豚鼠耳蜗中脂滴的分布特点和病理生理学意义

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中图分类号R764.35学校代码10634UDC616密级授予单位川北医学院豚鼠耳蜗中脂滴的分布特点和病理生理学意义TheDistributionandPathophysiologicalofLipidDropletsinGuineaPigCochlea作者杨风波导师吕萍教授培养院系临床医学系授位类别学术学位授位级别硕士学科门类医学学科专业耳鼻咽喉科学研究方向耳鼻咽喉基础与临床年级2013学号201303112二○一六年五月 致谢光阴似箭，时光穿梭，忙碌又充实的研究生生活将就此成为回忆，值此毕业之际，我衷心的感谢我的导师吕萍教授、301医院于宁研究员在我学习、工作和科研中给我的大力的帮助和悉心指导，导师们缜密的科研思维，严谨的治学态度，无私奉献的精神以及高尚的工作作风将始终激励我严格要求自己，勇攀科学高峰。衷心感谢国家重点实验室中国人民解放军耳鼻咽喉研究所及中心实验室为我提供的科研平台，衷心感谢国家973计划重大科学研究计划（2012CB967900）、北京市噪声项目（PXM2014-178304-000002-00130228）总装项目（JDZYY20132），国家自然基金项目（81241034，81271081），解放军总医院苗圃基金（12KMM07）及四川省卫生厅课题（110298）对本实验科研经费的支持。衷心感谢中国人民解放军耳鼻咽喉研究所王秋菊所长、李兴启教授、孙建和主任技师、王凌燕老师、丛涛老师、张悦老师、邱世伟老师、蒋晴晴老师、任红苗博士、王方圆博士、邵森垚博士、丁大雄硕士、李四军硕士、刘恋硕士、李凤娇硕士、黄国威硕士、王晓东硕士、刘晨硕士等在科研上对我的技术支持和生活上的帮助。衷心感谢清华大学高莹莹老师、常童洁老师、唐瑄老师等在科研上对我的技术支持。衷心感谢本科室唐嗣泉教授、刘海教授、李蓓副教授、甘卫刚讲师、蒲红英主任护师、赵锐助教等对在我临床实践中给予的帮助和支持。衷心感谢为本研究献出宝贵生命的实验动物们。衷心感谢对我一直默默支持的爸爸、妈妈，感谢你们的养育之恩； 感谢我亲爱的家人给予我的经济和精神支持。最后，感谢百忙之中抽出时间给我论文评审的专家和参加我毕业答辩的各位专家、老师们。 豚鼠耳蜗中脂滴的分布特点和病理生理学意义摘要耳蜗是内耳的一部分，是外周听觉系统的重要组成部分，主要起传导和感受声波的作用，其核心部件是Corti’s器。Corti’s器可将来自中耳的声音信号转换为相应的神经电信号，通过听神经传递给听觉中枢，并最终实现听觉。目前认为Corti’s器在实现声音信号转换的放大过程是一个高耗能的过程。生物体能量来源的主要物质是糖和脂肪，但是研究发现Corti’s器的内、外淋巴液中葡萄糖含量较低，而脂质的含量较高。如此高耗能的信号转换过程中脂滴在其中是否供能不得而知。本研究通过对豚鼠耳蜗组织细胞染色、三维重建定量、噪声暴露的方法，试阐明豚鼠耳蜗中脂滴分布特点及病理生理意义。第一部分豚鼠耳蜗中脂滴的验证目的：验证豚鼠耳蜗中脂滴的存在，并初步了解豚鼠耳蜗活细胞中脂滴的存在情况。方法：分别运用1%锇酸、苏丹Ⅲ、苏丹Ⅳ、油红O、Bodipy493/503五种染料染色Hartley豚鼠耳蜗组织细胞，观察耳蜗组织的染色情况。Bodipy493/503染色内耳活细胞并观察。结果：豚鼠耳蜗锇酸再固定后Corti’s器边缘可见黑色颗粒；苏丹Ⅲ染色豚鼠耳蜗Corti’s器可见Hensen细胞中可见橘黄色球形颗粒；苏丹Ⅳ染色见猩红色球形颗粒；油红O染色可见宝石红色球形颗粒分布，Bodipy染色493/503染色Hensen细胞，在荧光显微镜下Hensen细胞质中可见绿色颗粒散在分布。Bodipy493/503染色活体Hensen细胞可见绿色脂滴颗粒与光镜下的高透明物质完全重合。结论：以上五种染色方法均证明豚鼠耳蜗中含有大量的中性脂滴。活体Hensen细胞的高透明物质为脂滴 第二部分豚鼠耳蜗中脂滴的分布研究初探目的：明确豚鼠耳蜗中脂滴的分布特点,为豚鼠耳蜗中脂滴的功能研究提供方法和数据资料。方法：运用Bodipy493/503荧光分子探针染色豚鼠耳蜗组织细胞,于激光共聚焦显微镜下观察脂滴在耳蜗中的分布情况并留取图像。并用Imaris图像处理软件分析处理脂滴的荧光图像，计算脂滴的体积。结果：豚鼠耳蜗第1转中无脂滴，第2转中脂滴大小为:8.84±5.24μm3，第3转中脂滴大小为:23.38±8.31μm3，第4转中脂滴大小为:64.71±10.33μm3。结论：豚鼠耳蜗脂滴主要分布于Corti’s器的Hensen细胞中。不同Hensen细胞中脂滴的大小、数目不尽相同。采用激光共聚焦扫描三维重建技术和Imaris图像分析处理方法，发现脂滴在豚鼠耳蜗各转中体积分布在0.1~1000μm3，差异较大，主要集中于1~100μm3。从底转至顶转的分布特点是从无到有，从少到多，从小到大，且在第2转存在一个突然出现的“转折点”。第三部分豚鼠耳蜗中脂滴的病理生理研究初探目的：初步探究豚鼠耳蜗脂滴在听觉转换过程中的病理生理作用。方法：1、探究噪声对豚鼠耳蜗中脂滴的影响，将同窝、同性别、相似体重的3对Hartley豚鼠，分两组，其中1组给予噪声暴露，另1组不予噪声暴露；分别测量耳蜗脂滴的体积。2、探究脂滴对噪声性聋的作用，随机将Hartley豚鼠分为三组：脂代谢抑制剂组(A组),脂代谢激动剂组(B组),阴性对照组(C组)。A，B，C三组分别于噪声暴露(120dBSPF)前0.5小时给予腹腔注射胰岛素(1u/kg)，曲格列酮(10μmol/kg)，二甲基亚砜(1ml/kg)。Hartley豚鼠分别于噪声前、噪声后、噪声后第3天测ABR阈值。结果：噪声后脂滴数量较噪声前明显减小；B组听力损失较A、C组 轻，A、C组间无明显差异。结论：噪声刺激导致耳蜗脂滴减少，说明豚鼠耳蜗脂滴参与了听觉过程中的物质代谢。注射曲格列酮后在相同噪声条件下豚鼠的听力下降较轻，脂滴分解代谢被激动后可减轻噪声性听力损失。关键词：豚鼠；耳蜗；Hensen细胞；脂滴；噪声性聋；功能 TheDistributionandPathophysiologicalofLipidDropletsinGuineaPigCochleaAbstractThecochlea,apartoftheinnerear,isanimportantcomponentoftheperipheralauditorysystem,whichcanconductandfeelsoundwaves.ItscorecomponentisCorti’sorgan.Corti’sorgancanconvertsoundsignalfromthemiddleeartothecorrespondingneuralelectricsignals,passedthroughtheauditorynervetoauditorycenter,andfinallygeneratethehearing.TheprocessofcompilingandamplifythevoicesignalofCorti’sorgancontainsahighenergy-consuming.Sugarandfatarethemainmaterialofenergysupply,butlessglucoseandmorelipidsintheinternalandexternallymph.Theroleoflipiddropletsinthevoicesignalconversionprocessisnotclear.Thisresearchanalyzedcochleatissuestaining,quantitative3Dreconstruction,noiseexposureoftheguineapigtoilluminatelipiddropletsdistributionfeaturesandpathophysiologicalsignificanceoftheguineapigcochlea.PartⅠValidationoflipiddropletsinguineapigcochleaObjective:Toevaluatethelipiddropletsinguineapigcochleaandit’sexistenceinthelivingcells.Method:Hartleyguineapig’sCochleartissueisstainedby1%osmicacid,SudanⅢ,SudanⅣ,oilredOandBodipy493/503respectively.Observelipiddropletsdistributionandmorphologyinguineapigcochleabymicroscope.ObservethelivingcellsofcochleathroughBodipy493/503dye.Result:BlackparticleswerevisibleinguineapigcochleaCortiorganedgeafterosmicacidfixed;OrangesphericalparticleswerevisibleinguineapigcochleaCotiHensencellsaftersudanⅢdyeing;RedsphericalparticleswerevisibleinguineapigcochleaCortiHensencells aftersudanⅣdyeing;RedsphericalparticledistributionwerevisibleinguineapigcochleaCotiHensencellsafterOilredOstaining；GreenparticlesscattereddistributioninthecytoplasmwerevisibleinHensencellsafterBodipy493/503dyeingunderthefluorescencemicroscope.Conclusion:Theabovefivekindsofmethodsallcanprovedthatalargenumberoflipiddropletsexistedinguineapigcochlea.ThehightransparentmaterialinliveHensencellswerelipiddroplets.PartⅡThedistributionoflpiddropletsinguineapigcochleaObjective:Toquantifythedistributionoflipiddropletsinallkindsoftissuesandcellsintheguineapiginnerear,andtoprovidethebasisoffattyacidmetabolisminguineapiginnerear.Method:Hartleyguineapig’sCochleartissueisstainedby1%osmicacidandBodipy493/503,observedandtakenphotosbystereomicroscopeandlaserconfocalmicroscope.Fluorescenceimageanalysis,processingandcalculatingthevolumeoflipiddropletsbyImaris7.0imageprocessingsoftware.Result:Therehasnolipiddropletinthe1stturn,dropletaveragevolumeinthe2ndturnlipidis8.84±5.24um3,the3rdturnis23.38±8.31μm3,andthe4thturnis64.71±10.33μm3.Conclusion:LipiddropletsofguineapigcochleamainlydistributedintheCorti’sHensencells.ThenumbersandsizesoflipiddropletsinHensencellsweredifferent.Throughconfocallaserscanningtechnology3DreconstructionandImaris7.0imageprocessingsoftwareanalysisguineapigcochlea,Wefoundthatthevolumeofasinglelipiddropletiswidelydistributedin0.1~1000μm3,andmainlydistributedin1~100μm3.Lipiddropletsdistributioninguineapigcochleabasilarmembranefrombottomtotopisfromscratchandthe2ndturnisa‘turningpoint’. PartⅢThefunctionstudyoflipiddropletsintheguineapig’scochlearObjective:Todiscussthepathophysiologicalroleoflipiddropletsintheprocessofauditorytransformationinguineapigcochlear.Method:1.Toexploretheeffectofthenoiseexposuretothelipiddropletsintheguineapigcochlea.ThreepairsHartleyguineapigsweredividedintotwogroupsaccordingtocompatriots,sex,andweight.Onegroupwasgivennoiseexposure,andanothernot.Measurethelipiddropletsvolumeoftwogroups.2.Toexploretheeffectoflipiddropletstonoisedeafnessinguineapig.Hartleyguineapigsweredividedintothreegroups,givenintraperitonealinjectionoffattyacidtransporternhibitor(insulin,Agroup),fattyacidtransporteragonist(troglitazone,Bgroup),andDMSO(control,Cgroup)within0.5hoursbeforenoiseexposed.Hartleyguineapigsexposedby120dBSPFwhitenoise4h/dayconsecutive4days.Observedthethresholdofauditorybrainstemevokedpotential(ABR)beforenoiseexposed,immediateand3dayafternoiseexposed.Result:Afterthenoiseexposed,thequantityoflipiddropletsreducedobviouslyinguineapig’scochlea.HearinglossbetweenBgroupandAgrouporBgroupandCgrouphadsignificance,butnosignificancebetweenAgroupandCgroup.Conclusion:Noisecausesadeclineoflipiddropletsinthecochlea,thelipiddropletswereinvolvedinthematerialmetabolismofauditory.Thecatabolismoflipiddropletscanreducethatnoiseinducedhearingloss.Keywords:Guineapig;Cochlea;Hensencell;Lipiddroplets;Noiseinducedhearingloss;Function 目录前言.....................................................................................................................1参考文献.........................................................................................................4第一部分豚鼠耳蜗中脂滴的验证................................................................7前言..................................................................................................................7材料与方法.....................................................................................................8结果...............................................................................................................19讨论...............................................................................................................23结论...............................................................................................................24第二部分豚鼠耳蜗中脂滴的分布研究初探..............................................25前言...............................................................................................................25材料与方法...................................................................................................25结果...............................................................................................................26讨论...............................................................................................................36结论...............................................................................................................39第三部分豚鼠耳蜗中脂滴的病理生理意义研究初探.............................40前言...............................................................................................................40材料与方法...................................................................................................40 结果...............................................................................................................42讨论...............................................................................................................47结论...............................................................................................................49全文总结..........................................................................................................50参考文献..........................................................................................................51综述：Hensen细胞中脂滴的功能研究进展.................................................58参考文献.......................................................................................................65附录...................................................................................................................71个人简历..........................................................................................................72原创性声明及版权使用授权说明..................................................................74 川北医学院硕士学位论文前言2013年世界卫生组织调查结果显示，全球5%的人患有耳聋相关疾病[1]，据2006年第二次全国残疾人抽样，我国听力言语残疾居五类残疾人之首，人口达2131万[2]。听觉障碍不仅仅影响患者对声音的感受，还会影响其言语表达、智力发育、社会能力，甚至导致心理变态、违法犯罪。据调查显示，聋哑人犯罪在我国呈高发态势,犯罪数量急剧增加，给社会治安带来危害，给家庭经济带来负担[3]。所以，“防聋治聋”事关社会长治久安、国计民生，是我国全体人民的迫切需求。听觉病理生理机制研究是解决耳聋防治难题的关键步骤。正常的听觉必须依靠完整的内耳解剖结构和生理功能[4]。目前内耳的解剖结构研究已经达到了很高的水平，然而对其生理功能的研究一直相对较少。其实早在1948年Gold等就开始研究内耳的生理功能，并提出了内耳中可能存在着需要消耗能量的主动放大机制[5]。但由于内耳组织的特殊性及实验条件的限制，使得内耳生理功能研究进展相对较缓。能量代谢物质主要是糖和脂质。1996年Wangemann&Schacht[6]在《TheCochlea》一书中指出耳蜗管内淋巴中葡萄糖仅为0.6mmol/L，鼓阶外淋巴葡萄糖3.6mmol/L，前庭阶外淋巴葡萄糖3.8mmol/L；而脑脊液葡萄糖4.81mmol/L。2006年王艳等报道了内耳外淋巴含游离胆固醇1.57mg/dL，总胆固醇28mg/dL，远高于脑脊液中的胆固醇含量0.059mg/dL[7]。毛细胞的高频运动，会消耗大量的能量，而内耳环境却不能提供足够的糖，同时内耳中含有充足的脂质。理论上脂质是能够补充葡萄糖的不足，氧化提供能量，维持毛细胞的功能。Hensen细胞作为一种内耳上皮细胞，是内耳螺旋器的主要支持细胞，1 川北医学院硕士学位论文紧邻外毛细胞，于1863年首次被VictorHensen描述[8]。随后的研究发现Hensen细胞质内含有大量圆形脂肪颗粒，且脂滴的分布特点为从蜗底到蜗顶逐渐增多[9]。奇怪的是Hensen细胞含有大量脂滴，却没有与脂肪酸代谢相关的线粒体和内质网系统，而与之相邻的外毛细胞则含有大量的线粒体及内质网系统[10-11]。在骨骼肌和心肌也有与耳蜗微环境相似的情况——需要大量的能量却没有充足的葡萄糖用于氧化供能。研究表明骨骼肌和心肌都主要依赖脂肪供能[12]。在正常成年人心肌中ATP的供应有2/3是由脂肪酸β氧化提供的[13]，糖尿病患者的骨骼肌组织则几乎完全依赖脂肪酸的氧化供能[14-16]。听觉过程中声刺激引起相应频率外毛细胞快速伸缩运动，该运动虽不直接依赖于胞内ATP，但是为适应胞体快速运动细胞及细胞器必然存在与之相适应的能量物质的供应和代谢机制。外毛细胞在功能上与心肌细胞一样需要大量的能量；结构上毛细胞和支持细胞有着大量的缝隙连接与心肌细胞的结构相似。孙建和等提出Hensen细胞内脂肪滴可能通过β氧化给外毛细胞供能量，维持正常听力[17]。脂肪酸代谢可以为机体提供能量，但其代谢异常后也会诱发许多相关疾病，如在心肌诱发心肌缺血[18]，在骨骼肌诱发肌萎缩[19]，在皮下诱发脂肪瘤[20]等。如果耳蜗中脂肪酸参与了能量代谢，而各种原因引起的代谢异常就可能诱发耳蜗病变，导致听力下降。如果这个推断被证实，将为听觉相关疾病的研究与治疗提供新的理论依据和视角。既然耳蜗脂质代谢如此重要，为什么既往对内耳脂肪酸研究较少呢？这主要因人们对脂滴的认识和研究技术的限制，难于定量研究。随着近年来人们对脂肪酸尤其是脂滴、脂蛋白等进一步了解，认识到了脂滴功能的多样性和复杂性。研究表明，脂滴并非细胞内一个简单的能量2 川北医学院硕士学位论文贮存器，而是一个复杂、活动旺盛、动态变化的多功能细胞器[21]。脂滴能够沿着细胞骨架运动，并与其它细胞器相互作用，可能在脂类代谢与存储、膜转运、蛋白降解，以及信号传导过程中起着重要的作用[22-24]。传统的脂滴定量研究方法需要提取大量的组织和破坏组织结构[25-29]。与体内其他部位脂滴研究不同，耳蜗深埋于骨质内、结构精微、组织含量少。传统的定量研究方法在耳蜗脂滴的研究中受到极大的限制。近年有报道将激光共聚焦扫描显微镜技术和计算机三维重建技术相结合，用于定量研究精微结构的脂滴[30-34]。激光共聚焦扫描显微镜的广泛应用和计算机三维重建技术的长足发展，为耳蜗脂滴的定量研究提供了良好的实验条件。本研究拟用多种方法验证豚鼠耳蜗中含有脂滴并初步了解其分布特点，用激光共聚焦扫描+三维重建的方法研究豚鼠耳蜗中脂滴分布特点及病理生理意义。3 川北医学院硕士学位论文参考文献[1]世界卫生组织.耳聋与听力障碍[EB/OL].(2015-03)[2016-04-07]http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs300/en/.[2]第二次全国残疾人抽样调查领导小组,中华人民共和国国家统计局.2006年第二次全国残疾人抽样调查主要数据公报[J].中国康复理论与实践,2006,12(12):1013.[3]任荣升.聋哑人犯罪问题研究[D].济南:山东大学,2011.[4]ReichenbachT,HudspethAJ.Dualcontributiontoamplificationinthemammalianinnerear[J].PhysRevLett,2010,105(11):118102.[5]孙建和,杨仕明.耳组织学[M].北京:人民军医出版社,2015:152-153.[6]RichardRFay.Thecochlea[M].NewYork:Springer,1996:151-153.[7]王艳.内耳淋巴液的来源、性质和成分[J].生物学通报,2006,41(12):23.[8]RaicaM.AshortstoryofVictorHensenandacelloftheinternalear[J].RomJMorpholEmbryol,2012,53(3Suppl):855-857.[9]MerchanMA,MerchanJA,LudeñaMD.MorphologyofHensen'scells[J].JAnat,1980,131(Pt3):519-23.[10]李兴启,孙建和,杨仕明.耳蜗病理生理学[M].北京:人民军医出版社,2011.[11]孙建和,王秋菊,姜泗长.耳蜗扫描电镜图谱[M].北京:人民军医出版社,2006.[12]LiuP,YingY,ZhaoY,etal.ChinesehamsterovaryK2celllipiddropletsappeartobemetabolicorganellesinvolvedinmembranetraffic[J].JBiolChem,2004,279(5):3787-3792.[13]DoegeH,StahlA.Protein-mediatedfattyaciduptake:novelinsightsfrominvivomodels[J].Physiology(Bethesda),2006,21(4):259-268.[14]AnD,RodriguesB.Roleofchangesincardiacmetabolismindevelopmentofdiabeticcardiomyopathy[J].AmJPhysiolHeartCircPhysiol,2006,291(4):H1489-1506[15]WangP,LloydSG,ZengH,etal.ImpactofalteredsubstrateutilizationoncardiacfunctioninisolatedheartsfromZuckerdiabeticfattyrats[J].AmJPhysiolHeart4 川北医学院硕士学位论文CircPhysiol,2005,288(5):H2102-2110[16]FinckBN,HanX,CourtoisM,etal.AcriticalroleforPPARalpha-mediatedlipotoxicityinthepathogenesisofdiabeticcardiomyopathy:modulationbydietaryfatcontent[J].ProcNatlAcadSciUSA,2003,100(3):1226-1231[17]孙建和,胡吟燕,翟所强.豚鼠耳蜗Corti器外隧道的结构[J].听力学及言语疾病杂,2008,16(1):60-62.[18]WangY,LiC,WangQ,etal.DanqiPillregulateslipidmetabolismdisorderinducedbymyocardialischemiathroughFATP-CPTIpathway[J].BMCComplementAlternMed,2015,15:28.[19]BosmaM.Lipiddropletdynamicsinskeletalmuscle[J].ExpCellRes,2016,340(2):180-186.[20]GadeaE,ThivatE,PaulonR,etal.Hibernoma:aclinicalmodelforexploringtheroleofbrownadiposetissueintheregulationofbodyweight?[J].JClinEndocrinolMetab,2014,99(1):1-6.[21]张淑妍,杜雅兰,汪洋,等.脂滴——细胞脂类代谢的细胞器[J].生物物理学报,2010,26(2):97-105.[22]ZehmerJK,HuangY,PengG,etal.Aroleforlipiddropletsininter-membranelipidtraffic[J].Proteomics,2009,9(4):914-921.[23]GoodmanJM.Thegregariouslipiddrople[J].BiolChem,2008,283(42):28005-28009[24]BartzR,ZehmerJK,LiuPS.Thenewfaceoflipiddroplets[J].ProgressinBiochemistryandBiophysics,2005,32(5):387-392.[25]GreenspanP,MayerEP,FowlerSD.Nilered:aselectivefluorescentstainforintracellularlipiddroplets[J].TheJournalofCellBiology,1985,100(3):965-973.[26]GenicotG,LeroyJLMR,vanSoomA,etal.Theuseofafluorescentdye,Nilered,toevaluatethelipidcontentofsinglemammalianoocytes[J].Theriogenology,2005,63(4):1181-1194.[27]KimuraK,YamaokaM,KamisakaY.Rapidestimationoflipidsinoleaginousfungi5 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川北医学院硕士学位论文第一部分豚鼠耳蜗中脂滴的验证前言近年来，耳蜗支持细胞在听觉过程的功能作用成为学界研究热点。Hensen细胞作为一种内耳上皮细胞，是内耳螺旋器的主要支持细胞，紧邻外毛细胞，于1863年首次被VictorHensen描述[1]。文献报道Hensen细胞(Hensen’scells,HC)之间有缝隙连接（GapJunctions）的表达[2]，Hensen细胞内有大量圆形颗粒，Hensen细胞表面有大量微绒毛，且微绒毛下方胞浆中含大量的囊泡；推测Hensen细胞可能向内淋巴液中释放物质并参与声音的机械能的转换，其功能重要[3]。众所周知物质结构决定性质，性质决定功能。欲研究耳蜗中脂滴功能，需先了解结构和性质。既往研究表明Hensen细胞内有高透亮圆形小滴，形似“珍珠”，推测这些有高折光性的物质为脂滴[4]。随后Hallpik、Vinnikov&Titova及Kimura等学者开始将此类物质作为Hensen细胞的特征性细胞器[5-7]。1980年MiguelA虽通过透射电镜、扫描电镜、红油O、苏丹Ⅲ染色等方法观察了豚鼠耳蜗Hensen细胞中的高折光性的物质并定义为脂滴，但所用观察手段有较大局限性，实验标本均为固定后的组织细胞[3]。脂滴是一个有生物活性的细胞器，其在活体和固定标本中可能存在一定的差异。本研究为了观察活细胞中的脂滴分布情况，选用了高分辨率活细胞成像系统对活体Hensen细胞进行观察。它和普通激光共聚焦的区别在于该系统拍摄时程短，需要的激发光强度低，对细胞的光毒性较小。运用荧光染色在高分辨活细胞成像系统可以直接观察活细胞中的物质和细胞器。7 川北医学院硕士学位论文Bodipy493/503是一种氟硼二吡咯类荧光分子探针，广泛用于中性脂滴的鉴定[8]。本实验采用常用的脂肪酸染色剂1%锇酸、苏丹Ⅲ、苏丹Ⅳ、油红O以及Bodipy493/503对Hensen细胞的脂滴类物质进行验证，同时用Bodipy493/503对活体Hensen细胞进行荧光染色，用DeltaVision高分辨率活细胞成像系统进行观察，为下一步研究耳蜗中脂滴的分布打下基础。1材料与方法1.1.实验材料：1.1.1.实验动物：Hartley豚鼠20只，白毛赤目，耳廓形态正常无充血、畸形，耳廓反射灵敏，外耳道清洁，鼓膜完整、标志清楚、无充血、穿孔。体重300±25g，周龄：13±1周，雌雄不限。所有动物均无噪声暴露史，无药物接触史，清洁等级为SPF级。实验动物均由解放军军事科学院实验动物中心(北京)提供；均通过军事医学研究伦理委员会的批准。1.1.2.实验试剂：磷酸二氢钠(Sodiumdihydrogenphosphate，NaH2PO4,Amresco,美国)；磷酸氢二钠(DibasicSodiumPhosphate,Na2HPO4.7H2O,Amresco,美国)；氯化钠(Sodiumchloride,NaCl,北京化工,中国)；氯化钾(Potassiumchloride,KCl,北京化工,中国)；六水合氯化镁(SixhydratedMagnesiumchloride,MgCl2·6H2O,北京化工,中国)；8 川北医学院硕士学位论文二水合氯化钙(Calciumchloridedihydrate,CaCl2·2H2O,北京化工,中国)；4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES,Amresco,美国)；氢氧化钠(Sodiumhydroxide,NaOH,北京化工,中国)；水合氯醛(Chloralhydrate,C2H3Cl3O2,上海沪试,中国)；Bodipy493/503(invitrogen，美国)；苏丹Ⅲ染液：苏丹Ⅲ染液试剂盒(Leagene),内含苏丹Ⅲ染色液，苏丹Ⅲ分化液，Mayer苏木素染色液。(北京雷根生物技术有限公司,中国)；苏丹Ⅳ染液：苏丹Ⅳ染液试剂盒(Leagene),内含苏丹Ⅳ染色液，苏丹Ⅳ分化液。(北京雷根生物技术有限公司,中国)；四氧化锇(由孙建和主任技师赠送)；油红O(北京雷根生物技术有限公司,中国)；NucBluelivecellstain(LifeTechnologies，美国)；DAPI(C1002,碧云天，中国)；0.25%胰酶(上海史瑞可生物科技有限公司,中国)；酒精(北京化工,中国)；OCT凝胶(Leica，德国)；蔗糖(北京化工,中国)；多聚甲醛(Paraformaldehyde,PFD,北京化工,中国)；乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA,北京化工,中国)；二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide,DMSO，碧云天，中国)1.1.3.实验仪器及耗材：9 川北医学院硕士学位论文体视解剖显微镜(NikonSMZ-1,日本)；激光共聚焦显微镜(ZissLSM780,德国)；多功能去离子水制备仪器(Millpore,美国)；快速冰点渗透压测试仪（FiskeAssociates110,美国）；PH测试计（SartoriusAGPB-10,德国）；蠕动泵驱动器（BT100-2J/D6-2,中国北京）；冰冻切片机（LeicaCM1900,德国）；DeltaVision高分辨活细胞成像系统（GEHealthcare,瑞典）；分析天平（SartoriusA120S,德国）；电子天平仪器（CP4102，OHAUS,美国）加热磁力搅拌器（IT-08B15，中国上海）断头器1台(由上海继德教学实验器械厂提供)；咬骨剪1把(由上海继德教学实验器械厂提供)；电脑摄像系统(由莱卡公司提供)；显微解剖镊(由中镜科仪提供)；冰箱(海尔，中国)。1.2.实验方法：1.2.1.配液：1.2.1.1.配制缓冲液：(1)0.1M磷酸盐缓冲液(PhosphateBufferedSaline，PBS)：用分析天平分别秤取2.2796g磷酸二氢钠(sodiumdihydrogenphosphate，NaH2PO4)和21.7137g磷酸氢二钠(DibasicSodiumPhosphate，Na2HPO4.7H2O)；加去离子水至900ml；搅拌溶解；去离子水定容至1000ml，配成0.1mol/L10 川北医学院硕士学位论文的PBS，4℃密封保存。(2)0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)：量取0.1MPBS母液100ml；加入8.5g氯化钠(Sodiumchloride，NaCl)；加去离子水至800ml；搅拌混匀；去离子水定容至1000ml，配成0.01mol/L的PBS，4℃密封保存。(3)0.24M磷酸盐缓冲液(PBS)：用分析天平分别秤取3.48g磷酸二氢钠(sodiumdihydrogenphosphate，NaH2PO4)和0.356g磷酸氢二钠(DibasicSodiumPhosphate，Na2HPO4.7H2O)；加去离子水至45ml；搅拌溶解；去离子水定容至50ml，配成0.24mol/L的PBS，4℃密封保存。1.2.1.2.配制固定液：(1)4%的多聚甲醛(ParaformalclehydePFD)固定液：实验前一天用分析天平秤取40g多聚甲醛(ParaformalclehydePFD)粉末；加入到900ml0.1mol/L的PBS；加入4g氢氧化钠(Sodiumhydroxide，NaOH)；用加热磁力搅拌器IT-08B15调制稳定至40℃，搅拌溶解；完全溶解后用0.1mol/L的NaOH调节PH至7.4；配成4%的多聚甲醛固定液，4℃密封保存。(2)2.5%的戊二醛固定液：量取0.1MPBS母液90ml；加入25%的戊二醛固原液10ml；摇晃混匀；配成2.5%的戊二醛固定液，4℃密封保存。1.2.1.3配制细胞外液(Normalextracellularsolution，NES)：表1-1细胞外液配方试剂摩尔量(mmol)质量(mg)NaCl1428310KCl5.37400MgCl2·6H2O1.47299CaCl2·2H2O2294HEPES10238011 川北医学院硕士学位论文用分析天平按表1-1精确称量各试剂；加入900ml去离子水中，室温下搅拌溶解；用1mol/L的NaOH调节PH至7.2；去离子水定容至1000ml；用右旋葡萄糖调节渗透压至300mOsm；配成人工细胞外液，4℃密封保存[9]。1.2.1.4.配制麻醉药：用分析天平秤取10g水合氯醛(chloralhydrate，CCI3CH(OH)2)；完全溶于90ml灭菌去离子水；定容至100ml；常温密封保存。配制过程无菌操作。1.2.1.5.配制脱钙液：配制10%的乙二胺四乙酸二钠脱钙液（EDTA）：用分析天平秤取50g乙二胺四乙酸二钠脱钙液（EDTA）；完全溶于400ml灭菌去离子水；加入1mol/L的NaOH溶液100ml；调定PH至7.4，常温密封保存。1.2.1.6.配制染液：(1)配制Bodipy493/503染液：分析天平称量Bodipy493/503粉末1mg；溶于1ml二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide,DMSO)；分装为10μl每份的离心管中；避光密封-20℃保存。整个过程均在避光下操作。(2)配制锇酸染液：锇酸有毒，配制锇酸前穿好防毒衣，佩戴防毒口罩。在避光通风橱中用分析天平称量四氧化锇粉末1g；溶于50ml去离子水中；配成2%的四氧化锇贮存液；避光密封-20℃保存。使用前3小时内配制。(3)细胞核染料：NucBluelivecellstain（LifeTechnologies），每1mlNES加2滴NucBlue。1.2.2.制作标本：12 川北医学院硕士学位论文1.2.2.1.分离豚鼠耳蜗：取正常健康Hartley豚鼠1只，称重；按体重每100g腹腔注射10%的水合氯醛0.4ml麻醉；根据豚鼠肌张力的消失确定麻醉成功后，用断头器迅速断头；用咬骨剪剪去残余颈椎，充分暴露枕骨大孔后，沿头部正中线从后向前剪开头部皮肤和分离皮下组织至双眼眶后缘连线，暴露双侧外耳门及听泡位置；用咬骨剪沿头颅失状缝从枕骨大孔至冠状缝剪开颅骨，向两边掰开头颅骨，剔除脑组织；从外耳门向内钝性剥离豚鼠双侧听泡；咬骨剪剪开听泡；分离耳蜗。断头后至完整分离耳蜗均在2分钟之内完成。1.2.2.2.固定豚鼠耳蜗：迅速将分离好的豚鼠耳蜗放入4%的PFD溶液中；于体视解剖显微下，用细针在耳蜗顶端开一小孔；刺破圆窗膜和卵圆窗膜；用2ml的塑料滴管从耳蜗顶端开孔处缓慢匀速的灌入4%的PFD溶液；灌注至圆窗和卵圆窗流出清亮的4%的PFD溶液；4℃保存过夜。1.2.2.3.中性脱钙豚鼠耳蜗：取充分固定的豚鼠耳蜗，置于10%的EDTA中性脱钙液，室温下脱钙；每日更换10%的EDTA脱钙液；用细针刺探前庭区域骨质，确定脱钙完全，一般脱钙7日可脱钙完全。脱钙完全的耳蜗应立即进行下一步实验，可于4℃的0.01mol/L的PBS中短时保存，不宜长久保存。1.2.2.4.豚鼠耳蜗冰冻切片：取充分固定、脱钙后的豚鼠耳蜗，用0.01mol/L的PBS冲洗3遍；负压抽气15分钟；分别置于10%的蔗糖、20%的蔗糖、30%的蔗糖中梯度脱水6小时；OCT浸胶4℃过夜；显微镜下摆放标本位置，-80℃凝固；13 川北医学院硕士学位论文修切冰冻标本块，使蜗轴与切片方向平行；10μm的厚度切片。1.2.2.5.剥离豚鼠耳蜗基底膜：取固定充分的豚鼠耳蜗，置于0.01mol/L的PBS中；于体视解剖显微下，用细针于耳蜗顶端开一小孔处蜗壳骨质与螺旋韧带之间的间隙钝性分离二者，从上到下逐转向外剥离游离的蜗壳骨质；用显微解剖镊从顶转向外下撕扯螺旋韧带至勾端；用显微解剖镊从蜗顶沿基底膜向下撕掉整个几乎透明的盖膜；用显微解剖镊从蜗顶向下，逐段撕掉卷曲的前庭膜；用显微解剖镊从蜗顶向下，于基底膜底僵孔的位置，沿基底膜的走行向上抬离基底膜。1.2.2.6.分离豚鼠内耳Corti’s带：取新鲜的豚鼠耳蜗，置于4℃的NES中；于体视解剖显微下，用细针于耳蜗顶端开一小孔处蜗壳骨质与螺旋韧带之间的间隙钝性分离二者，从上到下逐转向外剥离游离的蜗壳骨质；用显微解剖镊从顶转向外下撕扯螺旋韧带；于离断蜗轴；用细钩针或注射器针，从底向顶沿基地膜走行剥离Corti’s器。以勾端为起点把豚鼠耳蜗Corti’s器分为第1、2、3、4转(如图1-1)。14 川北医学院硕士学位论文图1-1.豚鼠耳蜗Corti’s器分四段。注：右：豚鼠耳蜗离断蜗轴后的图像，粉红线上的3个黑点分别示各转基底膜的分界点；左：分离后的Corti’s器从下到上分别为第1转、第2转、第3转、第4转Corti’s器。1.2.2.7.分离豚鼠内耳细胞：取新鲜的豚鼠耳蜗，置于4℃的NES中；于体视解剖显微下，用细针于耳蜗顶端开一小孔处蜗壳骨质与螺旋韧带之间的间隙钝性分离二者，从上到下逐转向外剥离游离的蜗壳骨质；用显微解剖镊从顶转向外下撕扯螺旋韧带；螺旋韧带会从基底膜外侧端断开如(图1-2.A)；用100μl的微量注射器把剥离的Corti’s器移至10μl0.25%的胰酶中，消化吹打25次；转移至带10mm小孔的35mm培养皿；用200μlNES稀释含有细胞的胰酶液，终止消化；常温静置10分钟。可得到单离的Hensen细胞如(图1-2.B)。15 川北医学院硕士学位论文图1-2耳蜗Corti’s器及Hensen细胞A.耳蜗Corti’s器。H:Hensen细胞;IHC:内毛细胞;OHC:外毛细胞;RM:前庭膜;SG:螺旋神经节;TM:盖膜;黄色虚线示意去除螺旋韧带及血管纹后基底膜断裂位置；蓝色箭头示意针尖方向及位置。B.光镜下单个豚鼠Hensen细胞。Dapi标记细胞核呈蓝色。→示高折光透亮颗粒。标尺为15μm。1.2.3.标本染色：1.2.3.1.苏丹Ⅲ染色：NES作为灌洗液，用微量蠕动泵缓慢灌洗消化分离的内耳细胞3遍，时间约3分钟；用100μl的微量移液枪缓慢加入200μlMayer苏木素染色液，浸染细胞核5分钟，NES灌洗3分钟；再加入苏丹Ⅲ分化液(A液)分化5秒，NES灌洗3分钟；再用70%的酒精灌洗5秒，之后加入苏丹Ⅲ染色液(B液)100μl，充分浸染内耳细胞1h；然后再用70%的酒精灌洗5秒；NES灌洗30分钟；加入甘油200μl封片。以上每次加液步骤均应一侧加液同时对侧用微量蠕动泵吸去培养孔中原有的液体。1.2.3.2.苏丹Ⅳ染色：NES作为灌洗液，用微量蠕动泵缓慢灌洗消化分离的内耳细胞3遍，时间约3分钟；用100μl的微量移液枪缓慢加入200μlMayer苏木素染色液，浸染细胞核5分钟，NES灌洗3分钟；再加入苏丹Ⅳ分化液(A液)分化5秒，NES灌洗3分钟；再用70%的酒精灌洗5秒，之后加入苏丹16 川北医学院硕士学位论文Ⅳ染色液(B液)100μl，充分浸染内耳细胞1h；然后再用70%的酒精灌洗5秒；NES灌洗30分钟；加入甘油200μl封片。每次加液均用100μl的微量移液枪在一侧缓慢加入同时对侧用微量蠕动泵吸去培养孔中原有的液体。1.2.3.3.油红O染色：NES作为灌洗液，用微量蠕动泵缓慢灌洗消化分离的内耳细胞3遍，时间约3分钟；再加入过滤的油红O染色(5%的油红O原液与去离子水按3:2稀释，滤纸过滤)，浸染15分钟，NES灌洗3分钟；再用70%的酒精分化10秒；NES灌洗30分钟；加入甘油200μl封片。每次加液均用100μl的微量移液枪在一侧缓慢加入同时对侧用微量蠕动泵吸去培养孔中原有的液体。1.2.3.4.锇酸染色：用2.5%的戊二醛溶液灌流固定豚鼠耳蜗6小时；0.1mol/L的PBS冲洗2.5%戊二醛固定后的豚鼠耳蜗，3遍约10分钟；同时用2%的四氧化锇贮存液与0.24mol/L的PBS按1：1的比例配成1%的锇酸染液；用1%的锇酸再次灌流染色豚鼠耳蜗2小时；0.1mol/L的PBS冲洗1%的锇酸再次灌流染色后的豚鼠耳蜗，5遍约15分钟。1.2.3.5.Bodipy493/503基底膜染色：用0.01mol/L的PBS冲洗剥离的基底膜3遍(制备过程详见2.2.5.)；Bodipy493/503工作液(1:200)浸染1小时,0.01mol/L的PBS灌洗3分钟×3次；200μlDAPI染核15min；0.01mol/L的PBS灌洗3min×3次。以勾端为起点把基底膜分为第1、2、3、4转同Corti’s器的分法。分别用甘油封片，共聚焦显微镜下观察结果并拍照。17 川北医学院硕士学位论文1.2.3.6.Bodipy493/503活细胞染色：以NES作为灌洗液，用微量蠕动泵缓慢灌洗消化分离的内耳细胞3分钟×3次；用100μl的微量移液枪缓慢加入Bodipy493/503工作液(1:200)100μl×5次，浸染内耳细胞30分钟，NES灌洗3分钟×3次，NucBlue浸染细胞核15分钟，NES灌洗3分钟×3次。每次加液均用100μl的微量移液枪在一侧缓慢加入同时对侧用微量蠕动泵吸去培养孔中原有的液体。1.2.3.7.Bodipy493/503细胞染色：以NES作为灌洗液，用微量蠕动泵缓慢灌洗消化分离的内耳细胞3分钟×3次；4%的多聚甲醛固定2小时；0.01MPBS灌洗3分钟×3次；用100μl的微量移液枪缓慢加入Bodipy493/503工作液(1:200)100μl×5次，浸染内耳细胞30分钟，NES灌洗3分钟×3次，DAPI浸染细胞核15分钟，NES灌洗3分钟×3次；封片。每次加液均用100μl的微量移液枪在一侧缓慢加入同时对侧用微量蠕动泵吸去培养孔中原有的液体。1.2.4.结果观察：采用LSM780激光共聚焦显微镜(Zeiss,美国)对豚鼠耳蜗基底膜铺片和固定后的单离耳蜗细胞进行激光扫描，激发泼波长用488nm(Bodipy493/503)和405nm(Dapi)，Z轴步进选择0.5μm，针孔径为80μm，根据基底膜的厚度分层扫描约50-100次。采用DeltaVision高分辨率活细胞成像系统(GEHeathcare,瑞典)对活体单离的耳蜗细胞进行激光扫描，激发光选用DAPI(NucBlue)和FITC(Bodipy493/503)，同时采集明场(DIC)图像。18 川北医学院硕士学位论文2结果2.1三种经典染色剂染色结果：豚鼠耳蜗中脂滴可被油红O染色呈宝石红,苏丹Ⅲ成橘黄色,苏丹Ⅳ染色呈猩红色豚鼠Hensen细胞经油红O染色后可以清晰的观察到胞质中存在宝石红颗粒(图1-3.A)。豚鼠Hensen细胞条带被苏丹Ⅲ染色后可见橘黄色染色颗粒条带状分布于Hensen细胞区域(图1-3.B)。也可被同为亲脂性，苏丹Ⅳ染色呈红色(图1-3.C)。图1-3.豚鼠耳蜗Corti’s器条带、耳蜗、Hensen细胞条带脂肪酸染料被染色注：A.豚鼠Hensen细胞中脂滴被油红O染色呈宝石红。标尺为25μm。B.苏丹Ⅲ染色豚鼠耳蜗Hensen细胞条带。用苏丹Ⅲ染色豚鼠耳蜗Hensen细胞条带，被苏丹Ⅲ染色为橘黄色，细胞核被苏木素染色为蓝色。大图为10×63，小图为局部放大示意图，标尺为5μm。C.豚鼠Hensen细胞中脂滴被苏丹Ⅳ染色呈红色。标尺为10μm。2.2锇酸染色结果：豚鼠耳蜗Hensen细胞被1%锇酸染色后细胞内可见黑色颗粒豚鼠耳蜗经锇酸染色，于体视镜下观察，大量黑色颗粒分布于外毛细胞外侧——Hensen细胞区域(图1-4.A,B)。19 川北医学院硕士学位论文图1-4.豚鼠耳蜗耳蜗、基底膜被锇酸和Bodipy料色注：A.豚鼠耳蜗锇酸染色后Corti’s器边缘可见黑色颗粒。锇酸与脂滴结合成脂肪酸-锇，使脂滴在光镜下呈为黑色颗粒，豚鼠耳蜗锇酸染色后基底膜外侧Hensn细胞可见黑色颗粒。标尺为2mm。B.豚鼠耳蜗第3转基底膜锇酸染色后局部放大图，标尺为100μm。C.Dapi及Bodipy标记豚鼠耳蜗Corti’s器条带。大图为10×10倍整体观察一段Corti’s器中脂滴的染色及分布，小图为10×20倍局部观察脂滴染色及分布，Dapi标记细胞核为蓝色，Bodipy标记脂滴为绿色。标尺为25μm。2.3Bodipy493/503染色结果：Bodipy493/503染色Hensen细胞中的脂滴呈绿色固定后的Corti’s器条带，运用荧光分子探针Bodipy493/503标记，采用LSM780激光共聚焦显微镜(Zeiss,美国)激光扫描，激发泼波长用488nm(Bodipy493/503)和405nm(Dapi)。Corti’s器条带中Hensen细胞区域可见绿色颗粒(图1-4.C)。固定后的Hensen细胞，运用荧光分子探针Bodipy493/503标记，采用LSM780激光共聚焦显微镜(Zeiss,美国)激光扫描，激发波波长用488nm(Bodipy493/503)和405nm(Dapi)。Hensen细胞在光镜下的透亮区域(图1-5.A)与Bodipy493/503标记的绿色荧光区域高度一致(图1-5.B)。20 川北医学院硕士学位论文图1-5.固定后的豚鼠耳蜗Hensen细胞中高折光性颗粒被Bodipy标记注：Dapi标记细胞核为蓝色，Bodipy标记脂滴为绿色。标尺为25μm。活体单离的Hensen细胞于光镜下观察，细胞无肿胀,呈圆形或卵圆形，细胞膜完整，边界清楚，折光性好。细胞质均匀、无明显的布朗运动，细胞质中清晰可见高折光性透明颗粒。细胞核形态完整(图1-6.a)。单离的有活性的Hensen细胞Bodipy593/503荧光染色后，高分辨率活细胞成像系统(GEHC,瑞典)对活体单离的耳蜗细胞进行激光扫描，激发波选用DAPI(NucBlue)和FITC(Bodipy493/503)，同时采集明场(DIC)图像21 川北医学院硕士学位论文拍照下可以清晰的见到Hensen细胞中分布绿色圆形颗粒(图1-6.b)。NucBlue染色细胞核呈蓝色(图1-6.c)。可清晰的分辨脂滴的大小和多少，并能和明场(DIC)下的高折光性透明颗粒相重叠(图1-6.d)。图1-6.活体豚鼠耳蜗Hensen细胞中高折光性颗粒被Bodipy标记。注：DIC：明场拍摄。单离的Hensen细胞于光镜下可见高亮的透明颗粒(a,绿色△示脂滴)；Bodipy593/503染色Hensen细胞可见绿色颗粒(b)；Dapi染色Hensen细胞可见细胞核呈蓝色(c)；图像叠加处理后可见光镜下的高亮颗粒与Bodipy593/503染色的绿色颗粒完全重合。22 川北医学院硕士学位论文3讨论脂质包括脂肪和类脂。根据脂肪的性质可分为中性脂肪、胆固醇、脂肪酸、髓磷脂及其他类脂质[10]。脂滴是真核细胞储存中性脂的重要细胞器，当细胞需要能量的时候，其中的脂质被氧化释放能量[10]。既往，脂质的鉴定方法主要分为物理学方法和化学方法。物理方法主要利用有些脂质在紫外线照射下可发荧光和有些脂质有偏振光特性，如维生素A在紫外线照射下发出绿色荧光，胆固醇在偏振光显微镜观察到双折光现象；此法敏感性低，已很少使用。化学方法主要是利用相似相溶的原理。脂溶性的染料常用的有苏丹Ⅲ、苏丹Ⅳ、苏丹黑、油红O；其中苏丹黑没有β-羟基，虽然可以使中性脂肪较好的着色，但也能使非脂类物质着色，故本实验未选用[11-13]。近年来，对脂质的鉴定又有了新的进展，主要分为重金属鉴定法和分支探针法，如锇酸染色法，Bodipy荧光标记法[14-15]。锇酸染色的原理是四氧化锇与脂质形成螯合物，从而使脂质呈黑色[14,16]。Bodipy荧光分子探针是一类特异性高、光稳定性好的新型荧光染料，其中Bodipy493/503对中性脂肪特异性染色呈绿色[15,17-18]。1863年VictorHensen首次描述了豚鼠耳蜗Hensen细胞中存在大量透明颗粒，随后的研究发现这些透明颗粒为脂肪颗粒[1]。1980年MiguelA虽通过透射电镜、扫描电镜、红油O、苏丹Ⅲ染色等方法观察了豚鼠耳蜗Hensen细胞并定义为脂滴类物质，同时指出了豚鼠耳蜗顶转、第三转及底转的Hensen细胞中脂滴的分布情况[3]。不足的是既往的研究通过固定组织染色，普通光镜或电镜观察，并不能直接证明活体Hensen细胞中的透明物质是脂滴。23 川北医学院硕士学位论文本次研究通过五种染色方法，均证明豚鼠耳蜗Hensen细胞细胞中含有脂滴。以活体单离的Hensen细胞进行荧光染色，在共聚焦显微镜下可以观察到细胞内的透明颗粒与绿色荧光颗粒完全重合，证明了Hensen细胞中的透明物质即脂滴。4结论4.1.五种染色方法均验证了豚鼠耳蜗存在脂滴。4.2.证明了豚鼠耳蜗Hensen细胞的透明物质即是脂滴。24 川北医学院硕士学位论文第二部分豚鼠耳蜗中脂滴的分布研究初探前言经过上一阶段研究我们虽然知道Hensen细胞中含有脂滴，但其分布情况目前尚不完全清楚。1980年MiguelA报道了豚鼠耳蜗顶转和第3转的Hensen细胞中含有大量脂滴，底转无脂滴的分布情况；但未描述第2转中脂滴的分布情况[3]。豚鼠耳蜗深埋颞骨骨质内，组织细胞取材较困难，组织细胞含量少。这就导致了既往对豚鼠耳蜗脂滴的研究，大多停留在定性描述上，少有定量数据。但为了研究豚鼠耳蜗中脂滴的功能，就需要对其进行定量的、客观的描述[4,16]。本阶段研究，拟用1%的锇酸和Bodipy493/503对豚鼠耳蜗脂滴进行染色，观察脂滴在豚鼠耳蜗中的分布情况。用激光共聚焦扫描+三维重建的方法研究豚鼠耳蜗中脂滴分布特点及病理生理意义。1材料与方法1.1.试验动物：Hartley豚鼠：皮毛纯白色、光泽，无脱毛、皮肤病。双侧耳廓无充血，耳廓反射灵敏；电耳镜检查，双侧外耳道通畅，无积脓、积液，鼓膜无红肿充血。性别：雌雄不限。体重：300±25g。年龄：13±1周。数量：10只。以上动物均由军事医学科学院实验动物中心(北京)提供，均通过军事医学研究伦理委员会的批准。1.2.实验试剂及配液同第一部分。25 川北医学院硕士学位论文1.3.主要工具及设备：Imaris7.0(Bitplane公司，瑞士）图像分析软件；余器械设备同第一部分。1.4.实验取材,染色,结果观察同第一部分。1.5.三维重建分析脂滴含量：Maris7.0(Bitplane公司，瑞士）图像分析软件对共聚焦成像进行三维重建，选择标记脂滴的488nm或FITC通道，用spots模块手工选择一个居间偏小的一个脂滴作为标准，以刚好把该脂滴选定设为重建范围，然后用计算机自动重建所有脂滴的区域范围。选定结束后，对每个脂滴的直径、体积、三维坐标等统计参数进行计算。1.6.数据统计：使用统计软件SPSS17.0对数据进行统计学处理，以P＜0.05为差异有统计学意义。数据以平均数±标准差的形式表示。2结果2.1.豚鼠耳蜗脂滴的分布特点：2.1.1.脂滴在全耳蜗中的分布特点：脂滴从蜗底到蜗顶逐渐增多、增大全耳蜗基底膜用锇酸染色。锇酸与脂肪酸结合形成脂肪酸-锇，呈黑色。在体视显微镜下逐层聚焦，豚鼠耳蜗第1转转未见明显的脂滴(图2-1.A)，第2转(图2-1.B)开始出现稀疏的小脂滴，逐渐增多第3转(图2-1.B）可见大量小脂滴粒，第4转(图2-1.C)可明显看见大量脂滴位于基底膜Hensen细胞区域。26 川北医学院硕士学位论文图2-1.豚鼠耳蜗锇酸染色后。注：A：豚鼠耳第1转(1)基底膜上未观察到脂滴(黑色颗粒）。B:豚鼠耳蜗第2转(2)中可见少量细小的脂滴(黑色颗粒）；豚鼠耳蜗第3转(3)中可见大量细小的脂滴(黑色颗粒）；C：豚鼠耳蜗第4转(4)中可见大量较大的脂滴(黑色颗粒）。小图为放大图。2.1.2脂滴在豚鼠耳蜗冰冻切片上的分布情况：脂滴主要分布于Corti’s器耳蜗冰冻切片组织，用Bodipy493/503染色后显微镜下观察，在螺旋神经节、螺旋神经、Corti’s器处染色明显，而在血管纹处淡染。众所周知螺旋神经节和螺旋神经周围含有大量的，故其周围被Bodipy493/503染色。Corti’s器的外侧可见染色呈圆形和类圆形的物质，这可以得出豚鼠耳蜗中的Corti’s器中存在脂滴(图2-2)。27 川北医学院硕士学位论文图2-2.豚鼠耳蜗中的脂滴存在于Corti's器。注：用Bodipy493/503染色豚鼠耳蜗冰冻切片组织，螺旋神经节、螺旋神经、Corti's器均被染成绿色；仅Corti's器呈圆形和类圆形绿染。螺旋神经节和螺旋神经的绿染为其周围包裹的神经鞘磷脂。Corti's器中的绿染为脂滴。标尺为100μm。2.1.3脂滴在豚鼠耳蜗Corti’s器上的分布情况：脂滴主要分布于Hensen细胞豚鼠耳蜗中的Corti’s器中含有多种细胞，主要分为含有纤毛的的内、外毛细胞和不含纤毛的支持细胞，支持细胞主要包括Hensen细胞、Deiter细胞。单离豚鼠内耳细胞，并对其染色，观察发现，内毛细胞、外毛细胞Hensen细胞、Deiter细胞中均未染色标记，仅Hensen细胞中有圆形的绿色标记。故豚鼠耳蜗中的脂滴主要分布于Hensen细胞(图2-3)。28 川北医学院硕士学位论文图2-3.豚鼠内耳细胞中仅Hensen细胞中有脂滴注：用Dapi和Bodipy493/503双标豚鼠内耳细胞，包括：内毛细胞(A），外毛细胞(B),Hensen细胞(C)，Deiter细胞(D,E)及图F中红色箭头示外沟细胞，黄色箭头示外毛细胞，三角形示Hensen细胞。仅Hensen细胞被蓝色和绿色双重标记，其余细胞均为被Bodipy特异性标记。标尺为25μm。2.1.4脂滴在Hensen细胞上的分布特点：脂滴在不同的Hensen细胞中大小和数量不尽相同。豚鼠耳蜗中不同区域Hensen细胞中的脂滴形态及数量并不完全相同。总体而言越靠近顶部Hensen细胞中脂滴体积大、数量较多(如图2-4)。29 川北医学院硕士学位论文图2-4.不同部位的Hensen细胞中的脂滴形态及数量不完全相同。注：Dapi标记细胞核为蓝色，Bodipy标记脂滴为绿色。标尺为25μm。2.1.5.脂滴在基底膜铺片上的分布特点：耳蜗基底膜用Bodipy493/503染色铺片。Bodipy493/503特异性标记脂滴，呈绿色。在体视显微镜下逐层聚焦，豚鼠耳蜗第1转转未见明显脂滴(未展示图像)；第2转可以一个脂滴突然出现的“转折点”，且逐渐增多；第3、4转可明显看见大量脂滴位于基底膜Hensen细胞区域(图2-5)。无论是锇酸染色还是Bodipy493/503荧光染色均可见脂滴在豚鼠耳蜗基底膜上从第2转至第4转逐渐增多、增大，且第1转均为见脂滴。荧光染色可观察到脂滴在第2转有个突然出现的“转折点”。30 川北医学院硕士学位论文图2-5.豚鼠耳蜗中脂滴在基底膜上由底到顶逐渐增多、增大。注：上排为耳蜗基底膜第2，3，4转铺片图；下排为各转局部放大图像。可见脂滴在第2转至第4转基底膜上逐渐增多、增大。2.2.三维重建定量分析结果：2.2.1.激光共聚焦显微镜扫描基底膜三维重建后可清晰的分辨脂滴的大小及三维空间位置耳蜗基底膜铺片荧光染色，激光共聚焦显微镜扫描(ZissLSM780,美国)，激发波波长用488nm(Bodipy493/503)和405nm(Dapi)，Z轴步进选择0.5μm，针孔径为80μm，63倍油镜，根据基底膜的厚度分层扫描约50~100次。三维重建后可清晰的分辨脂滴的大小和空间位置(如图2-6)。光共聚显微镜拍摄图片用Imaris7.0软件分析处理后如(图2-6.d)。31 川北医学院硕士学位论文图2-6.脂滴在基底膜细胞中的分布和结构清晰。注：Bodipy593/503和Dapi染色铺片的耳蜗基底膜外侧区域可见绿色颗粒(a)；细胞核呈蓝色(b)；图像叠加处理后可见绿色颗粒分主要布于外毛细胞的外侧Hensen细胞区域(c)；运用Imaris7.0软件中的Spots模块处理后得到脂滴在基底膜中的模拟图像(d)。2.2.2.激光共聚焦显微镜扫描Hensen细胞三维重建后可清晰的分辨脂滴的大小及三维空间位置固定后的单离的Hensen细胞荧光染色，激光共聚焦显微镜扫描(ZissLSM780,美国)，激发波波长用488nm(Bodipy493/503)和405nm(Dapi)，Z轴步进选择0.5μm，针孔径为80μm，63倍油镜，根据细胞的厚度分层扫32 川北医学院硕士学位论文描约20~30次。共聚焦显微镜拍摄图像运用Imaris7.0图像处理软件可以360°全方位的观察Hensen细胞中的脂滴分布情况，并如实的记录。避免了人工计数时常出现的多计或漏计。对随机选取的1个Hensen细胞对胞内脂滴统计分析。可以清晰的、全方位的观察到该细胞中的脂滴的形态分布(图2-7)。可以清楚的观测到该Hensen细胞中含有10个脂滴，最大为13.16um3，最小2.72um3(表2-1)图2-7.Hensen细胞中的脂滴360°全方位的清晰成像。注：以Y轴为轴心，以45°为转角360°的观察记录单个Hensen细胞中的脂滴的情况。33 川北医学院硕士学位论文表1-2.单个Hensen细胞中脂滴体积及相对位置IDValueUnitDiameterPositionXPositionYPositionZUnit12.72um^31.7358.3558.503.36um213.16um^32.9360.8656.265.50um34.05um^31.9861.6958.337.59um44.22um^32.0165.3055.154.78um52.81um^31.7564.2160.1012.60um63.73um^31.9258.4568.341.04um74.18um^32.0060.0569.601.94um85.29um^32.1660.7968.496.55um96.29um^32.2950.8470.108.11um104.98um^32.1262.7868.204.48um2.3.3.定量分析表明豚鼠耳蜗中各转脂滴的大小及数量豚鼠耳蜗第1转中无脂滴，第2转中脂滴大小为:8.84±5.24μm3，第3转中脂滴大小为:23.38±8.31μm3，第4转中脂滴大小为:64.71±10.33μm3(图2-8)。除去第1转，脂滴在耳蜗各转之间的差异有统计学意义(P<0.001)。第2转脂滴体积主要分布在1~10μm3；第3转脂滴体积也主要分布在1~10μm3，同时10~100μm3的脂滴比例较第2转明显增加；第4转脂滴体积则主要分布在10~100μm3(图2-9)。34 川北医学院硕士学位论文图2-8.豚鼠耳蜗各转脂滴大小及数量。注：X轴代表耳蜗各转，Y轴代表脂滴的平均体积（μm3）n代表各转中脂滴的数量。豚鼠耳蜗第1转中无脂滴，第2转中脂滴大小为:8.84±5.24μm3，第3转中脂滴大小为:23.38±8.31μm3，第4转中脂滴大小为:64.71±10.33μm3。注：turn2,turn3,turn4之间两两比较有显著的统计学差异P<0.00135 川北医学院硕士学位论文图2-9.各转脂滴大小比例图。注：第2转脂滴体积主要分布在1~10μm3；第3转脂滴体积也主要分布在1~10μm3，同时10~100μm3的脂滴比例较第2转明显增加；第4转脂滴体积则主要分布在10~100μm3。注：第4转图注中“1-10：719”，“：”前的数字代表脂滴的大小，“：”后的数字代表脂滴的具体数量。3讨论我们虽然知道豚鼠耳蜗中含有脂滴，但其分布情况目前尚不完全清楚。1980年MiguelA报道了豚鼠耳蜗顶转和第3转的Hensen细胞中含有大量脂滴，底转无脂滴的分布情况；但未描述第2转中脂滴的分布情况[3]。本研究显示脂滴在豚鼠耳蜗基底膜第4转和第3转与既往研究报道相同，从底向顶端方向逐渐增多。本研究还观察到豚鼠耳蜗基地第2转Hensen细胞中脂滴存在一个突然出现的“转折点”。该“转折点”有可能是因为光学显微镜观察的最小分辨率的限制造成的“假象”。光学显微镜的最小分辨率约200nm，而目前报道的最小脂滴约15nm[19-22]。下一步实验可以用电子显微镜(电子显微镜分辨率可达0.2nm)观察是否有同样的“转折点”，在基地膜上是否与光学显微镜的“转折点”在同一位置[23]。如果有且在同一位置说明该点一下无脂滴存在，如果电镜下的“转折点”向底端移位说明该“转折点”为“假象”。目前本研及既往研究均未在豚鼠耳蜗底转36 川北医学院硕士学位论文(第1转)Hensen细胞中观察到脂滴。豚鼠耳蜗底转Hensen细胞的脂滴情况推测有两种可能：一种可能是有脂滴但限于实验条件，未被观测到；另一种可能是不含有脂滴。因为在第2转中脂滴有一个突然出现的“转折点”现象，所以笔者认为第一种可能性较大。论证方法可用电子显微镜观察。推测电子显微镜观察结果有三种可能：1.第1转中可在电子显微镜下观察到脂滴；2.第1转中未观测到脂滴，但第2转中脂滴的“转折点”向下移；3.第1转中未观测到脂滴，但第2转中脂滴的“转折点”位置和光学显微镜一致。第1、2种情况均支持第1转中含有脂滴，且第2转中的“转折点”为“假象”。通过冰冻切片染色发现豚鼠耳蜗脂滴仅分布于Corti’s器。通过豚鼠耳蜗单离细胞，相同条件下染色观察内、外毛细胞及Deiter细胞均无脂滴，Hensen细胞中存在大量脂滴；提示脂滴在Corti’s器分布于Hensen细胞。对不同的Hensen细胞中的染色发现，在Hensen细胞中脂滴的分布不规律，不同Hensen细胞中脂滴大小和数目不完全相同。但所有的Hensen细胞中的脂滴均主要分布于细胞质。2013年Layerenza等按脂滴在细胞内的位置不同把脂滴可分为细胞胞质脂滴和细胞胞核脂滴；其中胞质脂滴主要由92%甘油三脂,5%的甾醇酯,2%的胆固醇和1%极性脂质组成；胞核脂滴主要由19%甘油三酯,39%的甾醇酯,27%的胆固醇,和15%的极性脂质组成[24]。豚鼠耳蜗中的脂滴属于胞质脂滴，其中应该还有大量的甘油三脂，可能参与能量代谢。观察了耳蜗中脂滴的定性分布，我们接下来将探讨其定量描述。传统脂质定量研究的方法有薄层色谱分析、气象色谱分析和高效液相色谱分析[25-29],这些定量研究的方法能够精确地统计脂质的含量及组成37 川北医学院硕士学位论文成分，但需要的样品量较大，且需要破坏细胞结构，不能准确的呈现细胞内脂滴的定量分布与形态结构。豚鼠耳蜗深埋颞骨骨质内，组织细胞取材较困难，细胞含量较少，豚鼠耳蜗中的Hensen细胞虽没有具体的统计研究，但可根据其外毛细胞的数量(约3万个)推测约10万个[30]。如此少量的组织细胞，难于应用色谱分析法。有研究报道，对少样本和单个完整的细胞可利用尼罗红或油红O特异性标记细胞内脂滴，用荧光显微镜观察,所得图像利用图像分析软件统计细胞内脂滴的总荧光强度间接反映脂滴的含量[31-37]。荧光显微镜观察方法能够较精确的反映脂滴的相对含量，但是该方法为平面研究，而脂滴在细胞内是三维立体分布，此方法存在统计不全的误差。最近也有大量研究表明利用激光共聚焦显微镜多层扫描后三维重建的方法也能对各种细胞器的体积、含量和分布进行精确的定量[38-42]。由于脂滴在细胞内分布的不均匀性，三维重建的方法有效的避免了既往的观察法中出现的投影重叠效应，能精确的反应脂滴在胞内的三维分布及具体含量。由于豚鼠耳蜗Hensen细胞大小、形态差异较大，其中的脂滴的大小和分布不均匀，所以三维重建法是目前定量研究Hensen细胞脂滴的较精准的研究方法[43]。本次研究以Bodipy493/503荧光染色Hensen细胞中的脂滴，用激光共聚焦显微镜（LSM780）扫描三维重建技术和Imaris7.0进行图像分析处理。初步获得了豚鼠耳蜗脂滴的体积及分布数据。研究数据豚鼠耳蜗基底膜第2转中脂滴大小为:8.84±5.24μm3，第3转中脂滴大小为:23.38±8.31μm3，第4转中脂滴大小为:64.71±10.33μm3。表明豚鼠耳蜗中脂滴大小主要分布于1~100μm3；属于小脂滴。有研究表明脂滴的大小与其功能密切相关。在前体脂肪细胞的研究中发现脂蛋白家族38 川北医学院硕士学位论文Perilipin(PLIN)蛋白中的PLIN4和PLIN5主要表达在小脂滴上，PLIN1和PLIN2表达在大脂滴上[44-45]。其中PLIN1主要调控脂质的合成，促进脂滴增多；PLIN5则主要参与细胞氧化供能调控甘油三酯的水解[46-47]。推测豚鼠耳蜗中的脂滴主要功能为氧化供能。4结论4.1.激光共聚焦扫描三维重建技术和Imaris图像分析处理，可较精准的获得了豚鼠耳蜗各部分脂滴的大小和分布。4.2.豚鼠耳蜗中的脂滴主要分布于耳蜗Corti’s器的Hensen细胞胞质中。4.3.脂滴在豚鼠耳蜗各转中体积分布在0.1~1000μm3，差异较大，主要集中于1~100μm3。从底转至顶转的分布特点是从无到由，从少到多，从小到大，且在第2转存在一个突然出现的“转折点”。39 川北医学院硕士学位论文第三部分豚鼠耳蜗中脂滴的病理生理意义研究初探前言在本实验前期研究中发现Hensen细胞中的脂滴主要分布于细胞质中，且大小、数目差异较大，说明Hensen细胞中的脂滴是一个动态变化的、活跃的亚细胞结构。豚鼠耳蜗中的脂滴为小的胞质脂滴，推测其推测豚鼠耳蜗中的脂滴主要功能为氧化供能[49]。噪声性耳聋是一种常见的感音神经性耳聋,噪声性耳聋动物模型也是一种研究感音神经性耳聋的常见的、简便的、成熟的动物模型[49-54]。本阶段实验拟从研究脂滴在噪声性听力损伤中的变化和给脂肪酸代谢激动剂和抑制剂后豚鼠听力的变化入手，从而说明豚鼠耳蜗中脂滴的病理生理意义[55-62]。1材料与方法1.1.材料：1.1.1.实验动物与分组：Hartley豚鼠15只，纯白毛赤目，外耳形态正常，皮下无脓肿、结节，外耳道清洁、通畅，鼓膜完整、标志清楚，耳廓反射灵敏，体重300±15g，雄性豚鼠，年龄：14±0.5周。无噪声接触史、药物应用史。15只Hartley豚鼠分为两组，一组为噪声暴露组，一组为药物干预组。噪声暴露组取同窝、同性别、相似体重的Hartley豚鼠3对，分两组，第1组给予噪声暴露，第2组不予噪声暴露；分别测量耳蜗脂滴的体积。药物干预组另选取Hartley豚鼠9只随机分为三组，每组3只6耳，进行噪声造模，分别于每次噪声前0.5小时给予腹腔注射A组：胰岛素(1u40 川北医学院硕士学位论文/kg)，B组：曲格列酮(10μmol/kg)，C组：DMSO(1ml/kg)。1.1.2.主要实验试剂：a)曲格列酮(Troglitazone,北京化工,中国)；b)胰岛素(Insulin,北京化工,中国)；余试剂参同第一部分。1.1.3.主要实验仪器及耗材：a)消声室、隔声屏蔽室(由中国人民解放军耳鼻咽喉研究所提供)；b)TDT测听系统Ⅲ(TDTⅢ，美国)；c)白噪声给声系统(由中国人民解放军耳鼻咽喉研究所提供)；d)声级计(HS5671,中国)；其余仪器及耗材参同第二部分。1.2.实验步骤：1.2.1.配液：参同第一部分的配液。1.2.2.测听：10%水合氯醛0.4ml/100g腹腔注射麻醉。动物完全麻醉后，记录电极置于两耳连线颅顶中央皮下，参考电极置于测试耳耳垂部皮下，接地电极置于对侧耳耳垂部皮下，电极之间电阻小于1KΩ。刺激声：使用美国TDT公司SigGenRP软件。短声(Click)按照国际标准设置，采用等效峰值声压的方法校准。正弦波时程0.1ms，无上升下降时间，采用Blackman非线性开窗，能量主要集中在3～4kHz。带通滤波300～3000Hz，陷波50Hz防止交流电干扰，观察窗为10ms，刺激速率为21次/s，叠加1024次。喇叭出声管口置于距离动物外耳道口1mm的处，开放声场给声。刺激声从80dBSPL开始，用升降法测听。以Ⅲ波消失为判断阈值的标准，41 川北医学院硕士学位论文至少重复3次以上，以可重复次数最多的值作为最终结果。1.2.3.噪声造模：用声级计测定白噪声声场中声音强度在120dBSPL的位置，固定豚鼠于该处，外耳道口对应声强定点。给予120dBSPL白噪声4小时/天，连续4天。1.2.4.制作标本：1.2.4.1.分离豚鼠耳蜗。1.2.4.2.固定豚鼠耳蜗。1.2.4.3.剥离豚鼠耳蜗基底膜。（具体步骤详见第一部分）1.2.5标本染色及结果观察参同第二部分。1.2.6脂滴体积计算参同第二部分。1.2.7统计学分析同第二部分。2结果2.1.噪声后脂滴数量较噪声前明显减小第1组豚鼠给予120dBSPL白噪声连续暴露4天后。同时取材其和第2组中对应豚鼠的耳蜗基底膜，进行染色观察。用第二部分的方法测量耳蜗各转脂滴的体积。结果显示噪声暴露后的豚鼠第2、3、4转基底膜上的脂滴的体积均较未噪声暴露的减少，P<0.001(图3-1)。42 川北医学院硕士学位论文图3-1.噪声前后耳蜗脂滴体积的比较。注：Noise：噪声暴露后耳蜗脂滴体积，Control：未受噪声暴露正常豚鼠耳蜗脂滴体积。2ndturn,3rdturn,4thturn分别代表第2,3,4转耳蜗基地膜；＊：P<0.001。2.2.脂肪酸代谢对听力的影响分别比较给予脂肪酸转运体的激动剂曲格列酮，脂肪酸转运体的抑制剂胰岛素，和给予DMSO为对照组的豚鼠噪声暴露前后的听力变化。噪声前豚鼠听力都正常约10dBSPL；噪声暴露后即刻胰岛素组听阈为65±4.4dBSPL，曲格列酮为54.2±1.5dBSPL，对照组为72.5±2.7dBSPL；噪声暴露后第三天胰岛素组听阈为28.3±2.6dBSPL，曲格列酮为14.2±2.0dBSPL，对照组为25.8±6.7dBSPL。其中胰岛素组与对照组听阈相差小于10dB，无实际意义；曲格列酮组噪声后和噪声后三天均比另外两组ABR阈值低，且大于10dB(图3-2~6)。43 川北医学院硕士学位论文图3-2.正常听力豚鼠噪声前ABR阈值在10dBSPL。44 川北医学院硕士学位论文图3-3.给予胰岛素腹腔注射的豚鼠(A组)噪声暴露后即刻ABR阈值在65dBSPL。图3-4.给予曲格列酮腹腔注射的豚鼠(B组)噪声暴露后即刻ABR阈值在55dBSPL。45 川北医学院硕士学位论文图3-5.给予DMSO腹腔注射的豚鼠(C组)噪声暴露后即刻ABR阈值在75dBSPL。46 川北医学院硕士学位论文图3-6.脂肪酸代谢被激动后噪声性听力损失减轻。注：Insulin：胰岛素组豚鼠给予胰岛素腹腔注射作为脂肪酸代谢抑制组；Troglitazone：曲格列酮组豚鼠给予曲格列酮腹腔注射作为脂肪酸代谢激动组；DMSO：对照组豚鼠给予DMSO腹腔注射做为阴性对照。噪声暴露后即刻和第3天，曲格列酮组豚鼠ABR阈值都较胰岛素组合对照组低。3讨论研究表明豚鼠耳蜗中脂滴可能的功能有：1.释放蛋白质膜联蛋白A1(ANXA1)参与内耳免疫反应;2.调节Hensen细胞的高度参与保护噪声性聋;3.为毛细胞氧化供能;4.释放至盖膜和网状板之间起润滑作用;5.改变基底膜质量进而调节基底膜的共振频率等[3,19,63-65]。ANXA1是抑制白细胞、巨噬细胞游走和外渗的信号蛋白，参与细胞死亡的调节信号和凋亡细胞的吞噬清除[66]。2009年Kalinec等研究表明Hensen细胞在糖皮质激素47 川北医学院硕士学位论文刺激时其脂滴首先释放ANXA1防止白细胞入侵螺旋器[63]。由于覆膜的膜(TM)的侧端与Hensen细胞相连,Hensen细胞的高度的变化可能会影响TM与网状版之间的距离,此外delCanizo-Alvarez等人还报道高强度噪声暴露诱发豚鼠Hensen细胞中脂滴减少[64]。本实验第二部分发现豚鼠耳蜗中的脂滴以小脂滴为主，小脂滴主要用于氧化功能，且脂滴在基底膜中从底向顶端逐渐增多、增大与毛细胞在基底膜的分布(由底向顶端逐渐变长、变粗)大相一致。这可能与顶端大长的外毛细胞在运动的时候克服周围阻力和自身运动所消耗的能量均比底端矮小的外毛细胞要多，与之对应的Hensen细胞就必须储备更多的能量有关。该结果支持了孙建和等人提出的豚鼠耳蜗Hensen细胞中的脂滴通过β氧化为外毛细胞提供能量的观点。同时如果该观点成立，能更好的解释强噪声暴露下Hensen细胞中的脂滴减少的机制。噪声后脂滴减少，其可能是由于持续高强度的噪声刺激造成耳蜗毛细胞尤其是外毛细胞的耗能增加[67]。外毛细胞通过缝隙连接把需要能量的信号快速传递给Hensen细胞，Hensen细胞中的脂滴接收信号后分解为脂肪酸，游离的脂肪酸通过缝隙连接或脂肪酸转运体，为外毛细胞供能[68-69]。脂肪酸的代谢水平受到组织、细胞表面脂肪酸转运体调节[70-72]。曲格列酮等格列酮类通过激活过氧化物酶增殖体激活受体（PPAR）从而激动脂肪酸分解代谢[60]。脂肪酸分解代谢的抑制剂有胰岛素，曲美他嗪，二氯乙酸等[62]。胰岛素对脂代谢的主要作用是促进脂肪的合成和抑制脂肪组织释放脂肪酸[59-60]。胰岛素可以促进脂肪细胞中6-磷酸葡萄糖的生成，经过氧化和磷酸戊糖生成乙酞辅酶A和还原型辅酶增多，从而增加48 川北医学院硕士学位论文了合成脂肪酸的原料。此外，胰岛素因能促进糖的氧化，增加α-磷酸甘油的生成，所以能抑制脂酞辅酶A进人线粒体氧化，有利于α-磷酸甘油和脂酞辅酶A合成脂肪。胰岛素可以降低脂肪细胞中cAMP的浓度，所以能抑制脂肪酶的活性而使脂肪分解速度减慢。胰岛素和曲格列酮都能有降低血糖的作用。曲格列酮组听力损失较轻，而胰岛素组与对照组无差异。研究表明脂滴分解被活化后有利于保护噪声性听力损失，其可能原因分析：一方面脂肪酸分解代谢加强，为外毛细胞提供了充足的能量；另一方面脂滴减少使Hensen细胞的高度下降，进而增加了网状板与盖膜之间的距离，减少了内、外毛细胞的噪声刺激。在胰岛素组与对照组之间没有明显差异，其原因有待进一步研究。本次实验还发现在较低血糖的豚鼠A组与血糖正常的C组之间没有明显差异，是否可以说急性血糖变化对噪声性耳聋无影响还有待进一步研究；如果能证明急性血糖变化对耳蜗能带谢无明显影响，则可间接推断耳蜗能量主要来源于脂肪酸氧化供能。4结论4.1.噪声刺激会导致豚鼠耳蜗脂滴变少，持续噪声刺激会增加豚鼠内耳脂滴的消耗。4.2.豚鼠脂肪酸代谢被激动可保护噪声性听力损失。豚鼠内耳脂滴在噪声性听力损伤中起一定的保护作用。49 川北医学院硕士学位论文全文总结1.通过5种染色方法证实了豚鼠耳蜗中存在脂滴，同时荧光染色法证明了豚鼠耳蜗活体Hensen细胞的透明物质即是脂滴。2.对豚鼠耳蜗Corti’s器中几种细胞同时进行染色，证明了豚鼠耳蜗Corti’s器中的脂滴仅存在于Hensen细胞的细胞质中。3.不管是定性观察还是定量研究都表明豚鼠耳蜗中的脂滴在基底膜上的分布，从耳蜗底到顶呈逐渐增多、增大的趋势这与毛细胞的分布趋势一致。豚鼠耳蜗基底膜第1转中未观察到脂滴，第2转有一个脂滴突然出现的“转折点”。4.激光共聚焦扫描三维重建技术和Imaris图像分析处理方法，是精准研究豚鼠耳蜗Hensen细胞中脂滴体积与分布的可行、可靠的方法。5.豚鼠耳蜗各转中脂滴体积差异加大分布在0.1~1000μm3，主体集中于1~100μm3。豚鼠耳蜗中的脂滴属于小脂滴，是功能最活跃的一类脂滴。6.强噪声刺激导致豚鼠耳蜗脂滴减少。7.脂肪酸代谢激动剂可保护噪声性听力损失，豚鼠耳蜗脂滴参与噪声性听力损伤的保护工作。总之，豚鼠耳蜗中存在脂滴，且主要存在于Hensen细胞的细胞质中。豚鼠耳蜗中的脂滴在基底膜从底至顶逐渐增加，第2转中存在脂滴突然出现的“转折点”，第1转中是否有脂滴还有待进一步研究。豚鼠耳蜗中脂滴除已知的参与免疫应答功能外，还可能通过氧化供能或改变Hensen细胞的高度参与了听觉过程，其更多功能有待进一步研究。50 川北医学院硕士学位论文参考文献[1]RaicaM.AshortstoryofVictorHensenandacelloftheinternalear[J].RomJMorpholEmbryol,2012,53(3Suppl):855-857.[2]ZhaoHB,Santos-SacchiJ.EffectofmembranetensionongapjunctionalconductanceofsupportingcellsinCorti'sorgan[J].TheJournalofgeneralphysiology,1998,112(4):447-455.[3]MerchanMA,MerchanJA,LudenaMD.MorphologyofHensen'scells[J].Journalofanatomy,1980,131(Pt3):519-523.[4]李兴启,孙建和,杨仕明,等.耳蜗病理生理学[M].北京:人民军医出版社,2011.[5]HallpikeCS.OntheFunctionoftheTympanicMuscles:(SectionofOtology)[J].ProceedingsoftheRoyalSocietyofMedicine,1935,28(3):226-232.[6]KimuraRS.TheultrastructureoftheorganofCorti[J].Internationalreviewofcytology,1975,42:173-222.[7]VinnikovJA,TitovaLK.Cytophysiologyandcytochemistryoftheorganofcorti:acytochemicaltheoryofhearing[J].Internationalreviewofcytology,1963,14:157-191.[8]WangW,LvN,ZhangS,etal.Cideaisanessentialtranscriptionalcoactivatorregulatingmammaryglandsecretionofmilklipids[J].Naturemedicine,2012,18(2):235-243.[9]YuN,ZhuML,ZhaoHB.Prestinisexpressedonthewholeouterhaircellbasolateralsurface[J].BrainRes,2006,1095(1):51-58.[10]FahyE,CotterD,SudM,etal.Lipidclassification,structuresandtools[J].BiochimBiophysActa,2011,1811(11):637-647.[11]FrederiksWM.SomeaspectsofthevalueofSudanBlackBinlipidhistochemistry[J].Histochemistry,1977,54(1):27-37.[12]KuttH,LockwoodD,McDowellF.ThelipidandproteinstainingpropertiesofSudanII,IIIandIVandtheircomponents[J].StainTechnol,1959,34(4):197-202.51 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川北医学院硕士学位论文Hensen细胞内与第三排Deiter细胞(Deiterscells)相邻，外邻Claudius细胞（Claudiuscells），上连表皮板，下至基底膜底部或BÖttcher细胞[1-2,4-5]。细胞质中不含微丝和维管束，线粒体也较少，然而细胞质内含有大量的脂滴[1-2,4-5]。Hensen细胞的形态在耳蜗各段并不完全相同[6]。Hensen细胞在底转呈立方体排成3-4排，在顶转呈上宽下窄的高柱状体排成5-6排；并且在同转中呈内高外低的排列[7]。细胞核位于胞体的顶部或中部。细胞质较疏松，内质网和线粒体较分散分布于细胞质中[2]。微绒毛分布于朝向中阶的细胞顶端游离缘,吞饮泡散在分布于细胞中[8]。Hensen细胞在顶端以紧密连接的方式相连，该紧密连接把内、外淋巴液分隔开[9]。细胞侧面以缝隙连接的方式相连，方便细胞的信号传递和物质交换[10]。细胞与基底膜底部或BÖttcher细胞以粘连连接的方式相连[2]。1997年Burgess等研究发现了Hensen细胞底部有神经突触连接，随后1998年Fechner等试验发现这些神经纤维在Hensen细胞与外毛细胞之间形成局部反射环路[11-12]。外隧道的内侧壁由第三排外毛细胞构成,Deiter细胞指突移向Hensen细胞构成外隧道的外侧壁和顶壁,外隧道腔隙逐渐缩小[13]。第三、四回的外隧道完全被Deiter细胞所充填,Deiter细胞指突和Hensen细胞密切接触[13]。基底膜由耳蜗底转到顶转的过程中逐渐变宽，与之相适应，Hensen细胞、毛细胞逐渐变高大，Hensen细胞逐渐离开基底膜且形成Hensen坝；这都增加了耳蜗Cort’s器的不稳定性，这时候Deiter细胞指突参与构成外隧道，对Hensen细胞和Cort’s器起支撑作用[13-15]。Hensen细胞作为一种不含有微丝、维管束的支持细胞，虽然不能通过物理的方式维持Corti’s器的形态，但是能够通过调节内、外淋巴的稳定，维持Corti’s器的稳定[2,4]。Hensen59 川北医学院硕士学位论文细胞除上面与内淋巴相通，其余各面均与细胞外液相通；故Hensen细胞可以从内、外淋巴中摄取营养物质。Hensen细胞的钾离子活动参与了维持内淋巴高钾的状态和内、外淋巴液直接的钾离子循环[16]。低浓度ATP通过抑制Hensen细胞膜上的钾离子通道，从而抑制钾电流，这个过程是可逆的。高浓度ATP所引起非选择性离子流的进入可能激活了胞内的三磷酸肌醇系统，引起细胞内钙库的释放，以致使细胞内游离钙浓度增高。Nifedipine可以通过抑制ATP非选择性离子流来阻止Hensen细胞的钙超载，改善耳蜗中的钾离于循环[17]。Hensen细胞外向性钾电流参与了蜗内电位（endocochlearpotential,EP）的形成[18-20]。2.脂滴的结构脂滴作为一种细胞器，是中性脂质在细胞内的主要储存场所[21]。脂滴主要由磷脂单分子层和疏水的中性脂构成[22-23]。2013年Layerenza等人根据脂滴在细胞内的所在部位不同将脂滴分为位于细胞核的核脂滴和位于细胞质的胞质脂滴。这两种脂滴的成分差异较大：如在小鼠单离的肝细胞中细胞核脂滴含有19%甘油三酯,39%甾醇酯27%的胆固醇,和15%的极性脂质,而细胞质脂滴有92%甘油三脂,5%的甾醇酯，2%的胆固醇和1%极性脂质[24]。过去一直认为脂滴只是一个惰性的细胞器，仅仅储存脂质，供应能量[22]。随着对其表面的脂质相关蛋白的研究，发现脂滴还参与脂类的合成与分解代谢、蛋白降解、膜转运，以及信号传递过程[21,25]。3.脂滴的功能：3.1.脂滴的供能作用：脂滴是中性脂质的储存器，表面含有与中性脂质水解相关的酶激素60 川北医学院硕士学位论文敏感性脂肪酶(Hormonesensitivelipase,HSL)和甘油三酯的水解酶脂肪甘油三酯脂肪酶(Adiposetriglyceridelipase,ATGL)[25]。它常常通过释放脂肪酸参与机体的氧化供能作用。典型的是在脂肪细胞中平时以甘油三酯的形式贮存能量，当机体需要能量时释放脂肪酸氧化供能[26]。尤其是棕色脂肪组织中的脂滴较小直径约为2~10μm，能够快速的为机体提供能量[27]。骨骼肌和心肌也主要依靠脂肪酸氧化供应能量[28-29]。骨骼肌在有氧运动时主要依靠脂肪酸氧化供能；且有氧运动可促使大脂滴变为小脂滴，小脂滴更有利于氧化供能[30-31]。心肌是一种能量代谢旺盛的细胞，能同时利用碳水化物和脂肪供能。在正常情况下心肌细胞氧供丰富，其首先利用脂肪酸氧化供能。心肌的能量约2/3来自脂肪酸的氧化供能[29]。众所周知心肌细胞中并不存在大量的脂滴，因为非脂肪细胞中的脂滴存储过多，脂滴会通过神经酰胺和活性氧途径使细胞凋亡。心肌细胞主要从其丰富的血供中提取脂肪，维持其能量代谢；而耳蜗中的毛细胞和心肌细胞的运动类似，需要丰富的能量供应，但是供应毛细胞的血管是终末血管且缺少侧支循环所以无法从血供中提取大量的脂质。光镜下可见Hensen细胞中包含大量脂滴，但是Hensen细胞却没有与脂肪酸代谢有关的线粒体和内质网系统，而与之相邻的外毛细胞则含有大量的线粒体及内质网系统，可能Hensen细胞通过旁分泌的作用为耳蜗毛细胞提供脂肪酸，供其线粒体氧化供能[13]。3.2.脂滴参与脂质合成代谢：脂滴不仅脂质的“仓库”,还是脂质的合成“车间”。脂肪细胞的脂滴中不但存在甘油三酯，还有甘油三酯的合成前体——甘油二酯[32]。同时含有催化甘油三酯合成的酶，如：二脂酰甘油酰基转移酶，脂酰辅酶A合61 川北医学院硕士学位论文成酶和酰基转移酶等[33-35]。SorgerD等研究发现在分离纯化的脂滴中加入同位素标记的甘油二酯，可生产带有放射性的甘油三酯，说明脂滴可以单独合成甘油三酯[32]。脂滴中含有甾体类激素的前体——胆固醇。而且脂滴还含有与胆固醇合成代谢相关的酶,羊毛固醇合酶Erg6和胆固醇酯酶[36-38]。脂滴在卵巢和睾丸中参与甾体类激素的合成代谢，如雌激素、雄激素等[39]。3.3.脂滴参与免疫调节：脂滴通过参与炎症因子的合成代谢调节机体的免疫。炎性细胞脂滴表面含有合成前列腺素的环氧化酶和前列腺素合成酶。研究表明白细胞中脂滴的增加，伴随着前列腺素E2的增多；同时免疫定位研究显示脂滴是前列腺素E2从头合成的场所[40-45]。脂滴通过表面含有合成白三烯的5-脂氧合酶和白三烯C4合成酶参与白三烯的合成代谢[40-41]。蛋白质膜联蛋白A1(ANXA1)阻止炎性细胞进入中阶，进而保护了Corti’s器免受炎症细胞的破坏[46]。3.4.脂滴其它功能：除上述功能外，脂滴还有细胞保护、抗病毒、激素调节、营养和蛋白质的合成等作用[47-50]。肝细胞中一般不含有脂滴，只有当肝细胞受损后才会出现脂滴[51]。肝细胞脂肪变早期出现的脂滴，其表面表达大量的脂肪分化相关蛋白(adiposedifferentiation-relatedprotein，ADRP)促进脂滴形成和储存游离脂肪酸对肝细胞起一定的适应性保护作用[52]。当肝细胞损伤进一步加重时，脂滴大量形成后会加重肝细胞的功能下降和细胞损伤[53]。脂滴通过影响丙肝病毒的感染、组装、复制和分泌一系列生命过程；参与丙肝病毒生命周期的调控[48]。脂滴在平滑肌细胞中的堆积可以62 川北医学院硕士学位论文产生胰岛素抵抗作用等[49]。在乳腺组织分泌到乳汁中，维持乳汁的正常营养[50]。4.Hensen细胞脂滴的作用脂滴有如此多的功能，且几乎存在于所有的细胞中，然而其大小和多少受细胞的种类和功能的影响[39]。除了脂肪细胞，大部分细胞中的脂滴都又小又少，然而奇怪的是豚鼠耳蜗Hensen细胞中却含有大量的脂滴。目前明确报道的Hensen细中脂滴的功能有以下三个方面。在1980年Merchan等人首先提出了Hensen细胞中的脂滴参与了听觉系统的调节作用[54]。随后delCanizoAlvarez和MerchanCifuentes研究发现Hensen细胞的顶部与盖膜的外侧缘相连；Hensen细胞中的脂滴通过调节Hensen细胞的高度，改变毛细胞的网状板与盖膜直接的距离[55]。在强噪声暴露时豚鼠和小鼠的Hensen细胞通过释放脂滴，降低高度，从而保护Corti’s器免受噪声损伤[54-56]。2004年Bell和Fletcher对内耳Hensen细胞中脂滴的功能又有了新发现[57]。他们认为Hensen细胞中的脂滴，可以释放到盖膜和网状板之间，减少盖膜和网状板之间的粘度，从而参与耳蜗的微调功能。2009年，人们对Hensen细胞中的脂滴有了一个全新的认识。Kalinec等人研究发现Hensen细胞在糖皮质刺激下其脂滴释放大量的ANXA1阻止炎性细胞进入中阶，进而保护了Corti’s器免受炎症细胞的破坏[46]。ANXA1主要功能是阻止白细胞和巨噬细胞的迁移[58]。脂滴在Hensen细胞中有如此众多的功能，且主要参与保护Corti’s器和耳蜗的调节作用。脂滴作为一种功能多样的、活跃的复杂细胞器。其在Hensen细胞中的是否还有其他功能，或者其对周围细胞如毛细胞等63 川北医学院硕士学位论文的作用，乃至对整个Corti’s器的作用目前尚不完全清楚。5.总结及展望在过去几年时间里，脂滴作为一种重要的细胞器，其生物学功能正被人们逐渐认识。随着对脂滴的多功能性、复杂性、多样性的认识。虽然人们对Hensen细胞中的脂滴功能有了全新的定义和认识，但是Hensen细胞中脂滴可能还有更多的功能作用，如Hensen细胞中的脂滴可能通过旁分泌为毛细胞提供能量，通过细胞信号的作用参与内耳免疫应答，回收内耳代谢多余的脂肪酸减少其细胞毒性，参与内耳激素的合成等等[59]。上述的功能和作用都有待我们去研究、发现和证实。这将为耳聋的发病机制提供一个新的视角，为耳聋的防治提供新的理论基础。64 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川北医学院硕士学位论文个人简历一般情况：姓名：杨风波性别：男民族：汉出生年月：1987.03政治面貌：团员籍贯：四川达州个人履历:2006/09-2011/07川北医学院大学本科，学士2011/07-2013/09新疆建设兵团一师医院医师2013/09-2016/07川北医学院研究生，硕士攻读硕士学位主要事迹：1.参与科研立项：[1]以第四参与者，参与了一项国家自然科学基金资助的面上项目《光遗传学通道（ChR2）对螺旋神经节细胞兴奋性调控机制的研究》，（81470700）。[2]以第三参与者，参与了南充市科技局项目，《常见啮齿类动物内淋巴囊解剖定位、形态学的实验研究》，（14A0084）。[3]以第二参与者，参与了四川省教育厅项目，《内耳中脂肪酸及其转运体的分布特点和病理生理学意义》，（16ZB0231）。2.主要社会活动志愿者：2015年4月参加国际耳内科会议，获得“优秀志愿者”。3.主要参加会议及学习：[1]2014年8月参加了全国颞骨解剖培训，并取得相关证书。[2]2014年10月参加全国青年医生会，大会发言。[3]2015年5月参加亚太人工耳蜗大会，壁报展览。[4]2015年7月投稿中华耳鼻喉年会，获得书面交流。[5]2015年9月参加北京市听力培训、取得听力师培训合格证。[6]2015年9月参加亚太神经联合会，壁报展览。72 川北医学院硕士学位论文攻读硕士学位期间发表的学术论文：被索发表或投稿序作者（全体作者，按顺序发表的年月卷引收题目刊物名称、级号排列）期、起止页码录情别况杨风波,丁大雄,吕萍,程晓婷,任红苗,黄国豚鼠耳蜗Hensen细2015-8-28,23听力学及言1威,王晓东,刘晨,张悦,胞脂滴的性质与分（05）:500-50语疾病杂志丛涛,杨仕明,翟所强,布4于宁.丁大雄,杨风波,吕萍,豚鼠、大鼠和小鼠内听力学及言2015-8-28,232黄国威,王晓东,刘晨,淋巴囊组织学的差语疾病杂志(05):497-499张悦,杨仕明,于宁.异丁大雄,杨风波,吕萍,3种常用啮齿类实2015-6-19,10:解放军医学3张悦,王晓东,刘晨,黄验动物内淋巴囊解1039-1041+1院学报国威,杨仕明,于宁.剖定位差异064豚鼠耳蜗脂滴体积4杨风波,吕萍,于宁.拟投稿的计算方法ThePathophysiologicalYangFB，LvP,Ding5ofLipidDropletsin拟投稿DX,LiFJ,YuL.GuineaPigCochlea73