脾切除术对HbH+CS病患者铁代谢影响的研究

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分类号：Ｒ５５６学校代码：１０６０１密级：公开编号：Ｙ１３０２０８０鷄接朵處ＧＵＩＬＩＮＭＥＤＩＣＡＬＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ硕±学位论文脾切除术对化ＨＧＳ病患者铁代谢影响的研究学科专业：血液内科学研究方向：地中海贫血研究生姓名：暴伟业学号：Ｙ１３０２０８０学位类型：科学学位导师姓名：尹晓林教授二０—六年五月 独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加Ｗ标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得其他教育机构的学位或证书使用过的材料一。与我同王作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。６学位论文作者签名：签字日期年月＾学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解桂林医学院有关保留，、使用学位论文的规定有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权桂林医学院可Ｗ将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国学术期刊（光盘版）电子杂志社、中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国优秀博硕±学位论文全文数据库》、《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：５ｉ导师签字；一签字于日期；＞！作＊月：签字日期勺＾＾［月－１＾ 目录脾切除术对HbHCS病患者铁代谢影响的研究………………………………...1中文摘要………………………………………………………………………...1ABSTRACT……………………………………………………………………..4英汉缩略词对照表……………………………………………………………...7前言………………………………………………………………………...........8第一部分脾切除术对HbHCS病患者铁负荷的影响……………………….11前言…………………………………………………………………………….11正文…………………………………………………………………………….121材料与方法...………………………………………………………………..122结果………………………………………………………………………...133讨论………………………………………………………………………...17参考文献……………………………………………………………………….20第二部分脾切除术对HbHCS病患者铁代谢调节因子影响的研究…………………………………………………………………………….....24前言…………………………………………………………………………….24正文…………………………………………………………………………….251材料与方法...………………………………………………………………..252结果………………………………………………………………………...263讨论………………………………………………………………………...314结论…………………………………………………………………………...34全文小结……………………………………………………………………….343 参考文献……………………………………………………………………….36综述………………………………………………………………….................39攻读学位期间发表的学术论文目录………………………………………….49致谢………………………………………………………………….................504 脾切除术对HbHCS病患者铁代谢影响的研究中文摘要目的：观察脾切除术对HbHCS病患者铁负荷及其铁代谢的影响。方法：1.脾切除术对HbHCS病患者脏器铁负荷的研究：纳入64例HbHCS病患者（切脾组34例与未切脾30例），观察其发病年龄、输血情况及去铁等一般情况，均空腹抽血检测其血常规（包括WBC、血红蛋白（Hb）、网织红细胞计数（Ret）、有核红细胞计数（nucleatedredbloodcell，NRBC））、血清铁蛋白（serumferritin，SF）、肝功能（ALT、AST、总胆红素、间接**胆红素），采用3.0TMRIT2检测肝脏铁沉积水平，T2水平越低，则肝脏铁负荷越重。2.切脾对HbHCS病患者铁代谢调节因子hepcidin的研究：共纳入40例HbHCS病患者，其中切脾与未切脾患者均20例；另外22例健康体检者作为正常对照组。患者均空腹抽血，检测其血常规（包括Hb、Ret、NRBC）、SF、hepcidin、血清可溶性转铁蛋白受体（solubletransferrinreceptors,sTfR）、生长分化因子15（growthdifferentiationfactor15,GDF-15）。比较三组hepcidin、hepcidin/SF的表达水平，并分析hepcidin、SF与其他血液学指标的关系了解其影响因素。结果：1.切脾对HbHCS病患者铁负荷的研究：两组患者在年龄及性别组成、发病年龄、输血情况、去铁情况均无明显差异，切脾组WBC、血红蛋白、有核红细胞计数均高于未切脾组，总胆红素及间接胆红素均低于未切1 脾患者，两组Ret、ALT、AST无明显差差异，但切脾组LNSF高于未切脾组。*相反，以MRI检测肝脏铁沉积在切脾组低于未切脾组，二组间T2有显著性*差异。相关分析显示，两组肝铁MRIT2均与SF的自然对数（LNSF）负相关，切脾组LNSF与Hb负相关，与NRBC、WBC成正相关；未切脾组LNSF与*Hb、NRBC、WBC均无相关性。多元回归分析显示，切脾患者中肝脏MRIT2、NRBC、WBC为LNSF的独立影响因素；未切脾患者中肝铁为LNSF的独立影响因素。2.切脾对HbHCS病患者铁代谢调节因子hepcidin的研究：未切脾组LNSF水平较正常对照组高，但hepcidin及hepcidin/SF均较正常对照组低；切脾组Hb较未切脾组有所提高，铁负荷增加，hepcidin水平较高与对照组无明显差异，然而其hepcidin/SF仍然较低与未切脾组无明显差异仍低于对照组；相关性分析显示，在切脾组与未切脾组患者中，hepcidin/SF表达均与GDF-15显著负性相关。*结论：1.切脾虽然增加了HbHCS病患者的SF水平但升高了T2即改善了肝铁沉积；2.HbHCS病患者无论切脾与否，SF均可反应肝铁情况，但对于切脾*患者，同样的SF可能会高估其肝铁沉积，采用SF联合肝脏MRIT2可更好的反应HbHCS病患者铁负荷情况；3.切脾增加了HbHCS病患者SF水平，上调了hepcidin的表达，部分解释了切脾组患者SF上升、肝铁下降的分离现象；但切脾并未纠正异常的hepcidin/SF水平，仍然存在铁调节代谢紊乱情况；4.无效造血GDF-15可能为抑制hepcidin表达的主要因素,在hepcidin-SF轴中起着重要的作用。2 关键词：HbHCS，切脾，铁调素，生长分化因子15，MRI。3 StudyontheimpactofsplenectomyondysregulationofironmetabolisminpatientswithHemoglobinHConstantSpringdiseaseABSTRACTObjective:ToinvestigatetheimpactofsplenectomyonironloadandironmetabolisminpatientswithHbHCSdisease.Methods:1.IronloadinpatientswithHbHCSdiease：64patientswithHbHCSdiease(34casessplenectomisedand30casesnon-splenectomised)werestudied.Medicalhistory,historyofbloodtransfusionsandtreatmentwithironchelatordrugswererecorded.Fastingbloodwascollectedfromallparticipants.Redcellparametersincludinghemoglobin(Hb)concentration,reticulocytecount(Ret)andnucleatedredbloodcell(NRBC)countwereanalyzed,Serumconcentrationsofferritinandliverfunction(ALT,AST,totalbilirubinandindirectbilirubin)parametersweremeasured.Hepatic3.0TMagneticResonanceImaging(MRI)T2*wasperformedinpatients(34splenectomisedand30non-splenectomised)toevaluatetheliverironconcentration(LIC).2.HepcidininpatientswithHbHCSdiease:FortypatientswithHbHCS4 diease(20casessplenectomisedand20casesnon-splenectomised)werestudied,alongwith22healthycontrols.Serumconcentrationsofferritin,solubletransferrinreceptors(sTfR),growthdifferentiationfactor15(GDF15)andhepcidinweremeasured.Correlationsbetweenlevelsofhepcidinandferritinaswellashematologicalparameterswereanalyzed.Results:1.IronloadinpatientswithHbHCSdiease：Therewerenosignificantdifferencesinage,gendercomposition,ageatonset,bloodtransfusionvolumeandironchelatorbetweenthetwogroup.ThelevelsofWBC,HblevelandNRBCcountwerehigherwhilelevelsoftotalbilirubinandindirectbilirubinwerelowerinthesplenectomisedgroupthanthatofnon-splenectomisedgroup.TherewasnosignificantdifferenceofALT,ASTandRetlevelsbetweenthetwogroups.NapierianLogarithmofserumferritin（LNSF）levelsandtheratioofironoverload（SF＞500ng/ml）patientsweresignificantlyelevatedinsplenectomisedgroup,however,theMRIT2*wasalsohigher.CorrelationanalysesrevealedthatMRIT2*levelswerenegativelycorrelatedwithlevelsofLNSFinbothgroup.TheLNSFlevelsinthesplenectomisedwerenegativelycorrelatedwithHbandpositivelycorrelatedwithNRBCandWBC,whilenocorrelationswerefoundbetweenLNSFandHb,NRBC,WBClevelsinnon-splenectomisedgroup.MultivariatelinearregressionanalysesrevealedthatlevelofT2*,NRBCandWBCwereindependentriskfactorsaffectingtheLNSFlevelinsplenectomisedpatientswhilelevelofT2*wastheonlyindependentriskfactoraffectingtheLNSFlevelinnon-splenectomisedgroup.2.HepcidininpatientswithHbHCSdiease:Comparedwiththecontrolgroup,ahigherferritinlevel,alowerhepcidinlevelandlowerhepcidin/ferritinratiowerenoticedinthenon-splenectomisedgroup.Inpatientswhohadbeen5 splenectomised,hepcidin/ferritinratioremainedlower,andtheferritinlevelwasevenhigherthanthatinthenon-splenectomizedgroup.Bothinsplenectomizedandnon-splenectomizedgroup,hepcidin/ferritinratioweresignificantnegativelycorrelatedwiththeGDF-15level.Conclusions:1.Splenectomyreducesliverironconcentration(LIC)measuredby3.0TMRIT2*inpatientswithHbHCSdiease,despiteimprovingserumferritinlevels.2.Serumferritincanindicatethelevelsofliverironconcentrationinpatientswhethersplenectomisedornot.AndthesamelevelofserumferritinmayoverestimatetheLICinsplenectomisedpatients.TheferritincombinedwithliverMRIT2*canbetterindicatetheironloadinpatientswithHbHCSdieases.3.Splenectomyincreasestheserumferritinlevelandupregulateshepcidinlevel,partlyexplainingtheseparationphenomenonofhighserumferritinlevelandlowLICinsplenectomisedpatients.However,splenectomydoesnotimprovethedysregulationofironmetabolismindicatedbyinappropriatelylowhepcidin/ferritinratiosinpatientswithHbHCSdiease.4.GDF15maycontributemosttoinhibitionofhepcidinlevelsandplayacausalroleinthehepcidin-ferritincascade.Keywords：HemoglobinHConstantSpringdisease,splenectomy,hepcidin,growthdifferentiationfactor15(GDF15),MagneticResonanceImaging6 英汉缩略词对照表英文缩英文全称中文全称写HbHCSHemoglobinHConstantSpringdiseaseCS血红蛋白H病TIthalassemiaintermedia中间型β地贫TMthalassemiamajor重型β地贫NTDTnon-transfusiondependent非输血依赖性地贫thalassemiaMRIMagneticResonanceImaging核磁共振成像SFserumferritin血清铁蛋白LNSFNapierianLogarithmofserumferritin血清铁蛋白自然对数Hbhemoglobin血红蛋白NRBCnucleatedredbloodcell有核红细胞计数Retreticulocytecount网织红细胞计数GDF15growthdifferentiationfactor15生长分化因子15sTfRsolubletransferrinreceptors血清可溶性转铁蛋白受体EPOErythropoietin促红细胞生成素IEineffectiveerythropoiesis无效造血LICLiverironconcentration肝铁含量NTBINon-transferrin-boundiron非转铁蛋白结合铁FPNferroportin膜铁转运蛋白7 前言正常成人的血红蛋白是由2个α和2个β肽链组成的结构稳定的四聚体，地中海贫血（thalassemia,地贫）由于编码血红蛋白的α基因和/或β基因缺陷，相应肽链生成障碍而引起的慢性遗传性溶血性贫血。当其α基因缺陷时则称为α地贫，广西为地贫的高发区，携带率高达26%，其中α地贫高达17%[1]。由于α链合成缺陷，冗余的β链形成四聚体β,β四聚体易4分解为游离的β-链并沉积聚集形成H包涵体，沉积在红细胞膜上导致红细胞变形能力下降，通过脾脏时被破坏，产生溶血性贫血[2]。根据其基因型，α地贫可分为静止型、轻型、中间型、重型，正常人有4个α基因，其中当3个α基因缺陷时称为中间型α地贫，即血红蛋白H病（hemoglobinHdisease，HbH病）。HbH病又可分为缺失型HbH病和非缺失型HbH病，分别为两个α基因缺失合并另一条染色体上单个α基因的缺失（-α）或突变（αT[1]α）。大规模的流行病学调查表明，广西HbH病的发病率为0.46%。2010年,本课题组对357例HbH患者临床资料总结，表明临床就诊的非缺失型（即突变型）HbH病是广西地区HbH病的主要类型，占61%左右，而以HbHCS（HbHCSConstantSpring，基因型为--/αα）为主，其临床症状较缺失型患者要严重[3]。铁超载为地贫常见的并发症。长期慢性溶血性贫血对患者的铁代谢产生两方面的影响：首先，骨髓代偿性增生，红细胞生成增加，使得肠道铁吸收增加以提供更多的造血原料，据估计地贫患者胃肠道铁的吸收量约为正常人群的3倍，每年增加大约2-5g铁沉积量；其次，为改善贫血而输注的红细胞带来外源性的铁负荷，每100ml全血含铁约50mg，平均输血158 次以上就会出现铁超载。同样，铁超载也是HbHCS病患者的主要并发症之一[4]。中间型β地贫(thalassemiaintermedia,TI)与HbH病均可不依赖输血而长期存活，统称非输血依赖性地贫（non-transfusiondependentthalassemia,NTDT）。TI患者的主要溶血部位是骨髓，而HbH病患者的红细胞破坏场所主要在脾脏，因而脾切除术已成为HbH病患者的主要治疗手段。切脾可以提升HbH病患者的Hb水平，理论上应该减少患者胃肠道铁吸收、减少患者对输血的需要，降低患者的铁负荷。我们收集了198例HbH病患者的临床资料，发现115例（56.1%）患者已行脾切除术，其Hb水平显著高于未行脾切除组[3]，表明切脾的HbH患者血红蛋白水平有所改善，但其血清铁蛋白更高[5]。并在另一项研究中得到进一步证实。那么，增高的铁蛋白，是否意味着更高的铁负荷？为什么脾切除术者会有更高的SF，其病理生理机制是什么？为解释这一矛盾，首先需明确脾切除术是否真的能够增加患者的铁负荷。目前评估铁负荷的主要指标有SF、肝活检、MRI等，但SF是一种急性时相蛋白，易受输血、炎症等影响，故并不一定能准确反映铁超载水平。肝穿刺活检为测定肝内铁沉积的金标准，但其为有创操作且不易重复。由于铁的顺磁性，MRI检测时，铁超负荷的肝脏组织的信号强度明显减低或出**现缺失，驰豫时间（relaxationtime，T）T2缩短，肝铁越高，T2时间往往越短。并且研究显示肝脏铁含量（Liverironconcentration,LIC）与T2*负相关，1/T2*也就是驰豫率（relaxationratie，R）R2*与LIC直线正相关，均可反应肝铁含量[6]。AU等[7]对123例TI和HbH病患者中37例SF超过1000ng/ml者行MRI检查，其中HbH病患者10例，37例患者有84%出现铁超载，但仅2例出现心脏铁超载。采用MRI可以较为准确的评估脏9 器铁负荷，且具有无创及可重复性，因而逐步被应用到临床。由于肝铁往*往沉积较早，我们采用3.0TMRIT2来检测HbHCS病患者肝铁沉积情况，进一步了解切脾对HbHCS病患者铁负荷的影响，亦即SF增高是否意味着更高的肝铁负荷。血清铁蛋白调节的中心环节是hepcidin。其主要在肝脏中合成，在铁代谢调节中日益受到关注。Hepcidin受机体铁负荷、红细胞生成、缺氧和炎症反应等的调节[8,9]。铁负荷升高、炎症可上调hepcidin的表达，而贫血、无效造血、红系生成、缺氧等可下调其表达。地贫患者往往同时存在贫血、无效造血、铁超载，因而其铁代谢也受到诸多因素的影响较为复杂。HbHCS病切脾患者贫血得到改善，但SF升高，由于hepcidin为铁平衡的关键因子，因此观察HbHCS病患者hepcidin的水平对了解切脾对HbHCS病铁代谢影响尤为关键。因此我们从以下两个方面来评估切脾对HbHCS病患者铁代谢的影响：*（1）采用3.0TMRIT2检测肝铁来评估切脾对脏器铁负荷的影响；（2）比较切脾组与未切脾组hepcidin的水平及其影响因素进一步了解切脾对铁代谢调节的影响。10 第一部分脾切除术对HbHCS病患者铁负荷的影响前言HbHCS病是一种遗传性慢性溶血性疾病，由于其编码α血红蛋白链缺陷而导致无效造血，大量的红细胞被脾脏所破坏。目前切脾已成为治疗地贫的有效方法，然而，我们之前的研究证实，切脾改善了HbHCS病患者贫血症状，但却增加了HbHCS病患者血清铁蛋白（serumferritin，SF）。由于SF为一种急性时相蛋白,受炎症、输血等的影响，因而并不一定能准确反映铁负荷情况。铁超载对机体的损伤主要在于过多的铁可沉积在肝细胞、心肌细胞和内分泌器引起肝硬化、心衰、糖尿病等一系列并发症，其中肝脏为其主要靶器官。肝脏穿刺活检为检测肝铁的金标准，但因其为有创检查且不易重复在临床上较少应用。近年来通过核磁共振（magnetic*resonanceimaging，MRI）检测肝铁已被逐步应用到临床，采用MRIT2成像可较为准确的评估脏器铁负荷[7,8]。由于铁为顺磁性物质，可以使组织的**信号强度减低，采用MRI多回波扫描后表现为T2缩短，肝铁越高，T2值越*[10]小，因而可采用T2来代表地贫肝铁的含量。本课题组黄海波等既往研究显示3.0TMRI梯度多回波优化序列对活体肝扫描具有可行性，对肝铁负荷*检测可行度高。因此我们通过3.0TMRIT2检测HbHCS病患者肝铁含量来评估脾切除术对其铁负荷的影响。11 正文1材料与方法1.1实验对象本实验对象为2014年7月至2015年6月就诊中国人民解放军第三0三医院的患者。纳入标准：经基因明确诊断为HbHCS病,且年龄在14岁到65岁之间。排除标准：合并β基因缺陷及其它类型贫血如缺铁性贫血、自身免疫性溶血性贫血等疾病；合并血液病如白血病、遗传性血色素病等；近3月有输血史；近3月内使用抗贫血药物、发热、使用解热镇痛药和磺胺类药物史。最终共纳入64例HbHCS病患者，其中34例切脾，30例未切脾。所有入组对象均予签署知情同意书。1.2实验方法1.2.1观察所有患者发病年龄、输血及去铁等一般情况，均空腹抽血检测其血常规（RBC、Hb、Ret、NRBC）、SF、肝功能（ALT、AST、总胆红素、间接胆红素）。1.2.23.0TMRI检测肝脏铁负荷采用PhilipsAchieva3.0T扫描仪，应用SenseXLTorso16coils配合呼吸门控，仰卧位呼气末单次屏气扫描肝门上一层面横断面，按定位像、匀场与参考扫描、常规横断面T1WI、冠状和横断面T2WI(参数略)、*[10]12-echoGRE序列执行，T2序列参数设置如下，TEstudy=0.6、1.3、2.0、12 2.6、3.3、3.9、4.6、5.3、5.9、6.6、7.3、7.9ms，扫描完成后保存原*始数据，由接受过良好培训的影像医师利用专业软件测算肝T2值，取其*平均值为最终T2结果。表1T2*序列参数设置GradienRFBWSenseFA(°)FOV(mm)FrequencyTR(ms)tfield(Hz)factorencodingMaximumMaximum2988220250*370692001.3统计学处理SF变异系数较大,转换为自然对数LNSF表示，定量数据以均数±标准2差表示，计量资料的比较采用独立样本t检验，计数资料的比较采用χ检验,相关分析法采用Pearson法,多因素相关分析采用逐步回归法分析。所有数据采用SPSS18.0进行统计处理。双尾检验P值<0.05的被认为是具有统计学意义。2结果2.1一般状况34例切脾患者，切脾时年龄为6~43岁，平均切脾年龄22.6±10.6岁。切脾后时间为1~32年，平均7.1±6.0年。切脾组患者年龄为14~48岁，中位年龄29岁；未切脾组患者年龄15~65岁，中位年龄29岁。两组患者在发病年龄、年龄及性别组成、输血情况、去铁情况均无明显差异（见表2），切脾组Hb、NRBC高于未切脾组，切脾组总胆红素及间接胆红素低于未切脾患者，两组Ret、ALT、AST无明显差异。2.2铁负荷状况13 切脾组患者LNSF及铁超载（SF＞500ng/ml）比例高于未切脾患者，*但T2比未切脾组高即肝铁低于未切脾组（见表2）。肝脏MRI图像显示SF*越高，肝脏组织信号强度越低，T2越短（见图1、图2）。*2.3肝铁T2、LNSF相关性分析*相关分析显示，两组肝铁T2均与LNSF负相关（见表3、图3）；切脾组LNSF与Hb负相关，与NRBC、WBC成正相关；未切脾组LNSF与Hb、NRBC*均无相关性。多元回归分析显示，切脾患者中肝脏T2、NRBC、WBC为LNSF的独立影响因素；未切脾患者中年龄为LNSF的独立影响因素（见表3）。14 WBC:白细胞计数；PLT：血小板计数；RET:网织红细胞计数；NRBC:有核红细胞计数;SF:血清铁蛋白;LNSF：血清铁蛋白的自然对数。图1未切脾患者吴××肝脏MRI:图2切脾患者莫××肝脏MRI:SF107.58ng/ml；T2*16.39ms。SF6026.60ng/ml；T2*0.41ms。*表3HbHCS患者肝脏MRIT2和LNSF的影响因素相关分析切脾组(n=34)未切脾组(n=30)RPRP15 与MRIT2*相关Hb（g/L）0.2060.242-0.3100.096年龄（岁）-0.3430.047-0.2770.139LNSF-0.7220.000-0.3870.035与LNSF相关Hb（g/L）-0.3480.0440.2920.117年龄（岁）0.4070.0170.4120.024NRBC（×109/L）0.5040.0020.0250.897WBC（×109/L）0.3610.036-0.0810.671*图3HbHCS病切脾组（S）和未切脾组(NS)患者LNSF与肝脏MRI-T2的相关性：切脾组与未*切脾组肝脏T2均与LNSF成负相关。16 3讨论铁超载为地贫的常见并发症，HbHCS病患者铁超载的主要原因为输血带来的铁及肠道铁吸收增加所致，HbHCS病红细胞主要在脾脏中破坏，切脾可以提升HbHCS患者的Hb水平，理论上应该减少患者胃肠道铁吸收、减少患者对输血的需要，降低患者的铁负荷。本课题组既往研究发现HbHCS病患者切脾组SF更高[5,11]。本次对HbHCS病患者的研究同样发现，脾切除组患者其LNSF、铁超载（SF＞500ng/ml）比例均高于未切脾患者，然而采**用MRI检测患者肝脏T2时，发现切脾组T2要高于未切脾组，即切脾组肝铁负荷低于未切脾组。这表明，接受脾切除术者其肝铁负荷是下降的，血清铁蛋白的上升并不是铁负荷增加导致的，而是另有原因。脾切除术后SF的增高首先可能归结于铁的再分布。多项研究表明脾脏在铁负荷的储存方面起着重要的作用。TaherA等[12]在TI的铁负荷研究显示，74例TI患者，其中切脾组59例，切脾组肝铁含量（MRIR2）、血清非转铁蛋白结合铁（Non-transferrin-boundiron，NTBI）、SF均高于未切脾组，并且NTBI与SF及肝铁含量均具有相关，切脾为NTBI的独立危险因子。KolnagouA等[13]对28例男性、19例女性TM患者的研究显示，TM患者脾脏大致为正常人的5至20倍，16例未切脾的患者研究证实脾脏大小约为肝脏的80%，MRI检测表明脾脏额外贮存了约0-40%的铁，切脾后，全身铁贮存能力下降，虽然输血量减少，但铁蛋白上升；采用SQUID技术表明80%的铁存在于肝脾，MRI检测也表明脾脏是第二大存铁器官；另外追踪切脾后患者，发现输血量减少而SF上升。由此可见，脾脏在清除NTBI降低SF方面起着重要的作用，地贫切脾患者血清铁蛋白的升高可能部分源于切脾后全身储铁能力下降。17 血清铁蛋白增高的第二个原因，可能与切脾后的慢性炎症有关。本研究显示HbHCS病患者切脾组LNSF与Hb负相关，与NRBC、WBC成正相关，而未切脾组LNSF与Hb、NRBC、WBC均无相关性。铁蛋白为一种急性时相蛋白，炎症状态下铁负荷可升高。国外一项对β复合E的地贫患者的研究显示，地贫患者IL-6、CRP水平高于正常人，但切脾与未切脾组无明显差异，且Hepcidin相对表达与CRP呈正相关，说明在地贫患者中存在慢性炎症状态，且参与其铁代谢[14]。我们的研究显示HbHCS患者切脾组WBC高于未切脾组，且多元回归分析显示，切脾组WBC为LNSF的独立影响因素，说明HbHCS病切脾患者可能也存在慢性炎症状态，其铁蛋白的升高可能部分与其炎症刺激有关。考察患者的脏器铁负荷，表明与SF相反，接受脾切除术的HbHCS病患者其肝铁是下降的，表明脾切除术确实减轻了患者的脏器铁负荷。这首先可能归结于红细胞的破坏减少，相应的红细胞生成压力减轻，铁的需要减少，输血及肠道的铁吸收减少。RIGASDA等[2]在2例HbH病中观察其红细胞寿命时发现，HbH大量的包涵体迅速被脾脏破坏，切脾前红细胞平均寿命约40-45天，切脾后包涵体破坏明显减少，红细胞平均寿命延长至正常人水平，包含有包涵体的红细胞中HbA仍具携氧功能，病人贫血症状也相应得到改善。YangXY等[15]同样也发现切脾明显减少了HbH病红细胞的破坏改善了贫血。我们的研究显示，HbHCS切脾组Hb水平得到改善，另外HbHCS病患者切脾组总胆红素及间接胆红素均低于未切脾患者，说明其溶血可能相对较轻。在TM、TI中切脾组铁蛋白的升高往往伴随着脏器铁负荷的增加，这与我们HbHCS病患者存在着明显的差异。与本研究不同，多数观察表明，18 接受脾切除术的TI其铁负荷是增加的，表明脾切除术对TI和HbHCS病患者铁负荷的影响存在差异，其根源可能在于二者的发病机制有所不同。TI患者贫血主要是因为骨髓无效造血，而HbHCS主要是由于红细胞在脾脏的破坏。有学者在比较缺失型HbH、HbHCS及β复合E地贫红系前体细胞凋亡时，发现缺失型HbH凋亡比例最低几乎在正常范围内，β复合E最高无效造血最为明显，HbHCS无效造血较为轻微[16]。另外有研究显示，TM红系增生过度约为正常人的5-6倍，而红系前体细胞凋亡速率约为正常人的3-4[11]倍，红系前体细胞凋亡总数达正常人的15倍。有学者进一步研究显示，TM中红系前体细胞凋亡DNA降解产物显著增加，且明显高于β地贫携带者[17]。这表明，TI和HbH病患者的发病机制不同，前者的无效造血是其主要原因，破坏场所也主要在骨髓的原位溶血，而后者主要是脾脏的破坏，脾切除术对二者的疗效、红细胞生成的影响也有根本的区别。由于二组疾病的机制有明显的差异，相应的其铁代谢调节也有显著的不同。OrigaR等[18]在比较38例TI与36例HbH病（其中5例为非缺失型，含1例HbHCS）患者铁代谢时发现，TI患者的促红细胞生成素（Erythropoietin,EPO）、sTfR分别为HbH患者的4倍和2倍，TI的GDF15增高而HbH基本在正常范围内，TI的Hepcidin水平要低于HbH，而LIC和SF要高，TI患者hepcidin/GDF15水平比HbH病患者低100倍。因此在TI患者可以观察到，发现TI切脾患者GDF15（主要反应无效造血）明显高于未切脾者(29,266.5±15,914.8vs.18,077.6±14,477pg/ml,P=0.012)，并且GDF15与SF、LIC（MRIR2）正相关，与Hb负相关，提示在TI患者中切脾加重了其无效造血，且肝铁沉积及血清铁负荷均与其造血有关[19]。但是在HbH病患者，由于无效造血不如TI患者严重，因此对铁代谢调节的影19 响可能会有所不同，TI患者中无效造血明显高于HbH病患者，且无效造血对hepcidin的调节更为敏感，因此脾切除导致TI患者铁负荷增加，但对H病患者却出现了相反的结果。*相关性分析显示，HbHCS病患者切脾与未切脾组，LNSF均与肝脏T2*负相关，由于肝铁含量与肝脏T2负相关，因而提示LNSF与肝铁正相关，铁蛋白越高，肝铁越高。人体SF主要来源与单核巨噬细胞铁蛋白的释放，输血的铁可通过网状内皮系统吞噬造成铁蛋白的合成增加，同样肝脏枯否氏细胞铁蛋白合成增加[4]。同样HbHCS病患者输血可导致肝脏巨噬细胞铁蛋白合成释放增加，因而SF也相应增加。因而在HbHCS病患者中，无论切脾与否，SF均良好的反应脏器铁负荷情况，但是同等的SF下未切脾组肝铁沉积可能更为严重。与我们的研究类似，在TI患者采用MRI检测其肝铁，也发现切脾与未切脾组肝铁LIC均与SF成正比[20]。因此采用SF联合MRI可能更好的评估不同状态下的铁负荷。总之，我们的研究显示，HbHCS病患者切脾组肝铁下降，切脾改善了肝铁沉积，在切脾与未切脾的HbHCS病患者中，SF均可反应肝铁情况，采*用SF联合肝脏MRIT2可更好的反应HbHCS病患者铁负荷情况。20 参考文献1.XiongF,SunM,ZhangX,etc.MolecularepidemiologicalsurveyofhaemoglobinopathiesintheGuangxiZhuangAutonomousRegionofsouthernChina.ClinGenet,2010,78:139-148.2.RIGASDA,KOLERRD.DecreasederythrocytesurvivalinhemoglobinHdiseaseasaresultoftheabnormalpropertiesofhemoglobinH:thebenefitofsplenectomy.Blood,1961,18:1-17.3.YinXL,ZhangXH,WuZK,etc.Pulmonaryhypertensionriskinpatientswithhemoglobinhdisease:lowincidenceandabsenceofcorrelationwithsplenectomy.ActaHaematol,2013,130:153-159.4.OrigaR,GalanelloR,GanzT,etc.Liverironconcentrationsandurinaryhepcidininbeta-thalassemia.Haematologica,2007,92:583-588.5.ZhouYL,ZhangXH,LiuTN,etc.SplenectomyimprovesanaemiabutdoesnotreduceironburdeninpatientswithhaemoglobinHConstantSpringdisease.BloodTransfus,2014,12:471-478.6.PorterJB,El-AlfyM,ViprakasitV,etc.Utilityoflabileplasmaironandtransferrinsaturationinadditiontoserumferritinasironoverloadmarkersindifferentunderlyinganemiasbeforeandafterdeferasiroxtreatment.EurJHaematol,2016,96:19-26.7.AuWY,LamWW,ChuWW,etc.Organ-specifichemosiderosisandfunctionalcorrelationinChinesepatientswiththalassemiaintermediaandhemoglobinHdisease.AnnHematol,2009,88:947-950.8.NemethE,ValoreEV,TerritoM,etc.Hepcidin,aputativemediatorofanemiaofinflammation,isatypeIIacute-phaseprotein.Blood,2003,101:2461-2463.21 9.PietrangeloA.Hepcidininhumanirondisorders:therapeuticimplications.JHepatol,2011,54:173-181.10.黄海波,周亚丽,李致忠，等.前瞻性3.0TMRI梯度多回波序列参数优化可行性研究.磁共振成像,2015,6(7):529-534.11.CentisF,TabelliniL,LucarelliG,etc.Theimportanceoferythroidexpansionindeterminingtheextentofapoptosisinerythroidprecursorsinpatientswithbeta-thalassemiamajor.Blood,2000,96:3624-3629.12.TaherA,MusallamKM,ElRF,etc.Levelsofnon-transferrin-boundironasanindexofironoverloadinpatientswiththalassaemiaintermedia.BrJHaematol,2009,146:569-572.13.KolnagouA,MichaelidesY,KontoghiorgheCN,etc.Theimportanceofspleen,spleeniron,andsplenectomyfordeterminingtotalbodyironload,ferrikinetics,andirontoxicityinthalassemiamajorpatients.ToxicolMechMethods,2013,23:34-41.14.PratummoK,JetsrisuparbA,FucharoenS,etc.Hepcidinexpressionfrommonocyteofsplenectomizedandnon-splenectomizedpatientswithHbE-beta-thalassemia.Hematology,2014,19:175-180.15.YangXY,QuQ,YangTY,etc.Treatmentofthethalassemiasyndromewithsplenectomy.Hemoglobin,1988,12:601-608.16.PootrakulP,SirankaprachaP,HemsorachS,etc.Acorrelationoferythrokinetics,ineffectiveerythropoiesis,anderythroidprecursorapoptosisinthaipatientswiththalassemia.Blood,2000,96:2606-2612.17.YuanJ,AngelucciE,LucarelliG,etc.Acceleratedprogrammedcelldeath(apoptosis)inerythroidprecursorsofpatientswithseverebeta-thalassemia(Cooley'sanemia).Blood,1993,82:374-377.18.OrigaR,CazzolaM,MereuE,etc.Differencesinthe22 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第二部分脾切除术对HbHCS病患者铁代谢调节因子影响的研究前言铁调素（hepcidin），又叫肝脏抗菌多肽，是一种主要由肝脏分泌的25个氨基酸组成的小分子多肽类物质，其在在被细菌活化的中性白细胞和巨噬细胞也可少量合成[1]。Park等[2]根据其合成部位在肝脏(Hep-)及其在体外的抗微生物(-cidin)特性而将其命名为hepcidin。hepcidin为调节机体铁代谢平衡的关键物质[3]，主要通过内化降解小肠上皮细胞及巨噬细胞膜表面的膜铁转运蛋白(ferroportin，FPN),从而抑制小肠上皮细胞内铁进入肠腔,同时抑制巨噬细胞供红细胞生成所需铁的外排[4]，来调节机体的铁平衡。Hepcidin受机体铁负荷、红细胞生成、缺氧和炎症反应等的调节，炎症和铁负荷增加均可上调hepcidin的表达，而缺氧、贫血、骨髓造血红系生成则可抑制hepcidin的表达[5,6]。Hepcidin下调导致的肠道铁吸收增加是非输血依赖性地中海贫血（包括HbH病）患者铁超载的主要原因。HbHCS病为广西最为常见的非缺失型HbH病[7]，主要为编码血红蛋白的α基因缺陷相应肽链生成减少而引起的一种慢性遗传性溶血性疾病。HbHCS病患者主要表现为贫血及无效造血，其红细胞破坏主要在脾脏，脾切除术已成为HbH患者的主要治疗手段[8,9]。既往研究显示HbHCS病患者脾切除组贫血改善，但SF水平却更高[10]。*我们进一步采用MRIT2评估了切脾对HbHCS病患者肝铁的影响，发24 现切脾组肝铁负荷较未切脾组低，提示切脾虽然增加了SF水平但却改善了肝铁负荷。由于hepcidin为铁代谢的主要调控因子，为此我们比较了HbHCS病切脾患者和未切脾患者Hepcidin水平并分析其影响因素，进一步了解切脾对其铁代谢调节的影响,探讨其可能的机制,以期在临床实践中为铁过载的HbHCS病患者提供新的预防及治疗措施。正文1材料与方法1.1实验对象本研究是一个横断面调查,对象为2013年10月至2014年6月在中国人民解放军第三0三医院就诊的病人。HbHCS病患者的纳入标准、排除标准均同第一部分。最终收集病例40例，其中切脾组与未切脾组均20例。另外进行地贫基因检测并除外了地中海贫血的健康志愿者作为健康对照组，最终纳入22例。所有入组对象均签署知情同意书，临床标本经过我院伦理委员会同意，用于科学研究。1.2试剂与方法1.2.1一般情况调查所有患者发病年龄、输血史、去铁药物使用情况、是否接受脾切除术、切脾原因及手术时间。患者均空腹抽血，检测其血常规（包括血红25 蛋白、网织红细胞计数、有核红细胞计数（NRBC））（5000XE全自动血细胞分析仪（SysmexCorporation,Kobe,Japan））、SF（化学发光法（AxSYMFerritin,AbbottLaboratories,Chicago,IL,USA））等常规项目。1.2.2其他检测指标血清hepcidin的检测：酶联免疫吸附法（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA），采用ELISA试剂盒检测((DRGInstruments,Marburg,Germany)。血清GDF15、sTfR的检测：ELISA法(CusabioBiotechCo.,Ltd.,Wuhan,China)。1.3统计方法由于SF变异系数较大,转换为自然对数LNSF表示，所有数据采用SPSS18.0进行统计处理。计量资料采用均数±标准差表示，符合正态分布的连续性变量的比较采用方差分析（ANOVA），组间比较采用最小显著性差异检2测（LSD-test）。计数资料的比较采用皮尔森卡方检验（Pearson'sχtest）；单因素相关分析采用Pearson法，单因素相关分析具有意义的采用逐步回归分析法进行多因素相关分析。双尾检验P值<0.05的被认为是具有统计学意义。2结果2.1一般资料本实验一共纳入40例HbHCS病患者，其中切脾组、未切脾组均20例。切脾组切脾指征主要为：血红蛋白水平长期在8.0g/dL以下影响生长发育时；输血无效；脾亢导致贫血加重、白细胞减少、血小板减少出现反复感染及出血症状；合并巨脾（如脾大出现左上腹疼痛或产生压迫症状，或者26 脾脏最大长径＞20cm可能出现脾破裂时）。切脾组患者平均切脾平均年龄为25岁（8-44岁）；患者自切脾到纳入研究的平均时间为4.8年（0.5-15.7年）。切脾组患者年龄18.3~47.7岁，中位年龄26.7岁；未切脾组患者年龄18.8~39.1岁，中位年龄27.7岁；对照组年龄18.3~47.7岁，中位年龄28.5岁；未切脾组患者年龄23~33岁，中位年龄28.5岁。一般资料显示三组患者在年龄及性别组成方面无明显差异；并且切脾组与未切脾组在发病时间及诊断时间、起始输血时间均没有显著性差异。所有的患者输血总量均小于20U,大部分患者输血低于10U。卡方检验显示，两组患者输血量无显著性差异（p=0.937）（见表4）。27 表4HbHCS病切脾患者与未切脾患者及正常对照组临床特征的比较bPc临床特征切脾组(N=20)未切脾组(N=20)对照组(N=22)P年龄（岁）29.8±8.928.1±5.728.6±2.80.666-性别（女/男）8/129/1113/90.435-发病年龄（岁）6.8±5.88.9±8.4--0.362诊断时间（岁）10.5±8.612.5±9.3--0.474首次输血时间（岁）12.3±9.08.9±6.8--0.188输血总容量*--0.9372(10%)2(10%)---从未输血13(65%)12(60%)---0.5-10U5(25%)6(30%)---10-20UHb(g/L)90.0±11.3a79.0±13.5a139.5±7.40.0000.002SF(ng/mL)1227.3±1246.1a560.8±445.8219.2±115.50.0000.007LNSF6.7±0.9a6.0±0.9a5.2±0.60.0000.010铁超载数#(N,%)15(75%)a8(40%)a0(0.00%)0.0000.025sTfR(ng/mL)20254.6±14016.4a19510.0±13546.312215.9±7429.60.060-LNsTfR9.61±0.859.60±0.859.21±0.700.196-GDF-15(pg/mL)335.8±79.7307.4±84.2328.2±78.20.517-Hepcidin(ng/mL)13.3±7.27.6±2.2a11.3±6.70.0120.003Hepcidin/SF0.0147±0.0090a0.0217±0.0210a0.0667±0.05740.0000.547aLNSF：SF的自然对数；sTfR:血清可溶性转铁蛋白受体;GDF-15:生长分化因子15;p＜0.05:与正bC常组比较;p:三组比较;p:切脾组与未切脾组；*1U是指从200ml外周血中提取的红细胞；#SF＞500ng/mL。2.2Hepcidin水平及血液学参数的比较切脾组NRBC及Hb水平均高于未切脾组，但两组网织红细胞计数无明显差异。切脾组与未切脾组LNSF水平均高于正常人，且切脾组较未切脾组更高。切脾组血清hepcidin水平高于未切脾组,但与正常对照组无明显差异。切脾组与未切脾组hepcidin/SF水平无显著性差异但均低于正常对照组（见表4）。28 2.3Hepcidin的影响因素及相关性分析单因素相关分析显示切脾组hepcidin水平与LNSF、GDF-15及年龄均相关，在未切脾组中hepcidin与LNSF、GDF-15及年龄均无相关性。多元回归分析显示，切脾组LNSF为hepcidin独立影响因素（b=0.683,p=0.001）。以hepcidin/SF来表示铁调节的相对能力，相关分析显示切脾组hepcidin/SF与GDF-15负相关，未切脾组hepcidin/SF与GDF-15、LNsTfR及年龄均负相关，多元回归模型纳入GDF-15、LNsTfR及年龄，GDF-15为hepcidin/SF独立影响因素（见表5，图4、图5）。表5HbHCS病患者切脾组与未切脾组hepcidin及hepcidin/ferritin的相关性分析切脾组(N=20)未切脾组(N=20)影响因素Hepcidinhepcidin/SFhepcidinhepcidin/SFrprprprp年龄（岁）0.4810.032-0.3620.1170.0390.871-0.6420.002NRBC（×109/L）0.4070.075-0.1840.438-0.2450.298-0.2620.264GDF-15(pg/mL)0.5300.016-0.4980.026-0.2140.365-0.7210.000sTfR(ng/mL)-0.2350.318-0.1630.493-0.1410.552-0.5580.011LNsTfR-0.2830.227-0.0530.823-0.0210.928-0.6670.001LNSF0.6830.001--0.0020.994--NRBC:有核红细胞计数;GDF-15:生长分化因15；sTfR:血清可溶性转铁蛋白受体;SF:血清铁蛋白;LNSF：血清铁蛋白的自然对数;LNsTfR:sTfR的自然对数。29 图4.HbHCS病患者切脾组(S)与未切脾组(NS)GDF-15与hepcidin/SF的相关性分析:切脾组(S)与未切脾组(NS)患者hepcidin/SF均与GDF-15线性相关。图5.HbHCS病患者切脾组(S)与未切脾组(NS)sTfR与hepcidin/SF的相关性分析:sTfR水平与hepcidin/SF水平在未切脾组线性相关(NS)，在切脾组无线性关系(S).30 3讨论目前铁超载已成为非输血依赖型地贫如中间型β地贫及HbH病患者常见的并发症[11,12]。在中间型β地贫中，发现切脾可以加重其铁负荷[13]。既往研究也显示HbHCS病患者切脾组SF更高[10]，然而我们前期对HbHCS病患者肝铁进行MRI检测时发现，切脾组肝铁相对较低，也就是说切脾提高了SF但改善了其肝铁负荷。由于hepcidin为调节铁代谢的主要因子，因而我们进一步研究了HbHCS病切脾与未切脾患者铁代谢的情况来探索其潜在的原因。我们的研究显示HbHCS病未切脾组hepcidin水平低于正常对照组，LNSF水平及铁超载患者比例明显高于正常对照组，说明HbHCS病患者铁超载可能部分源于hepcidin下调胃肠道铁的吸收增加。研究显示TI患者的hepcidin也低于正常人，hepcidin水平与EPO及sTfR负相关[14]。OrigaR等[15]比较了38例TI和36例HbH病两种非输血依赖型地贫铁代谢的情况，其中HbH病患者29例为缺失型HbH病，另外7例为突变型仅1例为HbHCS病患者，所有患者都未曾输血，或只是偶尔输血（定义为感染或妊娠时输血，5年甚至5年以上内输血量小于10U），显示TI患者hepcidin要低于HbH病，肝铁及SF均高于HbH病，TI患者GDF15明显增高，而HbH病患者尽管sTfR增高其GDF15平均值并不高于正常人,且TI患者hepcidin/GDF15水平比HbH病患者低100倍。大量研究显示红系无效造血时GDF-15、sTfR为调节hepcidin的主要因子[16]。其中GDF-15主要由晚期红系组细胞表达主要反应无效造血（ineffectiveerythropoiesis，IE）,而可溶性转铁蛋白受体(solubletransferrinreceptor，sTfR)主要反应总的红细胞生成31 情况，既包括无效造血也包括有效的红系生成[17,18]。我们的研究同样显示HbHCS病未切脾患者GDF15平均水平在正常范围内，由此可见TI患者无效造血较HbHCS病患者更明显，因而其对hepcidin的抑制更为严重。Hepcidin主要受贫血下调和铁负荷上调的双重调节，虽然HbHCS病切脾患者GDF15、sTfR与未切脾组无明显差异，但Hb水平有明显的上升贫血改善、血清铁蛋白（SF）升高，二者均可导致hepcidin上调。然而相关分析显示切脾组hepcidin水平与LNSF、GDF-15及年龄均正相关，LNSF为hepcidin独立影响因素（b=0.683,p=0.001）。说明切脾组hepcidin水平主要受到LNSF的上调，上调的hepcidin可导致肠道铁吸收减少可利用铁减少，但巨噬细胞铁蛋白的合成增加，进一步解释了切脾组肝铁下降而SF上升的“矛盾现象”。然而国外对TM切脾患者（44例）与未切脾者（6例）铁代谢的比较显示，切脾组hepcidin有更低的趋势，但无显著性差异，并且两组肝铁、SF水平无明显差异[19]。另外在TI的研究显示切脾组GDF15明显高于未切脾组，并且GDF15与SF、肝铁正相关，与Hb负相关，切脾加重了其无效造血，且铁负荷受到其无效造血的影响[20]。以上HbHCS与TI、TM的差异可能主要源于其发病机制的不同，由于HbHCS病患者红细胞破坏主要在脾脏，切脾虽然没有明显改善HbHCS患者的无效造血但脾脏对红细胞的破坏明显减少，贫血明显改善，hepcidin上调；而TI、TM患者主要源于骨髓无效造血，切脾对其效果可能并不明显甚至加重其无效造血，因而TM患者hepcidin并没有上调。由于地贫患者hepcidin往往受到铁负荷上调及无效造血贫血下调这两种相反因素的作用，因而采用hepcidin/SF可纠正SF对hepcidin的影响，可更好表示铁负荷下的铁代谢调节水平反应铁代谢紊乱情况[21]。32 我们的研究显示HbHCS病未切脾组患者hepcidin/SF低于正常对照组，提示HbHCS病患者铁负荷下hepcidin的生成不足铁代谢的失调。然而，Origa等[15]研究显示HbH病患者hepcidin/SF水平普遍偏低但仍然在正常范围水平内，但其研究对象大部分为缺失型HbH病患者，这种差异可能源于缺失型HbH病相对于非缺失型HbH病患者其贫血及铁超载水平往往更轻[7,22]，铁代谢失衡相对较轻hepcidin/SF相对正常。Elet等[21]和Origa等[14]发现TI患者的hepcidin/SF水平也均相对偏低。Chauhanet等[16]研究显示重型β地贫患者血清hepcidin/SF平均水平也明显低于正常人（0.0055（0.0001-0.0272）vs0.378（0.0023-1.893））。虽然在不同的研究中hepcidin/SF正常水平存在差异，但均提示地贫患者铁负荷下hepcidin表达相对不足铁代谢的失衡。HbHCS病切脾患者仍然存在铁代谢失衡。虽然切脾组SF升高hepcidin水平上调，且与正常对照组无明显差异看似接近正常，但切脾患者hepcidin/SF水平仍低于正常对照组，且与未切脾组无明显差异，说明虽然切脾改善了患者的贫血，但是铁代谢紊乱并没有得到改善。那么，其潜在的原因为何？我们进一步研究了铁负荷下hepcidin影响因素，表明其主要受无效造血的影响。相关分析显示在切脾患者中hepcidin/SF水平仅与GDF-15呈负相关；在未切脾患者中其与GDF-15，sTfR及年龄均负相关，但多元回归分析显示仅GDF15为hepcidin/SF的唯一的独立影响因素。因此我们推测在HbHCS病患者中无论切脾与否，无效造血为调节hepcidin的主要因素，无效造血红系生成铁的需求增加可能为铁代谢的驱动力量。切脾组与未切脾组GDF15与正常组无明显差异，说明HbHCS病患者无效造血并不明显，切33 脾虽然改善了其贫血状态，但对其无效造血影响并不大，因而hepcidin/SF变化并不明显。总之，我们的研究显示，切脾提高了HbHCS病患者的血红蛋白水平改善其贫血症状，hepcidin水平恢复至正常水平,但hepcidin/SF水平的改善并不明显，铁代谢紊乱仍然存在，其主要原因可能是由于无效造血红系生成对铁代谢的驱动，但其潜在机制尚不明确，有待进一步研究。另外，hepcidin/SF能更好的反应地贫患者铁负荷下铁调节的相对能力，可作为评估铁代谢能力的良好指标。4结论（1）切脾虽然增加了HbHCS病患者的血清铁蛋白水平但改善了肝铁沉积；（2）HbHCS病患者无论切脾与否，SF均可反应肝铁情况，但对于切脾患*者，同样的SF可能会高估其肝铁沉积，采用SF联合肝脏MRIT2可更好的反应HbHCS病患者铁负荷情况；（3）HbHCS病脾切除患者贫血得到改善，SF升高，hepcidin异常得到部分纠正，可能是减轻内脏铁负荷的原因；（4）以hepcidin/SF为代表的铁调节代谢紊乱情况在脾切除患者并未得到根本纠正，无效造血GDF-15可能为抑制hepcidin表达的主要因素,在hepcidin-SF轴中起着重要的作用。34 全文小结*本文采用3.0TMRIT2检测肝铁来评估切脾对肝铁负荷的影响，并观察切脾组与未切脾组hepcidin的表达水平分析其影响因素来探讨切脾对HbHCS病患者铁代谢调节的影响。得出以下结果：1.HbHCS病患者切脾组*SF升高，但肝脏MRIT2升高表明其肝铁沉积下降，切脾降低了肝脏铁负荷；2.HbHCS病患者无论切脾与否，SF均可反应肝铁情况，但对于切脾患者，*同样的SF可能会高估其肝铁沉积，采用SF联合肝脏MRIT2可更好的反应HbHCS病患者铁负荷情况；3.HbHCS病切脾组患者贫血改善、SF升高，hepcidin上调肠道铁吸收减少，部分解释了脾切除术患者SF升高和肝铁下降的分离现象；4.脾切除组hepcidin/SF水平仍较低，表明切脾患者的铁调节代谢紊乱并未完全纠正；5.HbHCS病患者，无论切脾与否，GDF-15可能为抑制hepcidin表达的主要因素,无效造血在hepcidin-SF轴中起着重要的作用。本课题观察了脾切除术对HbHCS病患者肝脏铁负荷的影响并探讨了铁负荷变化的机制，为今后不同地贫患者铁负荷的评估、去铁时机及去铁治疗提供了新的思路。但是，本课题两个研究均为横断面研究，不是直接进行切脾患者切脾前与切脾后的对比，因而可能存在一定的混杂因素。另外由于炎症可以升高SF及上调hepcidin，SF、hepcidin是否受到炎症因子的影响有待进一步研究。本课题为今后研究切脾前后铁负荷的变化及铁代谢调节打下了一定的基础，课题将在无效造血对地贫铁代谢影响、地贫铁负荷与炎症关系等方面做进一步的研究。35 参考文献1.PeyssonnauxC,ZinkernagelAS,DattaV,etc.TLR4-dependenthepcidinexpressionbymyeloidcellsinresponsetobacterialpathogens.Blood,2006,107:3727-3732.2.ParkCH,ValoreEV,WaringAJ,etc.Hepcidin,aurinaryantimicrobialpeptidesynthesizedintheliver.JBiolChem,2001,276:7806-7810.3.PietrangeloA.Hepcidininhumanirondisorders:therapeuticimplications.JHepatol,2011,54:173-181.4.SunCC,VajaV,BabittJL,etc.Targetingthehepcidin-ferroportinaxistodevelopnewtreatmentstrategiesforanemiaofchronicdiseaseandanemiaofinflammation.AmJHematol,2012,87:392-400.5.NemethE,ValoreEV,TerritoM,etc.Hepcidin,aputativemediatorofanemiaofinflammation,isatypeIIacute-phaseprotein.Blood,2003,101:2461-2463.6.PigeonC,IlyinG,CourselaudB,etc.Anewmouseliver-specificgene,encodingaproteinhomologoustohumanantimicrobialpeptidehepcidin,isoverexpressedduringironoverload.JBiolChem,2001,276:7811-7819.7.YinXL,ZhangXH,ZhouTH,etc.HemoglobinHdiseaseinGuangxiprovince,SouthernChina:clinicalreviewof357patients.ActaHaematol,2010,124:86-91.8.RIGASDA,KOLERRD.DecreasederythrocytesurvivalinhemoglobinHdiseaseasaresultoftheabnormalpropertiesofhemoglobinH:thebenefitofsplenectomy.Blood,1961,18:1-17.9.Al-SalemAH,NasserullaZ.Splenectomyforchildrenwiththalassemia.IntSurg,2002,87:269-273.36 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综述LPI的检测及其临床意义[摘要]铁是人体重要的微量元素，然而铁也具有细胞毒性。铁超载引起的心脏并发症是地贫患者常见的死亡原因，目前评估铁负荷的指标如血清铁蛋白、肝活检、MRI等均有一定的局限性。铁超载铁游离时可形成血浆不稳定铁（labileplasmairon，LPI），铁毒性与LPI密切相关，其可催化活性氧簇的形成引起肝脏、心脏、内分泌腺体等脏器的损伤并促进微生物的生长及肿瘤的发生。检测LPI对于评估铁超载及指导输血、去铁治疗具有重要意义。[关键词]血浆不稳定铁；铁超载MeasurementandClinicalSignificanceofLabilePlasmaIron[Abstract]Ironisanessentialtraceelementinhumanbody,butalsoiscytotoxic.Cardiaccomplicationscausedbyironoverloadarethemostcommoncauseofdeathinpatientswiththalassemia,butthecurrentassessmentofironloadsuchasserumferritin,liverbiopsy,MRIhassomelimitations.Labileplasmairon(LPI)istheformofironpresentedinironoverloadorwhentheironisfree.IrontoxicityiscloselyrelatedtotheLPI,whichcancatalyzetheformationofreactiveoxygenspecies,causingdamagetotheliver,heartandendocrineglands,etc.andpromotingthegrowthofmicroorganismsandtheoccurrenceoftumor.LPIhasgreatsignificancetoserveasgoodindicatorsofironoverloadandasguidelinesforthetreatmentofbloodtransfusionandironchelation.[Keywords]Labileplasmairon;Thalassemia39 铁是人体重要的微量元素，是构成血红蛋白参与氧化反应及细胞增殖的必需元素，铁也具细胞毒性。铁游离时可形成血浆不稳定铁（labileplasmairon，LPI），LPI极不稳定可通过细胞膜沉积在心脏、肝脏、内分泌器官等可引起肝硬化、心衰、糖尿病等并发症，也可促进多种微生物的生长增加感染等风险。本文就LPI的定义、检验方法及临床意义做一综述。1LPI的定义及其沿革在血清中，铁主要与转铁蛋白结合，正常人血清中转铁蛋白饱和度约为20%-35%，当转铁蛋白逐渐饱和时，血清中可出现非转铁蛋白结合铁(non[1]transferringboundiron，NTBI)，即不与转铁蛋白结合的游离铁。这些NTBI可与白蛋白、柠檬酸、醋酸、DNA等诸多阴离子结合，但结合松散极[2]不稳定。NTBI中有一部分铁能够迅速地透细胞膜、进入细胞，产生氧自由基，导致细胞组织损伤，这部分铁称为血浆不稳定铁（labileplasmairon，[3]LPI）。LPI中二价铁与三价铁极不稳定，可通过芬顿反应产生活性氧簇，并且产生具有高度活性的羟自由基损害机体。LPI具有以下特点：不稳定能够穿过细胞膜；促进氧自由基的形成；可被螯合剂螯合。2LPI的检测利用LPI能够产生氧自由基的原理，可以用荧光法检测LPI浓度。二氢若丹明(dihydrorhodamine123,DHR)可与氧自由基反应产生荧光，生理浓度的抗坏血酸可促进LPI进入氧化还原反应产生氧自由基，与DHR反应产生荧光。由于反应过程中会消耗LPI，为防止血样中其它NTBI或转铁蛋白结合铁转化成新的LPI，需使用铁螯合剂去铁酮或去铁胺阻断，以保证反[3,4]应的特异性，准确评估LPI。反应过程如下：（1）抗坏血酸将三价铁还40 原为二价铁；（2）二价铁将电子转移给O2形成超氧化物；（3）超氧化物歧化为H2O2；（4）二价铁将电子转移给H2O2形成羟基；（4）羟基与罗丹明反应产生荧光(见图6)。图6LPI的检测3LPI评估铁超载程度铁是人体代谢的必需元素之一，正常成年人每天需铁量约为20-25mg，其中绝大部分来自衰老破坏的红细胞，剩余的由肠道每天吸收量约1-2mg进行补充；同时机体每天通过胆汁和粪便排泄1-2mg铁，维持铁的平衡。缺铁时胃肠道铁吸收可以增加；但是胆道和肠道铁的排泄是相对固定的。由于人体缺乏有效的排泄过量铁的机制，铁过多时可导致铁在体内沉积导致铁超载。通常认为，血清铁蛋白（serumferritin,SF）>1000ug/L可诊断铁超载。超载的铁会沉积在肝脏、心脏、内分泌器官等靶器官，引起肝硬化、心衰、糖尿病、生长发育障碍等，严重影响患者的预后及生活质量。3.1铁超载的检测指标目前评估铁超载的指标主要有血清铁蛋白、肝活检、MRI等。血清铁蛋白为评估铁超载的常用方法，简单易行可重复性高。但铁蛋白是急性时相41 蛋白，易受输血、炎症等影响，故并不能准确反映铁超载水平。肝穿刺活检为测定肝内铁沉积的金标准。但为有创操作且不易重复，由于肝铁浓度分布的不均其准确性也受到质疑。另外有研究显示铁超载患者肝铁沉积与[5,6]心铁并不一致，肝铁浓度不能反应全身脏器铁超载情况，因而其在临床*中的应用较为局限。磁共振成像T2作为一种无创检查是目前评估心肌铁超**载的最佳方法。器官铁含量增加T2值缩短，心肌T2＜20ms提示铁超载。磁共振使用范围较广，还可评估其他脏器如肝脏、胰腺等铁沉积情况，由于其安全可靠目前受到重视，但价格昂贵、设备复杂，限制了其在临床中的使用。3.2铁超载患者LPI的水平及其与肝脏、心脏铁超载的关联[3]Esposito等研究显示，正常人血清几乎检测不到LPI，一般低于0.45umol/l。在非输血依赖型HbE/β-地贫铁超载患者中LPI高达[7]1-16umol/l，与NTBI显著相关。Pootrakul等在17名去铁酮治疗的HbE/β-地贫患者检测其LPI显示，血清转铁蛋白饱和度（Tfs）＞85%时97%的血清（n=267）LPI＞0.4umol/l（3.1±0.2umol/l）,转铁蛋白饱和度＜85%时仅4%的LPI＞0.4umol/l。肝脏是铁储存和代谢的最主要器官，铁超载时往往首先累及肝脏，检测LPI对于评估肝铁沉积有重要意义。在13名地贫铁超载患者研究中显示，血清铁蛋白平均水平为6334ngmL，LPI初始水平（0.98±0.82umolL）与肝铁浓度（28.6±10.3mgFeg）显著相关(R=0.63,P=0.0198)，去铁[8]治疗52周后LPI与肝铁浓度也显著相关(R=0.55,P=0.024)。LPI也反映了心肌铁沉积和心脏损伤。对40名输血依赖型β-地贫患[4]者的研究显示，80%合并心脏并发症患者LPI＞0.5umol/l。一项纳入2642 名地贫女性的研究中显示，心肌铁MRIT2*（19.4±9.4ms）与LPI（0.8±1.0umol/l）及NTBI(4.2±2.4umol/l)均负相关（r=－0.5;P=0.04;r=[9]－0.4;P=0.059）。相反，镰刀形细胞贫血患者虽然有铁超载，但LPI增[10,11]高者很少，很少有患者出现心脏并发症。由此可见LPI异常可能预示着心肌铁超载，LPI可能对于评估心肌铁超载具有重要意义，但仍需大量的临床实验进一步明确其价值。4LPI与去铁治疗铁鳌合剂为目前治疗铁超载主要方法，目前的去铁剂有去铁胺（deferoxamine,DFO）、去铁酮(deferiprone,DFP，L1)、地拉罗司(deferasirox,DFR)，均可选择性结合体内的铁离子，促进铁的排泄，降低体内铁负荷减少铁沉积。由于铁超载是通过LPI才能产生氧自由基、损害脏器功能，因此有学者认为去铁治疗最重要的目标是LPI浓度持续降至正常，而非血清铁蛋白浓度。不同的去铁药物由于其半衰期不同，用药间歇时LPI的浓度有所不同，因而对患者的“持续保护时间”也有明显的差异。去铁胺停药2小时内检[7]测不到LPI，此后逐渐上升，因此持续应用更有利于降低LPI浓度、提高[12]去铁效果。服用去铁酮（3次/日）后LPI下降2-3小时后又升高，夜间及早上均出现高峰，相同剂量分为4次口服，可以更有效地降低LPI浓度，其白天均值由0.66±0.14umol/l降到0.50±0.12umol/l,LPI累积[4]量由5.33umol/l降为3.99umol/l。而地拉罗司其半衰期长，单次给药[8]可达到24小时持续螯合覆盖，从而减少机体铁沉积及器官的损伤。另外，地拉罗司能够降低输血依赖型MDS患者的铁蛋白及LPI，改善肝[13]功能及血液学指标，延长患者的生存期。List等研究显示，173名输血43 依赖型MDS患者地拉罗司治疗后，铁蛋白在第1、2、3年分别下降23%（n=91）、36.7%（n=49）、36.5%（n=33），铁蛋白的下降与AST的改善明显正相关，LPI过高的患者（n=68）13周后LPI均正常，转铁蛋白饱和度由91%（n=172）降到67%（n=90）与LPI平行下降，49周后LPI与转铁蛋白饱和度显著正相关(n=69;r=0.363;P=0.002），28%的患者（41/173）血液学得到改善，其中仅7名患者接受生长因子或MDS治疗，虽然血液学改善的患者其LPI变化与未改善的患者无明显区别，但其总的生存期相对较长。另一项研究也[14]显示，MDS患者地拉罗司治疗12周后LPI均降至正常水平（＜0.4umol/l），部分患者血液学及输血需求均得到改善。有研究显示LPI比铁蛋白更敏感，可作为评估铁超载患者去铁疗效的早期指标。地贫患者口服去铁酮(50mg/kg，一天两次)13到17个月后LPI从5.1±0.5umol/l降到2.18±0.24umol/l，LPI下降速度最快，在6-8个月下降到最低水平，而铁蛋白及红细胞膜铁则在10-12月后才降到最低水平，转铁蛋白饱和度和血清铁一直无明显变化，而LPI及肝铁浓度均下[7,15]降了50%-80%。由于LPI的下降较其它铁负荷指标要快，因此有学者探索利用LPI早期调整去铁策略、提高去铁效果。去铁胺需静脉注射或皮下注射，患者往[4]往服药依从性不好，Breuer等研究显示，联用去铁酮、去铁胺可使LPI持续在正常水平，效果优于单用去铁胺或去铁酮。地贫患者去铁胺联用地拉罗司可使LPI进一步下降0.03±0.01umol/l(p=0.006)，延长去铁胺[16]使用间隔并有效降低机体铁负荷。5LPI与输血国外研究显示红细胞的存储期限可达42天，红细胞在储存过程中由44 于各种生化代谢，变形能力下降红细胞受到损伤存活率下降，输注的部分红细胞会被肝脾等巨噬系统吞噬释放出铁。检测不同储存时间的血液显示，[17]陈旧血（17至22天）中可检测到NTBI，储存时间越长NTBI越高。因此理论上输注陈旧血可能会引起LPI升高，并影响患者预后。在小鼠的模型中，输注陈旧血可导致NTBI短暂的升高，造成组织急[18]性铁沉积，引发炎症。14名健康供者，抽取2份滤白红细胞，分别体外保存3至7天（新鲜血）和40至42天（陈旧血）回输，陈旧血在输注后[19]出现一过性NTBI上升。动物实验也证实，小猎犬输注陈旧血出现一过性[20]LPI上升，死亡率增加。综上所述，铁是人体重要的微量元素，铁超载及输注陈旧血时均可出现游离铁形成NTBI、自由铁、不稳定铁池等，但其对机体损伤的根本在于LPI的形成。LPI可产生活性氧簇尤其是高毒性的羟自由基损伤肝脏、心脏、内分泌腺体等脏器引起肝硬化、心衰糖尿病、生长发育障碍等并发症，并促进微生物的生长及肿瘤的发生。目前的实验室指标如血清铁蛋白、肝活检、MRI等对于评估铁负荷均有一定的局限性，因此寻找一种动态、准确、无创的方法具有重要意义。研究显示LPI为脏器损伤的根本，且其与心脏、肝脏铁沉积具有一定相关性，去铁治疗时增加患者服药的依从性，足量去铁或者联合去铁治疗可更有效降低LPI进而减少其对机体的损伤，LPI对于评估铁超载、脏器铁沉积及指导评估去铁治疗有着广阔的前景，有待深入研究。但LPI循环速率较铁蛋白及肝铁沉积快，易受患者去铁依从性的影响，且在不同的疾病中其基础水平存在差异，评估时应引起注意。45 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致谢首先，感谢我的导师尹晓林教授，感谢导师在这三年来对我的学业及临床的指导，每次对我论文的细心指导及点拨、鼓励与肯定，对我生活上无微不至的关心和照顾。感谢导师对我的尊尊教诲，教我如何做人做事。导师的为人处事及对科研的严谨、实事求是的态度，在临床的认真踏实、无穷探索及谦卑的精神，是我这辈子都值得学习的，将是我一生的财富。其次，感谢科室张新华主任、周天红副主任及各位老师对我无尽的支持与帮助，感谢科室陈永升老师、王丽老师、呼吸科石磊老师、老干科杨振老师及心内科覃善都老师等对我临床的指导，感谢普外科、影像科、检验科、地贫实验室等相关人员对课题所做的贡献与帮助。同时感谢桂林医学院为我提供了研究生学习的平台，感谢我的研究生老师及同学们，给我帮助让我不断进步。感谢中国人民解放军第三0三医院为我提供了学习及实践的平台，感谢教学办郑洁英主任、何伶老师等对我的帮助。另外，特别感谢师母尹红英教授对我生活及学习上无微不至的关心与帮助，教我如何做人及学习应有的态度。感谢广西师大叶芳贵教授对我前期实验的指导与帮助。感谢师妹黄琴、李云双等对我的帮助。感谢各位老师及答辩委员对我论文所提的宝贵意见。最后，感谢我的家人一直以来对我的支持，感谢所有帮助我给我启发的人，谢谢你们！50