《外阴硬化性苔癣相关蛋白的蛋白质组学研究及真皮病变相关因素的探讨》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
分类号：R711.72单位代码：10159密级：公开学号：201110167博士学位论文中文题目：外阴硬化性苔癣相关蛋白的蛋白质组学研究及真皮病变相关因素的探讨英文题目：ProteomicsStudyonVulvaLichenSclerosus-associatedProteinsandtheStudyonCorrelatedFactorswiththeCoriumLesion论文作者：赵毅指导教师：武昕教授学科专业：妇产科学完成时间：2018年3月 中国医科大学博士学位论文中国医科大学博士学位论文外阴硬化性苔癣相关蛋白的蛋白质组学研究及真皮病变相关因素的探讨ProteomicsStudyonVulvaLichenSclerosus-associatedProteinsandtheCorrelatedFactorswiththeCoriumLesion论文作者赵毅指导教师武昕教授申请学位医学博士培养单位第一临床学院一级学科临床医学二级学科妇产科学研究方向女性下生殖道疾病论文起止时间2013年3月—2018年3月论文完成时间2018年5月中国医科大学（辽宁）2018年3月 中国医科大学博士学位论文中国医科大学学位论文独创性声明本人郑重声明：本论文是我个人在导师指导下独立进行的研究工作及取得的研究成果，论文中除加以标注的内容外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得其他学位而使用过的成果。对本研究提供贡献的其他个人和集体均已在文中进行了明确的说明并表示谢意。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。论文作者签名：日期：2018年6月13日中国医科大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的原件、复印件和电子版，允许学位论文被查阅和借阅。本人授权中国医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。保密（），在年后解密适用本授权书。（保密：请在括号内划“√”）论文作者签名：指导教师签名：日期：2018年6月13日日期：2018年6月13日日期：2018.6.13 摘要目的：外阴硬化性苔癣是一种皮肤病变，属于女性外阴上皮内非瘤样病变的范畴，它可以于任何年龄的女性发生，尤其中老年女性最常见。主要发生于外阴及肛周皮肤，其表现主要皮肤组织发生色素脱失，白变，与外阴鳞状上皮增生外观难以区分，临床症状相同，两种皮肤病变难以区分，需要病理检查进行区别，常被统称为外阴营养不良性疾病。外阴硬化性苔癣的表皮细胞层变薄，硬缩，真皮胶原纤维变性呈现玻璃样变，均匀一致的匀质带形成为主要病理标志。主要症状为顽固性的外阴瘙痒，并且在入睡时瘙痒特别明显，治疗的主要目的是抑制瘙痒，但效果不理想，容易反复发作。病变长时间持续下去会导致很多的并发症，常见的有大小阴唇缩小融合、外阴阴蒂处形成挛缩瘢痕、阴道口粘连阴道外口逐渐狭窄等解剖形态的改变，患者伴随会有性情绪的异常。还有4%的患者会发生恶性变，恶变成外阴上皮癌，即外阴鳞状细胞癌。人们经常还会发现，在外阴鳞癌的癌旁会有脱色的皮肤组织，在脱色的组织其中超出60%的患者会查找到外阴硬化性苔癣的病变情况出现，因而，学者把外阴硬化性苔癣认定为是外阴鳞状细胞癌的癌前病变。外阴硬化性苔癣的病因目前仍不清楚，根据文献的报道，发病机制可能与免疫平衡失调、激素、遗传、细胞周期调控失调、特殊病原体感染、氧化应激、局部病变等相关因素有关，其中自身免疫失调在所有发病因素中都占有重要地位，受到国内外学者的广泛重点关注。分子生物学检测技术的不断发展，目前很多与外阴硬化性苔癣致病相关的基因片段和蛋白已经被发现，但该病变确切的发病机制仍未探清。蛋白质组学是一项相对较新颖的实验技术，是指以某个特定组织单位的所有蛋白质组为研究对象，从整体的角度，来分析组织细胞内某一时点不断变化的全部蛋白质构成与活动规则情况。通过对有可比性的正常组织及病变组织间的所有蛋白质组比较分析，进而筛选出与疾病有特异关系的单个蛋白质分子，那么与传统的单个蛋白质研究相比，蛋白质组学是使用高通量的研究方式，一下筛选出多个蛋白质，利用此方法在研究某种病理生理发生机制的基本问题方面达到了最大I 中国医科大学博士学位论文的规模，与传统的方法对比，节省了挑选的时间，又降低了各种蛋白相互干扰的情况，有利于对整体相关蛋白的筛选和蛋白质之间相互关系的确立。蛋白质组学虽然开始使用的时间不是很长，但用在探究针对细胞的增殖、凋亡、异常分化、肿瘤相关领域，逐渐变成了及其有效的探索工具。本研究使用蛋白质组学方法，即双向荧光凝胶电泳（Two-dimensionalfluorescencedifferencsgelelectrophoresis,or2D-DIGE）结合激光基质辅助解吸电离飞行质谱（Matrix-AssistedLaserDesorption/IonizationofFlightMassSpectrometry，orMALDI-TOF-MS）鉴定的方式，对外阴硬化性苔癣组织（VLS）和外阴正常皮肤组织（VNS），先把差异性表达的蛋白质筛选出来，然后针对有意义并相关的蛋白质使用常用的实验方式，既Western-bloting及免疫组织化学sp法的方法对部分筛选出的差异表达蛋白质进行扩大样本的验证和表皮或真皮的组织学定位，进一步对这些差异蛋白的可比较性鉴定，以期待从整体角度探讨外阴硬化性苔癣的发病机制。利用原代细胞培养技术、免疫细胞化学鉴定、细胞增殖曲线检测及荧光染料法Rt-PCR技术检测半乳糖凝集素-7（Galectin-7）对外阴正常皮肤成纤维细胞增殖情况及合成胶原能力的作用及影响，以期初步探讨真皮病变的相关机制。实验方法：1、组织总蛋白的提取、定量及纯化：收集外阴硬化性苔癣标本组织及外阴正常皮肤组织各6例分别进行总蛋白质的提取。根据2DClean-upKit蛋白质纯化试剂盒使用说明书开展总蛋白质的提纯。依据蛋白质定量试剂盒（2DQuantKit）使用说明书展开总蛋白质浓度的测定。2、双向荧光差异凝胶电泳（2D-DIGE）及图像分析：用荧光标识已经提取出来的总蛋白，随后开始第一向固相pH梯度等电聚焦，然后用胶条来平衡，继而开始SDS聚丙烯酰胺第二向凝胶电泳。把电泳后的胶板扫描并分析。3、MALDI-TOF-MS蛋白鉴定及生物信息学分析：制做凝胶样本及点样，然后将样品放入质谱仪中开始荧光波普鉴别，链接EMBL-EBI数据库进行查询，并对挑出的蛋白质开展生物讯息的分析。4、使用免疫组化SP法对10例外阴正常皮肤组织和15例外阴硬化性苔癣中的皮肤桥蛋白（DermatopontinorDPT），膜粘连蛋白A2（AnnexinA2orAnexA2），半乳糖凝集素-7（Galectin-7）及过氧化物还原酶4（Prx4orPeroxiredoxin4）的表达情况进行半定量分析以及定位分析（表皮真皮）。5、使用Western-blot蛋白印迹法对10例外阴正常皮肤组织和15例外阴硬化性苔癣中DPT，Prx4，AnnexinII 中国医科大学博士学位论文A2及Galectin-7的表达情况进一步半定量检测及鉴定。6、使用组织块贴片接种法将正常外阴皮肤组织中的成纤维细胞开展原代提取培养、分离并用免疫细胞化学对原代的成纤维细胞开展波形蛋白的染色鉴定。7、应用MTS法检测不同浓度Galectin-7对外阴正常皮肤成纤维细胞增殖的影响。8、使用荧光定量逆转录Rt-PCR方法检测不同浓度Galectin-7培养下，原代外阴正常皮肤成纤维细胞中合成的Ⅰ型、Ⅲ型前胶原蛋白mRNA的情况。实验结果：1、有114个双向荧光差异凝胶电泳中差异明显的蛋白质点被切取，其中得到了鉴定结果的有107个。剔除重复的蛋白质，最终有92个差异蛋白质被获得。其中，在外阴硬化性苔癣组织中表达上调的蛋白质为40个，表达下调的蛋白质为52个。2、查询EMBL-EBI数据库分别获取92个差异蛋白的生物学信息，既最主要的生物功能及细胞组织定位。差异蛋白质的生物学功能表现多样，其中主要包括凋亡（25.01%），信号转导（3.26%），代谢酶（24.59%），转运（9.78%），细胞骨架（32.61%），细胞粘附（4.35%）。对92个差异蛋白的亚细胞定位进行分析，其中72个位于细胞质（78.26%），10个位于细胞核（10.87%），5个位于细胞膜（5.43%），还有5个为细胞外分泌蛋白（5.43%）。3、免疫组织化学检查结果提示AnnexinA2，Prx4，Galectin-7，DPT表达阳性的细胞主要位于正常外阴皮肤组织的表皮细胞全层，阳性颗粒分布在细胞浆和细胞核，其中DPT蛋白在真皮层细胞和间质中也有表达。这4种蛋白阳性表达细胞在外阴硬化性苔癣组织中也主要存在于表皮细胞层，而真皮层细胞中基本未见阳性表达。进一步半定量分析提示外阴硬化性苔藓与外阴正常表皮中4种蛋白的表达之间差异均有显著性（P<0.05）。免疫组化结果与前面蛋白质组学的结果相同，在外阴硬化性苔癣组织中，Galectin-7过表达，有显著性差异（P<0.05），DPT，Prx4及AnnexinA2低表达，有显著性差异（P<0.05）。4、Western-blot的结果提示，与正常皮肤组织相比，在外阴硬化性苔癣组织中AnnexinA2，Prx4及DPT的表达下降，有显著性差异（P<0.05）；Galectin-7呈过表达，有显著性差异（P<0.05）。这一结果与免疫组织化学相同，进一步验证了蛋白质组的结论。5、MTS检测结果显示Galectin-7在体外既可促进也可抑制外阴正常成纤维细胞的增殖，该作用受培养基中Galectin-7浓度影响，超过0.5μg/mlGalectin-7培养基可导致细胞增殖受限，甚至抑制。6、PCR的结果显示在Galectin-7作用下，外阴成纤维细胞合成Ⅰ型/Ⅲ型前胶原蛋白mRNA均增加，与Galectin-7浓度呈正相关。随着III 中国医科大学博士学位论文Galectin-7浓度的增加，Ⅰ型/Ⅲ型前胶原蛋白mRNA的比例逐渐下降，与Galectin-7浓度呈负相关。结论：1、运用蛋白质组学技术共筛选出92种差异蛋白，其中40种蛋白质在外阴硬化性苔癣组织中表达上调，52种蛋白质在外阴硬化性苔癣组织中表达下调。2、通过验证实验发现Galectin-7在外阴硬化性苔癣组织中显著高表达，Prx4，AnnexinA2及DPT在外阴硬化性苔癣组织中显著低表达，可能参与表皮萎缩及真皮匀质化的行成。其表达情况和前面的蛋白质组结果相同。3、Galectin-7有促进和抑制外阴皮肤成纤维细胞增殖的作用。浓度小于0.5μg/mlGalectin-7的培养基中，细胞增殖受到促进。浓度大于0.5μg/mlGalectin-7的培养基中，细胞增殖受到抑制。4、Galectin-7可以促进外阴皮肤成纤维细胞合成胶原蛋白，改变Ⅰ型/Ⅲ型胶原蛋白的分布比例。随Galectin-7浓度增高，胶原蛋白合成增多，而Ⅰ型/Ⅲ型胶原蛋白比例呈下降趋势。关键词：外阴硬化性苔癣；2D-DIGE；Galectin-7；免疫组织化学；Western-blot；MTS；Rt-PCR；真皮成纤维细胞课题资助：国家自然科学基金（No.30973190）。IV 中国医科大学博士学位论文AbstractObjective：VulvaLichensclerosusisanonneoplasiaepithelialdisordersofvulvaskinandmucosathatoccursinfemalesatanyage,especiallythewomeninmiddle-agedandolder-aged.Itischaracterizedbydepigmentationandleucismusintheskintissuesofvulvaandperianalareaandpathologicallymarkedbyepidermalatrophy,dermalcollagenfiberhyalinedegenerationandiso-substance.Thepresentingsymptomofvulvalichensclerosusisrefractorypruritusvulvaewhichisobviousduingsleep.Thetreatmenteffectivenessispoorandtheattackisrecurrent.Thelesiondevelopsverychronicallyandleadstomanybadoutcomes,includingscarinthevulvaclitoris,conglutinationandnarrowofostiumvaginaeaswellaspsychosexualdisorder.Thecauseofvulvalichensclerosusisnotveryclear.Thepathogenesismightcorrelatewithimmunity,hormone,heredity,cell-cycledregulationandinfectiontoo,oxidativestressandlocallesion.Autoimmunityactsagreatroleinallofthefactorsandholdsthescholars’sattentionsofalloveroftheworld.Somerelatedgenesandproteinswerefoundwiththeprogressofmolecularbiologyresearch,butmanytruelymechanismswitchinthelichenwerestillunknown.Proteomicsisanewlyemergingexperimentaltechnologywhichresearchontheproteomefromtheoverallperspectivetoanalyzetheintracellularproteinconstructionandavtivtyregularitydynamically.Proteomicscanscreenproteinmoleculethatisspecificfordiseasesbycomparingtheproteinsbetweennormalandimpairedindividuals.Proteomicscanscreenseveralproteinssimultaneouslybyhigh-fluxmethodandhasreachedtoanunprecedentedscaleandspeedintheresearchofthemechanismsoflifeactivities.Thoughproteomicsisaemergingtechnology,ithasbeenacompetentmethodtostudythecellularproliferation,differentiation,abnormaltransformationandtumorformation.V 中国医科大学博士学位论文Inthisstudy,Two-dimensionalfluorescencedifferencegelelectrophoresis(2D-DIGE)andmatrixassistedlaserdesorptionionizationtime-of-flight(MALDI-TOF)massspectrometrywereusedtoidentifytheexpressedproteinsthatsignificantdifferentiallybetweenthetissuesofthevulvalichensclerosusandthenormalvulvaskin.Thenwevalidatedandlocalizedsomedifferentiallyexpressedproteins,andtestifiedtheconsistencyofthedifferentialproteinsbywesternblotandbyimmuno-histochemisty.Cellculture,primarycellsproliferate、MTS、immuno-cytochemistryandQRT-PCRwereusedtodetecttheeffectofGalectin-7onthecollagensynthesizedbythefibroblastinthenormalvulvaskin,andexplorethecorrelatedmechanismsunderlyingthedermallesions.Methods：1、Totalproteinsextraction,quantificationandpurification：Thetissueofvulvalichensclerosus(n=6)andnormalvulva(n=6)werecollected.Accordingtotheprotocolsweuesd2DClean-upKitTheextractethetotalproteins.Theconcentrationoftotalproteinswereassessedaccordingtothedirectionsof2DQuantKit.2、Two-dimensionalsdifferencegelelectrophoresisandimagesanalysis(2D-DIGE)：ExtractedtotalproteinwereprocessedonfirstdimensionalimmobilizedpHgradientsisoelectricfocusing(IEF)afterfluorescentlylabeling,andthenprocessedonseconddimensionalSDSpolyacrylamidegelelectrophoresisafterthebalanceofgels.Wescannedthegelsandthenanylazedafterelectrophoresis.3、MALDI-TOFmassspectrometryandbioinformaticanalysis：Thesamplesofthegelswerepreparedandplacedinthemassspectrometerforidentificationafterspotting.BioinformaticsoftheanalyzedbyselectedproteinswasanalyzedbyqueringEMBL-EBIdatabase.4、Galectin-7,Prx4,AnnexinA2andDermatopontin(DPT)expressionsinthevulvalichensclerosus(n=15)andnormalvulva(n=10)wereanalyzedbyimmunohistochemistrystreptavidin-perosidas(SP)method.5、Galectin-7,Prx4,AnnexinA2andDPTexpressionsinthevulvalichensclerosus(n=15)andnormalvulva(n=10)wereanalyzedbywesternblot.6、Fibroblastsinthenormalvulvawereseparated,culturedandimmunocytochemistryidentifiesthecell.7、TheeffectofVI 中国医科大学博士学位论文Galectin-7ontheproliferationoffibroblastsinthenormalvulvawasdetectedbyMTS.8、TheeffectofGalectin-7onthemRNAexpressionsoftypeⅠandtypeⅢprocollagensynthesizedbyfibroblastsinnormalvulvaweredetectedbyRt-PCR.Results：1、Onehundredandfourteensignificantlydifferentproteinpointswerecuttedby2D-DIGE，107ofwhichwereidentified.Ninty-ninedifferentialproteinswereaquiredafterremovingthereduplicativeproteins.40proteinsup-regulateintheVLSand52proteinsdown-regulateintheVLS.2、Thefunctionofbiologicalandthelocalizationofsubcellular，witch92differentialproteinswereaquiredbysearchingtheEMBL-EBIdatabase.Thebiologicalfunctionsofdifferentialproteinswerevarious,whichincludedapoptosis(25.01%),signaltransduction(3.26%),metabolicenzyme(24.59%),transport(9.78%)andcytoskeleton(32.61%)aswellascelladhesion(4.35%).Thesubcellularlocalizationanalysisshowedthat77proteinswerelocatedincytoplasm(63.7%),10proteinswerelocatedincellnucleus(10.87%)andtheother5proteinswerelocatedincellmembrane(5.43%).3、Thegalectin-7,Prx4,AnnexinA2andDPTwereexpressedinthefullthicknessofthenormalvulvaandwerelocatedinthecytoplasmandnucleus.Themajorpositivecellsinthevulvalichensclerosuswerelocatedinthecuticularlayerandfewofthemwereinthecorium.TheexpressionofGalectin-7inthevulvalichensclerosusweresignificantlyhigherthanthatinthenormalvulva(P<0.05),whereastheexpressionofAnneA2,Prx4andDPTinthevulvalichensclerosusweresignificantlylowerthanthatinthenormalvulva(P<0.05),thatwerethesamewiththeproteomicsresults.4、ThepickedproteinleveloftheAnnexinA2,Prx4andDPTinthevulvalichensclerosuswassignificantlylowerthanthatinthenormalvulva.TherelativeproteinleveloftheGalectin-7comparethevulvalichensclerosustothenormalvulvawassignificantlyhigher.5、Galectin-7caneitherimproveorinhibittheproliferationofthefibroblastsinvitro.TheeffectsofGalectin-7ontheproliferationoffibroblastswerechangedwiththeconcentrationofGalectin-7.Galectin-7couldinhibittheproliferationoffibroblastswhentheconcentrationishigherthan0.5μg/ml.6、TheresultsofPCRshowedthatmRNAofTypeⅠandⅢprocollagenVII 中国医科大学博士学位论文synthesizedbyfibroblastswerebothincreasedundertheeffectofGalectin-7andthiseffectwaspositivelycorrelatedwiththeconcentrationofGalectin-7.TheratioofmRNAlevelintpyeⅠprocollagentothatintypeⅢprocollagenisnegtivelycorrelatedwiththeconcentrationofGalectin-7.Conclusions：1、Ninty-twodifferentialproteinswerescreendusingproteomicstechnology.Fortydifferentialproteinswereup-regulatedandfifty-twodifferentialproteinsweredown-regulatedinthevulvalichensclerosus.2、TheexpressionofGalectin-7comparedthevulvalichensclerosustothenormalvulvaskinwassignificantlyhigher,whereastheexpressionofAnnexA2,Prx4andDPTweresignificantlylowerinthevulvalichensclerosusthanthatinthenormalvulva,whichwerethesametotheproreomic.3、Galectin-7couldeitherenhanceorinhibittheproliferationofvulvafibroblasts.ItenhancedtheproliferationofvulvafibroblastswhentheconcentrationofGalectin-7waslowerthan0.5μg/mlandinhibitedtheproliferationofvulvafibroblastswhentheconcentrationwashigherthan0.5μg/ml.4、Galectin-7couldincreasethecollagenproteinsynthesizedbyvulvaskinfibroblastsandreducetheratiooftypeⅠcollagenproteintotypeⅢcollagenprotein.AstheGalectin-7concentrationincreased,thesynthesisofcollagenproteinwasincreasedwhereasthetheratiooftypeⅠcollagenproteintotypeⅢcollagenproteinwasreduced.Keywords：Vulvalichensclerosus；2D-DIGE；Galectin-7；westernblot；immunocytochemistry；immunohistochemistry；MTS；Real-timePCR；fibroblastsVIII 中国医科大学博士学位论文英文缩略语英文缩写英文全称中文全称VLSVulvarlichensclerosus外阴硬化性苔癣2D-DIGETwo-dimensionalsfluorescence荧光双向差异凝胶differencesgelelectrophoresis电泳MALDI-TOFMatrixassistedlaserdesorption基质辅助激光解析ionization/timeofflight电离飞行时间DTTDithiothreitol二硫苏糖醇IEFIsoelectricfocusing等电聚焦IPGImmobilizedpHgradient固相化pH梯度MSMassspectrometry质谱PBSPhosphatebufferedsaline磷酸缓冲盐溶液PMFPeptidemassfingerprinting肽质量指纹图SDSSodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸钠TBSTTrisbufferedSaline-TweenTris缓冲盐溶液ROSReactiveoxygenspecies活性氧簇TEMEDN,N,N',N'-tetramethylethylenediamineN,N,N,N'-四甲基二乙胺TNFTumornecrosisfactor肿瘤坏死因子PrxPeroxiredonxin过氧化还原蛋白GSTGlutathioneS-transferases谷胱甘肽S-转移酶DPTDermatopontin皮肤桥蛋白PIG1p53-inducedgene1p53诱导基因1TRAILTNF-relatedapoptosis-inducingligand肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体IX 中国医科大学博士学位论文NF-κBNucleartranscriptionfactorkappaB核转录因子MTS3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carb四唑化合物oxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfonyl)-2H-tetrazoliumHFHumanskinfibroblasts皮肤成纤维细胞Rt-PCRRealtimereversetranscription实时定量逆转录-polymerasechainreaction多聚酶链反应DCNDecorin核心蛋白聚糖Col-ⅠTypeⅠcollagenⅠ型胶原Col-ⅢTypeIIIcollagenⅢ型胶原TGF-βTransforminggrowthfactor-β转化生长因子βECMExtracellularMatrix细胞外基质MMP-9Matrixmetallopeptidase9基质金属蛋白酶-9X 中国医科大学博士学位论文目录摘要.................................................................IAbstract.............................................................V英文缩略语..........................................................IX第一部分外阴硬化性苔癣与外阴正常皮肤间差异蛋白的筛选1、前言.............................................................12、材料和方法.......................................................23、结果.............................................................64、讨论.............................................................75、结论............................................................12第二部分部分差异蛋白的验证1、前言............................................................172、材料和方法......................................................173、结果..........................................................214、讨论............................................................255、结论............................................................28第三部分Galectin-7对外阴成纤维细胞的影响1、前言............................................................292、材料和方法......................................................303、结果............................................................354、讨论............................................................385、结论............................................................40本研究创新性的自我评价.............................................42参考文献..........................................................43文献综述...........................................................50XI 中国医科大学博士学位论文攻读学位期间取得的个人成果.........................................62致谢..............................................................63个人简历...........................................................64XII 中国医科大学博士学位论文第一部分外阴硬化性苔癣与外阴正常皮肤间差异蛋白的筛选1前言外阴硬化性苔癣（Vulvarlichensclerosus，VLS）是一种以女性肛周及外阴皮肤色素脱失，皮肤弹性降低，表皮固缩变薄为主要体征的妇科门诊常见疾病[1]，一般可以出现在少年至老年的女性，但尤其以老年女性更为常见，最重要的临床症状表现为持续顽固性的瘙痒，长期渐渐发展最终引起外阴形态解剖结构的变化，如外阴萎缩，阴道口挛缩，狭窄。迄今为止外阴硬化性苔癣尚无统一特效的治疗方法，以局部保守用药治疗为主，用药的目的主要针对止痒和防止外阴解剖结构改变为主要目的，效果不佳，病变容易反复发作，也有采用手术治疗的，但易复发，一般很少采用，手术多为发生或可以恶性改变后才进行。病损的典型病理形态包括表皮复层鳞状细胞层变薄萎缩；呈现出过度角化，棘细胞层变薄，基底层细胞液化、空泡化，上皮脚部分变钝或消逝；真皮下浅层部分胶原纤维变性，呈玻璃样变，均匀一致的匀质透明纤维带化形成，深层匀质带下方有浆细胞及大量淋巴细胞浸润。因外阴硬化性苔癣可以在大多数外阴鳞状细胞癌的癌旁出现，约占60%以上，因此被认为是癌前病变，但外阴硬化性苔癣本身恶变几率很低，约为4%。目前外阴硬化性苔癣病因仍不清楚,根据以往的研究报道，发病机制可能与局部免疫增强、性激素、家族遗传、细胞周期调控失调、感染、局部机[2]械性病变等因素有关。随着分子生物学研究进展，已经发现了一些病变相关的基因和蛋白在外阴硬化性苔癣组织中被发现，但蛋白与蛋白之间的相互作用及确切的发病机制尚不清楚。人体各种生命活动是非常繁杂和变化多端的，蛋白质是一种大分子物质，最终的执行着和效应着各种生命活动，因此蛋白质形态功能的变化，不论是在生理还是病理下都受到广大学者的高度重视，同时蛋白水平的研究方法种类也是最多的。为了适应未来生命科学发展的趋势，利用整体水平上对在某一特定蛋白质群体进行种类、数量、结构、功能及各类蛋白间相互协同拮抗作用关系等各个方面进行综合研究提出了新要求。以整个蛋白质组为研究对象的研究方法就是蛋白质组学，要从整体的角度，对特定组织的全部蛋白质的分布组成与活动规则进行分析。把正常个体的总体蛋白和病变个体的总体蛋白分别提取，然后进行量化比较并鉴定分析，筛选出与正常组织相比，增多或减少的具有特异性的蛋白质分子，1 中国医科大学博士学位论文探讨疾病发生发展的潜在可能机制。与原有的蛋白质研究办法比较，蛋白质组能同时筛选出多个差异表达的蛋白质群，在探讨有关生命活动机制领域的各种问题方面，达到了最大的规模和速度。这第一部分的研究就是应用蛋白质组学技术，双向荧光凝胶电泳（2D-DIGE）结合辅助激光解析基质电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）对外阴正常组织及外阴硬化性苔癣组织之间的有差异表达的蛋白种类进行筛选并且鉴定。从整体差异蛋白角度探讨外阴硬化性苔癣潜在的发病机制。2材料与方法2.1材料2.1.1研究对象选取2009年2月至2010年12月就诊于中国医科大学第一附属医院妇科门诊，外阴活检并经至少两名病理专家病理学证实为外阴硬化性苔癣组织标本6例，住院行外阴手术（良性肿物或单纯修复）中多余的正常外阴皮肤组织6例。标本迅速放进负80℃深度冰箱之中冻存等待使用。外阴硬化性苔癣组织进行实验前，先切取一小块做成石蜡病理切片，进行HE染色，再请两位有经验的病理科医生进行确认。2.1.2主要试剂十二烷基硫酸钠（SDS购于sigma公司、美国）甲叉丙烯酰胺（购于sigma公司、美国）丙烯酰胺（购于sigma公司、美国）四甲基二乙胺（TEMED购于sigma公司、美国）过硫酸氨（AP购于sigma公司、美国）三羟甲基氨基甲烷（购于sigma公司、美国）蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF购于sigma公司、美国）尿素（购于sigma公司、美国）硫脲（Thi购于sigma公司、美国）甘氨酸（Glycine购于sigma公司、美国）二甲基亚砜（DMSO购于sigma公司、美国）3-[（3-胆酰胺丙基）]-二乙胺（CHAPS购于Merck公司、德国）β-巯基乙醇（β-MERL购于Merck公司、德国）2 中国医科大学博士学位论文Bindsilence（购于Merck公司、德国）溴酚蓝（Bromlblue购于Merck公司、德国）赖氨酸（L-Lysine购于Merck公司、德国）醋酸铵（购自购于Merck公司、德国）蛋白酶抑制剂（proteaseinhibitorcocktail购于Merck公司、德国）吲哚-3-乙酸（IAA购于Merck公司、德国）二硫苏糖醇（DTT购于Merck公司、德国）琼脂糖（Agarose购于Merck公司、德国）CyDye荧光染料（Cy2Cy3Cy5购于GEHealthcare公司、美国）两性电解质（购于GEHealthcare公司、美国）矿物油（购于GEHealthcare公司、美国）deeppurple（购于GEHealthcare公司、美国）2.1.3主要仪器EttanIPGphor等电聚焦仪（GEHealthcare公司）TyphoonTRIOVariableModeImager（瑞典AmershamBiosciences公司）EttanDALT垂直电泳槽（GEHealthcare公司）illi-QBiocel超滤除热源型超纯水系统（美国密理博公司）EttanDALTPowerSupply（美国GEHealthcare公司生产）DeCyderDifferrntialAnalysisSoftware（瑞典AmershamBiosciences公司生产）Ettanspotpicker（GEHealthcare公司生产）2.2实验方法2.2.1组织蛋白的提取和纯化组织块取出自深度超低温冰箱中。分别将6例VLS和6例NVS组织称重，将组织分别放入EP管中，EP管要4℃预冷，分别加预冷的PBS1ml,在冰上于EP管中把组织剪成小碎块，低温高速离心12000rpm，4℃离心5min后弃去上清，保留沉淀组织。按照比例（每20mg组织：200ul组织裂解液）加裂解液裂解组织，同时间断使用超声波充分裂解组织，静置于冰上继续静置裂解30min，低温高速离心12000rpm，4℃持续离心30min，将上清液收集。上清液即为总蛋白，按照蛋白质纯化试剂盒的说明书进行对上清液中总蛋白质提纯。2.2.2组织细胞总蛋白浓度的测定3 中国医科大学博士学位论文根据说明书（2D蛋白质定量试剂盒）对上清液总蛋白浓度的进行测定。原理是离心沉淀的是总蛋白，移除上清裂解液，把总蛋白质用含铜离子的溶液溶解成蛋白溶液，铜离子可以与蛋白按量结合，剩余的游离铜离子能和显色工作液产生化合反应并且显色，那么显色的深浅代表剩余的游离的铜离子浓度，与蛋白质的浓度呈反比，可据此绘制曲线。2.2.3第一向固相pH梯度等电聚焦（IPGIEF）1、专用清洗剂对胶条槽清洁然后晾干。2、对已提取的蛋白质进行分别标记。加入荧光染料1ul工作溶液至含有蛋白质50ug的样品中，使用涡旋震荡的方法彻底混合，短暂离心，在避光环境中继续静置冰浴30min，向各管中分别加入1ul10mmol赖氨酸结束蛋白的标记，短暂离心，充分混合后在无光暗环境中继续放置于冰上10min。3、充分混合水化液和已标记过总蛋白质提取物，使每根干胶条IPG的上样总体积达到450ul（总蛋白的上样量为450ug），然后充分混匀震荡。4、吸取样品，从IPG胶条槽的中部开始加起，不间断加入样品，注意要连续加样，避免加样过程中产生气泡。5、揭去IPG干胶条（pH3-10NL，18cm）的保护膜，胶面朝下放入胶条槽中，槽中含蛋白质样品。注意要与电极贴紧，以避免气泡的产生。6、浇筑液约900ul盖住整层Immobiline干胶条，从一侧开始浇起，浇覆盖液要防止有气泡的产生，覆盖液要完全盖住胶条完全，最后盖上胶条槽的盖子。7、于EttanIPGphor3等电聚焦仪上将IPG胶条槽放入，检查胶条槽的电极与聚焦仪面板是否已接触正确，盖好安全盖。8、设置程序：总电压时间积为80000Vh，其中于30V低电压水化lh，然后依次经过100V1h、500V1h，1000V1h，最后恒定在8000V，直至总电压时间积为80000Vh。2.2.4第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）1、制备出6块凝胶含12.5%的聚丙烯酰胺。2、将配置好的平衡缓冲液从4℃冰箱中取出，室温预先放置30min使其充分溶解，再配置平衡A液和平衡B液。等电聚焦后迅速取出IPG胶条，先后置于平衡液A10ml和平衡液B10ml的混合液中，再将其置于摇床上平衡，各需要平衡15min。4 中国医科大学博士学位论文3、将平衡后的胶条从平衡混合液中取出，轻轻冲洗胶面用ddH2O，然后放上端在第二向电泳凝胶，均匀盖在胶面上，尽量把所有的气泡挤出。排尽所有气泡后，再用0.5%琼脂糖封胶。4、先以1W/胶进行电泳持续8h，然后恒功率电泳以5W/胶进行，一直到底边处有溴酚蓝到达凝胶马上将电泳终止。2.2.4染色、扫描及图像分析1、将胶板的两片玻璃片分离开，将有胶的那块玻璃板用ddH2O轻轻冲洗后放入固定液500ml中进行固定持续2h。2、倒出托盘中的固定液，加入清洗液500ml，放置于摇床上清洗，共清洗2次，每次需15min，清洗时注意避光操作。3、从-20℃冰箱中将DeepPurple染料取出，放置室温中5min，自然融化。4、倒掉托盘中的清洗液，加入按照1：200稀释过的染料，托盘加盖，放置于摇床上，室温下避光摇晃1h。5、倒掉托盘中的染料，然后加入7.5%乙酸溶液，盖上盖子，室温下避光摇晃15min，重复一次。6、把胶板放进于Typhoon9400多功能仪中进行扫描并拍照，获得Cy2、Cy3及Cy52D凝胶荧光标记的图片。7、使用DeCyderv.6.5图片分析软体进行蛋白点检测、自动及人工相配合匹配与比较差异等分析。8、在本实验中，共进行了6次重复技术性操作，一共得到2D凝胶电泳图像18张应，用图像分析软件进行比较，选择存在1.5倍以上的差异蛋白质点作为候选的差异蛋白点，进行鉴定质谱。9、所有数据结果的统计分析在SPSS17.0软件以及MicrosoftExcel2003上进行并绘图。2.2.6质谱分析与数据库检索1.制备凝胶样品及凝胶样品点样（1）切胶：应用全自动EttanSpotPicker斑点切取系统进行定位切胶，将切好的胶放置于96孔板中。（2）清洗及脱水：吸尽弃掉孔内的酒精，在每个孔内加入ddH2O100ul，轻轻震荡，持续10min，吸尽弃掉每个孔内的ddH2O，重复一次。吸出孔内的ddH2O，5 中国医科大学博士学位论文加入乙腈脱2次，使胶粒萎缩变白。（3）酶解：每孔加入6ul胰蛋白酶液，4℃放置1h，等待胶粒充分吸收酶液后，用10ul25mmol/LNH4HCO3覆盖胶粒，放置37℃孵箱中进行酶解16h。（4）点样：酶解充分完成后，取2ul萃取的样品液进行点靶，待自然晾干后，重复2ul萃取的样品液点靶一次；1ul基质工作液点在已经晾干的样品上。点4个样品中间的肽标准品，再晾干。2.质谱分析及数据库查询将制备好的点样板置于MALDI-TOF/TOF质谱仪中开始剖析，取得肽质量指纹图(PMF)。运行Matrixseience公司的MascotDistiller软件进行PMF的解谱。MascotDistiller软件参数设置均用其默许。数据库检索使用Matrixscience公司的Mascot进行。数据库检索参数设置为：Database选择SwissProt或NCBInr，Taxonomy选择Homosapiens或human，Enzyme选择Trypsin，Allowuptomissedcleavages选择1，Fixedmodifications选择为Carbamidomethyl(C)修饰，Variablemodifications不选。肽片段容差选择l00ppm，Massvalues选择MH+，选择Monoisotopic，再打开相应的文件后进行数据库检索。2.2.7生物信息学分析用EMBL-EBI数据库对鉴定出的差异蛋白主要的生物学功能及细胞内的亚定位进行分析。3实验结果3.1组织细胞总蛋白的2-DE分离及分析将收集经过病理学确认过的的6例外阴正常组织及6例外阴硬化性苔癣组织混合成6对标本。对外阴正常组织及外阴硬化性苔癣组织的总蛋白进行2-DE分离，得到了背景清晰、分辨率高的2-DE图谱18张，为Cy2，Cy3和Cy5各6张。其中Cy3及Cy5荧光标记的图谱见图1-2，运用DeCyderv.6.5软件对图谱进行分析，每张图谱有1000余个蛋白质斑点，从中识别出表达差异在1.5倍以上的蛋白质点124个，其中与外阴正常组织蛋白相比，有72个蛋白质点在外阴硬化性苔癣组织中表达上调，52个蛋白质点在外阴硬化性苔癣组织中表达下调。3.2差异蛋白质点的质谱分析采用MADLDI-TOF-MS对差异蛋白质点进行初步判定，取得蛋白质肽片段的PMF，用MascotDistiller软件判断单同位素峰，取得的肽片段的质荷比(m/z)数值6 中国医科大学博士学位论文输入Mascot在线进行检索，检索SwissProt蛋白质数据库。如果得分(Mascotscore)大于56分(P<0.05)，就判定鉴定是可信的（图1-3）。最终，差异表达的蛋白质斑点有124，其中有98个得到鉴定。剔除重复的蛋白质，92个差异蛋白质被最终得到。其中，在外阴硬化性苔癣组织中表达上调的蛋白质为40个，表达下调的蛋白质为52个（表1-1、表1-2）。3.3差异蛋白质的生物信息分析92个差异蛋白的生物学功能及在细胞中的定位利用EMBL-EBI数据库查询获得。对92个差异蛋白的亚细胞定位进行分析，其中80个位于胞浆（cytoplasm，83.7%），8个位于细胞核（nucleus，10.87%），4个位于细胞膜（memberane，5.43%），6个分泌于细胞外发挥功能。如图1-1，对92个差异蛋白质的生物学功能进行分析。差异蛋白质的生物学功能多样，其中主要包括细胞骨架蛋白（cytoskeleton，32.61%），第二信使信号转导（signaltransducer，3.26%），细胞粘附迁移（celladhesion，4.35%），转运蛋白（transport，9.78%），诱导凋亡（apoptosis，25.01%），能量及催化代谢酶（metabolicenzymes，24.59%）。进一步分析，很多蛋白还兼有如下功能：蛋白质修饰与折叠（proteinfolding），细胞氧化还原平衡（cellredoxhomeostasis），免疫调节反应（immuneresponse），钙结合调节蛋白（Cabindingprotein），应激反应（stressresponse），转录与翻译相关（transcriptionandtranslation），膜通道（channel），细胞运动变形（motility），增殖分化（differentiation），促血管生成（angiogenesis）。4讨论随着人类基因组图谱序列公布在各种大数据库，虽然揭示了基因组结构序列同时，但也说明了相对的有限基因数量和不易改变相对稳定的基因结构，生命现象的复杂多变性与基因序列的有限性和稳定性之间显示出了非常大的反差。近年来世界各地学者越来越多的开始关注到与生命活动息息相关的生物大分子蛋白质层面的研究上。而蛋白质组学作为能够同时筛选较多相关蛋白的一项技术，已成为对各种疾病研究中的最基础，有效的研究技术之一。已被广泛应用于对疾病特异性相关蛋白的首先基础性筛选。蛋白质组学的核心技术是蛋白质分离的双相凝胶电泳技术和蛋白质鉴定的质谱技术。目前，较为常见的蛋白质鉴定前显色技术7 中国医科大学博士学位论文有：银染法、考马斯-亮蓝染色和荧光法。考马斯-亮蓝染色具有较差的灵敏性，因此所需上样的蛋白总量大，组织需求多；银染法操作步骤多复杂，对后续不利；而荧光法定量以及定性能力均较好，还便于于后续鉴定研究，较前两种染色方法，使用更为便利，逐渐会取代前两种方法。2D-DIGE是目前被认为是先进的分离蛋白质的技术之一，是在双向凝胶电泳聚丙烯酰胺（2D-PAGE）基础上发展而来的。以往最初2D-PAGE技术的基本原理是根据蛋白质的差异，既蛋白等电点和分子质量不同，进行先后两次在凝胶上进行电泳，在胶板上将不同分子量和等电点的蛋白质分离开来，而在实际分离操作的过程中常因为对疏水性的蛋白质和极碱、极酸性的蛋白质有偏性、胶上蛋白共迁移等问题，而蛋白质的分子量过大或者过小的[3-4]情况出现、丰度较低的蛋白质在分离上仍存在一定的困难。发展为现在的2D-DIGE技术应用染料，其中含有不一样的荧光的对总蛋白质样品预先进行标识后再行双向电泳，由于各自的荧光标记物能激发出不同的波长，因此所标记的蛋白标本可通过不同的滤光片在同一块胶板中记录下互相不干扰的胶图结果，从而有效的避免了不同胶板之间的系统误差，更有利于蛋白的分离和鉴定，与此同时，引入内参对胶内各种荧光标记染料所标识样本的表达量进行校对，极大的提高了[5-7]实验结果的可重复性和准确性，取代了最初的2D-PAGE。2D-DIGE还可用来检测比较小的蛋白样品间微小的表达差异，非常适合临床医疗的研究，通过对人体不同的细胞、血液、组织、各种分泌的体液进行比对和分析，在寻找患病的分子标志物及药效对应的相关蛋白靶点等地方，监测疾患的产生、延续过程，药理及毒理等方面都有很广泛的应用前景。在本研究中，我们采用2D-DIGE及MALDI-TOF-MS研究对外阴硬化性苔癣组织及外阴正常皮肤组织之间差异表达的蛋白质进行检测。我们发现一共有92种蛋白质表达存在显著性差异，超过至少1.5倍。经过鉴定，其中有40种差异蛋白在外阴硬化性苔癣组织中表达增高，52种差异蛋白在外阴硬化性苔癣组织中表达降低。联合已知的信息生物学的方法，我们分析了已经鉴定出92个差异蛋白质。差异表达的蛋白质多数定位于细胞质中，少数定位于细胞核及细胞膜，还有部分蛋白是具有细胞外分泌功能，在体液中能够检测到的蛋白质；这些差异蛋白在细胞中的功能主要归类于骨架蛋白、促凋亡蛋白、氧化应激、细胞信号信使、细胞之间粘附、转录与翻译和代谢酶。综合考察这些蛋白，我们发现，虽然功能各异，绝大多数的蛋白均与细胞的凋亡与增殖有关，凋亡蛋白多于增殖蛋白，有学者称表皮层的8 中国医科大学博士学位论文萎缩是VLS最重要的发病特征，与我们的研究结果一致。本文结合文献将对其中部分差异蛋白质的功能进行阐述讨论，初步探讨是否与外阴硬化性苔癣的发病有关。促进细胞凋亡相关蛋白包括半14-3-3γ、乳糖凝集素7（Galectin-7）等，其中Galectin-7是凝集素家族中半乳糖凝集素重要成员。Galectin-7可在大部分的上皮组织中被检测，认为与上皮组织的分化和成熟有密切的关系，与表皮损伤后的再生与修复过程有关，可促进细胞的凋亡，同时对细胞的增殖、分化也有调节[8-9]作用。野生型p53介导细胞凋亡早期诱导出的蛋白之一是Galectin-7，因此，Galectin-7又称为p53诱导基因1（p53-inducedgene1，PIG1）。Galectin-7的[10]表达可加速细胞色素c的释放和上调JNK活性从而促进细胞进入程序化凋亡，说明Galectin-7可以抑制细胞的增殖。具体是凋亡还是增殖与其不同的组织定位有密切的关系，在关于儿童哮喘的研究中，Galecitn-7过表达可导致支气管粘膜的[11]凋亡。在外阴鳞状细胞癌的研究中，我们发现Galectin-7在外阴癌中低表达，进一步提示Galectin-7在外阴癌中的促凋亡作用减弱，从而促进外阴鳞癌的发展。对肿瘤细胞来讲，Galectin-7起到抑癌蛋白的作用。但也有文献报道Galectin-7在一些肿瘤细胞中高表达，如Galectin-7在咽喉部肿瘤细胞中高表达，并且与肿瘤的复发及不良预后相关联。如在乳腺癌的研究中发现，Galectin-7的过表达与乳腺癌去分化，侵袭与转移，甚至复发及耐药有密切关系。而且众所周知，基质金属蛋白酶9（MMP-9）被认为在肿瘤的侵袭性增殖尤其是转移中扮演着非常重要的角色，在乳腺癌的研究中，Galectin-7促进癌细胞的转移和侵袭，就是因为[12]Galectin-7直接诱导了MMP-9的过表达有关，也推测出Galectin-7还有其他途径的促进肿瘤细胞增殖的作用。Galectin-7是促进细胞凋亡还是促进细胞增殖，除了可能与组织器官的定位性差异有关外，还可能与Galectin-7本身的甲基化有关[13-15]。我们的研究结果显示：相对于NVS组织，Galectin-7在VLS组织中表达上调，结果有显著性差异。基于Galectin-7上调JNK及促进细胞色素c释放，促进细胞凋亡、并且可能通过非凋亡途径可能抑制细胞增生，推测在外阴硬化性苔癣组织中Galectin-7的过表达可能会促使表皮细胞凋亡增加，表皮细胞增殖变缓甚至受抑，导致表皮萎缩，变薄。而Galectin-7的过表达与真皮病变之间是否存在关系将在后面进一步研究探讨。细胞氧化还原蛋白有多个，其中典型的有过氧化物酶4（Prx4，Peroxiredoxin）及谷胱甘肽S转移酶P1（GSTP1，GlutathioneS-transferaseP1）。其中9 中国医科大学博士学位论文Peroxiredoxin(Prx)家族是一种新发现的抗氧化酶系，这种酶广泛的存在于各种生物体内，它可与H2O2结合，发挥抗氧化功能，保护组织和细胞免受氧化损伤，稳定细胞，抑制其死亡或进入程序性凋亡。除此之外，还具有直接促进细胞增殖，分化，细胞信号转导的作用。其家族中的Prx4是唯一定位于内质网的过氧化物酶家族成员，是内质网中H2O2的清道夫。细胞内许多正常的生理及病理活动均会产生活性氧，过多活性氧导致基因的错配，蛋白的损伤，释放细胞色素C，启动程序性细胞死亡，将会导致组织细胞损伤，出现疾病与衰老。因此，清除内质网中过多的H2O2，Prx4起主要作用。Prx4还可以通过减少ROS的产生以保护细胞免受辐射诱导的细胞凋亡的影响。目前还发现Prx4在许多肿瘤中呈高表达，如神经胶质瘤、[16-17]肺癌及乳腺癌。肿瘤细胞增殖活跃，会产生许多活性氧，反射性诱导Prx4产生，保护肿瘤细胞免受活性氧的损伤，从而保证肿瘤细胞的增殖。另有研究显示Prx4的过表达可通过减少肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL，TNF-related[18][19]apoptosis-inducingligand）抑制细胞凋亡。Kim等研究发现敲低胶质母细胞瘤细胞中Prx4的表达后可抑制瘤细胞的增殖。因此，可以推断出，Prx4有稳定细胞，抑制凋亡的作用。在我们的研究中发现，Prx4在外阴硬化性苔癣中呈低表达，一方面提示硬化性苔藓病变过程中各种细胞活动减少，处于低代谢状态，因此产生的H2O2少，反馈性引起Prx4生成减少，另一方面Prx4产生减少或生成障碍，导致组织细胞中H2O2堆积，导致组织细胞损伤，凋亡增加。研究表明氧化应激参与了外阴硬化性苔藓的发病，Prx4低表达致使硬化性苔藓病变中抗氧化能力降低，组织细胞损伤变性可能参与其中。另外根据文献报道各种对肿瘤细胞有杀伤作用的有毒物质可以被GSTP1所消除，因而一直被认为对肿瘤有保护的作用，也就是能抑制肿瘤细胞凋亡，反而促进肿瘤细胞增殖的作用。目前研究显示多种人类如乳[20-21]腺癌、胃癌和卵巢癌等多种恶性肿瘤细胞，其中GSTP1表达量明显升高。本研究结果显示GSTP1在外阴硬化性苔癣组织中表达下调，这表明它可能也参与表皮细胞增殖受抑制，凋亡增加的细胞活动。当Prx4及GSTP1同时减少，使产生的自由基、过氧化的脂质等毒素物质无法清除，从而加速表皮细胞凋亡增加，增殖受抑，导致表皮层萎缩变薄的发生。细胞外基质与细胞粘附相关蛋白有胶原蛋白作用结合蛋白（CO6A2）皮肤桥蛋白（DPTorDermatopontin）等。其中DPT是分布于细胞外基质物质蛋白（ECM）[22]中广泛存在的一种作用强大的相对小分子质量的蛋白质，可以和I型胶原蛋白、10 中国医科大学博士学位论文TGF-β、DCN等产生相互作用，具有诱导细胞之间黏附、胶原纤维最终形成等功能，在多种和细胞外基质有关的病理形成中发挥一定的作用。DPT最丰富的来源就是皮肤，它得表达与皮肤的弹性和胶原蛋白积累有直接关系。研究显示，DPT基因敲除[23]的小鼠并没有表现出任何明显的器官解剖结构异常，但与野生鼠相比，却表现出了显著的真皮层厚度减少和皮肤胶原蛋白的总含量减少，降低约40%。这充分表明充足的DPT在身体各部组织中，对细胞合成的胶原蛋白在细胞外的后装及合成胶原纤维，维持皮肤一定的韧性和弹性的过程中起着至关重要的作用。DPT还是纤维连接蛋白的天然激动剂，能够介导成纤维细胞和内皮细胞的迁移。通过α3β1整[24][25]合素促进细胞粘附。有研究发现DPT在口腔鳞状细胞癌中表达降低，且与淋巴结转移相关，提示细胞间粘附降低有关，因此，DPT可降低细胞间粘附进而间接参与肿瘤细胞的侵袭，并有助于恶性肿瘤转移。本研究发现DPT在外阴硬化性苔癣组织中表达下调，推测可能存在表皮中细胞间的粘附下降，抑制细胞的增殖，使上皮萎缩变薄。另外，在真皮中，DPT可以促进胶原原纤维的形成，减低新形成的胶[26][27]原蛋白纤维直径，与胶原纤维重排有关。在肥大性瘢痕和系统性硬化症病人皮肤真皮中成纤维细胞中均检测到DPT的mRNA水平和蛋白质水平的表达较正常皮肤真皮层成纤维细胞都有显著性的下降，肥大性瘢痕和系统性硬化症患者的皮肤均有皮肤弹性的明显降低。与此相似，外阴硬化性苔藓皮肤的弹性降低，可能与DPT表达减少有关。综上所述，DPT可能参与外阴硬化性苔癣病变的发生，导致表皮萎缩及真皮胶原结构异常的形成，致使局部皮肤弹性降低，挛缩。但DPT的低表达在表皮层及真皮层的具体作用机制还需进一步探讨。11 中国医科大学博士学位论文5结论5.1.通过差异蛋白质组学方法，筛选出92个与外阴硬化性苔癣病变相关的差异蛋白质，其中40个蛋白质在外阴硬化性苔癣中表达明显上调，52个蛋白质在外阴硬化性苔癣中表达明显下调。5.292个差异蛋白质功能涉及蛋白质转录与翻译加工蛋白、细胞骨架蛋白异常、促进细胞凋亡蛋白、第二信使、氧化应激的增强、细胞粘附、免疫反应等生物学过程，其表达异常与外阴硬化性苔癣病变发生相关。6附图表图1-1，鉴定出的92种蛋白质的功能分布比例图示12 中国医科大学博士学位论文图1-2，外阴硬化性苔癣组织（Cy3，A）和外阴正常皮肤组织（Cy5，B）2D-DIGE荧光染色图谱图1-3，激光鉴定后，数据库Galectin-7的搜索结果页13 中国医科大学博士学位论文表1-1，外阴硬化性苔癣组织中上调的差异蛋白质编号登录号蛋白质名称分子量得分值PI部位功能分组1gi|469939842ALBU_HUMAN7413171215.92细胞质结构蛋白2gi|21614499EZRI_HUMAN69484915.94细胞质结构3gi|70906435FIBB_HUMAN56577568.54细胞质细胞骨架4gi|70906439FIBG_HUMAN52106575.37细胞质细胞骨架5gi|4501883ACTA_HUMAN42381585.23细胞质骨架6gi|4826762HPT_HUMAN45861726.13细胞质结构蛋白7gi|4504349HBB_HUMAN16102836.75外分泌结构8gi|125797KV302_HUMAN11882698.7细胞质结构9gi|32189392PRDX2_HUMAN220491545.66细胞质抗氧化细胞膜10gi|115527062CO6A2_HUMAN1097091115.85细胞质骨架11gi|11321561HEMO_HUMAN523851396.55细胞质蛋白酶类12gi|62414289VIME_HUMAN53676885.06细胞质骨架13gi|182518FRIL_HUMAN200641875.51细胞质结构14gi|30584243PDIA3_HUMAN5714663/845.98细胞质蛋白酶类15gi|4503481EF1G_HUMAN504261236.25细胞核蛋白酶16gi|4503571ENOA_HUMAN4748163/987.01细胞质蛋白酶17gi|5902072SPB3_HUMAN44549796.35细胞质蛋白酶18gi|4502107ANXA5_HUMAN35971914.94细胞质增殖、凋亡19gi|6912286CASPE_HUMAN27949865.44细胞质凋亡20gi|4502133SAMP_HUMAN25485846.1细胞质凋亡21gi|4557581FABP5_HUMAN1549762/836.6细胞质代谢22gi|1703319ANXA4_HUMAN36088645.84细胞质增殖23gi|74739412ACTB_HUMAN42331985.91细胞质骨架24gi115387108GSTP2-HUMAN24014568.8细胞质蛋白酶25gi005549K2C10-HUMAN346471066.5细胞质结构26gi355728317TTHY-HUMAN89950635.14细胞质第二信使27gi|5031839K2C6A-HUMAN60293588.09细胞质结构28gi45079531433Z-HUMAN27899744.73细胞质生长，迁移，凋亡29gi47496673GRB2-HUMAN25304565.89细胞质增殖30gi4504985LEG7-HUMAN151231737.03细胞质，凋亡，分化（Galectin-7）外分泌31gi5729840S100A9-HUMAN103096596.38细胞质，迁移，分化外分泌32gi19913410MFAP4-HUMAN99551625.34细胞质结构33gi5031839S100A7-HUMAN60293678.09细胞质迁移，增殖34gi4557701S100A8-HUMAN48361704.97细胞质分化，迁移，增殖35gi47496673SODM-HUMAN25304965.89细胞质，氧化、应激14 中国医科大学博士学位论文36gi4503513EFTU-HUMAN36878765.28细胞核DNA合成37gi14251209CAGP-HUMAN27248855.09细胞质增殖38gi19913410MOES-HUMAN99551675.34细胞膜细胞运动，受体39gi47496673GELS-HUMAN25304565.89细胞质结构40gi355728317TREF-HUMAN899501465.14细胞质，运输，增殖外分泌表1-2，在外阴硬化性组织中表达下调的差异蛋白质编号登录号蛋白质名称分子量得分值PI部位功能分组1gi|11935049K2C1_HUMAN661701628.15细胞质结构2gi|27436946LMNA_HUMAN74380886.57细胞核结构3gi|4502101ANXA1_HUMAN38918836.57细胞质增殖4gi|4757756ANXA2_HUMAN388082077.57细胞质增殖，凋亡（AnnexinA2）5gi|397475051HSPB1_HUMAN22826605.98细胞质分子伴侣6gi|32698767ATP23_HUMAN28690568.3细胞质能量代谢7gi|87196339CO6A1_HUMAN1096021135.26细胞质结构8gi|74739412ACTBM_HUMAN423312085.91细胞质结构9gi150592EF1G-HUMAN20732854.85细胞质、增殖细胞核10gi704416ENOA-HUMAN49852987.26细胞质蛋白酶，增殖11gi|4502133SAMP-HUMAN254851096.1细胞质抗感染，结合补体，调节免疫；稳定DNA防止降解12gi5174447GNAZ-HUMAN35511567.6细胞核结构13gi19913410MYL9-HUMAN99551615.34细胞质结构14gi12025678S100A6-HUMAN44558564.63细胞质增殖，信号传导15gi355728317TERA-HUMAN89950615.14细胞质结构16gi297815186GRP78-HUMAN1897611116.08细胞质能量代谢17gi16507237ZN613-HUMAN72402565.07细胞质结构18gi5729877HSP71-HUMAN710821675.37细胞质分子伴侣19gi4557701K1C10-HUMAN483611654.97细胞质结构20gi12025678APOH-HUMAN105245725.27细胞质结构21gi117275SFTPD-HUMAN56251567.71细胞质细胞迁移22gi4505753PDIA1-HUMAN289001456.67细胞质氧化应激23gi32189394K2C5-HUMAN565251615.26细胞质结构24gi4502133SSX1-HUMAN25485626.1细胞质增殖25gi4503513ECHD1-HUMAN36878615.28细胞质代谢26gi15431310K1C14-HUMAN518721945.09细胞质结构15 中国医科大学博士学位论文27gi4885049APR3-HUMAN42334915.23细胞质结构28gi4557701K1C5-HUMAN483611144.97细胞质结构29gi3058455QCR1-HUMAN53297795.94细胞质能量代谢30gi20070125PA2G4-HUMAN57480604.76细胞质增殖31gi4503481EDEM1-HUMAN50429566.25细胞质增殖32gi30584243PSD13-HUMAN57146755.98细胞质代谢33gi5174447GBB1-HUMAN35511567.6细胞膜，信号传导细胞质34gi54540521433E-HUMAN27871804.68细胞质生长，迁移，凋亡35gi10863927ECHM-HUMAN18229597.68细胞质蛋白酶36gi115387108RAN-HUMAN24014748.8细胞核DNA合成37gi49456297PRDX4-HUMAN30749815.86细胞质抗氧化（Prx4）38gi23111005ATP5H-HUMAN28972715.38细胞质能量代谢39gi4504183GSTP1-HUMAN23569705.38细胞质抗氧化40gi10863927PPIA-HUMAN18229747.68细胞质蛋白修饰41gi30583991RABP2-HUMAN51087566.11细胞膜，运输维生素外分泌42gi4504986LEG1-HUMAN25263884.38细胞质，增殖43gi5729877HSP7C-HUMAN710822025.37细胞质，分子伴侣细胞核44gi4506017SPB-HUMAN36142785.3细胞质蛋白酶45gi117275SAHH-HUMAN56251577.71细胞质蛋白酶，修饰46gi49456298PRDX1-HUMAN22324678.27细胞质氧化、凋亡47gi70906439FABP5-HUMAN52106835.37细胞质代谢48gi4504517HSP90B-HUMAN83554974.97细胞质，分子伴侣细胞核49gi10863927PPIA-HUMAN182291914.7细胞质蛋白酶50gi4826643ANXA8-HUMAN37086565.56细胞质增殖51gi005545DERM-HUMAN346511066.5细胞质，细胞粘附、运（DPT）外分泌动52gi4504517HSPβ-1-HUMAN22826585.98细胞质分子伴侣16 中国医科大学博士学位论文第二部分部分差异蛋白的验证1前言论文的第一部分我们运用MALDI-TOF-MS质谱结合2D-DIGE方法分析比较并鉴定了正常外阴皮肤组织及外阴硬化性苔癣组织之间差异蛋白质组的构成，共得到92个差异蛋白质。虽然我们使用了技术相对成熟的2D-DIGE结合质谱的研究策略，但是，由于其实验方法的相对局限性，其结果是不是真实准确，还需要使用更传统的、准确性较高的分子生物学及形态学技术对其进行扩大样本的验证。在所有的差异蛋白质中，我们发现这些蛋白质的作用主要是于氧化与还原酶类、促进细胞凋亡的相关蛋白、细胞骨架蛋白和粘附与细胞间迁移有关蛋白这几类，这些蛋白质主要参与表皮层细胞的增殖周期有关，既细胞的凋亡增殖平衡相关联，与疾病的表皮层病理特征有密切联系。有文献报道，外阴硬化苔癣的表皮的细胞凋亡是疾病的病理基础，这与我们蛋白质组的研究结果分析出的蛋白功能一致。因此，在第一部分蛋白质组学结果中，根据差异表达倍数（得分情况）、数据库检索的Mascot分数、差异蛋白质的生物学功能及文献检索，我们选定下一步验证的4个蛋白质即Galectin-7，Prx4，AnnexinA2及DPT。其中Galectin-7属于以细胞凋亡为主的多功能蛋白，Prx4属于氧化还原酶能抑制氧自由基的产生，AnneA22+属于是一种磷脂结合蛋白Ca依赖，DPT属于细胞外细胞粘附相关蛋白。本部分采用最常用的组织内蛋白质检测方法，既Western-blot及免疫组化sp的方法扩大病例样本量数对前期蛋白质组学的研究结果中这4种已经检查出具有差异的蛋白质进行验证，同时了解这4个蛋白质在外阴硬化性苔癣及外阴正常皮肤组织中的定位及分布，从而进一步证实这些蛋白的改变与外阴硬化性苔癣的发生是否有关。2实验材料与方法2.1研究对象选取中国医科大学附属第一医院2010年3月至2011年9月住院的外阴鳞癌患者手术的癌旁组织5例，门诊活检取材10例，各种阴式整形术中剔除的多余外阴皮肤组织10例，肉眼及病理证实无异常。标本被分装成两个形式：一方面用10%的福尔马林固定后石蜡包埋，制成石蜡病理切片；另一方面存入深度-80℃冰箱保存为新鲜组织。开展实验前，用HE染色后，请两位有经验的病理医师再次确认确认证实为VLS和NVS。17 中国医科大学博士学位论文2.2实验方法2.2.1主要试剂兔抗人Galectin-7单克隆抗体（购于Abcam生物公司美国）兔抗人AnnexinA2单克隆抗体（购于Abcam生物公司美国）兔抗人Prx4多克隆抗体（购于Proteintech生物公司美国）兔抗人DPT多克隆抗体（购于Proteintech生物公司美国）鼠抗人β-actin单克隆抗体（购于SantaCruze生物公司美国）免疫组化SP法试剂盒（上海生工有限公司购得）DAB显色试剂盒（购自大连宝生物生物技术有限公司）辣根过氧化酶标识的羊抗IgG（购自上海生工生物技术有限公司）ECL试剂（碧云天上海生物技术有限公司购得）2.2.2主要仪器光学显微镜(Olympus，日本)AO切片机(promeger美国)恒温摊片烤片机(中国)微量加样器（加样枪）(Eppendorf公司德国生产)高压锅(中国红双喜)电泳及转印仪(Bio-Rad，美国)2.2.3实验方法及步骤2.2.3.1免疫组化采用免疫组织化学SP方法检测Gal-7，AnneA2，Prx4及DPT的表达（1）石蜡病理切片经脱蜡二甲苯两次，均脱蜡10min，经水化过梯度酒精，每次需10min，蒸馏水浸泡后，PBS浸泡洗涤3次，每次需5min；（2）蒸馏水和30%H2O2按9:1体积进行混合制成溶液，室温浸泡10min用来灭活细胞内源性酶，取出用蒸馏水浸泡洗涤3次，每次5min；（3）抗原热修复：将洗涤后的切片放入装有0.01M枸橼酸盐缓冲液（PH6.0）的小罐中，再置于高压锅中，高压高温上汽两分钟后迅速冷却，冷却后用PBS（PH7.2～7.4）洗3次，每次5min。（4）将玻片平置于湿盒中，标记笔画圈，羊血清封闭液滴加入圈中，室温放置30min。直接把多余液体甩除。18 中国医科大学博士学位论文（5）封闭后的玻片不洗，滴加经过稀释的一抗（DPT，1：100；Galectin-7，1：800；AnnexinA2，1：200；Prx4，1：200）于4℃冰箱过夜。（6）PBS洗3次，每次3min。（7）把生物素标记山羊抗兔IgG滴加在标本上，室温下孵育15min。（8）PBS洗3次，每次3min。（9）辣根酶标记链霉卵白素工作液滴加到标本上，室温下孵育15min。（10）PBS洗4次，每次5min。（11）滴加DAB溶液（每次使用前均需要重新配置），在镜下观察显色出现的情况（细胞内出现黄色斑点即为显色），显色后适时用自来水冲洗终止显色。（12）复染用苏木精，短时分化用盐酸酒精（3秒），返蓝直接用自来水冲洗。（13）梯度酒精脱水需经反向，再经过两次二甲苯透明，每次10min，玻片中央滴加中性树胶，盖玻片加盖最后封片。2.2.3.2Westernblot技术Western-blot测定正常皮肤组织和外阴硬化性苔癣组织中Prx4，Galectin-7，DPT及AnnexinA2蛋白的表达情况(1）组织蛋白的抽提分别取50mg新鲜标本组织，置于Eppendoff管中，加入裂解缓冲液，用小剪子冰上尽量剪碎后间断超声裂解，冰上静止30min。然后于4℃12000rpm低温高速离心机中15min，提取上面的清亮液体，遵照说明书（蛋白提取的试剂盒）操作，使用试剂盒（BCA蛋白浓度测定）测定提取的蛋白浓度，并绘制曲线。再用裂解缓冲液将所有样品稀释至同一浓度即5µg/µl，置于-20℃冰箱备用。（2）SDS-PAGE电泳1配置浓缩胶及分离胶。15%分离胶（15ml）30%丙烯酰胺7.5ml1.5mol/LTris-HCL（PH8.8）3.8毫升10%SDS0.15ml10%过硫酸铵0.15mlTEMED0.006ml19 中国医科大学博士学位论文dH2O3.4ml5%浓缩胶（5ml）30%丙烯酰胺0.66ml1mol/LTris-HCL（pH6.8）1.26ml10%SDS0.05ml10%过硫酸铵0.05mlTEMED0.003mldH2O3ml2处理样品：适量的上样缓冲液加入到组织蛋白中，100摄氏度水中持续10min。3在干净的电泳槽中加入电泳缓冲液，用加样器分别吸取14µl待分析样品加入胶孔。4接通电泳装置的电源，先把电压调定到电压为80V，当分离胶有溴酚蓝进入后，将提高电压至100V，维持此电压下电泳，直至分离胶的底部出现溴酚蓝后关闭电源，将胶取出。（3）转膜将硝酸纤维素膜贴于胶上，避免产生气泡，膜及胶两侧分别垫3张滤纸及海绵垫，放置于转移槽中，调整电压至70V，电转膜90分钟后断开电源，按照自上到下顺序把转移装置拆卸，按次掀去每一层的滤纸以及海绵。（4）Western杂交1用5%脱脂奶粉配置封闭液，将膜置于封闭液中，置于摇床上室温下进行封闭2hr。2摇床上用TBST洗涤3次室温条件，每次10min。加入一抗（稀释度为1：800）后用薄塑料膜封闭，4℃过夜。3摇床上用TBST洗涤3次室温条件，每次10min。加入二抗，室温条件孵育2hr后弃去二抗，摇床上用TBST洗涤3次室温条件，每次10min。（5）显色：将膜铺至发光仪中，将试剂盒（ECL）中的B液和A液按照等比例条件混合，滴加发光液进行发光显像并拍照。2.3结果判定免疫组织化学的玻片结果应用BX60万能显微照相系统（OLYMPUS，日本）进20 中国医科大学博士学位论文行图像采集，AnnexinA2，Galectin-7，Prx4及DPT都呈现为细胞质和细胞核/细胞质浆着色，阳性染色为棕黄色或黄色颗粒，分布于VLS的全部上皮层。积分光密度值测定利用显微图像分析系统MetaMorph（UIC/OLUMPUS.US/JP）进行，选取5个各不相同视野在每张切片上，统计出同一张切片积分光密度的平均值，平均值即为该组织中的表达水平，代表了切片组织中的阳性细胞。Westernblot结果通过应用QuantityOne软件进行条带灰度值的测量，从而进行半定量分析。2.4统计学处理所有的计量资料以均数加减标准差表示其结果，同时使用独立样本t检验进行检验。数据检验使用SPSS17.0软件处理，P<0.05被认为是有统计学意义。3实验结果3.1免疫组化检测结果3.1.1Prx4，Galectin-7，DPT及AnnexinA2在外阴硬化性苔癣和外阴正常的皮肤中的表达AnnexinA2，Galectin-7，DPT，Prx4显示为阳性细胞均出现在NVS组织的全部表皮细胞，呈细胞质和/或胞核染色阳性，在外阴硬化苔癣组织中阳性细胞表达也主要位于表皮层，而真皮层中基本无表达。其中Galectin-7在外阴硬化苔癣组织中显著高表达（P<0.05），DPT，Prx4及AnnexinA2在VLS组织中显著低表达（P<0.05）（表2-1）。这与蛋白质组学的研究结果一样。21 中国医科大学博士学位论文表2-1，Galectin-7，Prx4，AnnexinA2及DPT蛋白在外阴硬化性苔癣及外阴正常皮肤中的表达情况（光密度值s±x-）蛋白名称组织类别平均光密度值PGalectin-7外阴正常皮肤0.2409±0.0085外阴硬化性苔癣0.2631±0.0257<0.05Prx4外阴正常皮肤0.3451±0.0165外阴硬化性苔癣0.3370±0.0113<0.05AnnexinA2外阴正常皮肤0.2697±0.0065外阴硬化性苔癣0.2248±0.0088<0.05DPT外阴正常皮肤0.3748±0.0085外阴硬化性苔癣0.3211±0.0031<0.05B图2-1，Galectin-7在外阴正常皮肤（A）及外阴硬化性苔癣（B）中的表达（SP×200）22 中国医科大学博士学位论文图2-2，Prx4在外阴正常皮肤（A）及外阴硬化性苔癣（B）中的表达（SP×200）图2-3，AnnexA2在外阴正常皮肤（A）及外阴硬化性苔癣（B）中的表达（SP×200）图2-4，DPT在外阴正常皮肤（A）及外阴硬化苔癣组织（B）中的表达（SP×200）23 中国医科大学博士学位论文LSNLSNLSNLSNβ-actinGalectin-7Prx4AnnexinA2DPT图2-5，Westernblot法检测Galectin-7，Prx4，AnnexinA2及DPT在外阴硬化性苔癣及外阴正常皮肤中的表达。LS表示外阴硬化性苔癣组织；N表示外阴正常皮肤组织。图2-6，Westernblot法分析Galectin-7，Prx4，AnnexinA2及DPT在外阴硬化性苔癣及外阴正常皮肤中的表达，差异均显示出显著性的意义（*:P<0.01,**:P<0.05）。24 中国医科大学博士学位论文4讨论目前，比较蛋白质组学已成为研究疾病的最基础最有效的技术之一，尤其广泛应用于肿瘤组织相关蛋白的鉴定筛选及肿瘤的早期诊断。我们的研究在第一部分使用2D-DIGE联合质谱分析的蛋白质组学方法比较分析了VLS组织及NVS组织的蛋白质表达组谱，共筛出并鉴定了92个差异蛋白，其中40个蛋白质在外阴硬化性苔癣中高表达，52个蛋白质在外阴硬化性苔癣中低表达。它们的生物学功能包括细胞信号转导（第二信使）、促进细胞增殖、促进细胞凋亡、细胞粘附与迁移、氧化应激反应及细胞骨架蛋白。本部分选择细胞增殖与凋亡及细胞粘附运动相关的4个蛋白即Galectin-7，Prx4，AnnexinA2及DPT进行进一步验证。再使用Western-blot及免疫组化学方法验证验证鉴别所选的4个有代表性的有差异蛋白质表达是否与第一部分蛋白质组学结果一样，并且进一步地了解了这4个蛋白质在外阴硬化性苔癣组织及外阴正常组织中的分布和细胞定位，发现这4个蛋白质均分布在正常皮肤组织及外阴硬化性苔癣组织的表皮层，定位于表皮细胞的细胞质和/或细胞核，真皮极少表达。通过利用两种传统方法探查4种差异蛋白质在15例VLS组织中的确切表达状态，是否高于或低于NVS组织，初步考察外阴硬化性萎缩苔癣组织的可能的潜在致病机制。Galectins是一类碳水化合物结合蛋白具有进化保守性的，存在于各级动物中，分布十分广泛，到目前为止一共发现了15种。Galectins与许多重要的生物学功能有关，包括发育、分化、细胞粘附、细胞基质间的相互作用、生长调控、细胞凋亡、免疫调节等。其中Galectin-7是具有高度的组织特异性，属于半乳糖凝集素家族成员之一，上皮组织是其主要分布组织，尤其是具有角化功能的复层鳞状上皮细胞和各种良恶性肿瘤的实质细胞之中。Galectin-7是野生型p53介导的细胞凋亡通路中在早期就能诱导出的下游蛋白之一，因此又被称作为（PIG1，p53-inducedgene1）p53诱导基因1。Galectin-7最初的功能被认为是其表达可加速细胞色素c释放和上调JNK活性从而促进细胞凋亡，另外，Galectin-7除了细胞内诱导凋亡的作用，还具有家族其它成员一样的特性，既通过与细胞表面的糖蛋白/糖脂特异受体结合，开启凋亡作用从而抑制细胞进一步增殖。本研究结果发现Galectin-7在外阴硬化性苔癣皮肤组织中的表皮中表达显著高于外阴正常皮肤，表明Galectin-7可能参与外阴硬化性苔癣的表皮细胞凋亡，增殖受抑，导致表皮层萎缩。由于其促进细胞凋亡，并且通过非凋亡途径可抑制细胞增殖，25 中国医科大学博士学位论文因此认为Galectin-7具有抑制肿瘤发展的作用。与有些文献报道的相反在头颈部的鳞状细胞癌（头颈部皮肤癌，喉癌，舌鳞癌，基底细胞癌）中，乳腺癌，卵巢癌，胃癌中发现Galectin-7的过表达反而起到了促进肿瘤生长，侵袭转移的作用，这些可能与Galectin-7的组织器官定位差异有关，甚至与甲基化有关。此外根据8+文献报道，在体外实验中，发现Galectin-7可诱导T细胞增殖，其中以CD细胞[28-29]亚群的增殖为主，说明Galectin-7对免疫有增强的可能性。外阴硬化性苔癣得病理显示，在VLS真皮内有淋巴细胞与浆细胞浸润，文献报道而局部免疫增强可能是外阴硬化性苔癣发病机制之一，推测Galectin-7可能也参与局部免疫增强，导致硬化性苔癣的发生。但Galectin-7是上皮细胞合成的蛋白，是否对真皮的病变起一定作用，还需进一步的探索。过氧化还原蛋白(peroxiredoxin，PRDX)是存在于原核生物和真核生物中一类分布广泛的过氧化物酶，分属抗氧化自由基蛋白家族。目前探得6种蛋白属于哺乳动物的PRDX家族，命名PRDX1-6，是一类分子量很小的蛋白质。分子量为22-27[30]kDa。过氧化物酶4（peroxiredoxin4，Prx4）是一种能够普遍表达的抗氧化蛋白质，是唯一一个N端含有潜在分泌信号肽序列的成员，该信号肽便于Prx4定位于内质网，跨膜，以及便于分泌到细胞外，而Prx家族的其他成员都只定位于细胞内。Prx4在胞外空间通过清除ROS发挥抗氧化功能，该酶具有依赖硫氧还蛋白和谷胱甘肽的抗氧化活性，是H2O2介导的NF-κB信号激活的分泌调节因子；存在于胞质空间的Prx4被认为是一个NF-κB信号通路和c-JunN端激酶的硫氧还蛋白过氧化物酶相关激活剂，进而促进细胞增殖与分化，还可以保护细胞辐射后出现细胞凋亡被诱导增加的影响。研究显示Prx4的过表达可通过抑制肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL，TNF-relatedapoptosis-inducingligand）起到抑制细胞凋亡的作用。目前已发现Prx4在许多肿瘤中高表达，如神经胶质瘤、肺癌及乳腺癌。Kim等研究发现敲低胶质母细胞瘤细胞中Prx4的表达后可抑制瘤细胞的增殖。我们研究发现Prx4在外阴硬化性苔癣中显著低表达，表明Prx4对表皮细胞增殖的保护作用减弱，对细胞凋亡的抑制作用也减弱，从而导致表皮层的萎缩，变薄。膜联蛋白（Annexins）是磷脂结合蛋白超家族蛋白，是钙离子依赖的，160[31]种以上的该家族成员已经被发现，分别是为A、B、C、D、E5组。AnnexinA2是一种磷脂结合蛋白，是钙离子依赖，在多种组织和细胞，如人体内皮细胞、26 中国医科大学博士学位论文单核、多数肿瘤和骨髓细胞中表达，并且在持续增生和持续转化的细胞中过表达，[32]而在分化终末期的细胞中呈现减少表达的状态。AnnexinA2可以以单体、异二聚体、异四聚体等3种形式存在。AnnexinA2可以和S100A10连接成异源四聚体，参与生物膜相关的一系列活动，如胞吞，胞吐，跨膜转运及离子通道的活性[33]改变等。细胞胞膜表面的AnnexinA2蛋白还是受体，包括组织型纤溶酶激活物[34]（t-PA）和纤溶酶原（PLG），纤溶酶产生过多可以降解基底膜和细胞外基质，提示AnnexinA2在肿瘤的浸润生长中发挥了一定的作用。细胞内的AnnexinA2异源四聚体（A2t）可以联络中间纤维、胞质蛋白分子和细胞器，因而限制细胞的迁移运动，稳定了细胞骨架；AnnexinA2的C-端上的特殊位点结合F-肌动蛋白，诱使F-肌动蛋白结构发生改变，细胞伸出伪足，促使细胞发生运动，在细胞骨架[35]的重构中起到了重要的作用。AnnexinA2的C-端含有和mRNA结合的位点，AnnexinA2还可以以自身的一些模序或锌指结构与mRNA的多聚鸟苷酸（PolyG）[36]序列结合，调节多种蛋白的翻译过程，如c-myc基因，活化NF-κB。NF-κB和特定的DNA位点结合后，直接调控和参与多种其他基因活化情况，包括的转录增加、诱导蛋白翻译的增加，具有抗凋亡和促进细胞增殖作用。研究显示在肝癌、肺癌、胰腺癌、高分化胶质瘤、胃癌、急性早幼粒细胞白血病和原发性大肠癌等[37-41]多种恶性肿瘤中AnnexinA2蛋白均呈现出过量表达，在病毒转化细胞株和人类很多良性肿瘤中通常也可以观察到AnnexinA2的过度表达。本研究中，AnnexinA2在硬化性苔癣表皮中的表达明显低于正常皮肤组织，推测可能由于AnnexinA2减少，使表皮细胞的细胞膜功能降低，细胞稳定性降低，细胞重构，同时细胞核转录因子启动受抑，从而造成表皮细胞增殖受抑，凋亡增加，导致表皮层萎缩的发生。DPT在细胞外基质中广泛存在，是一种分子质量很小的蛋白质，但却有重要的生理作用。它同时是一种细胞外基质蛋白，却不是胶原单边，是从牛的真皮层[42][43]提取物最初提取得到，可以和DCN、TGF-β、I型/III型胶原等产生作用，具有促进胶原蛋白纤维形成、促进细胞间粘附等生理功能，在很多与细胞外基质形成及成分改变等生理和病理过程中发挥一定作用。在肥大性瘢痕和系统性硬化病灶中原代培养出的成纤维细胞中DPT的mRNA水平和蛋白质水平较正常皮肤中原[44]代培养出的成纤维细胞都有显著性的下降；皮肤桥蛋白基因敲除小鼠没有表现出任何明显的解剖异常，但比野生鼠的真皮层表现出显著的相对厚度减少和降低，27 中国医科大学博士学位论文[45]约40%的皮肤胶原蛋白的含量；体外研究发现，DPT可促进胶原纤维的形成，并使新形成的胶原纤维更加稳定。DPT还可以改变胶原纤维的直径，通过胶原纤维纵向和横向生长速率和(或)增加胶原纤维的总数量来使胶原纤维的直径减小。由此可见，DPT在促进胶原蛋白聚集以介导胶原纤维形成过程中和维持皮肤弹性中起重要的作用。各种实验，包括体内和体外，均表明DPT在胶原纤维的正常组装中通过调节胶原纤维的直径和结构来改变胶原纤维的形态，以改变皮肤的理化性质。这些均表明DPT对皮肤弹性和胶原蛋白积累形成胶原纤维起着至关重要的作用。我们的研究发现与正常的外阴皮肤组织相比，DPT在外阴硬化性苔癣组织中表达显著下调，使胶原蛋白的合成，在细胞外组装及基质等发生改变，可能参与表皮过度角化，真皮胶原玻璃样变、匀质化的形成等病理改变，进而导致病变皮肤弹性减低，外阴挛缩，阴道口狭窄等改变的发生。但我们的研究发现DPT减少的主要定位为硬化性苔癣的表皮层，真皮层基本无表达，那么表皮DPT减少是以何种方式和机制影响真皮层变化，以及是否还影响表皮层的萎缩还需进一步的探讨和验证。5结论5.1通过Westernblot发现Galectin-7在外阴硬化性苔癣组织中显著高表达，Prx4，AnnexinA2及DPT在外阴硬化性苔癣组织中显著低表达，其表达趋势和前期蛋白质组学研究结果相一致。5.2通过免疫组织化学技术验证发现与外阴正常皮肤组织相比，Galectin-7在外阴硬化性苔癣组织中显著高表达，Prx4，AnnexinA2及DPT在外阴硬化性苔癣组织中显著低表达，其表达趋势和前期蛋白质组学研究结果相一致。28 中国医科大学博士学位论文第三部分Galectin-7对外阴成纤维细胞的影响1前言外阴硬化性苔癣病变包括表皮病变和真皮病变，以往的观点认为表皮细胞的凋亡是外阴硬化性苔癣病变的基础，因此研究主要集中在表皮萎缩，角化过度。真皮的玻璃样变及胶原匀质化也是重要的病理标志之一，而针对真皮病变研究的较少。真皮层细胞功能的改变和细胞外基质的变化就是真皮病变的基础。真皮层中最主要的细胞成分是成纤维细胞，它最重要的功能就是合成和分泌各种类型的前胶原蛋白，分泌的前胶原蛋白形成真皮层中主要的细胞外基质成分。其中最主[46]要的胶原蛋白属Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白，占皮肤真皮胶原蛋白总量的95%以上，[47]Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的量及比例的改变可能成为真皮病变的发生基础。表皮改变与真皮改变相互影响，但其中主动与被动的相互关系及影响改变的方式等作用机制尚不清楚。我们假定表皮病变发生在先，推测并验证其对真皮的作用。在以往，鉴于Galectins族蛋白的多重角色，其细胞定位一直受到密切的关注。既往的普遍猜想是Galectins同时存在于细胞外和细胞内。尽管他们不是经典的分泌型蛋白，但Galectins确实可通过非经典分泌途径或是富含Galectins[48]的囊泡以及与细胞质膜融合的细胞衍生物形式被分泌到细胞外。因此，即使在正常患者和某种特定疾病患者的血清中，也能够检测到Galectins族蛋白的存在，被认为可以用到监测疾病消长的指标之一。由此，很多重组Galectins蛋白[49]被广泛用于研究各种体外疾病模型系统的建立中，用来对如碳水化合物有依赖性的细胞某种功能检测。前期蛋白质组学研究结果显示Galectin-7在外阴硬化苔癣中显著高表达，并且差异倍数超过2倍，免疫组化检测发现其在表皮中表达增强，真皮表达不明显。有报道称利用重组Galectin-7蛋白培养乳腺癌细胞中发现，乳腺癌细胞表面有糖蛋白依赖性受体可以与Galectin-7结合，刺激MMP-9的[46,50]产生和表达增高。因此，我们有理由推测表皮过度表达的Galectin-7可以以各种形式分泌到细胞外，到达真皮层，与真皮层的成纤维细胞结合，影响细胞的功能。本部分研究首次运用原代培养方法，分离正常外阴皮肤真皮层的成纤维细胞进行原代培养，探讨在不同的Galectin-7的培养基质浓度下，成纤维细胞的增殖情况。然后应用实时荧光Rt-PCR检测不同浓度的Galectin-7培养基中成纤维细胞合成的Ⅰ型/Ⅲ型前胶原蛋白mRNA的改变情况，研究Galectin-7对成纤维细胞的生长情况的影响及胶原蛋白合成与种属分布的改变。29 中国医科大学博士学位论文2实验材料与方法2.1研究对象选取一例中国医科大学附属第一医院妇科外阴整形手术切除的外阴正常皮肤组织。患者为34岁女性，无自身免疫等疾病。2.2实验方法2.2.1主要试剂胎牛血清（购自GIBCO公司）DMEM（购自GIBCO公司）胰蛋白酶粉剂（购自GIBCO公司）二甲基亚枫（购自GIBCO公司）丙酮（普通国产分析纯试剂）磷酸二氢钠（普通国产分析纯试剂）氯化钾（普通国产分析纯试剂）谷氨酸胺（购于SIGMA公司，美国）硫酸链霉素（购自齐鲁制药）青霉素（购自齐鲁制药）兔抗人波形蛋白抗体（购于GENETEX公司美国）Galectin-7蛋白（购自美国USCNK公司）TRIZOL（购于大连TAKALA宝生物合资公司、日本）Rt-PCR试剂盒（购于大连TAKALA宝生物合资公司、日本）无水乙醇（购自国产分析纯试剂）异丙醇（购自国产分析纯试剂）无核酶水（购自TAKALA公司）Taq酶（购于大连TAKALA宝生物合资公司、日本）DL2000（购于大连TAKALA公司、日本）琼脂糖（购自北京美华生物）10*buffer（购于大连TAKALA公司、日本）PCR引物（购自上海生工）2.2.2主要仪器超净工作台（苏州安泰公司）30 中国医科大学博士学位论文细胞培养箱（长沙天锦科技有限公司）倒置显微镜（OLYMPUS）细胞培养96孔板（Corning）细胞培养皿（Corning）酶标仪（Beckman公司）低温高速离心机（PROMEGA公司）恒温水浴箱（中国）琼脂糖凝胶电泳装置（Bio-Rad公司）凝胶成像分析系统（AlphaImage3400美国ThermoBrite）PCR仪（SIGMA公司）2.2.3主要实验溶液配制1.1*PBSNaCl8gKCl0.2gNa2HPO43.58gKH2PO40.2gddH2O1000ml定容2.DMEM培养基DMEM粉剂13.4gNaHCO33.7gddH2O1000ml定容CO2气体调节pH到7.2，分装后4℃保存。3.0.25%胰蛋白酶胰蛋白酶粉0.25g1*PBS100ml充分溶解后分装后放4℃储存。4.细胞冻存液DMSOlml小牛血清9ml混匀4℃避光保存。31 中国医科大学博士学位论文5.15%小牛血清的DMEM培养基(DMEM完全培养基)DMEM培养基185ml小牛血清15ml混匀即可，4℃保存。2.2.4实验过程2.2.4.1皮肤成纤维细胞的分离培养（1）尽量无菌条件下收集正常外阴皮肤标本，暂时将其保存于15%小牛血清的DMEM培养基（含有200U/ml链霉素，200U/ml青霉素双抗）中。（2）用PBS（含有200U/ml青霉素，200U/ml链霉素）充分洗涤皮肤标本到发白状态，再将皮肤组织浸泡于75%酒精中1分钟，迅速将收集到的皮肤转移至15%小牛血清的DMEM培养基中，把皮下多余的脂肪组织尽量减除，用眼科手术小3剪子将剔除了脂肪的皮肤尽量剪成小碎块，约1mm大小为止。2（3）细胞培养皿的预处理：在超净工作台中取无菌25cm的培养皿，用无菌毛细管滴加一层胎牛血清在培养皿的细胞培养面，再将剪切充分的皮肤组织小块用镊子转移至细胞培养皿底部，每个培养皿可以均匀接种30个左右的组织小块。（4）将接种组织块的培养皿置于5%CO2、37℃细胞培养箱中培养6小时后，向细胞培养瓶中补加1mlDMEM完全培养基，再培养2天，继续补加4mlDMEM完全培养基。（5）等从组织块中长出来的细胞形成单层贴壁生长后，可以将培养皿中的小组织块移至新的含培养基的培养皿中继续培养，充分利用组织块中的细胞。（6）弃去培养皿内液体，洗涤细胞3遍用无菌PBS，加入0.5ml0.25%的胰蛋白酶，消化作用1min左右，可见大部分成纤维细胞已被消化好，加入5mlDMEM胎牛血清完全培养基终止胰蛋白酶消化，将贴壁的细胞吹打成悬液，移至新的无菌培养皿中，可见新培养皿中的细胞主要为纤维样的细胞。（7）当贴壁生长的纤维细胞融合达到将近80~90%时，倒掉培养皿内培养液，洗涤3遍用无菌PBS，加入0.5ml0.25%的胰蛋白酶进行消化作用1min，然后在显微镜下观察，可以发现纤维样细胞形态以及细胞间隙变大，细胞皱缩，用5mlDMEM胎牛血清完全培养基终止胰酶，毛细吸管吹打细胞液至细胞彼此分散，按1：3比例传代继续培养。使用相同的做法进行细胞传代三次培养后，此时为纯化后的成纤维细胞，收集进行下一步实验。32 中国医科大学博士学位论文2.2.4.2皮肤成纤维细胞的波形蛋白检测（1）单纯观察细胞形态：在倒置显微镜下可以看到：细胞呈梭形或长梭形、甚至多角形，细胞核明显增大，呈椭圆形，核仁清晰，多核，一般含有2～3个核，细胞质透明。（2）将无菌盖玻片放进用DMEM完全培养基培养成纤维细胞的6孔板中让成纤维细胞爬片生长，观察细胞爬片占75%左右的时候，镊子钳出盖玻片后，洗涤细胞培养片3遍，用PBS，洗净胎牛血清。（3）吸净PBS，用2ml丙酮浸泡玻片，室温条件，固定15min。（4）吸净丙酮，用PBS，每次4mn。（5）0.1%Triton-100浸泡，室温条件下处理细胞玻片15min。（6）浸泡洗涤细胞培养片3次用PBS，每次4min。（7）使用现配置的3%H2O2成纤维细胞玻璃片以灭活内源性过氧化物酶活性。（8）吸去3%H2O2，浸泡洗涤细胞培养片3次用PBS，每次4min。（9）山羊血清滴加到玻片上室温条件下封闭作用10min后，直接甩除掉封闭液。（10）不用洗涤，直接按照说明书把兔抗人波形蛋白IgG抗体滴加到玻片上，4℃过夜。（11）把玻片从冰箱中取出后，把细胞培养片放进37℃孵箱，45min复温。（12）浸泡洗涤细胞培养片3次用PBS，每次4min。（13）按照说明书把HRP标记的羊抗兔IgG抗体滴加在玻片上，37℃孵箱，孵育20min。（14）浸泡洗涤细胞培养片3次用PBS，每次4min。（15）滴加DAB进行显色，浸泡洗涤细胞培养片用PBS10min。（16）将培养玻璃片放入自来水浸泡洗涤细胞培养片15min。（17）脱水、透明：梯度酒精70%、80%、90%、95%乙醇每次浸泡脱水分别1min，再用无水乙醇作用脱水3次，每次1min，二甲苯浸泡透明3次，每次1min。（18）封片：滴加中性树脂在玻璃片上，盖上载玻片。（19）显微镜下观察拍照。2.2.4.3MTS法检测Galectin-7培养液对人皮肤成纤维细胞增殖的影响（1）将已经传了3代的人皮肤成纤维细胞接种在96孔板上，按照细胞密度33 中国医科大学博士学位论文35×10/孔，正常培养24h。（2）将培养液依次换成不同浓度（0.2，0.5，1，2，5µg/ml）Galectin-7DMEM/F12培养液（含10%FBS），设置每组相对应的Galectin-7培养液组（背景消除组），每组设3个复孔。（3）48h培养持续后，每孔分别加入20µlMTS/100µl培养液，37℃避光继续孵育4h，然后用490nm处酶标仪检测每一孔的OD值。（5）根据OD值绘制增殖曲线。2.2.4.4实时荧光Rt-PCR检测成纤维细胞中Ⅰ型/Ⅲ型前胶原蛋白mRNA（1）引物合成Ⅰ型前胶原蛋白mRNA5'CCCCCTCCCCAGCCACAAAG3'5'TCTTGGTCGGTGGGTGACTCT3'产物：360bpⅢ型前胶原蛋白mRNA5'CCAAACTCTATCTGAA3'5'GGACTCATAGAATACA3'产物：449bpβ-actin（内参）mRNA5'ATCTGGCACCACACTTCTACA3'5'GTTTCGTGGATGCCACAGGCT3'产物：577bp（2）Trizol法提取总RNA8收集细胞0.4ml（细胞数约10），加1mltrizol，室温5min，加氯仿0.2ml，室温5分钟，4℃离心12000rpm，15min；转移上层水（0.5ml）相加等体积异丙醇（0.5ml），室温10min，4℃离心12000rpm，10min；弃上清，加75%乙醇1ml，4℃离心7500rpm，5min；弃上清，超净工作台内干燥30min（不能完全干燥）；加DEPC水20μl，保存于-70℃超低温冰箱中。（3）总体积20ul逆转录体系（按试剂盒说明书操作）：5*buffer4ddH2O834 中国医科大学博士学位论文dNTP2MgCl20.5MLV1.0随机引物1.5RNA342℃，55min。（4）PCR扩增PCR扩增过程:将上述处理后的DNA作为模板，特异性上、下游引物等进行PCR扩增过程。扩增反应体系总体积为20ul，具体反应体系（操作按试剂盒说明）：SYBR（2*）10.0上游引物0.4下游引物0.4ROX0.4ddH2O6.8cDNA2.0PCR反应条件：95℃预变性1min，95℃变性30s，44℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸5min，4℃循环，44℃0：30采集荧光信号。（6）PCR结果判定以无菌去离子水替代模板DNA的阴性对照组未检测到任何产物，绘制溶解曲线（附图1）。琼脂糖凝胶电泳相应位置是否出现条带，ΔΔCT法绘制扩增曲线（附图2），由此可以认为所设计的引物及使用的试剂正确，实验结果可信。2.3统计学分析所有数据均使用SPSS17.0软件分析，MicrosoftExcel软件绘图。P＜0.05认为有统计学意义。3实验结果3.1外阴正常皮肤组织成纤维细胞的分离、培养及鉴定情况3.1.1组织块接种法分离培养的成纤维细胞成纤维细胞呈细长梭形，纤维放射状分布于培养皿，部分细胞呈多核（图1）。35 中国医科大学博士学位论文图1，培养过程中的成纤维细胞3,1,2成纤维细胞波形蛋白的检测[54]成纤维细胞可以稳定的表达波形蛋白。从组织中分离培养的梭形细胞经过免疫组织细胞化学染色（图2），可见波形蛋白在细胞浆中呈现深浅不一的棕褐色，表明波形蛋白的细胞免疫化学为阳性，说明培养出并分离春华的细胞就是成纤维细胞。图2，波形蛋白免疫细胞化学为阳性鉴定成纤维细胞3.2Galectin-7对皮肤成纤维细胞增殖的影响当培养基中Galectin-7浓度小于5μg/ml时，促进细胞的增殖；当培养基Galectin-7浓度大于等于1μg/ml时，细胞的增殖反而受到了抑制（图3）。36 中国医科大学博士学位论文1.00.8**0.60.40.2Absorbance(490nm)0.00.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.0Galectin-7(μg/ml)图3，不同浓度Galectin-7培养液对人正常成纤维细胞的增殖影响曲线低浓度情况下促进细胞增殖，高浓度抑制细胞增殖3.3Galectin-7对皮肤成纤维细胞合成胶原蛋白的影响在Galectin-7作用下，成纤维细胞合成Ⅰ型前胶原蛋白mRNA改变不明显，合成Ⅲ型前胶原蛋白mRNA增加（P＜0.05）。随着Galectin-7浓度在培养液中的增加，Ⅰ型/Ⅲ型前胶原蛋白mRNA的表达比例逐渐下降（P＜0.05），如图4。图4，不同Galectin-7浓度培养液中成纤维细胞的Ⅰ/Ⅲ型前胶原蛋白mRNA。随着浓度的增加，成纤维细胞合成胶原蛋白增加，有显著差异37 中国医科大学博士学位论文4讨论成纤维细胞是一种支持细胞，存在于各种结构的结缔组织中，也是皮肤真皮层中众多细胞成分中最重要的部分，尤其是对细胞外基质成分的作用，主要功能就是分泌并合成各种类型胶原蛋白形成胶原纤维。其中，最主要的胶原蛋白就Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白，约占总胶原的95%。Ⅰ型胶原蛋白从结构发育来讲比较成熟，理化性质相对固定，在真皮中能够聚集成束，交织成网，带给皮肤机械张力与充[55-58]盈感，维持皮肤弹性，不易发生变性；而Ⅲ型胶原蛋白结构相对不成熟，是一种原始而幼稚的胶原纤维，是构成真皮中网状纤维的主要成分，易受到其他因[59-62]子的影响，发生蛋白的变性、交联、粘着，继而发生形态学的改变。在正常生理的情况下，随着年龄的增长，Ⅰ型胶原蛋白合成总量相对逐渐减少，而Ⅲ型[63]胶原蛋白合成相对逐渐增多，导致皮肤的弹性降低，充盈感下降。既往研究表明，Ⅰ型/Ⅲ型胶原蛋白的比例在人体的各个部位的皮肤，器官组织有较大的差异[64-65]，受各部位组织中成纤维细胞数量、功能状态的调控，本研究采取外阴正常皮肤组织进行原代细胞培养，以期望最大限度的模拟外阴皮肤病变的基础模型，探讨外阴硬化性苔癣真皮病变的相关因素。我们的研究结果显示，当培养液中的Galectin-7浓度小于0.5μg/ml时，促进了成纤维细胞的增殖，当培养液中的Galectin-7浓度大于1μg/ml时，抑制了成纤维细胞的增殖。高浓度的Galectin-7抑制细胞增殖，可能与具有其明确的促进细胞凋亡的机制有关。低浓度Galectin-7可以促进细胞增殖，可能是Galectin-7浓度较低时，进入细胞的量较小，因此本身的促进凋亡的作用没有显现，因此在细胞内在增殖与凋亡的平衡中，促进细胞凋亡的作用受到了抑制，增殖作用占据上风。我们在外阴癌的研究中也发现Galectin-7表达低于正常皮肤，[66]Galectin-7成为诱导细胞癌变的因素之一。有研究报道Galectin-7甲基化调控其蛋白的表达及作用，外源性Galectin-7的作用如何还处有待于进一步探讨[67-70]。根据我们的结果可以推测，在外阴硬化性苔癣的发病早期，真皮层的成纤维细胞可能有轻度的增生，而在发病晚期，真皮层成纤维细胞的增殖受抑，数量明显减少。在以往的报道中，针对VLS成纤维细胞在真皮层中的数量情况报道不一，增多和减少没有统一的定论，可能与此有关。由于最初在结肠癌细胞中通过野生型p53基因诱导凋亡的通路中，发现了Galectin-7是在较为靠前的位置中[71]出现，因此把Galectin-7的促凋亡作用广为认知。在正常皮肤组织中凋亡正38 中国医科大学博士学位论文是保持表皮完整的重要机制，同时有实验也验证了Galectin-7调控细胞凋亡的[72]能力在维持表皮稳态过程的中发挥了重要的作用。但Galectin-7抑制细胞增殖的能力也许并不总是通过其促凋亡功能实现，且并不局限于上皮组织。例如，Galectin-7能抑制神经细胞瘤细胞增殖，但在细胞中并没有发现任何凋亡的迹象[73]。在这种情况下，抗凋亡作用似乎是通过重组Galectin-7对于特异性胞膜糖[74]蛋白受体来介导的，并且在体外实验中被外源性Galectin-3抑制。又由于重组Galectin-7可以结合细胞表面受体的非还原性终末乳糖胺残留物及内部乳糖[46]胺寡糖残基，推测Galectin-7的潜在结合受体的数目可能比较大，无论是上皮细胞还是间质细胞。因此，在高浓度Galectin-7的培养基中，成纤维细胞的增殖是受到抑制的。然而，Galectin-7也可能通过抗细胞凋亡从而促进细胞增殖。在成熟的人类B细胞淋巴瘤中，也发现了Galectin-7的过度表达，但在普通B淋[49,75]巴细胞中却没有发现；在化学诱导大鼠乳腺癌模型中，相对于正常的乳腺组[50,76]织，Galectin-7在乳腺肿瘤中过度表达。因此，在低浓度Galectin-7的培养基中，成纤维细胞的增殖增加也可能是Galectin-7促进增殖的功能引起的。然而，在人体内是否存在这种Galectin-7浓度依赖的成纤维细胞异常增殖的情况改变，以及具体发生的机制还有待于进一步探究。我们的研究结果显示，当培养液中的Galectin-7浓度小于0.5μg/ml时，促进了成纤维细胞的增殖，继而PCR的结果显示Ⅲ型胶原蛋白的量也是增加的。当培养液中的Galectin-7浓度大于1μg/ml时，虽然抑制了成纤维细胞的增殖，而胶原蛋白的量仍然是增加的，提示Galectin-7可以直接或间接促进成纤维细胞合成胶原蛋白，且以合成Ⅲ型胶原蛋白为更多，I型胶原的变化不明显。Hashiomto[51]S等发现TGF-β通过JNK途径促进成纤维细胞转化为肌成纤维细胞的，同时[77]间质蛋白异常增多，最终导致肺间质纤维化。Galectin-7的表达可加速细胞色素c释放和上调JNK活性，推测Galectin-7在上调JNK活性的同时，在同一通路上间接的促进了成纤维细胞转化成肌成纤维细胞，进而使间质蛋白合成分泌增加[78]。而通过JNK通路引起的纤维化形成的结果，均以Ⅲ型胶原蛋白增加更为明显。我们的研究结果显示随着Galectin-7浓度的增加，成纤维细胞合成分泌Ⅲ型胶原蛋白逐渐增多，且Ⅰ型/Ⅲ型胶原蛋白的比例逐渐下降。I型胶原减少，III型胶原增多，是皮肤弹性减弱的因素之一，外阴硬化性苔藓病变表现为皮肤的弹性减弱，是否与Galectin-7诱导胶原蛋白分布异常有关，有待于进一步探讨。39 中国医科大学博士学位论文5结论5.1Galectin-7即可促进也可抑制外阴皮肤成纤维细胞增殖的作用。当培养基中小于0.5μg/mlGalectin-7的浓度时，促进细胞增殖。当培养基中大于0.5μg/mlGalectin-7的浓度时，细胞增殖呈抑制状态。5.2Galectin-7能使皮肤成纤维细胞增加合成胶原蛋白，以III型为更多，Ⅰ型/Ⅲ型胶原蛋白的比例有下降的趋势。随Galectin-7浓度增高，Ⅲ型胶原蛋白合成增多，而Ⅰ型/Ⅲ型胶原蛋白比例呈下降趋势。40 中国医科大学博士学位论文6附图ⅠβⅢ附图1，HFF，低Gal浓度HFF，高Gal浓度HFF胶原mRNA溶解曲线HⅢ-βLⅢ-Ⅰ附图2，HFF，低Gal浓度HFF，高Gal浓度HFF胶原mRNA扩增曲线41 中国医科大学博士学位论文本研究创新性的自我评价本研究是首次运用蛋白质组学技术对外阴正常皮肤组织及外阴硬化性苔癣组织进行差异蛋白筛选。本研究发现Galectin-7在外阴硬化性苔癣组织中显著高表达，Prx4、AnnexinA2及DPT在外阴硬化性苔癣组织中显著低表达。本研究发现Galectin-7既可促进又可抑制外阴皮肤成纤维细胞的增殖。小于0.5ug/ml的Galectin-7促进细胞增殖。大于0.5ug/ml的Galectin-7抑制成纤维细胞增殖。本研究发现Galectin-7可以改变成纤维细胞合成前胶原蛋白的量和比例。Galectin-7浓度越大，Ⅲ型胶原蛋白合成增多，Ⅰ型/Ⅲ型比例降低，可能成为外阴硬化性苔癣治疗的靶点。42 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中国医科大学博士学位论文综述外阴硬化性苔癣病因与Galectin-7的研究进展1.外阴硬化性苔癣外阴硬化性苔癣（VLS，vulvarlichensclerosus）是一种女性外阴皮肤粘膜组织发生白变，色素脱失为主要体征，逐渐发展成皮肤弹性改变的一种慢性妇科皮肤疾病，肉眼与外阴鳞状上皮增生很难区别，旧称外阴白斑或营养不良。以顽固性的外阴瘙痒和皮肤粘膜白变为主要临床特征，瘙痒的发生顽固，以夜间为重，皮肤白变面积逐渐在外阴范围增大，逐渐发展导致大小阴唇的萎缩融合，外阴阴道挛缩变形。VLS的病理特征最初的改变是基底膜水肿增厚，棘细胞层常有轻度不规则地增厚，黏膜下层失去原有的结构，纤维增生，真皮层可见大量的噬黑素细胞，真皮乳头变钝，胶原有轻度的均质化趋势，基底膜下和真皮内毛细血管减少，发生玻璃样变。密集的淋巴细胞沿基底膜及血管周围浸润。过度至晚期的VLS真皮明显萎缩，变薄，毛囊和末端汗管明显减少，呈角质过度角化表现，毛发营养不良，真皮层内明显变厚的胶原均质化，广泛的真皮硬化改变，血管明显减少，管壁硬化，真皮下有大量的淋巴细胞和浆细胞浸润。虽然经过大量的研究，但外阴硬化性苔癣的发病相关机制和确切病因仍不清楚，国际上没有统一的治疗标准，治疗效果不良，治疗主要针对止痒，病损既白变容易反复发作。很多[1]学者就该病的病因学和发病相关机制进行了大量实验研究，也提出过很多假说，从最初“瘙痒一抓伤一硬化性苔癣”机械性因素的发展模式，到自身免疫失调、体内雌孕激素水平异常、遗传因素、氧化应激平衡失调等多因素交互作用模式，其中自身免疫，尤其局部免疫增强在各种病因相关因素中都占有重要地位，并受到国内外广泛关注。1.1细胞周期调控目前认为VLS中表皮细胞凋亡是发病的基础，因此VLS表皮细胞存在凋亡和[19]增殖平衡紊乱，也就是说与细胞周期有关的蛋白和基因，包括P53、PCNA、Caspase-3、细胞周期蛋白Ki-67、PTEN、Caspase-4、P16蛋白等均在硬化性苔癣50 中国医科大学博士学位论文中表达异常。其中，病变组织中促进细胞凋亡的蛋白过度表达，使凋亡增加，而促进增值的蛋白低表达，增殖受抑制，因此造成细胞凋亡增加，增殖受抑，可能与发病有关。外阴硬化苔癣的上皮细胞中还可以见到很多促进细胞增殖的蛋白高表达，似乎与表皮凋亡相矛盾，但可能说明这类细胞潜在的恶性潜能。此观点也解释了外阴硬化性苔癣恶变为外阴癌的几率为4％～6％。但在外阴鳞状细胞癌的周边组织中，超过60％的几率可以检测到到硬化性苔癣的存在，常出现在正常皮肤与鳞状细胞癌交界区域。此外还发现表皮棘细胞层增厚，缺乏正常角质细胞结构分化，这一类型病损区域在慢性期可能活化，从而导致的细胞周期紊乱，参与硬化性苔癣的恶变。1.2激素因素本病可发生于任何年龄的女性，也可以发生于卵巢放疗后失去内分泌功能甚至双侧卵巢切除术后的女性，但绝经期前后妇女患病率明显高于育龄女性及幼女。[17]有报道，硬化性苔癣患者患病率调查显示，月经初潮前发病患者仅占9％，育龄期占4l％，绝经后占50％，幼年发病的患者至青春期后有自愈的趋势，提示本病与性激素可能有关。进而有学者对此展开研究，VLS患者的血清中双氢睾酮的水平明显低于正常同龄女性。即使使用睾酮外用治疗也会临床有效，还可以是血清双氢睾酮水平升高，更加印证了睾酮在疾病中的作用。患者病变局部组织中激素受体蛋白阳性表达的细胞数均有不同程度的降低趋势，而且随病变时间的延长而进行性下降，进一步表明性激素分泌水平，及局部受体代谢异常是可能的致病因素。另外，大量文献研究报道局部使用皮质类固醇激素和孕激素治疗也可以取得较好疗效。1.3遗传因素不少的报道提示硬化性苔癣发病趋势呈现一定的家族性，如母女、孪生姐妹、[18]姐妹同时患病，致使大多数学者都认为硬化性苔癣发病有一定的遗传倾向。有学者通过随访或回顾性分析发现，在硬化性苔癣患者的所有亲属中，直系亲属出现了硬化性苔癣新发病例，因此，有学者提出了硬化性苔癣为遗传性皮肤病的假说。但硬化性苔癣的HLA表现型，尚未达到统一观点。已经发现在患者体内出现率增高的基因有HLA-B40，HLA-AW31，HLA-B44，HLA-A29，HLA-DQ7，HLA-DQ8等，51 中国医科大学博士学位论文尤其与HLA-A29，HLA-B44相关，如果二者同时出现，则能显示出更强的相关性。在一些小样本的研究中发现VLS患者的HLA-DR11、DRl2和DQ7增高，DRl7不常见，HLA-DR、DQ抗原或其单倍体可能与VLS的易感性和保护机制有关。还有学者指出HLA-B08和HLA-B18并存在硬化性苔癣发展过程中可能起重要作用。1.4免疫因素1.4.1与全身其他系统自身免疫相关疾病的关系[2]有学者通过对硬化性苔癣进行大量临床和病理学研究，发现硬化性苔癣与由于细胞或体液免疫失调引发的自身抗体的形成和紊乱有密切相关，提示VLS发病可能与自身免疫有关，但VLS本身病程长短、损害的外阴部位及病损的严重程[3]度与自身免疫病无关。同时，文献也提示硬化性苔癣患者常合并有其他全身系统器官的自身免疫疾病，如斑秃、银屑病、自身免疫相关性甲状腺疾病、糖尿病、再生障碍性贫血等，尤其是免疫相关性甲状腺疾病和银屑病。1.4.2与T、B淋巴细胞关系[4]最初有文献报道，在对外阴硬化性苔癣的血清进行淋巴细胞亚型的检测，发现血清游离淋巴细胞CD3阳性和CD4阳性数量有明显降低，T细胞增加。还有少部分的患者虽然有T细胞总数的增多，但却表现出T细胞免疫有功能缺陷的血清学表现。[5-6]此外，硬化性苔癣被认为是一种生殖部位皮肤病由慢性局部淋巴细胞介导的，这种局部淋巴细胞介导可能是自身免疫源性的。外阴硬化性苔癣病理提示了受损部位的真皮层内会发生炎症改变，真皮匀质代下有密集的淋巴细胞和浆细胞浸润，血管硬化，炎细胞包绕和广泛的组织玻璃样变，引起受损皮肤的弹性改变。对于VLS的所有研究者，对那种免疫占主导可能有不同的见解，但唯一达成共识的是VLS为非瘤样性质。在硬化性苔癣活检组织，经过免疫组织化学分型淋巴细胞提示，患者病变组织中的CD2阳性、CD3阳性、CD4阳性、CD8阳性细胞比正常组织少，无自然杀伤CD56阳性细胞或B淋巴细胞（CDl9阳性、CD20阳性、CD21阳性）。表皮中的单核巨噬细胞数量与正常皮肤组织相同，但在真皮中单核巨噬细胞数量与正常皮肤组织有所不同。最新的研究针对细胞免疫对硬化性苔癣的研究取得进展。研究发现T淋巴细胞的局部聚集参与了硬化性苔癣发病过程，3+这类T淋巴细胞是与I型干扰素相关CXCR细胞毒性细胞。1.4.3与免疫反应类型的关系52 中国医科大学博士学位论文[7-9]有学者对收集了39名硬化性苔癣患者（8～80岁，中位数年龄50岁）的血清进行研究，通过检测出的88个免疫学参数指标来判定VLS发生可能得免疫学类型，如自身免疫抗体，细胞免疫，体液免疫和炎性反应。通过对所得到的数据分布的来进行比较判断，发现自身免疫抗体，细胞免疫，体液免疫和炎性反应的相关指标都是随机分布的，没有特异性的分布。即使从其他的方向分析，得到的结果也没有多大变化。但是，有些代表全身免疫参数出现了异常，提示当慢性患者逐渐出现明显的临床症状之前，可能已经存在相当长的一段时间系统损伤。这可能在外阴硬化性苔癣患者的病程中普遍存在的一种现象，病损局部皮肤，因为瘙痒过度搔抓引发的疤痕，可能只是一个局部组织反应，与免疫或其他过程导致原发损伤无关。1.4.4免疫调节剂治疗的作用免疫调节剂包含免疫刺激增强剂和免疫抑制剂两种。外用药物如二苯莎莫酮、二硝基氯苯，具有抗病毒的功能，也能治疗一些自身免疫皮肤。全身用药的如目前临床使用的受体激动剂：咪喹莫特和瑞喹莫德，具有双向调节的作用，可以用[12-13]来治疗具有免疫增强和免疫抑制患者的病毒感染甚至皮肤癌症。对外阴硬化性苔癣患者使用免疫调节剂进行免疫调节治疗，全身用药基本没有效果，局部使[14-16]用吡美莫司、环孢素A、他克莫司等免疫抑制剂可以改善外阴硬化性苔癣患者局部病损，且疗效显著。另外，还有长期交叉使用神经钙蛋白拮抗剂和强效类固醇激素来治疗硬化性苔癣的方法，可以非常有效的缓解临床症状和改善晚期患者的生活质量。1.4.5与自身抗体的关系有研究发现患者血清内游离的自身抗体数目增加，局部活检标本中的IgG，[10-11]IgM和C3沉着物较正常皮肤组织少。有文献报道硬化性苔癣患者中，高达80％患者抗细胞外膜蛋白自身抗体升高，还有约20％患者会出现甲状腺抗体升高。1.5感染因素有研究报道在外阴硬化性苔癣患者外阴病灶活检组织中可以检测到博氏疏螺[20]旋体，进一步检测患者，发现体内与病原体相对应的抗体滴度增高，针对性抗感染治疗，病损取得一定的疗效。还有人发现硬化性苔癣与慢性炎症会有相同的[17-23]细胞因子表达，如INF-γ，TNF-α，IL-α，IFN-γ等。但对于将感染因素列为外阴硬化性苔癣的一个病因，仍然存在很大争议。对于现在研究较多的另一个53 中国医科大学博士学位论文感染性病原体，HPV感染，被证实，与患病没有联系，即高危型HPV的感染与硬化性苔癣无关。另外，硬化性苔癣是否会通过接触、性及其他途径传播，对此尚无报道。还有医生在治疗硬化性苔癣时使用了肌内注射青霉素和头孢曲松，疗效被肯定，反证本病有感染的可能因素。1.6其他因素除上述因素，研究还发现细胞氧化还原平衡失调在硬化性苔癣患者体内存在，表现为抗氧化能力显著降低，脂质过氧化等产生的氧自由基造成硬化性苔癣的脂质、蛋白质、甚至DNA损伤，从而导致细胞功能损伤，甚至细胞凋亡，增殖受抑等出现可能为一种引发硬化萎缩变、免疫失衡和恶性变的新机制。其次，各种局部刺激作用于外阴后，引起外阴神经末梢纤维持续受到刺激，神经纤维的局部代谢物处于失衡状态，诱发局部皮肤顽固性瘙痒，通过反复搔抓引起炎症反应、表皮增生异常和神经变性，形成瘙痒一抓伤一苔癣样病变。除了上述的因素，多产，辣饮食，情绪变化，泌尿生殖道炎症，锌、维生素B1、B2等微量元素缺乏等等的因素也与本病的发生有一定的关联。总之，尚不能用某一单一的理论和病因学来解释外阴硬化性苔癣的发病，可能存在多种因素的混杂交叉出现，导致其发病机制的多变性。最终在治疗上也无法制定统一有效，复发率低的治疗方法及标准。目前能够达成共识的标准是，保守用药治疗为主，但随访观察中注意局部的变化，必要时复查活检病理，如有恶变，应积极手术治疗。2半乳糖苷凝集素-7半乳凝素是一种β-半乳糖苷结合蛋白属凝集素家族，涉及调节细胞与细胞之间和细胞与基质之间相互作用，参与细胞的生长分化、细胞间粘附、细胞信号传[22-25]导及凋亡；其中半乳糖苷凝集素-7(Galectin-7)，分子量为14kDa，定位于19号染色体，主要在复层鳞状上皮中分布。抗原定位于基底角质形成细胞，在底层也被发现，表达较少，集中在细胞与细胞接触的区域。它们的细胞定位以及其在角质形成细胞中的显著下调暗示了在正常生长控制所必需的细胞-细胞和/或细胞-基质相互作用中的作用。Galectin-7调控着上皮细胞的分化、发育和[23]迁移，在皮肤伤口和角膜的上皮愈合过程中也起着调节的作用，在肿瘤的发展[24]中因肿瘤的不同而起着正性或负性的调控作用。54 中国医科大学博士学位论文2.1结构特征GL按结构分成3类：（1）单一型，包括GL-1，GL-2、GL-5、GL-7、GL-10、GL-11和GL-13，分子中只有1个CRD，多以同质二聚体形式存在。（2）串联重复型，主要包括GL-4、GL-6、GL-8、GL-9、GL-12和CL-l4。（3）嵌合型，如GL-3，[23]具有特殊的嵌合结构，包含C端CRD和N端富含PYG串联重复序列的CRD。Galectin-7可与许多配体相结合，Mac-2BP（又称为90K）是一种高糖基化的分泌蛋白。Galectin-7可与T细胞表面CD3-TCR复合物的糖基相结合，Kopitz等[25,26]发现Galectin-7与成神经瘤细胞表面的神经节苷脂GMI配体结合后。2.2组织分布Galectin-7在人体组织中分布广泛，较为特异性的表达于角化上皮组织中，正常组织和异常组织中都有表达。Galectin-7在正常组织中几乎所有的复层上皮[27]细胞中都有表达，研究证明Galectin-7表达于发育完整的复层鳞状上皮各层，以表层较多，基底细胞层较少，在滤泡间表皮和毛囊外根鞘中表达，但不在毛发基质中，也不在皮脂腺中表达。它存在于食道和口腔上皮细胞，角膜，Hassal的胸腺小体中，但不存在于简单和过渡的上皮细胞中。因此，Galectin-7可以被认[28]为是角质形成细胞所有亚型的标记。也特异性表达于来源于外胚层非表皮上皮的复层区域比如乳腺、食道、胃和肛门直肠区域；来源于中胚层的气管的假复层[28]上皮、卵巢和宫颈的间质上皮有一定量的表达；而来源于内胚层的上皮例如小肠、肾、肺的年末上皮层基本无表达。在人的头颈部鳞状细胞癌、基底细胞癌、喉癌中均发现Galectin-7的表达，乳腺癌，胃癌，直肠癌，宫颈癌，卵巢癌，外[29]阴癌中均检测出galectin-7的表达；除了上皮来源肿瘤外，在淋巴瘤患者的淋[30]巴细胞中，脑胶质细胞肿瘤中也可以检测到galectin-7的表达。在一些非正常及肿瘤组织外，还在哮喘病病人的支气管粘膜上皮中，银屑病，肥大性瘢痕，肝[31-36]纤维化，光敏性皮炎，外阴硬化性苔藓等良性疾病中发现有异常的表达。甚至在一些基质变性性疾病中也能发现其的异常表达，如中耳炎的胆脂瘤沉积物，皮肤淀粉样变性的异常病灶中等。2.3作用及机制生理条件下，Galectin-7与多分化上皮细胞的分化和发育有关的不同事件作出贡献。它也与上皮细胞迁移有关，Galectin-7在角膜或表皮创伤的再上皮化过55 中国医科大学博士学位论文程中起着至关重要的作用。Galectin-7缺陷小鼠表现出降低的再上皮化潜力。这种影响可能归因于细胞迁移的缺陷。因为半乳糖凝集素7位于角质形成细胞的podosome中，从培养的皮肤外植体中迁移出来，可以推测出这种聚糖结合蛋白可能直接影响细胞/细胞外基质的相互作用。表明galectin-7可以调节角质形成细[37-41]胞凋亡，增殖和皮肤修复过程中的迁移。半乳糖凝集素-7与角质形成细胞发育中p53依赖性凋亡和增殖控制/分化的[42]发作相关。最初，许多研究表明Galectin-7具有与P53相关的促凋亡功能，在正常培养条件下，半乳糖凝集素-7转染的DLD-1（DLD-1-Gal7）细胞比对照转染子（DLD-1-V）生长显着更慢，进一步的研究发现，这种增殖的抑制是由P53强烈诱导Galectin-7表达导致，最近的证据表明，galectin-7被命名为p53诱导基因1（PIG1）的产物，是通过JNK激活和线粒体细胞色素c释放而调节细胞凋亡[43-46]的调节因子。说明，galectin-7最为一种促进凋亡的蛋白，可以抑制肿瘤的[47]增殖，起到抑癌蛋白的作用。针对宫颈癌的研究中，分别对宫颈癌组织及Hela细胞进行研究，均得到galectin-7能够抑制肿瘤细胞增殖的结果。同时galectin-还与预后，放疗敏感性及化疗效果有关，galectin-7和S100A9对宫颈癌有协同[38]保护作用，被认为是联合检测宫颈癌治疗后长期监测的新指标之一。Matsui等研究在顺铂处理后对具有不同P53状态的膀胱癌细胞系Galectin-7表达的研究中也同样证明了Galectin-7的促凋亡功能。而进一步的研究发现Galectin-7的这种促进凋亡的作用，依赖于顺铂能够诱导P53野生型的膀胱癌细胞系表达；而如果P53突变，这种诱导凋亡的作用将消失。Galectin-7除了作为一种新的线粒体[49-52]Bcl-2相互作用伴侣。进一步数据显示内源性Bcl-2与Gal7免疫共沉淀，并且重组Gal7直接与重组Bcl-2相互作用。一部分Gal7以Bcl-2依赖性方式组成性定位于线粒体，并使线粒体对凋亡信号敏感。显示Bcl-2/Gal7相互作用在遗传毒性应激后被消除。总之，我们的研究结果表明，Gal7与Bcl-2的结合可能构成增强内在细胞凋亡途径的新靶点。在一些体外实验中还发现Galectin-7与成神经瘤细胞表面的GMl配体结合，减少肿瘤细胞的增殖。然而，Galectin-7在不同组织类型的肿瘤发展中也起着正性调控作用，在头颈部鳞状细胞癌的研究中，包括头面部鳞状细胞癌，口腔鳞癌，喉癌的研究，均[53][54]显示galectin-7有促进癌发展的作用。在乳腺癌的研究中，galectin-7的过表达与乳腺癌的高侵袭性，转移与扩散，放化疗的不敏感及耐药，甚至高复发56 中国医科大学博士学位论文及预后不良有关。进一步的研究中发现，Galectin-7对乳腺癌及乳腺癌细胞高侵袭能力的调节可能主要是通过控制基质金属蛋白酶-9（MMP-9）基因的表达得以实现。相似的结果，在galectin-7与侵袭性淋巴瘤的相关研究中得到验证。同样的蛋白在不同的肿瘤中起到的作用不同，有正性调节，还有负性调节，除了由于组织分布的差异性以外，在一些实验中还看到，galectin-7的一些功能的体现还有[55]赖于galectin-7本身的甲基化的调节。我们在针对外阴鳞癌的研究中发现，galectin-7在高分化，早期癌组织中与外阴正常皮肤组织相比低表达，然而在低分化，晚期癌组织中却高表达。在低分化，晚期的高表达组织中发现，galectin-7的甲基化高于低表达的组织。因此说明，galectin-7对肿瘤增殖与凋亡的调节受几方面的调节，包括组织分布的特异性，P53的野生型与突变型的诱导，以及自身甲基化的调节。除了对细胞的生长分化的调节，galectin-7还作用与细胞与细胞之间，细胞与基质之间的调节。有研究表明过量的半乳凝素-7导致与表皮修复缺陷相关的粘[56]连连接处的不稳定。已经确定了半乳糖凝集素-7，肌动蛋白和细胞角蛋白作为皮肤局部淀粉样变的主要成分，表明在中性pH下释放的半乳糖凝集素7的胰蛋白酶肽可以通过半乳糖凝集素-7肽以及肌动蛋白和细胞角蛋白的调节导致在角质形成细胞凋亡过程中细胞内酸化条件下的皮肤局部淀粉样变的淀粉样蛋白原纤维形[57][58]成。Galectin-7在有流产史的妇女的子宫内膜中异常升高，免疫定位于合体滋养细胞，绒毛膜滋养层和腺体上皮在妊娠早期胎盘/蜕膜和合体滋养细胞和内皮细胞在足月胎盘，但在先兆子痫胎盘内皮染色缺席。Galectin-7可能是一种有用的胆脂瘤残留标志物，可以用这种免疫荧光方法进行观察。由于残余的胆脂瘤基质被认为是胆脂瘤复发的主要原因之一，因此在手术时用Galectin-7染色将是一种有助于完全去除残余物的有前途的方法。有研究者利用重组Galectin-7蛋白与纯化的T细胞共同培养，实验结果提示Galectin-7体外有促进T细胞的增殖的作++用，在进一步实验中，Galectin-7与抗CD3和抗CD28抗体产生了协同促进的作8+[59]用，淋巴细胞亚型为CD阳性为主，推测出其具有免疫增强作用。Rossi等的研究发现Galectin-7上的单个糖基识别位点能结合T细胞表面CD3·TCR复合物糖基，因此我们可以推测Galectin-7有类似抗CD3抗体的作用，与细胞表面复合物糖基结合，为T细胞活化提供细胞外入胞的第一信号。除了第二信号的活化外，尚不能够解释单用重组Galectin-7蛋白诱导T细胞的增殖，因此推测有其他可能57 中国医科大学博士学位论文的相关机制也参与其中。寻常痤疮患者的脸颊上中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白水平的比较显示显著降低。症状改善时的半乳糖凝集素-7水平显着高于研究开始时的水平。表明，一方面galectin-7可能有抑制局部免疫的作用，另一方面galectin-7还能促进皮损后皮肤细胞及基质的修复中起重要的作用。还有研究提[58-60]出重组人galectin-7杀死JurkatT细胞和人外周T细胞，表明galectin-7也具有免疫抑制性质。这与之前的研究有矛盾，也可能与组织的分布特异性和甲基化有关。总之，外阴硬化性苔癣是局部皮肤的系统性病变，表皮中凋亡与潜在的增殖癌变相制衡，真皮中组织中病理特征决定了其难以探究的特性，故很难获得确切的靶点来指导目前的临床治疗。随着人们不断深入的研究发现，外阴硬化性苔癣主要由于表皮层的萎缩，真皮层的纤维基质增殖异常，以及真皮下淋巴细胞的浸润。而Galectin-7的作用机制中有促进细胞增殖，凋亡，调节细胞基质及促进T细胞增殖的机制及其与T细胞亚群不同结合的能力。外阴硬化性太癣的病理基质与galectin-7的作用机制有较大的契合性。且可能为外阴硬化性苔癣的治疗提供新的靶点。针对外阴硬化性苔癣和galectin-7做一综述，同时进行针对性研究，探讨其间关系。参考文献[1]ValI，AlmeidaG.Anoverviewoflichernsclerosus[J]．ClinObstetynecl,2005,48：808-817[2]RegauerS，ReichO，Beham-SchmidC.Monoclonalgamma-T-celIreceptorrearrangementinvulvarlichensclerosusandsquamouscellcarcinomas[J]．AmJPathol,2002,160:1035-1045[3]HowardA，DeanD，CooperS．Circulatingbasementmembranezoneantibodiesarefoundinlichensclerosusofthevulva[J]AustralasJDermatol,2004,45:12-15[4]Foldes-PappZ;ReichO;DemelULackofspecificimmunologicaldiseasepatterninvulvarlichensclerosus[J]ExpmolPathol，2005，79：176—185[5]BirenbaumDL;YoungRCHighprevalenceofthyroiddiseaseinpatientswithlichensclerosus[J]．JReprodMed，2007,52:28-3058 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中国医科大学博士学位论文cervicalcancer.MedOncol.2014Oct;31(10):2083、ZhaoYi，WuXin；ExpressionofGalectin-7invulvarlichensclerosusanditseffectondermalfibroblasts.OncologyLetters.(accepted).20184、RenLina，ZhaoYi，WuXin；MiR-155-5ppromotesfibroblastcellproliferationandinhibitsFOXOsignalingpathwayinvulvarlichensclerosisbytargetingFOXO3andCDKN1B[J].Gene.653（2018）43-50二、科研项目1、国家自然科学基金课题：SDF-1/CXCR4/CXCR7在强制性运动疗法促进脑缺血后轴突再生中的作用及机制研究.编号81401002（2015.1-2017.12）经费23万元，第二负责人2、辽宁省自然科学基金课题：强制性运动疗法促进脑缺血后轴突再生的机制研究.编号2014021074(2014.7-2017.6)经费5万元，第二负责人64 中国医科大学博士学位论文致谢首先，我要衷心感谢我的博士导师武昕教授，她同时也是我的硕士导师，感谢她多年来的耐心，指引我进入临床及科研之门。无论在临床工作还是在科学研究过程中，导师严谨的治学态度，正直善良的人品，敏捷的临床逻辑思维，敏锐的科研洞察力及高尚的医德医风都使我受益终生，永远是我学习的典范。在此谨向老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意。同时要感谢中国医科大学附属第一医院妇科各位老师在我研究生期间给予我的指导和帮助，感谢产科各位同事在我求学过程中给予的各种关照和理解。也感谢在实验过程中给予我指导的中心实验室陈阳、于爽老师；喉癌研究室的关超老师；生理教研室的秦鑫老师；血液研究室的王玥老师。还要对所有关心、支持、帮助过我的师妹、师弟们表示诚挚的谢意。还要感谢孟涛主任及产科的同时们在我读博士期间工作的协调上给予了极大的关照。最后还要感谢我的家人，长期以来默默地对我的支持及鼓励。尤其是我的爱人，是神经内科的医生和教授，自己在繁忙的医疗工作，科研工作及教学工作之余，兼顾家庭，支持我最终完成博士学业。需要感谢的人还有很多，在不同的情况下，给予了我很大的帮助。再次感谢！65 中国医科大学博士学位论文个人简历姓名：赵毅性别：男出生年月：1980年4月民族：汉学习工作经历：1998年9月-2003年7月大连医科大学本科2004年9月-2007年7月中国医科大学硕士研究生2011年9月-2015年7月中国医科大学博士研究生2007年7月-2017年8月中国医科大学附属第一医院主治医师2017年8月至今东芬兰大学访问学者66
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