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分类号：Ｓ８５２授予学位单位代码：１０４３４学号：２０１５１２０２３７ｃ山东农业大学全日制硕士专业学位论文禽白血病病毒通过弱毒疫苗污染途径对鸡免疫机能及生产性能的影响ＥｆｆｅｃｔｏｆＡｖｉａｎＬｅｕｋｏｓｉｓＶｉｒｕｓｏｎＣｈｉｃｋｅｎＩｍｍｕｎｅＦｕｎｃｔｉｏｎａｎｄＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅＡｔｔｅｎｕａｔｅｄＶａｃｃｉｎｅＣｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ姓名：吕艳艳学位类别：兽医硕士专业：兽医研究方向：分子病毒学学院：动物科技学院指导教师：赵鹏副教授崔治中教授２０１７年６月６日 论文提交日期：２０１７．０４．２８论文答辩日期：２０１７．０６．０６学位授予日期：２０１７．０６学科类别：兽医硕士答辩委员会主席：尹燕博 关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所取得，的成果。对在论文研宄期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以釆用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名：爲４钇％导师签名：￣￣曰期：２〇／、卜／／ 本研究由公益性行业（农业）科研专项经费（201203055）和十三五国家重点研发计划课题“种禽场禽白血病综合防控技术集成与示范研究”（2016YFD0501606）项目资助ThisstudywassupportedbySpecialFundforAgro-scientificResearchinthePublicInterest(201203055)andtheNationalKeyResearchandDevelopmentProgramofChina(2016YFD0501606) 符号说明英文缩写英文全称中文全称ALVAvianleukosisvirus禽白血病病毒ALV-AAvianleukosisvirussubgroupAA亚群禽白血病病毒ALV-BAvianleukosisvirussubgroupBB亚群禽白血病病毒ALV-JAvianleukosisvirussubgroupJJ亚群禽白血病病毒ALV-KAvianleukosisvirussubgroupKK亚群禽白血病病毒bpbasepair碱基对CEFchickenembryofibroblast鸡胚成纤维细胞dday天DMEMDulbeco'smodifiedeaglemedia极限必需培养基ELISAEnzyme-linkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验envenvelopegene囊膜糖蛋白基因gaggroupantigen群抗原gp85glycoprotein85糖蛋白85HIHemagglutinationinhibtion血凝抑制试验hhour小时LLLymphoidleukosis淋巴白血病LTRLongterminalrepeatsequence长末端重复序列MDVMarek’sdiseasevirus马立克氏病病毒mgmilligram毫克minminute分钟NDVNewcastlediseasevirus新城疫病毒p27protein27衣壳蛋白PBSPhosphate-buffersaline磷酸盐缓冲液PolProtease/polymerase蛋白酶/核酸聚合酶rpmroundsperminute转/分钟reversetranscription-polymeraseRT-PCR反转录-聚合酶链式反应chainreaction SPFspecificpathogenfree无特定病原SUsurfaceprotein外膜蛋白TCID50mediantissuecultureinfectivedose半数组织细胞感染量TMtransmembraneprotein穿膜蛋白µlmicroliter微升µgmicrogram微克wweek周 目录中文摘要.....................................................................................................................................IAbstract....................................................................................................................................III1前言.........................................................................................................................................11.1禽白血病的研究进展...........................................................................................................11.1.1禽白血病的病原学特点....................................................................................................11.1.1.1亚群分类.........................................................................................................................11.1.1.2形态学特征.....................................................................................................................21.1.1.3理化性质.........................................................................................................................21.1.1.4基因组结构.....................................................................................................................31.1.2禽白血病的流行病学特征................................................................................................41.1.2.1感染特性.........................................................................................................................41.1.2.2传播特征.........................................................................................................................51.1.3禽白血病的临床表现........................................................................................................51.1.4禽白血病的病理变化........................................................................................................51.1.5禽白血病病毒的致病性....................................................................................................61.1.6抗体和病毒血症存在情况................................................................................................71.1.7禽白血病的检测与诊断....................................................................................................71.1.8疫苗中外源性禽白血病病毒污染的检测........................................................................81.1.9鸡群禽白血病的防控........................................................................................................91.2本试验研究的目的和意义.................................................................................................102材料与方法...........................................................................................................................112.1试验材料............................................................................................................................112.1.1细胞和毒株......................................................................................................................112.1.2疫苗..................................................................................................................................112.1.3主要试剂及仪器..............................................................................................................112.1.4其他试剂的配制..............................................................................................................122.1.5试验动物与SPF饲养设施.............................................................................................12 2.2方法.....................................................................................................................................122.2.1ALV-A4P株和ALV-JNX0101株的培养...................................................................122.2.2细胞上清的收集与检测..................................................................................................122.2.3病毒扩增定量..................................................................................................................132.2.4弱毒疫苗中禽白血病病毒污染对海兰褐鸡免疫机能及生产性能的影响..................142.2.4.1动物试验设计...............................................................................................................142.2.4.2应用荧光定量PCR检测MDV核酸..........................................................................142.2.4.3不同组别禽白血病病毒病毒血症的动态检测...........................................................152.2.4.4不同组别禽白血病病毒抗体的检测...........................................................................152.2.4.5不同组别鸡体重的测定...............................................................................................162.2.4.6不同组别NDV和AIV-H9灭活疫苗的免疫和抗体水平的测定.............................172.2.4.7统计学分析...................................................................................................................182.2.5内源性禽白血病病毒基因对分子生物学方法检测弱毒疫苗中禽白血病病毒污染的干扰及鉴别...............................................................................................................................182.2.5.1引物的设计与合成.......................................................................................................182.2.5.2不同人为污染疫苗的制备...........................................................................................182.2.5.3不同来源SPF鸡胚及其细胞中禽白血病病毒的p27检测......................................192.2.5.4不同样品病毒核酸的提取...........................................................................................192.2.5.5不同样品的PCR检测.................................................................................................202.2.5.6不同样品的RT-PCR结合斑点杂交检测...................................................................203试验结果...............................................................................................................................233.1弱毒疫苗中禽白血病病毒污染对海兰褐鸡免疫机能及生产性能的影响.....................233.1.1禽白血病病毒污染对海兰褐鸡MDV疫苗免疫效果的影响.....................................233.1.2病毒血症的动态检测.....................................................................................................233.1.3海兰褐鸡禽白血病病毒抗体阳性率分析......................................................................243.1.4禽白血病病毒污染对海兰褐鸡体重的影响.................................................................263.1.5NDV和AIV-H9灭活疫苗的免疫和抗体水平的测定.................................................273.2内源性禽白血病病毒基因对分子生物学方法检测弱毒疫苗中禽白血病病毒污染的干扰及鉴别...................................................................................................................................27 3.2.1不同空白疫苗产品的PCR检测....................................................................................273.2.2不同空白疫苗产品的RT-PCR结合核酸斑点杂交检测..............................................283.2.3不同来源SPF鸡胚及其制备细胞后禽白血病病毒检测............................................293.2.4RT-PCR结合核酸斑点杂交检测疫苗中人为污染的禽白血病病毒...........................304讨论.......................................................................................................................................324.1弱毒疫苗中禽白血病病毒污染对海兰褐鸡免疫机能及生产性能的影响.....................324.2内源性禽白血病病毒基因对分子生物学方法检测弱毒疫苗中禽白血病病毒污染的干扰及鉴别...................................................................................................................................335结论.......................................................................................................................................36参考文献..................................................................................................................................37致谢..........................................................................................................................................45攻读学位期间发表论文情况..................................................................................................45 山东农业大学全日制硕士专业学位论文中文摘要禽白血病病毒（Avianleukosisvirus,ALV）是引起禽类发生肿瘤性疾病的一种重要病原，该病毒可引起禽的多种具有传染性的良性肿瘤和恶性肿瘤，同时能导致感染机体发生严重的细胞和体液免疫抑制以及生长抑制，进而易与其他病原并发或混合感染，给养禽业带来重大损失。为了防止ALV的流行，很多国家已实施了非常严格的净化措施来控制ALV。但由于ALV传播方式的广泛性，使得ALV感染在我国及其它国家仍然普遍存在。除垂直传播外，使用了被ALV污染的弱毒疫苗被认为是ALV感染的另一重要途径，不管是在中国还是其他国家都曾多次报道过ALV在弱毒疫苗中的污染。使用了被ALV污染的弱毒疫苗会给已经完成ALV净化的养殖企业带来巨大损失。因此我们设计了人工模拟试验，探究使用不同剂量ALV污染疫苗对海兰褐鸡的影响，并对ALV在弱毒疫苗中的污染进行了不同检测方法的比较。1．弱毒疫苗中禽白血病病毒污染对海兰褐鸡免疫机能及生产性能的影响为了探究使用污染ALV的弱毒疫苗后对鸡的生产性能和免疫机能的影响，将不同剂量ALV-A掺入市售合格的马立克氏病疫苗，接种到海兰褐鸡上；七日龄时分别接种ALV-A、ALV-J，并同时免疫NDV和AIV-H9灭活疫苗。结果表明，使用每羽份污染10TCID50ALV和50TCID50ALV两种剂量的MDV疫苗后均造成了海兰褐鸡体重的下降，与使用未污染疫苗组相比差异显著。其中使用污染50TCID50ALV的MDV疫苗组明显低于使用污染10TCID50ALV的MDV疫苗组。并且使用两种ALV污染剂量的疫苗后MDV核酸含量与使用未污染组相比显著降低。其中使用污染50TCID50ALV的MDV疫苗组显著低于使用污染10TCID50ALV的MDV疫苗组。同时使用污染两种剂量ALV的疫苗后NDV和AIV-H9的抗体滴度与使用无污染疫苗组相比显著下降。其中使用污染50TCID50ALV的MDV疫苗组明显低于使用污染10TCID50ALV的MDV疫苗组。并且，七日龄再次感染ALV后，生长及免疫的抑制作用更加明显。其中，再次感染ALV-J的组生长及免疫的抑制作用比再感染ALV-A的组更加明显。本研究通过展示弱毒疫苗中ALV污染对海兰褐鸡生产性能及免疫机能的影响，提示我们在使用弱毒疫苗时要严防外源病毒的污染。2．内源性禽白血病病毒基因对分子生物学方法检测弱毒疫苗中禽白血病病毒污染的干扰及鉴别使用了污染有禽白血病病毒特别是A亚群ALV的弱毒疫苗是ALV感染途径之一，I 禽白血病病毒在弱毒疫苗中的污染及其对鸡免疫机能及生产性能的影响而应用PCR检测弱毒疫苗中ALV污染时通常会受到鸡染色体上内源性ALV基因的干扰。目前国家标准的检验规程是将疫苗经不同预处理后接种至鸡胚成纤维细胞后盲传并测定其细胞上清中p27抗原，但是很多企业不了解这一情况通过使用p27的PCR检测方法检测疫苗污染并引起很多纠纷，为了说明这一方法的不合理性，本研究针对ALV保守的群特异性抗原p27基因设计合成了两对引物，应用两对引物对不同来源SPF鸡胚及其制备的鸡胚成纤维细胞（CEF）进行PCR检测时均为阳性，但鸡胚的蛋清和细胞培养上清经ALV-p27抗原ELISA检测均为阴性；应用上述引物对市售合格的鸡马立克氏病毒（MDV）、鸡传染性法氏囊病毒（IBDV）和禽痘病毒（FPV）等活疫苗进行PCR检测时均为阳性，但应用本实验室研制的鸡外源性禽白血病病毒特异性核酸探针交叉斑点杂交检测试剂盒却均为阴性，并且应用核酸斑点杂交可检测到10TCID50/1000羽份的人为添加污染，显示了良好的特异性和灵敏度。本研究表明在某些SPF鸡胚及其制品中内源性ALV基因对PCR检测的干扰，也通过比较试验提供了可供参考的解决方案。关键词：禽白血病病毒；弱毒疫苗；污染；免疫机能；生产性能；检测II 山东农业大学全日制硕士专业学位论文EffectofAvianLeukosisVirusonChickenImmuneFunctionandProductionPerformancethroughtheAttenuatedVaccineContaminationAbstractAvianleukosisvirus(ALV)isanimportantpoultrypathogenanditsinfectionmayresultinlowproductivityandtumormortalityinchickens,whichcanleadtocellularandhumoralimmunesuppressionandgrowthinhibition,tobringsignificantlossestothepoultryindustry.InordertopreventtheprevalenceofALV,manycountrieshaveimplementedALVeradication.However,duetotheextensivespreadofALV,isstillprevalentinChina.Besidetheverticaltransmission,theALVcontaminatedinattenuatedvaccineisoneoftheimportantroutesofinfection.IthasrepeatedlyreportedALVinattenuatedvaccinecontaminationinChinaandothercountries,whichwillresultinsignificantlossestoenterprisesthathavecompletedALVeradication.Therefore,weconductedontheeffectofdifferentdosesofALVcontaminatedvaccineonHylinebrownchickens,andcomparedthedifferentdetectionmethodsofALVintheattenuatedvaccine.1.TheeffectofALVcontaminationontheimmunefunctionandproductionperformanceinattenuatedvaccineInordertoexploretheeffectsofALVcontaminationinattenuatedvaccineofproductionperformanceandimmunefunction,Hyline-BrownChickenswerevaccinatedwithdifferentdosesofALV-AmixedwithcommerciallyMarek'sdiseasevaccine,andchallengedwithALV-AandALV-Jat7daysoldofchickens,andsimultaneouslyvaccinatedwithNDV,AIV-H9..Theresultsshowedthat10TCID50and50TCID50ALVperplumeattenuatedMDVvaccineswereusedtocausetheweightlossofHyline-BrownChickens,comparedwiththeuseofthenoncontaminatedvaccinegroup,ithassignificantdifference.TheMDVvaccinegroupwithcontaminationof50TCID50ALVwassignificantlowerthanthe10TCID50ALV.TheMDVloadcomparedwiththeuseofthenoncontaminatedgroupsalsodecreaseafterusethevaccinewithtwodosesofALVcontaminated.TheMDVvaccinegroupwithcontaminationof50TCID50ALVwassignificantlowerthanthe10TCID50ALV.NDVandIII 禽白血病病毒在弱毒疫苗中的污染及其对鸡免疫机能及生产性能的影响AIV-H9antibodylevelscomparedwiththeuseofthenoncontaminatedgroupsalsodecreasedafterusethevaccinewithtwodosesofALVcontaminated.TheMDVloadcomparedwiththeuseofthenoncontaminatedgroupsalsodecreaseafterusethevaccinewithtwodosesofALVcontaminated.Moreover,chickenswereinfectedwithALV,at7daysofage,thegrowthandimmuneinhibitionwasmoreobvious,andshowssignificantdifference.Theresultsofthisstudysuggestingthatweshouldpreventexogenousviruscontaminatedinattenuatedvaccine.2.InterferenceandidentificationofendogenousAvianLeukemiaVirusforthedetectionofALVcontaminatedintheattenuatedvaccines.Attenuatedlivevaccinescarryapotentialriskofcontaminatedwithavianleukemiavirus,especiallyfortheALVsubgroupA(ALV-A),isknowntooneoftheroutesofALVtransmission.However,theALVcontaminationintheattenuatedvaccinesfordetectingusingPCRassaysisusuallyaffectedbytheinterferenceofendogenousALVgeneonchickenchromosome.Atthepresent,thenationalstandardoftheprocedureisthevaccinewastreatmentbydifferentmethodandinoculatedtochickenembryofibroblastsafterblindpassagesanddeterminethep27usingtheELISAkits.But,manypoultryindustrydonotunderstandvaccinecontaminateddetectionbyPCRmethod,andinducealotofdisputes.ThesupernatantofthecellcultureandtheeggalbumenwerethenassayedforALVp27antigenbyELISAmethodwasnegative.TheprimerswereusedtodetecttheMarek'sdiseasevirus(MDV),infectiousbursadiseasevirus(IBDV)andfowlpoxvirus(FPV)vaccineswerepositivebyPCRassay.However,avianleukosisvirus-specificnucleicacidprobescross-hybridizespotdetectionkitwasusedtodetecttheabovethreevaccines,whichshowednegativetoALV.Andalowdosageof10TCID50/1000plumescontaminationcouldbedetectedbydot-blothybridizationinattenuatedvaccines.Inconclusion,alldatainthispresentstudydemonstratedthatendogenousavianleukemiavirusinSPFchickenembryoanditsproductsmayinterferethePCRmolecularassays,andofferedanavailablesolutionthroughthecomparisontest.Keywords:Avianleukosisvirus;Attenuatedvaccine;Contamination;Immuneresponse;Productionperformance;DetectionIV 山东农业大学全日制硕士专业学位论文1前言1.1禽白血病的研究进展禽白血病(AvianLeukosis,AL)又称禽白细胞增生病，是由禽白血病病毒(AvianLeukosisVirus,ALV)和禽肉瘤病病毒(AvianSarcomaVirus,RSV)引起的禽类多种肿瘤性疾病的总称。该病不仅能引起病禽的死亡、淘汰，造成多个组织的肿瘤，还会降低禽类的生产性能，造成疫苗的免疫失败，进而影响到其它禽类相关产品的生产与研究工作。家禽感染禽白血病后可以引起许多具有传染性的良性肿瘤或恶性肿瘤(Dongetal.,2015)，在临床上有多种的表现形式，其中包括淋巴细胞性白血病（LL）、成髓细胞性白血病、成红细胞性白血病、骨髓细胞瘤、肾母细胞瘤、内皮瘤、血管瘤、纤维瘤以及纤维肉瘤等(Payneetal.,2012)。大多数的肿瘤与造血系统有关，少数会侵害到其它组织。本病几乎能波及所有的商品鸡群，但出现临床症状的病鸡数量比较少。此外，很多感染鸡群的生产性能下降，尤其是产蛋率和蛋品质的下降（殷震等,1997;Fadlyetal,2008），也会降低对疫苗的免疫应答水平等各种亚临床症状。虽然全世界大多数养鸡业发达的国家都已经基本消灭和控制了ALV在鸡群中的流行，但是在我国鸡群中，特别是特有地方品系鸡中ALV的感染仍然非常普遍（Caietal.,2013;Lietal.,2013;Zengetal.,2014;Dongetal.,2015）。在2000年以前，禽白血病在我国只是时有发生，也并没有引起广泛的关注。但在进入21世纪以后，国内禽白血病的发生越来越普遍(Cuietal.,2014;Zhangetal.,2011)，防控也变得越来越难，而且还伴有爆发流行的趋势。除此之外，使用存在ALV污染的弱毒疫苗被认为是ALV感染的另一重要途径，在过去的二十年间，一些弱毒疫苗中污染了免疫抑制性病毒，例如ALV等一些可通过种蛋垂直传播的病毒(Fadlyetal.,2006)，由此给规模化养鸡业和家禽疫苗等产业带来巨大损失，因而使得禽白血病的防制与净化工作越来越难。国内外曾多次报道过ALV在弱毒疫苗中的污染，这些ALV经基因组序列分析鉴定被证实均为ALV-A（Barbosaetal.,2008;Zavalaetal.,2006）。1.1.1禽白血病的病原学特点1.1.1.1亚群分类根据病毒的血清中和试验、宿主范围、病毒间的干扰模式以及囊膜蛋白特性等，将禽白血病病毒划分为A、B、C、D、E、F、G、H、I、J共10个亚群（Hanafusa,1973;1 禽白血病病毒在弱毒疫苗中的污染及其对鸡免疫机能及生产性能的影响Hanafusaetal.,1976;Frisbyetal.,1979;Troeschetal.,1985;Baietal.,1995）。能够自然感染鸡群的只有A、B、C、D、E和J这六个亚群。E亚群属于内源性ALV，内源性ALV是指整合进宿主细胞的染色体基因组内，能借助染色体垂直传播的前病毒DNA及其可能产生的ALV粒子。它可能只是基因组的不完全片段，不能产生传染性病毒；但也有可能是全基因组，因而能够产生传染性的病毒粒子，但这类病毒一般致病性很弱或者没有致病性（Gavoraetal.,1991）。虽然E亚群内源性ALV通常没有致病性，但会干扰对禽白血病的鉴别诊断。除E亚群以外都是外源性ALV，均有致病能力。其中，A、B亚群流行最为广泛，尤其以A亚群最为严重。而J亚群与其它亚群的抗原性差异最显著，致病性和传染性最强，它是在20世纪90年代从英国的肉用型种鸡中分离到的一种新的ALV亚群（Baietal.,1995;Bensonetal.,1998)。近几年来，董宣等（2015）从中国各地方的品种鸡中分离到了几十株ALV，并对它们的囊膜糖蛋白的gp85基因序列的同源性进行比较分析，结果发现多数毒株的gp85基因与已知亚群A~J亚群的同源性在77.7%~82.4%之间，不属于任何的已知亚群。这些毒株间gp85基因的同源性达到95%以上（王鑫等,2012;Cuietal.,2014;DongXetal.,2015）。因此，可以推测这是长期存在于东亚地区的地方品种鸡群中的一个ALV亚群。根据国际命名的传统，将这个新的亚群命名为“K亚群ALV”。1.1.1.2形态学特征禽白血病病毒属于反转录病毒科、正反转录病毒亚科、α反转录病毒属的一类病毒。该群病毒的成员有着相似的物理特性和分子特性，并且有共同的群特异性抗原。ALV是呈二十面体对称的近似球形的有囊膜的RNA病毒，直径约为80~100nm。病毒粒子由外部的囊膜和内部的核芯构成。核芯的直径大约45nm，位于病毒粒子的中央，包括二倍体RNA、核衣壳、整合酶、蛋白酶以及反转录酶。病毒囊膜的外部有放射状的突起，直径大约8nm，病毒粒子以出芽的方式从细胞膜内释放。病毒的化学成分有60%~65%的蛋白质、30%~35%的脂类、2.2%的RNA以及来自细胞的少量DNA。1.1.1.3理化性质禽白血病病毒对外界环境的抵抗力很弱，在外界环境中存活的时间也比较短。ALV对热不稳定，温度升高会加快ALV的灭活，高温下ALV很快失活。在-15℃条件下，禽反转录病毒的半衰期不足1周，但在-60℃以下能够保存数年且不降低感染力，但是反复冻融会引起病毒发生裂解，从而使其释放特异性抗原。因此保存病毒时对温度要尤其2 山东农业大学全日制硕士专业学位论文注意。PH在5~9范围时，ALV较稳定，但超出此范围时会显著降低ALV的传染性。病毒的囊膜中脂类含量很高，乙醚、甲醛、脂溶剂均可降低ALV的感染性。十二烷基硫酸钠（SDS）等去污剂能够裂解病毒，使其能够释放核心蛋白和RNA（殷震,1997）。1.1.1.4基因组结构ALV基因组为单股正链RNA，单体长度约为7.6~7.8kb，主要为60~70SRNA和4~5SRNA。每一段RNA的长度大约8kb，同时具有5’端甲基化的帽子结构和3’端的多聚A（Yooetal.,1996）。如图1所示，中间为编码区，编码基因从5’端到3’端依次为衣壳蛋白基因(gag)、聚合酶基因(pol)和囊膜蛋白基因(env)，两端有非编码区UTR(Yooetal.,1996)，这些非编码区的序列具有启动子或增强子的活性。前病毒DNA通过转录产生病毒的基因组RNA，该前病毒DNA拥有与病毒RNA相同的基因组序列，称做长末端重复序列(Longterminalrepeat,LTR)。图1ALV基因组的结构图Fig.1genomestructureofALVGag基因长度约为2100bp左右，序列具有高度保守性，gag基因编码的初始产物是前体蛋白Pr76，在p15蛋白整合酶（PR）的作用下，编码病毒基质核衣壳蛋白NC(p12)、蛋白酶PR(p15)、蛋白MA(p19)、衣壳蛋白CA(p27)和其它一些多肽。其中，p27是ALV最主要的群特异性抗原，是区分不同亚群间的一段高度保守的基因，p15主要是负责剪切前体蛋白，p12主要是参与加工包装RNA。Pol基因长度约为2600bp，在病毒的基因组插入细胞染色体时起关键作用。包含蛋白酶、反转录酶、整合酶三种。Pol基因主要编码病毒反转录酶蛋白RT(p68)和整合酶蛋白IN(p32)。其中，RT具有三种活性，主要负责产生前病毒DNA，决定病毒生命周期的完整性。IN则主要负责将ALV前病毒DNA整合到宿主细胞的染色体当中(Baietal.,1995)。Env基因主要与病毒的抗原性、组织的亲嗜性和毒力相关，是ALV致肿瘤的重要基因。Env基因编码的囊膜糖蛋白包括2条肽链，分别是gp85基因编码的表面蛋白3 禽白血病病毒在弱毒疫苗中的污染及其对鸡免疫机能及生产性能的影响(Surfaceprotein,SU)和gp37基因编码的跨膜蛋白(Transmembraneprotein,TM）。表面蛋白含有抗原决定簇(Young,1998)，可以与受体结合。跨膜蛋白主要是参与病毒与细胞膜的融合。球形结构的gp85与跨囊膜的杆状gp37直接相结合，附着在病毒的囊膜上。非编码区中，有一段末端重复序列(R)及5’端独特区(5’uniqueregion,U5)或3’端独特区(3’uniqueregion,U3)组成，不同毒株之间3'UTR区核苷酸的数目差别很大，3'UTR区包括末端重复序列(R)、3’端独特区(3’uniqueregion,U3)、DRl区以及E元(Chestersetal.,2006)。在逆转录的过程中5’R和3’R发挥着重要作用。ALV前病毒基因组的两末端具有两段结构完全相同的长末端重复序列，LTR分别由3’端独特区（U3）、重复区（R）以及5’端独特区（U5）三部分组成，主要负责病毒复制、转录、翻译以及RNA的加工。1.1.2禽白血病的流行病学特征1.1.2.1感染特性鸡是ALV最主要的的自然宿主，但不同品种的鸡对病毒的感染力和发生肿瘤的抵抗力有很大差别。在人工试验接种时，部分ALV毒株呈现出比较广的宿主范围，一些ALV在非常年幼动物上连续传代时，也能在其他的宿主适应并复制。鸡场爆发淋巴细胞白血病时，经分离鉴定后多数为A亚群禽白血病病毒。曾有研究表明（Calneketal.,1968），选取八个不同商品经营品种鸡群的鸡胚，能分离到ALV-A的鸡胚占1.6%-12.5%，并且这些鸡群都存在排毒的现象。相比较而言，B亚群病毒的分离率较低，向鸡胚排毒的几率比A亚群小得多。在1988年前后，英国首先从白羽肉鸡中发现了致毒性更强的ALV-J，于此同时该病毒也随着引进的种鸡传入到我国。1998年，本实验室从白羽父母代肉鸡和商品代肉鸡中分离到了4株ALV-J（杜岩等,1999）。2005年，中国农业大学首次从蛋用型鸡群中证实了ALV-J的存在（徐缤蕊等,2005）。最近几年间，在商品代肉鸡、蛋鸡以及一些地方品系鸡中发现ALV-J的报道也日渐增多(Laietal.,2011;Panetal.,2012)。对我国不同地区的不同品种的鸡群感染ALV情况进行血清学调查，结果显示，感染ALV-A/B并呈现阳性的鸡群占92/197，而感染ALV-J并呈阳性的鸡群占105/199，结果表明，我国鸡群感染ALV的情况是比较普遍的，并且鸡群的遗传背景不同，发生感染比例的差别也非常大（崔治中,2010）。4 山东农业大学全日制硕士专业学位论文1.1.2.2传播特征外源性ALV有垂直传播和水平传播两种传播方式。垂直传播是通过感染的母鸡垂直感染鸡胚，将病毒从祖代鸡场直接扩散到父母代，再传到商品代鸡群，呈现逐代放大的趋势。垂直传播还可以导致鸡只的免疫耐受性，使得鸡只不能产生相应的抗体，终生带毒或排毒，严重的可能发展出成髓细胞瘤。在鸡体内的ALV可以被诱导产生大量的具有传染性的病毒粒子，它们分布于体液、排泄物、分泌物及饮具当中，通过鸡只的密切接触使病毒得到传播。饲养员污染的手在输精、去冠、修趾断喙等过程时可以传播ALV进而感染健康鸡(Fadlyetal.,1999;Witteretal.,2000)。内源性ALV主要是通过鸡的生殖细胞进行传递（Smithetal.,1986）。这种传递方式是病毒通过感染鸡胚的干细胞，随着胚胎的生长发育，感染的细胞也随之分裂，使得子细胞含有来自母体的内源性病毒的遗传物质，感染的后代将接受该病毒的拷贝。许多内源性ALV具有遗传缺陷性，不能产生感染性的病毒粒子，但也有些非缺陷型的病毒可以在鸡胚或者出壳的雏鸡体内表达产生感染性的病毒粒子。内源性非缺陷型禽白血病病毒有着与外源性病毒相似的传播方式，这类病毒具有微弱的或者无致瘤的能力，但会干扰鸡只对外源性ALV的应答反应（Crittendenetal.,1982;Smithetal.,1988;Gavoraetal.,1991）。1.1.3禽白血病的临床表现鸡感染禽白血病后，大多为亚临床症状，通常表现为食欲不振、生长缓慢，体重明显低于正常发育鸡水平，鸡冠和肉髯呈淡紫色，站立不稳、关节增粗、胸骨和肋骨异常突起，发生淋巴白血病时，可见腹部明显增大。发生成红细胞白血病时，可见羽毛囊孔出血。病鸡在出现临床症状后几周内死亡，甚至未显现出任何症状时就已死亡。当部分病鸡发生特定的肿瘤时，会出现特征性的临床表现。发生骨髓细胞瘤白血病时，头部、胸部会形成结节性突起，皮肤上还会出现血管瘤。骨硬化时，骨干和骨后端肿大。蛋鸡感染禽白血病后不一定出现明显病变，但生产性能下降。排毒鸡性成熟延后，产蛋数明显减少，蛋较小、壳较薄。排毒鸡死亡率增高，受精率下降，孵化率下降。大多排毒鸡呈现病毒血症，非排毒鸡会产生免疫反应。1.1.4禽白血病的病理变化淋巴细胞性白血病（LL）：一般4月龄或更大日龄的鸡才能形成典型的LL。肿瘤多在肝脏、脾脏、法氏囊出现，也可侵害肾脏、心肌、肺、性腺、骨髓和肠系膜。肿瘤5 禽白血病病毒在弱毒疫苗中的污染及其对鸡免疫机能及生产性能的影响质地柔软，表面光滑，光泽度良好。切开肿瘤后，呈灰白色到乳白色，偶有坏死灶。肿瘤可长成结节状、点状或弥散状。组织学检查时，可见所有肿瘤组织都是灶性或多中心性的。法氏囊中的淋巴肉瘤，还可看出肿瘤生长的滤泡样结构。成红细胞性白血病：通常发生于3-6月龄的鸡。肝和肾中度肿胀而脾显著肿大。肿大的脏器呈樱桃红色至深红木色，质地脆软。骨髓增生、半液状呈红色。在肌肉、皮下和内脏等组织出现点状出血。还可见到肝、脾血栓形成、梗塞和破裂。也会出现肺水肿、心包积水，肝脏表面纤维素沉积。贫血时，病鸡的内脏萎缩，尤以脾最为严重，骨髓色淡呈胶冻样。血液稀薄，红细胞的数量减少，呈淡红色，凝血缓慢。成髓细胞性白血病：自然发生成髓细胞性白血病的病例很少见，一般发生于成年鸡。病鸡肝脏显著增大，硬实，弥漫性布满灰白色的肿瘤浸润组织，使肝脏呈一种斑驳状或颗粒状表现。脾和肾也呈弥漫性细胞浸润，中度增大。骨髓质地坚硬，呈红色到灰色。组织学检查可见肝脏血管内外都积聚大量的成髓细胞。脾脏中，肿瘤细胞集聚在红髓中。髓细胞瘤（ML）：多发生于骨的表面骨膜及软骨附近，其他组织也会有相应的肿瘤病变。髓细胞瘤常出现在肋骨软骨接合处、胸骨的内表面、骨盆骨及下颌骨等软骨部位。在脑壳的平骨部分也常会发生。肿瘤呈结节状，也可能是多结节性的，质地柔软质脆，呈奶酪色。组织学检查可见大量形态一致的分化完全的髓细胞，细胞质中聚集有嗜酸性颗粒，颗粒多为圆形。血管瘤：不同年龄鸡的皮肤和内脏器官均可发生血管瘤。这些血管瘤表现为充满血液的囊泡或硬实的瘤状物。他们是一层内皮细胞或其他细胞增生物构成的外膜包裹的血泡。组织学检查可见海绵状血管瘤充满血液，其周围是由内皮细胞组成的一层薄膜。毛细管性血管瘤是一个实体增生物，并形成一种致密的团块及血管内皮瘤。骨硬化病：最早出现的可见变化发生在胫骨和跗跖骨的骨干部分，很快也会发生在其他长骨和骨盆骨、肩胛骨、肋骨等部位，但不会在趾骨发生。通常这种病变的发生呈两侧对称性。最初表现为正常灰白色略显透明的骨骼上出现明显的淡黄色病灶。然后骨膜开始增厚，骨质呈海绵状易折断。组织学检查可见嗜碱性的成骨细胞数目增多、体积增大，导致病变处骨膜显著增厚。1.1.5禽白血病的致病性特征根据致肿瘤作用的速度快慢，禽白血病病毒可被分为慢性致肿瘤ALV和急性致肿瘤ALV。6 山东农业大学全日制硕士专业学位论文慢性致肿瘤ALV：多数分离到的ALV野毒株都属于慢性致肿瘤病毒，通常要经过几个月的潜伏期才能发生肿瘤。对鸡白血病来说，多在性成熟时才发生肿瘤。ALV可引起多种器官、组织产生肿瘤。有些肿瘤呈大块肿瘤结节，有些肿瘤呈弥漫性细小结节，形状规则或不规则。在慢性致肿瘤ALV中都没有原癌基因，它是通过前病毒cDNA整合到宿主细胞原癌基因的上游，ALV的前病毒DNA中的长末端重复序列（LTR）含有增强子和启动子的活性，使得相关的原癌基因产物被激活从而表达，进而改变了细胞生长和分化的活性，从而转化为肿瘤细胞。急性致肿瘤ALV：急性致肿瘤ALV携带着不同的肿瘤基因，这些肿瘤基因是由正常细胞的肿瘤基因产物的表达而引起的细胞肿瘤性转化，可在短时间内诱导发生肿瘤。由ALV诱发的急性肿瘤有多种不同类型的肿瘤。病毒感染宿主细胞后，相关肿瘤基因过量表达，从而诱发细胞转化为肿瘤细胞，因此鸡在感染后会很快诱发肿瘤。不过，这些病毒都是复制缺陷性的，它们缺少了pol或部分gag、env基因，因此需要辅助性的ALV同时感染一个宿主细胞才得以复制。1.1.6抗体和病毒血症存在情况根据有无病毒血症（V+或V-）或对ALV血清抗体是否为阳性（A+或A-），在感染鸡群中，对ALV的感染状态可表现为四种类型，即：有病毒血症有抗体（V+A+）、有病毒血症无抗体（V+A-）、无病毒血症无抗体（V-A-）、无病毒血症有抗体（V-A+）。在一个已感染ALV的鸡群的不同时期，处于这四种不同状态鸡的比例是不同的，且在变化中。一般来说，随着鸡群年龄的增长，处于V+A-、V+A+状态的鸡会逐渐减少，而处于V-A-、V-A+状态的鸡会逐渐增多。在垂直感染鸡胚孵出的鸡，多表现为V+A-，称之为耐受性感染。1.1.7禽白血病的检测与诊断在对鸡只中ALV感染进行诊断时，主要通过流行病学、临床症状以及病理变化来进行初步的诊断，要想进一步确诊则需在实验室诊断。病毒分离与鉴定：病毒分离常用的样品有全血、血清、血浆、组织、肿瘤病灶、泄殖腔和阴道拭子、蛋清、鸡胚等（Crittendenetal.,1984;Fadlyetal.,2000;Fadlyetal.,1998）。将样品适当处理后接种到DF-1细胞或CEF细胞上，运用多种方法包括抵抗力诱导因子试验（RIF）、补体结合试验（COFAL）、非产毒细胞激活试验（NP）以及表型混合试验（PM）等试验方法进行分离鉴定。7 禽白血病病毒在弱毒疫苗中的污染及其对鸡免疫机能及生产性能的影响核酸斑点杂交试验：该方法特异性强、灵敏度高，在病毒性疾病的诊断中起到了重要的作用。鸡致病性外源禽白血病病毒的试剂盒，不仅可以区分内外源性的ALV，还可以区分不同亚群（崔治中等,2011）。该方法操作技术很强，需要经过专门训练的技术人员操作，尤其对于一些不便用细胞培养的实验室或对于某些疫苗，还是可以选用的。血清学检测：在临床中，ELISA方法的应用比较广泛，该方法操作简单、判定结果比较客观，也适合大批量样品的检测，便于机器操作和读数。详细的操作方法和注意事项可参考各商家试剂盒中的说明书。目前，市场上已有多种用于检测ALV-A/B抗体和ALV-J抗体的ELISA试剂盒，并被广泛应用于ALV的血清学流行病学调查（郭慧君等,2010）。但是，有些生产批次的试剂盒会产生一些假阳性反应。研究表明，ELISA检测鸡血清中ALV-A/B抗体的S/P值与IFA检测ALV-A/B的血清效价之间具有显著相关性。这为必要时利用IFA来验证ELISA试剂盒提供了可靠性（崔治中,2015）。免疫荧光技术：应用特异性ALV-A/B单因子血清、ALV-J单克隆抗体进行ALV抗原的检测，该方法具有很高的特异性，结果可靠。当血清样品数量较少时，可用IFA检测方法替代ELISA的检测（秦爱建,1999），既可以节约检测的成本，也可以提高检测的准确性。该方法一般要人工操作、人工判断、不适合大批量样品的检测。快速检测试纸条：使用免疫层析法，将胶体金作为标记的快速检测试纸条。该方法具有快速、准确和无污染等优点。快速检测试纸条的成功研制将会在临床上为禽白血病的检测与净化工作提供一种强有力的工具。1.1.8疫苗中外源性ALV污染的检测为了保证避免使用被ALV污染的疫苗，不仅要对每一种弱毒疫苗的每一个批号的产品进行检测，更重要的是要选择可靠的方法和试剂。选择的方法必须保证灵敏度、检出率高，同时还必须有很高的特异性，二者缺一不可。SPF鸡检查法：该方法被认为是经典的“金标准”，检测结果相对可靠且容易判定。通过将疫苗接种SPF鸡观察其是否诱发抗体反应来判断疫苗中是否污染外源性ALV。该方法必须严格用SPF鸡来进行接种试验，再配以过滤空气的隔离罩内维持饲养。但疫苗中污染的ALV毒株不同、含量不同以及接种鸡的年龄不同，其反应性也不尽相同。接种太早如1日龄接种，有可能诱发免疫耐受性，但接种成年鸡时又可能既不产生病毒血症又不产生抗体反应。而且反应的个体差异性也很大，鸡在感染后的抗体反应很慢，需要保证足够的试验数量和足够的观察时间。因此该试验虽然结果可靠性高，但是周期8 山东农业大学全日制硕士专业学位论文较长，检测成本也很高。细胞培养检查法：该方法是最基本也是最可靠的方法。将疫苗做相应预处理后接种鸡胚成纤维细胞（CEF），盲传后以ELISA测定细胞培养上清中的p27抗原，该方法灵敏度、特异性高，但是由于一些活疫苗接种CEF后能够引起细胞病变，使ALV的复制受到明显干扰，导致ALV分离不容易成功，例如使用禽痘疫苗，即使采用高效的抗血清进行中和病毒反应，以及超小孔径的滤膜过滤，也不能使禽痘疫苗的病毒完全去掉，病毒会很快复制形成细胞病变，ALV因生长缓慢会被完全掩盖，很难检测出来，因此不能适用于所有疫苗。而且，对于中小型养殖公司来说，配备专业的细胞培养实验室和技术人员，成本相对比较高。核酸检测法：针对外源性ALV的特异性序列设计引物，以疫苗样品中可能存在的ALV病毒基因组RNA为模板，通过RT-PCR扩增外源性ALV基因序列。该方法简单易操作，但如果不用特定方法来验证，会出现很高的非特异性结果，即假阳性。因此可靠的方法是对PCR产物进行克隆测序，但对多数实验室特别是诊断实验室来说，需要把样品移交其他商业服务实验室测序，因此很不方便，时间上也没有保证。另一个可取的方法是RT-PCR结合外源性ALV特异性核酸探针来进行验证，该方法特异性强、灵敏度高。对于疫苗中外源性ALV的检测，没有哪个方法是绝对可靠的，选用两个及以上的方法互补检测，可大大提高检测的可靠性。对于已净化或者正在进行净化中的原种鸡场的核心群来说，建议使用两个方法同时进行，以最大限度减少每种方法的不足可能带来的漏检。1.1.9鸡群禽白血病的防控目前，市场上并没有有效的疫苗来防制ALV，疫苗对于ALV的防制效果仍不理想、尚待研究。目前，国内外进行防制ALV的方法主要是通过减少种鸡群的感染率，净化种鸡群来实现的(Okazakietal.,1980)。控制该病的关键在于早期的检测和带毒鸡只的淘汰，避免垂直传染和水平传染的发生。首先要加强、完善对进口种鸡ALV的监控检疫。选择从净化的种源引进鸡苗，对外来进口的种鸡实施严格的针对ALV的监控和检测。我国ALV的流行与之前对进口鸡群没有进行相关严格的检测密切相关。我们必须要让出口方提供官方出具或认可的检疫证明，其次，进口祖代鸡的饲养过程中也要做详细的跟踪检疫。再者种鸡场应建立科学9 禽白血病病毒在弱毒疫苗中的污染及其对鸡免疫机能及生产性能的影响合理的繁育和饲养管理体制。核心种鸡群的鸡舍应完全封闭，不同来源的种蛋在孵化和出雏时必须严格分开，严格禁止混用和共用。最后对要选用的疫苗进行严格检测，坚决杜绝疫苗中外源性ALV的污染。疫苗中主要是关注弱毒疫苗，其中应最主要关注用鸡胚或鸡胚来源的细胞作为原材料生产出来的疫苗。在疫苗的种类上，应高度关注雏鸡阶段，特别是1日龄通过注射法使用的疫苗，这是因为ALV的感染对年龄及感染途径都有很强的依赖性，年龄越小越易感，注射感染比其他途径更易感。因此，为了防止使用被ALV污染的疫苗，首先要特别关注的是液氮保存的细胞结合性马立克病疫苗。这是因为，该疫苗是在出壳后要立即注射使用，而且如果发生污染，也容易污染较大剂量的病毒。1.2本试验研究的目的和意义在过去的几十年内，疫苗中外源病毒的污染始终是影响疫苗安全质量的首要问题，不仅给规模化养鸡业和家禽疫苗产业带来了很大的危害，还会给企业间带来了很多经济纠纷。目前国内外的外源病毒污染中，针对ALV污染的报道时有发生，但是对疫苗中低剂量污染ALV所造成的危害始终缺少系统的人工试验评估方法，同时很多养殖企业对疫苗中外源ALV污染的检测方法也存在片面的认识。因此，本研究针对疫苗中外源ALV的污染，进行了人工模拟试验。在马立克氏病弱毒疫苗中掺入不同剂量的ALV，研究其对海兰褐鸡生产性能以及免疫机能的影响；同时对不同种类疫苗中ALV的污染进行了检测方法的比较，表明在某些SPF鸡胚及其制品中内源性ALV基因对PCR方法检测弱毒疫苗中ALV污染的干扰。本研究的结果有助于企业加深对疫苗外源病毒污染控制的意识，并对不同检测措施在检测弱毒疫苗外源病毒污染中的应用进行综合判定和选择，为实际生产提供了关键参考，有利于ALV预防和控制。10 山东农业大学全日制硕士专业学位论文2材料和方法2.1试验材料2.1.1细胞和毒株DF-1细胞，对内源性E亚群ALV有抗性的C/E鸡胚成纤维细胞，购自美国ATCC，本实验室将其传代保存。其基础培养液为Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium（DMEM）（pH7.2,GIBCO,USA），生长液中含有10%胎牛血清（FBS,GIBCO,USA），维持液中添加1%FBS。ALV-NDVP4株（ALV-A疫苗污染毒）由本实验室从污染的NDV弱毒疫苗中分离鉴定（Zhaoetal.,2014），在DF-1细胞上增殖后，上清液按照Reed-Muench方法测定其细胞半数感染量（TCID50）。ALV-JNX0101株（GenBankaccessionNo.DQ115805）是2001年本实验室由宁夏回族自治区某父母代的种鸡场分离得到（Cuietal.,2003a），该野毒株经过IFA检测和RT-PCR结合核酸斑点杂交方法检测均无CIAV、REV和IBDV污染。它的传染性克隆毒株是由本实验室制备得到和保存的（Zhangetal.,2005）。在DF-1细胞上增殖后，其上清液按Reed-Muench方法测定其细胞半数感染量TCID50。2.1.2疫苗鸡马立克病（MDV）活疫苗购自乾元浩生物股份有限公司，鸡新城疫（NDV）灭活疫苗、H9亚型禽流感（AIV-H9）灭活疫苗、鸡新城疫（NDV）活疫苗、鸡痘（FPV）活疫苗、鸡传染性法氏囊病（IBDV）活疫苗均购自齐鲁动物保健品有限公司。2.1.3主要试剂及仪器主要试剂：ALV特异性抗原p27检测试剂盒AvianLeukosisVirusAntigenTestkit、ALV-J抗体检测试剂盒AvianLeukosisVirusAntibodyTestKit和ALV-A抗体试剂盒AvianLeukosisVirusAntibodyTestKit均购自IDEXX公司；病毒DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；SYBRPremixExTaqTM；DMEM细胞培养基、胎牛血清均购自美国Invitrogen生命技术有限公司。主要仪器：NIKONECLIPSETSl00型倒置显微镜；HEARcellCO2细胞培养箱；BioBase生物安全柜；普通台式高速冷冻离心（美国贝克曼）；ELISA洗板机（美国BioTek）；超低温冰箱（法国Thermo）；超净台（加拿大Cabinets）；SUB28型恒温11 禽白血病病毒在弱毒疫苗中的污染及其对鸡免疫机能及生产性能的影响水浴锅（英国Grant）；0.1-2.5µL、0.5-10µL、20-200µL、100-1000µL型号的移液器（德国Eppendorf）。2.1.4其他试剂的配制（1）PBS（500mL，pH=7.2±0.1）：称取Nacl4.25g，NaH2PO4·2H2O0.178g，Na2HPO4·12H2O1.386g，待固体完全溶解后，用去离子水定容到500mL，调整溶液pH至7.1-7.3之间。（2）肝素钠配制：取1g肝素钠，溶解在200mL去离子水中，在121℃高压灭菌锅中进行高压灭菌。2.1.5试验动物与SPF饲养设施一日龄海兰褐鸡购自山东某父母代种鸡场，在动物房的负压空气过滤隔离器中饲养。2.2方法2.2.1ALV-A4P株和ALV-JNX0101株的培养接种4个铺有DF-1细胞的培养皿，待DF1细胞在六孔板中长到70%~80%时，即细胞的复制进入对数生长期时，分别接种ALV-A4P株和ALV-JNX0101毒株，盲传三代，并使用IDEXX禽白血病抗原检测试剂盒测定每一代细胞上清的p27。2.2.2细胞上清的收集与检测在每次传代前收集细胞上清，使用IDEXX禽白血病抗原检测试剂盒对收集的细胞上清进行p27检测鉴定，对其中S/P值最高的细胞上清进行病毒定量。使用IDEXX禽白血病抗原检测试剂盒的具体步骤如下：使用前先将试剂恢复至18-26℃，并将其震荡混匀后再进行使用。1）取出用抗体包被的反应板，在样品记录表上准确记录样品的位置。2）在A1和B1孔中分别加入100μL阴性对照。3）在C1和D1孔中分别加入100μL阳性对照。4）在其他孔内加入100μL待检测样品，样品无需稀释。5）将反应板装在袋中，放于18-25℃条件下孵育60min（±5min）。6）用约350μL蒸馏水或去离子水洗涤反应板，或者使用洗板机，重复3-5次，最后一次洗板后将孔内液体倒掉，并用吸水纸彻底吸干水分。12 山东农业大学全日制硕士专业学位论文7）向所有反应孔中均加100μL酶标抗体后，将反应板装在袋中，于18-25℃下孵育60min（±5min）。8）重复步骤6。9）向所有反应孔中均加100μLTMB底物溶液，底物液要注意避光使用及存放，在18-25℃下孵育15min（±1min）。10）在孵育期间，可打开酶标仪，设置选项。11）向所有反应孔中均加入100μL的终止液终止反应的进行。12）反应终止后，先将酶标仪进行空气调零，然后使用酶标仪测量样品和对照在650nm波长下的吸光度值A（650），测量后记录测量数据，并根据测量数据进行结果的判定。结果判定的方法具体如下：当阳性对照的平均值与阴性对照的平均值的差（PCx-NCx）大于0.200，并且阴性对照测定的平均值小于或者等于0.150时，试验结果才是可信的。p27抗原是否在被检的样品中存在与样品中A（650）和阳性对照所测得的平均值的比值相关。检测使用的阳性对照已经过标准化的处理，可显示出明显的抗原水平（大约10ng/mL）。在检测中，被检样品中p27抗原的含量与样品吸光值和阳性对照的比值（S/P）有关。待检样品的平均值与阴性对照的平均值的差和阳性对照的平均值与阴性对照的平均值的差的比值即为S/P值。S/P>0.2，表示检测样品中含有p27抗原，表明样品是阳性的。S/P≤0.2，表示检测样品中并没有p27抗原的存在，表明样品是阴性的。2.2.3病毒扩增定量参考文献方法（孟凡峰等,2015），从-80℃冰箱中取出一支1mL冻存的病毒原液，在灭菌的1.5mL离心管中用空白的灭菌的DMEM作连续10倍的倍比稀释，即每个离心管加900ul空白DMEM，然后向第一管中加入100μL病毒原液，充分混匀，然后以此类推，倍比稀释，最多稀释到七个稀释度即可。然后将稀释好的病毒接种到铺有DF-1细胞的96孔微量培养板中，从小浓度加，每一稀释度的病毒接种一纵排共8孔，每孔接种100μL。2小时后换成维持液，维持液中含有2%FBS。将培养板放在37℃培养箱中维持9d后，取细胞上清用ELISA的方法检测p27抗原。计算方法：lgTCID50=L+d(s-0.5)13 禽白血病病毒在弱毒疫苗中的污染及其对鸡免疫机能及生产性能的影响L：最高稀释度的对数D：稀释度对数之间的差S：阳性孔比率总和2.2.4弱毒疫苗中禽白血病病毒污染对海兰褐鸡免疫机能及生产性能的影响2.2.4.1动物试验设计动物实验分组情况与处理方法见表1。七组鸡分别饲养于同等规格的SPF隔离器。每周对所有鸡称重，同时对各组鸡经翅静脉分别采集抗凝血和促凝血，其中抗凝血以TianGen血液核酸提取试剂盒提取DNA，促凝血离心分离血清后冻存于-20℃备用。表1动物实验分组与处理Table1Animalexperimentgroupingandtreatment处理组别数量1日龄7日龄1空白MDV疫苗腹腔注射生理盐水152MDV疫苗污染10TCID50ALV-A腹腔注射生理盐水153MDV疫苗污染50TCID50ALV-A腹腔注射生理盐水154MDV疫苗污染10TCID50ALV-A腹腔注射2000TCID50ALV-A155MDV疫苗污染50TCID50ALV-A腹腔注射2000TCID50ALV-A156MDV疫苗污染10TCID50ALV-A腹腔注射2000TCID50ALV-J157MDV疫苗污染50TCID50ALV-A腹腔注射2000TCID50ALV-J152.2.4.2应用荧光定量PCR检测MDV核酸使用DNA提取试剂盒提取抗凝血中的DNA，提取步骤具体如下：1）取200μL新鲜的抗凝血液，直接加入200uL缓冲液GA。2）加入20μLProteinaseK溶液，混匀。3）加入200μL的缓冲液GB，充分颠倒混匀，放置于70℃10min，溶液变清亮，简短离心去除内壁的水珠。4）加入200μL无水乙醇，充分震荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心后以去除管盖内壁的水珠。5）将溶液和絮状物都转移到收集管中的吸附柱CB3中，12000rpm，离心30s，倒掉废14 山东农业大学全日制硕士专业学位论文液，将吸附柱CB3放回到收集管中。6）向吸附柱CB3加入500μL的缓冲液GD，缓冲液中已提前加入无水乙醇，然后12000rpm，离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回到收集管中。7）向吸附柱CB3加入600μL的漂洗液PW，缓冲液中提前加好无水乙醇，然后12000rpm，离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回到收集管中。8）重复步骤7。9）将吸附柱CB3放回到收集管中，12000rpm，离心2min，倒掉废液，把吸附柱CB3放置于室温数分钟，将吸附材料中残余的液体彻底晾干。10）将吸附柱CB3转移到新的离心管中，向吸附膜的中央悬空地滴加50-200uLTEBuffer，放置于室温环境下2-5min，12000rpm，离心2min，将溶液收集到离心管中。根据本实验室建立的MDV荧光定量PCR方法，应用Primer5.0软件设计了针对Meq基因的引物用于检测MDV核酸的含量，引物序列见表2.按照如下反应体系进行荧光定量PCR检测：2μLDNA模板、0.4μLROXII、10μLSYBRGreenII、上游引物和下游引物各0.5μL、超纯水6.6μL，共20μL反应体系。反应条件：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火34s，扩增40个循环。表2Meq引物序列Table2SequencesofMeqPrimers引物名称引物序列产物大小Meq-FGACGCCTCTCGGAGAAGAC112bpMeq-RCCATAGGGCAAACTGGCTCAT2.2.4.3不同组别禽白血病病毒病毒血症的动态检测将采集的无菌抗凝血0.5mL，于4℃、2000rpm、离心2min，取80μL离心后的血浆接种在提前铺好的24孔DF-1细胞板上，在37℃培养箱中孵育2h，弃掉培养的上清液，并用无菌PBS缓冲液漂洗1遍，换成2%细胞维持液，继续在37℃培养箱中培养，7d后分别取100μL细胞培养上清用AvianLeukosisVirusAntigenTestKit检测ALV群特异性抗原p27。记录数据结果，并统计各组阳性比例。p27的具体检测方法见2.2.2。2.2.4.4不同组别禽白血病病毒抗体的检测将采集的抗体血分离血清后，分别用IDEXX公司ALV-A/B和ALV-J的抗体检测试剂盒检测抗体。具体步骤如下：15 禽白血病病毒在弱毒疫苗中的污染及其对鸡免疫机能及生产性能的影响使用前先将试剂盒中的试剂放置到室温环境下恢复18-26℃，并将其震荡摇匀后进行使用。首先用样品稀释液对待检样品进行500倍稀释，即先向190uL的样品稀释液中加入10μL样品，混匀后从中取出10μL加入到240μL的样品稀释液中。1）取出抗原包被板，轻拍以保持孔内清洁。2）在第一列的前四孔中分别加入100μL阴性对照和阳性对照。3）将待检样品500倍稀释后，取100μL稀释后的样品加入到相应的孔中，然后记录加样的顺序。4）将96孔反应板放入袋中，在18-26℃孵育箱中孵育30min。5）孵育后每孔加入350μL的已稀释的洗涤液进行洗板，洗3～5次，或者使用洗板机洗涤反应板。洗完后，将反应板中的液体倒掉，并将孔内液体完全拍干。6）每孔加100μL的辣根过氧化物酶标抗体，将反应板装入袋中，放于18-26℃孵育箱中孵育30min。7）重复第5步。8）每孔分别加入100μL的TMB底物液，将反应板再装入袋中，继续在18-26℃孵育箱中孵育15min。9）孵育后，每孔加入100μL的终止液，使反应终止。10）使用酶标仪测定各孔于650nm波长处的吸光值（A650），并且记录保存好检测数据。11）抗体检测结果的判定：被检血清的抗体是否存在主要是根据样品与阳性对照吸光值（A650）再分别减去阴性对照的吸光值后的比值（S/P）来确定的。所测样品平均值-阴性对照平均值S/P=阳性对照平均值-阴性对照平均值若样品的S/P值大于0.4，则表明所测样品为ALV-A阳性，说明该鸡群已感染了禽白血病病毒；若S/P值小于等于0.4，表明所测样品为ALV-A阴性。若样品的S/P值大于0.6，则说明所测样品为ALV-J阳性，存在ALV-J抗体；若S/P值小于等于0.6，表明所测样品为ALV-J阴性。2.2.4.5不同组别鸡体重的测定为了探究ALV-A4P株污染疫苗及再感染对海兰褐鸡生长状况的影响，每天观察鸡16 山东农业大学全日制硕士专业学位论文群生长状态，在1w、2w、3w、4w、5w、6w、7w、8w对所有鸡只称重、记录。2.2.4.6不同组别NDV和AIV-H9灭活疫苗的免疫和抗体水平的测定所有鸡只在7日龄分别于颈部皮下接种NDV灭活疫苗、AIV-H9灭活疫苗各0.2mL。在免疫后的第4w、5w、6w分别采血，分离血清后进行血凝血抑测定NDV和AIV-H9的抗体。为保证准确性，每周各组的血清样品同时进行检测。所用抗原均购自齐鲁动物保健品公司。具体测定方法如下：（1）1%鸡红细胞的制备1）取5mL注射器，吸取1mL肝素钠后，采集成年的SPF公鸡的静脉或心脏血液。2）血液与抗凝剂充分混匀后分装在10mL离心管中，2000rpm、离心10min，将上层的血浆液体和白细胞层用吸管弃去；3）再用适量的PBS轻轻吹打使上下层充分混匀后，2000rpm、离心10min，再弃去上层的液体及白细胞层；4）重复上述操作洗涤3次。5）用移液器精确量取剩余的量即为红细胞的体积。按1%的稀释比例量取适量的PBS加入瓶中，再缓慢地加入红细胞，即为配置好的1%鸡红细胞悬液。（2）四单位抗原的配制及验证取96孔板，向每孔中均加入50μLPBS，再向第1孔内加入50μL待检抗原，充分混匀后倍比稀释到第11孔，第12孔作为空白对照。然后每孔中加入50μL（1）中已配好的1%的鸡红细胞悬液，放置于37℃温箱中孵育15min后，判定结果，按照能使100%红细胞凝集的最后稀释倍数作为判定的终点。若抗原血凝价为8孔（即1:256），则配制四单位抗原从8孔倒退2孔，即为第6孔（1:64）。将1mL抗原加入到63mLPBS中充分混匀后即为四单位抗原。对配好的四单位抗原进行验证，向96孔板中加50μLPBS，向第1孔中加入50μL配好的四单位抗原，充分混匀后倍比稀释到第4孔，第5孔作为阴性对照，每孔均加入50μL1%的鸡红细胞悬液，放置于37℃温箱中孵育15min，判定结果，若仅有前两孔产生了血凝、后两孔划线，即表明该四单位病毒可以使用，否则需要重新进行四单位抗原的配制。（3）血凝抑制实验的具体步骤如下：1）向96孔血凝试验反应板中每孔均加入50μL的生理盐水。2）向每排的第一孔中加入50μL待测的血清，然后吹打混匀，从第一孔中吸取50μL17 禽白血病病毒在弱毒疫苗中的污染及其对鸡免疫机能及生产性能的影响加入到第二孔中，重复上述操作倍比稀释到第11孔后，弃掉50μL的液体，第12孔作为对照孔。3）向96孔血凝试验反应板的每孔中均加入50μL四单位抗原。4）振荡混匀后，放置于37℃环境下15分钟。5）取出96孔血凝试验的反应板，每孔中加入50μL配好的1%鸡红细胞悬液。6）振荡混匀后，放置于37℃环境下15分钟，观察结果，并记录数据。7）结果的判断：将反应板倾斜45度角（角度不可过大），当红细胞没有被病毒凝集时红细胞就会沿着倾斜面向下划线；当红细胞被病毒凝集时孔底的红细胞不流动，呈伞状。可以使红细胞完全凝集的抗原的最高稀释倍数，则为该抗原滴度的红细胞凝集价，即不划线的前一孔为该抗原的效价。2.2.4.7统计学分析使用SPSS17.0统计软件包(SPSSInc.,Chicago,IL,USA)对实验数据进行处理，同时对数据进行显著性检验，P<0.05时为差异有统计学的意义。2.2.5内源性禽白血病病毒基因对分子生物学方法检测弱毒疫苗中禽白血病病毒污染的干扰及鉴别2.2.5.1引物的设计与合成根据GenBank中已发表的ALV基因序列，应用Primer5.0软件设计针对了ALV群特异性抗原p27基因的特异性引物，引物序列见表3。表3p27引物序列Table3Sequencesofp27Primers引物名称引物序列产物大小p27-wF5’-ATGCCTGTAGTGATTAAGACAGAGGGA-3’689bpp27-wR5’-GCAGTCTTCTGCCTGTCTAGCACATAT-3’p27-nF5’-CCATATGCCTTATGGATGGACGCTT-3’341bpp27-nR5’-GACCCTTCAACCGCCTTTATAAGACG-3’2.2.5.2不同人为污染疫苗的制备用无菌PBS稀释ALV-NDVP4株至1TCID50/2mL，10TCID50/2mL，100TCID50/2mL，1000TCID50/2mL，然后分别用上述已掺入ALV的PBS稀释4瓶同一批次的新城疫活疫苗（1000羽份），即获得了污染剂量分别为1TCID50/1000羽份、10TCID50/1000羽份、18 山东农业大学全日制硕士专业学位论文100TCID50/1000羽份、1000TCID50/1000羽份的4瓶NDV污染活疫苗。鸡马立克病疫苗、鸡痘疫苗、鸡传染性法氏囊病疫苗等均按照上述操作进行检测。2.2.5.3不同来源SPF鸡胚及其细胞中禽白血病病毒的p27检测分别选取3家不同鸡胚供应商的SPF鸡胚各10枚，其中5枚孵化至7日龄时取鸡胚尿囊液以禽白血病抗原检测试剂盒（IDEXX）按照说明书测定细胞上清中p27抗原，p27具体检测方法见2.2.2。剩余5枚鸡胚孵化至9日龄时按照常规方法制备成CEF，CEF盲传2代后取上清测定细胞上清中p27抗原。鸡胚成纤维细胞的具体制备方法如下：1）取9-11日龄的SPF鸡胚，将有气室的部位朝上，用酒精棉消毒蛋壳，由气室中央向四周擦拭，用无菌的镊子小心敲破蛋壳，沿着气室边缘取掉蛋壳，避免蛋壳碎屑落入蛋内。2）换用新的无菌镊子揭开壳膜，再使用弯头镊子取出鸡胚，放入无菌的平皿中。3）用pH7.2的灭菌PBS冲洗一次，用灭菌手术剪刀去除眼、脑、四肢、内脏，将胚体转入一灭菌小烧杯中，再用PBS冲洗3遍。4）然后用灭菌手术剪刀将组织剪碎，将剪碎的组织块移入无菌的三角瓶中。5）向三角瓶中加入事先配制好的消化液15mL（胰酶的最终浓度为0.025%，EDTA的最终浓度为0.001mol/L），放到磁力搅拌器上，于37℃水浴中消化10min左右。6）将三角瓶内的消化液通过无菌滤网倒入事先加好5ml小牛血清的锥形瓶里，混匀。7）重复步骤5，反复消化四次，直至消化完全。时间依次递减，加胰酶的量依次递减。8）将三角瓶里的混合液分装至10mL的无菌离心管中，离心，1200rpm、7min。9）弃去上清，用小牛血清（几个胚用几毫升小牛血清）重悬，分装至1.5mL的无菌离心管里。10）进行活细胞计数。2.2.5.4不同样品病毒核酸的提取将市售合格的鸡马立克病疫苗、新城疫疫苗、鸡痘疫苗、鸡传染性法氏囊病疫苗以2mLPBS稀释后按照TIANGEN公司DNA提取试剂盒说明书提取病毒DNA，提取步骤见2.2.4.2。将上述疫苗同时按照OMEGA公司RNA提取试剂盒说明书提取病毒RNA；将2.2.5.2中人工制备的污染疫苗使用OMEGA公司的RNA提取试剂盒提取RNA；将2.2.5.3中7日龄鸡胚的剩余胚体，9日龄制备成CEF的细胞均进行DNA和RNA的提取。RNA的具体提取步骤如下：19 禽白血病病毒在弱毒疫苗中的污染及其对鸡免疫机能及生产性能的影响1）取灭菌的1.5mL离心管，先加入560μLQVL裂解液。2）加140μL待检样品于上述离心管中，振荡混匀。3）室温静置8~10min，短暂离心。4）悬空加入560μL无水乙醇，轻轻混匀。5）将离心管中的650μL液体转移至HiBindRNA吸附柱中，静置2min，10000g离心30s，弃掉废液。6）重复步骤（5）。7）加入500μLRWAWashBuffer，10000g离心30s，弃掉废液。8）加入500μLRWBWashBuffer，10000g离心30s，弃掉废液。9）12000g离心3min，使吸附膜完全变干，倒掉废液。10）将吸附柱置于一灭菌新1.5mL离心管中，向膜中央加入25~30μL的DEPC水。37℃放置7min，12000rpm、离心3min后，收集病毒RNA，并于每管中加入0.75μLRNA酶抑制剂使终浓度为3%，置于-80℃冰箱保存备用。2.2.5.5不同样品的PCR检测将2.2.5.4中所提DNA为模板，用p27引物进行扩增。反应体系为：10×Buffer2.5μL、dNTP2μL、上下游引物（10umol/L）各1μL、模板1μL、rTaq酶0.5μL，ddH2O补足25μL。PCR反应条件为：95℃预变性，5min；95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1min，共31个循环；72℃延伸10min。反应结束后，将PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。2.2.5.6不同样品的RT-PCR结合斑点杂交检测根据本实验室已发表的RT-PCR结合核酸斑点杂交检测方法（崔治中等,2011），首先用针对ALV的扩增引物对2.2.5.4中提取的RNA为模板，使用TAKARA公司的RNAPCRKit(AMV)进行RT-PCR扩增。RT反应体系见表4，反应条件为：42℃，45min；99℃，5min。产物4℃保存。PCR反应体系见表5，反应条件为：95℃，5min；95℃，1min；56℃，50s；72℃，1min10s。31个循环，最后72℃延伸10min，产物4℃保存。20 山东农业大学全日制硕士专业学位论文表4RT反应体系Table4ReactionsystemofRTMgCl22μL10×RT-PCRbuffer1μLdNTP1μLSampleRNA4.5μLAMV0.5μLReversePrimer1μLTotalvolume10μL表5PCR反应体系Table5ReactionsystemofPCRRTproduct10μL5×PCRbuffer10μLddH2O27.75μLForwordPrimer1μLReversePrimer1μLHsTaqenzyme0.25μlLTotalvolume50μL以RT-PCR扩增产物作为检测样品进行核酸斑点杂交检测，所用核酸检测探针为利用PCRDIGProbeSynthesisKit（Roche,USA）通过PCR法制备的ALV核酸检测探针，具体标记程序参照试剂盒说明书进行。核酸斑点杂交检测方法具体如下：1）取一张适当大小的硝酸纤维素膜（NC膜），在膜上划好0.75cm×0.75cm的格子，需做好标记，以便于识别。2）取2μL样品的核酸产物分别点在膜的格子里，并表明阴阳对照。3）NC膜（点样面朝上）晾干后，在变性液中变性10min，然后再在中和液里中和5min。4）NC膜在室温条件下干燥晾干后，放到80℃的烘干箱中2h固定DNA。5）将已固定好的NC膜放在盛有预杂交液的平皿中放置于68℃的水浴锅中反应2h。21 禽白血病病毒在弱毒疫苗中的污染及其对鸡免疫机能及生产性能的影响6）在预杂交进行到一个半小时后，准备杂交液，将探针放置在沸水中变性10min，，取出后立刻在已提前准备好的冰浴中冷却5min。7）杂交液是将准备好的要变性的探针与预杂交液充分混匀后的液体，然后放置于68℃的水浴锅中使NC膜在其中杂交6h以上。8）将NC膜放置于洗液I中洗涤15min，2次。9）将NC膜放置于洗液II中68℃洗涤15min，2次。10）将NC膜放置于缓冲液I中洗涤1min。11）将NC膜放置于缓冲液II中37℃浸沉30min，再放置于缓冲液I中洗1min。12）向20ml缓冲液II中加入4μL抗Digoxiaenin抗体（碱性磷酸酶标记物，用之前先10000rpm离心5min），将膜放置于37℃中浸沉30min。13）将NC膜放置于缓冲液I中，室温摇床洗涤5min，5次。14）将NC膜放置于缓冲液III中浸没2min。15）向平皿中加入10mL的缓冲液III和100μL的显色底物，反应一定时间后，再加入蒸馏水或者去离子水来终止显色反应。22 山东农业大学全日制硕士专业学位论文3.试验结果3.1弱毒疫苗中禽白血病病毒污染对海兰褐鸡免疫机能及生产性能的影响3.1.1禽白血病病毒污染对海兰褐鸡MDV疫苗免疫效果的影响由表6可以看出，在免疫一周后，使用污染ALV的疫苗组MDV疫苗的核酸含量明显低于使用空白MDV疫苗组，差异显著。2周龄时，空白MDV疫苗组的核酸含量最高，之后逐渐下降。三周龄时，使用污染ALV的疫苗组MDV疫苗的核酸含量最高，但仍低于空白疫苗组的核酸含量，之后逐渐下降。同时，使用50个TCID50ALV剂量污染疫苗组MDV的核酸含量从2周龄始明显低于使用10个TCID50ALV剂量污染疫苗组，差异显著。并且七日龄攻毒组MDV核酸含量又明显低于单独疫苗污染组，差异显著。七日龄再感染组中感染ALV-J组的MDV核酸含量从3周龄开始明显低于攻ALV-A组，差异显著。表6不同日龄时MDV核酸含量（拷贝）Table6MDVnucleicacidcontentatdifferentdaysofage分组1w2w3w4w5w1302±15A10471±838A7606±105A223±15A21±2A2195±12B4107±106B5177±118B184±14B22±3A3174±13B3148±85C4051±97C196±14A18±3A4162±17C2941±82C4236±101C188±16B20±1A5152±17C3052±69C3921±93C136±9C12±4B6193±13B2779±66C3253±84D87±11D19±2A7148±14C2148±71D2906±71D92±12D13±3B注：右上方大写字母表示差异显著（p<0.05），字母相同者表示差异不显著（p>0.05）.Note:Differentlowercasemeanssignificantdifference(p<0.05),andthesamelowercasemeansnoobviousdifference(p>0.05).3.1.2病毒血症的动态检测如表7所示，单独疫苗污染组中使用50个TCID50ALV剂量污染疫苗组第5w时即有1只鸡呈病毒血症阳性，9周龄时病毒血症阳性率达到27.3%；使用10个TCID50ALV23 禽白血病病毒在弱毒疫苗中的污染及其对鸡免疫机能及生产性能的影响剂量污染疫苗组第6w时有1只鸡呈病毒血症阳性，8周龄时病毒血症达到25.0%，此C后病毒血症维持在本水平。再次感染组病毒血症与单独疫苗污染组相比病毒血症明显升高。其中再次感染ALV-J的组病毒血症明显高于感染ALV-A的组，病毒血症能达到44.4%。表7不同感染鸡群的病毒血症阳性率Table7Positiveratesofviremiaindifferentchickens组别3W4W5W6W7W8W9W0/150/150/140/140/130/130/1310.0%0.0%0.0%0.0%0.0%0.0%0.0%0/150/150/141/142/133/123/1220.0%0.0%0.0%7.1%15.4%25.0%25.0%0/150/151/142/132/132/123/1130.0%0.0%0.0%15.4%15.4%16.7%27.3%0/140/140/141/132/133/124/1240.0%0.0%0.0%7.6%15.4%25.0%33.3%0/120/120/112/102/104/104/1050.0%0.0%0.0%20.0%20.0%40.0%40.0%0/140/140/120/111/102/103/860.0%0.0%0.0%0.0%10.0%20.0%37.5%0/130/130/101/92/93/94/970.0%0.0%0.0%11.1%22.2%33.3%44.4%注：右上方大写字母表示差异显著（p<0.05），字母相同者表示差异不显著（p>0.05）.Note:Differentlowercasemeanssignificantdifference(p<0.05),andthesamelowercasemeansnoobviousdifference(p>0.05).3.1.3海兰褐鸡禽白血病病毒抗体阳性率分析如表8所示，在免疫疫苗后的第5周，污染不同剂量污染疫苗组均检测到了2只ALV-A抗体阳性鸡，第8周开始使用50个TCID50ALV剂量污染疫苗组的抗体阳性率明显高于使用10个TCID50ALV剂量污染疫苗组，第9周时达到36.4%。再感染ALV-A24 山东农业大学全日制硕士专业学位论文组抗体阳性率明显升高，分别达到了33.3%、50.0%。但再感染ALV-J后对ALV-A的抗体阳性没有明显影响。如表9所示，再次感染ALV-J后，使用50个TCID50ALV剂量污染疫苗组在第6周时检测到1只ALV-J的抗体阳性鸡，使用10个TCID50ALV剂量污染疫苗组在第7周时检测到1只ALV-J的抗体阳性鸡。第8周开始使用50个TCID50ALV剂量污染疫苗组再感染ALV-J的抗体阳性率明显高于使用10个TCID50ALV剂量污染疫苗组，达到25.0%。仅免疫MDV弱毒疫苗的海兰褐鸡在连续9周检测时均为阴性，显示海兰褐鸡和所使用疫苗本身均没有MDV的感染或者污染。表8不同感染鸡群的ALV-A/B抗体阳性率Table8PositiveratesofantibodyindifferentchickenAB抗体阳性数组别3W4W5W6W7W8W9W0/150/150/140/140/130/130/1310.0%0.0%0.0%0.0%0.0%0.0%0.0%0/150/152/142/143/133/123/1220.0%0.0%14.3%14.3%23.1%25.0%25.0%0/150/152/143/133/134/124/1130.0%0.0%14.3%23.1%23.1%33.3%36.4%0/140/141/142/132/134/124/1240.0%0.0%7.1%15.4%15.4%33.3%33.3%0/120/122/112/104/105/105/1050.0%0.0%18.2%20.0%40.0%50.0%50.0%0/140/141/121/112/102/92/860.0%0.0%8.3%9.1%20.0%22.2%25.0%0/130/132/102/92/92/93/970.0%0.0%20.0%22.2%22.2%22.2%33.3%25 禽白血病病毒在弱毒疫苗中的污染及其对鸡免疫机能及生产性能的影响表9不同感染鸡群的ALV-J抗体阳性率Table9PositiveratesofantibodyindifferentchickenJ抗体阳性数组别3W4W5W6W7W8W9W0/150/150/140/140/130/130/1310.0%0.0%0.0%0.0%0.0%0.0%0.0%0/140/140/120/111/102/102/960.0%0.0%0.0%0.0%10.0%20.0%22.2%0/130/130/101/92/82/82/870.0%0.0%00.0%11.1%25.0%25.0%25.0%3.1.4禽白血病病毒污染对海兰褐鸡体重的影响由表10可以看出，在免疫疫苗前各组的体重平均度好，统计学无差异，但免疫间隔三周后，使用了污染有10个TCID50和50个TCID50ALV的两组MDV弱毒疫苗组其体重明显低于使用正常MDV疫苗组，随着日龄的增加，体重之间的差距逐渐增大，差异极显著。并且使用10个TCID50和50个TCID50ALV两种剂量污染疫苗组之间体重差异也显著。同时从第五周开始，七日龄攻毒组体重又明显低于单独疫苗污染组，随着日龄的增加，体重之间的差距逐渐增大，差异极显著。并且七日龄感染ALV-J组明显低于攻ALV-A组，差异显著。表10不同日龄时各组海兰褐鸡平均体重(g)Table10AveragebodyweightofHylinechickensatdifferentdaysofage组别1w2w3w4w5w6w7w8w168.1±3.4A115.1±6.9A181.1±8.6A264.8±13.7A353.7±20.2A457.3±25.1A576.0±35.0A690.1±43.1A268.9±4.6A116.2±7.9A168.2±15.9A223.1±16.7A311.5±22.8B374.1±29.6B450.1±31.5B543.8±36.4B367.6±4.9A116.5±8.7A167.9±13.2A212.1±16.9B249.2±22.4C327.3±34.3C427.8±28.8B513.3±34.5C468.9±4.6A109.8±10.8A156.7±15.7B204.9±23.3B245.1±27.7C314.4±31.5C410.3±32.6C515.9±39.3C567.5±4.5A107.0±7.9A150.3±10.7B203.4±15.3B251.2±19.2C314.4±23.1C367.4±27.7D447.2±36.1D668.1±3.9A113.0±8.2A156.2±14.3B216.0±21.5B249.1±35.8C339.6±33.9C383.8±32.5C476.8±35.3D767.8±4.9A107.7±8.4A153.5±7.3B190.7±10.3B240.4±18.6C284.2±15.2D340.4±19.7D396.8±25.1E注：右上方大写字母表示差异显著（p<0.05），字母相同者表示差异不显著（p>0.05）.Note:Differentlowercasemeanssignificantdifference(p<0.05),andthesamelowercasemeansnoobviousdifference(p>0.05).26 山东农业大学全日制硕士专业学位论文3.1.5NDV和AIV-H9灭活疫苗的免疫和抗体水平的测定所有组别鸡只在七日龄时同时免疫NDV和AIV-H9灭活油乳疫苗，在免疫后4、5、6w采血检测NDV和AIV-H9抗体效价。如图11，血凝抑制抗体检测结果表明，使用污染ALV的疫苗组后都能显著抑制鸡只对NDV和AIV-H9疫苗所诱发的HI抗体滴度，与空白疫苗组相比差异显著。并且使用10个TCID50和50个TCID50ALV两种剂量污染疫苗组之间抗体滴度差异也显著。同时七日龄攻毒组抗体滴度又明显低于单独疫苗污染组，差异显著。并且七日龄攻ALV-J组的抗体滴度又明显低于攻ALV-A组，差异显著。表11不同感染鸡的NDV和AIV-H9抗体结果Table11InhibitoryeffectofinfectiononNDVandAIV-H9antibodies不同日龄测定NDV抗体滴度（HI）不同日龄测定AI抗体滴度（HI）组别4w5w6w4w5w6w14.85±0.71A6.61±1.28A6.78±1.76A3.97±0.69A4.54±1.03A4.89±1.26A23.73±0.84B4.75±1.57B5.24±1.50B3.11±0.82B3.97±1.22B4.02±1.37B33.54±1.02B3.99±1.35C4.48±1.64C3.16±0.86B3.28±1.46C3.56±1.76C43.45±0.81B4.02±1.05C4.59±1.08C3.28±0.73B3.26±1.08C3.65±1.51C53.12±0.63C3.57±1.16C4.42±1.60C2.68±1.12C3.05±0.73C3.11±1.92D62.80±0.97C3.48±0.74D4.31±1.32C2.56±0.75C2.72±1.31D3.01±1.44D72.97±0.69C3.42±0.96D4.08±1.79D2.34±0.72D2.40±1.34D2.91±1.08D注：右上方大写字母表示差异显著（p<0.05），字母相同者表示差异不显著（p>0.05）.Note:Differentlowercasemeanssignificantdifference(p<0.05),andthesamelowercasemeansnoobviousdifference(p>0.05).3.2内源性禽白血病病毒基因对分子生物学方法检测弱毒疫苗中禽白血病病毒污染的干扰及鉴别3.2.1不同空白疫苗产品的PCR检测27 禽白血病病毒在弱毒疫苗中的污染及其对鸡免疫机能及生产性能的影响使用p27引物分别对商品化鸡马立克病疫苗、新城疫疫苗、鸡痘疫苗、鸡传染性法氏囊病疫苗等弱毒疫苗的DNA进行扩增，结果发现除新城疫疫苗未扩增到任何条带外，其他疫苗均有相应的条带出现，尽管扩增产量有所差别，结果如图2。（a）（b）图2应用PCR方法扩增不同疫苗中的内源性ALV基因Fig.2DetectionresultsofPCRamplificatingendogenousALVgeneofdifferentvaccines（a）应用p27-n引物扩增不同疫苗结果；（b）应用p27-w引物扩增不同疫苗结果1-6分别为马立克病疫苗DNA、新城疫疫苗DNA、鸡痘疫苗DNA、法氏囊病疫苗DNA、DF1细胞DNA、阴性对照（a）Detectionresultsofp27-nprimersamplificatingdifferentvaccines；（b）Detectionresultsofp27-wprimersamplificatingdifferentvaccines1-6:MDVvaccineDNA,NDVvaccineDNA,FPVvaccineDNA,IBDVvaccineDNA,DF1cellDNA,Negativecontrol3.2.2不同空白疫苗产品的RT-PCR结合核酸斑点杂交检测使用RT-PCR结合核酸斑点杂交的方法分别对商品化鸡马立克病疫苗、新城疫疫苗、鸡痘疫苗、鸡传染性法氏囊病疫苗等弱毒疫苗进行检测，结果发现四种疫苗的检测均为阴性，如图3。(a)(b)图3应用RT-PCR结合斑点杂交方法检测疫苗DNAFig.3DetectionresultsofRT-PCRcombinedDot-Blotondifferentvaccines（a）应用ALV-A引物检测不同疫苗结果；（b）应用ALV-J引物检测不同疫苗结果；A1-A6分别为为马立克病疫苗DNA，新城疫疫苗DNA，鸡痘疫苗DNA，法氏囊病疫苗DNA，DF1细胞DNA，阴28 山东农业大学全日制硕士专业学位论文性对照，B5分别为感染ALV-A、ALV-J的DF-1培养物作为阳性对照（a）DetectionresultsofALV-Aprimersondifferentvaccines；（b）DetectionresultsofALV-JprimersondifferentvaccinesA1-A6:MDVvaccineDNA,NDVvaccineDNA,FPVvaccineDNA,IBDVvaccineDNA,DF1cellDNA,NegativecontrolB5:PositivecontrolofDF1cellculturesinfectedALV-AorALV-J3.2.3不同来源SPF鸡胚及其制备细胞后禽白血病病毒检测对分别来自于三家不同鸡胚供应商的SPF鸡胚各5枚孵化至7日龄时取尿囊液以商品化ALV-p27抗原ELISA试剂盒测定细胞上清中p27抗原，结果均为阴性；胚体研磨后提取DNA用p27引物进行PCR扩增均为阳性，但提取RNA使用RT-PCR结合核酸斑点杂交检测均为阴性；剩余每场各5枚鸡胚按照常规方法制备成CEF，CEF盲传2代后取上清以商品化ALV-p27抗原ELISA试剂盒测定细胞上清中p27抗原，结果显示15枚鸡胚均为阴性，15枚鸡胚制备CEF所提取DNA以p27引物进行PCR扩增均为阳性，但提取RNA使用RT-PCR结合核酸斑点杂交检测均为阴性，结果如表9、图4、图5。表9不同方法对不同来源SPF鸡胚及其制备细胞后ALV检测结果Table9ALVdetectionresultsofdifferentmethodsofSPFchickembryoanditspreparation鸡胚胚体核酸检测制备CEF核酸检测尿囊液CEF上清(阳性/检测数)(阳性/检测数)ELISA检测ELISA检测SPF鸡场(阳性/检测(阳性/检测RT-PCR+DotRT-PCR+DotPCRPCR数)数)-Blot-BlotA0/50/55/50/55/50/5B0/50/55/50/55/50/5C0/50/55/50/55/50/5（a）（b）图4应用PCR扩增不同来源SPF鸡胚DNAFig.4ResultsofPCRdetectdifferentSPFchickembryoDNA29 禽白血病病毒在弱毒疫苗中的污染及其对鸡免疫机能及生产性能的影响（a）应用p27-w引物检测不同来源SPF鸡胚DNA；（b）应用p27-n引物检测不同来源SPF鸡胚DNA；1-15分别为不同来源SPF鸡胚，16为阳性对照，17为阴性对照（a）Resultsofp27-wprimersdetectdifferentSPFchickembryoDNA；（b）Resultsofp27-nprimersdetectdifferentSPFchickembryoDNA；1-15：DifferentSPFchickembryo,16:Positivecontrol,17:Negativecontrol（a）（b）图5应用RT-PCR结合斑点杂交方法对不同来源SPF鸡胚及其制备细胞检测Fig.5DetectionresultsofRT-PCRcombinedDot-BlotonSPFchickembryoanditspreparation（a）应用ALV引物检测来源SPF鸡胚；（b）应用ALV引物检测不同来源SPF鸡胚的制备细胞；A1-A5,B1-B5,C1-C5分别为三家不同鸡胚供应商的各5枚鸡胚，（a）中D4、（b）中D5均为ALV的DF-1培养物作为阳性对照；（a）中D4、（b）中D5均为ALV的DF1培养物作为阳性对照；（a）中D5、（b）中D4均为阴性对照（a）DetectionresultsofRT-PCRcombinedDot-BlotonSPFchickembryo；（b）DetectionresultsofRT-PCRcombinedDot-BlotonSPFchickembryo’spreparation；A1-A5,B1-B5,C1-C5:ThreedifferentSPFchickembryosuppliers（a）D4,（b）D5:PositivecontrolofDF-1cellcultureseffectedALV；（a）D5,（b）D4:Negativecontrol3.2.4RT-PCR结合核酸斑点杂交检测疫苗中人为污染的禽白血病病毒对污染不同剂量ALV的疫苗提取RNA后进行RT-PCR结合核酸斑点杂交检测，结果如图6显示，当在每瓶疫苗中添加ALV的剂量在10TCID50/1000羽份及以上时，结果均为阳性，但是当污染剂量为1TCID50/1000羽份时检测为阴性；鸡马立克病疫苗、新城疫疫苗、鸡痘疫苗、鸡传染性法氏囊病疫苗四种疫苗的检测结果均为如此，不同的是对人为污染的鸡痘疫苗检测时同等污染剂量情况下显色均不如其他疫苗明显，但不影响结果的判定。30 山东农业大学全日制硕士专业学位论文图6应用RT-PCR结合斑点杂交检测不同疫苗中人为污染的ALVFig.6DetectionresultsofofRT-PCRcombinedDot-BlotonALVofattenuatedvaccinesA1-A4、B1-B4、C1-C4、D1-D4分别为每瓶（1000羽份）马立克病疫苗、新城疫疫苗、鸡痘疫苗、法氏囊病疫苗中添加了1000TCID50、100TCID50、10TCID50、1TCID50的ALV-NDVP4毒株；E1、E2为空白CEF细胞DNA作为阴性对照，E3、E4为ALV-A的DF-1培养物作为阳性对照。A1-A4、B1-B4、C1-C4、D1-D4:Perbottle(1000doses)MDVvaccine、NDVvaccine、FPVvaccineIBDVvaccineadded1000TCID50ALV,100TCID50,10TCID50,1TCID50ALV-NDVP4；E1、E2:negativecontrolCEFcellDNA；E3、E4:positivecontrolofDF1cellcultureseffectedALV-A31 禽白血病病毒在弱毒疫苗中的污染及其对鸡免疫机能及生产性能的影响4讨论4.1弱毒疫苗中禽白血病病毒污染对海兰褐鸡免疫机能及生产性能的影响在过去的二十多年中，禽用弱毒疫苗中污染外源病毒的现象引起了社会和各行业的高度关注，垂直传播性病毒是报道最多的污染禽用弱毒疫苗的外源病毒，这些外源病毒主要是ALV、REV、CIAV等。无论是在国内还是国外，目前针对ALV（Barbosaetal.,2008;ZavalaGetal.,2006;ZhaoPengetal.,2014），REV（FadlyAetal.,2006;LiJetal.,2015;WeiKetal.,2012;AwadAMetal.,2010）及CIAV(YuasaNetal.,1976;邵红霞等,2012)三种外源病毒污染的报道始终是最多的。其中ALV的污染已经被多次报道，这些ALV经序列分析鉴定均为ALV-A。对于已经完成ALV净化的养殖企业，使用了污染有ALV的弱毒疫苗带来的损失是极其惨重的。然而，对于这种污染所造成的危害始终缺少系统的人工试验进行评估，本研究通过人工模拟试验初步观察了使用污染有ALV-A的疫苗后对海兰褐鸡疫苗免疫效果和再感染抗体水平的影响，结果也证实了使用污染ALV的疫苗不仅能导致感染鸡的体重下降影响鸡的生产性能，还会显著降低免疫疫苗诱导产生的抗体水平，导致疫苗免疫后抗体水平不达标，而感染其他疾病。实际上我们在生产中观察到的很多免疫失败的案例很多时候并非疫苗本身不合格，很有可能恰好这一鸡群感染了ALV等免疫抑制性病毒甚至使用的弱毒疫苗中污染有ALV，这值得引起我们的高度重视。本研究以模拟实验证实了特定ALV-A毒株的特定剂量污染对海兰褐鸡疫苗免疫和再感染抗体水平的影响，尽管不同的ALV污染毒株可能其致病性、复制能力以及诱导抗体能力均有所差别，我们所观察到的具体指标必然存在一定差异，本研究的结果有助于企业加深对疫苗外源病毒污染控制的意识并对不同检测措施在检测弱毒疫苗外源病毒污染中的应用进行综合判定和选择。本研究模拟实验的结果表明，在疫苗中每羽份污染10个TCID50ALV和50个TCID50ALV时均可检测到一定比例的ALV的抗体，但是抗体至少在免疫污染疫苗后4周才开始出现并且比例也较低。与REV和CIAV等病毒相比，ALV诱发抗体的能力较低，因此对于接种海兰褐鸡检测抗体的效果可能会因为不同病毒污染而有所不同。本研究还初步观察了这种低剂量的污染对使用鸡群造成的影响，结果表明低剂量的污染也可造成使用鸡群体重的明显下降，尽管从理论上这种低剂量的感染一般不会对感染鸡群造成明显肿瘤，这需要长期观察并且存在有一定的概率，但是任何可能的外源病32 山东农业大学全日制硕士专业学位论文毒污染不管其剂量高低都是不允许的，因此本研究有助于企业加深对疫苗外源病毒污染控制的意识并对不同检测措施在检测弱毒疫苗外源病毒污染中的应用进行综合判定和选择，为以后控制疫苗外源病毒污染层面对鸡群ALV净化起着重要的指导作用。4.2内源性禽白血病病毒基因对分子生物学方法检测弱毒疫苗中禽白血病病毒污染的干扰及鉴别使用有外源性ALV污染的弱毒疫苗是造成禽白血病在我国蛋鸡鸡群和地方品系鸡鸡群中传播流行的一个重要的原因。美国曾报道过在MDV疫苗中发现了ALV-A的外源性污染（Zavalaetal.,2006;Fadlyetal.,2006），在国内也有类似的报道案例。目前对疫苗中ALV污染的检测方法主要包括细胞培养检查法和SPF鸡检查法（Caietal.,2013），但是对于鸡马立克氏病病毒（MDV）、鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）、禽痘病毒（FPV）和ND活疫苗等利用细胞培养检查法检测ALV非常困难，因为这些病毒接种CEF或DF-1细胞后能够引起细胞病变，明显干扰了ALV的复制，从而导致ALV分离失败。相对来讲，SPF鸡检查法被认为是最有效检测ALV污染的方法，但该方法试验周期长，成本也很高，因此很多企业、基层养殖场更偏向于使用分子生物学特别是PCR的方法来检测疫苗中ALV的污染，但一般分子生物学检测除了受到内源性ALV的干扰，其灵敏度的限制也可能造成漏检。因此，在对疫苗进行检测ALV污染的时候，重点要鉴别内源性ALV和外源性ALV，外源性ALV是指不会通过宿主细胞染色体传递的ALV，主要包括A，B，C，D和J亚群，它们既可以像其他病毒一样以完整的病毒粒子的形式在细胞之间传播，或者通过接触的形式或污染物在个体和群体之间发生横向感染，也可通过鸡胚以游离的完整病毒粒子的形式从种鸡垂直传染给后代。而内源性ALV是指可整合到宿主细胞染色体基因组内的前病毒cDNA，能通过染色体垂直传播的ALV。它既可能只是基因组中不完全的片断，不能够产生传染性的病毒；也可能是全基因组因而会产生传染性的病毒，不过这类病毒通常没有致病性或者致病性很弱。目前被发现的可以产生传染性病毒的内源性ALV均属于E亚群，尽管E亚群内源性ALV通常不会产生致病性，但是会干扰对ALV的鉴别诊断。内源性ALV一般不会引起病变。在鸡群中，ALV横向的传播能力比较弱，只有在鸡群中发生垂直传播时会产生很严重的问题（Akilimalietal.,2015），因此，一般在鸡群中检测外源性ALV抗体时，阳性率基本上都不会超过30%（张丹俊等,2012），如果33 禽白血病病毒在弱毒疫苗中的污染及其对鸡免疫机能及生产性能的影响在鸡群中检测到ALV的抗体阳性率大于30%，我们就可以有理由怀疑在给鸡群免疫的过程中使用了污染有外源性ALV污染的弱毒疫苗。使用了污染有外源性ALV污染的弱毒疫苗，可能不会在鸡群中诱发肿瘤特征，但是ALV有极大的可能性会通过垂直传播感染下一代鸡群。所以，为了预防和控制ALV的传播，也为了在我国能更好的净化鸡群中的ALV，我们必须更加严格、更大力度的去监控和检测弱毒疫苗中外源性ALV的污染。外源性ALV既可以在CEF上复制也可以在DF-1上复制，但内源性ALV无法在DF-1上复制。目前，我国兽药典对弱毒疫苗中ALV污染的检测程序是疫苗接种CEF后盲传2代然后测定上清中p27抗原（Qianetal.,2015）。然而很多人对这一程序的理解不够透彻，我国兽药典界定的是在CEF上接种疫苗后不能检测出p27蛋白而非p27基因，很多单位特别是一些基层养殖场习惯于用针对p27基因的引物进行PCR扩增来判断疫苗中是否存在ALV污染，结果经常检出阳性结果引来不必要的纠纷。本研究按照这一错误方法分别对不同鸡胚和不同疫苗提取DNA后同时使用针对p27基因的引物进行PCR扩增和本实验室发明的RT-PCR结合斑点杂交检测（孟凡峰等,2015），结果所有鸡胚和疫苗使用RT-PCR结合核酸斑点杂交检测均为阴性，而使用针对p27基因的引物进行PCR扩增除了NDV疫苗未扩增出相应条带外所有鸡胚和其他疫苗均为阳性，这就说明这些鸡胚和疫苗中均存在内源性ALV基因成分但是并不表达，而NDV疫苗未扩增出相应条带很可能是因为其作为尿囊液制备疫苗经过离心后其中鸡的染色体基因很少，内源性ALV核酸比例很低，不足以被PCR检测到。显然使用一般的引物进行PCR扩增特别是针对p27基因的引物用于检测疫苗中ALV污染会造成大量的假阳性，采用分子生物学检测方法用于疫苗中ALV污染检测存在很高的风险。此前，本实验室曾多次报道使用RT-PCR结合核酸斑点杂交方法能够有效避免CEF基因组中内源性ALV的干扰，本研究通过向鸡马立克病疫苗、新城疫疫苗、鸡痘疫苗、鸡传染性法氏囊病疫苗中人为添加不同剂量ALV污染的方式观察了这一方法在检测疫苗中ALV污染时的可行性，结果显示当污染剂量低于10TCID50/1000羽份时使用RT-PCR结合核酸斑点杂交检测均为阴性，这恰恰说明这一方法可有效鉴别疫苗中内源性ALV基因，而且四种疫苗均可以检测出10TCID50/1000羽份以上剂量的污染，即最低检出量为0.01TCID50/羽份。本研究希望通过对不同样品和不同检测方法的比较使疫苗使用者正确理解弱毒疫苗ALV污染检测规程并抛弃片面性的错误做法，减少不必要的纠纷，同时能够确保准34 山东农业大学全日制硕士专业学位论文确检测出弱毒疫苗中ALV污染。35 禽白血病病毒在弱毒疫苗中的污染及其对鸡免疫机能及生产性能的影响5结论1、本试验通过人工模拟使用了污染禽白血病病毒的马立克氏病弱毒疫苗后，鸡群的生长会受到显著抑制，体重明显降低。剂量越高，抑制作用更加明显。同时，造成免疫抑制，使疫苗的免疫达不到预期效果，导致免疫失败。2、在检测弱毒疫苗中禽白血病病毒污染时，单纯用PCR的方法会受到内源性ALV基因的干扰，导致假阳性的出现，而结合鸡外源性禽白血病病毒特异性核酸探针交叉斑点杂交试验会避免假阳性的出现，并且有良好的特异性和灵敏度。36 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山东农业大学全日制硕士专业学位论文致谢两年的硕士研究生生活即将划上句号而我们又将踏上新的征程。这两年的求学生涯在导师、同学、亲友的大力支持下收获满满，我学会了许多，成长了许多。本论文是在我的导师赵鹏副教授和崔治中教授的亲切关怀和悉心指导下完成的。两位导师有着严谨的治学态度，敏锐的科学洞察力以及精益求精的工作作风，这些优良品质一直深深地感染和激励着我，使我受益终生。不论是在学习上，还是在生活上，两位导师都给予我以无微不至的关怀和耐心细致的指导，使我能够克服各种困难，顺利完成实验研究工作。在生活中，两位导师教育我要踏踏实实做人，认认真真做事，在人生航向方面给予我教导和指正，并且以身作则照亮我前行的路。在此，谨向赵老师和崔老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意！感谢动科院的各位领导和预防兽医学系的赵孝民教授、崔言顺教授、柴同杰教授、朱瑞良教授、刁有祥教授、常维山教授、姜世金教授、孙淑红教授、柴家前教授等教师们多方面的关心和帮助！特别感谢常爽老师、王一新博士、李阳博士、孟凡峰博士的给予我的实验上和生活上的帮助和支持，他们带着我去开启实验研究的大门，带着我去融入我们实验室这个大家庭。衷心感谢孙鹏师兄、李思菲师姐、苏红芹师姐、崔贺师兄、栾怀彪师兄、许书珍师姐、房立春师兄、陈俊霞师姐对我生活上的的照顾和关心、对我实验上的帮助和支持。感谢我的同级刘英楠、任志浩、李晓晗、张言坤、韩妮、赵颖洁、付佳媛、崔帅，谢谢你们两年来对我的包容和照顾，感谢你们在我身边彼此陪伴、相互依靠。感谢我的师弟们，任衍倍、张玉标、李秋辰、董桂伟、苏奇、田似报，正是有了你们，我的实验才能顺利的进行。感谢实验室的科研辅助人员孙文丽、鲁金、吕汉英为我的实验付出的辛勤劳动和汗水。感谢我的家人，在你们的殷切期盼下我才能一步步前行，你们的支持和鼓励是我前进的最大动力。值此论文完成之际，向所有给予我指导、关心和帮助的所有老师、领导、同学和朋友表示深深的谢意！同时向参加本论文评阅和答辩工作的各位老师表示深深的谢意！45 禽白血病病毒在弱毒疫苗中的污染及其对鸡免疫机能及生产性能的影响攻读学位期间发表论文情况栾怀彪，赵颖洁，吕艳艳，徐颖，崔治中，常爽，赵鹏.核酸斑点杂交法与ELISA在SPF鸡检测弱毒疫苗中ALV污染的应用与比较[J].中国家禽,2016,04:10-13.李思菲#，苏红芹#，王一新，吕艳艳，赵颖洁，崔治中，常爽，赵鹏.拉米夫定对禽白血病病毒的体内外抑制效应及其应用.中国预防兽医学报.2016,(9)：700-704.赵颖洁，张玉标，孟凡峰，吕艳艳，崔治中，常爽，徐步，范建华，赵鹏.ALV-J经卵黄囊接种对鸡的致病性与逆转录酶抑制剂类药物对鸡的保护作用[J].中国家禽.2016,(23)：20-23.46
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