鞘内注射人脐带间充质干细胞对大鼠神经病理性疼痛的影响

《鞘内注射人脐带间充质干细胞对大鼠神经病理性疼痛的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

＂－－古．分类号Ｒ４密级公开校代码１０巧５ＵＤＣ６１０学Ｉ義孝义索ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＯＦＳＯＵＴＨＣＨＩＮＡ硕ｄｒ学位论文（专业学位）Ｉ输内法射人勝带间充质干细胞对大鼠神绞病理性疼痛的影响研巧生姓名：冯娟指导教师、职称：巧啸玲主任医师专业学位类别（领域）：临床医学（麻醉学）研究方向：神经病理性疼痛一医院所在学院：南华大学附属第二〇—六年五月 ＵＮＩＮＡＩＶＥＲＳＩＴＹＯＦｓｏｕ了ＨＣＨ论文题目：藉内注射人勝带间充质干细胞对大鼠神经病理性疼痛的影响论文作者签名：＾指导教师签名：于论文评阅人１：下骗，副教授，南华大学附屈第二医院、谭演湘，副教授，衡阳市中屯评阅人２；医隨３，评阅人；干白岩，副教授南华火学附属南华医院，稱导，」海答辩委员会主席：闻乂翔，教授交通大学附扇仁济輕院１：不賴明委员，教暢，硕丹，南华乂学附属第二候院委员２；偉亦九，副教授，硕导，南华大学附屆南华医院－３巧阳，硕导乂学附屈第医院，，，南华委员；丰副郵授委员４：扭雪霉，丰件展师，衞阳市中私展院答辩Ｕ期：２０１６年０５巧０７日 Ｉ南华大学学位论文原创性声明工作及取得的研巧本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下地进方行外的研究经成发果表。尽我所知，除了论文中特别加际注和致谢的，论文中不包含其他人己或撰写过的研巧成果，也不包含为获得南华大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研巧所作的贡献均已在论文中作了明确的说？明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名；７ｒ南华大学学位论文版权使用授权书；＝本学位论文是本人在南华大学攻读（博±学位期间在导师指导下完成的学＾１其它单位的名论位论文。本论文的研巧成果归南华大学所有，本论文的研巧内容不得＾＾位义发表。本人同意南华大学有关保留、使用学位论文的规定，全目Ｐ部：或学校部有权保留学采文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可１＾＾公布学位论文的南分内容，可＾用复印、缩印或其它手段保留学位论文；学校可根据国家或湖省有关部口规定送交学位论文。同意学校将论文加入《中国优秀博硕古学位论文全文数据库》，并按科《中国优秀博硕±学位论文全文数据库出版章程》规论定享受相关权益。同意授权中国学信会息技术研究所将本学位论文收录到《中国学位文全文数据库》，并通过网络向社公众提供信息服务。对于涉密的学位论文，解密后适用该授权。，作者签名：石知年月非為＊（＞导师签名；－沪年ｆ月日 鞘内注射人脐带间充质干细胞对大鼠神经病理性疼痛的影响摘要：目的观察鞘内注射人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）对脊神经结扎（SNL）大鼠神经病理性疼痛（NP）行为学、炎症因子水平、脊髓背角小胶质细胞和星形胶质细胞激活的影响。方法选择鞘内置管成功无运动功能异常的成年雄性SD大鼠48只，体重150-200g，随机均分为3组（n=16）：Sham组（假手术+细胞培养液）、Control组（SNL+细胞培养液）、Treatment组（SNL+hUC-MSCs）。SNL术后第3天Sham组和Control组鞘内注射细胞培养液，Treatment组鞘内注射hUC-MSCs。各组分别于术前1d（基础值）和术后3、7、14d测机械痛阈（Mechanicalpawwithdrawalthreshold,PWT）和热痛阈（Thermalpawwithdrawallatency,PWL）。术后14d痛阈测定后取SD大鼠新鲜脊髓组织，行酶联免疫吸附试验（Enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）测定炎症因子水平，免疫荧光及免疫印迹（WesternBlot,WB）法测脊髓背角星形胶质细胞和小胶质细胞激活情况。结果1.与Sham组比较，Control组术后3、7、14dPWT及PWL均降低（P＜0.05）。与control组比较，Treatment组术后7、14dPWT和PWL明显升高（P＜0.05）。2.与Sham组比较，Control组的促炎症因子水平明显升高（P＜0.05）。与Control组比较，Treatment组促炎症因子水平明显降低（P＜0.05）。与Control组比较，Treatment组抗炎症因子水平升高（P＜0.05），3.与Sham组比较，Control组的胶质纤维酸性蛋白（GFAP）及离子钙接头蛋白分子1(Iba-1)表达明显增多（P＜0.05）。Treatment组与I Control组比较，GFAP及Iba-1表达明显减少（P＜0.05）。结论鞘内注射hUC-MSCs可以通过减少促炎因子水平，增加抗炎因子水平，抑制星形胶质细胞和小胶质细胞的激活从而对SNL模型引起的NP起到治疗的作用。关键词：神经病理性疼痛；人脐带间充质干细胞；星形胶质细胞；小胶质细胞；炎症因子II TheeffectsofintrathecallyinjectedofhumanumbilicalcordmesenchymalstemcellsonneuropathicpaininratsJuanFeng(Anesthesiology)DirectedbyXiaolingHuAbstract:ObjectivesToobservetheeffectsofintrathecalinjectionofhumanumbilicalcordmesenchymalstemcells(hUC-MSCs)inratswithspinalnerveligation(SNL)onneuropathicpain-(NP)likebehaviorsandtheexpressionofinflammatoryfactors,theactivationofglia(microgliaandastrocytes)inspinalcorddorsalhorn.MethodsForty-eightMaleSprague-Dawleyratsweighting150~200gwithoutmotordysfunctionaftersuccessfulintrathecalcatheterplacementwererandomlydividedintothreegroups(n=16):shamgroup(shamoperation+cellculturesfluidgroup),controlgroup(SNL+cellculturefluidgroup)andtreatmentgroup(SNL+hUC-MSCsgroup).Ratsinshamgroupandcontrolgroupwereintrathecallyinjectedofcellculturemediumonday3afterSNL.WhileratsintreatmentgroupwereintrathecallytreatedwithhUC-MSCsonday3afterSNL.Mechanicalpawwithdrawalthreshold(PWT)andthermalpawwithdrawallatency(PWL)weremeasuredonDay1beforesurgery(baseline)andDay3,7,14daftersurgery.FreshspinalcordtissueweretakenoutafterbehavioralassessmentonDay14aftersurgery.TheexpressionoflevelsofinflammatoryfactorsweremeasuredbyEnzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA),astrocytesandmicrogliaactivationinspinaldorsalhornweremeasuredbyimmunofluorescenceandWesternblot(WB).Results1.Comparedwiththeshamgroup,thePWTandPWLweredecreaedIII at3d,7d,and14dafterspinalnerveligation(P<0.05).Comparedwiththecontrolgroup,thePWTandPWLoftreatmentgroupweresignificantlyincreasedat7dand14daftersurgery(P<0.05).2.Comparedwiththeshamgroup,thelevelsofpro-inflammatorycytokinesincontrolgroupweresignificantlyincreased(P<0.05).Comparedwiththecontrolgroup,thelevelsofpro-inflammatorycytokinesintreatmentgroupweresignificantlyreduced(P<0.05).Comparedwiththecontrolgroup,thelevelsofanti-inflammatorycytokineoftreatmentgroupweresignificantlyincreased(P<0.05).3.Comparedwiththeshamgroup,theexpressionofglialfibrillaryacidicprotein(GFAP)andionizedcalciumadapterproteinmolecule1(Iba-1)incontrolgroupwassignificantlyincreased(P<0.05).Treatmentgroupcomparedwiththecontrolgroup,theexpressionofGFAPandIba-1wassignificantlyreduced(P<0.05).ConclusionsTheintrathecalinjectionofhUC-MSCscanpreventandtreatNPfromSNLbyreducinglevelsofpro-inflammatorycytokinesandincreasinglevelsofanti-inflammatorycytokines,suppressingactivationofastrocytesandmicroglia.Keywords:neuropathicpainhumanumbilicalcord-derivedmesenchymalstemcellsmicrogliaastrocyteinflammatorycytokinesIV 中英文缩写对照英文简称英文全称中文全称NPNeuropathicpain神经病理性疼痛SNLSpinalnerveligation脊神经结扎胶质纤维酸性蛋白GFAPGlialfibrillaryacidicproteinIba-1Ionizedcalciumbindingadaptermolecule1离子钙接头蛋白分子1MSCsMesenchymalstemcells间充质干细胞hUC-MSCsHumanumbilicalcord-derivedmesenchymalstemcells人脐带间充质干细胞ELISAEnzymelinkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验WBWesternBlot免疫印迹试验IL-17AInterleukin-17A白细胞介素-17AIL-1βInterleukin-1β白细胞介素-1βIL-10Interleukin-10白细胞介素-10PWTMechanicalpawwithdrawalthreshold机械缩爪压力阈值PWLThermalpawwithdrawallatency热缩爪延迟时间PBSPhosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲盐水V 目录摘要........................................................................................................................IAbstract..............................................................................................................III中英文缩写对照.................................................................................................Ⅴ第一章前言...................................................................................................1第二章材料和方法...........................................................................................3第三章结果………………………………………………………………15第四章讨论.................................................................................................21第五章结论.................................................................................................25参考文献.............................................................................................................27文献综述.............................................................................................................35硕士期间发表的论文……………………………………………………..43致谢.....................................................................................................................45 第一章前言神经病理性疼痛（neuropathicpain,NP)是指由躯体感觉系统的病变或疾病所引起的一系列疼痛的总称[1]。NP主要表现为刺激诱发性疼痛和自发性疼痛。自发性疼痛也叫刺激非依赖性疼痛，患者通常在不依赖外界刺激的条件下出现阵发性或持续性疼痛，表现为烧灼样，针刺样或刀割样疼痛[2]。而刺激诱发性疼痛通常表现为痛觉超敏(allodynia)和痛觉过敏(hyperalgesia)。痛觉超敏是对非伤害性刺激表现出疼痛感觉，而痛觉过敏是机体对正常的伤害性刺激反应性增强[3]。具有神经性疼痛特征的慢性疼痛常常呈现出病程慢性化、治疗效果差、易致患者出现抑郁、焦虑等精神症状的特点，严重影响了患者的生活质量，给个体和社会带来了巨大的经济负担[4]。一项评估全球疾病负担的研究发现，因累及腰段脊髓和/或脊神经导致的腰背痛及颈肩痛占到了劳力丧失寿命年（yearslivedwithdisability,YLDs）的15%，分别为第1和第4大因素[5]。在我国，最近的统计显示，仅腰背痛1年的患病率就高达58.3%[6]。因此，寻找有效的治疗NP的方法是当前国内外的研究重点。大量的研究证实，脊髓背角免疫细胞在NP的发生和发展过程中起着重要的作用[7-10]。外周神经损伤后，小胶质细胞和星形胶质细胞出现明显的增值活化，其表面标志物Iba-1（小胶质细胞）及GFAP（星形胶质细胞）在脊髓背角中的表达明显增多，活化的胶质细胞可以分泌大量的细胞因子，如：炎症介质、趋化细胞因子和生长因子等[11]。这些细胞因子在NP的中枢敏化过程中起着重要的作用。如：鞘内注射IL-1β中和抗体可以明显缓解NP的疼痛症状并抑制脊髓背角中NMDA受体的磷酸化[12]，IL-1β可以增加脊髓背角第二板层中神经元经AMPA受体和NMDA受体介导的Ca2+内流[8]。同样，鞘内注射IL-17可以产生明显的痛觉过敏[13]，IL-17可以磷酸化NMDA受体的NR1亚单位从而促进经NMDA受体的Ca2+内流，参与中枢敏化过程[14]。间充质干细胞（mesenchymalstemcells，MSCs）具有以下优点：1.来源丰富，取材方便，较少涉及医学伦理学问题[15]；2.增值、分化能力强；3.多向分化：可以向脂肪细胞[16,17]、骨细胞[18,19]、软骨细胞[20]、平滑肌细胞[21]、神经元[22]、肝细胞等分化[23]；4.定向归巢：对受损的细胞或组织发出的信号作出反应并向其迁移[24,25]；5.低或无免疫原性：不表达主要组织相容性复合体（MHC）Ⅱ类分子和B7分子，异体移植后能被受体很好的耐受。1 因此使其成为有前景的具有临床使用价值的种子细胞。人脐带间充质干细胞（humanumbilicalcord-derivedmesenchymalstemcells，hUC-MSCs）是一种来源于脐带组织的间充质干细胞。自Mitchell等人[26]第一次从脐带中成功地分离出脐带间充质干细胞（hUC-MSCs)并证实其神经分化潜能后，对hUC-MSCs的研究便引起了广泛关注[27]。近年来基础及临床试验都发现hUC-MSCs可以较好的用于各类疾病的治疗。例如鞘内注射hUC-MSCs可明显改善脊髓损伤患者下肢感觉及运动功能的恢复[28]。而静脉注射hUC-MSCs则可安全有效的用于类风湿性关节炎患者的治疗[29]。在治疗NP方面，以往的研究发现，鞘内反复多次注射骨髓源性的间充质干细胞可以缓解外周神经损伤引起的疼痛症状，降低脊髓背角中神经胶质细胞的活化和免疫炎症过程[30]。而在脊髓损伤引起的神经病理性疼痛小鼠，在损伤部位的中心位置反复多次注射骨髓源性间充质干细胞同样可以改善疼痛症状和脊髓的免疫炎症反应过程[31]。相比于其它MSCs，hUC-MSCs具有更强的扩增能力及低免疫原性，并具有明确的基因工程及细胞遗传学研究的应用价值，临床实用性也更强[32]。但hUC-MSCs是否也可以用于治疗NP，缓解疼痛症状及神经病理性疼痛大鼠脊髓背角中的免疫反应过程，至今仍不清楚。本研究主要通过观察鞘内注射hUC-MSCs对脊神经结扎（spinalnerveligation,SNL）大鼠痛阈、炎症因子水平、脊髓背角小胶质细胞和星形胶质细胞的活化情况的影响，探讨hUC-MSCs治疗NP的可能机制。2 第二章材料和方法2.1主要设备和药品2.1.1主要设备主要设备生产厂家4℃冰箱中国海尔-20℃冰箱中国海尔-80℃冰箱中国海尔移液器德国Eppendorf制冰机中国雪花烘干箱中国精宏石蜡切片机德国Leica离心机美国Sigma荧光显微镜日本Olympus高速离心机德国试剂配制Eppendorf电子天平德国Sartorius高速低温离心机美国Sigma转膜槽美国Bio-Rad电泳槽美国Bio-Rad3 电泳仪北京六一仪器厂化学发光荧光成像系统美国Bio-RadPVDF膜美国AmershanBiosciences数显恒温水浴锅中国国旺10μl微量进样器上海高鸽工贸有限公司ELISA试剂盒中国欣博盛生物科技有限公司ElectronicvonFrey2390意大利UGOBASILEPlantartest37370意大利UGOBASILECO2细胞培养箱美国Gibco公司超净工作台美国FORMA公司培养皿美国Corning公司流式细胞仪美国BectonDickinson公司倒置相差显微镜日本Olympus2.1.2手术器械持针器、手术刀、眼科剪、显微镊、弯钳、组织剪、线剪、无齿镊、圆针及三角针、无菌手套、3-0和4-0的缝线、无菌巾、聚乙烯PE-10导管（anilab，宁波）。2.1.3主要药品主要药品厂家Tris北京普利莱基因技术有限公司4 甘氨酸北京普利莱基因技术有限公司SDS粉北京普利莱基因技术有限公司PBS中国博士德Tween-20北京普利莱基因技术有限公司多聚甲醛美国Sigma甲醇国药集团化学试剂有限公司牛血清蛋白（BSA）美国Sigma脱脂牛奶伊利乳业股份有限公司戊巴比妥钠美国Sigma兔抗GFAP单克隆抗体武汉三鹰生物技术有限公司兔抗Iba-1单克隆抗体武汉三鹰生物技术有限公司羊抗兔IgG抗体武汉博士德生物工程有限公司羊抗小鼠IgG抗体武汉博士德生物工程有限公司FITC偶联山羊抗兔二抗武汉博士德生物工程有限公司鼠抗β-actin多克隆抗体美国Abcam上样缓冲液碧云天生物试剂研究所超敏ECL发光试剂盒碧云天生物试剂研究所SDS-PAGE凝胶试剂盒碧云天生物试剂研究所5 凯基全蛋白提取试剂盒南京凯基生物科技发展有限公司BCA蛋白浓度测定试剂盒美国PierceHanks'平衡盐溶液美国Gibco公司胶原酶美国Sigma公司2.1.4溶液配制1.电泳缓冲液：甘氨酸18.8gTris3.03gSDS1.0g蒸馏水1000ml2.转膜缓冲液：甘氨酸14.4gTris3.03g甲醇200ml蒸馏水800ml3.0.1%TBST：Tween1mlTBS5g蒸馏水1000ml4.5%BSA封闭液BSA粉2gTBST40ml5.5%脱脂牛奶封闭液脱脂奶粉2gTBST40ml6 2.2实验动物处理雄性SPF级SD大鼠48只，周龄6-8周，体重150-200g，所有动物均由武汉大学实验动物中心提供。实验前使动物熟悉环境1周，大鼠自由饮食摄水，维持12小时明暗交替，室温控制在20-25℃。2.2.1鞘内置管及动物分组按照Shih[33]等推荐的方法行鞘内置管。大鼠以2%戊巴比妥钠（50mg/kg）腹腔注射麻醉后取俯卧位，腰部垫高，四肢固定后备皮，常规消毒后铺无菌单。在L4-5椎间隙处切开一个约1cm的竖直切口，钝性分离肌肉及筋膜，将22G穿刺针的斜面朝头端并向上，针与大鼠脊柱约成20°角，针尖穿破硬脊膜大鼠出现甩尾动作,表明穿刺针在蛛网膜下腔中。经针内孔置入PE10导管，置入长度约3cm，置管时动作尽量轻柔，使导管头端尽量位于脊髓腰膨大处。此时可见有脑脊液在导管内流动，穿刺处可见脑脊液外漏，然后在筋膜处固定导管，并将PE10导管通过皮下走行于大鼠颈后部引出，导管外露约3-4cm，缝扎固定导管。用生理盐水通过微量进样器冲洗导管，然后加热封闭导管外露端以防止脑脊液外漏。最后逐层缝合手术伤口。整个手术操作过程均保持在无菌条件下实施。术后青霉素G钠（40000U/kg）腹腔注射预防感染。做完手术后大鼠分别单笼饲养，麻醉苏醒24小时后参考相关文献[34]，经导管鞘内注射20μl2%利多卡因，大鼠30s内表现为双后肢麻痹，且在数分钟内恢复，证明置管成功。鞘内置管成功无运动功能异常的大鼠48只随机均分为3组：Sham组（假手术+细胞培养液）、Control组（SNL+细胞培养液）、Treatment组（SNL+hUC-MSCs）。2.3hUC-MSCs的制备培养和鉴定人脐带组织选取的是武汉协和医院产科进行剖宫产手术的健康孕妇（18-38岁），与供者签订了知情同意书。hUC-MSCs的培养参照WangHS[23]等介绍的方法。从健康产妇中采集的人脐带放入75％乙醇中浸泡5分钟，然后在Hanks'平衡盐溶液（HBSS）中小心地去除脐带中的血管并保留其中载有间充质组织的脐带华通胶。然后将其切成大约0.5立方厘米的组织块用DMEM洗涤两次（250g离心5分钟，除去上清液部分）。沉淀物在37℃下HBSS中用2ug/ml胶原酶处理1小时，在此之后含有间质干细胞的悬浮液离心7 32（250g离心10分钟）并再悬浮。计数细胞数后，将细胞密度大约为1×10/cm的细胞悬浮液接种于含有10％胎牛血清（FBS）的DMEM培养基的6厘米培养皿中，并在5％CO2培育箱中37℃培养。培养基每3天更换一次。当80%的细胞覆盖培养皿时使用0.25％胰蛋白酶来传代。第3代MSCs（第3代细胞）通过流式细胞仪鉴定以及用于SNL大鼠鞘内注射。2.4动物模型制作2.4.1SNL模型参照Kim等[35]介绍的方法制作SNL模型。大鼠以2%戊巴比妥钠（50mg/kg）腹腔注射麻醉后取俯卧位，腰部垫高，四肢固定后备皮，常规消毒后铺无菌单。沿后正中线偏左侧平大鼠髂棘(L5~L6棘突间隙)水平上下各切开皮肤2cm。钝性分离腰椎左侧椎旁肌肉从而暴露L6横突，然后用咬骨钳咬掉大鼠L6横突，暴露L5脊神经，造模组大鼠用4-0缝线结扎L5脊神经，假手术组大鼠仅暴露左侧L5脊神经。最后逐层缝合伤口。手术时间约1h，整个手术操作过程均保持在无菌条件下实施。术后青霉素G钠(40000U/kg)腹腔注射预防感染。2.4.2细胞移植4采用微量进液器于术后第3天经导管鞘内给予Treatment组注入20ul浓度为5×10/ul的细胞悬液，Sham组和Control组注入20ul的细胞培养液（无血清DMEM培养液）。最后都采用20ul生理盐水封管。2.5机械痛阈和热痛阈的测定PWT测定按照Myers等[36]推荐的方法，于术前1天测得的大鼠左侧后爪PWT作为术前的基础PWT。各组大鼠分别于手术后第3、7、14天测定左侧后爪PWT。测定时间均选择下午14:00到16:00之间进行。在安静环境下，将大鼠放置于金属网格上的有机玻璃箱里，让大鼠适应环境约30-60min，待其基本安静后开始进行测定。选用vonFrey2390型机械性测痛仪进行测量，探针垂直置于大鼠后爪正下方，然后匀速刺激大鼠后爪脚掌正中皮肤，持续≤4S，当大鼠因疼痛出现舔足、抬足、躲避等反应时记录仪器屏幕上所显示的压力值即为PWT。每只大鼠重复测定3次，每次间隔5min，取平均值。PWL8 测定参考Shih等推荐的方法，于术前1天测定大鼠后爪PWL作为基础PWL。各组大鼠分别于手术后第3、7、14天测定左侧后爪PWL。测定时间均选择下午14:00到16:00之间进行。选用Plantartest37370红外辐射热痛测定仪，在安静环境下，将大鼠放在厚度约为3mm玻璃板上的有机玻璃箱里，让大鼠适应环境约30-60min，待其基本安静后将红外辐射光源对准大鼠后爪脚掌正中，然后按Start键开始测定，此时可见热痛仪屏幕上计时器开始计时。当大鼠因疼痛出现舔足、抬足、躲避等反应时计时器立即停止计时，该时间即为PWL。此外为防止大鼠后足底因反复测量而灼伤，设置红外光源最长照射时间为20s。每只大鼠重复测量3次，每次间隔5min，取平均值。2.6ELISA法检测大鼠同侧脊髓背角IL-17A、IL-1β、IL-10SNL术后第14天各组大鼠测完痛阈值后，每组随机选取6只过度麻醉处死。暴露大鼠脊髓部分并取出术侧脊髓的腰膨大，然后将取得的脊髓称重之后放入研磨器中，加入PBS将其制备成5%的组织匀浆液，最后离心取上清，放入-80°C冰箱保存。IL-17A、IL-1β、IL-10的ELISA检测按照相应试剂盒说明书进行操作，步骤如下：（1）从4℃冰箱中取出试剂盒，放置室温下恢复至室温，同时计算所需的微孔数量；（2）（IL-17A）将标准品稀释至1000，500，250，125，62.5，31.25,15.6，0pg/ml；（IL-1β、IL-10）将标准品稀释至4000，2000，1000，500，250，125，62.5，0pg/ml；（3）取出标本解冻。空白孔仅加入100μl标准品稀释液，其余相应的酶标孔中分别加入标本或不同浓度的标准品（100μl/孔），将反应孔封好，36℃孵箱恒温孵育1.5h；（4）甩尽孔内液体，洗板每次30s，共5次。标本孔均加入生素化抗体工作液，空白孔中则加入生物素化抗体稀释液（100μl/孔），将反应孔封好，36℃孵箱恒温孵育1h；（5）甩尽孔内液体，洗板每次30s，共5次。标本孔加入酶结合物工作液，空白孔中则均加入的酶结合物稀释液（100μl/孔），将反应孔封好，36℃孵箱恒温孵育30min。（6）打开酶标仪电源，将仪器预热，同时将检测程序设置好；（7）甩尽孔内液体，洗板每次30s，共5次。每个孔加入显色底物TMB（100μl/孔），避光36℃孵箱孵育15min；（8）加入反应终止液100μl/孔，混匀后3分钟内测量OD450值，记录结果；（9）将每个标准品OD值减去空白孔OD值所得的差值输入CurveExpert1.4软件分析数9 据，软件会得出一条最佳的OD值与标本浓度关系的函数曲线图并得出相关的计算公式，最后根据这个公式把已知的标本OD值减去空白孔OD值的差值代入即可算出标本的浓度。2.7免疫荧光染色标记2.7.1组织取材SNL术后第14天各组大鼠测完痛阈值后，每组随机选取3只大鼠，以2%戊巴比妥钠（50mg/kg）腹腔注射麻醉后取仰卧位，先将腹腔打开然后找到剑突将其提起，沿胸骨两旁剪断肋骨以暴露心脏，用眼科剪将心尖部开一小口再用硅胶管从心尖插入至主动脉，并用动脉夹固定，剪开右心耳放血。起初生理盐水需快速滴入以灌洗血液，直到右心耳流出的液体颜色为无色，且肠管肿胀，肝脏颜色变淡为止（一般需150-200ml生理盐水）。然后以PBS（0.1mol/l，pH7.4）4%多聚甲醛灌注，先快后慢。当大鼠出现尾部竖起，后肢绷直，说明已达到固定效果，可以将速度调慢（一般需250ml左右）。整个灌注所需时间大约为30min。结束灌注后，暴露脊髓，找出之前结扎的L5神经，并取出L5脊髓放入4%多聚甲醛中过夜固定，最后石蜡包埋备用。2.7.2免疫荧光标记染色观察同侧脊髓背角GFAP及Iba-1表达（1）将L5脊髓的石蜡切片放在干净的载玻片上,放入二甲苯中脱蜡（二甲苯Ⅰ15min,二甲苯Ⅱ15min），梯度酒精（100%、90%、80%、75%酒精）脱水各5min，然后用PBS漂洗，10min×3；（2）将标本放入相应体积的抗原修复液（0.01mol/L柠檬酸,PH6.0）中，微波炉中高火维持5min，中低火维持5min×2（检查抗原修复液的量不够时应及时添加），然后自然复温；（3）用免疫组化笔在脊髓切片周围画圈，然后在圈内滴加5%正常山羊血清放入湿盒中室温下封闭30-60min；（4）甩去封闭的血清，加入合适浓度的一抗（兔抗GFAP单克隆抗体或兔抗Iba-1单克隆抗体）孵育液在37℃下孵育lh，4℃过夜；（5）PBS漂洗，5min×3；（6）加入合适浓度的山羊抗兔FITC荧光二抗，在室温下孵育1h，注意避光；10 （7）PBS漂洗，5min×3；（8）甩干，放湿盒中加DAPI染色5分钟，再用PBS漂洗5min×3；（9）用50%甘油封片，然后在荧光显微镜下观察，拍片。2.8Westernblot法检测大鼠同侧脊髓背角GFAP及Iba-1表达SNL术后第14天各组大鼠于测完痛阈值后，每组随机选取6只过度麻醉处死。在冰面上取出术侧脊髓的腰膨大部分，以保留L5脊神经作为L5节段的标记。然后放入冻存管中-80℃冰箱保存。为了尽量减少蛋白质降解，取材的整个过程需动作迅速。2.8.1全蛋白提取根据相应的试剂盒说明书进行操作：每2ml裂解缓冲液中加入蛋白酶抑制剂2μl、磷酸酶抑制剂20μl、PMSF10μl，将其混匀后放于冰上保存待用。取脊髓背角组织称重后放于研磨器中，加入已配好的裂解液制备成5%的组织匀浆液（需在冰上研磨）。然后将组织匀浆液放到离心管中，然后在4℃下以12000r/min离心15min，取上清液，放入-80°C冰箱保存。2.8.2总蛋白浓度测定按照相应试剂盒说明书进行测定，步骤如下：（1）取出蛋白标本，根据计算公式：总量=（待检标本孔+标准品孔）×重复次数×每孔工作液体积得出所需工作液的总量；（2）按照说明书配制2000、1500、1000、750、500、250、125、25、0µg/ml的标准品溶液，用生理盐水将标准品溶解。按A试剂：B试剂为50:1的比例算出总工作液所需A试剂和B试剂的量，然后用微量移液器分别吸取相应的量，混匀充分后室温下放置待用；（3）在微孔板中加入各个浓度的标准品及标本（25μl/孔），然后再加入工作液（200ul/孔），在摇床上放置30s将其混匀。然后将微孔板盖子盖上，在37℃下孵育30min。此时可打开酶标仪进行预热，并将相应的测量程序设置好；（4）取出微孔板，让其逐渐恢复至室温。在酶标仪OD570下读取各微孔吸光光度值并记录；（5）将每个标准品OD值减去空白孔OD值所得的差值输入CurveExpert1.4软件分析数据，软件会得出一条最佳的OD值与标本浓度关系的函数曲线图并得出相关的计算公式，11 最后根据这个公式把已知的标本OD值减去空白孔OD值的差值代入即可算出标本的浓度。2.8.3Westernblot具体操作步骤（1）配制SDS-PAGE分离胶及浓缩胶：首先将用来制胶的玻璃板底边对齐后放入夹中卡紧，然后将其垂直并卡在架子上准备灌胶。所需添加的试剂及配方具体见以下表格分离胶和浓缩胶的配制各成分所需的体积（ml）10%分离胶5%浓缩胶蒸馏水1.31.430%Acr-Bis(29:1)1.70.331MTris，pH8.81.91MTris，pH6.80.2510%SDS0.050.0210%过硫酸铵0.050.02TEMED0.0020.002总体积5.0022.022当分离胶达到梳齿下1cm即可，然后用双蒸水液封促进凝胶。当水胶间出现折射线时再等3min左右使胶充分凝固后吸干上层的水。灌浓缩胶，然后将梳子水平插入浓缩胶中，待浓缩胶凝固后将玻璃板放入电泳液中，将梳子竖直快速轻轻拔出。（2）上样及电泳：在电泳槽中加入足够的电泳液（至少要漫过内侧玻璃板），用微量移液器冲洗每个上样孔，另外将上样缓冲液加到待检测的蛋白中再放入沸中水煮10min取出，然后将20µg待检蛋白缓慢加入上样孔中，最后加入Maker。起初选择70V恒压电泳，等到电泳至分离胶时（溴酚蓝可指示）换成100V恒压电泳，直至溴酚蓝跑至胶的底部；（3）转膜：裁好合适尺寸的PVDF膜，然后取出胶，按海棉垫-三层滤纸-胶-PVDF膜-三层滤纸-海绵垫的顺序依次叠加。整个过程尽量使胶保持湿润，同时尽量避免PVDF12 膜和胶之间产生小气泡，最后将夹子合上。在300mA恒流下转膜1.5h；（4）封闭：将转有蛋白的PVDF膜用TBST漂洗3×5min，再将其放入5%脱脂牛奶中摇床上封闭1-2h，最后用TBST漂洗3×10min；（5）一抗孵育：将相对应的一抗按比例（Iba-1和GFAP1:500，β-actin1:4000）用5%脱脂牛奶稀释，然后将膜放入一抗溶液中4℃过夜（注意膜蛋白面向上并完全浸在一抗溶液中）；（6）二抗孵育：取出PVDF膜恢复至室温，用TBST摇床上洗3×10min。将相对应的二抗用TBST按比例（1:5000）稀释，然后将膜放入相应的二抗溶液中并在摇床上室温孵育1h（膜蛋白面朝上）；（7）成像：取出PVDF膜，用TBST摇床上洗膜3×10min。在PVDF膜上加ECL液后放入荧光成像仪，即可获取所有蛋白显影后的照片；（8）条带分析：所有条带都以ImageJ分析其光密度值，目的蛋白与内参的比值即为目的蛋白的相对表达量。2.9统计分析所有的数据使用GraphpadPrism5统计软件包处理。数据以均数±标准差(x±SD)表示，除PWT、PWL组间比较采用two-wayANOVA分析以外其余组间比较均采用one-wayANOVA，P<0.05为差异有统计学意义。13 14 第三章结果3.1hUC-MSCs流式细胞仪鉴定结果通过流式细胞仪检测，第3代细胞中CD73阳性细胞数达98.15±2.09%，CD105阳性细胞数达98.56±2.05，CD90阳性细胞数达97.1±1.06%，CD45阳性细胞仅1.71±0.14%，CD34阳性细胞数仅0.33±0.16%，CD11b阳性细胞数仅0.23±0.13%，HLA-DR阳性细胞数仅0.91±0.37%。故该细胞高表达CD73、CD105、CD90，基本不表达CD45、CD34、CD11b、HLA-DR（如图1），属于典型的hUC-MSCs，故可认为hUC-MSCs的提取、分离、培养成功。15 图1流式细胞仪鉴定结果3.2疼痛阈值测定SNL术前第1天，Sham组、Control组、Treatment组PWT和PWL差异无统计学意义（P＞0.05）。SNL术后第3天，Control组与Sham组大鼠比较，Control组大鼠出现明显的的PWT及PWL的下降，并且持续到第14天（P＜0.05）；Treatment组在术后第7、14天与Control组相比，PWT及PWL均有明显的上升，差异具有统计学意义（P＜0.05）(图2，图3)。图2各组大鼠机械痛阈比较#注：Control组与Sham组比较，*P＜0.05。Control组与Treatment组比较，P＜0.05。16##Control组与Treatment组比较，P＜0.05。Control组与Treatment组比较，P＜0.05。 图3各组大鼠热痛阈比较#注：Control组与Sham组比较，*P＜0.05。Control组与Treatment组比较，P＜0.05。3.3各组大鼠脊髓背角IL-17A、IL-1β、IL-10水平ELISA法检测各组大鼠SNL术后第14天脊髓背角IL-17A、IL-1β、IL-10。结果显示，Control组与Sham组比较，IL-17A和IL-1β明显升高（P＜0.05），而Treatment组与Control组比较，IL-17A和IL-1β明显下降（P＜0.05）。此外，Treatment组与Control组比较，IL-10明显升高（P＜0.05）（图4、5、6）。图4各组大鼠脊髓背角IL-17A比较图5各组大鼠脊髓背角IL-1β比较注：Control组与Sham组比较，*P＜0.05。注：Control组与Sham组比较，*P＜0.05。##Control组与Treatment组比较，P＜0.05。Control组与Treatment组比较，P＜0.05。17 图6各组大鼠脊髓背角IL-10比较#注：Control组与Treatment组比较，P＜0.05。3.4各组脊髓背角GFAP及Iba-1免疫荧光标记染色表达免疫荧光检测脊髓背角GFAP及Iba-1，GFAP及Iba-1阳性表达呈绿色荧光，结果显示：GFAP和Iba-1的Control组荧光强度明显高于Sham组，而Treatment组的荧光强度明显低于Control组。Control组GFAP和Iba-1的积分光密度值(integratedopticaldensity,IOD)值明显高于Sham组，而Treatment组GFAP和Iba-1的IOD值低于Control组（P＜0.05）。（图7、8）。18 图7各组大鼠脊髓背角GFAP荧光染色（×100）及IOD值比较#注：Control组与Sham组比较，*P＜0.05。Control组与Treatment组比较，P＜0.05。图8各组大鼠脊髓背角Iba-1荧光染色（×100）及IOD值比较比较#注：Control组与Sham组比较，*P＜0.05。Control组与Treatment组比较，P＜0.05。19 3.5各组大鼠脊髓背角GFAP及Iba-1表达Westernblot结果显示，Control组SNL术后第14天脊髓背角GFAP和Iba-1蛋白表达明显高于Sham组，而Treatment组明显低于Control组脊髓背角GFAP和Iba-1蛋白表达（P＜0.05）（图9、10）。图9各组大鼠脊髓背角GFAP蛋白表达比较#注：Control组与Sham组比较，*P＜0.05。Control组与Treatment组比较，P＜0.05。图10各组大鼠脊髓背角Iba-1蛋白表达比较#注：Control组与Sham组比较，*P＜0.05。Control组与Treatment组比较，P＜0.05。20 第四章讨论目前还没有发现hUC-MSCs的特异性表面标志物，故还没有直接的方法鉴定hUC-MSCs。而国际细胞治疗委员会为此专门制定了MSC的判定标准[37]，应该表达的一类细胞表型CD9O、CD73、CD105必须阳性,且阳性率不能低于95%，另外为了保证MSC在原代分离培养过程中未混杂存在的一些其它细胞,需选取一组己知的MSC不表达的表型作为辅助排查的标准,CD45(白细胞标记)、CD34(内皮细胞标记和造血祖细胞)、CD14/CDllb(巨噬细胞和单核细胞标记)、HLA-DR阴性,阳性率不高于2%。故本实验选择CD45、CD34、CDllb、HLA-DR和CD105、CD73、CD90作为鉴定hUC-MSCs的指标。流式细胞仪检测第三代细胞结果显示不表达CDllb、HLA-DR、CD34、CD45，而高表达CD105、CD73、CD90，说明所培养的细胞为hUC-MSCs。SNL动物模型是研究NP的经典模型，它可以测定机械刺激和热刺激所引发的机械痛觉超敏和热痛觉过敏，SNL术后第3天会出现疼痛反应，第7天逐渐趋于稳定，而热痛觉过敏可以维持5周，机械痛觉超敏可以维持10周[35,38]。SNL模型结扎强度容易控制，所以疼痛模型差异性小，可靠性高，此外它可以完全分离脊髓非损伤节段和损伤节段。本实验选择在术后第3天鞘内注射hUC-MSCs，意在探讨hUC-MSCs对NP的影响及其可能机制。因动物模型通常无法直接定量评估其自发疼痛，故通常是通过观察其行为的变化来评估。本研究通过观察SNL术后的大鼠是否出现舔足、缩爪、重心体位改变、足底悬空等保护性行为来评判大鼠是否出现自发性痛。而采用热刺激和机械刺激分别来测定热痛阈值和机械痛阈值是目前公认的评估动物痛觉过敏和超敏比较好的检测方法。本研究的control组和treatment组在SNL术后均出现了明显的PWT和PWL的降低，而且持续到了术后14天，这与之前的研究相一致[35]。证明SNL模型建立成功。Treatment组与control组相比，术后第7、14天时treatment组的PWL和PWT明显上升，以上结果表明鞘内注射hUC-MSCs可以明显减轻NP相关的机械痛觉超敏及热痛觉过敏。而MSCs是如何起作用的到现在仍存在争议。目前研究MSCs的作用机制主要为以下几种：1.MSCs通过定向归巢迁移到神经受损区域分化为神经元或神经胶质细胞；2.21 分泌神经营养因子；3.免疫调节作用。MSCs的主要优势是具有免疫调节和多向分化功能，能够分泌有生物活性的抗炎因子和再生物质[39]。MSCs分泌广泛的生物活性物质包括：生长因子、细胞因子、趋化因子，这是它们在组织受损时的重要生物学特性[40-42]。移植MSCs后所产生的抗炎因子可以作为目前研究注射MSCs后NP得到功能改善的机制的基础。NP的发生发展过程不但涉及了神经通路而且还涉及了部分外周免疫系统参与[43]。NP表现出在神经受损的位置有炎症的存在。炎症反应导致了在组织受损区域的免疫细胞的激活和聚集。这些细胞能够释放免疫活性物质，比如细胞因子、神经营养因子、趋化因子等能够引起更广泛的免疫应答[44]。IL-1β是一种主要的促炎因子。多种慢性疼痛状态都可以引起IL-1β在脊髓中的上调，大量证据支持IL-1β在疼痛敏化中起到重要作用[11,45]。IL-1β可以导致胶质细胞释放“内毒素”从而影响神经损伤。而Siniscalco等人发现产生促炎因子IL-1β的细胞便是星形胶质细胞[42]。NP可以激活CD4+细胞从而产生IL-17，而这个炎症因子是负责在炎症过程中调节免疫反应的。有研究证明在NP的条件下IL-17可以吸引和激活巨噬细胞[46]。此外，MSC可以使得巨噬细胞过度表达抗炎细胞因子，尤其是IL-10[47]。IL-10是炎症过程的负性调节因子，它能够有效抑制所有的促炎因子的合成及其生理作用，有研究表明IL-10对NP有一定的镇痛作用[48-50]。本实验观察到control组的IL-17与IL-1β表达水平明显高于sham组，而treatment组的IL-17与IL-1β表达水平又低于control组。此外，本实验还观察到treatment组IL-10的表达水平明显高于control组。结果表明NP可以导致促炎因子的释放，而鞘内注射hUC-MSCs可以减少促炎因子表达水平，增加抗炎因子的表达水平。这与已有的研究相一致[51]。小胶质细胞在中枢神经系统中相当于巨噬细胞，在神经受损后会进一步激活并上调小胶质细胞表面标志物离子钙接头蛋白分子1(Iba-1)[52]。大量的研究表明在NP的发生发展过程中小胶质细胞是一个关键因素[53-56]。此外，小胶质细胞的激活可能参与了中枢敏化现象57。非选择性的小胶质细胞抑制剂，如米诺环素，可以减少NP[55,58-60]。星形胶质细胞是中枢神经系统中数量最多的细胞，在过去十年的研究当中表明星形胶质细胞在急性和慢性神经系统疾病当中充当了多种积极的角色[61]。有研究表明鞘内注射TNF-α孵育的星形胶质细胞可以引起小鼠产生机械痛觉超敏[62]。此外，抑制星型胶质细胞功能时可以阻断或缓解慢性疼痛的产生。在一些疼痛模型中，鞘内注射氟乙酸或氟代柠檬酸（阻断胶质细胞特异性酶一顺乌头酸酶）均对疼痛有缓解作用[63]。大量研究显示，在各类疼22 痛刺激的情况下，脊髓水平的小胶质细胞和星形胶质细胞都可以出现激活并大量表达，释放出一系列神经活性物质，这些物质可以特异性的作用于脊髓背角细胞，从而使痛觉传递神经元出于活化状态[64,65]。而星形胶质细胞的特异性标记物是胶质纤维酸性蛋白(GFAP)[66]。本实验选择用Iba-1来标志小胶质细胞，GFAP来标志星型胶质细胞，结果显示control组与sham组比较，GFAP与Iba-1表达明显增加，而treatment组与control组比较，GFAP与Iba-1表达减少，这表明了小胶质细胞和星形胶质细胞的激活参与了NP的形成，而hUC-MSCs可以减少小胶质细胞和星型胶质细胞的激活从而缓解NP。本实验的不足之处为没有标记移植的细胞，因此并没有在体内追踪其存活、分化、生长情况。但前期研究发现，经静脉移植MSCs后，仅有1.7%的细胞可以检测到[67]。鞘内注射MSCs后6天也只能在脊髓软脊膜上有少量的表达，术后21天其检测量则更少[30]。还有研究发现，经静脉移植MSCs后4周，基本检测不到MSCs的存在[68]。虽然MSCs监测不到，但其产生的作用却是持久的。一项研究表明，静脉移植MSCs后90天，其仍然可以产生改善疼痛行为的作用[51]。监测不到MSCs是由于其失去了荧光性还是已经死亡还有待进一步的研究。我们的研究发现，鞘内注射MSCs后，脊髓背角中的胶质细胞激活数量明显降低，促炎细胞因子IL-1β和IL-17的表达明显减少，抗炎细胞因子IL-10的表达明显增加。而鞘内注射细胞培养液则对胶质细胞和炎症因子的表达都没有明显的作用。这提示hUC-MSCs在脊髓背角中起着免疫调节的作用。如何有效的标记追踪hUC-MSCs在体内的存活、分化和生长情况还有待进一步研究。23 24 第五章结论鞘内注射hUC-MSCs可通过减少促炎因子水平，增加抗炎因子水平，抑制星形胶质细胞和小胶质细胞的激活从而对SNL模型引起的NP起到治疗的作用。这项研究为hUC-MSCs用于临床治疗NP方面提供了更可靠的依据，使其有望成为治疗NP的有效方法。25 26 参考文献[1]TreedeRD,JensenTS,CampbellJN,etal.Neuropathicpain:Redefinitionandagradingsystemforclinicalandresearchpurposes.Neurology.2008;70:1630-1635[2]YangZ,KlionskyDJ.Mammalianautophagy:Coremolecularmachineryandsignalingregulation.Currentopinionincellbiology.2010;22:124-131[3]BaronR,BinderA,WasnerG.Neuropathicpain:Diagnosis,pathophysiologicalmechanisms,andtreatment.TheLancet.Neurology.2010;9:807-819[4]MehraM,HillK,NichollD,etal.Theburdenofchroniclowbackpainwithandwithoutaneuropathiccomponent:Ahealthcareresourceuseandcostanalysis.Journalofmedicaleconomics.2012;15:245-252[5]VosT,FlaxmanAD,NaghaviM,etal.Yearslivedwithdisability(ylds)for1160sequelaeof289diseasesandinjuries1990-2010:Asystematicanalysisfortheglobalburdenofdiseasestudy2010.Lancet.2012;380:2163-2196[6]LiJY,WangS,HeLH,etal.Riskfactorsoflowbackpainamongthechineseoccupationalpopulation:Acase-controlstudy.Biomedicalandenvironmentalsciences:BES.2012;25:421-429[7]AustinPJ,Moalem-TaylorG.Theneuro-immunebalanceinneuropathicpain:Involvementofinflammatoryimmunecells,immune-likeglialcellsandcytokines.Journalofneuroimmunology.2010;229:26-50[8]KawasakiY,ZhangL,ChengJK,etal.Cytokinemechanismsofcentralsensitization:Distinctandoverlappingroleofinterleukin-1beta,interleukin-6,andtumornecrosisfactor-alphainregulatingsynapticandneuronalactivityinthesuperficialspinalcord.TheJournalofneuroscience:theofficialjournaloftheSocietyforNeuroscience.2008;28:5189-5194[9]GuoW,WangH,WatanabeM,etal.Glial-cytokine-neuronalinteractionsunderlyingthemechanismsofpersistentpain.TheJournalofneuroscience:theofficialjournaloftheSocietyforNeuroscience.2007;27:6006-6018[10]LiouJT,LiuFC,MaoCC,etal.Inflammationconfersdualeffectsonnociceptiveprocessinginchronicneuropathicpainmodel.Anesthesiology.2011;114:660-672[11]JiRR,BertaT,NedergaardM.Gliaandpain:Ischronicpainagliopathy?Pain.2013;15427 Suppl1:S10-28[12]ZhangRX,LiA,LiuB,etal.Il-1raalleviatesinflammatoryhyperalgesiathroughpreventingphosphorylationofnmdareceptornr-1subunitinrats.Pain.2008;135:232-239[13]KimCF,Moalem-TaylorG.Interleukin-17contributestoneuroinflammationandneuropathicpainfollowingperipheralnerveinjuryinmice.Thejournalofpain:officialjournaloftheAmericanPainSociety.2011;12:370-383[14]MengX,ZhangY,LaoL,etal.Spinalinterleukin-17promotesthermalhyperalgesiaandnmdanr1phosphorylationinaninflammatorypainratmodel.Pain.2013;154:294-305[15]HeQ,WanC,LiG.Concisereview:Multipotentmesenchymalstromalcellsinblood.StemCells.2007;25:69-77[16]DennisJE,MerriamA,AwadallahA,etal.Aquadripotentialmesenchymalprogenitorcellisolatedfromthemarrowofanadultmouse.Journalofboneandmineralresearch:theofficialjournaloftheAmericanSocietyforBoneandMineralResearch.1999;14:700-709[17]ProckopDJ.Marrowstromalcellsasstemcellsfornonhematopoietictissues.Science.1997;276:71-74[18]BruderSP,KurthAA,SheaM,etal.Boneregenerationbyimplantationofpurified,culture-expandedhumanmesenchymalstemcells.Journaloforthopaedicresearch:officialpublicationoftheOrthopaedicResearchSociety.1998;16:155-162[19]BruderSP,JaiswalN,HaynesworthSE.Growthkinetics,self-renewal,andtheosteogenicpotentialofpurifiedhumanmesenchymalstemcellsduringextensivesubcultivationandfollowingcryopreservation.Journalofcellularbiochemistry.1997;64:278-294[20]KadiyalaS,YoungRG,ThiedeMA,etal.Cultureexpandedcaninemesenchymalstemcellspossessosteochondrogenicpotentialinvivoandinvitro.Celltransplantation.1997;6:125-134[21]GalmicheMC,KotelianskyVE,BriereJ,etal.Stromalcellsfromhumanlong-termmarrowculturesaremesenchymalcellsthatdifferentiatefollowingavascularsmoothmuscledifferentiationpathway.Blood.1993;82:66-76[22]WoodburyD,SchwarzEJ,ProckopDJ,etal.Adultratandhumanbonemarrowstromalcellsdifferentiateintoneurons.Journalofneuroscienceresearch.2000;61:364-37028 [23]PetersenBE,BowenWC,PatreneKD,etal.Bonemarrowasapotentialsourceofhepaticovalcells.Science.1999;284:1168-1170[24]DittmarT,EntschladenF.Migratorypropertiesofmesenchymalstemcells.Advancesinbiochemicalengineering/biotechnology.2013;129:117-136[25]KangSK,ShinIS,KoMS,etal.Journeyofmesenchymalstemcellsforhoming:Strategiestoenhanceefficacyandsafetyofstemcelltherapy.Stemcellsinternational.2012;2012:342968[26]MitchellKE,WeissML,MitchellBM,etal.Matrixcellsfromwharton'sjellyformneuronsandglia.StemCells.2003;21:50-60[27]WangHS,HungSC,PengST,etal.Mesenchymalstemcellsinthewharton'sjellyofthehumanumbilicalcord.StemCells.2004;22:1330-1337[28]LiuJ,HanD,WangZ,etal.Clinicalanalysisofthetreatmentofspinalcordinjurywithumbilicalcordmesenchymalstemcells.Cytotherapy.2013;15:185-191[29]WangL,CongX,LiuG,etal.Humanumbilicalcordmesenchymalstemcelltherapyforpatientswithactiverheumatoidarthritis:Safetyandefficacy.Stemcellsanddevelopment.2013;22:3192-3202[30]SchaferS,BergerJV,DeumensR,etal.Influenceofintrathecaldeliveryofbonemarrow-derivedmesenchymalstemcellsonspinalinflammationandpainhypersensitivityinaratmodelofperipheralnerveinjury.Journalofneuroinflammation.2014;11:157[31]WatanabeS,UchidaK,NakajimaH,etal.Earlytransplantationofmesenchymalstemcellsafterspinalcordinjuryrelievespainhypersensitivitythroughsuppressionofpain-relatedsignalingcascadesandreducedinflammatorycellrecruitment.StemCells.2015;33:1902-1914[32]RomanovYA,SvintsitskayaVA,SmirnovVN.Searchingforalternativesourcesofpostnatalhumanmesenchymalstemcells:Candidatemsc-likecellsfromumbilicalcord.StemCells.2003;21:105-110[33]ShihMH,KaoSC,WangW,etal.Spinalcordnmdareceptor-mediatedactivationofmammaliantargetofrapamycinisrequiredforthedevelopmentandmaintenanceofbonecancer-inducedpainhypersensitivitiesinrats.Thejournalofpain:officialjournaloftheAmericanPainSociety.2012;13:338-34929 [34]SakuraS,KiriharaY,MugurumaT,etal.Thecomparativeneurotoxicityofintrathecallidocaineandbupivacaineinrats.Anesthesiaandanalgesia.2005;101:541-547,tableofcontents[35]KimSH,ChungJM.Anexperimentalmodelforperipheralneuropathyproducedbysegmentalspinalnerveligationintherat.Pain.1992;50:355-363[36]MyersB,Greenwood-VanMeerveldB.Elevatedcorticosteroneintheamygdalaleadstopersistentincreasesinanxiety-likebehaviorandpainsensitivity.Behaviouralbrainresearch.2010;214:465-469[37]CoronelMF,MusolinoPL,VillarMJ.Selectivemigrationandengraftmentofbonemarrowmesenchymalstemcellsinratlumbardorsalrootgangliaaftersciaticnerveconstriction.Neuroscienceletters.2006;405:5-9[38]金小高，罗爱林，张广雄.三种大鼠神经病理性疼痛模型的制备和效果比较[J].临床麻醉学杂志.2005,21(5):338-340.39.[39]BonfieldTL,CaplanAI.Adultmesenchymalstemcells:Aninnovativetherapeuticforlungdiseases.Discoverymedicine.2010;9:337-345[40]PanHC,ChengFC,ChenCJ,etal.Post-injuryregenerationinratsciaticnervefacilitatedbyneurotrophicfactorssecretedbyamnioticfluidmesenchymalstemcells.Journalofclinicalneuroscience:officialjournaloftheNeurosurgicalSocietyofAustralasia.2007;14:1089-1098[41]PisatiF,BossolascoP,MeregalliM,etal.Inductionofneurotrophinexpressionviahumanadultmesenchymalstemcells:Implicationforcelltherapyinneurodegenerativediseases.Celltransplantation.2007;16:41-55[42]SiniscalcoD.Transplantationofhumanmesenchymalstemcellsinthestudyofneuropathicpain.MethodsMolBiol.2010;617:337-345[43]ScholzJ,WoolfCJ.Theneuropathicpaintriad:Neurons,immunecellsandglia.Natureneuroscience.2007;10:1361-1368[44]VallejoR,TilleyDM,VogelL,etal.Theroleofgliaandtheimmunesysteminthedevelopmentandmaintenanceofneuropathicpain.Painpractice:theofficialjournalofWorldInstituteofPain.2010;10:167-184[45]GaoYJ,JiRR.Targetingastrocytesignalingforchronicpain.Neurotherapeutics:thejournaloftheAmericanSocietyforExperimentalNeuroTherapeutics.2010;7:482-49330 [46]KleinschnitzC,HofstetterHH,MeuthSG,etal.Tcellinfiltrationafterchronicconstrictioninjuryofmousesciaticnerveisassociatedwithinterleukin-17expression.Experimentalneurology.2006;200:480-485[47]KimJ,HemattiP.Mesenchymalstemcell-educatedmacrophages:Anoveltypeofalternativelyactivatedmacrophages.Experimentalhematology.2009;37:1445-1453[48]YuCG,FairbanksCA,WilcoxGL,etal.Effectsofagmatine,interleukin-10,andcyclosporinonspontaneouspainbehaviorafterexcitotoxicspinalcordinjuryinrats.Thejournalofpain:officialjournaloftheAmericanPainSociety.2003;4:129-140[49]SaadeNE,NasrIW,MassaadCA,etal.Modulationofultraviolet-inducedhyperalgesiaandcytokineupregulationbyinterleukins10and13.Britishjournalofpharmacology.2000;131:1317-1324[50]PlunkettJA,YuCG,EastonJM,etal.Effectsofinterleukin-10(il-10)onpainbehaviorandgeneexpressionfollowingexcitotoxicspinalcordinjuryintherat.Experimentalneurology.2001;168:144-154[51]SiniscalcoD,GiordanoC,GalderisiU,etal.Long-lastingeffectsofhumanmesenchymalstemcellsystemicadministrationonpain-likebehaviors,cellular,andbiomolecularmodificationsinneuropathicmice.Frontiersinintegrativeneuroscience.2011;5:79[52]SuterMR,WenYR,DecosterdI,etal.Doglialcellscontrolpain?Neurongliabiology.2007;3:255-268[53]CoullJA,BeggsS,BoudreauD,etal.Bdnffrommicrogliacausestheshiftinneuronalaniongradientunderlyingneuropathicpain.Nature.2005;438:1017-1021[54]JiRR,SuterMR.P38mapk,microglialsignaling,andneuropathicpain.Molecularpain.2007;3:33[55]RaghavendraV,TangaF,DeLeoJA.Inhibitionofmicroglialactivationattenuatesthedevelopmentbutnotexistinghypersensitivityinaratmodelofneuropathy.TheJournalofpharmacologyandexperimentaltherapeutics.2003;306:624-630[56]TsudaM,Shigemoto-MogamiY,KoizumiS,etal.P2x4receptorsinducedinspinalmicrogliagatetactileallodyniaafternerveinjury.Nature.2003;424:778-783[57]TsudaM,InoueK,SalterMW.Neuropathicpainandspinalmicroglia:Abigproblemfrommoleculesin"small"glia.Trendsinneurosciences.2005;28:101-10731 [58]BeggsS,CurrieG,SalterMW,etal.Primingofadultpainresponsesbyneonatalpainexperience:Maintenancebycentralneuroimmuneactivity.Brain:ajournalofneurology.2012;135:404-417[59]HainsBC,WaxmanSG.Activatedmicrogliacontributetothemaintenanceofchronicpainafterspinalcordinjury.TheJournalofneuroscience:theofficialjournaloftheSocietyforNeuroscience.2006;26:4308-4317[60]HuaXY,SvenssonCI,MatsuiT,etal.Intrathecalminocyclineattenuatesperipheralinflammation-inducedhyperalgesiabyinhibitingp38mapkinspinalmicroglia.TheEuropeanjournalofneuroscience.2005;22:2431-2440[61]KimelbergHK,NedergaardM.Functionsofastrocytesandtheirpotentialastherapeutictargets.Neurotherapeutics:thejournaloftheAmericanSocietyforExperimentalNeuroTherapeutics.2010;7:338-353[62]GaoYJ,ZhangL,JiRR.Spinalinjectionoftnf-alpha-activatedastrocytesproducespersistentpainsymptommechanicalallodyniabyreleasingmonocytechemoattractantprotein-1.Glia.2010;58:1871-1880[63]SunS,ChenWL,WangPF,etal.Disruptionofglialfunctionenhanceselectroacupunctureanalgesiainarthriticrats.Experimentalneurology.2006;198:294-302[64]MilliganED,TwiningC,ChacurM,etal.Spinalgliaandproinflammatorycytokinesmediatemirror-imageneuropathicpaininrats.TheJournalofneuroscience:theofficialjournaloftheSocietyforNeuroscience.2003;23:1026-1040[65]HashizumeH,DeLeoJA,ColburnRW,etal.Spinalglialactivationandcytokineexpressionafterlumbarrootinjuryintherat.Spine.2000;25:1206-1217[66]BenvenisteEN.Cytokineactionsinthecentralnervoussystem.Cytokine&growthfactorreviews.1998;9:259-275[67]ParkHJ,LeePH,BangOY,LeeG,AhnYH.Mesenchymalstemcellstherapyexertsneuroprotectioninaprogressiveanimalmodelofparkinson'sdisease.Journalofneurochemistry.2008;107:141-151[68]WangF,YasuharaT,ShingoT,KamedaM,TajiriN,YuanWJ,KondoA,KadotaT,BabaT,TayraJT,KikuchiY,MiyoshiY,DateI.Intravenousadministrationofmesenchymalstemcellsexertstherapeuticeffectsonparkinsonianmodelofrats:Focusingonneuroprotectiveeffectsofstromalcell-derivedfactor-1alpha.BMCneuroscience.32 2010;11:5233 34 综述干细胞治疗神经病理性疼痛的研究进展摘要：神经病理性疼痛是一种由不同原因所引起在性质上多样化的慢性疾病。尽管神经病理性疼痛的分类为慢性疼痛，但它比其他类型的慢性疼痛更严重，且神经病理性疼痛更严重地影响人们的生活质量。因此在开发一种有效的治疗方面，了解各种神经病理性疼痛发生和发展的机制具有重要的意义。临床上神经病理性疼痛的治疗目前广泛采用的是药物治疗，而干细胞对于神经病理性疼痛的治疗方面具有相当大的潜力，这项研究一旦完成，细胞疗法有可能将取代目前的药物治疗，并且其具有更持久的效果。在这篇综述中，我们将描述神经病理性疼痛的机制和干细胞的种类以及特别着重描述当前利用干细胞移植来治疗神经病理性疼痛的研究。关键词：干细胞；神经病理性疼痛；间充质干细胞；疼痛；神经营养因子1神经病理性疼痛的定义及分类[1]神经病理性疼痛是指由躯体感觉系统的病变或疾病所引起的一系列疼痛的总称。神经病理性疼痛在性质上是多样化的，其按照特征可分为四大类：外周神经系统的局灶或多灶性病变，广义的外周神经系统病变（多发性神经病变），中枢神经系统病变，以[2]及复杂的神经病理性疾病。外周神经系统的局灶或多灶性病变主要包括：神经卡压综合征、幻肢痛、残肢痛、外伤后神经痛、带状疱疹后遗神经痛、糖尿病性单发神经病、缺血性神经病、结节性多动脉炎等。广义的外周神经系统病变主要由糖尿病、酒精、浆细胞瘤、人免疫缺陷病毒神经病变、甲状腺功能减退症、遗传性感觉神经病变、法布里氏病、神经性莱姆病、B族维生素缺乏、神经毒性物质等引起。中枢神经系统病变主要包括：脊髓损伤、脑梗死（尤其是丘脑和脑干）、脊髓梗死、脊髓空洞症、多发性硬化症等。复杂的神经病理性疾病主要包括复杂性区域疼痛综合征I型和II型。2神经病理性疼痛的机制神经病理性疼痛的机制虽然至今尚未完全了解清楚，但目前讨论的几种机制主要为五个方面，即外周敏化、中枢敏化、小胶质细胞的激活、抑制调节受损及异位放电，以35 下就这五个方面来进行阐述。2.1外周敏化C纤维（无髓鞘）和Aδ纤维（薄髓鞘）负责引发响应于有害刺激的疼痛感觉。然而周围神经损伤后，增加了自发的异常放电。放电增加是由于致敏的初级传入伤害性感受器的分子和细胞的改变，如增加的电压门控钠离子通道RNA的表达（特别是Nav1.3，一种胚胎的通道），增加的冷觉表达/冷敏感通道（TRPM8），以及钠通道的编码基因突变（例如Nav1.7通道的SCN9A基因）。变化也发生在膜结合受体的调节，TRPV1（一种典型的香草酸受体通常见于伤害性传入纤维）已被证明在大量的受损背根神经节细胞介质中增加。此外，TRPV1受体也被证明了下调受损的传入纤维并上调未损伤的C[2]和Aδ纤维。TRPV4似乎同样起到上调紫杉醇引起的机械痛觉过敏的作用。在周围神经受损后引发了纤维结构和功能的异常变化，从而增加了神经病理性疼痛的概率。2.2中枢敏化超敏的周围神经引起在脊髓背角的变化。突触前的敏化是由受损的C纤维发起，它通过电压门控N型钙离子通道释放谷氨酸（作用于N-甲基-D-天冬氨酸受体）和神经[2]肽P物质引发。此外，在浅表脊髓背角中周围神经损伤减少了GABA释放中间神经[3]元的数量，这个减少是由于GABA的合成酶谷氨酸脱羧酶水平的降低。突触后电压门控钠离子通道表达增加（特别是Nav1.3），结果导致低阈值机械性感受器（Aδ和Aβ）对正常的无伤害性刺激反应增加。周围神经受损后，多感受性脊髓背角神经元的一般兴奋性增加，导致神经元活动对有害刺激的反应增加。此外神经元接受领域扩大和过[2]度兴奋传播到其他脊髓节段。2.3小胶质细胞的激活在过去15年不断的有许多证据表明神经病理性疼痛（及其它疼痛状态）与小胶质细胞激活以及其他在中枢神经系统（CNS）的非神经元细胞相关联。此外，激活的小胶[4]质细胞的这些改变可能参与了中枢敏化现象。一些来源于受损后的小胶质细胞激活带来的分子变化已经确定参与痛觉超敏，包括促丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸化，[5]上调趋化因子受体和释放小胶质细胞因子和生长因子。36 2.4抑制调节受损除了增强伤害性感受的改变，已经有证据表明神经损伤的一些环境中可以导致损伤[6,7]内源性抑制机制。例如，神经受损后兴奋传导已经显示出由于GABA能脊髓的抑制[8]中间神经元凋亡（细胞死亡）进一步促进伤后痛觉过敏。2.5异位放电[9]随着神经的损伤，导致了在初级传入神经元或中枢神经元的异常动作电位，这可能是自发的（无刺激）感觉异常、感觉迟钝及可能以不同时间模式（如：阵发性、间歇[10]性、持续性）表现出来的疼痛的重要机制。证据表明许多不同的分子改变可以引起异位的电活动，包括受损后电压门控钠通道（如：Nav1.3,Nav1.6,andNav1.9）电压门控钾通道（如：KCNQKv7）的改变，以及超极化激活的环核苷酸门控通道（如：HCN2）[11]。3干细胞现今发现的干细胞种类有胚胎干细胞、造血干细胞、间充质干细胞以及神经干细胞等。胚胎干细胞因来源涉及伦理和法律问题，以及作为一种异体细胞移植而带来的免疫排斥问题，故未能在治疗神经病理性疼痛方面广泛开展起来研究。而造血干细胞只能沿着本组织的分化途径进行，只能进行“有限的分化”。间充质干细胞具有多向分化潜能、低免疫原性及定向归巢等生物学特性，因此成为理想的移植细胞。3.1干细胞的特点干细胞能分泌神经营养因子，为神经病理性疼痛提供保护的微环境，神经营养因子是已知可促进神经元发育和存活的生长因子，它们还保持了功能的完整性，促进肝细胞[12]再生，调节神经元可塑性和帮助修复受损的神经。神经营养因子包括各种类型的保护因子，如：脑源性神经营养因子（BDNF）、神经营养因子-4（NT-4）、神经生长因子（NGF）、神经营养因子3/5（NT-3/5）。其它良好的神经营养因子包括：胰岛素样生长因子I和II（IGF-I和IGF-II）、胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）、NTN和PSP。睫状结神经营养因子（CNTF）也进行了研究，并显示出对神经嵴来源的感觉神[13]经，以及副交感神经和运动神经起到作用。3.2干细胞治疗神经病理性疼痛研究总结目前有许多研究都表明了干细胞在治疗神经病理性疼痛方面有不错的疗效。因为干37 细胞的定向归巢生物学特性，干细胞移植可以通过许多微创的方式进行，比如Siniscalco等人在小鼠的SNI模型当中采用了颅内和尾静脉注射的方式移植骨髓间充质干细胞，[14,15]结果发现都显著减少了机械痛觉过敏和热痛觉过敏。而不同的方式移植干细胞治疗神经病理性疼痛作用的机制也不同，颅内注射骨髓间充质干细胞主要的机制为促炎因子IL-1β和IL-17的减少，增加抗炎因子IL-10的表达，并且减少了过度活化的β-半乳糖[14][16]苷。同样的微创方式给予干细胞还有从小鼠或大鼠尾静脉注射，如Sacerdote等人用脂肪来源的间充质干细胞从CCI小鼠的尾静脉注射，结果小鼠的机械痛及热痛都得到了改善。此外，采用内源性阿片肽基因修饰的干细胞同样也可用于治疗神经病理性疼痛的动物模型。比如采用人前脑啡肽原基因(hPPE)修饰永生化大鼠神经前体细胞(INPC)[20]治疗大鼠慢性神经病理性疼痛。糖尿病所引起的周围神经病变同样也可以采用干细胞疗法，Shibata等人采用了链脲霉素诱导的SD大鼠为模型，肌注骨髓间充质干细胞，干细胞的移植组阻止了毛细管[17]数与肌纤维数比值的下降以及增加VEGF和bFGF。移植了骨髓来源MSC的患有糖[17,18]尿病的动物与只是接受盐水注射的动物相比改善了运动神经传导速度。尽管有这些[18]好处，但是，运动神经传导速度和NGF及NT-3的增加的水平被认为只持续了4周。[18]有趣的是，当涉及到神经营养因子这两项研究又相互矛盾。在Kim等人的研究中，神经营养因子水平，如NGF和NT-3，发现在接受骨髓来源的间充质干细胞移植的动物[17]中增加但除了VEGF或bFGF。在由Shibata等人的研究中，然而VEGF和bFGF，除了NGF和NT-3，发现在接受干细胞移植的动物中增加。正如亲眼所见，有更多的研究需要被实施从而来了解干细胞在这些疾病中的作用。另外除了在外周神经损伤的神经病理性疼痛使用外，在脊髓损伤中也有不错的结[23]果。在Ichim等人的研究中，在T12-L1水平不完全性脊髓损伤和L1椎体粉碎性骨折（ASIA量表中描述为A型）的患者在鞘内注射MSC与CD34细胞。移植之后无不良反应报导。肌肉力量的提高，各种表皮感觉增加，泌尿系统和性功能恢复。虽然这些结果是积极的，但这个研究是一个病人的病例报告。因此，必须慎重考虑这些结果的解[23]释，特别是关于疗效。3.3干细胞治疗的潜在缺点虽然干细胞疗法可以防止神经变性和促进神经再生，但还有一些需要解决的几个问38 题。干细胞移植的最佳剂量仍是未知的，被引入临床试验之前还需要进一步的研究。其中一项研究表明，移植hMSCs到他们的动物模型产生不同的移植取决于细胞剂量：低量移植hMSCs产生巢蛋白阳性移植，而较高量的移植hMSCs产生相当数量的星形胶质[22]细胞标志物移植。细胞移植的数量并且增加了关于细胞存活的问题;上述研究报告之[23]一表明，只有占总注入1.7％的hMSCs细胞存活。剩余98.3％的细胞发生什么了？难道身体丢弃不必要的细胞？难道细胞死亡？唯一生存下来的细胞是需要产生所期望的效果的细胞？在另一个不相关的研究中，干细胞移植4周后，分别在动物模型中没有[24]检测到细胞。有人说，原因不明，一些可行的建议是死亡或荧光的减少。在使用干细胞来治疗神经性疾病中还有其他未知变量。根据上述研究，尽管有这些利益，但大量[23][21]的研究仍然需要完成来了解干细胞的归巢能力和作用机制。对于干细胞疗法从实验室转移到临床之前，这些问题可以提供一个真实而又艰巨的挑战。4总结神经病理性疼痛是一种慢性、多样化状态的疾病，目前还没有长期治疗的方法。目前的药物治疗主要为姑息保守治疗，虽然能够暂时缓解疼痛，但不能解决疼痛的基本机制。尽管干细胞的作用机制尚未完全了解，但干细胞的神经营养因子释放营养为干细胞修复细胞过程的能力提供了一种保护性和恢复性的微环境，可以潜在地完全逆转神经病理性疼痛背后的发病原因。尽管如此，与任何细胞的治疗方法中一样，要达到干细胞的全部治疗潜力之前仍然要解决一些挑战。干细胞的神经营养因子释放的特点和干细胞剂量要求都还需要由研究人员使用干细胞为神经病理性疼痛的治疗加以解决。最近研究都是在动物模型上使用干细胞，但是已经证明有希望在临床上使用，并鼓励继续研究追求最佳的细胞疗法用于治疗神经病理性疼痛。参考文献[1]TreedeR,JensenT,CampbellJetal.Neuropathicpain:Redefinitionandagradingsystemforclinicalandresearchpurposes.Neurology2008;70:1630–1635.[2]BaronR.Mechanismsofdisease:Neuropathicpain:Aclinicalperspective.NatClinPractNeurol2006;2:95–106.39 [3]MooreK,KohnoT,KarchewskiLetal.PartialperipheralnerveinjurypromotesaselectivelossofGABAergicinhibitioninthesuperficialdorsalhornofthespinalcord.JNeurosci2002;22:6724–6731.[4]TsudaM,InoueK,SalterMW.Neuropathicpainandspinalmicroglia:abigproblemfrommoleculesin“small”glia.TrendsNeurosci.2005;28(2):101-107.[5]JiRR,BertaT,NedergaardM.Gliaandpain:ischronicpainagliopathy?Pain.2013;154(suppl1):S10-S28.[6]CampbellJN,MeyerRA.Mechanismsofneuropathicpain.Neuron.2006;52(1):77-92.[7]vonHehnCA,BaronR,WoolfCJ.Deconstructingtheneuropathicpainphenotypetorevealneuralmechanisms.Neuron.2012;73(4):638-652.[8]ScholzJ,BroomDC,YounDH,etal.BlockingcaspaseactivitypreventstranssynapticneuronalapoptosisandthelossofinhibitioninlaminaIIofthedorsalhornafterperipheralnerveinjury.JNeurosci.2005;25(32):7317-7323.[9]AmirR,KocsisJD,DevorM.Multipleinteractingsitesofectopicspikeelectrogenesisinprimarysensoryneurons.JNeurosci.2005;25(10):2576-2585.[10]vonHehnCA,BaronR,WoolfCJ.Deconstructingtheneuropathicpainphenotypetorevealneuralmechanisms.Neuron.2012;73(4):638-652.[11]ChaplanSR,GuoHQ,LeeDH,etal.Neuronalhyperpolarization-activatedpacemakerchannelsdriveneuropathicpain.JNeurosci.2003;23(4):1169-1178.[12]OssipovM.Growthfactorsandneuropathicpain.CurrPainHeadacheRep2011;15:185–192.[13]ApfelS.Neurotrophicfactorsinperipheralneuropathies:Therapeuticimplications.BrainPathol1999;9:393–413.[14]SiniscalcoD,GiordanoC,GalderisiUetal.Intra-brainmicroinjectionofhumanmesenchymalstemcellsdecreasesallodyniainneuropathicmice.CellMolLifeSci2010;67:655–669.[15]SiniscalcoD,GiordanoC,GalderisiUetal.Long-lastingeffectsofhumanmesenchymal40 stemcellsystemicadministrationonpain-likebehaviors,cellular,andbiomolecularmodificationsinneuropathicmice.FrontIntegrNeurosci2011;5:79.[16]SacerdoteP,NiadaS,FranchiS,ArrigoniE,RossiA,YenagiV,etal:Systemicadministrationofhumanadipose-derivedstem.cellsrevertsnociceptivehypersensitivityinanexperimentalmodelofneuropathy.StemCellsDev22:1252–1263,2013[17]ShibataT,NaruseK,KamiyaHetal.Transplantationofbonemarrow-derivedmesenchymalstemcellsimprovesdiabeticpolyneuropathyinrats.Diabetes2008;57:3099–3107.[18]KimB,JinH,BaeJ.Bonemarrow-derivedmesenchymalstemcellsimprovethefunctioningofneurotrophicfactorsinamousemodelofdiabeticneuropathy.LabAnimRes2011;27:171–176.[19]IchimT,SolanoF,LaraFetal.Feasibilityofcombinationallogeneicstemcelltherapyforspinalcordinjury:Acasereport.IntArchMed2010;3:30.[20]高峰等人.鞘内移植hPPE修饰INPC对大鼠慢性神经病理性疼痛的镇痛效应[J].中华麻醉学杂志2007,27(3)264-267.[21]WilkinsA,KempK,GintyMetal.Humanbonemarrow-derivedmesenchymalstemcellssecretebrain-derivedneurotrophicfactorwhichpromotesneuronalsurvivalinvitro.StemCellRes2009;3:63–70.[22]CovaL,ArmenteroM,ZennaroEetal.MultipleneurogenicandneurorescueeffectsofhumanmesenchymalstemcellaftertransplantationinanexperimentalmodelofParkinson’sdisease.BrainRes2010;1311:12–27.[23]ParkH,LeeP,BangOetal.MesenchymalstemcellstherapyexertsneuroprotectioninaprogressiveanimalmodelofParkinson’sdisease.JNeurochem2008;107:141–151.[24]WangF,YasuharaT,ShingoTetal.Intravenousadministrationofmesenchymalstemcellsexertstherapeuticeffectsonparkinsonianmodelofrats:Focusingonneuroprotectiveeffectsofstromalcell-derivedfactor-1alpha.BMCNeurosci2010;11:52.41 42 攻读硕士期间撰写的论文1、发表文章冯娟，胡啸玲.剖宫产术后镇痛研究进展[J].现代医药卫生杂志.2015，31（20）3111-3113.43 44 致谢岁月如梭，光阴似箭。三年的硕士研究生生活转瞬即逝，回首这三年走过的岁月，所有的奋斗与辛劳，甜美与欢笑都仍历历在目。值此毕业论文完成之际，我向所有关心、鼓励、支持与帮助我的人表示最真诚的感谢。衷心感谢我的导师胡啸玲主任这三年来对我临床及科研方面的悉心的指导，从而得以顺利完成学业。导师渊博的专业知识，崇高的品德、严谨的治学态度及孜孜不倦、精益求精的工作作风是我学习及工作中的榜样,不仅教会了我许多专业知识，而且还学到了很多为人处世的道理，使我受益终身。感谢麻醉科旷昕主任、郭立平副主任、彭庆明副主任、刘文捷老师、周亚辉老师、周志刚老师、彭良玉老师、杨冯睿老师等全体工作人员在我工作、学习中的指导与帮助。感谢华中科技大学同济医学院陈向东教授的课题及科研方面的指导，感谢陈春秀师姐在实验操作过程中的指导，使得我的课题能够顺利地完成。感谢南华大学附一医院临床研究所祖旭宇老师和科技科王峰老师给予的关心和帮助。感谢陈春秀、钟琪师姐及胡志强、刘汝、易汉等同学在实验和工作和生活方面给予的帮助。感谢南华大学附一医院各科室医务人员在我轮科期间的给予的指导和帮助。感谢各位专家和学者在百忙之中参与评审我的硕士学位论文。最后，我要衷心地感谢我的家人，是你们对我无私的理解与支持，才使得我顺利完成学业，你们的爱将会成为我人生路上不断前进的动力！45