状细胞数...............................................................192.2.5实时荧光定量PCR法检测E.coli对肠道组织中ITF和TGFβ1mRNA的相对表达量的影响..........................................................................................192.3数据统计与分析.............................................................................................223结果.............................................................................................................................223.1致病性大肠杆菌K99复苏与平板计数....................................................223.2小鼠临床症状观察.........................................................................................223.3病理组织学变化.............................................................................................233.3.1HE染色结果..........................................................................................233.3.2免疫组化结果.........................................................................................353.3.3PAS染色结果..........................................................................................443.3.4ITF、TGFβ1mRNA的表达检测........................................................524讨论.............................................................................................................................564.1动物模型的建立.............................................................................................564.2牛源致病性大肠杆菌K99对小鼠肠道组织形态学及病理变化的影响.........................................................................................................................................564.3E.coli感染小鼠后对肠组织中Brdu阳性细胞迁移距离的影响...574.4E.coli感染小鼠后对肠组织杯状细胞数的影响.................................584.5E.coli感染小鼠后对肠组织ITFmRNA表达的影响..........................594.6E.coli感染小鼠后对肠组织TGF-β1mRNA表达的影响.................605全文结论....................................................................................................................62致谢....................................................................................................................................63参考文献...........................................................................................................................64作者简介...........................................................................................................................76 插图和附表清单1.图1-1小肠的结构........................................................................................................................42.图1-2十二指肠、空肠、回肠的结构形状.........................................................................53.图1-3杯状细胞依染色方法不同而显示不同颜色...........................................................64.图1-4杯状细胞功能示意图.....................................................................................................85.图1-5ITF二聚体结构..............................................................................................................106.图3-1致病性大肠杆菌K99扩增后的计数结果............................................................217.图3-2E.coli组小鼠临床症状................................................................................................228.图3-3-A6h十二指肠的病理变化(HE，×200).................................................................239.图3-3-B12h十二指肠的病理变化(HE，×200)...............................................................2310.图3-3-C24h十二指肠的病理变化(HE，×200)...............................................................2411.图3-3-D30h十二指肠的病理变化(HE，×200)...............................................................2412.图3-3-E36h十二指肠的病理变化(HE，×200)...............................................................2513.图3-3-F48h十二指肠的病理变化(HE，×200)................................................................2514.图3-3-G60h十二指肠的病理变化(HE，×200)...............................................................2615.图3-4-A6h空肠的病理变化(HE，×200)...........................................................................2616.图3-4-B12h空肠的病理变化(HE，×200).........................................................................2717.图3-4-C24h空肠的病理变化(HE，×200).........................................................................2718.图3-4-D30h空肠的病理变化(HE，×200)........................................................................2819.图3-4-E36h空肠的病理变化(HE，×200).........................................................................2820.图3-4-F48h空肠的病理变化(HE，×200).........................................................................2921.图3-4-G60h空肠的病理变化(HE，×200)........................................................................2922.图3-5-A6h回肠的病理变化(HE，×200)...........................................................................3023.图3-5-B12h回肠的病理变化(HE，×200).........................................................................3024.图3-5-C24h回肠的病理变化(HE，×200).........................................................................3025.图3-5-D30h回肠的病理变化(HE，×200)........................................................................3126.图3-5-E36h回肠的病理变化(HE，×200).........................................................................3127.图3-5-F48h回肠的病理变化(HE，×200).........................................................................3128.图3-5-G60h回肠的病理变化(HE，×200)........................................................................3229.图3-6不同时间点E.coli对小鼠十二指肠、空肠、回肠绒毛长度和隐窝深度变化的影响........................................................................................................................................3330.图3-7-A6h十二指肠上皮细胞的增殖变化(IHC，×400).............................................3431.图3-7-B12h十二指肠上皮细胞的增殖变化(IHC，×400).........................................34 32.图3-7-C24h十二指肠上皮细胞的增殖变化(IHC，×400).........................................3533.图3-7-D30h十二指肠上皮细胞的增殖变化(IHC，×400).........................................3534.图3-7-E36h十二指肠上皮细胞的增殖变化(IHC，×400).........................................3535.图3-7-F48h十二指肠上皮细胞的增殖变化(IHC，×400)..........................................3636.图3-7-G60h十二指肠上皮细胞的增殖变化(IHC，×400).........................................3637.图3-8-A6h空肠上皮细胞的增殖变化(IHC，×400).....................................................3738.图3-8-B12h空肠上皮细胞的增殖变化(IHC，×400)...................................................3739.图3-8-C24h空肠上皮细胞的增殖变化(IHC，×400)...................................................3840.图3-8-D30h空肠上皮细胞的增殖变化(IHC，×400)..................................................3841.图3-8-E36h空肠上皮细胞的增殖变化(IHC，×400)...................................................3842.图3-8-F48h空肠上皮细胞的增殖变化(IHC，×400)...................................................3943.图3-8-G60h空肠上皮细胞的增殖变化(IHC，×400)..................................................3944.图3-9-A6h回肠上皮细胞的增殖变化(IHC，×400).....................................................4045.图3-9-B12h回肠上皮细胞的增殖变化(IHC，×400)...................................................4046.图3-9-C24h回肠上皮细胞的增殖变化(IHC，×400)...................................................4147.图3-9-D30h回肠上皮细胞的增殖变化(IHC，×400)..................................................4148.图3-9-E36h回肠上皮细胞的增殖变化(IHC，×400)...................................................4149.图3-9-F48h回肠上皮细胞的增殖变化(IHC，×400)...................................................4250.图3-9-G60h回肠上皮细胞的增殖变化(IHC，×400)..................................................4251.图3-10在不同作用时间点Brdu阳性上皮细胞的迁移距离......................................4352.图3-11-A6h十二指肠绒毛杯状细胞数变化(PAS，×200)..........................................4353.图3-11-B12h十二指肠绒毛杯状细胞数变化(PAS，×200)........................................4454.图3-11-C24h十二指肠绒毛杯状细胞数变化(PAS，×200)........................................4455.图3-11-D30h十二指肠绒毛杯状细胞数变化(PAS，×200).......................................4456.图3-11-E36h十二指肠绒毛杯状细胞数变化(PAS，×200)........................................4557.图3-11-F48h十二指肠绒毛杯状细胞数变化(PAS，×200)........................................4558.图3-11-G60h十二指肠绒毛杯状细胞数变化(PAS，×200).......................................4559.图3-12-A6h空肠绒毛杯状细胞数变化(PAS，×200)...................................................4660.图3-12-B12h空肠绒毛杯状细胞数变化(PAS，×200).................................................4661.图3-12-C24h空肠绒毛杯状细胞数变化(PAS，×200).................................................4662.图3-12-D30h空肠绒毛杯状细胞数变化(PAS，×200).................................................4763.图3-12-E36h空肠绒毛杯状细胞数变化(PAS，×200).................................................4764.图3-12-F48h空肠绒毛杯状细胞数变化(PAS，×200)..................................................4765.图3-12-G60h空肠绒毛杯状细胞数变化(PAS，×200).................................................48 66.图3-13-A6h回肠绒毛杯状细胞数变化(PAS，×200)...................................................4867.图3-13-B12h回肠绒毛杯状细胞数变化(PAS，×200).................................................4868.图3-13-C24h回肠绒毛杯状细胞数变化(PAS，×200).................................................4869.图3-13-D30h回肠绒毛杯状细胞数变化(PAS，×200).................................................4970.图3-13-E36h回肠绒毛杯状细胞数变化(PAS，×200).................................................4971.图3-13-F48h回肠绒毛杯状细胞数变化(PAS，×200)..................................................4972.图3-13-G60h回肠绒毛杯状细胞数变化(PAS，×200).................................................4973.图3-14不同时间点E.coli对小鼠十二指肠、空肠、回肠杯状细胞数量的影响4974.图3-15β-action、ITF、TGFβ1RT-PCR扩增曲线和溶解曲线.................................5075.图3-16β-actin和ITF的RT-PCR扩增产物电泳结果..................................................5176.图3-17β-actin和TGF-β1的RT-PCR扩增产物电泳结果.........................................5277.图3-18在不同作用时间点E.coli对小鼠十二指肠、空肠、回肠ITFmRNA相对表达量的影响..............................................................................................................................5378.图3-19在不同作用时间点E.coli对小鼠十二指肠、空肠、回肠TGF-β1mRNA相对表达量的影响.....................................................................................................................5479.表2-1反转录反应体系(唯赞).............................................................................................1980.表2-2反转录反应程序(唯赞).............................................................................................1981.表2-3引物序列及产物长度................................................................................................2082.表2-4qPCR反应体系.............................................................................................................2083.表2-5qPCR反应程序.............................................................................................................20 缩略语表AGE(Agsrosegelelectrophoresis)琼脂糖凝胶电泳Brdu(5-bromo-2-deoxyuridine)细胞增殖标记物cDNA（complementaryDNA）互补DNADNA（DeoxyribonucleicAcid）脱氧核糖核酸ddH20（doubledistilledH20）双蒸水HE（Hematoxylin-Eosin）苏木精伊红h（hour）小时ITF(IntestinalTrefoilFactor)肠三叶因子Min（Minute）分钟mRNA（messengerRNA）信使核糖核酸mL（milliliter）毫升LPS（lipopolysaccharide）脂多糖OD（OpticalDensity）光密度PCR（PolymeraseChainReaction）聚合酶链式反应PAGE（PolyacrylamideGelElectrophoresis）聚丙烯酰胺凝胶电泳PAS（PeriodicAcid-shiff'sReaction）磷酸盐缓冲液PBS（PhosphateBufferedSaline）高碘酸希夫试剂RT-qPCR（Real-Timefluorescencequantitative实时荧光定量聚合酶链式反PCR）应RNA（RibonucleicAcid）核糖核酸RNase(Ribonuclease)核糖核酸酶r/min（rotationperminute）每分钟转速SD(StandardDeviation)标准差TGF-β1（TransformGrowthFactorBeta1）转化生长因子-β1µL（microliter）微升 内蒙古农业大学硕士学位论文11引言1.1大肠杆菌与肠道致病性的关系1.1.1大肠杆菌的生物学特征大肠埃希菌（Escherichiacoli，E.coli）简称大肠杆菌，用革兰氏染色为两端钝圆的阴性短杆菌，兼性厌氧型。大肠杆菌可在18℃～48℃下生长，最适合生长的环境为37℃，需氧或兼性厌氧型菌，许多菌株为运动型，周身有鞭毛，无荚膜和细胞核[1]。大肠杆菌对营养的需求较低，在LB营养琼脂培养基上即可正常生长，在普通营养琼脂平板上，菌落为中心凸起边缘整齐的圆形，表面湿润光滑，颜色为乳白色大菌落，直径为2mm左右，将致病性大肠杆菌K99接种于麦康凯琼脂培养基观察，可见菌落生长一致，菌落呈湿润、光滑、整齐、扁平的圆形，单个菌落的颜色为微红色，将致病性大肠杆菌K99接种于高压过的普通LB肉汤中，37℃过夜振荡培养，肉汤由澄亮变为均匀的浑浊，底部有少量絮状沉淀。1.1.2大肠杆菌的抗原结构和血清型大肠杆菌的抗原结构比较复杂，主要包括菌体(O)抗原、表面(K)抗原、鞭毛(H)抗原、菌毛(F)抗原、外膜蛋白(OuterMembraneProtein，OMP)抗原以及分泌抗原如渗透因子(PermeabilityFactor，PF)等[2]。依据其主要O（菌体抗原）、K（荚膜抗原）、H（鞭毛抗原）抗原的不同，可构成不同的血清型。己确定O抗原有173种血清型，K抗原有103种血清型，H抗原有64种血清型[3]。迄今发现与动物有关的黏附素抗原主要有F4、F5（K88）、F（K99），同时不断有新的相关菌毛抗原被发现。1972年Smith和Linggood[4]首次从犊牛和羔羊腹泻中分离得到K99菌株。在电子显微镜下呈杆状微丝结构，并具有很强的聚集倾向。菌毛平均直径约4.8nm，平均长度130nm。在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE）中呈现分子量为18Ku的蛋白条带。K99黏附素对绵羊和马的红细胞表现抗甘露糖血凝反应。丙氨酸可抑制K99的生物合成。这些血清型毒力因子相互协调，在大肠杆菌侵袭宿主后引起机体免疫力低下，并引发各种疾病。本实验用牛源致病性大肠杆菌K99诱导小鼠的肠道损伤，探讨牛源致病性大肠杆K99对肠道微绒毛脱落的关系。1.1.3大肠杆菌的致病性大肠杆菌属于一种常见的原核生物[5]，其最初被认为是寄居于动物肠道内无致病作用的正常菌群，由Es-cherich[6]在1885年首次从婴儿腹泻物中分离出细菌后才开始认识到其致病性。大肠杆菌是引起人、哺乳类及禽类肠道疾病的主要致病菌之一。致病性大肠杆菌以其致病性划分为以下几类：肠致病性大肠杆菌（Enteropathogenic 2牛源致病性大肠杆菌K99对小鼠肠绒毛生长及ITF和TGF-β1mRNA表达的影响E.coli，EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(EnterotoxigenicE.coli，ETEC)、肠出血性大肠杆菌(EnterohmorrhagicE.coli，EHEC)、肠侵袭性大肠杆菌（EnteroinvasiveE.coli，EIEC)、肠黏附性大肠杆菌(EnteroadhesiveE.coli，EAEC)和弥散黏附性大肠杆菌（DiffuselyaderentE.coli，DAEC)[7-8]。其中肠毒素是ETEC在体内或体外生长时产生并分泌到胞外的一种蛋白质性毒素。肠毒素可通过激活小肠上皮细胞的腺苷酸环化酶（Adenylatecyclase，AC），使小肠上皮细胞内环腺苷酸和环鸟苷酸的浓度升高，破坏机体营养物质和水分的吸收以及排泄的动态平衡，使得肠上皮细胞分泌机能亢进，伴随着水和电解质大量蓄积，同时抑制小肠绒毛上皮细胞的吸收作用，导致机体的排泄速度超过其吸收速度，使得机体发生腹泻和脱水以及代谢性酸中毒。此外，致病性大肠杆菌产生的细胞毒素（内毒素和外毒素）、溶血素、神经毒素等致病物质与肠损伤有一定联系[9]。黏附素（又称菌毛因子、定植附因子，或F抗原）也可黏附于宿主的小肠上皮细胞。1.1.4大肠杆菌与疾病大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的各种肠道或肠道外感染的疾病，是严重危害世界养殖业的三种细菌病之一[10]。直到1995年，人们才开始认识到一些特殊的致病性血清型大肠杆菌对人和动物是有感染性的，能引起人、哺乳类及禽类腹泻和败血症，造成出血性结肠炎（HemorrhagicColitis，HC）、溶血性尿毒症综合症（HemolyticUremicSyndrome，HUS）。EPEC是引起溃疡性结肠炎和结肠息肉的主要因素，也是导致小孩腹泻的主要病原菌，在发展中国家几乎每年导致近上百万儿童的死亡。以EHEC引起的急性肾功能衰竭和溶血性尿毒综合症在世界范围内引起多人死亡[11-14]；ETEC产生的内毒素会导致水样腹泻，尤其是在热带地区比较严重；EHEC所产生的内毒素可以引发肠黏膜损伤，使肠道通透性增加，诱发内毒血症导致出血性结肠炎、血样便或溶血性尿毒症性综合症，并发症可有胆囊炎、肠穿孔、胰腺炎、阑尾炎、肺炎、出血性膀胱炎、肺水肿、心肌损伤和神经症状[15]。EIEC会导致血性痢疾样腹泻、血栓性血小板减少紫癜、粪便带有粘液等。EIEC也是导致犊牛腹泻、奶牛细菌性乳房炎、仔猪黄痢、白痢及水肿病、系统性炎症反应及多器官系统功能不全综合征等许多疾病[16-19]；EAEC可根据聚集性的黏附特征进行识别，其在肠道内寄生会引起急性或持续性腹泻。致病性大肠杆菌是导致人类、哺乳类以及禽类许多疾病的病原菌之一[20]。致病性大肠杆菌产生的LPS（Lipopolysaccharide）可导致肠绒毛间质充血水肿，黏膜细胞坏死脱落，同时破坏黏膜表面紧密连接蛋白的结构，使得肠黏膜通透性增加，造成肠源性细菌和内毒素移位，最终导致全身性炎症反应和多器官功能发生障碍[21-22]。灌胃是目前用到的主要攻毒途径。周秀红[23]等对这种途径进行尝试，发现这是 内蒙古农业大学硕士学位论文3以大肠杆菌进入小鼠体内引发肠道性疾病为前提的攻毒方式。我们进行攻毒试验的目的是为了诱导小鼠的肠道损伤，探讨致病性大肠杆对肠道疾病的损伤问题。1.2小肠的结构与功能1.2.1小肠的结构小肠是消化管中最长的部分，粗细较为均匀，从前到后分为十二指肠、空肠和回肠，各段没有明显的界限。小肠肠壁是由黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜四层构成[24-25]，但每段又各具有其结构特点。（图1-1[26]）。1.2.1.1黏膜层黏膜由上皮和固有层构成，无黏膜肌。在黏膜层的表面覆盖一层厚而多皱襞的类角质膜（keratinoidlayer），又称鸡内金。它是有肌胃腺的分泌物、黏膜上皮的分泌物和脱落的上皮共同在酸性环境下黏合硬化而成，具有保护黏膜的作用，并可抵抗蛋白酶、稀酸和弱碱的作用。小肠黏膜的结构特点是有环形皱襞、肠绒毛、微绒毛和小肠腺（smallintestinalgland）又称为肠隐窝（Intestinalcrypt）。环形皱襞（policaecirulares）是由黏膜和部分黏膜下层向肠腔内隆起而成。反刍兽皱襞内的黏膜下层为致密结缔组织，故为永久性皱襞，其他家畜的皱襞在器官充盈时消失。肠黏膜表面布满由上皮和固有层向肠腔内隆起的指状突起，称肠绒毛（intestinalvillus）。不同动物肠绒毛的长度、形状和密度各不相同。肠绒毛一般长0.35mm～1mm，其中以十二指肠和空肠前段的绒毛最发达。黏膜中柱状细胞的游离端有发达的微绒毛。皱襞、肠绒毛和微绒毛多次扩大了黏膜的表面积。小肠腺是绒毛根部的上皮下陷至固有层内形成的管状腺。其中上皮为单层柱状上皮，有吸收细胞。杯状细胞核少量内分泌细胞组成。①吸收细胞，数量最多，约占小肠上皮细胞的90%。呈高柱状。杯状细胞，分散在柱状细胞之间，分泌黏液，可润滑和保护黏膜上皮。当分泌的黏原颗粒增多时，细胞膨大，将细胞核挤到基部。从十二指肠到回肠，杯状细胞逐渐增多。内分泌细胞，也散在于上皮细胞之间。但在常规的HE染色切片上与其他上皮细胞区别不开。固有层，分布于肠腺之间并构成绒毛的中轴，为网状纤维的疏松结缔组织，其中有血管、淋巴管、神经、巨噬细胞、淋巴细胞[24]。1.2.1.2黏膜下层在黏膜肌层和肌层之间，由胶原纤维和弹性纤维束组成的一层疏松结缔组织。其内有较大的血管、淋巴管与神经。十二指肠的该结缔组织内含有管泡状黏膜下腺。1.2.1.3肌层 4牛源致病性大肠杆菌K99对小鼠肠绒毛生长及ITF和TGF-β1mRNA表达的影响分为内环外纵两层平滑肌。1.2.1.4浆膜由疏松结缔组织和肠系膜疏松结缔组织组成，其间皮由单层扁平细胞组成。[26]图1-1小肠的结构[26]Fig.1-1Intestinalstructure1.2.2小肠的功能小肠是消化管中最长的部分，小肠能将来自胃的食团通过胰液、胆汁和肠分泌物在整个小肠内持续作用的过程称为消化，并吸收营养物质进入血液和淋巴。因此，小肠是消化和吸收的主要场所[27-28]。负责小肠发挥其消化和吸收功能的主要部位是小肠黏膜，小肠黏膜主要由肠绒毛和小肠腺构成。其中十二指肠肠绒毛多为呈指状、空肠肠绒毛多呈叶状、回肠肠绒毛多呈锥状[29-30]。见（图1-2）。小肠的正常结构是营养物质消化与吸收的基础。在小肠绒毛中，绒毛的长度与其肠上皮细胞数量呈显著正相关。绒毛变短时，肠上皮细胞数减少，对营养物质的消化吸收能力将会降低。正常情况下，隐窝基部的细胞不断地分化并向绒毛的端部迁移，形成具有吸收能力的肠上皮细胞，以补充绒毛正常周期脱落的肠上皮。肠绒毛长度增加，消化吸收功能增强，生长发育加快[31]。反之，消化吸收功能减弱，生长发育减缓。图1-2十二指肠、空肠、回肠的结构形状（HE，×200）Fig.1-2Thestructuralshapeofduodenum,jejunumandileum(HE,x200) 内蒙古农业大学硕士学位论文51.2.3小肠黏膜上皮的更新在正常生理状态，肠道黏膜上皮细胞的凋亡和再生处于一个动态平衡，从而保持肠黏膜上皮的完整结构。小肠黏膜上皮细胞的过度凋亡可能造成黏膜上皮屏障受损[32]，而凋亡不足可能导致黏膜上皮细胞的过度增生。肠道黏膜受损时，绒毛、隐窝等发生不同程度的改变。在研究小肠黏膜的损伤病变过程中，常将绒毛高度、隐窝深度作为衡量肠道黏膜形态结构完整性的重要指标[33]。肠上皮细胞增殖受抑是肠黏膜屏障完整性破坏的原因之一，由于肠上皮细胞具有强的再生能力，因此肠道具有较强的自我修复能力[34]。正常细胞的增殖是以DNA合成为起点，故DNA的合成情况能较好反映细胞的增殖情况。细胞增殖标记物Brdu(5-bromo-2-deoxyuridine)，为胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶DNA合成期（S期），而后利用抗Brdu单克隆抗体，显示增殖细胞。同时结合其他细胞标记物，双重染色，可判断增殖细胞的增殖速度[35-36]。近年来，常将5-溴脱氧尿嘧啶核苷Brdu标记法作为一种新的、简便、敏感、特异的检测细胞增殖的方法，在细胞增殖动力学、肿瘤生物学、遗传学、分子生物学等领域得到广泛应用[37-38]。增殖细胞标记物Brdu经免疫组化染色可观察Brdu在细胞内的掺入情况，故Brdu是反映细胞增殖及跟踪监测迁移细胞的理想指标[39]。本实验利用牛源致病性E.coliK99建立动物模型，应用Brdu标记增殖细胞在肠上皮细胞内的迁移速度，来探索牛源致病性E.coliK99对小鼠肠绒毛生长的影响。1.3致病性大肠杆菌与肠组织杯状细胞的相互关系1.3.1肠组织杯状细胞的概述杯状细胞(GobletCell，GC)具有单分泌腺的黏液分泌功能；对该领域上最新的研究结果包括肠道黏膜上皮GC上TLR感知肠道微生物的刺激，并激活相应信号转导通路，与之邻近的GC共同分泌大量黏液，将入侵的细菌冲回到肠腔的过程，且GC还参与机体免疫调节的研究进展[40]。2017年Knoop等[41]报道：肠道的GC分泌的黏液形成的黏液层在维持肠道上皮的完整性具有不可替代的作用。若黏液减少时，会出现黏膜受损，细菌感染，可诱发肠道炎性反应。由此可见GC在肠道保护和免疫调节中扮演不可忽视的角色。一旦有细菌穿过黏液层，这种类型的GC便会立即感知并通知周围的GC，使其迅速“喷”出大量的黏液，将细菌冲出黏液层。这些研究揭示了GC与肠道细菌易位后诱发相关疾病的机制，从而有望为这些疾病的研究和治疗带来新的思路。1.3.2肠组织杯状细胞的形态及分布 6牛源致病性大肠杆菌K99对小鼠肠绒毛生长及ITF和TGF-β1mRNA表达的影响杯状细胞的顶部因含有大量膜包分泌颗粒而膨大，细胞基底部因无分泌物而形成长柄状附着于基膜上。GC是典型的黏液细胞，因其黏液分泌是持续不断的，故而形成了形似高脚杯状的杯状细胞[42]。在常规HE染色中，杯状细胞是液泡化状的，不能轻易地观察和辨认到，这是因为杯状细胞所分泌的黏蛋白被溶解，外表染色较轻的原因；在PAS染色法中，杯状细胞显强阳性被染为深紫色，这是由于黏蛋白内含有多糖的缘故。见（图1-3）。杯状细胞由于分布较广泛，可位于不同的器官中，其主要分布在呼吸道和胃肠黏膜的假复层纤毛柱状细胞以及单层柱状上皮细胞内，在咽鼓管、胆囊颈、主胰管附近的管口咽等上皮中也分布一些比较少的杯状细胞。然而结肠中的杯状细胞主要分布在黏膜上皮，在肠腺的吸收细胞和绒毛之间也有分布，只是分布在肠腺上皮内的杯状细胞较小，分布在绒毛上皮内的杯状细胞较大[44]。所以杯状细胞的寿命是不同的，通常从发生到死亡为3到5天[45]。图1-3杯状细胞依染色方法不同而显示不同颜色Fig.1-3Gobletcellsshowdifferentcolorsdependingonstainingmethod左图：小肠上皮细胞胞质呈弱嗜酸性，胞核呈蓝紫色.杯状细胞呈空泡状；右图：颗粒呈深紫色，但颗粒粗大，容易与杯状细胞区别1.3.3肠组织杯状细胞的发育近年的研究结果表明，肠上皮基底干细胞可发育为吸收细胞、GC、潘氏细胞、肠内分泌细胞和丛细胞，GC出现得最早，肠道GC散落分布于吸收细胞之间。小肠杯状细胞开始发育于小肠腺内，之后逐渐向上迁移至肠绒毛，最后从肠绒毛顶端死亡脱落。正常杯状细胞数量从十二指肠至回肠末端逐渐增多，而结肠近端数量少于远端[46]，这是由于正常十二指肠和空肠细菌数量约为102cfu/mL，近端回肠细菌数量约为103cfu/mL，到远端回肠细菌数量约为107cfu/mL～108cfu/mL，而结肠细菌数量最多，约1011cfu/mL～1012cfu/mL[47]，可见GC的数量分布与肠道菌保持一致。Grant等[48]研究表明：结肠的腺体底部干细胞发育形成鼠结肠杯状细胞，同时进行细胞的增殖。 内蒙古农业大学硕士学位论文7在结肠中的杯状细胞，肠腺的基底部以最快的速度进行增生，但迁移速率却很慢[49]；而根据WeiZG等[50]报道，用秋水仙素处理SENCAR小鼠的结膜上皮后，发现其结膜上皮杯状细胞的分裂相，表明结膜杯状细胞具有分裂增生的能力。这两项研究的报道一致表明了未发育的细胞在位于肠腺的下部能连续增殖为杯状细胞，刚形成的杯状细胞连续向上迁移来补充绒毛从顶部脱落的杯状细胞。Norlander等[51]研究发现，新西兰白兔被辣椒素刺激后，其鼻旁窦杯状细胞数目明显增多，而且杯状细胞顺着一个特性的规律进行发育，首先浆液开始分化，然后细胞肿胀，最后形成杯状细胞。由此可见由刺激诱发产生的杯状细胞是由处于中间阶段的分泌细胞转化来的。Hughes等[52]发现，在病理的情况下，胃黏膜内的干细胞也可以发育形成杯状细胞，这与肠黏膜干细胞的功能相似，此为胃黏膜的肠上皮化生现象，又称肠化生（IntestinalMetaplasin，IM)即在病理情况下，胃黏膜上皮及胃腺上皮可转变为肠黏膜上皮[53]。目前有关杯状细胞的发育和来源有待进一步深入研究。1.3.4肠组织杯状细胞的结构与功能胃肠上皮细胞表面覆盖着黏液层，小肠只有一层黏液层[54]，而胃和结肠黏液层分内外两层，结肠GC分泌的黏蛋白（MUC2）以网状结构展开，与水和其他GC产物（肠三叶因子、免疫球蛋白IgG结合蛋白抗体、抗菌肽）[55-56]等混合，如胶冻样平铺在肠黏膜上皮细胞表面，形成内黏液层。杯状细胞作为单分泌腺有以下功能：（1）杯状细胞参与肠道免疫，通过抗原呈递功能：将小肠腔的抗原呈递给小肠固有层CD103+的树突状细胞。实验研究表明[57]在常规喂养的小鼠中，只在小肠中观察到自发的抗原呈递，而结肠却没有发现，也许结肠的抗原呈递可能被结肠共生菌群所抑制的缘故。（2）杯状细胞中多种免疫调节因子（IL-13、IL-9、IL-25、L-22）能促进其成熟与增值，其中IL-13能促进GC的增殖[58]；外源促IL-9和IL-25过表达能诱导GC的增殖[59-60]；IL-22一样在GC分化成熟和MUC2表达中起到重要作用，而IL-22缺陷的小鼠出现MUC2异常表达，GC增殖度降低。[61-63]（3）杯状细胞参与肠损伤表面重建，在失血性休克达一定程度时，肠道黏膜遭受较重损害，但仍然能够在短期内大部分恢复其黏膜细胞的连续性。形态学观察表明：损伤后的肠黏膜表面GC数增多，在休克复苏后3h就极显著，12h时发现，因为部分绒毛脱落所形成的缺损面上几乎完全由GC所替代，实验表明GC的强黏附力和黏蛋白分泌的增加在肠黏膜损伤重建中起到着关键作用[64]。（4）MUC2为高度糖基化的蛋白，MUC2单体主要由两个PTS区域和一些(VonWillebrandDdomain，VWD)区域组成。单体形成之后，在内质网通过C末端远端CK区域的分子内二硫键两两连接形成二聚体[65-67]。在内质网加工完成的蛋白产物抵达高尔基体进行糖基化。此后，在GC的分泌囊泡中，电镜显 8牛源致病性大肠杆菌K99对小鼠肠绒毛生长及ITF和TGF-β1mRNA表达的影响示MUC2二聚体进一步形成三聚体从而形成复杂网状结构[68]，黏蛋白从分泌颗粒中排出后，迅速展开空间骨架[69]。见（图1-4[70]）图1-4[70]杯状细胞功能示意图Fig.1-4[70]SchematicdiagramofgobletA：杯状细胞将捕获的抗原呈递给CD103+的树突状细胞；B：杯状细胞参与免疫调节，多种细胞因子促进杯状细胞的成熟和增殖；C：杯状细胞增殖填补肠损伤缺损面；D：MUC2黏蛋白在杯状细胞的合成和加工过程。1.3.5肠组织杯状细胞与肠道疾病炎症性肠病(InflammatoryBowelDisease，IBD)是目前一种原因不明的肠道炎症性疾病。溃疡性结肠炎(UlcerativeColitis，UC)是IBD的一种，病理特点为结肠黏膜炎症，炎症以不同程度连续性向近端扩展；其组织学特征包括上皮损害、隐窝脓肿、炎症、GC减少或消失[71]，一般UC患者隐窝上1/3减少最为明显[72]，GC的减少或消失常与肠三叶因子（Intestinaltrefoilfactor，ITF的表达受抑相关[73]。而同样属IBD的克罗恩病(Crohn'sdisease，CD)却有所不同[74]，相同水平的炎症促进CD患者肠GC的分化，这可能与CD的炎症诱导ITF表达有关[75]。在对MUC2缺陷[76]的小鼠研究[77-78]中发现，这些小鼠表现出类似UC的便血、体重下降、拉黏液物质等症状，由GC分泌的MUC2结构和功能的缺陷与UC发病密切相关，即：MUC2糖基和网状结构的破坏会导致肠黏膜上皮在细菌环境下的广泛暴露，长期如此便会触发机体的免疫反应从而致病[79]。现如今，科学家们对GC分泌物质的基因机制已经有所研究。最新研究发现，大肠和小肠黏膜上皮的杯状细胞内有编码ITF的基因，杯状细胞内基因的特殊表达是由ITF基因参与完成的[80]。谢冰颖等[81]研究溃疡性结肠炎结肠黏膜中的 内蒙古农业大学硕士学位论文9MUC5AC以及ITF的表达发现，UC大肠湿热证MUC5AC的表达上调和ITF的表达下调可能与UC的发生、发展有关。有研究报道，在小鼠的肠杯状细胞中分离出了基因一是一种可能与杯状细胞的分泌机制密切相关的基因[82]。经反复研究发现，不同器官杯状细胞的形态功能的改变可导致机体不同种类疾病的发生，如：在结膜中，杯状细胞的数目和分泌的黏蛋白基因表达发生改变可导致一系列眼部疾病的发生[83]；呼吸道中，若杯状细胞发生上述变化则能导致支气管哮喘的发生，并伴有黏液的栓塞[84-85]；消化道中，则会导致胃癌、肠炎以及结直肠癌的发生等[86-87]，Harrison等[88]研究发现：MUC2小鼠肠道共生菌直接与结肠表面上皮细胞接触，且小鼠在实验过程中发展为自发性结肠炎。于晓丽等[89]发现活动性溃疡性结肠患者其肠道MUC2黏蛋白O-型糖基化发生改变。然而MUC5AC、MUC5B基因的异常表达可引起支气管哮喘周围气道的黏液的栓塞；MUC1基因在乳腺内皮细胞的异常表达可造成乳腺浸润性导管癌；MUC2在食管、胃肠等疾病中的表达也有变化[90]。这些研究表明了杯状细胞基因表达的异常与一些常见的疾病有着至关重要的联系。本实验利用牛源致病性E.coliK99建立动物模型，应用PAS染色技术，观查GC的形态、数量、结构和功能的变化及其所分泌的ITF的变化来探索牛源致病性E.coliK99对杯状细胞免疫调节功能的影响。1.4肠三叶因子1.4.1ITF的研究进展肠三叶因子(TrefoilFactorFamily，TFF3)家族是近年来研究较多的一群小分子多肽。在哺乳动物中肠三因子家族包括3个因子：TFF1(乳癌相关肽，pS2)，TFF2(解痉多肽，SP)，ITF(小肠三叶因子，ITF)[91]。其中ITF主要由杯状细胞所分泌的多肽类物质，在肠道内相当丰富，甚至可以认为是一种结构蛋白[92]。ITF主要参与损伤黏膜的再生和修复，对胃肠黏膜起保护作用[93]。由于ITF发现不久，对ITF的研究主要集中在炎症性肠病、消化道溃疡和结肠息肉、肿瘤、肠缺氧及烧伤的领域[94]，而对于ITF是否具有减轻牛源致病性大肠杆菌K99所引起肠道黏膜的损伤，是否能加快细胞修复的作用却未见报道。现已证实肠屏障功能障碍在脓毒症的发生发展中起重要作用，且损伤肠道黏膜的修复与脓毒症预后密切相关[95]。因此，本实验通过研究肠道牛源致病性E.coliK99对小鼠ITFmRNA动态表达的影响，以探讨E.coli感染与肠黏膜上皮细胞损伤和修复的关系。1.4.2ITF的结构1991年Suemori等[96]首先发现并命名ITF。随后，Thim等[97]利用酵母产生了人及大鼠ITF蛋白(hITF和rITF)并对其二级结构进行了研究。发现ITF是由肠杯状细胞特异分泌的，由59个氨基酸组成的小分子多肽，分子中含有一个P结构，P结构 10牛源致病性大肠杆菌K99对小鼠肠绒毛生长及ITF和TGF-β1mRNA表达的影响域约由50多个氨基酸组成其基本单元，其间的6个半胱氨酸按1-5，2-4和3-6的顺序，依次以二硫键两两相接，形成3个环状结构，整个链由此发生弯曲和折叠，形成三个袢状结构，就像三片叶子一样，结构域也被称为三叶结构域，故名三叶因子。ITF特异的空间结构既是其保持生物活性的结构基础，也是人工合成的难点所在。见（图1-5[97]）。[97]图1-5ITF二聚体结构[97]Fig.1-5ITFdimerstructure1.4.3ITF的生物学特性ITF除保护作用外，一系列的实验已证明三叶因子也参加了损伤组织的修复过程，三叶因子是一种运动因子，能与表皮生长因子（EGF）及转化生长因子（TGF-β1）协同作用，参与损伤组织的上皮重建过程，即：促进受损黏膜周围完好的上皮细胞向损伤黏膜表面迁移覆盖，促进损伤黏膜的修复，但并不促进细胞分裂。在体外受损模型中，ITF和TFF2能引起受损上皮细胞以3～6倍的速率迁移到受损区域，而对正常肠细胞则无促细胞迁移活性[98-100]。Playford等[101]认为TFF2可能通过刺激细胞的移行，从而修复上皮。NieSN等[102]研究发现，ITF在早期细胞迁移和晚期细胞增殖中均起重要作用。体外实验显示，无论是重组ITF或重组TFF2，都能刺激肠道上皮细胞的迁移，促进伤口愈合，改变上皮细胞钙粘蛋白的表达和细胞定位[103-104]。正常胃肠道中ITF与MUC5AC结合而发挥生理功能[105]。TFF2已被发现由黏液细胞分泌，进一步实验证实无论在正常胃窦组织或是慢性溃疡的溃疡相关细胞系(UACL)中，TFF2都是与黏蛋白MUC6共同表达的[106-108]。ITF同时还结合着特殊的抗酸、耐酶及热分解的生物学特性，有望成为预防和治疗溃疡性结肠炎的新途径[109]。 内蒙古农业大学硕士学位论文111.4.4ITF与疾病有关实验证实，ITF可通过降低内毒素诱导幼鼠的肠损伤，在肠损伤过程中起保护作用［110］，通过基因重组技术，利用第2代酵母表达系统获得稳定的ITF，模拟肠道环境条件下，rhITF具备抗蛋白酶、热、酸和碱的特性以及生物学活性，并已证实ITF能减轻烧伤后小鼠胃肠黏膜的损伤，促进肠黏膜修复［111］。有关研究报道，敲除ITF的小鼠较正常小鼠更易引起溃疡性结肠炎，虽MUC也由杯状细胞正常分泌，但其不足以保护黏膜表面，而正常小鼠ITF表达增加；用水浸束缚应激而引起的大鼠胃黏膜损伤，可通过给予ITF得到改善［112］。ITF在动物疾病模型中的研究结果表明［113］，ITF可加强甲氨蝶呤损害的上皮单层细胞的重建。体外实验亦证实了ITF能维护肠上皮细胞免疫稳态，减少炎性介质释放，对肠上皮细胞增殖影响有限，但能明显改善细胞变形能力，促进细胞移行。在诱导坏死性小肠结肠炎(NecrotizingEnterocolitis，NEC)模型中，缺血再灌注损伤前30min或60min给予ITF能有效地防治肠道损伤［114］。在缺氧所诱导的NEC模型，同样可看到ITF对黏膜损伤和肠道炎症因子具有显著的防御作用［115］。体外研究还发现ITF对血小板活化因子诱导的肠上皮细胞紧密连接的损伤有保护作用，通过定量反转录酶-聚合酶链锁反应和免疫印迹显示ITF抑制血小板活化因子诱导的紧密连接蛋白-1的表达下调，以及抑制这些蛋白的异常定位和分布，表明ITF能降低黏膜通透性以及对炎症性肠道疾病治疗有潜力。1.4.5ITF在临床上的研究谢冰颖[116]等研究溃疡性结肠炎(UC)中的黏蛋白MUC2和MUC5AC以及ITF表达规律中发现，结肠黏膜中的MUC5AC的表达上调和ITF的表达下调可能与UC的发生和发展有关。而且对临床诊疗、判断预后也有较大意义。国外一项临床试验［117］，在溃疡性结肠炎患者中进行直肠内给予ITF次/d，为期3周，ITF未见明显临床效果，分析原因可能由于ITF存在单体和二聚体2种成分或所选择的给药途径不恰当。我国通过临床试验已证实［118］，ITF在胃肠道黏膜保护和修复方面有显著效果，溃疡性结肠患者能在短期内缓解症状，而美沙拉嗪肠溶剂、氨基水杨酸制剂和糖皮质激素以及免疫抑制剂的使用，使溃疡性结肠炎得到一定程度的控制，但此病易复发。目前临床上面临的主要问题是：如何治疗、如何用药才能促进胃肠道黏膜上皮组织愈合，防止溃疡性结肠患者复发并减少并发症的发生。基因重组ITF已被批准为国家一类新药，为修复黏膜、预防与治疗肠道溃疡及炎症提供辅助的支持治疗。目前可使用的为口服剂和注射剂2种剂型。但目前还没有发现受体特点的ITF结合分子，这不仅影响ITF的功能性研究，而且对于药物的有效性安全性开发是一个很大的障碍。ITF同时存在一个潜在的安全问题，在体外诱导侵袭、扩散和血管生成的能力，这可能会使慢性炎症组织增加化生潜能。但只要证实ITF在腔内给药是有效的，那么这种给药途径在大 12牛源致病性大肠杆菌K99对小鼠肠绒毛生长及ITF和TGF-β1mRNA表达的影响多数情况下将优于全身给药，ITF对上消化道酶以及肠道细菌蛋白酶有显著抵抗力，使ITF比大多数治疗消化道溃疡和炎症性肠病的的肽或蛋白质化合物更适合局部治疗，如口服或直肠内给药。目前最佳给药途径还不清楚，有一些研究支持静脉给药，而另一些研究支持口服治疗［119］；但皮下给药不太支持，有研究表明，在丝裂霉素C诱导的结肠炎大鼠，肠管内给予hITF能减轻结肠炎，而皮下注射hITF反而加重溃疡性结肠炎［120］。随着对ITF的分子机制和功能实现方式的进一步研究，相信ITF将为成为胃肠道损伤性疾病有效的治疗手段。1.5转化生长因子-β1.5.1转化生长因子--β的研究进展Delarco和Todaro于1978年发现小鼠肉瘤病毒转化T3，T3细胞系所产生的多肽因子可诱导非肿瘤细胞转化为失去接触抑制，获得具有在软琼脂层上生长能力的肿瘤细胞，当时称其为肉瘤生长因子[121-122]。随后研究发现，某些人体肿瘤细胞也能产生类似多肽因子，即将这些能刺激静止性生长的细胞称为转化生长因子-β（TransformingGrowthFactorβ，TGF-β）。TGF-β是一种多功能细胞因子，除了能使正常细胞转化外，在细胞增殖、分化和凋亡等基本活动中行使多种重要的调节作用和其他生物效应[123]，还参与成熟哺乳动物机体的免疫调节、细胞黏附及细胞外基质（Extracellularmatrix，ECM）的合成和储存，并与多种疾病的发生相关联。1.5.2TGF-β亚型TGF-β是一类功能复杂的多肽类细胞因子，广泛存在于动物正常组织细胞以及转化细胞中。现已了解TGF-β亚型中，TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3均已在哺乳动物细胞中被发现。Flanagan-Steet[124]用异核核磁共振谱测得TGF-β1的二级结构，其基本骨架与TGF-β1相同；TGF-β1亚单位分子量为12.5kD，不同组织（如骨与血小板）中提取的TGF-β1是同质的，不同动物的TGF-β1亚单位结构高度保留，如人、牛及猪成熟型TGF-β1的氨基酸顺序完全相同，人与小鼠的TGF-β1间仅在75（前体的354）位上的氨基酸有差异（人为丙氨酸，小鼠为丝氨酸）。在有关炎症疾病的相关研究中，TGF-β1是主要的研究对象，因为其表现出的促进或抑制炎症发生的效果[125]；TGF-β2则能够诱导胚胎发育过程中的中胚层的形成[126]，还能调控晶状体细胞，TGF-β2mRNA是白内障手术后囊膜混浊发展的影响因素[127]；TGF-β3可以抑制角质细胞和内皮细胞的增殖，同时研究发现TGF-β3对骨细胞也有重要的调节功能[128]。1.5.3TGF-β在肠道上皮的分布 内蒙古农业大学硕士学位论文13Dünker[129]进行了深入的研究发现，TGF-β的不同亚型及不同类型的肠黏膜上皮细胞的表达各不相同。他发现小鼠肠道中的TGF-β1在空肠中突出分布；TGF-β2主要表达在肠内分泌细胞，而且通过Westernblot分析表明，其在小肠中表达水平极显著；而TGF-β3大多表达在杯状细胞中，其主要在结肠中表达水平突出。Barnard等［130］在小鼠空肠和结肠的组织匀浆里检测到了TGF-β1mRNA、TGF-β2mRNA、TGF-β3mRNA的表达，说明这些亚型共同定位于这些组织中；通过免疫组化染色发现TGF-β的表达在肠绒毛顶部细胞中最显著，而在隐窝细胞中极低。有研究发现TGF-β可以对细胞分化产生抑制，TGF-β在未分化和低分化细胞中的表达远不及处于终末分化期的细胞，可能与肠绒毛顶部的细胞多为终末分化期的肠上皮细胞、内分泌细胞、杯状细胞等有关，而这些细胞是由肠隐窝中含有的未分化细胞不断分裂和分化而成，与彭瑞云等［131］曾用免疫组化染色检测TGF-β3在正常小鼠的小肠和大肠表达时，发现其在肠绒毛上皮细胞浆内的表达呈强阳性，其顶层阳性细胞极为显著，然而隐窝细胞呈弱阳性，与其表达结果类似。综上所述，TGF-β在肠道上皮的表达集中在肠绒毛顶部的终末分化细胞，且TGF-β的不同亚型在不同类型的肠黏膜上皮细胞的表达有特异性，造成了其在肠道不同部位的特异性表达。1.5.4TGF-β1在肠道损伤中的作用肠道中的TGF-β往往在炎症期间出现显著变化。刘一等［132］通过灌胃O127型大肠杆菌建立肠炎性小鼠模型后，发现实验组小鼠结肠组织中的TGF-β1mRNA出现明显上升，并将其作为模型建立成功与否的测定指标。研究发现，TGF-β1既可调节肠道免疫细胞的增殖、分化，影响其免疫应答中TGF-β1促炎症发展，又可抑制炎症发展，往往取决于其剂量、细胞周期及细胞类型等这些因素。如TGF－β1在低浓度时是促炎因子，在高浓度时是抑制炎症的作用。TGF-β在肠损伤前或损伤后给动物注入TGF-β均能加快许多动物模型（如鼠、兔、猪）等的创伤愈合，包括胃肠切口、结肠溃疡等，对肠组织损伤的修复起重要的作用［133-134］。体外研究发现人结肠癌细胞株(T84)培养液中添加外源性TGF-β1，可以上调上皮细胞紧密连接蛋白表达，维护跨膜电位平衡，起到加固肠黏膜屏障的作用，进而阻断因大肠杆菌感染而引起的肠黏膜炎症及通透性增加［135］。即：TGF-β可上调肠上皮细胞的紧密连接蛋白的表达，也可上调肠黏膜细胞中的抗凋亡蛋白的表达，抑制肠黏膜细胞的凋亡，对胃肠黏膜的完整性和伤口修复产生有利影响。现如今肠道损伤对养殖业产生了深远的影响，对相关细胞因子在肠道损伤中的作用机制的研究也不断展开。TGF-β作为重要的细胞因子之一，其异常表达往往会导致家畜肠道疾病产生和发展。研究TGF-β1与肠道损伤间的相互作用机制对预防和治愈肠道疾病是必要的。 14牛源致病性大肠杆菌K99对小鼠肠绒毛生长及ITF和TGF-β1mRNA表达的影响1.5.5TGF-β与疾病Hang等［136］研究发现TGF-β在受损肠道中会出现异常表达。如冷应激可以诱导十二指肠的损伤。相关研究发现，在急性和慢性冷应激条件下，肠道中TGF－β1的表达出现了先升后降的趋势，这表明TGF－β1在冷应激的初期表现出了促炎的作用，而在冷应激的后期，则因为炎症症状的缓解，其表达开始下降［137］。Ghareeb[138]等研究采食了被呕吐毒素污染的饲料的肉仔鸡，发现肉仔鸡肠道的固有免疫应答受到毒素影响，并导致其抗病力的减弱，在鸡球虫病方面，为预防球虫感染，TGF-β被用做免疫佐剂用在球虫DNA疫苗中。研究发现用堆型艾美耳球虫来二次感染5周龄大的雏鸡，二次感染后的雏鸡肠上皮细胞中TGF-β1mRNA的表达升高6～8倍，而在肠上皮细胞中TGF-β2和TGF-β3的表达保持恒定[139]。Hunter等[140]用热灭活的弓形虫刺激体外培养的患有联合免疫缺陷（SCID）的小鼠脾细胞，结果发现培养液里TGF-β1含量增加了2～3倍。在乳腺纤维化早期小鼠乳腺细胞内，TGF-β水平高低与乳腺纤维化程度呈正相关。而在田鼠乳腺纤维化模型中，也发现TGF-β基因高表达[141]。在肿瘤发生早期，TGF-β可抑制肿瘤细胞的生长，抑制细胞生长周期从G1期进入到S期，进而抑制细胞的分裂[142]。而在中晚期，TGF-β则能促使肿瘤生长并表现出恶性特征。体内表达TGF-β的乳腺癌，侵袭能力表现很强，而晚期乳腺癌产生更高水平的TGF-β，其癌组织中TGF-β水平显著高于正常乳腺组织。有研究表明：在肾脏部分切除后，残余肾脏中TGF-β表达显著增高；在糖尿病型大鼠的肾小球中也发现有TGF-βmRNA表达增多[143]。实验还发现[144]：TGF-β对骨折的愈合也有促进作用，在大鼠股骨骨膜或骨膜下多次注入，TGF-β可导致新骨生成，这说明外源性TGF-β的参与刺激成骨细胞的恢复和增殖。TGF-β广泛参与机体的病理生理过程，是肿瘤发生、发展的相关因子，在克罗恩病、肠结核、原发性肠道损伤、骨折愈合、软组织创伤修复、器官移植、肿瘤治疗等许多学科领域具有广泛的应用前景[145]。1.6研究的目的和意义目前对E.coli感染在病原、诊断和治疗方面的研究较多，而对致病机理相关的研究较少，比如，E.coli感染后，肠黏膜损伤和肠上皮修复和再生的一些关系以及细胞生长因子的一些相互关系的研究较少。为了解决这个问题，本课题通过牛源致病性E.coliK99感染，建立小鼠肠道损伤模型。应用HE染色观察小鼠肠道病理组织学变化，并测量其肠绒毛长度和隐窝深度；应用免疫组化检测肠黏膜上皮细胞中Brdu阳性信号的迁移距离；应用PAS染色统计杯状细胞数；并使用qRT-PCR法检测肠黏膜组织中ITFmRNA和TGF-β1mRNA表达水平；将初步揭示牛源致病性E.coliK99对小鼠肠绒毛生长、ITF及TGF-β1mRNA表达的影响，以探讨牛源致病性E.coliK99感染与肠黏膜上皮细胞损伤和再生的关系。 内蒙古农业大学硕士学位论文152实验研究2.1材料2.1.1实验菌株及实验动物牛源致病性E.coliK99由本实验室分离、鉴定并保存。6～8周龄Balb/c小鼠，体重25g左右，购自内蒙古医科大学，自由采食饮水，保持环境卫生，适应饲养一周后进行实验。2.1.2主要试剂与药品营养肉汤购自广东环凯微生物科技有限公司；柠檬酸和柠檬酸三钠（分析纯）购自上海凌峰化学试剂有限公司；磷酸二氢钾（分析纯）、十二水磷酸氢二钠（分析纯）、氯化钠（分析纯）、氯化钾（分析纯）、碳酸氢钠（分析纯）、甲醛（分析纯）、无水乙醇（分析纯）购自天津风船化学试剂科技有限公司；粘附载玻片（188105）购自江苏世泰实验器材有限公司；中性树胶（10004160）购自国药集团化学试剂有限公司；Brdu单克隆抗体、生物素-链霉卵白素免疫组化检测试剂盒（SP-9002）、浓缩型DAB试剂盒（ZL1-9017）购自北京中杉金桥生物技术有限公司；RNAisoPlus（9108）、MultisourceTotalRNAPrimeScriptRTreagentKit、SYBRPremixExTaqTMⅡ(RR820A)试剂盒、DL500Marker均购自Takara公司；RNA反转录试剂盒（R122）购自南京诺唯赞公司；5×loadingbuffer（P0015）购自碧云天生物技术公司；琼脂糖（75510-019）购自Invitrogen公司；核酸染料GoodViewTM购自北京赛百盛基因技术有限公司；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（P1200）、丙烯酰胺（29:1）（A010）购自北京索莱宝科技有限公司；甲醇购自天津永晟精细化工有限公司；DNase/RNase-free去离子水，购自天津三箭公司。2.1.3主要仪器设备电热恒温隔水式培养箱（SGSP-02）购自黄石恒丰医疗器械有限公司；低速离心机（SC-2552）购自安徽中佳科学仪器有限公司；高压锅（SX-500）购自公司；超低温冰箱（DW-88L38J）购自海尔公司；电子分析天平购自METTLERTOLEDO公司；组织脱水机（Tissue-Tek®VIPTM5Jr）、组织包埋机（Tissue-Tek®TECTM）、水平切片机、烤片机（Tissue-TekSlideWarmerPS-53）购自日本Sakura樱花；展片机、服务器购自Leica公司；伊红-苏木素染色机（VaristainGemini371）、盖片机（Clearvue）购自Thermoscientific公司；玻片扫描仪器（AxioScan.Z1）、图片处理系统购自Zeiss公司；PCR仪（2720）、实时荧光定量仪Q7、全能酶标仪购自ABI公司；琼脂凝胶成像系统购自美国GE公司；倒置显微镜，购自日本Olympus公司。 16牛源致病性大肠杆菌K99对小鼠肠绒毛生长及ITF和TGF-β1mRNA表达的影响2.2方法2.2.1E.coli感染小鼠实验2.2.1.1E.coli菌液的配制于37℃营养肉汤中复苏E.coli，麦康凯琼脂选择培养基上划线培养18h后，挑取单个菌落进行E.coli单克隆培养，采用平板活菌计数法计算菌液浓度，并用灭菌1×PBS调整菌液浓度为3.6×108CFU/mL（预试验测得）。2.2.1.2小鼠实验分组选取80只6～8周龄Balb/c小鼠，随机分为空白对照组，Brdu组（Brdu）和Ecoli感染组（Brdu+Ecoli）三组，空白对照组，不做任何处理。Brdu组，腹腔注射5mg/μL细胞标识剂Brdu溶液；E.coli感染组，先灌喂1mL（108CFU/mL）E.coli菌液，再腹腔注射细胞标识剂Brdu溶液。2.2.1.3小鼠实验取材观察小鼠临床症状，于处理后6h、12h、24h、30h、36h、48h、60h采集小鼠十二指肠、空肠和回肠，10%福尔马林中固定，其余肠组织匀浆后，-80℃保存备用。2.2.2小鼠肠道的病理组织观察2.2.2.110%中性福尔马林溶液的配制称取磷酸二氢钠4g，磷酸氢二钠6.5g，完全溶解后加入甲醛100mL，蒸馏水定容至1000mL。2.2.2.2病理组织切片的制作10%中性福尔马林溶液中分别固定十二指肠、空肠和回肠组织，待组织块充分固定后，将十二指肠、空肠和回肠组织修成小块置于包埋盒中，在新的中性福尔马林溶液中进行二次固定；流水冲洗组织块2h～4h，于封闭式脱水机过夜脱水、浸蜡后，组织包埋机中包埋组织块；以5μm于切片机进行组织切片，40℃展片机中充分展片，载玻片捞起组织切片，于烤片机上40℃烤片4h左右；将玻片转置染色架中通过染色机进行伊红-苏木素（HE）染色，稍微晾干，置于盖片机器内封片，风干后经玻片扫描机扫描后，存储图片信息。2.2.2.3测量肠绒毛长度及隐窝深度 内蒙古农业大学硕士学位论文17从隐窝最底部上皮细胞到隐窝开口部上皮细胞的距离为肠隐窝长度；从隐窝开口部上皮细胞到绒毛最顶部上皮细胞的距离为肠绒毛长度，每组5只小鼠的小肠各部位组织中取20个肠隐窝和肠绒毛测量[146]。2.2.3免疫组化法检测肠绒毛上皮细胞中Brdu阳性信号的迁移距离2.2.3.11XPBS的配制4g氯化钠，0.1g氯化钾，0.1g磷酸二氢钾，1.45g十二水磷酸氢二钠，蒸馏水定容至500mL，4℃备用。2.2.3.2柠檬酸盐缓冲液的配制称取21.01g柠檬酸溶于1000mL蒸馏水中，制成0.1M的柠檬酸储存A液，称取29.41g柠檬酸钠溶于1000mL蒸馏水中，制成0.1M柠檬酸钠储存B液；取9mLA液和41mLB液与450mL蒸馏水混匀，现配现用。2.2.3.3免疫组化的步骤5μm连续切片，组织切片于烤片机上42℃烤1h，53℃烤5h；于二甲苯Ⅰ中脱蜡15min，二甲苯Ⅱ中脱蜡10min，无水乙醇1min，95%乙醇2min，85%乙醇2min（此时煮抗原修复液），75%乙醇2min，50%乙醇2min；于1×PBS中浸泡3min；于柠檬酸缓冲液中抗原修复15min，取出片子冷却片刻，1×PBS中浸泡2min；按照小鼠生物素-链霉卵白素检测试剂盒说明书进行（进行优化后）：加3%H2O2去离子水室温避光封闭30min；PBS中冲洗，3min×3次；正常山羊血清室温孵育45min；将抗Brdu（一抗）抗体进行1：100稀释，取抗体稀释液覆盖组织，于湿盒中4℃过夜；PBS冲洗3次，3min/次；加生物素标记山羊抗小鼠（二抗）室温或37℃孵育30min；PBS中冲洗3次，3min/次；辣根酶标记链霉卵白素工作液室温或37℃孵育10min；PBS中冲洗3次，3min/次；吸取1mLDAB底物液与50uLDAB浓缩液混匀，制成DAB工作液，显色6min～7min，自来水终止染色；于苏木素中复染5min后，自来水充分水洗；无水乙醇中浸泡5min，二甲苯中浸泡5min，封片，光学显微镜下观察。Brdu组和E.coli组按以上免疫组化染色步骤进行。阴性对照组:用PBS代替抗Brdu（一抗）抗体，其余步骤与实验切片相同。2.2.3.4测量Brdu阳性信号在肠绒毛上皮细胞中的迁移距离从隐窝最底部上皮细胞到肠绒毛最领先上皮细胞中Brdu阳性信号的距离为Brdu阳性信号在肠绒毛上皮细胞中的迁移距离。每组5只小鼠的小肠各部位组织中取20 18牛源致病性大肠杆菌K99对小鼠肠绒毛生长及ITF和TGF-β1mRNA表达的影响个肠隐窝和肠绒毛测量[146]。每张切片在高倍镜(10x40)下随机取5个视野，计算每个视野内的阳性细胞迁移距离，取均数作为每张切片的阳性细胞迁移距离。2.2.4PAS染色法统计肠组织杯状细胞数2.2.4.1雪夫试剂（schiff）配制称取碱性复红1g溶于200mL蒸馏水，加热煮沸5min，将20mL，1mol/LHCl加入刚配好的碱性复红溶液中。2.2.4.2亚硫酸冲洗液的配制10％偏重亚硫酸钠7.5mL溶于130mL的蒸馏水。2.2.4.3PAS染色步骤组织切片经梯度酒精脱蜡后，高碘酸液氧化10min，自来水冲洗20s；Schiff氏酒精液避光处理10min，于亚硫酸水中涮洗6min，流水冲洗组织切片5min。苏木精复染核4min后，流水冲洗3min，75％酒精脱水5min，二甲苯透明5min，中性树胶封固。2.2.4.4肠组织杯状细胞的计数由于个体差异肠绒毛长短不同，本实验统计了从肠绒毛根部到顶部为200μm以上绒毛的杯状细胞数[146]。2.2.5实时荧光定量PCR法检测E.coli对肠道组织中ITF和TGF-β1mRNA表达的影响2.2.5.1肠道总RNA的提取（1）匀浆：剪取黄豆大小十二指肠、空肠、回肠组织样本，放入研钵中，加少量液氮快速研成浆液，整个操作在冰盒内进行。匀浆至液体中没有大颗粒组织块为止，在研钵中加300μLBufferR-I，用移液枪上下吹打8～10次。（2）转移上述细胞悬浮液1.5ml离心管（试剂盒内提供）中，用移液枪上下吹打8～10次。（3）加110μLBufferR-II，旋涡振荡15s～30s，12000r/min、4℃离心5min。（4）取上清至1.5ml离心管中，加200μL异丙酮，混合均匀。（5）将制备管于2ml离心管（试剂盒内提供）中，转移步骤④中的混合液到制备管中，6000r/min、4℃离心1min。 内蒙古农业大学硕士学位论文19（6）弃滤液，将制备管制回2ml离心管中，制备管中加500μLBufferW1A，12000r/min、4℃离心1min。（确认BufferW-1A中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇）。（7）弃滤液，将制备管制回2ml离心管中，制备管中加700μLBufferW2，12000r/min、4℃离心1min；以同样的方法再用700μLBufferW2洗涤一次。（确认BufferW2A中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇）。（8）弃滤液，将制备管制回2ml离心管中，12000r/min、4℃离心1min。（9）将制备管放入一个干净的1.5ml离心管（试剂盒内提供）中，在制备管膜中央加70μL-100μLBufferTE。（10）室温静置1min，12000r/min、4℃离心1min，洗脱得RNA。置于-80℃冰箱中保存备用。用酶标仪测每个样品的总RNA浓度及OD260/OD280比值，OD260/OD280比值介于1.8～2.2之间的样品可用于实验。若OD值小于1.8说明RNA溶液中蛋白质杂质较多，OD值大于2.2说明RNA开始降解。记录RNA浓度。将提取的总RNA根据反转录试剂盒说明书进行反转录，反应体系为10μL，反转录总量为500ng，于10μL的反应体系（表2-1）中根据试剂盒提供的反应程序（表2-2）进行反转录反应，合成的cDNA于-20℃保存备用。2.2.5.2反转录cDNA制备表2-1反转录反应体系(唯赞)Table.2-1Reversetranscriptreactionsolution(Vazyme)反转录反应组分反应体积（μL）5xqRTSuperMix2μLRNA500ngRNase-freeWater加至10μLTotal10μL表2-2反转录反应程序(唯赞)Table.2-2Reversetranscriptionalprogram(Vazyme)温度时间25℃10min50℃30min85℃5min4℃∞ 20牛源致病性大肠杆菌K99对小鼠肠绒毛生长及ITF和TGF-β1mRNA表达的影响2.2.5.3实时荧光定量PCR反应β-actin、ITF和TGF-β1的引物序列（表2-3）由上海生工生物工程公司设计并合成。Easydillution作为稀释液，以1:4的比例稀释cDNA；根据试剂盒所提供的反应体系（表2-4）按照说明书的反应程序（表2-5）进行相对定量PCR反应。表2-3引物序列及产物长度Table.2-3Primersequenceandproductsize引物名称引物序列(5′-3′)产物长度/bpPrimernamePrimersequenceproductsizeβ-actin-FCTGGAACGGTGAAGGTGACA101bpβ-actin-RAAGGGACTTCCTGTAACAATGCAITF-FCTGTGCAGTGGTCCTGAAGC123bpITF-RTTGGAGACAGGCCAACGTAATGF-β1-FCCCCTGCAAGACCATCGAC90bpTGF-β1-RCTGGCGAGCCTTAGTTTGGAC表2-4qPCR反应体系Table.2-4QaurantiverealtimePCRsystem试剂体积SYBRPremixExTaqⅡ(TilRNaseHPlus)(2×)10μLPCRForwardPrimer(10μM)0.8μLPCRReversePrimer(10μM)0.8μLcDNA2μLdH2O6.4μL表2-5qPCR反应程序Table.2-5ReactionprocedureofqPCR反应阶段温度时间循环变性95℃30s195℃5s退火4058℃34s95℃15s延伸60℃30s195℃15s 内蒙古农业大学硕士学位论文212.2.5.3.1实时荧光定量PCR产物电泳分析琼脂糖凝胶电泳测定产物大小。以1xTAE配制1%的琼脂糖凝胶，用微波炉加热至沸腾溶解后取出，制作3mm～5mm厚度胶板。取5μLRT-qPCR的产物与1μLLoadingBuffer的上样缓冲液混合后上样，Marker上样5μL，120V电泳持续25分钟，在凝胶成像仪下观察结果。2.3数据统计与分析应用Zeiss图片处理系统对HE染色图片进行存储，观察小鼠小肠的病理组织学变化并统计小鼠十二指肠、空肠和回肠绒毛长度及隐窝深度的变化。应用Zeiss扫描系统对免疫组化染色切片进行扫描并存储图片，并统计Brdu阳性细胞在十二指肠、空肠和回肠绒毛上皮细胞的迁移距离。应用Zeiss扫描系统对PAS染色切片进行扫描并存储图片，观察并统计小鼠十二指肠、空肠、回肠杯状细胞数量的变化。采用2-Δct法处理qPCR数据，应用SPSSStatistics22软件进行单因素ANOVA分析。应用GraphPadPrism5软件进行方差分析组内差异性和组间差异性并制图。p<0.05有统计学意义。 22牛源致病性大肠杆菌K99对小鼠肠绒毛生长及ITF和TGF-β1mRNA表达的影响3结果3.1致病性大肠杆菌K99复苏与平板计数复苏致病性大肠杆菌K99的过程中，采用平板画线法成功分离出单个菌落。在随后的平板计数中，我们发现10-7梯度的平板上的菌落数符合30～500范围，通过计数我们得到大肠杆菌菌悬液浓度是3.6×108cfu/mL（图3-1）。图3-1致病性大肠杆菌K99扩增后的计数结果Fig.3-1CountingresultsafteramplificationofpathogenicE.coliK99A平板划线分离单个菌落的肉汤培养基平板，B致病性大肠杆菌K99扩增后的计数结果APlateswerestreakedtoseparatebrothcultureplatesfromindividualcolonies，BEnumerationresultsafteramplificationofpathogenicE.coliK993.2小鼠临床症状观察空白对照组无明显变化。Brdu组6h～60h无明显变化。E.coli感染组小鼠在6h～12h之间出现临床症状，部分小鼠精神萎靡；24h～36h出现明显临床症状，主要表现为扎堆现象、怕冷、精神萎靡，行动迟缓、食欲减退、腹泻、被毛蓬松等临床症状，剖检E.coli感染组小鼠后，发现其腹腔内有多量液体渗出，肠壁肿胀，肠腔内充满腥臭、黄色稀薄的内容物，如图箭头所示。48h～60h小鼠精神状态出现好转，开始采食和饮水（图3-2）。图3-2小鼠临床症状Fig.3-2Clinicalsymptomsofmice 内蒙古农业大学硕士学位论文23A.空白对照组，Brdu组小鼠，B.感染E.coli组小鼠，C.空白对照组，Brdu组小鼠腹腔，D.感染E.coli组小鼠腹腔A.Theblankcontrolgroup，theBrdugroupofmice，B.InfectedwithE.coligroupmice，C.Theblankcontrolgroup，Brdumicewereperitoneal，D.InfectedwithE.coligroupmiceabdominalcavity3.3病理组织学变化3.3.1HE染色结果3.3.1.1E.coli对小鼠十二指肠肠绒毛的病理变化空白对照组小鼠的十二指肠肠绒毛排列整齐且细长紧密，隐窝轮廓清晰，上皮结构完整。Brdu组6h～60h，小鼠肠绒毛排列整齐且细长紧密，隐窝轮廓清晰，未见上皮细胞脱落。E.coli感染小鼠6h～60h后，十二指肠均出现不同程度的病理变化：肠黏膜水肿、绒毛缩短、部分上皮细胞坏死脱落，其中24h～30h肠绒毛缩短、断裂脱落最明显；48h～60h肠绒形态有所好转，绒毛长且排列紧密（图3-3-A～3-3-G）。图3-3-A6h十二指肠的病理变化(HE，×200)Fig.3-3-A6hPathologicalchangesoftheduodenal(HE，×200)空白对照组和6h-Brdu组十二指肠肠绒毛结构完整，层次分明，肠黏膜上皮细胞的轮廓清晰，染色鲜明，肠绒毛排列较整齐且排列规则无较明显病变；6h-E.coli组肠绒毛顶部有少量轻微的绒毛开始脱落（箭头所指）Theduodenalvilliofthecontrolgroupandthe6h-Brdugroupwerewell-structuredandwell-structured.Theoutlineoftheepithelialcellsoftheintestinalmucosawasclearanddistinctlystained.Thevilliwerearrangedmoreneatlyandthearrangementruleswerenotobvious;6h-E.coligroupasmallamountofslightfluffonthetopoftheintestinalvillibeginstofalloff.（Arrows）图3-3-B12h十二指肠的病理变化(HE，×200)Fig.3-3-B12hPathologicalchangesoftheduodenal(HE，×200) 24牛源致病性大肠杆菌K99对小鼠肠绒毛生长及ITF和TGF-β1mRNA表达的影响空白对照组和12h-Brdu组十二指肠肠绒毛结构完整，层次分明，肠黏膜上皮细胞的轮廓清晰，染色鲜明，肠绒毛排列较整齐且排列规则无较明显病变；12h-E.coli组肠绒毛顶端脱落，损坏严重，部分绒毛萎缩，出现核破碎、核浓缩现象（箭头所指）Theduodenalvilliofthecontrolgroupandthe12h-Brdugroupwerewell-structuredandwell-structured.Theoutlineoftheepithelialcellsoftheintestinalmucosawasclearanddistinctlystained.Thevilliwerearrangedmoreneatlyandthearrangementruleswerenotobvious;12h-E.coligroupendofintestinalvilliwasdetachedandthedamagewasserious.Somevilliwereatrophiedandnuclearfragmentationandnuclearcondensationappeared.（Arrows）图3-3-C24h十二指肠的病理变化(HE，×200)Fig.3-3-C24hPathologicalchangesoftheduodenal(HE，×200)空白对照组和24h-Brdu组十二指肠肠绒毛结构完整，层次分明，肠黏膜上皮细胞的轮廓清晰，染色鲜明，肠绒毛排列较整齐且排列规则无较明显病变；24h-E.coli组肠绒毛严重脱落和坏死，核破碎和核浓缩现象极显著（箭头所指）Inthecontrolgroupand24h-Brdugroup，thestructureoftheduodenalintestinalvilliwasintactandwell-defined，andtheoutlineoftheepithelialcellsoftheintestinalmucosawasclear，withclearstaining，andtheintestinalvilliwasarrangedmoreneatlyandthearrangementruleswerenotobvious;24h-E.coligroup，therewasseveresheddingandnecrosisoftheintestinalvilli，andthephenomenonofnuclearfragmentationandnuclearcondensationwasextremelysignificant.（Arrows）图3-3-D30h十二指肠的病理变化(HE，×200)Fig.3-3-D30hPathologicalchangesoftheduodenal(HE，×200)空白对照组和30h-Brdu组十二指肠肠绒毛结构完整，层次分明，肠黏膜上皮细胞的轮廓清晰，染色鲜明，肠绒毛排列较整齐且排列规则无较明显病变；30h-E.coli组肠绒毛出现严重脱落和坏死，核破碎和核浓缩现象极显著（箭头所指） 内蒙古农业大学硕士学位论文25Inthecontrolgroupand24h-Brdugroup，thestructureoftheduodenalintestinalvilliwasintactandwell-defined，andtheoutlineoftheepithelialcellsoftheintestinalmucosawasclear，withclearstaining，andtheintestinalvilliwasarrangedmoreneatlyandthearrangementruleswerenotobvious;30h-E.coligroup，therewasseveresheddingandnecrosisoftheintestinalvilli，andthephenomenonofnuclearfragmentationandnuclearcondensationwasextremelysignificant.（Arrows）图3-3-E36h十二指肠的病理变化(HE，×200)Fig.3-3-E36hPathologicalchangesoftheduodenal(HE，×200)空白对照组和36h-Brdu组十二指肠肠绒毛结构完整，层次分明，肠黏膜上皮细胞的轮廓清晰，染色鲜明，肠绒毛排列较整齐且排列规则无较明显病变；36h-E.coli组肠绒毛出现严重脱落和坏死，核破碎和核浓缩现象极显著（箭头所指）Inthecontrolgroupand36h-Brdugroup，thestructureoftheduodenalintestinalvilliwasintactandwell-defined，andtheoutlineoftheepithelialcellsoftheintestinalmucosawasclear，withclearstaining，andtheintestinalvilliwasarrangedmoreneatlyandthearrangementruleswerenotobvious;36h-E.coligroup，therewasseveresheddingandnecrosisoftheintestinalvilli，andthephenomenonofnuclearfragmentationandnuclearcondensationwasextremelysignificant.（Arrows）图3-3-F48h十二指肠的病理变化(HE，×200)Fig.3-3-F48hPathologicalchangesoftheduodenal(HE，×200)空白对照组和48h-Brdu组十二指肠肠绒毛结构完整，层次分明，肠黏膜上皮细胞的轮廓清晰，染色鲜明，肠绒毛排列较整齐且排列规则无较明显病变；48h-E.coli组肠绒毛结构恢复完整，肠黏膜上皮细胞的轮廓清晰，染色鲜明。Theduodenalvilliofthecontrolgroupandthe48h-Brdugroupwerewell-structuredandwell-structured.Theepithelialcellsoftheintestinalmucosawerewell-definedandclearlystained.Thevilliwerearrangedmoreneatlyandthe 26牛源致病性大肠杆菌K99对小鼠肠绒毛生长及ITF和TGF-β1mRNA表达的影响arrangementruleswerelessobvious;48h-E.coligroupthestructureoftheintestinalvilliwasrestoredandtheepithelialcellsoftheintestinalmucosawerewell-definedandclearlystained.图3-3-G60h十二指肠的病理变化(HE，×200)Fig.3-3-G60hPathologicalchangesoftheduodenal(HE，×200)空白对照组和60h-Brdu组十二指肠肠绒毛结构完整，层次分明，肠黏膜上皮细胞的轮廓清晰，染色鲜明，肠绒毛排列较整齐且排列规则无较明显病变；60h-E.coli组肠绒毛结构恢复完整，肠黏膜上皮细胞的轮廓清晰，染色鲜明。Theduodenalvilliofthecontrolgroupandthe60h-Brdugroupwerewell-structuredandwell-structured.Theepithelialcellsoftheintestinalmucosawerewell-definedandclearlystained.Thevilliwerearrangedmoreneatlyandthearrangementruleswerelessobvious;60h-E.coligroupthestructureoftheintestinalvilliwasrestoredandtheepithelialcellsoftheintestinalmucosawerewell-definedandclearlystained.3.3.1.2E.coli对小鼠空肠肠绒毛的病理变化空白对照组小鼠的空肠肠绒毛排列整齐且细长紧密，隐窝轮廓清晰，上皮结构完整。Brdu组6h～60h，小鼠肠绒毛排列整齐且细长紧密，隐窝轮廓清晰，未见上皮细胞脱落。E.coli感染小鼠6h～60h后，空肠均出现不同程度的病理变化：绒毛缩短、部分上皮细胞坏死脱落、肠黏膜水肿，其中24h～36h肠绒毛缩短、断裂脱落最明显；60h肠绒形态有所好转，绒毛长且排列紧密（图3-4-A～3-4-G）。图3-4-A6h空肠的病理变化(HE，×200)Fig.3-4-A6hPathologicalchangesofthejejunuml(HE，×200)空白对照组和6h-Brdu组空肠绒毛结构完整，层次分明，肠黏膜上皮细胞的轮廓清晰，染色鲜明，肠绒毛排列较整齐且排列规则无较明显病变；6h-E.coli组肠绒毛顶部有少量轻微的绒毛开始脱落（箭头所指）Thejejunumlvilliofthecontrolgroupandthe6h-Brdugroupwerewell-structuredandwell-structured.Theoutlineoftheepithelialcellsoftheintestinalmucosawasclearanddistinctlystained.Thevilliwerearrangedmoreneatlyandthe 内蒙古农业大学硕士学位论文27arrangementruleswerenotobvious;6h-E.coligroupasmallamountofslightfluffonthetopoftheintestinalvillibeginstofalloff.（Arrows）图3-4-B12h空肠的病理变化(HE，×200)Fig.3-4-B12hPathologicalchangesofthejejunuml(HE，×200)空白对照组和12h-Brdu组空肠肠绒毛结构完整，层次分明，肠黏膜上皮细胞的轮廓清晰，染色鲜明，肠绒毛排列较整齐且排列规则无较明显病变；12h-E.coli组肠绒毛顶端脱落，损坏严重，部分绒毛萎缩，出现核破碎、核浓缩现象（箭头所指）Thejejunumvilliofthecontrolgroupandthe12h-Brdugroupwerewell-structuredandwell-structured.Theoutlineoftheepithelialcellsoftheintestinalmucosawasclearanddistinctlystained.Thevilliwerearrangedmoreneatlyandthearrangementruleswerenotobvious;12h-E.coligroupendofintestinalvilliwasdetachedandthedamagewasserious.Somevilliwereatrophiedandnuclearfragmentationandnuclearcondensationappeared.（Arrow）图3-4-C24h空肠的病理变化(HE，×200)Fig.3-4-C24hPathologicalchangesofthejejunuml(HE，×200)空白对照组和24h-Brdu组空肠肠绒毛结构完整，层次分明，肠黏膜上皮细胞的轮廓清晰，染色鲜明，肠绒毛排列较整齐且排列规则无较明显病变；24h-E.coli组肠绒毛顶端脱落，损坏严重，部分绒毛萎缩，出现核破碎、核浓缩现象（箭头所指）Thejejunumvilliofthecontrolgroupandthe24h-Brdugroupwerewell-structuredandwell-structured.Theoutlineoftheepithelialcellsoftheintestinalmucosawasclearanddistinctlystained.Thevilliwerearrangedmoreneatlyandthearrangementruleswerenotobvious;24h-E.coligroupendofintestinalvilliwasdetachedandthedamagewasserious.Somevilliwereatrophiedandnuclearfragmentationandnuclearcondensationappeared.（Arrows） 28牛源致病性大肠杆菌K99对小鼠肠绒毛生长及ITF和TGF-β1mRNA表达的影响图3-4-D30h空肠的病理变化(HE，×200)Fig.3-4-D30hPathologicalchangesofthejejunuml(HE，×200)空白对照组和30h-Brdu组空肠肠绒毛结构完整，层次分明，肠黏膜上皮细胞的轮廓清晰，染色鲜明，肠绒毛排列较整齐且排列规则无较明显病变；30h-E.coli组肠绒毛顶端脱落，损坏严重，部分绒毛萎缩，出现核破碎、核浓缩现象（箭头所指）Thejejunumvilliofthecontrolgroupandthe30h-Brdugroupwerewell-structuredandwell-structured.Theoutlineoftheepithelialcellsoftheintestinalmucosawasclearanddistinctlystained.Thevilliwerearrangedmoreneatlyandthearrangementruleswerenotobvious;30h-E.coligroupendofintestinalvilliwasdetachedandthedamagewasserious.Somevilliwereatrophiedandnuclearfragmentationandnuclearcondensationappeared.（Arrows）图3-4-E36h空肠的病理变化(HE，×200)Fig.3-4-E36hPathologicalchangesofthejejunuml(HE，×200)空白对照组和36h-Brdu组空肠肠绒毛结构完整，层次分明，肠黏膜上皮细胞的轮廓清晰，染色鲜明，肠绒毛排列较整齐且排列规则无较明显病变；36h-E.coli组肠绒毛顶端脱落，损坏严重，部分绒毛萎缩，出现核破碎、核浓缩现象（箭头所指）Thejejunumvilliofthecontrolgroupandthe36h-Brdugroupwerewell-structuredandwell-structured.Theoutlineoftheepithelialcellsoftheintestinalmucosawasclearanddistinctlystained.Thevilliwerearrangedmoreneatlyandthearrangementruleswerenotobvious;36h-E.coligroupendofintestinalvilliwasdetachedandthedamagewasserious.Somevilliwereatrophiedandnuclearfragmentationandnuclearcondensationappeared.（Arrows）图3-4-F48h空肠的病理变化(HE，×200)Fig.3-4-F48hPathologicalchangesofthejejunuml(HE，×200) 内蒙古农业大学硕士学位论文29空白对照组和48h-Brdu组十二指肠肠绒毛结构完整，层次分明，肠黏膜上皮细胞的轮廓清晰，染色鲜明，肠绒毛排列较整齐且排列规则无较明显病变；48h-E.coli组肠绒毛结构恢复完整，肠黏膜上皮细胞的轮廓清晰，染色鲜明。Thejejunumvilliofthecontrolgroupandthe48h-Brdugroupwerewell-structuredandwell-structured.Theepithelialcellsoftheintestinalmucosawerewell-definedandclearlystained.Thevilliwerearrangedmoreneatlyandthearrangementruleswerelessobvious;48h-E.coligroupthestructureoftheintestinalvilliwasrestoredandtheepithelialcellsoftheintestinalmucosawerewell-definedandclearlystained.图2-4-G60h空肠的病理变化(HE，×200)Fig.3-4-G60hPathologicalchangesofthejejunuml(HE，×200)空白对照组和60h-Brdu组十二指肠肠绒毛结构完整，层次分明，肠黏膜上皮细胞的轮廓清晰，染色鲜明，肠绒毛排列较整齐且排列规则无较明显病变；60h-E.coli组肠绒毛结构恢复完整，肠黏膜上皮细胞的轮廓清晰，染色鲜明。Thejejunumvilliofthecontrolgroupandthe60h-Brdugroupwerewell-structuredandwell-structured.Theepithelialcellsoftheintestinalmucosawerewell-definedandclearlystained.Thevilliwerearrangedmoreneatlyandthearrangementruleswerelessobvious;60h-E.coligroupthestructureoftheintestinalvilliwasrestoredandtheepithelialcellsoftheintestinalmucosawerewell-definedandclearlystained.3.3.1.3E.coli对小鼠回肠肠绒毛的病理变化空白对照组、Brdu组、E.coli感染组小鼠的回肠肠绒毛排列整齐且紧密，隐窝轮廓清晰，上皮结构完整。其中E.coli感染组24h～30h肠绒毛着色较空白对照组、Brdu组浅（图3-5-A～3-5-G）图3-5-A6h回肠绒毛结构(HE，×200)Fig.3-5-A6hilealvillusstructure(HE，×200)空白对照组、6h-Brdu组、6h-E.coli感染组小鼠的回肠肠绒毛上皮结构完整且排列整齐，隐窝轮廓清晰。 30牛源致病性大肠杆菌K99对小鼠肠绒毛生长及ITF和TGF-β1mRNA表达的影响Intheblankcontrolgroup，6h-Brdugroupand6h-E.coliinfectedgroup，theilealintestinevilliepitheliuminmiceiswell-structuredandneatlyarranged，withclearcryptcontours图3-5-B12h回肠绒毛结构(HE，×200)Fig.3-5-B12hilealvillusstructure(HE，×200)空白对照组、12h-Brdu组、12h-E.coli感染组小鼠的回肠肠绒毛上皮结构完整且排列整齐，隐窝轮廓清晰。Intheblankcontrolgroup，12h-Brdugroupand12h-E.coliinfectedgroup，theilealintestinevilliepitheliuminmiceiswell-structuredandneatlyarranged，withclearcryptcontours图3-5-C24h回肠绒毛结构(HE，×200)Fig.3-5-C24hilealvillusstructure(HE，×200)空白对照组、24h-Brdu组、24h-E.coli感染组小鼠的回肠肠绒毛上皮结构完整且排列整齐，隐窝轮廓清晰。其中24h-E.coli感染组肠绒毛着色较空白对照组，24h-Brdu组浅Intheblankcontrolgroup，24h-Brdugroupand24h-E.coliinfectedgroup，theilealintestinevilliepitheliumwasintactandneatlyarranged，andthecryptcontourwasclear.Inthe24h-E.coliinfectiongroup，thecoloroftheintestinalvilliwaslessthanthatoftheblankcontrolgroup，andthe24h-Brdugroupwasshallow.图3-5-D30h回肠绒毛结构(HE，×200)Fig.3-5-D30hilealvillusstructure(HE，×200)空白对照组、30h-Brdu组、30h-E.coli感染组小鼠的回肠肠绒毛上皮结构完整且排列整齐，隐窝轮廓清晰。其中30h-E.coli感染组肠绒毛着色较空白对照组，30h-Brdu组浅 内蒙古农业大学硕士学位论文31Intheblankcontrolgroup，30h-Brdugroupand30h-E.coliinfectedgroup，theilealintestinevilliepitheliumwasintactandneatlyarranged，andthecryptcontourwasclear.Inthe30h-E.coliinfectiongroup，thecoloroftheintestinalvilliwaslessthanthatoftheblankcontrolgroup，andthe30h-Brdugroupwasshallow.图3-5-E36h回肠绒毛结构(HE，×200)Fig.3-5-E36hilealvillusstructure(HE，×200)空白对照组、36h-Brdu组、36h-E.coli感染组小鼠的回肠肠绒毛上皮结构完整且排列整齐，隐窝轮廓清晰。Intheblankcontrolgroup，36h-Brdugroupand36h-E.coliinfectedgroup，theilealintestinevilliepitheliuminmiceiswell-structuredandneatlyarranged，withclearcryptcontour图3-5-F48h回肠绒毛结构(HE，×200)Fig.3-5-F48hilealvillusstructure(HE，×200)空白对照组、48h-Brdu组、48h-E.coli感染组小鼠的回肠肠绒毛上皮结构完整且排列整齐，隐窝轮廓清晰。Intheblankcontrolgroup，48h-Brdugroupand48h-E.coliinfectedgroup，theilealintestinevilliepitheliuminmiceiswell-structuredandneatlyarranged，withclearcryptcontour图3-5-G60h回肠绒毛结构(HE，×200)Fig.3-5-G60hilealvillusstructure(HE，×200)空白对照组、60h-Brdu组、60h-E.coli感染组小鼠的回肠肠绒毛上皮结构完整且排列整齐，隐窝轮廓清晰。Intheblankcontrolgroup，60h-Brdugroupand60h-E.coliinfectedgroup，theilealintestinevilliepitheliuminmiceiswell-structuredandneatlyarranged，withclearcryptcontour 32牛源致病性大肠杆菌K99对小鼠肠绒毛生长及ITF和TGF-β1mRNA表达的影响3.3.1.4E.coli对小鼠十二指肠、空肠、回肠绒毛长度和隐窝深度的变化结果小肠黏膜没有明显皱褶，有指状肠绒毛和管状肠隐窝。空白对照组小肠绒毛长度从十二指肠到回肠逐渐变短。肠隐窝各部位间没有显著差异（p>0.05）。E.coliK99感染组较空白对照组和Brdu组的十二指肠、空肠绒毛长度变短，差异极显著（p<0.01）（见图3-6-A、3-6-C)；肠隐窝变长，差异极显著（p<0.01）（见图3-6-B、3-6-D)。回肠绒毛长度、隐窝长度在E.coli感染组、Brdu组及空白对照组没有显著差异（p>0.05）（见图3-6-E、3-6-F）。图3-6不同时间点E.coli对小鼠十二指肠、空肠、回肠绒毛长度和隐窝长度变化的影响Fig.3-6EffectofE.colionchangesoflengthofduodenum，jejunum，ileumvillusandcryptsatdifferenttimepointsinmice 内蒙古农业大学硕士学位论文33A、C、E分别是十二指肠、空肠、回肠的绒毛长度；B、D、F分别是十二指肠、空肠、回肠的隐窝深度A，C，Earethevilluslengthofduodenum，jejunum，ileum，respectively;B，D，Farethecryptlengthofduodenum，jejunum，andileum，respectively注：**.p＜0.01较空白对照组、Brdu组，**.p＜0.01comparedwithcontrol3.3.1.5小结牛源致病性E.coli感染小鼠后，可以引起小肠黏膜上皮细胞是损伤。3.3.2免疫组化结果3.3.2.1E.coli对小鼠十二指肠上皮细胞的增殖变化十二指肠空白对照组组织中细胞核呈阴性染色。E.coli作用小鼠6h后Brdu组阳性细胞在肠隐窝底部分布较多，E.coli组阳性细胞较Brdu组迁移距离较快；E.coli作用小鼠12h后Brdu组阳性细胞在肠绒毛基底部分布较多，E.coli组阳性细胞迁移到肠绒毛基底上部较Brdu组距离迁移较快；E.coli作用小鼠24h后Brdu组阳性细胞在肠绒毛基底上部分布较多，E.coli组阳性细胞迁移到肠绒毛1/4位置较Brdu组迁移距离较快；E.coli作用小鼠30h后Brdu组阳性细胞在肠绒毛1/4位置分布较多，E.coli组阳性细胞迁移到肠绒毛2/4位置较Brdu组迁移距离较快；E.coli作用小鼠36h后Brdu组阳性细胞在肠绒毛2/4位置分布较多，E.coli组阳性细胞迁移到肠绒毛3/4位置较Brdu组迁移距离较快；E.coli作用小鼠48h后Brdu组和E.coli组阳性细胞在接近肠绒毛顶部分布较多，在肠隐窝部位分布较少，阳性细胞的迁移距离相同；E.coli作用小鼠60h后Brdu组和E.coli组阳性细胞在肠绒毛顶部分布较多，在肠隐窝部位分布较少，阳性细胞的迁移距离相同（见图3-7-A～3-7-G）。图3-7-A6h十二指肠上皮细胞的增殖变化(IHC，×400)Fig.3-7-A6hduodenalepithelialcellproliferationchanges(IHC，×400)E.coli作用小鼠6h后，Brdu组阳性细胞在肠隐窝底部分布较多，E.coli组阳性细胞较Brdu组迁移距离较快（单箭头所指：阳性细胞；双箭头所指：Brdu阳性细胞从肠隐窝到绒毛迁移的距离）AfterE.colitreatedmicefor6h，Brdupositivecellsweredistributedmoreatthebottomofintestinalcrypts，andE.coligrouppositivecellsmigratedfasterthanBrdugroup.（Thesinglearrow:positivecells;thedoublearrow:Brdupositivecellsmigratefromintestinalcryptstovilli） 34牛源致病性大肠杆菌K99对小鼠肠绒毛生长及ITF和TGF-β1mRNA表达的影响图3-7-B12h十二指肠上皮细胞的增殖变化(IHC，×400)Fig.3-7-B12hduodenalepithelialcellproliferationchanges(IHC，×400)E.coli作用小鼠12h后，Brdu组阳性细胞在肠绒毛基底部分布较多，E.coli组阳性细胞迁移到肠绒毛基底上部较Brdu组距离迁移较快（单箭头所指：阳性细胞；双箭头所指：Brdu阳性细胞从肠隐窝到绒毛迁移的距离）AfterE.colitreatedmicefor12hours，Brdugrouppositivecellsweremoreinthebasementoftheintestinalvilli，andE.coligrouppositivecellsmigratedtotheupperpartoftheintestinalvillisuperiortotheBrdugroup（Thesinglearrow:positivecells;thedoublearrow:Brdupositivecellsmigratefromintestinalcryptstovilli）图3-7-C24h十二指肠上皮细胞的增殖变化(IHC，×400)Fig.3-7-C24hduodenalepithelialcellproliferationchanges(IHC，×400)E.coli作用小鼠24h后，Brdu组阳性细胞在肠绒毛基底上部分布较多，E.coli组阳性细胞迁移到肠绒毛1/4位置较Brdu组迁移距离较快；（单箭头所指：阳性细胞；双箭头所指：Brdu阳性细胞从肠隐窝到绒毛迁移的距离）AfterE.colitreatedmicefor24h，Brdupositivecellsweredistributedintheupperpartoftheintestinalvilli，andE.colipositivecellsmigratedtothevillus1/4positionfasterthantheBrdugroup.（Thesinglearrow:positivecells;thedoublearrow:Brdupositivecellsmigratefromintestinalcryptstovilli）图3-7-D30h十二指肠上皮细胞的增殖变化(IHC，×400)Fig.3-7-D30hduodenalepithelialcellproliferationchanges(IHC，×400)E.coli作用小鼠30h后，Brdu组阳性细胞在肠绒毛1/4位置分布较多，E.coli组阳性细胞迁移到肠绒毛2/4位置较Brdu组迁移距离较快（单箭头所指：阳性细胞；双箭头所指：Brdu阳性细胞从肠隐窝到绒毛迁移的距离） 内蒙古农业大学硕士学位论文35AfterE.colitreatedmicefor30h，Brdupositivecellsweredistributedin1/4ofthevilli，andE.colipositivecellsmigratedtointestinalvilliat2/4comparedwithBrdu.（Thesinglearrow:positivecells;thedoublearrow:Brdupositivecellsmigratefromintestinalcryptstovilli）图3-7-E36h十二指肠上皮细胞的增殖变化(IHC，×400)Fig.3-7-E36hduodenalepithelialcellproliferationchanges(IHC，×400)E.coli作用小鼠36h后，Brdu组阳性细胞在肠绒毛2/4位置分布较多，E.coli组阳性细胞迁移到肠绒毛3/4位置较Brdu组迁移距离较快；（单箭头所指：阳性细胞；双箭头所指：Brdu阳性细胞从肠隐窝到绒毛迁移的距离）AfterE.colitreatedmicefor36hours，theBrdugrouppositivecellsweredistributedmoreintheintestinalvilliatthe2/4location，andtheE.coligrouppositivecellsmigratedtotheintestinalvilliatthe3/4location.ComparedwiththeBrdugroup，themigrationdistancewasfaster.（Thesinglearrow:positivecells;thedoublearrow:Brdupositivecellsmigratefromintestinalcryptstovilli）图3-7-F48h十二指肠上皮细胞的增殖变化(IHC，×400)Fig.3-7-F48hduodenalepithelialcellproliferationchanges(IHC，×400)E.coli作用小鼠48h后，Brdu组和E.coli组阳性细胞在接近肠绒毛顶部分布较多，在肠隐窝部位分布较少，阳性细胞的迁移距离相同；（单箭头所指：阳性细胞；双箭头所指：Brdu阳性细胞从肠隐窝到绒毛迁移的距离）AfterE.colitreatedmicefor48hours，positivecellsinBrdugroupandE.coligroupweremoredistributednearthetopofintestinalvilliandlessdistributedinintestinalcrypts，andthemigrationdistanceofpositivecellswasthesame.（Thesinglearrow:positivecells;thedoublearrow:Brdupositivecellsmigratefromintestinalcryptstovilli）图3-7-G60h十二指肠上皮细胞的增殖变化(IHC，×400)Fig.3-7-G60hduodenalepithelialcellproliferationchanges(IHC，×400) 36牛源致病性大肠杆菌K99对小鼠肠绒毛生长及ITF和TGF-β1mRNA表达的影响E.coli作用小鼠60h后，Brdu组和E.coli组阳性细胞在肠绒毛顶部分布较多，在肠隐窝部位分布较少，阳性细胞的迁移距离相同（单箭头所指：阳性细胞；双箭头所指：Brdu阳性细胞从肠隐窝到绒毛迁移的距离）AfterE.colitreatedmicefor60h，thepositivecellsofBrdugroupandE.coligroupdistributedmoreonthetopofintestinalvilliandlessintheintestinecrypts，andthemigrationdistanceofpositivecellswasthesame.（Thesinglearrow:positivecells;thedoublearrow:Brdupositivecellsmigratefromintestinalcryptstovilli）3.3.2.2E.coli对小鼠空肠上皮细胞的增殖变化空肠空白对照组组织中细胞核呈阴性染色。E.coli作用小鼠6h后Brdu组阳性细胞在肠隐窝底部分布较多，E.coli组阳性细胞较Brdu组迁移距离较快；E.coli作用小鼠12h后Brdu组阳性细胞在肠绒毛基底部分布较多，E.coli组阳性细胞迁移到肠绒毛基底上部较Brdu组距离迁移较快；E.coli作用小鼠24h后Brdu组阳性细胞在肠绒毛基底上部分布较多，E.coli组阳性细胞迁移到肠绒毛1/4位置较Brdu组迁移距离较快；E.coli作用小鼠30h后Brdu组阳性细胞在肠绒毛1/4位置分布较多，E.coli组阳性细胞迁移到肠绒毛2/4位置较Brdu组迁移距离较快；E.coli作用小鼠36h后Brdu组阳性细胞在肠绒毛2/4位置分布较多，E.coli组阳性细胞迁移到肠绒毛3/4位置较Brdu组迁移距离较快；E.coli作用小鼠48h～60hBrdu组和E.coli组阳性细胞迁移到绒毛顶部且迁移距离相同（见图3-8-A～3-8-G）。图3-8-A6h空肠上皮细胞的增殖变化(IHC，×400)Fig.3-8-A6hjejunumepithelialcellproliferationchanges(IHC，×400)E.coli作用小鼠6h后，Brdu组阳性细胞在肠隐窝底部分布较多，E.coli组阳性细胞较Brdu组迁移距离较快（单箭头所指：阳性细胞；双箭头所指：Brdu阳性细胞从肠隐窝到绒毛迁移的距离）AfterE.colitreatedmicefor6h，Brdupositivecellsweredistributedmoreatthebottomofintestinalcrypts，andE.coligrouppositivecellsmigratedfasterthanBrdugroup.（Thesinglearrow:positivecells;thedoublearrow:Brdupositivecellsmigratefromintestinalcryptstovilli）图3-8-B12h空肠上皮细胞的增殖变化(IHC，×400)Fig.3-8-B12hjejunumepithelialcellproliferationchanges(IHC，×400) 内蒙古农业大学硕士学位论文37E.coli作用小鼠12h后，Brdu组阳性细胞在肠绒毛基底部分布较多，E.coli组阳性细胞迁移到肠绒毛基底上部较Brdu组距离迁移较快（单箭头所指：阳性细胞；双箭头所指：Brdu阳性细胞从肠隐窝到绒毛迁移的距离）AfterE.colitreatedmicefor12hours，Brdugrouppositivecellsweremoreinthebasementoftheintestinalvilli，andE.coligrouppositivecellsmigratedtotheupperpartoftheintestinalvillisuperiortotheBrdugroup（Thesinglearrow:positivecells;thedoublearrow:Brdupositivecellsmigratefromintestinalcryptstovilli）图3-8-C24h空肠上皮细胞的增殖变化(IHC，×400)Fig.3-8-C24hjejunumepithelialcellproliferationchanges(IHC，×400)E.coli作用小鼠24h后，Brdu组阳性细胞在肠绒毛基底上部分布较多，E.coli组阳性细胞迁移到肠绒毛1/4位置较Brdu组迁移距离较快；（单箭头所指：阳性细胞；双箭头所指：Brdu阳性细胞从肠隐窝到绒毛迁移的距离）AfterE.colitreatedmicefor24h，Brdupositivecellsweredistributedintheupperpartoftheintestinalvilli，andE.colipositivecellsmigratedtothevillus1/4positionfasterthantheBrdugroup.（Thesinglearrow:positivecells;thedoublearrow:Brdupositivecellsmigratefromintestinalcryptstovilli）图3-8-D30h空肠上皮细胞的增殖变化(IHC，×400)Fig.3-8-D30hjejunumepithelialcellproliferationchanges(IHC，×400)E.coli作用小鼠30h后，Brdu组阳性细胞在肠绒毛1/4位置分布较多，E.coli组阳性细胞迁移到肠绒毛2/4位置较Brdu组迁移距离较快（单箭头所指：阳性细胞；双箭头所指：Brdu阳性细胞从肠隐窝到绒毛迁移的距离）AfterE.colitreatedmicefor30h，Brdupositivecellsweredistributedin1/4ofthevilli，andE.colipositivecellsmigratedtointestinalvilliat2/4comparedwithBrdu.（Thesinglearrow:positivecells;thedoublearrow:Brdupositivecellsmigratefromintestinalcryptstovilli） 38牛源致病性大肠杆菌K99对小鼠肠绒毛生长及ITF和TGF-β1mRNA表达的影响图3-8-E36h空肠上皮细胞的增殖变化(IHC，×400)Fig.3-8-E36hjejunumepithelialcellproliferationchanges(IHC，×400)E.coli作用小鼠36h后，Brdu组阳性细胞在肠绒毛2/4位置分布较多，E.coli组阳性细胞迁移到肠绒毛3/4位置较Brdu组迁移距离较快；（单箭头所指：阳性细胞；双箭头所指：Brdu阳性细胞从肠隐窝到绒毛迁移的距离）AfterE.colitreatedmicefor36hours，theBrdugrouppositivecellsweredistributedmoreintheintestinalvilliatthe2/4location，andtheE.coligrouppositivecellsmigratedtotheintestinalvilliatthe3/4location.ComparedwiththeBrdugroup，themigrationdistancewasfaster.（Thesinglearrow:positivecells;thedoublearrow:Brdupositivecellsmigratefromintestinalcryptstovilli）图3-8-F48h空肠上皮细胞的增殖变化(IHC，×400)Fig.3-8-F48hjejunumepithelialcellproliferationchanges(IHC，×400)E.coli作用小鼠48h后，Brdu组和E.coli组阳性细胞在肠绒毛顶部分布较多，在肠隐窝部位分布较少，阳性细胞的迁移距离相同（单箭头所指：阳性细胞；双箭头所指：Brdu阳性细胞从肠隐窝到绒毛迁移的距离）AfterE.colitreatedmicefor48h，thepositivecellsofBrdugroupandE.coligroupdistributedmoreonthetopofintestinalvilliandlessintheintestinecrypts，andthemigrationdistanceofpositivecellswasthesame.（Thesinglearrow:positivecells;thedoublearrow:Brdupositivecellsmigratefromintestinalcryptstovilli）图3-8-G60h空肠上皮细胞的增殖变化(IHC，×400)Fig.3-8-G60hjejunumepithelialcellproliferationchanges(IHC，×400)E.coli作用小鼠60h后，Brdu组和E.coli组阳性细胞在肠绒毛顶部分布较多，在肠隐窝部位分布较少，阳性细胞的迁移距离相同（单箭头所指：阳性细胞；双箭头所指：Brdu阳性细胞从肠隐窝到绒毛迁移的距离） 内蒙古农业大学硕士学位论文39AfterE.colitreatedmicefor60h，thepositivecellsofBrdugroupandE.coligroupdistributedmoreonthetopofintestinalvilliandlessintheintestinecrypts，andthemigrationdistanceofpositivecellswasthesame.（Thesinglearrow:positivecells;thedoublearrow:Brdupositivecellsmigratefromintestinalcryptstovilli）3.3.2.3E.coli对小鼠回肠上皮细胞的增殖变化回肠空白对照组组织中细胞核呈阴性染色。E.coli作用小鼠6h后Brdu组阳性细胞在肠隐窝底部分布较多，E.coli组阳性细胞较Brdu组迁移距离较快；E.coli作用小鼠12h后Brdu组阳性细胞在肠绒毛基底部分布较多，E.coli组阳性细胞迁移到肠绒毛基底上部较Brdu组距离迁移较快；E.coli作用小鼠24h后Brdu组阳性细胞在肠绒毛基底上部分布较多，E.coli组阳性细胞迁移到肠绒毛1/4位置较Brdu组迁移距离较快；E.coli作用小鼠30h后Brdu组阳性细胞在肠绒毛1/4位置分布较多，E.coli组阳性细胞迁移到肠绒毛2/4位置较Brdu组迁移距离较快；E.coli作用小鼠36h后Brdu组阳性细胞在肠绒毛2/4位置分布较多，E.coli组阳性细胞迁移到肠绒毛3/4位置较Brdu组迁移距离较快；E.coli作用小鼠48h～60hBrdu组和E.coli组阳性细胞的迁移距离相同，60h阳性细胞都迁移到肠绒毛顶部（见图3-9-A～3-9-G）。图3-9-A6h回肠上皮细胞的增殖变化(IHC，×400)Fig.3-9-A6hIleumepithelialcellproliferationchanges(IHC，×400)E.coli作用小鼠6h后，Brdu组阳性细胞在肠隐窝底部分布较多，E.coli组阳性细胞较Brdu组迁移距离较快（单箭头所指：阳性细胞；双箭头所指：Brdu阳性细胞从肠隐窝到绒毛迁移的距离）AfterE.colitreatedmicefor6h，Brdupositivecellsweredistributedmoreatthebottomofintestinalcrypts，andE.coligrouppositivecellsmigratedfasterthanBrdugroup.（Thesinglearrow:positivecells;thedoublearrow:Brdupositivecellsmigratefromintestinalcryptstovilli）图3-9-B12h回肠上皮细胞的增殖变化(IHC，×400)Fig.3-9-B12hIleumepithelialcellproliferationchanges(IHC，×400） 40牛源致病性大肠杆菌K99对小鼠肠绒毛生长及ITF和TGF-β1mRNA表达的影响E.coli作用小鼠12h后，Brdu组阳性细胞在肠绒毛基底部分布较多，E.coli组阳性细胞迁移到肠绒毛基底上部较Brdu组距离迁移较快（单箭头所指：阳性细胞；双箭头所指：Brdu阳性细胞从肠隐窝到绒毛迁移的距离）AfterE.colitreatedmicefor12hours，Brdugrouppositivecellsweremoreinthebasementoftheintestinalvilli，andE.coligrouppositivecellsmigratedtotheupperpartoftheintestinalvillisuperiortotheBrdugroup（Thesinglearrow:positivecells;thedoublearrow:Brdupositivecellsmigratefromintestinalcryptstovilli）图3-9-C24h回肠上皮细胞的增殖变化(IHC，×400)Fig.3-9-C24hIleumepithelialcellproliferationchanges(IHC，×400）E.coli作用小鼠24h后，Brdu组阳性细胞在肠绒毛基底上部分布较多，E.coli组阳性细胞迁移到肠绒毛1/4位置较Brdu组迁移距离较快；（单箭头所指：阳性细胞；双箭头所指：Brdu阳性细胞从肠隐窝到绒毛迁移的距离）AfterE.colitreatedmicefor24h，Brdupositivecellsweredistributedintheupperpartoftheintestinalvilli，andE.colipositivecellsmigratedtothevillus1/4positionfasterthantheBrdugroup.（Thesinglearrow:positivecells;thedoublearrow:Brdupositivecellsmigratefromintestinalcryptstovilli）图3-9-D30h回肠上皮细胞的增殖变化(IHC，×400)Fig.3-9-D30hIleumepithelialcellproliferationchanges(IHC，×400E.coli作用小鼠30h后，Brdu组阳性细胞在肠绒毛1/4位置分布较多，E.coli组阳性细胞迁移到肠绒毛2/4位置较Brdu组迁移距离较快（单箭头所指：阳性细胞；双箭头所指：Brdu阳性细胞从肠隐窝到绒毛迁移的距离）AfterE.colitreatedmicefor30h，Brdupositivecellsweredistributedin1/4ofthevilli，andE.colipositivecellsmigratedtointestinalvilliat2/4comparedwithBrdu.（Thesinglearrow:positivecells;thedoublearrow:Brdupositivecellsmigratefromintestinalcryptstovilli）图3-9-E36h回肠上皮细胞的增殖变化(IHC，×400)Fig.3-9-E36hIleumepithelialcellproliferationchanges(IHC，×400) 内蒙古农业大学硕士学位论文41E.coli作用小鼠36h后，Brdu组阳性细胞在肠绒毛2/4位置分布较多，E.coli组阳性细胞迁移到肠绒毛3/4位置较Brdu组迁移距离较快；（单箭头所指：阳性细胞；双箭头所指：Brdu阳性细胞从肠隐窝到绒毛迁移的距离）AfterE.colitreatedmicefor36hours，theBrdugrouppositivecellsweredistributedmoreintheintestinalvilliatthe2/4location，andtheE.coligrouppositivecellsmigratedtotheintestinalvilliatthe3/4location.ComparedwiththeBrdugroup，themigrationdistancewasfaster.（Thesinglearrow:positivecells;thedoublearrow:Brdupositivecellsmigratefromintestinalcryptstovilli）图3-9-F48h回肠上皮细胞的增殖变化(IHC，×400)Fig.3-9-F48hIleumepithelialcellproliferationchanges(IHC，×400)E.coli作用小鼠48h后，Brdu组和E.coli组阳性细胞在肠绒毛顶部分布较多，在肠隐窝部位分布较少，阳性细胞的迁移距离相同（单箭头所指：阳性细胞；双箭头所指：Brdu阳性细胞从肠隐窝到绒毛迁移的距离）AfterE.colitreatedmicefor48h，thepositivecellsofBrdugroupandE.coligroupdistributedmoreonthetopofintestinalvilliandlessintheintestinecrypts，andthemigrationdistanceofpositivecellswasthesame.（Thesinglearrow:positivecells;thedoublearrow:Brdupositivecellsmigratefromintestinalcryptstovilli）图3-9-G60h回肠上皮细胞的增殖变化(IHC，×400)Fig.3-9-G60hIleumepithelialcellproliferationchanges(IHC，×400)E.coli作用小鼠60h后，Brdu组和E.coli组阳性细胞在肠绒毛顶部分布较多，在肠隐窝部位分布较少，阳性细胞的迁移距离相同（单箭头所指：阳性细胞；双箭头所指：Brdu阳性细胞从肠隐窝到绒毛迁移的距离）AfterE.colitreatedmicefor60h，thepositivecellsofBrdugroupandE.coligroupdistributedmoreonthetopofintestinalvilliandlessintheintestinecrypts，andthemigrationdistanceofpositivecellswasthesame.（Thesinglearrow:positivecells;thedoublearrow:Brdupositivecellsmigratefromintestinalcryptstovilli）3.3.2.4Brdu阳性细胞在十二指肠、空肠、回肠绒毛上皮细胞的迁移距离 42牛源致病性大肠杆菌K99对小鼠肠绒毛生长及ITF和TGF-β1mRNA表达的影响经免疫组化方法统计分析了阳性细胞于十二指肠、空肠、回肠从6h～60h的迁移距离：在6h～36h十二指肠、空肠、回肠绒毛上皮细胞中，E.coliK99感染组阳性细胞的移动距离较Brdu组极显著（p<0.01），在48h～60hE.coliK99感染组阳性细胞的移动距离较Brdu组无显著变化（p>0.05）（见图3-10-A～3-10-C）。图3-10在不同作用时间点Brdu阳性上皮细胞的迁移距离Fig.3-10MigrationdistanceofBrdupositiveepithelialcellsatdifferenttimepointsofaction 内蒙古农业大学硕士学位论文43A、B、C分别是十二指肠、空肠、回肠绒毛上皮细胞Brdu阳性信号迁移的长度A，B，Carelengthchangesofduodenal，jejunum，andileumvillipositiveepithelialcellmigration，respectively.注：**.p＜0.01较空白对照组、Brdu组**.p＜0.01comparedwithcontrol3.3.2.5小结牛源致病性E.coli感染小鼠后，能够促进小肠绒毛上皮细胞的生长。3.3.3PAS染色结果3.3.3.1E.coli对小鼠十二指肠绒毛杯状细胞数的变化十二指肠中绒毛杯状细胞数6h～60h各时间点E.coli感染组均显著低于空白对照组和Brdu组(p<0.01)，且12h～24h持续降低，30h～60h逐渐升高（见图3-11-A～3-11-G）。图3-11-A6h十二指肠绒毛杯状细胞数变化(PAS，×200)Fig.3-11-A6hchangesinduodenalvillousgobletcells(PAS，×200)6h-E.coli组杯状细胞数量较空白对照组和Brdu组明显减少（箭头所指）Thenumberofgobletcellsinthe6h-E.coligroupwassignificantlylowerthanthatintheblankcontrolgroupandtheBrdugroup(Arrows)图3-11-B12h十二指肠绒毛杯状细胞数变化(PAS，×200)Fig.3-11-B12hchangesinduodenalvillousgobletcells(PAS，×200)12h-E.coli组杯状细胞数量较空白对照组和Brdu组明显减少（箭头所指）Thenumberofgobletcellsinthe12h-E.coligroupwassignificantlylowerthanthatintheblankcontrolgroupandtheBrdugroup(Arrows) 44牛源致病性大肠杆菌K99对小鼠肠绒毛生长及ITF和TGF-β1mRNA表达的影响图3-11-C24h十二指肠绒毛杯状细胞数变化(PAS，×200)Fig.3-11-C24hchangesinduodenalvillousgobletcells(PAS，×200)24h-E.coli组杯状细胞数量较空白对照组和Brdu组明显减少（箭头所指）Thenumberofgobletcellsinthe24h-E.coligroupwassignificantlylowerthanthatintheblankcontrolgroupandtheBrdugroup(Arrows)图3-11-D30h十二指肠绒毛杯状细胞数变化(PAS，×200)Fig.3-11-D30hchangesinduodenalvillousgobletcells(PAS，×200)30h-E.coli组杯状细胞数量较空白对照组和Brdu组明显减少（箭头所指）Thenumberofgobletcellsinthe30h-E.coligroupwassignificantlylowerthanthatintheblankcontrolgroupandtheBrdugroup(Arrows)图3-11-E36h十二指肠绒毛杯状细胞数变化(PAS，×200)Fig.3-11-E36hchangesinduodenalvillousgobletcells(PAS，×200)36h-E.coli组杯状细胞数量较空白对照组和Brdu组明显减少（箭头所指）Thenumberofgobletcellsinthe36h-E.coligroupwassignificantlylowerthanthatintheblankcontrolgroupandtheBrdugroup(Arrows) 内蒙古农业大学硕士学位论文45图3-11-F48h十二指肠绒毛杯状细胞数变化(PAS，×200)Fig.3-11-F48hchangesinduodenalvillousgobletcells(PAS，×200)48h-E.coli组与空白对照组和Brdu组杯状细胞数量相当（箭头所指）Thenumberofgobletcellsinthe48h-E.coligroupwassimilartothatoftheblankcontrolgroupandtheBrdugroup(Arrows)图3-11-G60h十二指肠绒毛杯状细胞数变化(PAS，×200)Fig.3-11-G60hchangesinduodenalvillousgobletcells(PAS，×200)60h-E.coli组与空白对照组和Brdu组杯状细胞数量相当（箭头所指）Thenumberofgobletcellsinthe60h-E.coligroupwassimilartothatoftheblankcontrolgroupandtheBrdugroup(Arrows)3.3.3.2E.coli对小鼠空肠绒毛杯状细胞数的变化空肠中绒毛杯状细胞数6h～60h各时间点E.coli感染组均显著低于空白对照组和Brdu组(p<0.01)，且12h～24h持续降低，30h～60h逐渐升高（图3-12-A～G）。图3-12-A6h空肠绒毛杯状细胞数变化(PAS，×200)Fig.3-12-A6hchangesinjejunumvillousgobletcells(PAS，×200)6h-E.coli组杯状细胞数量较空白对照组和Brdu组明显减少（箭头所指）Thenumberofgobletcellsinthe6h-E.coligroupwassignificantlylowerthanthatintheblankcontrolgroupandtheBrdugroup(Arrows) 46牛源致病性大肠杆菌K99对小鼠肠绒毛生长及ITF和TGF-β1mRNA表达的影响图3-12-B12h空肠绒毛杯状细胞数变化(PAS，×200)Fig.3-12-B12hchangesinjejunumvillousgobletcells(PAS，×200)12h-E.coli组杯状细胞数量较空白对照组和Brdu组明显减少（箭头所指）Thenumberofgobletcellsinthe12h-E.coligroupwassignificantlylowerthanthatintheblankcontrolgroupandtheBrdugroup(Arrows)图3-12-C24h空肠绒毛杯状细胞数变化(PAS，×200)Fig.3-12-C24hchangesinjejunumvillousgobletcells(PAS，×200)24h-E.coli组杯状细胞数量较空白对照组和Brdu组明显减少（箭头所指）Thenumberofgobletcellsinthe24h-E.coligroupwassignificantlylowerthanthatintheblankcontrolgroupandtheBrdugroup(Arrows)图3-12-D30h空肠绒毛杯状细胞数变化(PAS，×200)Fig.3-12-D30hchangesinjejunumvillousgobletcells(PAS，×200)30h-E.coli组杯状细胞数量较空白对照组和Brdu组明显减少（箭头所指）Thenumberofgobletcellsinthe30h-E.coligroupwassignificantlylowerthanthatintheblankcontrolgroupandtheBrdugroup(Arrow) 内蒙古农业大学硕士学位论文47图3-12-E36h空肠绒毛杯状细胞数变化(PAS，×200)Fig.3-12-E36hchangesinjejunumvillousgobletcells(PAS，×200)36h-E.coli组杯状细胞数量较空白对照组和Brdu组明显减少（箭头所指）Thenumberofgobletcellsinthe36h-E.coligroupwassignificantlylowerthanthatintheblankcontrolgroupandtheBrdugroup(Arrows)图3-12-F48h空肠绒毛杯状细胞数变化(PAS，×200)Fig.3-12-F48hchangesinjejunumvillousgobletcells(PAS，×200)48h-E.coli组与空白对照组和Brdu组杯状细胞数量相当（箭头所指）Thenumberofgobletcellsinthe48h-E.coligroupwassimilartothatoftheblankcontrolgroupandtheBrdugroup(Arrows)图2-11-G60h空肠绒毛杯状细胞数变化(PAS，×200)Fig.3-12-G60hchangesinjejunumvillousgobletcells(PAS，×200)60h-E.coli组与空白对照组和Brdu组杯状细胞数量相当（箭头所指）Thenumberofgobletcellsinthe60h-E.coligroupwassimilartothatoftheblankcontrolgroupandtheBrdugroup(Arrows)3.3.3.3E.coli对小鼠回肠绒毛杯状细胞数的变化回肠中绒毛杯状细胞数6h～60h各时间点E.coli感染组均显著低于空白对照组和Brdu组(p<0.01)，且12h～24h持续降低，30h～60h逐渐升高（图3-13-A～G）。 48牛源致病性大肠杆菌K99对小鼠肠绒毛生长及ITF和TGF-β1mRNA表达的影响图3-13-A6h回肠绒毛杯状细胞数变化(PAS，×200)Fig.3-13-A6hchangesinileumvillousgobletcells(PAS，×200)6h-E.coli组与空白对照组和Brdu组杯状细胞数量相当（箭头所指）Thenumberofgobletcellsinthe6h-E.coligroupwassimilartothatoftheblankcontrolgroupandtheBrdugroup(Arrows）图3-13-B12h回肠绒毛杯状细胞数变化(PAS，×200)Fig.3-13-B12hchangesinileumvillousgobletcells(PAS，×200)12h-E.coli组杯状细胞数量较空白对照组和Brdu组明显减少（箭头所指）Thenumberofgobletcellsinthe12h-E.coligroupwassignificantlylowerthanthatintheblankcontrolgroupandtheBrdugroup(Arrows)图3-13-C24h回肠绒毛杯状细胞数变化(PAS，×200)Fig.3-13-C24hchangesinileumvillousgobletcells(PAS，×200)24h-E.coli组杯状细胞数量较空白对照组和Brdu组明显减少（箭头所指）Thenumberofgobletcellsinthe24h-E.coligroupwassignificantlylowerthanthatintheblankcontrolgroupandtheBrdugroup(Arrows) 内蒙古农业大学硕士学位论文49图3-13-D30h回肠绒毛杯状细胞数变化(PAS，×200)Fig.3-13-D30hchangesinileumvillousgobletcells(PAS，×200)30h-E.coli组杯状细胞数量较空白对照组和Brdu组明显减少（箭头所指）Thenumberofgobletcellsinthe30h-E.coligroupwassignificantlylowerthanthatintheblankcontrolgroupandtheBrdugroup(Arrows)图3-13-E36h回肠绒毛杯状细胞数变化(PAS，×200)Fig.3-13-E36hchangesinileumvillousgobletcells(PAS，×200)36h-E.coli组杯状细胞数量较空白对照组和Brdu组明显减少（箭头所指）Thenumberofgobletcellsinthe36h-E.coligroupwassignificantlylowerthanthatintheblankcontrolgroupandtheBrdugroup(Arrows)图3-13-F48h回肠绒毛杯状细胞数变化(PAS，×200)Fig.3-13-F48hchangesinileumvillousgobletcells(PAS，×200)48h-E.coli组与空白对照组和Brdu组杯状细胞数量相当（箭头所指）Thenumberofgobletcellsinthe48h-E.coligroupwassimilartothatoftheblankcontrolgroupandtheBrdugroup(Arrows)图3-13-G60h回肠绒毛杯状细胞数变化(PAS，×200)Fig.3-13-G60hchangesinileumvillousgobletcells(PAS，×200) 50牛源致病性大肠杆菌K99对小鼠肠绒毛生长及ITF和TGF-β1mRNA表达的影响60h-E.coli组与空白对照组和Brdu组杯状细胞数量相当（箭头所指）Thenumberofgobletcellsinthe60h-E.coligroupwassimilartothatoftheblankcontrolgroupandtheBrdugroup(Arrows)3.3.3.4E.coli对小鼠不同时间十二指肠、空肠、回肠杯状细胞数量的影响试验表明:(1)十二指肠、空肠、回肠中的杯状细胞数量在6h～60h各时间点E.coli感染组均显著低于空白对照组和Brdu组(p<0.01)，且12h～24h杯状细胞数量持续降低，30h～60h杯状细胞数量逐渐升高。(2)不同肠段之间杯状细胞的数量差异极显著(p<0.01)，其中回肠杯状细胞数量最多，空肠次之，十二指肠杯状细胞数量最少。（图3-14）图3-14不同时间点E.coli对小鼠十二指肠、空肠、回肠杯状细胞数量的影响Fig.3-14EffectofE.colionmouseduodenum，jejunumandileumgobletcellsatdifferenttimepointsA、B、C分别是十二指肠、空肠、回肠杯状细胞数A，B，Carelengthchangesofduodenal，jejunum，andileumvillipositiveepithelialcellmigration，respectively注：*.p＜0.05较空白对照组、Brdu组；**.p＜0.01较空白对照组、Brdu组 内蒙古农业大学硕士学位论文513.3.3.5小结牛源致病性E.coli感染小鼠后，可以抑制杯状细胞数量。3.3.4ITF、TGFβ1mRNA的表达检测3.3.4.1β-action、ITF及TGFβ1mRNA扩增曲线和溶解曲线将制备好的cDNA（50ng/μL）用反转录试剂盒中的EASYDilution按5倍进行梯度稀释，以β-action为内参，以等量不同稀释倍数的cDNA为模板平行扩增ITF和TGFβ1，结果显示，溶解曲线峰单一，无杂峰，各组的起峰时间一致，因此所得结果稳定（见图3-15）。图3-15β-action、ITF、TGFβ1RT-PCR扩增曲线和溶解曲线Fig.3-15RT-PCRamplificationcurvesanddissolutioncurvesofβ-action，ITF，andTGFβ1A、C、B分别是β-action、ITF、TGFβ1RT-PCR扩增曲线和溶解曲线A，CandBareRT-PCRamplificationcurvesanddissolutioncurvesofβ-action，ITFandTGFβ1，respectively3.3.4.2引物特异性结果 52牛源致病性大肠杆菌K99对小鼠肠绒毛生长及ITF和TGF-β1mRNA表达的影响应用2%的琼脂糖凝胶对荧光定量PCR产物作电泳检测，结果显示：qRT-PCR扩增产物条带单一，无非特异性条带，且产物片段大小与预计产物大小相一致（见图3-16、图3-17）。图3-16β-actin和ITF的RT-PCR扩增产物电泳结果Fig.3-16ElectrophoresisofRT-PCRamplificationproductsofβ-actinandITF注：M.DNA标准DL500DNA；1、2.阴性对照；3、4．β-actin；5、6.ITF图3-17β-actin和TGF-β1的RT-PCR扩增产物电泳结果Fig.3-17ElectrophoresisofRT-PCRamplificationproductsofβ-actinandTGF-β1注：MDNA标准DL500DNA；1、2.阴性对照；3、4．β-actin；5、6．TGF-β13.3.4.3ITFmRNA在肠组织的表达E.coli感染十二指肠、空肠、回肠肠组织，结果显示，E.coli在6h～36h均可以显著抑制十二指肠、空肠、回肠ITFmRNA的表达（p<0.01），24h感染组ITFmRNA的表达量降到最低后开始上升（p>0.05）（见图3-18）。 内蒙古农业大学硕士学位论文53图3-18在不同作用时间点E.coli对小鼠十二指肠、空肠、回肠ITFmRNA相对表达量的影响Fig.3-18EffectofE.colionrelativeexpressionofITFmRNAinmiceduodenum，jejunumandileumatdifferenttimepoints 54牛源致病性大肠杆菌K99对小鼠肠绒毛生长及ITF和TGF-β1mRNA表达的影响A、B、C分别是十二指肠、空肠、回肠ITFmRNA相对表达量A，B，CaretherelativeexpressionofITFmRNAinduodenum，jejunumandileum，respectively.注：*.（P＜0.05）较空白对照组、Brdu组；**.p＜0.01较空白对照组、Brdu组3.3.4.4TGF-β1mRNA在肠组织的表达E.coli感染十二指肠肠组织，结果显示，E.coli在6h～30h均可以显著促进十二指肠TGF-β1mRNA的表达（p<0.01），24h感染组TGF-β1mRNA的表达量达到最高后开始下降（p>0.05）（见图3-19-A）。E.coli感染空肠肠组织，结果显示，E.coli在不同时间点（6h、24h、30h）均可以显著促进空肠TGF-β1mRNA的表达（p<0.01），24h感染组TGF-β1mRNA的表达量达到最高后开始下降（p>0.05）（见图3-19-B）。E.coli感染回肠肠组织，结果显示，E.coli在30h可以显著促进回肠TGF-β1mRNA的表达（p<0.01），30h感染组TGF-β1mRNA的表达量达到最高后开始下降（p>0.05）（见图3-19-C）。 内蒙古农业大学硕士学位论文55图3-19不同作用时间点E.coli对小鼠十二指肠、空肠、回肠TGF-β1mRNA相对表达量的影响Fig.3-19EffectofE.colionrelativeexpressionofTGF-β1mRNAinmiceduodenum，jejunumandileumatdifferenttimepointsA、B、C分别是十二指肠、空肠、回肠TGF-β1mRNA相对表达量A，B，CaretherelativeexpressionofTGF-β1mRNAinduodenum，jejunumandileum，respectively.注：*.P＜0.05较空白对照组、Brdu组；**.p＜0.01较空白对照组、Brdu组3.3.4.5小结牛源致病性E.coli感染小鼠后，既可以促进小肠绒毛上皮细胞TGF-β1mRNA的表达；也能够抑制小肠黏膜上皮细胞ITFmRNA的表达。 56牛源致病性大肠杆菌K99对小鼠肠绒毛生长及ITF和TGF-β1mRNA表达的影响4讨论4.1小鼠肠道损伤模型的建立目前小鼠是实验室最常用的动物，价格便宜，饲养管理较方便，且易于控制，所以是建立致病性大肠杆菌K99感染模型的首选动物[147]。近年来，国内外有很多报道关于利用小鼠建立动物模型，研究大肠杆菌致肠道炎症、溃疡性结肠炎、坏死性肠炎、肠道肿瘤疾病和大肠杆菌病等，绝大部分报道都是利用腹腔注射方法来建立动物模型[148-149]，而本实验牛源致病性大肠杆菌K99感染途径以消化道感染为主，所以本实验利用灌胃法建立大肠杆菌感染小鼠模型，对探讨肠道组织损伤更具有研究价值。4.2牛源致病性大肠杆菌K99对小鼠肠道组织形态学及病理变化的影响小肠的正常结构与功能是营养物质被充分消化与吸收的基本保证，特别是小肠的肠绒毛长度和隐窝深度是衡量小肠消化吸收功能的重要指标[150-151]。肠绒毛长度与隐窝深度呈显著相关，当肠绒毛变短时，肠隐窝深度相应变深，对营养物质的吸收能力将降低。而本实验致病性大肠杆菌K99在体内产生的内毒素、肠毒素、大肠杆菌毒素V等毒力因子造成了小鼠肠内容物的排空、黏液的分泌流动、黏膜上皮细胞不断脱落、微绒毛运动等生理机能不断清除相应部位的细菌，使致病性大肠杆菌成为优势菌群[152-153]。即：大肠杆菌其致病性主要依靠其紧密连接黏附于肠上皮细胞，导致微绒毛的损伤和柱状上皮细胞损害，造成细胞膜通透性增强，从而引起肠道炎症和相关疾病的产生。有研究报道致病性E.coli是引起动物肠道组织损伤、肠炎的常见病原菌，其中E.coliK99多引起犊牛和羔羊发病[154]。本实验主要从病理形态学上对牛源致病性大肠杆菌K99感染小鼠肠道组织的影响进行进一步研究，通过病理切片光学显微镜可观察到，攻菌后6ｈ～60h，空白对照组和Brdu组十二指肠和空肠肠绒毛结构完整，层次分明，肠黏膜上皮细胞的轮廓清晰，染色鲜明，排列规则无较明显病变，肠绒毛排列较整齐；攻菌后6ｈ，E.coli组肠绒毛顶部有少量轻微的上皮细胞开始脱落；攻菌后12ｈ，E.coli肠绒毛顶端脱落、损坏严重，部分绒毛萎缩）；攻菌后24ｈ，E.coli组肠绒毛脱落严重，脱落的黏膜和坏死细胞掉落在肠腔内与杯状细胞分泌的黏液，因此在24ｈ剖开的十二指肠、空肠内有大量黏稠分泌物，光学显微镜下也可观察到此时肠绒毛排列紊乱，部分肠绒毛脱落崩解；攻菌后30ｈ，E.coli组肠绒毛大量损伤、脱落、萎缩；攻菌后36ｈ，E.coli组可观察到绒毛顶端脱落损伤严重，部分绒毛萎缩；攻菌后48ｈ～60h，E.coli组肠绒毛组织形态结构恢复正常，水肿等症状消失。而回肠在6ｈ～60h，空白对照组、Brdu、E.coli组无明显变化。表明牛源致病性大肠杆菌K99在小肠的近段影响较大，加快了肠黏膜上皮细胞脱落萎缩，导致十二指肠和空肠肠绒毛明显变短。但在回肠影响不明显，也许是牛源致病性大肠杆菌K99在小肠近 内蒙古农业大学硕士学位论文57段被消化吸收的较快，对回肠的刺激较小。而十二指肠和空肠肠隐窝在E.coli组有所增加是为了补充脱落的上皮细胞，机体调节肠隐窝上皮细胞的增殖和分化。研究肠黏膜的损伤与修复情况，有助于从微观方面观察致病性大肠杆菌K99对小鼠肠道组织形态学的影响。本实验与曹玲芝等[155]使用四君子汤来治疗大肠杆菌腹泻小鼠的研究相比，其腹泻组的病变与本次实验肠道病变结果相似，大肠杆菌造成肠黏膜上皮细胞的损伤，与其病理织学变化中小肠肠绒毛脱落，肠隐窝深度变深结果相一致。而本实验中E.coli组在48ｈ时十二指肠、空肠肠绒毛排列整齐，绒毛形态和长度开始恢复到正常与曹玲芝等在48h绒毛顶端还有部分肠绒毛脱落，肠绒毛排列紊乱等症状不同，可能由于致病菌的血清型因素、肠组织损伤程度和检测时间等不同有关。本实验结果说明，在E.coli组感染初期，致病性E.coliK99可促进细胞坏死、紧密连接疏松、上皮细胞损伤、绒毛脱落等变化，与Qureshi等[156]和Seifarth等[157]的研究结果基本一致。通过感染致病性E.coli，对小鼠进行病理组织学研究，可以了解致病性E.coli感染能引起机体的形态结构变化，以及这些结构病变与临床表现间的关系，对掌握牛源肠道致病性大肠杆菌病的本质，及大肠杆菌病的致病机理、诊断、预防和治疗奠定了基础。4.3E.coli感染小鼠后对肠组织中Brdu阳性细胞迁移距离的影响长期以来，氚标记的胸腺嘧啶(3H-TdR)常用于细胞动力学的研究，但由于3H-TdR有放射性，限制了对其的应用。自1982年Gratzner[158]发现5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)与胸腺嘧啶(3H-TdR)具有结构的相似性，能代替胸腺嘧啶渗人S期细胞新合成的DNA链内，且3H-TdR和Brdu所标记的S期细胞结果完全一致，而Brdu具有省时、简便、重复性好和无放射性等优点，能够更好地利用Brdu单抗标记研究细胞动力学的技术，大大拓宽了对遗传物质结构、功能研究的领域。我们利用该方法检测牛源致病性大肠杆菌K99所致肠道功能紊乱模型小鼠小肠黏膜细胞的增殖能力，为揭示肠道功能紊乱的本质提供客观依据。本实验通过对实验小鼠注射细胞增殖标识剂Brdu，应用免疫组化染色观察细胞迁移距离，结果发现E.coliK99感染组于6h～36h十二指肠、空肠、回肠绒毛中细胞迁移比Brdu组快。经Brdu标记的处于S期的细胞，体积明显大于其它细胞，胞质丰富，核浓染，呈颗粒状，核浆比例大。细胞吸收Brdu后，核膜、核内染色质核仁均有阳性反应。本实验结果发现被标记的呈深棕色或棕黄色的阳性细胞主要位于小肠腺的基底部，散在于其它细胞之间。这些Brdu阳性细胞不断增殖、分化、向上迁移，以补充胃肠上皮损伤脱落的细胞，与何荣根等[159]报道的结果相一致。本结果清楚的显示十二指肠、空肠、回肠黏膜上皮的Brdu阳性细胞主要位于肠腺内。DeFazio等[160]观察到肠腺被标记的Brdu阳性细胞在48h后开始向绒毛上皮移动，3d后3/4的绒毛上皮细胞呈 58牛源致病性大肠杆菌K99对小鼠肠绒毛生长及ITF和TGF-β1mRNA表达的影响Bdru阳性；然而本实验观察到注射Brdu后6h十二指肠、空肠、回肠见Brdu阳性细胞向绒毛上皮方向移动，到48h后空肠Brdu阳性细胞已经迁移到绒毛顶端，在60h后十二指肠和回肠Brdu阳性细胞也已经迁移到绒毛顶端，与DeFazio等在48h后Brdu阳性细胞才开始向绒毛上皮移动等结果不同，可能由于致病菌的血清型因素、肠组织损伤程度、检测时间等不同有关。姚永莉等[161]曾报道胃肠道功能紊乱模型大鼠胃肠道黏膜细胞的增殖能力处于受抑制状态，明显弱于正常组，自然恢复组大鼠胃肠道黏膜细胞的增殖能力虽有一定程度的改善，但明显不如中药治疗组大鼠胃肠道黏膜细胞增殖活跃，即在胃肠道功能紊乱时胃肠道黏膜细胞增殖能力低下与本实验结果发现E.coliK99感染组于6h～36h十二指肠、空肠、回肠绒毛中阳性细胞迁移比空白对照组快略有不同，可能由于所选鼠的种类、致病菌血清型因素、肠组织损伤程度、用药等不同有关。SukhotnikI等[162]的研究表明，致病性E.coliK99使感染动物肠黏膜受损，肠绒毛减少，细胞增殖迁移距离明显增加，这与本实验结果较一致。细胞迁移是肠黏膜受损后早期修复的关键过程，损伤区域周边细胞迁移到损伤部位，重建上皮的完整性和黏膜屏障[163]。孙勇[164]等研究腺病毒介导人ITF基因对肠上皮细胞的影响，表明腺病毒载体对肠上皮细胞具有促迁移作用，与本实验结果相似。对溃疡性结肠炎的研究表明[165]，双歧杆菌、脆弱拟杆菌卵形拟杆菌、粪链球菌将细菌内毒素控制在一定范围，有利于肠道损伤的修复与愈合。本实验在致病性大肠杆菌对肠道损伤的动物模型基础上，通过应用Brdu标记阳性细胞在小鼠肠黏膜上皮细胞生长发育过程中迁移距离速度快慢的探索，进而研究Brdu阳性细胞对小鼠肠黏膜上皮细胞增殖的影响，以探索E.coli组在十二指肠、空肠、回肠组织中Brdu阳性细胞在6h～36h迁移距离比空白对照组、Brdu组极显著。说明在E.coli组Brdu阳性细胞迁移有所增加是为了补充脱落的上皮细胞，机体开始调节肠黏膜上皮细胞的增殖和分化形成的机制。为探索应用新的方法进行肠道损伤的诊断和治疗提供理论及实验基础，最终达到预防肠道炎症发生的目的。4.4E.coli感染小鼠后对肠道杯状细胞组织结构的影响正常肠道的功能依赖于肠道黏膜上皮机械屏障、免疫屏障、生物屏障的完整性来维持。致病性大肠杆菌感染，会导致小鼠肠道屏障功能受损，表现为肠道黏膜形态结构改变、肠上皮屏障通透性增加、消化吸收功能降低、肠道pH升高、免疫抑制及肠道微生物菌群失衡等。黏膜上皮细胞及其连接结构是肠黏膜机械屏障的主要组成部分，肠黏膜的绒毛长度、隐窝深度、杯状细胞数是衡量黏膜完整性的重要指标[166]。有研究表明，杯状细胞可能在肠黏膜损伤后的重建过程中起关键作用[167]。本研究表明，十二指肠、空肠、回肠杯状细胞6h～60h各时间点E.coliK99感染组均显著低于对照组，且12h～24h持续降低，30h～60h逐渐升高。杯状细胞的数量减少，说 内蒙古农业大学硕士学位论文59明E.coliK99可使杯状细胞损伤，从而影响肠黏膜屏障结构。本试验研究致病性大肠杆菌感染小鼠与正常小鼠小肠上皮杯状细胞数量的差异，以探讨E.coli对小鼠肠道黏膜免疫的影响。肠组织杯状细胞是一种典型的糖蛋白分泌细胞，其分泌的黏蛋白分布于绒毛上皮细胞表面，在一定程度上可通过粘附作用，阻挡病原生物和有害物质的正面破坏，阻止毒素与上皮细胞接触，对上皮细胞有保护作用[168]。小肠上皮内的杯状细胞在抗感染调节上皮细胞的完整性和外来抗原的免疫应答等方面起重要作用[169]，其肠组织杯状细胞数量的变化可以在一定程度上反应消化道的局部免疫状况[170]。本研究应用PAS染色法对十二指肠近端、空肠中部、回肠末端制作的细胞切片的杯状细胞的形态和数量进行分析。图像显示PAS染色中，肠组织杯状细胞被染成深粉色，呈高脚杯状，核靠近基底侧显深蓝色。肠组织杯状细胞散在分布于柱状细胞之间，一般靠近肠腺部位集中分布，排列紧密，靠近绒毛顶端的杯状细胞较少，呈散在分布。本实验结果表明：E.coli感染小鼠对小肠黏膜形态及小肠杯状细胞数量有影响。E.coli感染小鼠，会损伤小肠黏膜形态同时能减少小鼠小肠上皮杯状细胞的数量。因此，本研究观察，进一步为E.coli感染小鼠对肠道损伤及肠组织杯状细胞数量减少提供数据支持。对于小肠中杯状细胞在回肠和空肠分布较多，在十二指肠分布较少，具体原因还有待进一步研究。4.5E.coli感染小鼠后对肠道ITFmRNA表达的影响本研究表明，空白对照组小鼠十二指肠的ITFmRNA表达量最高，空肠、回肠次之，这与Amiranoff等[171]的研究结果较一致。E.coliK99感染小鼠，在感染后6h～36h肠黏膜ITFmRNA表达下调，在48h～60h肠黏膜ITFmRNA的表达逐渐上调且与对照组无显著差异。RenesIB[172]等报道，ITFmRNA对黏膜的修复作用是在损伤一段时间后开始；TaupinD[173]等用醋酸诱导的大鼠、小鼠结肠炎，在炎症的急性期ITF表达下调，张萌[174]等探讨脓毒症大鼠肠道ITFmRNA表达的变化，发现ITFmRNA表达在脓毒症模型建立后3h即显著下降。上述相关研究报道与本实验小鼠感染E.coliK99ITFmRNA表达量的变化规律基本相似。许玲芬[175]等对人和鼠的研究发现，ITF在肠黏膜上皮损伤后表达量会急速上调，与本研究结果不同，可能与致病因素、肠组织损伤程度、检测时间等不同有关。本实验结果表明，致病性E.coli可以使小鼠肠组织改变，E.coli感染组ITFmRNA表达量下调与杯状细胞数的减少可能有一定的关系。梁凯[176]等研究非酒精性脂肪性肝炎大鼠肠道黏液屏障改变，探讨ITF对NASH大鼠肠道黏液屏障的影响，发现模型组回肠末端上皮细胞坏死、肠绒毛损伤脱落、杯状细胞明显减少、ITF表达下调，与本实验结果基本一致。王帅[177]等观察三黄汤灌肠方对溃疡性结肠炎急性期模型大鼠的治疗作用及其对结肠组织表皮生 60牛源致病性大肠杆菌K99对小鼠肠绒毛生长及ITF和TGF-β1mRNA表达的影响长因子(Epidermalgrowthfactor，EGF)、ITF的影响，表明模型组结肠ITF水平显著低于正常组，与本实验结果相似。本研究结果表明，E.coliK99感染小鼠在6h～36h十二指肠、空肠、回肠绒毛上皮细胞的生长速度与对照组比较极显著增加，但ITFmRNA表达量与对照组比较明显下调，二者的变化趋势并不一致，其机理有待进一步的研究。4.6E.coli感染小鼠后肠组织TGF-β1mRNA表达的影响TGF-β1是一族具有多种功能的蛋白多肽，具有抗炎、调节细胞增殖分化及加强上皮修复等功能[178]。TGF-β1在消化道炎性病灶中可诱导巨噬细胞活化，使中性粒细胞、淋巴细胞等聚集，限制炎症的扩散。还可以促进单核细胞、巨噬细胞等释放炎症因子发生继发作用，加重局部炎症反应[179]。在我们的实验研究中发现，E.coli感染组于6h～30h，十二指肠组织中TGF-β1mRNA的表达量升高，其中24hTGF-β1mRNA的表达量达最高；然而在空肠组织中E.coli感染组TGF-β1mRNA的表达量于6h、24h、30h表达上调，其中24hTGF-β1mRNA的表达量上调到最高；在回肠组织中E.coli感染组TGF-β1mRNA的表达量于30h达到最高。说明TGF-β1的表达量在十二指肠中随时间的延长而逐渐升高，24h达到最高峰，以后则逐渐下降。可见致病性大肠杆菌致肠道损伤后，胞体内TGF-β1的高表达是机体自身的保护反应，降低致病性大肠杆菌对肠道的损害，为肠道的再生和功能恢复提供了前提条件；此结果与巩丹等[180]研究TGF-β信号通路及其在鸡肠道损伤中的作用中报道，E.coli组雏鸡空肠在12hTGF-β1mRNA的表达量显著上升相类似。韩天宇等[181]报道急、慢性挤压伤后感觉神经元内TGF-β1的表达及其在周围神经损伤、修复过程中作用机制的研究，条件损伤组在各时间点再生的长度明显快于非条件损伤组，且两组TGF-β1mRNA表达均逐渐升高，伤后第五天达到高峰，且两组存在显著差异，其证实TGF-β1可抑制细胞内钙离子浓度变化，抗细胞调亡，且具有维持神经肠道形状和结构稳定性，保护肠道免受损伤的作用，其结果与本实验结果相类似。相关研究发现TGF-β1在受损肠道中会出现异常表达。吕朝辉[182]在冷应激可以诱导鸡十二指肠的损伤机制的研究发现，在急性和慢性冷应激条件下，肉仔鸡十二指肠中TGF-β1的表达出现了先升后降的趋势，这表明TGF-β1在冷应激的初期表现出了促炎的作用，在冷应激的后期，则因为炎症症状的缓解，其表达开始下降，与本实验中E.coli感染组TGF-β1的表达量在十二指肠中随时间的延长先升高后降低的结果相一致。解广东等[183]实验结果表明，在结直肠癌组织中TGF-β1表达水平明显高于正常癌旁组织，复发者TGF-β1表达水平亦明显高于未复发者，且复发者癌组织TGF-β1水平也明显高于未复发者，说明结直肠癌组织通过上调TGF-β1表达而抑制机体的免疫功能。TGF-β1是双向性的生长因子，所以在肠道生长发育和损伤修复过程中对肠道各细胞的调节作用是不同的。 内蒙古农业大学硕士学位论文61TGF-β1的表达既是一种保护措施，可促进肠道细胞增殖与再生，又可促进胶原的分泌，形成瘢痕[184]。Spurgeon等[185]报道在心脑肾等多种器官损伤恢复过程中TGF-β1表达逐渐升高，因其在损伤发生的同时，机体也启动了其内源性保护机制，并且心脑肾等多种器官损伤的发生可能与内源性TGF-β1表达不足有关与本实验结果相类似。近年来TGF-β1对肠道损伤的保护研究主要集中在炎性疾病方面。TGF-β1能抑制炎症因子上游调控基因干扰素γ(IFN-γ)的转录，抑制IL-6信号传导通路，从而抑制肠道炎症，对肠黏膜屏障具有保护作用[186]。Ramesh等[187]在体外肠黏膜组织细胞培养中发现外源性TGF-β1可以通过丝裂原活化蛋白激酶上调上皮细胞紧密连接蛋白表达，保护跨膜电位平衡，加固肠黏膜屏障，阻断大肠杆菌引起的肠黏膜炎症及通透性增加；该研究结果显示TGF-β1预处理可预防小肠上皮组织结构的损伤，对肠黏膜形态和功能均有保护作用。肠黏膜损伤致绒毛顶端上皮脱落，肠黏膜通透性增加，肠道细菌及代谢产物可通过其旁路途径入血。综上所述，TGF-β1可以减轻小肠上皮细胞的损伤，在临床监测与防治肠黏膜屏障损伤及肠源性提供了理论依据。但影响肠黏膜上皮细胞损伤的机制很多。而TGF-β1具体通过何种机制减轻肠黏膜上皮细胞的损伤尚待进一步研究。 62牛源致病性大肠杆菌K99对小鼠肠绒毛生长及ITF和TGF-β1mRNA表达的影响5全文结论5.1牛源致病性E.coli感染小鼠后，可以引起小肠黏膜上皮细胞的损伤和抑制杯状细胞数量及ITFmRNA的表达。5.2牛源致病性E.coli感染小鼠后，能够促进小肠绒毛上皮细胞的生长和TGF-β1mRNA的表达。 内蒙古农业大学硕士学位论文63致谢回首在农大的七年岁月里，完成了本科、研究生期间的学习。时光荏苒、光阴似箭，毕业将至，心却有些许的不舍。母校伴我度过人生中最重要的7年，我坚信在未来步入社会的日子里，自己将更加努力，同时也希望母校更加繁盛。感谢导师王凤龙教授三年以来的培养和关怀。谢谢王老师在我生活和学习上的帮助，导师治学严谨的态度、持之以恒的精神值得我辈终身学习。整个实验自始至终都凝结着他渊博的知识和辛勤的汗水。他精益求精的工作态度、渊博的专业知识、丰富的科研经验、严谨的学风和忘我的工作热情是我终身学习的榜样。在此，对导师孜孜不倦的教诲表示最诚挚的谢意和感激。始终难以忘怀他那句“不要求什么都不会，有要求什么都会”使我至今难以忘怀。他的那种“教人求真”的思想境界是我们在往后学习过程中要一直传承下去的精神。感谢丁玉林老师，王金玲老师在生活和学习中的关怀与帮助。感谢师姐毕艳楠、同届缪增强、陈梦娟师妹、牛广胜师弟、吕金宝师弟、曹霞师妹，感谢你们2年多的陪伴和在实验过程中给我的帮助和鼓励。感谢我的父母和家人在读硕士期间的理解、支持、包容与关怀。在今后的日子里，我希望自己会更加努力!感谢论文评审和答辩过程中，各位老师们和专家们的参与，你们辛苦了！母校七年，收获了太多感动和感恩，再次感谢所有给予帮助的老师和同学们！ 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76牛源致病性大肠杆菌K99对小鼠肠绒毛生长及ITF和TGF-β1mRNA表达的影响作者简介张丽霞，女，蒙古族，1990年12月出生于内蒙古自治区准格尔旗薛家湾镇柳青梁村，2015年毕业于内蒙古农业大学生命科学专业，获理学学士学位。2015年9月于内蒙古农业大学兽医学院基础兽医学专业攻读硕士学位。攻读硕士学位期间发表的论文有：张丽霞，王凤龙，丁玉林，等.动物医学进展牛源致病性大肠杆菌K99对小鼠绒毛生长和ITFmRNA表达的影响[J].已收录。
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