《小反刍兽疫病毒V蛋白拮抗干扰素介导的先天性免疫系统功能位点的确定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
、.-密级论文编号:中囯农典科学院学位论文*；小反刍兽疫病毒v蛋白拮抗干扰素介导的先天性免疫系统功能位点的确定IdentificationofAmino-acidResiduesintheVProteinofPeste-Des-Petits-RuminantsEssentialforInterferenceandSuppressionofIFN-mediatedInnateImmuneSystemA.'Wm/':n博士研究生：马旭升指导教师：才学鹏研究员申请学位类别：农学博士专业：预防兽医学研究方向：灵漱疫苗与分子兔^培养单位：兰w2015年5月 Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationIdentificationofAmino-acidResiduesintheVProteinofPeste-Des-Petits-RuminantsEssentialforInterferenceandSuppressionofIFN-mediatedInnateImmuneSystemPh.D.Candidate：MaXushengSupervisor：ProfessorCaiXuepengMajor：PreventiveVeterinaryMedicineSpecialty:Animalvaccine&molecularimmunologyMay2015 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知.除r文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果.也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的村料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意研究生签名时间：J月关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定.即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅.可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容研究生签名：时间：y//年/月，/曰导帅签名： 答辩主席 摘要小反刍兽疫（PesteDesPetitsRuminants，PPR）是由小反刍兽疫病毒（PesteDesPetitsRuminantsVirus，PPRV）感染引起的一种高感染性、高致死率疾病。PPRV感染严重损伤宿主动物靶器官，导致巨大的经济损失。目前对于PPRV的发病机制、感染损伤机制以及免疫抑制机制研究不多。本文利用荧光素酶检测发现,过表达西藏毒株PPRVV蛋白能够抑制干扰素的产生和干扰素的信号转导。通过缺失突变技术发现，V蛋白C端对于干扰素的产生起到关键作用。为探明V蛋白的C端抑制干扰素产生的分子机理，进一步采用PPRVV蛋白、V蛋白缺失和单位点突变体共沉淀RLRs通路中的MDA5、RIG-I模式识别受体。结果表明，PPRVV蛋白能够通过其C端的半胱氨酸残基结合MDA5，但对于RIG-I介导的IFN的产生没有影响，同时利用荧光素酶检测发现，V蛋白的C端可利用LGP2模式识别受体的协助，抑制RIG-I介导的IFN的产生。实验研究发现，PPRVV蛋白能够抑制IFN介导的信号转导，利用V蛋白及其突变体，通过荧光素酶检测、免疫共沉淀、pull-down、VSV-GFP感染复制等实验手段，证实PPRVV蛋白的C端抑制STAT2介导的干扰素的信号转导，而PPRVV蛋白的N端却抑制STAT1介导的干扰素的信号转导。深入研究还发现，PPRVV蛋白的C端利用其Cys残基和Trp残基结合STAT2，进而改变STAT2的亚细胞分布；PPRVV蛋白的N端利用Y110位氨基酸残基结合STAT1进而改变STAT1的亚细胞分布。本文深入研究了PPRVV蛋白引起宿主细胞先天性免疫抑制的分子机制，阐明了V蛋白在PPRV抑制RLRs介导的干扰素产生和干扰素介导的信号转导中的作用，为深入了解PPRV感染引起的免疫抑制提供重要的研究基础。关键词：小反刍兽疫病毒V蛋白，黑色素瘤分化分化相关抗原5，干扰素，信号转导和转录因子I AbstractPestedespetitsruminantsdisease(PPRV)isanhighlycontagious,andimmunosuppressivesmallruminantsdiseasecausedbyPPRvirus(PPRV).PPRVinfectioncausesseveredamagesinhostorgans.leadingcauseofdeathamongSmallruminantsincludingbothdomesticandwild,especiallyingoatsandsheep,alwayscauseseriouseconomicloss.AlthoughPPRV-inducedseveredamagesinhostorganshasbeenestablished,theunderlyingmolecularmechanismofimmunosuppressiveisstillunclear.ByluciferaseassaytheeffectofVproteinofPPRVplaysapivotalroleininterferingwithhostinnateimmunitybyblockingtheproductionofIFNsandIFNssignaling.WerevealedthecriticalroleofPPRVVinhibitsdsRNA-inducedIFNproduction.First,weconfirmedthatPPRVVanditsVCTdeletionmutationscanblockMDA5,notRIG-I,-mediatedIFNproduction.Second,wefoundthatLGP2asapositiveregulatortoinhibitRLRs-mediatedIFNproductionwhenover-expressionPPRVVprotein.Finally,byusingdeletionandsite-directedmutagenesis,weidentifiedthatCysacidresiduesclusterwerecriticalaminoacidsforV-inducedimmunosuppression.TofurtherinvestigatethemechanismofPPRVVinhibitsIFN-inducedimmuno-suppression,weusedPPRVVproteinanditsmutationsasbaittoscreentheeffectivesitesofVproteininSTAT-mediatedIFNsignalinginhibition.CysclusterandTrpacidresidueswereidentifiedasimportantsitesofCterminalofVproteininteractingwithSTAT2andY110acidresiduewasimportantsiteforNterminalofVproteintointeractwithSTAT1.Next,wefoundthatVproteinchangesthedistributionofSTATproteins.Takentogether,ourresultsrevealedthatPPRVVprotein,oneofthemajorinhibitortoblockinnateimmunity.MutagenesisdefinesthatCysclusterandTrpmotifofPPRV-VareessentialforSTAT-mediatedIFNsignalingandRLRs-mediatedIFNproduction.ThesefindingsgiveanewsightforthefurtherstudiestounderstandthedelicatemechanismofPPRVtoescapetheinnateimmunity.Keywords:PPRVV,MDA5,IFN,STATII 目录第一章引言...................................................................................................................................11.1国内外研究进展...............................................................................................11.2研究目的和意义............................................................................................241.3研究内容与实验路线设计.............................................................................25第二章PPRVV蛋白拮抗MDA5介导的IFNs产生的分子机制................................262.1前言.................................................................................................................262.2实验材料和方法.............................................................................................262.3实验结果.........................................................................................................312.4结论................................................................................................................40第三章PPRVV蛋白拮抗和干扰STAT蛋白介导的干扰素信号转导的分子机制413.1前言.................................................................................................................413.2实验材料和方法.............................................................................................413.3实验结果.........................................................................................................423.4结论.................................................................................................................49第四章全文讨论..........................................................................................................................50参考文献.........................................................................................................................................54附录..................................................................................................................................................69III 英文缩略表英文缩写英文全称中文名称cDNAComplementaryDNA互补DNACo-IPCoimmunoprecipitation免疫共沉淀dNTPDeoxynucleosidetriphosphate三磷酸脱氧核苷GST-Pull-downGlutathione-S-transferase-pull-down蛋白质体外结合实验IFNInterferon干扰素ISGF3Interferon-stimulatedgenefactor3干扰素诱导刺激因子3IPImmunoprecipitation免疫沉淀LGP2Laboratoryofgeneticsandphysiology2遗传学和生理学实验室基因2kDaKilodalton千道尔顿MDA5MelanomaDifferentiation-Associatedprotein5黑素瘤差异化相关基因5NF-κBNuclearfactorκB核转录因子PCRpolymerasechainreaction聚合酶链式反应PAGEPolyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳PBSPhosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液PNTNterminalofVproteinV蛋白的N端PPRVPestedespetitsruminantsvirus小反刍兽疫病毒RdRpRNAdependentRNApolymeraseRNA依赖的RNA聚合酶RIG-IRetinoicacid-induciblegene1视黄酸（维甲酸）诱导基因蛋白IRLRsRIG-IlikereceptorsRIG-I样受体RT-PCRReversetranscription-polymerasechainreaction反转录聚合酶链式反应STAT1Signaltransducersandactivatorsoftranscription1转录信号转导和活化因子1STAT2Signaltransducersandactivatorsoftranscription2转录信号转导和活化因子2TLRsTolllikereceptorsToll样受体VCTCterminalofVproteinV蛋白的C端IV 中国农业科学院博士学位论文第一章引言第一章引言小反刍兽疫（PestedesPetitsRuminants，PPR）又叫做假牛瘟(信爱国，2003)，是由小反刍兽疫病毒（PestedesPetitsRuminantsvius，PPRV）引起的能够导致小反刍动物发热、腹泻、肺炎、口炎等症状的一种烈性传染病。该病主要感染山羊、绵羊及小反刍类的野生动物，猪牛也可感染，而山羊高度易感。因此，世界动物卫生组织（OIE）将其列为A类动物疫病。该病1940年首次在象牙海岸被记述，1942年首次在非洲科特迪瓦发生，随后在中东一些国家发生。目前非洲国家和中东地区以及与我国接壤的南亚地区如印度、尼泊尔、孟加拉国、巴基斯坦和阿富汗流行该病(Alexopoulouetal.,2001,)。2007年我国首次在西藏山羊牧区检测到该病原，属跨境动物传播疾病，按照该病流行趋势以及周边国家频发的态势，该病对我国的威胁程度日益严峻。2014年在我国甘肃武威市古浪县发生严重疫情，说明该病在我国已经开始具有从西藏向内地扩散趋势。所以，该病的监控、研究、防治和消灭势在必行。而疫病的防控需以病原学的研究为基础。加强PPRV的基础研究，尤其在分子生物学、免疫学等研究将对于后期疫苗储备提供研究基础。1.1国内外研究进展1.1.1PPRV综述1.1.1.1PPRV分子病毒学PPRV被定性为生物操作安全级别为3的病原体，这节提供了PPRV的分子病毒学方面的概览。1.1.1.2PPRV的结构PPRV属于副粘病毒科麻疹病毒属单股负链无节段RNA病毒，其病毒结构与麻疹病毒（MV）、牛瘟病毒（RPV）、狂犬病毒（CDV）等相似。PPRV病毒颗粒被多面体晶体结构包裹，包含被RNP包裹的单链RNA（如图1A），全基因组为1.5Kb。PPRV基因组按照3′-N-P/C/V-M-F-HN-L-5′的顺序编码8个基因(如图1B)，PPRV颗粒直径大约400-500nm，较牛瘟病毒300nm稍大。作为麻疹病毒属一员，PPRV也遵循“6原则”，但是通过调节+1、+2和-1nt形成某种程度的变化，这个在麻疹病毒属中是一个特例。病毒基因组RNA被N蛋白（核衣壳蛋白）包裹，形成含有N蛋白、L蛋白和P蛋白的核衣壳复合体（RNP）。L蛋白为不依赖病毒RNA的RNA聚合酶（RdRp），P蛋白在L蛋白发挥作用过程中充当辅助因子。M蛋白起到链接N蛋白、F蛋白和HN蛋白的作用。与其它麻疹属病毒相似，PPRV能够编码两种非结构蛋白V蛋白和C蛋白。V蛋白通过P基因mRNA编辑形成。而C蛋白通过从P基因mRNA第二个起始密码子起始翻译形成新的蛋白。副粘病毒科的3′-和5′-UTR，作为基因组的启动子和抑制子，对于病毒复制和翻译至关重要。PPRV基因组3′端107个nts包括52nt的前导区和N基因3′UTR的碱基,具有结合RdRp聚合酶的位点，两者被GAA密码子隔开。3’-基因启动子（GP）和5’-抑制子（AGP）非翻译区在副粘病毒科病毒转录和复制过程非常重要(Gubbayetal.,2001)。一个基因起始和多聚腺苷化的信号存1 中国农业科学院博士学位论文第一章引言在于N基因开终止密码子下游的52nt处，这个信号在麻疹病毒属中高度保守(Baileyetal.,2005)。AGP负责起始合成反义基因组RNA，由位于L蛋白终止密码子后的5’UTR组成，包含一个来自负义RNA基因组3’端“尾巴”区。双向模式显示，两种不同的区域对于SeV功能的有效发挥是必须的（SeV同时具有GP和AGP区域，与PPRV相似）(Hoffmanetal.,2000)。在副粘病毒科中，基因组保守的3’和5’末端反映出,在这些区域,启动子活性具有相似性。据推测，PPRV3’末端23-31nts保守区能与三个六聚物基序（CNNNNN）组成的保守区相结合。目前，对于这两个区域的结合机制和具体功能尚不清楚，推测在第二个启动子元件的三个六聚物的基序位于第一个三串联六聚物基序同向的Helix之上(Gubbayetal.,2001)。因此，最大的可能是在GP和AGP存在的这两个区直接相互结合，形成一个功能型启动子单位(Murphyetal.,1999)。图1:(A)PPRV病毒粒子模式图;(B)PPRV病毒编码基因Fig1:(A)PPRVvirusstructurepattern;(B)EncodinggeneofPPRVvirus结构蛋白N蛋白N蛋白在不分节段负链RNA病毒中是主要的结构蛋白。虽然在PPRV的免疫原蛋白中丰度最高，但N蛋白不是诱导免疫保护的蛋白。其免疫原区在452-472位的氨基酸。除了免疫原外，2 中国农业科学院博士学位论文第一章引言N蛋白作为分型蛋白，可将PPRV分为四个型，能够更好的反映出该病流行的地理区域(Couacy-Hymannetal.,2007)。PPRVN蛋白ORF起始于108位UAC，终止于1685位AUU，蛋白大小为58kDa。基于PPRV和其它麻疹属病毒的序列相似性，N蛋白可分为四个区：I区：1-120aa非常保守，在组间相似性达到75-83%；II区：122-145aa只有40%的相似度；III区为146-398aa，IV区域为421-525aa(Baileyetal.,2005,Dialloetal.,1994)。Choi等人发现区I和II的免疫原性优于区III和IV。在麻疹病毒属中，N蛋白是主要的交叉反应抗原。N蛋白通过许多步骤影响PPRV增殖周期：结合M蛋白促进病毒富集、包裹基因组RNA、与P-L聚合酶复合体共同作用于基因组的复制和翻译。ServandeAlmeidaetal.发现，N蛋白在PPRV复制过程中可以抑制或沉默N基因(ServandeAlmeidaetal.,2007)，此过程中所有的病毒mRNA的合成都从N基因前端的启动子区开始。所以，认为N基因的表达将会降低病毒复制。研究进一步证实，N蛋白对于M蛋白的产量也起到负调控作用。N蛋白作用关键位点也被证实，在其5’-RRWYYDRNUGGUUYGRG-3’的核苷酸基序中，当R变为A/G，W变为A/U，Y变为C/U，D变为G/A/U，N变为任何一种碱基时，都能导致N蛋白抑制PPRV复制的失活。不同株型N蛋白，尤其是在N蛋白143-149aa位的RINWFEN（其中心部分NWF）非常保守(Keitaetal.,2008)。在麻疹病毒属中，N蛋白可分为“核心区(Ncore)”和“尾巴区（Ntail）”，核心区为420aa，非常保守，推测与核衣壳蛋白富集相关。PPRVN蛋白核心区的一个伸展序列：F-X4-Y-X4-SYAMG(X为任意氨基酸)，影响N蛋白自身或同RNA的结合。“尾巴区”为N蛋白的C端区（CTD），保守性相对较低，其488-499位氨基酸与N蛋白或其它蛋白如P蛋白或P-L复合体蛋白的结合相关(Karlinetal.,2002,Kingstonetal.,2004)。推测认为N蛋白的CTD位于病毒表面，非常容易被胰蛋白酶降解。参照麻疹病毒研究，缺失N蛋白CTD时，N蛋白核心区仍然可以形成核衣壳样结构(Giraudonetal.,1988)。Karlin等人在2002年发现，突变麻疹病毒(deYucatánetal.,)N蛋白的228S和229L能够导致N蛋白自我结合能力降低，进而不能够包装RNA。研究显示，N蛋白的正确多聚化对于RNA的结合非常关键(Karlinetal.,2002)。而分析PPRV和MV的N蛋白此处序列非常相似，推测PPRVN蛋白也可能具有相似功能。副粘病毒科病毒N蛋白可以富集宿主体内调节因子，例如能够结合热激蛋白Hsp72参与应激反应；结合干扰素调节因子IRF3，进而抑制IFN的表达，促进病毒的增殖等(Laineetal.,2003,Zhangetal.,2002)。N蛋白相互结合研究已经较为清楚，N端区（1-120aa）和中心区（146-241aa）参与N蛋白自我结合。121-145aa的区域对于核衣壳结构的稳定性至关重要。这些区域在麻疹病毒属中非常保守(Bodjoetal.,2008,Dialloetal.,1994)。PPRV的复制发生于细胞质中，N蛋白在组装成核衣壳样聚集体，形成非常粘稠的形状，可在细胞质和细胞核中观察到(Huberetal.,1991)。所以N蛋白中存在核定位信号（NLS）和核输出信号（NES）(Satoetal.,2006)。P蛋白P蛋白由PPRV1807-3333nts编码，大小为60kDa，但P蛋白在病毒感染感染细胞中,经过SDS-PAGE后迁移到79kDa。由于其酸性环境和转录后的磷酸化修饰，麻疹病毒属的P蛋白大小在72-86kDa之间不等(Dialloetal.,1987)。根据Netphos2.0预测，P蛋白有5个潜在磷酸化位点，分别是151、307、348、361、470位3 中国农业科学院博士学位论文第一章引言氨基酸。这5个位点在麻疹病毒属中非常保守，只是PPRVP蛋白的348位Thr被Ser取代。目前，对于P蛋白的磷酸化的作用还没有相关研究(Blometal.,1999)。虽然P蛋白或,V蛋白的磷酸化不是PPRV复制和转录的先决条件，但其相关信息的获得仍然具有科学意义。P蛋白具有多种功能，在MV中P蛋白与N蛋白的CTD结合，参与核衣壳组装及RNA复制和转录。本质上P蛋白较为松散和不稳定。这种快速转换的状态能够促进模板RNA复制和在复制中新生RNA的包裹。N和P蛋白的结合也需要关键的生物学过程如细胞周期控制、转录和翻译调节(Johanssonetal.,2003)。P蛋白N端1-59aa和C端316-346aa是N蛋白结合基序。P蛋白是病毒L聚合酶蛋白复合体必需的元件，推测是物种间跨种的重要因素(Rahamanetal.,2004)。M蛋白M蛋白ORF位于PPRV的3438-4442nts，由335aa组成，预测蛋白分子量为37.8kDa。目前认为M蛋白与肌动蛋白纤维丝运动相关，具有潜在的病毒富集位点和细胞转运位点，导致病毒的细胞膜顶端出芽(Riedletal.,2002)。M蛋白可与N蛋白结合。同样，M蛋白的细胞质部分也可与H蛋白或F蛋白结合(Baronetal.,1994)。目前证实，Nipah病毒M蛋白的FMYL基序是M蛋白定位于细胞膜和出芽过程所必需的(Ciancanellietal.,2006)。PPRV具有和Nipah病毒非常相似的位点，推测也可能存在这种功能。Takeda等人于2005年发现PPRV的M蛋白3’UTR能够上调M蛋白的表达。F蛋白F基因在PPRV的不同毒株中非常保守。其编码一个GC丰富的546aa的蛋白质，蛋白大小为59.137kDa。这种高度保守的序列导致麻疹病毒属种内和种间广谱的交叉保护作用。如抗RPV的疫苗可用来免疫保护PPRV感染。F蛋白和H蛋白都镶嵌于病毒脂质双分子层中，被包裹并形成突起物。在H蛋白辅助下，麻疹病毒属F蛋白作为细胞与细胞或细胞与病毒融合的促进子，通过病毒与细胞膜融合介导病毒侵入宿主细胞(Molletal.,2002)。F0是F蛋白前体，是麻疹病毒属病毒毒力的决定因素，F蛋白的功能主要取决于其被酶切的氨基酸序列以及细胞内酶切蛋白酶的酶切功效。酶切对于病毒的富集不是非常重要，但它是病毒感染性和致病性的先决条件(Watanabeetal.,1995)。F0经过酶切后形成两个活性部分：F1和F2，二者通过二硫键相联。分析显示，除两个可变疏水区外，F0的核苷酸序列在麻疹病毒属高度保守。第一个可变疏水区位于N端，其功能是牵引蛋白至粗面内质网进行翻译；第二个可变疏水区位于C端，具有锚定蛋白于细胞膜的功能。最近发现F0蛋白细胞膜内侧部分，可与M蛋白结合，促进病毒的出芽。该区域在PPRV不同毒株中高度保守，将此区域进行突变会导致病毒增殖的抑制(Meyeretal.,1995)。麻疹病毒属中F0的酶切位点为RRX1X2R(X1：任意氨基酸;X2：Arg/Lys)，PPRV的RRTRR位于F0的104-108aa处，能够被反面高尔基体关联的碱性氨基酸内切酶所识别(Chardetal.,2008)。锚定于细胞膜的F1亚基研究的较为清楚，F1具有四个保守基序：N端的融合肽（FP）、heptaderepeat1（HR1）、HR2和跨膜区（TM）。PPRVF1的3D结构显示，HR1-HR2复合体覆盖一个HR1的三聚体的内部核型，形成六个helix复合体（如图2）。一旦N端的FP锚定于细胞膜上，二聚化的HR区域通过拉近病毒与细胞膜的距离，从而导致细胞膜与病毒的融合(Rahamanetal.,2003)。大多数副粘病毒科病毒如SV5、NDV和PPRVF蛋白都具有一个相同结构的hepatedrepeat，这可能是它们具有相似融合机制的原因。副粘病毒科F蛋白具有一个亮氨酸拉链结构，在PPRV4 中国农业科学院博士学位论文第一章引言中位于F蛋白的459-480aa位置。这个基序能够促进F蛋白的寡聚化和融合功能，具体机制尚不清楚(Plemperetal.,2001)。F蛋白遭遇潜在的N-linked糖基化，在蛋白链的外侧加入寡聚糖，对于F蛋白转运到细胞膜表面至关重要，这样可以维持蛋白的融合能力和完整性。所有的麻疹病毒属成员的F2都包含一个保守的NXS/T（X任意氨基酸）糖基化位点(Meyeretal.,1995)，而PPRV的F2有三个N-linked糖基化位点：NLS、NIT和NCT，分别位于25-27aa、57-59aa和63-65aa。目前这些糖基化位点的功能仍不清楚。图2麻疹病毒Ｆ蛋白三聚体结构预测(Leeetal.,2007)Fig.2MeaslesvirusFproteintrimerstructure(Leeetal.,2007)HN蛋白HN蛋白或H蛋白是麻疹病毒属中保守性最低的蛋白，例如RPV和PPRV之间只有50%的氨基酸相同，这种高度的多态性反映出对于细胞的特异性。所以体液免疫检测主要识别的是HN蛋白(Renukaradhyaetal.,2002)。在PPRVNigeria75/1毒株中，HN的ORF从7326-9152nt，编码67kDa的蛋白。在MV中，H蛋白介导病毒与宿主细胞的受体结合，是病毒感染细胞的第一步,HN蛋白的N端通过二硫键形成同源二聚体，信号肽位于细胞质侧，而C端伸出于细胞膜的外侧(Vongpunsawadetal.,2004)。HN蛋白在麻疹病毒属病毒中是非常重要的抗原。Das等人于2000年设计了一个RPV的载体，用PPRV的HN或F蛋白替换RPV相应蛋白。结果发现，替换任何糖蛋白的RPV都不能被拯救，推测这种型特异性的糖蛋白之间的结合可能导致了病毒的入侵、富集和出芽(Dasetal.,2000)。只有同时替换PPRV的H和F才有可能拯救RPV病毒，且这种拯救的病毒在组织中增殖缓慢。尽管如此，该病毒诱导产生的免疫反应能保护山羊对PPRV野生株的感染。同时在研究中也存在着相反的结论，使用MV和RPV的H蛋白替换CDV的H蛋白能够拯救出病毒(Brownetal.,2005)。麻疹病毒属的H蛋白可以结合宿主细胞的的表面受体CD46和CD150（SLAM），进而侵入宿主细胞。在麻疹病毒属中，MV感染的细胞的表面受体CD46只识别疫苗毒株，而另外的SLAM受体（CD150）却能同时识别疫苗株和野生株(Tatsuoetal.,2000,Tatsuoetal.,2000)。尽管5 中国农业科学院博士学位论文第一章引言人类的SLAM和小鼠的SLAM结构和功能非常相似，但小鼠的SLAM不能够结合MV。所以推测SLAM受体的保守基序（58-67）对人类和小鼠起不同的作用(Onoetal.,2001)。PPRVSLAM的60和61位氨基酸已被鉴定，可能与PPRV对宿主的易感性密切相关。另外的研究显示，H蛋白有7个氨基酸残基对MV与SLAM的结合非常重要。其中6个（Y529，D530，R533，F552，Y553和P554）与PPRV相比非常保守(Vongpunsawadetal.,2004)。本实验室陈蕾等通过同源建模预测了PPRV可通过HN蛋白与SLAM结合，进而感染宿主细胞。为了验证PPRV的SLAM受体，Pawar等人在2008年使用siRNA技术将SLAM受体进行沉默，发现PPRV的复制降低了12-143倍，病毒滴度降低了12-190倍，证明SLAM可作为PPRV的受体(Pawaretal.,2008)。在有些副粘病毒科病毒中，糖蛋白不仅仅具有血凝素的功能，还具有神经氨酸酶的功能。在麻疹病毒属中，只有MV和PPRV具有血凝素功能(Sethetal.,2001,Sethetal.,2001,Varsanyietal.,1987)。PPRVHN蛋白是唯一具有神经氨酸酶活性的蛋白(Sethetal.,2001,Sethetal.,2001)。单克隆抗体鉴定表明，PPRVHN蛋白有两个功能域：263-368aa和538-609aa。目前认为麻疹病毒属HN蛋白，尤其是PPRVHN蛋白，不仅能结合于细胞膜表面发挥血凝素活性，同时可酶切糖蛋白的部分碳水化合物的唾液酸残基，这可能与HN蛋白结合F蛋白侵入细胞的模式相关。近期发现PPRV可通过其HN蛋白与Nectin受体结合，进而入侵宿主细胞，本实验陈蕾等人通过HN蛋白和Nectin复合体的同源建模，发现PPRV的HN蛋白可以通过其B5β折叠与Nectin的A’GFCC’C’’β折叠相互作用，进而达到病毒进入宿主细胞的生理过程。Nectin与HN的结合主要是两者形成了较多且稳定的氢键，主要包括Nectin的Gly31/Asp56/Lys48与HN蛋白的Ser548/Ser550/Ser502形成氢键，产生相互作用，此处的Ser502与Lys48之间形成的氢键由于疫苗株与野毒株在499Tyr（Glu）处的突变，导致疫苗株HN蛋白与Nectin的结合力较野毒株的强。同时，PPRVHN蛋白的Tyr541/Tyr543/Ile508/Gly465/Pro458/Leu466/Leu483/Leu500共同形成的疏水区与Nectin的Phe131/Pro132/Ala133共同形成的疏水区间形成较为稳定的氢键。综合分析表明，PPRVHN蛋白可通过与宿主细胞CD46、SLAM、Nectin三种受体结合方式，促进病毒进入宿主细胞，对于三种蛋白的利用效率仍有待于进一步的研究。L蛋白在麻疹病毒属病毒的蛋白中，L蛋白为6949nt，编码2183aa，是病毒中最大的蛋白。L蛋白最显著的特征是在麻疹病毒属中最保守，PPRV与RPV和CDV具有70.7%和57%的核苷酸相似(Baileyetal.,2005)。预测PPRV的L蛋白的分子量大小为247.3kDa。与其它的单股负链RNA病毒相似，PPRVL蛋白富含异亮氨酸和亮氨酸，占整个序列的18.4%(Muthuchelvanetal.,2005)。L蛋白形成聚合酶复合体，起到转录和复制基因组RNA的功能，包括起始、延伸、终止。L蛋白也参与病毒mRNA的加帽、甲基化和多聚腺苷化。PPRVL基因起始于AGGAGCCAAG基序，与一般麻疹病毒属的L基因的起始基序（AGG(A/G)NCCA(A/G)G）相一致。这个基序为L基因mRNA加帽提供信息。与其它麻疹病毒属病毒一样（除了MV），起始密码子侧具有Kozak序列基序（（A/G）CCAUG），该基序与翻译起始相关(Kozak1986)。研究负链非节段的RNA病毒发现，L蛋白可以分为三个独立部分，被两个可变区（607-652nt；1695-1717nt）相间隔。不同的区域具有不同的功能(Carteeetal.,2003,Maluretal.,2002)。在三个区域中，前两个区域为正电荷，后一个为负电荷。N端区（1-606aa）为RNA结合基序，其KEXXRLXXKMXXKM(X为任意氨基酸)基序高度疏水。在PPRV中，该基序为KETGRLFAKMTYKM，位于540-553aa的位6 中国农业科学院博士学位论文第一章引言置。此处的负电荷氨基酸可能与结合RNA的能力相关。N蛋白和P蛋白结合到RdRp复合体的位置也是负电荷。在PPRV中这个区域同样具有保守的多肽GHP（357-359aa），推测可能组成一个转角结构。第二个区域（650-1694aa），具有两个基序，771aa位（QGDNQ）和1464aa位（GDDD），这个区域推测为RNA聚合酶的功能位点(Blumbergetal.,1988)。五肽QGDNQ基序中的GDN三肽与+ssRNA的聚合酶的GDD三肽基序非常相似，在麻疹病毒属中这个基序非常保守。推测GDN序列与磷酸二酯键的形成、模板特异性以及阳离子结合相关(Muthuchelvanetal.,2005)。第三个区域具有ATP结合位点和蛋白激酶活性（氨基酸位置1799aa，基序序列为GXGXGX的赖氨酸富集区，在PPRV中为GEGSGS），但其功能尚不清楚(Blumbergetal.,1988)。Muthuchelvam等将麻疹病毒属的L蛋白分为六个区域，其中两个区域的相似度较低（607-650aa;18695-1717aa）（Muthuchelvanetal.2005）。麻疹病毒属L蛋白只有结合P蛋白才能发挥其RNA聚合酶功能，位于9-21aa的氨基酸序列ILYPEVHLDSPIV为P蛋白结合区(Horikamietal.,1994)。推测该区域被α螺旋和β折叠缠绕。Cevik等预测L2P4或者L2P8在RdRp复合体中非常关键。麻疹病毒属的P-L结合位点也非常保守，在PPRV中，除第一个氨基酸外，其余都相同(Chardetal.,2008)。辅助蛋白V蛋白V蛋白是P基因在RNA编辑时插入一个碱基G，导致密码子发生移位而产生的非结构蛋白。麻疹病毒属的编辑位点（-5’-ttaaaagggcacag-3’）是保守的，在PPRV中该位点位于P基因的751bp位，麻疹病毒属中V蛋白的长度不同：PPRV为298aa、CDV和RPV为299aa、MV和DMV分别为300和303aa。推测V蛋白分子量为32.28kDa。本研究发现，真核表达的V蛋白的分子量约为40kD，估计由不同预测软件预测的结果不同，或在宿主体内发生修饰，导致V蛋白分子量增大。V蛋白也是从P基因起始密码框开始翻译，所以拥有和P蛋白相同的N端，但插入碱基G后发生密码子移位。所以形成一个与P蛋白不同的富含Cys的C端。His和7个Cys通过与两个Zn2+结合形成锌指结构，该结构在拮抗先天性免疫中发挥重要作用。PPRV不同毒株V蛋白C端高度保守，这种转录后的编辑只发生在病毒感染的细胞(Mahapatraetal.,2003)。与P蛋白相似，通过Netphos2.0预测，V蛋白60%的Ser能够被磷酸化。这可以解释本实验表达的V蛋白大小在40kD左右的原因。V蛋白能够和N蛋白以及L蛋白结合，说明V蛋白参与RNA合成的调节(Sweetmanetal.,2001)。然而这其中的机理目前尚不清楚。Tober等人发现V蛋白能够促进病毒的复制，显示V蛋白参与转录过程(Toberetal.,1998)。非结构蛋白不仅在麻疹病毒属中保守，在副粘病毒科中也保守，这说明它们在各自种属中对于病毒的增殖和致病性非常关键。使用位点特异性突变和缺失病毒某种特定蛋白，利用反向遗传学工具，可进一步证实它们在病毒生活周期和致病性中所扮演的角色。一个非常显著的特征是V蛋白在先天性免疫中具有非常关键的作用，副粘病毒科的主要病毒都能够拮抗干扰素的活性，但不同病毒其机制不同。最初研究证实，缺失V蛋白或V蛋白Cys富集区的重组病毒体外增殖能力变弱。这可能由于V蛋白拮抗IFN的原因所致(Chambersetal.,2009)，后期发现V蛋白在拮抗先天性免疫过程中起至关重要的作用。C蛋白C蛋白从P基因第二个ORF起始，编码117aa的蛋白，分子量为20.11aa。在麻疹病毒属中，PPRVC蛋白与RPVC蛋白的长度一样，其它均不相同。C蛋白不能被磷酸化。MV感染细胞的7 中国农业科学院博士学位论文第一章引言细胞质和细胞核中都能检测出C蛋白(Bellinietal.,1985)。而在RPV感染的细胞中只能在细胞质中检测出C蛋白。在RPV中，C蛋白结合L蛋白，可以调节RdRp功能(Sweetmanetal.,2001)。没有研究发现其它病毒C蛋白能和病毒的任何蛋白结合(Listonetal.,1995)。推测C蛋白结合L蛋白是由于在磷酸化的pH环境中其高正电荷导致两者结合。目前研究显示，C蛋白可以抑制IFN-β的生成(Boxeretal.,2009)。由于C蛋白与IFN产生通路的转录因子结合，导致IFN产生的抑制。且不同毒株抑制IFN的能力不同。Patterson等也证实，C蛋白是MV感染和增殖的毒力因子(Baronetal.,2000,Pattersonetal.,2000)。1.1.1.3PPRV分型图3PPRV根据N基因分型结果Fig.3PPRVclassificationbasedontheNgene8 中国农业科学院博士学位论文第一章引言以PPRVN基因为参照，可将PPRV分为4支（图3）。象牙海岸附近区域为一支（LineageI），并从象牙海岸传播到苏丹，再通过苏丹传播至印度。目前，我国周边的很多国家都发生了PPRV感染。我国也于2007年在西藏地区首次暴发疫情，2013年我国甘肃再次发生PPRV疫情。从系统发育树的分类看，PPRV在我国可能会有蔓延之势。目前PPRV的进化研究不是很多，通过病毒序列的分析和跟踪，能够更好地了解疫情来源和流行趋势。麻疹病毒属中病毒对宿主感染性的差异与病毒F蛋白、H蛋白与细胞受体特异性结合密切相关。所以，将PPRV的F基因和H基因作为分类依据，可能会提供更好更多的信息，有助于PPRV的有效防控。1.1.1.4PPRV生活周期PPRV通过HN蛋白与宿主唾液酸受体结合后，病毒以胞吞方式进入胞内，并利用宿主细胞的蛋白元件进行复制和转录翻译。PPRV生活周期病毒复制第一步和最重要的一步是病毒与宿主受体的结合。PPRV通过HN蛋白与宿主唾液酸受体结合(Renukaradhyaetal.,2002)。Paward等人2008年通过siRNA干扰实验证实，SLAM为PPRV的结合受体(Pawaretal.,2008)。研究表明，通过抑制SLAM的表达可导致PPRV滴度的降低。将绵羊和山羊的SLAM受体表达于猴的CV1细胞中，重组的CV1细胞对PPRV具有高度易感性(Adombietal.,2011)。病毒HN蛋白同样可以通过与宿主细胞的CD46和Nectin受体结合，从而侵入宿主细胞。病毒与宿主的结合还可通过F蛋白介导的融合作用，导致病毒从核衣壳中释放N蛋白（如图4）。L蛋白作为RNA依赖的聚合酶，起始mRNA的转录。RdRp结合于基因组的启动子上，每个基因连接都有弱化作用，因为病毒的复制需要不同蛋白含量的相对恒定。对于N蛋白的mRNA，在基因组的N端，是需要最多的蛋白；然而L蛋白只需要非常少的量就能满足病毒基因组的组装。MV研究显示，假设N蛋白的量为100%，那么P、M、F、H蛋白的蛋白量大约分别为81%、67%、49%、39%(Horikamietal.,1995)。P蛋白与C、V蛋白的相对水平也被调节，编辑过程明显调节P蛋白和V蛋白的相对水平。事实上，负链RNA中，经常发生错误，形成单链或多链mRNA。负义RNA病毒典型的特征是，通过宿主的核糖体对产生的RNA进行5’加帽及3’加尾，目前对此机理尚不清楚。在感染的过程中，通过不是非常清楚的机制，病毒从转录开始转向复制，产生全长的反义RNA基因组，然后被N蛋白所包裹(Gubbayetal.,2001)。尽管RdRp从转录酶转换为复制酶的功能是复杂的，但是Kolakofsky等推测Sendai病毒RdRp存在两种不同的结构形式：复制酶形式和转录酶形式(Kolakofskyetal.,2004)。病毒的其它蛋白如M、N、P蛋白在活化的RdRp中的分布不能忽视。在MV中，M蛋白调节RdRp的功能，但这种调节作用不同于病毒富集和出芽中M的功能(Suryanarayanaetal.,1994)。其它麻疹病毒属病毒的M蛋白无此功能。病毒出芽则是利用神经氨酸酶酶切糖蛋白C端的部分唾液酸残基(Scheidetal.,1974)。9 中国农业科学院博士学位论文第一章引言图4PPRV感染宿主细胞的过程示意图Fig.4PPRVinfecthostcellsdiagramPPRV的增殖和传播PPR通过空气、分泌物、排泄物等与健康动物接触而导致传播，一般牧场都有可能发生。健康动物大概在10m范围内通过吸入感染动物喷嚏或咳嗽产生的飞沫而感染。感染动物也可通过母乳感染幼崽。研究表明，山羊感染PPRV后粪便中携带的HA病毒抗原达11周之久(Ezeibeetal.,2008)。与牛瘟相似，感染康复的动物具有非常强的免疫力，不会出现慢性或者携带PPRV的状态。尽管牛、猪、水牛和野生反刍动物都易感，但是只有野生反刍动物如白尾羚羊100%易感。目前其它动物中，该病的易感性、发病率和治病性资料甚少。1.1.1.5PPRV的免疫学及其免疫应答机理被动免疫被动免疫是将现成的抗体从一个个体转移到另一个个体。母系被动免疫就是一个例子，母系抗体转移到新生幼崽,形成对幼崽一定时间的保护。通过中和抗体和竞争ELISA抗体水平检测发现，感染PPRV或疫苗注射PPRV的怀胎母畜在初乳中的母源抗体对幼崽保护能达到3-4月(Libeauetal.,1992)。所以推荐的幼畜疫苗注射的时间为4或5月龄。有些研究显示，新生幼畜的免疫时间应该从3月龄开始(Couacy-Hymannetal.,2007)。这些差异可能是由于使用不同抗体检测手段所引起的，如前者使用病毒中和抗体检测，后者使用竞争ELISA。主动免疫主动免疫是对外界病原的免疫应答保护，最终产生免疫记忆细胞，从而保护宿主获得终生免疫。主动免疫可通过PPRV感染或PPRV疫苗注射动物使其产生细胞免疫和体液免疫应答。使用PPRV异源疫苗也可产生对PPRV的免疫保护，如使用RPV疫苗株。一项研究显示，用RPV的糖蛋白H和F，可以达到对PPRV的免疫保护，但病毒中和抗体只针对RPV(Jonesetal.,1993)。使用重组PPRV的HN蛋白免疫山羊可使其产生体液和细胞免疫，而且产生的抗体能够中和PPRV和RPV(Sinnathambyetal.,2001)。另一研究也显示，使用重组表达RPV的H或F的疫苗病毒不10 中国农业科学院博士学位论文第一章引言能产生中和PPRV的抗体，但能够保护动物出现临床症状(Romeroetal.,1995)。Mitra-Kaushik等用重组的RPV和PPRV的N蛋白免疫小鼠，研究体液和细胞免疫应答。结果显示，免疫应答同时具有抗体特异性和交叉反应。进一步的研究表明，小鼠和天然宿主共同具有保守的T细胞抗原决定簇(Mitra-Kaushiketal.,2001)。该抗原决定簇在所有麻疹病毒属中是保守的，这也解释了RPV和PPRV间产生交叉保护的原因。同样RPV和PPRV的H和HN蛋白具有相似的保守的T细胞抗原决定簇，这些决定簇位于保守的N端（123-137aa）和C端（242-609aa）。疫苗注射和野毒感染均可导致机体抗体的大量产生，抗体产生的保护作用可能只限于同源病毒。这意味着B细胞的抗原决定簇在麻疹病毒属中不是完全保守的。Choi等（2005）绘制了N蛋白主要的B细胞抗原决定簇，将N蛋白分为四个主要的抗原区：A-I、、A-II、C-I、C-II。并推测了HN的抗原决定簇，HN蛋白的单克隆抗体结合区为263-368和538-609aa。通过抗HN的单克隆抗体，利用血凝素和神经氨酸酶活性抑制实验可检测二者的活性(Renukaradhyaetal.,2002)。尽管PPRV具有高度免疫抑制效果，但宿主通过细胞和体液免疫产生的有效免疫应答清除免疫疫苗或感染病毒。T细胞和B细胞抗原决定簇主要拮抗N蛋白和HN蛋白，所以对于免疫学和免疫应答机理的研究有助于PPRV的疫苗研发和疾病防控。尽管PPRV感染或疫苗注射能够导致广泛的免疫抑制，但能诱导产生免疫保护从而防止PPRV的再次感染，甚至可以达到终生免疫。目前有许多的研究证实，PPRV能够产生免疫性B或T细胞抗原决定簇，至于体液免疫和细胞免疫的产生机理尚不明晰。因此，病毒蛋白导致的免疫抑制和涉及到的分子机制，对于PPRV的研究有非常大的空间。但目前尚缺乏合适的反向遗传操作技术，对研究这些机制产生非常大的障碍。已经有研究阐释了PPRV感染动物的细胞凋亡、免疫抑制、细胞因子、血液学和生物化学的变化。真核生物有不同的机制抑制病毒复制，如产生中和抗体、补体系统、细胞因子的产生。与其它细胞因子相比较，干扰素（IFNs）被认为是与抗病毒应答最重要的细胞因子。IFNs对于病毒复制起到直接的抑制作用，同时起到免疫刺激和免疫调节作用(Koyamaetal.,2008)。感染PPRV的动物与对照组动物相比较，其口腔、肺部、舌的上皮细胞内侧能产生较高浓度的IFNs(Atmacaetal.,2012)。宿主在免疫系统进化过程中产生了大量清除外源病原的途径，而病毒也在逃避免疫系统清除的不断进化中建立了自己的免疫逃避机制。1.1.2PPRV非结构蛋白拮抗干扰素（IFNs）的机制研究副粘病毒科病毒的V蛋白通过包括IFN产生和信号转导抑制(Didcocketal.,1999,Didcocketal.,1999,Heetal.,2002,Pooleetal.,2002,Wansleyetal.,2002)、宿主细胞凋亡拮抗(Heetal.,2002,Wansleyetal.,2002)、细胞周期改变(Linetal.,2000)、dsRNA信号转导抑制(Heetal.,2002,Pooleetal.,2002)等方式逃避宿主的抗病毒作用。V蛋白对IFN系统的影响研究的较为深入。许多的副粘病毒科病毒的V蛋白已经证实可直接干扰MDA5/LGP2/IRF3/STATs等蛋白的稳定性或功能，影响IFN的产生和信号转导。目前，在拮抗机制研究中证实，这些病毒在抑制宿主关键蛋白的过程中存在种属特异性。PPRV在免疫逃避过程中，利用V蛋白结合宿主免疫系统中的关键节点蛋白，进而抑制先天性免疫系统，为病毒增殖提供有利的外部环境。最典型的特征是PPRVV蛋白在抑11 中国农业科学院博士学位论文第一章引言制IFNs方面起非常关键性的作用。1.1.2.1国内外研究进展先天性免疫是宿主抗病毒的第一道防线，免疫系统通过宿主和病原体的“斗争”，不断进化。然而宿主免疫系统的进化也促进了病原体逃避免疫系统的进化。宿主干扰素系统和病毒抗干扰素系统的共同进化过程尤为明显。自1957年Isaacs发现IFN至今，IFN对于病毒感染后的清除占据非常重要的位置。早期主要集中于IFN对于病毒的清除作用，随着研究的不断深入，发现病毒也在IFN的压力下产生了许多逃避策略。病毒以多种方式逃避IFN应答，根据病毒调节的目标，将逃避策略分为三类：（1）抑制IFN诱导的抗病毒蛋白功能；（2）抑制IFN的产生；（3）干扰IFN的信号转导。(Alcamietal.,2000,Cebullaetal.,1999,Galeetal.,1998,Garcia-Sastre2001,Goodbournetal.,2000,Gotohetal.,2001,Haig2001,Kalvakolanu1999,Levyetal.,2001,Ploegh1998,Tortorellaetal.,2000)。第一和第二类在RNA病毒和DNA病毒中都存在，第三类只在有限的DNA病毒和少部分RNA病毒中存在。近年对于副粘病毒科ssRNA病毒的研究发现，许多病毒利用第三类方式达到逃避宿主免疫系统的目的。外界刺激（尤其病毒感染真核细胞）导致IFN分泌表达。IFNs被分为I-IFN（IFN-α/β）和II-IFN（IFN-γ）。病毒感染后多种细胞能够表达I-IFN，而II-IFN为活化T淋巴细胞和自然杀伤细胞诱导产生。胞内病毒复制和转录过程中产生的双链RNA能够诱导I-IFN的产生。副粘病毒科ssRNA病毒感染宿主细胞，病毒RNA释放到细胞质内，宿主细胞通过胞内的模式识别受体如MDA5、LGP2或RIG-I识别外来模式分子（分子病毒RNA），激活的模式识别分子结合线粒体上的MAVS蛋白，将信号转导至IRF3/7，最终激活干扰素调节因子形成异源二聚体，作为反式作用因子结合宿主细胞基因组IFN启动子区，导致IFN的表达，从而参与下游信号转导。IFN具有诸多功能，如干扰病毒复制、调节免疫应答（如激活主要组织相容性复合体（MHC）基因的表达，刺激NK细胞通过细胞因子介导的抗体依赖的细胞毒性作用(Herberman1997)）和抗病毒增殖。这些功能都需要IFN与细胞表面IFN受体结合，激活IFN活化基因（ISG）的表达。ISG活化后的产物包括dsRNA依赖的蛋白激酶PKR、2’-5’寡腺苷酸合成酶和Mx蛋白等抗病毒因子(Clemensetal.,1997,Silverman2007)。I-IFN结合IFN受体（IFNAR1/2两个主要亚基组成），受体胞内结构激活结合的JAK激酶，活化的JAK磷酸化下游的转录活化因子STAT1/2，磷酸化的STAT蛋白形成异源二聚体进入细胞核与IRF9形成ISGF3复合体，最终复合体结合到干扰素刺激应答元件（ISRE）启动区域，启动抗病毒因子的产生。核内的STAT蛋白发挥功能后被未知的去磷酸化酶降解，形成非活化状态的形式出核，然后进入再次循环。近年研究发现，STAT蛋白在胞质内被降解，但也有研究表明STAT蛋白被正调控(Colamonicietal.,1994,Davidetal.,1993,Haspeletal.,1999,Haspeletal.,1996,Kimetal.,1996,Leungetal.,1995,Lietal.,1997,Novicketal.,1994,Qureshietal.,1996,Shuaietal.,1993,Vealsetal.,1992,Yanetal.,1996)。研究副粘病毒科病毒和先天性免疫的关系最早源于细胞预感染的仙台病毒（SeV）或副流感病毒3型（PIV3），然后检测发现副粘病毒科病毒能够增强IFN敏感病毒的增殖。初步研究显示，副粘病毒科病毒具有使细胞对自分泌的IFN失去应答的能力。通过反向遗传技术研究发现，这种现象的分子机理与细胞的IFN信号转导途径相关。SeV感染能使人或者小鼠的细胞失去对IFNα/β12 中国农业科学院博士学位论文第一章引言的应答。通过mRNA或蛋白水平证实，SeV感染的细胞中与抑制ISG相关的因子有6-16、IRF-1、STAT1、STAT2、PKR和IRF9。在HPIV3、SV5、SV41、MuV等病毒中也发现有类似结果。IFN-α信号转导抑制只发生使用SeV/SV5前期感染的细胞。SeV感染先于IFN-α处理可以达到拯救VSV复制，且抑制宿主抗病毒的效果。如果在IFN-α处理后感染就不能达到这样的效果。SeV基因组中包含与PPRV相似的基因组成，学者通过紫外线（UV）辐射处理病毒颗粒，发现抗IFN的基因靠近病毒基因组的3’端(Yokooetal.,1999)。副粘病毒科的P基因就在3’端，且P基因能够通过mRNA编辑形成不同的蛋白。这说明P基因在病毒生存过程中是非常经济，且具有重要的功能。目前，学者逐渐着眼于P基因形成的非结构蛋白拮抗IFN的研究中。通过反向遗传技术，在不影响其它基因的基础上，构建C基因或V基因敲除的重组SeV。此时SeV不能产生C或V蛋白(Katoetal.,1997,Katoetal.,1997,Kurotanietal.,1998)。构建的病毒能和野生型病毒一样表达、复制和致细胞病变，但重组病毒在体内的复制能力和致病性明显降低(Delendaetal.,1998,Katoetal.,1997)。同样，缺失C基因的病毒增殖非常困难(Hasanetal.,2000,Kurotanietal.,1998,Latorreetal.,1998)。这些研究表明，V蛋白或C蛋白参与宿主先天性免疫，包括IFN的调节。与呼吸道病毒属病毒不同，腮腺炎病毒属病毒不表达C蛋白。通过SV5研究发现，病毒颗粒拮抗IFN信号转导，STAT1蛋白水平在感染后的4h下降，并最终消失。这种现象能被蛋白酶抑制剂MG132或lactacystin.抑制。通过重组SV5V蛋白的Senlikiforest病毒，感染2fTGH细胞显示相似的STAT1降解现象。瞬时表达SV5V蛋白可导致IFN-β启动子应答抑制。SV5V蛋白降解STAT1，并拮抗IFN信号转导。这些说明V蛋白通过结合STAT1而导致STAT1降解，最终抑制IFN信号转导(Andrejevaetal.,2002,Didcocketal.,1999)。其它的腮腺炎病毒属病毒如MuV和SV41也存在降解STAT1的现象(Fujiietal.,1999,Kubotaetal.,2001,Nishioetal.,2001,Yokosawaetal.,1998)。值得注意的是，腮腺炎病毒属的hPIV2病毒颗粒感染宿主细胞不能降解STAT1，而是通过降解STAT2达到拮抗IFN的效果。不仅抑制IFN-α/β信号转导，还可抑制IFN-γ的信号转导。单独表达hPIV2V蛋白能够导致STAT2的消失。敲除V基因的重组hPIV2病毒感染CV1和FL细胞后病毒增殖能力明显减弱。副粘病毒科病毒的V蛋白和P蛋白N端相同，但高度保守且富含半胱氨酸，C端却与P蛋白不同。在明确了V蛋白可拮抗IFN后，研究集中在讨论V蛋白哪个区域在抑制IFN的过程中起关键作用。通过构建表达MuV或hPIV2V蛋白C端的细胞系，发现细胞系可抑制IFN的刺激，而且STAT1/2降解消失，与完整表达V蛋白的效果一致。同时，表达这两个病毒V蛋白的N端失去了拮抗IFN的能力。P基因与V基因含有相同的N端，通过表达SV5-P蛋白不能抑制IFN的活化(Didcocketal.,1999,Kawanoetal.,2001,Kubotaetal.,2001,Nishioetal.,2001,Parisienetal.,2001)。但是在有些病毒中发现，N端也能够调节IFN的信号转导。以SV5CP+毒株为例，其V蛋白N端26位由Tyr变为His、50位由Leu变为Pro、102位由Leu变为Pro后，丧失了抑制IFN的能力(Baumgartneretal.,1987,Chatziandreouetal.,2002)。在麻疹病毒属中，细胞持续感染野生型MeV或来自全脑炎硬化的MeV，发现IFN-α诱导下产生的2’–5’OAS非常少。这说明MeV也具有抑制IFN信号转导的功能，但实验室传代的毒株和临床分离的MeV产生IFN-α/β的能力也不相同(Fujiietal.,1999,Fujiietal.,1990,Nanicheetal.,2000)。以上表型研究说明，副粘病毒科V蛋白在病毒逃避先天性免疫应答过程中起非常重要的拮抗作用。这种拮抗形式主要分为两类：（1）V蛋白抑制IFN产生的上游通路，根据PAMPs的不13 中国农业科学院博士学位论文第一章引言同主要分为抑制RIG-I样受体通路或RLRs样受体通路；（2）V蛋白抑制IFN诱导的信号转导。1.1.2.1.1副粘病毒科病毒V蛋白抑制IFN的产生RLRs通路的关键蛋白结构与功能先天性免疫系统能通过模式识别受体识别外源病原体(Kumaretal.,2009,Takeuchietal.,2010)，诱导宿主细胞的免疫信号活化，最终导致炎症因子的上调及抗病原因子的表达(Janewayetal.,2002)。模式识别受体是免疫系统中细胞表面识别外来病原的特殊分子，主要由Toll样识别受体（TLRs）、RIG-I样受体（RLRs）、NOD样受体（NLRs）组成(Takeuchietal.,2010)。2004年，RLRs首次被作为识别外源病原核酸RNA诱导先天性免疫应答的受体(Yoneyamaetal.,2004)。RLRs包括黑色素瘤分化相关基因5（MDA5）、视黄酸诱导基因I（RIG-I）、遗传学和生理学实验室蛋白2（LGP2）(Yoneyamaetal.,2004)。在黑色素瘤细胞中发现，MDA5能诱导蛋白酶C激活的mezerein表达，并且发现MDA5参与细胞凋亡；抑制肿瘤的增殖和生长。MDA5可被caspase剪切，然后进入细胞核，加速核内DNA降解。同时过表达MDA5能够诱导IFN的产生。所以外源微生物可通过抑制MDA5的功能，达到逃避先天性免疫的目的。RIG-I同样识别外源病原核酸，从而启动先天性免疫应答。一系列的结构研究阐述了dsRNA的识别机制及活化RIG-I的机制。RLRs属于超家族2解旋酶，含DExD/Hbox解旋酶功能的保守结构域。该结构域识别外源病毒RNA，然后将激活信号传递到线粒体链接蛋白（MAVS），MAVS的N端Card区与RIG-I/MDA5相互作用，将信号传递到下游，最终激活IFN的产生。RLRs的结构相似，但LGP2与MDA5和RIG-I相比较，缺少N端的Card区。其它结构有DEAD解旋酶区（DEADhelicase）、RNA结合域（RD）或与其重叠的C端结构域（CTD）组成(Yoneyamaetal.,2005)。Card区由线性的Card串联形成，是半胱天冬酶的招募结构域，也称为效应结构域。MDA5/RIG-I的Card结构域与MAVS的Card结构域同源结合，启动下游信号转导。DExD/H结构域属于RNA解旋酶家族，具有水解ATP及解旋RNA的功能，所以也叫调节结构域。抗病毒效果依赖模式识别受体对病毒RNA的准确识别。dsRNA通常在病毒感染的细胞中聚集，形成病毒基因组或复制中间体：（1）病毒dsRNA是受体如TLR3、蛋白激酶K（PKR）、MDA5和RIG-I识别起始抗病毒应答的关键结构。在细胞中也存在其它dsRNA结构，包括小RNA前体和转录复合体。研究显示，许多dsRNA的识别受体能通过生化修饰和末端结构区分病毒或细胞的RNAs结构(Nallagatlaetal.,2008,Nallagatlaetal.,2007,Schleeetal.,2009)。MDA5介导的信号转导不识别5’ppp结构和dsRNA的7-甲基化鸟苷加帽结构。通过长度依赖识别0.5-7kb的病毒或细胞内dsRNA，该长度超过了典型的细胞dsRNA长度(Katoetal.,2008)。MDA5识别小核糖核酸病毒如小儿麻痹症和脑心肌炎病毒（EMCV）、识别长度0.5-7kbp的dsRNA。尼罗河病毒和登革热病毒能同时被RIG-I和MDA5识别。最近的研究证实，MDA5在MV感染的细胞中识别富含AU的病毒RNA(Rungeetal.,2014)。这些发现说明MDA5用基于长度依赖的分子机制识别dsRNA。MDA5一旦与dsRNA结合，就形成丝状复合体。电镜观察显示，丝状MDA5由手型结构元件沿着dsRNA组成。MDA5CTD区域结合到dsRNA的颈部，每个手型结构占据14bp的长度，同时每个手型结构组成二聚体(Peisleyetal.,2011)。丝状MDA5结构与细胞中的信号转导相关。如MDA5与不同类型的核酸具有不同的亲和力。只有dsRNA能够激活MDA5介导的信号转导，同时在体外诱导形成丝状14 中国农业科学院博士学位论文第一章引言结构。一些丧失部分功能的突变体如I923V突变体，缺乏形成丝状结构的元件，并能够快速解体丝状结构。目前对于MDA5形成丝状结构和解体丝状结构的精确机制、形成和解体之间的动态平衡及MDA5区别dsRNA类型的影响因素尚不明确(Berkeetal.,2012,Peisleyetal.,2011)。RNA结合域与MDA5/RIG-I的C端发生重叠，RIG-I的RNA结合域主要与自身功能调节有关，无外源RNA刺激时，起到RIG-I的“自我”抑制作用，使得RIG-I处于“失活”状态。MDA5没有这种调节作用。因此在实验中，MDA5在没有RNA配体刺激的过程中也可激活MAVS的活性。但有实验发现，RIG-I也可在没有RNA配体的刺激下，激活MAVS的活性。所以，推测在病毒感染过程中，MDA5可能被其它的蛋白刺激或“自身”存在特殊的机制，使MDA5从“失活”状态进入活化状态。MDA5分子的活化机制目前不是很明确，以前研究推测MDA5的C端不能起到自我抑制作用(Saitoetal.,2007)。MDA5的晶体结构显示，helicase区和CTD类似RIG-I,围绕在dsRNA周围，但是MDA5的CTD不具有5’末端加帽环（此结构对于RIG-I的CTD识别5’ppp非常重要）(Wuetal.,2013)。MDA5证实与一些自我免疫疾病相关。如在小鼠中，MDA5突变体（Gly821-Ser821）能诱导狼疮样肾炎发生。MDA5突变体存在于Aicardi-Goutie`综合症，说明MDA5介导的先天性免疫在炎症反应中起到重要作用。RIG-I应答短的dsRNA、5’PPP单链RNA、poly(I:C)、病毒干扰RNA发卡结构及丙型肝炎病毒（HCV）富含polyU的非编码区RNA等。RIG-I识别的病毒有SeV、IAV、NDV、VSV、MV及HCV等。RIG-ICTD区结合dsRNA末端的加帽结构，且其I结合的dsRNA末端拥有5’ppp，长度小于1-2kbp。RIG-ICTD和helicase区在ATP存在的情况下识别和解旋病毒dsRNA。除了dsNRA，RIG-I也可识别含有5’PPP的单链RNA(Pichlmairetal.,2006)。ATP和dsRNA结合诱导RIG-I构型变化，从而形成二聚体(Yoneyamaetal.,2004)。最终，RIG-I蛋白N端Card区与MAVS结合，激活下游信号转导(Kawaietal.,2005,Meylanetal.,2005,Xuetal.,2005)。全长RIG-I与dsRNA按照2:2的分子比例形成复合体。目前，全长RIG-I与平末端dsRNA结合复合体的电镜结构已被解析。RIG-I的结构研究推测，RIG-I的CTD区域结合自身helicase和Card区域形成自我抑制构型，抑制Card功能区，使对ATP和dsRNA的亲和力降低（Kowalinskietal.,2011）。一旦病毒感染宿主细胞，结合dsRNA的CTD断开连接，诱导RIG-I构型变化。活化的RIG-I被大量募集至线粒体MAVS蛋白的Card区(Kawaietal.,2005,Meylanetal.,2005,Xuetal.,2005)。MAVS活化后激活蛋白激酶IKK和TBK1，这两种蛋白激酶激活NF-κB和IRF3及其它能诱导IFN产生的转录因子。RIG-I蛋白的Card区影响MAVS蛋白的Card区域，诱导信号转导的级联反应。含有5’ppp-RNA转录本也是RIG-I的非常重要的一类识别配体(Pichlmairetal.,2006,Schleeetal.,2006)。合成的dsRNA或来源于被RNA酶降解片段的dsRNA类似物polyI:C，同样能被RIG-I蛋白的CTD区识别(Takahasietal.,2008)。全长RIG-I的CTD区在含有ATP的生理条件下，能够结合平端的dsRNA，但与5’ppp-RNA相比亲和力较低(Schleeetal.,2009)。翻译后修饰是细胞信号通路中调节蛋白功能非常重要的方式。研究证实，RIG-I翻译后修饰调节有泛素化和磷酸化。一旦结合病毒dsRNA，RIG-I蛋白的Card区K172位氨基酸通过E3连接酶TRIM25发生泛素化(Gacketal.,2007)。TRIM25通过其SPRY区结合到RIG-I的第一个Card区(Gacketal.,2008)。RIG-I的T55I突变体能降低TRIM25的结合力，导致RIG-I泛素化水平的降低，影响下游MAVS的信号转导。另外，Riplet和RNF125等其它泛素连接酶也能调节RIG-I的活性(Oshiumietal.,2010)。同时研究证实，RIG-I特异性结合非锚定K63链接的多聚化泛素对于RIG-I的活化是必需15 中国农业科学院博士学位论文第一章引言的，能够诱导RIG-I的多聚化(Jiangetal.,2012,Zengetal.,2010)。相反，磷酸化已经证实能够负调控RIG-I的信号转导(Gacketal.,2010)。一旦病毒感染，RIG-I的磷酸化水平降低，说明RIG-I的活化需要其去磷酸化(Maharajetal.,2012)。RIG-I的磷酸化导致RIG-I抗病毒信号转导的抑制。在生理条件下，Card区的S8和T170位氨基酸能组成型磷酸化(Nistal-Villanetal.,2010)，S8E和T170E磷酸化模拟的RIG-I蛋白，丧失了结合E3连接酶TRIM25的能力。在磷酸化的过程中蛋白激酶C（PKC）起到重要的作用(Maharajetal.,2012)。这说明RIG-I的磷酸化通过破坏RIG-I的多聚泛素化使其不能结合MAVS，最终抑制RIG-I的磷酸化。RIG-I的Card区同源建模在结构基础上解释了RIG-I的磷酸化，由于T170和K172非常接近，磷酸化的T170改变蛋白表面电荷，进而阻碍非锚定K63多聚化泛素的结合。S8非常接近第一个Card区的C端，可间接影响第二个Card区的泛素化位点K154、K164和K172(Nistal-Villanetal.,2010)。LGP2不存在N端的Card区，在非感染的细胞中丰度很低。一旦病毒感染或经poly(I:C)诱导，LGP2迅速富集(Komuroetal.,2006,Rothenfusseretal.,2005,Saitoetal.,2007)。LGP2与dsRNA有非常高的亲和力，甚至超越MDA5与RIG-I的结合能力。因此，推测LGP2具有类似“海绵”样功能，吸收剩余的RIG-I的配体。最初认为LGP2为RIG-I和MDA5的负调控因子(Yoneyamaetal.,2005)。然而，用LGP2缺失小鼠研究表明，LGP2在应答许多RNA病毒如EMCV和VSV感染时，能够促进IFN的产生(Satohetal.,2010,Venkataramanetal.,2007)。LGP2与特定的RNA结合，特定的RNA能够刺激EMCV感染细胞的MDA5的活化，这说明在识别小核糖核酸RNA病毒的过程中，这两种RLRs是协同工作的。LGP2协助MDA5与RNA的结合，以及MDA5复合体的形成(Brunsetal.,2014,Deddoucheetal.,2014)。当敲除LGP2后，宿主细胞应答许多RNA病毒会呈现相反结果，所以LGP2既有正调控也具有负调控功能。LGP2功能仍需进一步的研究(Satohetal.,2010,Sutharetal.,2012,Venkataramanetal.,2007)。以上这些不同的配体反映出RNA病毒能够被RLRs识别，核酸配体诱导RLRs构型发生变化，诱导RLRs产生二聚体或者多聚体，进而激活线粒体上的MAVS的信号转导。这个诱导激活过程通过严格的调控，依赖于MDA5和RIG-I的转录后修饰以及包括非锚定多聚化泛素以及LGP2等的调控。所以病毒在进化的过程中，形成了一套通过影响这种信号转导的模式，进而逃避RLRs诱导的先天性免疫（如图５D）。RIG-I与许多正调控或者负调控途径相关，包括泛素化、磷酸化和抗病毒调节蛋白或因子(Belgnaouietal.,2011,Hiscottetal.,2011,Jacobsetal.,2013,Leungetal.,2012,Looetal.,2011,Pazetal.,2011)。当小鼠体内缺失RLRs时，会导致对多种病毒的易感性，包括许多RNA病毒，如NDV、VSV、SeV、EMCV等(Gitlinetal.,2006,Katoetal.,2006,McCartneyetal.,2008)。来自这类基因缺失小鼠的细胞不能起始抗病毒信号转导的形成，导致IFNs的产生减少(Katoetal.,2006)。16 中国农业科学院博士学位论文第一章引言图5RLRs的结构示意图以及RLRs和TLRs介导的IFNs产生示意图(A)RLRs模式识别受体中MDA5/RIG-I/LGP2的基因编码结构图;(B)RIG-I识别双链RNA活化示意图;(C)RLRs介导的信号转导示意图(RIG-I/MDA5形成多聚体后传递放大级联信号);(D)RLRs和TLRs介导的IFN产生示意图Fig.5StructureofRLRsandthediagramofRLRs-orTLRs-mediatedIFNsproduction(A)genestructureofMDA5/RIG-I/LGP2;(B)activationofRIG-IactivedbyssRNA;(C)RLRsmediatedsignaltransduction;(D)thediagramofRLRs-orTLRs-mediatedIFNproduction17 中国农业科学院博士学位论文第一章引言V蛋白抑制IFN的产生研究证实，在IFN产生的信号通路中，病毒利用其蛋白结合IFN通路的许多节点蛋白，从而达到抑制IFN的产生，导致IFN的下游通路的抑制，最终导致病毒逃避IFN系统的清除而大量增殖(Basleretal.,2009,Oksayanetal.,2012,Randalletal.,2008)。图5可以看出PPRV入侵宿主细胞，能诱导RIG-I样受体信号通路的激活，进而激活IFN启动子的表达。副粘病毒科病毒的V蛋白通过与RIG-I样受体通路的胞内蛋白结合，从而抑制IFN的产生。虽然副粘病毒的大部分目标蛋白为MDA5和IRF3，但不同病毒抑制机制不同。目前发现，至少有13种不同副粘病毒科病毒V蛋白能结合MDA5，抑制IFN的产生(Childsetal.,2007,Childsetal.,2009,Parisienetal.,2009,Ramachandranetal.,2010)。除牛瘟病毒的V蛋白外，副粘病毒科病毒不同种属的病毒如PIV5、hPIV2、MuV、MeV、HeV、NiV、SeV等的V蛋白都能与MDA5的701-816位氨基酸区结合。此区域为helicase区，能阻碍dsRNA-MDA5的结合空间位阻，该过程不是竞争结合，而是V蛋白的结合改变了MDA5结合dsRNA的特性(Childsetal.,2012,Childsetal.,2009,Parisienetal.,2009)。晶体结构显示，V蛋白结合MDA5后，其ATPase区由折叠变得展开，破坏了该区域的疏水位点(Motzetal.,2013)。副粘病毒科病毒V蛋白通过含有锌指结构的C端与MDA5结合，从而发挥抑制作用(Andrejevaetal.,2004,Childsetal.,2007,Childsetal.,2009,Irieetal.,2012,Parisienetal.,2009,Ramachandranetal.,2010)。不同病毒V蛋白结合MDA5的精确位点具有特异性，如PIV5、NiV病毒V蛋白含有保守的Cys的大loop，该结构在结合MDA5的过程中是非必需的，但在MeV以及MuV等病毒V蛋白结合MDA5的过程中，Cys形成的锌指结构至关重要。说明副粘病毒科病毒V蛋白能利用其C端结合MDA5，但结合的分子机制具有病毒特异性。研究证实，RIG-I对于病毒诱导的IFN的产生起重要的作用。由于MDA5和LGP2结合Ｖ蛋白的功能位点与RIG-I不同，导致V蛋白不能与RIG-I结合。本文的研究发现，PPRVV蛋白仍能抑制SeV诱导的IFN产生。这说明PPRVV蛋白能抑制RIG-I依赖的IFN产生通路。推测V蛋白通过抑制某种胞内蛋白进而抑制RIG-I依赖的信号通路。有报道LGP2能够结合外源病原核酸，但LGP2没有CARD区，所以不能将信号传递到MAVS。然而LGP2可通过结合RIG-I或MDA5，调节IFN的产生。最近的研究发现，V蛋白能结合LGP2进而促进其对RIG-I的负调控作用，这很好解释了V蛋白能抑制RIG-I依赖的IFN的产生。V蛋白抑制RIG-I的活性需要LGP2的共表达，而LGP2与RIG-I的结合，也仅在V蛋白同时表达时才能检测到。说明V蛋白对于LGP2的负调控作用起促进作用，该种机制的精确阐述有待于进一步的研究证实。模式识别受体TLRs中的TLR3/TLR7/TLR8/TLR9也能识别外源病原的核酸，激活的TLRs可导致IFN的产生。副粘病毒科病毒V蛋白可通过抑制TLR3依赖的IRF3的活性，进而抑制IFN的产生。IRF3属于PRRs下游的关键蛋白，不同的模式识别受体信号的传递都可在IRF3处形成交叉。所以，IRF3对于IFN的产生非常关键。腮腺炎病毒属病毒利用V蛋白作为TBK1的诱饵底物与IRF3竞争，同时作为NF-κB激酶（IKKε）的抑制剂，最终抑制IRF的磷酸化，并且促进IKKε/TBK1的多聚泛素化，使得该信号通路的关键蛋白降解，IFN的产生丧失。亨尼帕病毒属病毒对于IRF3的影响不同于腮腺炎病毒，该病毒属利用非结构蛋白W结合和俘获IRF3，导致细胞核内的IRF3的失活。麻疹病毒诱导IRF7竞争结合IKKα，从而限制IFN的产生。其它属的病毒18 中国农业科学院博士学位论文第一章引言V蛋白影响IRF3的活性研究目前不是很多，抑制机制也不尽相同。PPRV属于副粘病毒科，麻疹病毒属，ssRNA病毒。该病毒存在5’PPP结构，所以推测PPRV能被RIG-I识别。与此同时，PPRV的基因组长度大约1.5kb，推测PPRV病毒基因组也能被MDA5或LGP2所识别，进而诱导先天性免疫应答。1.1.2.1.2V蛋白拮抗IFN诱导的STAT依赖的先天性免疫应答从生物发育到免疫系统调节，细胞因子和生长因子控制不同的细胞生物学过程。这些因子结合到特异性的细胞膜受体，激活了胞内的信号转导系统，从而起始信号特异性表达。STATs家族就是一类能够活化这些细胞因子和生长因子的重要胞内蛋白组分，STATs直接调节细胞内基因表达(Aaronsonetal.,2002)。缺乏STATs蛋白能够导致癌症和慢性炎症的发生。由于STAT家族的这种重要的作用，所以在进化的过程中ssRNA病毒利用自身的蛋白将STAT蛋白家族作为靶向。副粘病毒科V蛋白有效的拮抗STAT家族信号转导，导致IFN抗病毒状态的破坏。V蛋白的作用机制具有多样性。STAT蛋白的结构与功能STAT家族由STAT1/2/3/4/5/6组成的具有相同结构域的蛋白家族。果蝇的DSTAT也具有相似的结构域。研究DNA结合蛋白在IFN诱导表达过程中，首次发现了STAT1/2蛋白(Levyetal.,1989)。而在研究应激反应过程中，发现了STAT3(Akiraetal.,1994,Zhongetal.,1994)。STAT4基因与STAT1的基因在小鼠1号染色体上紧密相连，所以在PCR克隆时被发现。STAT蛋白1-700aa的序列具有28%-40%的一致性。所以，STAT蛋白具有保守的功能域和结构域。STAT蛋白Ｎ端保守性较高，其功能非常重要。当STAT蛋白N端发生缺失，导致STAT蛋白不能发生磷酸化而丧失功能。STAT蛋白的DNA结合区位于400-500aa的区域，为高度保守序列。研究发现，其Glu-Glu、Val-Val-Val序列发生突变，都将影响STAT蛋白的酪氨酸磷酸化。Src同源三区（SH3）是一个类似于Src同源二区（SH2）的非保守区，SH3区的氨基酸保守性较差。所以，没发现重要的氨基酸残基发挥重要功能。SH2区位于600-700aa区域，该区高度同源，是潜在的磷酸化酪氨酸激活区，如该区的精氨酸(Arg620)发生突变，将导致STAT蛋白不能被磷酸化，从而不能形成二聚体。SH2区的酪氨酸（Tyr701）位点的磷酸化也严重影响DNA结合活性，即STAT蛋白磷酸化形成的二聚体影响DNA的结合。STAT蛋白的激活丰度存在细胞特异性，目前发现有30种以上细胞因子能够激活多种动物细胞的STAT蛋白，如IFN-α/β能诱导STAT1和STAT2的活化，而IFN-γ却只能诱导STAT1的磷酸化。19 中国农业科学院博士学位论文第一章引言图6STAT蛋白的示意图A:STAT蛋白的二级结构模拟图，STAT蛋白具有保守区（Con）；相互作用区（ID1）；DNA结合区（DNAbindingdomain）；Src同源三区（SH3）；Src同源二区（SH2）；转录激活区（Tr）。B：STAT蛋白的三维结构示意图（引用PDB:1bf5）三维结构蓝色部分：SH2区域，红色部分：DNA结合区域Fig.6StructureofSTATproteinSTAT蛋白能对IFNs、KITLG/SCF等细胞因子、生长因子的刺激产生应答。当I-IFN结合到细胞表面受体，信号通过蛋白激酶导致JAK1-TYR1激酶磷酸化STAT蛋白的酪氨酸。磷酸化的STAT蛋白形成二聚体，并与IRF9结合形成ISGF3转录因子进入细胞核。ISGF3结合到IFN刺激应答元件ISRE，导致干扰素刺激基因ISG的转录活化，使细胞进入抗病毒状态。对于II-IFN的应答，STAT蛋白的酪氨酸和丝氨酸被磷酸化，形成STAT1的同源二聚体，迁移到细胞核内，与IFN-γ活化序列GAS结合，促进相关基因的表达，并诱导细胞进入抗病毒状态。STAT蛋白通过形成同源或异源二聚体进入细胞核内，不但参与结合DNA,也可以和其它能参与结合DNA或增强DNA转录活性的蛋白产生相互作用。如STAT1/2复合体利用其相互作用区可以和P48组成ISGF3，达到稳定ISGF3的作用，并保证ISGF3识别特异性的核酸序列(Schindleretal.,1995)；STATs蛋白与AP-1蛋白提供适当的结合位点，辅助金属蛋白酶1组织抑制因子的基因启动，这样IL-6才能诱导该基因的完全转录(Bugnoetal.,1995)。STAT蛋白具有重要的生物学功能，如果STAT蛋白缺失，将导致一系列疾病或死亡。如缺乏STAT1可导致宿主先天性免疫缺陷；STAT2的缺失可引起胚胎早期死亡；STAT3缺失诱导胚胎早期死亡，同时伴有无原肠胚形成；STAT4与STAT6基因的缺失，分别导致Th1和Th2的功能丧失；STAT5却与乳腺发育相关。因为活化应答KITLG/SCF和KIT信号转导，所以STAT可能介导分支杆菌引起的疾病。该疾病的主要特征是免疫缺陷导致的免疫应答的改变，以及对于真菌感染清除能力的丧失，导致包括皮肤、指甲和粘膜等持久和重复性感染。这些都说明STAT蛋白在生物体中扮演非常重要的角色，而在抗病毒和细菌的先天性免疫方面STAT1/2蛋白分别起到不可或缺的作用。V蛋白以STAT为靶向的IFN抑制作用20 中国农业科学院博士学位论文第一章引言副粘病毒亚科分为腮腺炎病毒属、麻疹病毒属、亨尼帕病毒属等，这些病毒的V蛋白富含Cys保守区的C端具有高度相似性，在副粘病毒科中V蛋白的相似性达到了50%。蛋白C端7个Cys与His分别结合两个锌原子，形成与脊椎动物无同源性的锌指结构。V蛋白抑制STAT介导的IFN的信号转导，主要依赖于其保守的C端区，而不同病毒的抑制机制具有多样性。（1）副粘病毒科V蛋白诱导的STAT的降解STAT蛋白的核内与胞内的分布水平调节STAT蛋白的活性。受体诱导的Tyr的磷酸化导致STATs蛋白的活化，然后STATs蛋白通过内部SH2的磷酸化形成二聚体，同源或异源的二聚化STATs在细胞核内富集，并结合于目的基因。STAT二聚体在核内被Tyr磷酸化酶去磷酸化后失去活性(Haspeletal.,1999,Haspeletal.,1996,tenHoeveetal.,2002)。研究证实，STAT蛋白的半衰期能够达到几天。然而当腮腺炎病毒感染后其蛋白表达水平迅速降低。STAT1的丰度在感染SV5后明显降低(Didcocketal.,1999)，而当单独表达SV5的V蛋白时，STAT1明显被降解，类似的结果在腮腺炎病毒属的研究中也得到证实(Goodbournetal.,2000,Kubotaetal.,2001,Parisienetal.,2002,Parisienetal.,2002,Parisienetal.,2001,Ulaneetal.,2003,Yokosawaetal.,2002,Youngetal.,2000)。蛋白酶抑制剂能抑制V蛋白诱导的STAT蛋白的降解，说明V蛋白诱导蛋白酶依赖的STAT降解。随后发现，腮腺炎病毒诱导STAT1的多聚泛素化。原核表达的SV5和HPIV2的V蛋白在体外能够催化泛素的转移反应(Ulaneetal.,2003)，在细胞内转染SV5/HPIV2/MuVV蛋白导致所有的STAT蛋白多聚泛素化，最终诱导STAT蛋白降解。利用纯化的V蛋白，可以鉴定与V蛋白结合的宿主细胞蛋白。腮腺炎病毒属大部分病毒的V蛋白通过宿主细胞体内的蛋白酶系统，形成V蛋白降解复合体，分别降解STAT1或STAT2。降解复合体由V蛋白、STAT1蛋白、STAT2蛋白、E3泛素连接酶组分（主要为UV损伤特异性蛋白（DDB1）和许多SCF泛素连接酶亚基的Cullin家族成员（如：Cul4A或者Cullin，这两种类型组分介导STAT蛋白的多聚泛素化）组成。DBB1和Cullin家族成员在STAT降解过程中是必需的。V蛋白和对同源STAT蛋白的蛋白酶降解作用具有高度的一致性，但在腮腺炎病毒属种，不同种属的V蛋白诱导降解的底物具有特异性。如PIV5V蛋白介导STAT1的多聚泛素化和蛋白酶体降解。PIV5的V降解复合体的体外实验证实，V蛋白N端和C端对于降解复合体的形成及STAT1的降解都是必需的，降解复合体中无论STAT1或STAT2哪一方降解，都需要另外的STAT作为辅助因子。HPIV2V蛋白却以STAT2作为泛素化的目的蛋白。MuVV蛋白能诱导STAT1和STAT3同时降解，对于STAT2没有调节作用(Nishioetal.,2002,Parisienetal.,2001,Ulaneetal.,2003)，MuVV蛋白降解复合体的组分STAT3代替了STAT2，所以MuVV蛋白复合体能够多聚泛素化和降解STAT3，进而抑制STAT3依赖的细胞因子和致癌因子的转录和活化。突变MuVV蛋白结合的STAT3位点，不影响V蛋白与STAT1的结合，STAT3的降解不依赖STAT1或者STAT2。这种现象只存在于MuVV蛋白复合体，腮腺炎病毒属的其它病毒V蛋白不影响STAT3的表达。生化分析确定SV5、HPIV2V蛋白通过与STAT1或STAT2形成多聚复合体，并与非目的STATs蛋白结合，从而发挥其E3泛素化连接酶的活性。也可认为，SV5V蛋白只有在表达STAT2的细胞中才能导致STAT1的降解，而HPIV2V蛋白介导的STAT2的降解必需依靠STAT1的存在(Parisienetal.,2002)。在V蛋白依赖的IFN免疫逃避中，STATs作为主要的降解蛋白也需要其它胞内蛋白的辅助。在腮腺炎病毒属中，HPIV4a和HPIV4b的V蛋白能够结合STAT1和STAT2，形成V蛋白降解复合体，但这两个病毒不降解STAT蛋白，也不影响STAT蛋白的定位和磷酸化21 中国农业科学院博士学位论文第一章引言水平。所以这两种病毒缺乏抑制STAT信号转导的能力。与其它腮腺炎病毒属病毒相反的是，MPRVV蛋白能够结合STAT蛋白，导致STAT蛋白的细胞定位发生改变，但是不能诱导STAT蛋白的降解。这种情况与亨尼帕病毒属和麻疹病毒属病毒类似。目前，推测V蛋白降解STAT蛋白有四种模式（图6显示），分别为1）类似PIV5的V蛋白形成依赖STAT2、DBB1和Cullin4A的降解复合体，与STAT1结合，且导致STAT1的降解；2）类似Mumps的V蛋白形成依赖STAT2、DBB1和Cullins的降解复合体，与STAT1结合，导致STAT1的降解；3）类似HPIV2的V蛋白形成依赖STAT1、DBB1和Cullin4A的降解复合体，与STAT2结合，导致STAT2的降解；4）类似Mumps的V蛋白形成依赖DBB1和Cullin4A的降解复合体，与STAT3结合，导致STAT3的降解；图7：V蛋白与STAT形成的蛋白降解复合体的模式图（A）V蛋白通过STAT2；DDBI以及Clu4A或者Cullins的辅助形成降解复合体与E3连接酶结合导致STAT1的降解（B）V蛋白通过STAT1；DDBI以及Clu4A的辅助形成降解复合体与E3连接酶结合导STAT2的降解（C）V蛋白通过DDBI和Cullins的辅助形成降解复合体与E3连接酶结合导致STAT3的降解Fig.7PatternofV-STATproteinComplexdegradation(A)V-STAT2-DDBIandassistantClu4AorCullinsdegradationcomplexcombinewithE3ligaseleadtothedegradationofSTAT1(B)V-STAT1-DDBIandClu4AdegradationcomplexcombinewithE3ligaseleadtothedegradationofSTAT2.(C)V-DDBIandCullinsdegradationcomplexcombinewithE3ligaseleadstothedegradationofSTAT3（2）副粘病毒科V蛋白通过非降解方式抑制STAT蛋白信号转导尼帕病毒和亨德拉病毒属于副粘病毒科，是能够感染人类和家畜的一类烈性呼吸道疾病。亨22 中国农业科学院博士学位论文第一章引言尼帕病毒能依赖V蛋白抑制IFN，进而逃避先天性免疫应答。亨尼帕病毒V蛋白具有相似的C端保守区，V蛋白N端与其它副粘科病毒相比不具有同源性。这种序列的差异导致亨尼帕病毒V蛋白抑制IFN信号转导的机制不同。研究证实，亨尼帕病毒V蛋白通过俘获STAT1/2蛋白，形成胞内大分子量的非降解复合体，进而抑制IFN的应答(Rodriguezetal.,2002,Rodriguezetal.,2003)。虽然V蛋白的C端功能保守，但V蛋白的N端具有三个非常重要的功能：核输出信号（NES）、STAT蛋白的结合、IFN信号转导的抑制。NES定位于尼帕病毒V蛋白N端的174-192氨基酸区，是V蛋白在细胞质中富集所必需的。如果替代或缺失了NES，就会导致STAT蛋白在细胞质中再分布的抑制，但IFN依赖的STAT1/2抗病毒通路的激活抑制与V蛋白ENS的完整性无特殊的相关性。这说明亨尼帕病毒V蛋白核质穿梭在其生物学功能中扮演独特的角色，而与IFN的逃避无相关性。尼帕病毒V蛋白的IFN信号转导抑制功能区和STAT蛋白的结合区定位于V蛋白100-300位氨基酸区。STAT1结合于V蛋白的100-160位氨基酸区，这个区域是主要的免疫逃逸功能区，对于IFN信号应答的抑制是必须的。STAT1的结合是V蛋白结合STAT2的充要条件。正常细胞中V-STAT1-STAT2蛋白复合体共同协调抑制IFN信号通路的转导，STAT1也与STAT2结合，需要V蛋白的100-300位氨基酸区。上述研究表明，副粘病毒科V蛋白N端也参与发挥作用(Parketal.,2003,Rodriguezetal.,2004)。亨尼帕病毒V蛋白通过俘获STAT蛋白，形成大分子量的蛋白复合体，进而抑制IFN的信号转导。麻疹病毒也可通过抑制STAT蛋白的入核方式，抑制IFN的信号转导。麻疹病毒编码的V蛋白不同于轮状病毒属和亨尼帕病毒属的病毒，与它们V蛋白整体序列的一致性只有20%左右。虽然一致性不高，但MVV蛋白可通过不同机制在宿主细胞中有效的抑制IFN的信号转导(Palosaarietal.,2003)。MVV蛋白能有效抑制IFN-α/β和IFN-γ诱导的抗病毒因子转录应答，同时抑制IFN诱导的STAT1和STAT2的入核。与亨尼帕病毒属不同的是MVV蛋白不能穿梭于细胞质与细胞核之间，因此不改变潜在的STAT1的分布。亲和层析纯化麻疹病毒VIP证实，其V蛋白与STAT1/2/3及IRF9结合，这与轮状病毒的VDC泛素连接酶复合体不同。说明麻疹病毒V蛋白拥有独特的活性机制。麻疹病毒V蛋白结合IFN受体亚基（IFNAR2.2或βlong）及信号转导配体RACK1(Yokotaetal.,2003)，这说明有可能存在多种受体结合模式。与IRF9及干扰素受体结合形成复合体，是麻疹病毒不同于轮状病毒V蛋白的特征，可能因为在宿主细胞抗病毒应答逃逸中导致整个ISGF3的完全失活。在麻疹病毒感染的细胞中发现，STAT1/2蛋白在细胞质中重新分布，而且与病毒N蛋白和核酸共定位(Palosaarietal.,2003)。这种现象在其它副粘病毒科病毒中也有发现，如SV5(Fearnsetal.,1994,Nishioetal.,1996,Preciousetal.,1995,Randalletal.,1996,Watanabeetal.,1996)、呼吸道和包体病毒(Garciaetal.,1993)、仙台病毒(Portneretal.,1986)、腮腺炎病毒(Ulaneetal.,2003)。对于这种结构的具体功能目前研究不多。总之，对于V蛋白拮抗STAT介导的干扰素的信号转导机制多而复杂，涉及病毒与宿主的结合、免疫系统的激活及细胞因子的活化。此外，可能还存在新的STAT蛋白与病毒复制及免疫应答的机制。因此，探讨精确的干扰素的信号转导的分子机制，将为研究调节炎症和肿瘤疾病的相关细胞因子、JAK、STAT信号转导之间的关系提供依据。23 中国农业科学院博士学位论文第一章引言图8：尼帕病毒V蛋白功能域示意图IFN抑制活性功能域定位于尼帕病毒V蛋白的100-160aa（STAT1蛋白通过SH2linker结合V蛋白的100-160区域的氨基酸；STAT2结合V蛋白的100-300氨基酸区域，同时这种结合需要STAT1的参与）；尼帕病毒V蛋白的核输出信号（NES）定位于氨基酸174-192区域；V蛋白的CTD定位于氨基酸406-456区域。Figure8:NipahvirusVproteinfunctionaldomainIFNinhibitorydomainlocalizationin100-160aaofVprotein(STAT1proteincombinedwith100-160aaregionoftheVproteinbySH2linker,STAT2bindingwiththeregion100-300aaofVprotein,thecombinationneedstheparticipationofSTAT1);NESlocatedinthe174-192aaofVprotein;CTDislocatedinthe406-456aa.1.2研究目的和意义PPRV作为一种小反刍兽的重要病原，主要侵害绵羊、山羊、牛、骆驼等动物，具有非常高的发病率和致死率。PPRV能够导致免疫抑制，使带毒动物更易感染其它病原。PPRV可通过利用自身蛋白侵染宿主细胞，并在胞内进行复制包装，形成新的病毒颗粒继续侵染宿主细胞。在病毒侵染初期，由于病毒刺激产生抗病毒因子如IFNs。所以病毒利用自身的非结构蛋白结合IFNs产生通路中的节点蛋白，抑制IFNs的产生，达到病毒在宿主体内的快速增殖。目前对于病毒非结构蛋白拮抗先天性免疫的研究成为热点。PPRV在基础研究方面基本处于空白，所以研究PPRV的非结构蛋白拮抗先天性免疫的分子机制对对该病毒疫苗如重组疫苗或者反向操作系统构建的疫苗系统等起到指导作用，有利于PPRV的整体防控。本研究主要目的是：探索PPRV的非结构蛋白V对于先天性免疫的影响。本研究通过合成PPRV西藏强毒株的V基因，利用luciferase检测、免疫共沉淀、GST-Pulldown、细胞共定位、VSV病毒增殖抑制试验等明确PPRVV蛋白是否能够抑制宿主细胞IFNs的产生。如果V蛋白抑制宿主细胞IFNs的产生，进一步研究PPRVV蛋白与宿主细胞免疫系统信号通路靶蛋白之间的相互作用，阐明V蛋白抑制先天性免疫应答的分子机理，初步揭示PPRV感染引起宿主先天性免疫抑制的分子机制，为研制新型有效的PPRV的疫苗提供理论依据。24 中国农业科学院博士学位论文第一章引言1.3研究内容与实验路线设计1.3.1研究内容：本研究以PPRVV蛋白对先天性免疫系统IFNs产生及IFNs的信号转导通路的影响作为研究内容，以PPRVV蛋白为研究对象，通过荧光素酶检测方式探讨V蛋白对IFN产生通路的影响；使用免疫共沉淀、pull-down研究V蛋白对于RLRs途径以及IFNs信号转导途径的影响；确定PPRVV蛋白与上述两种途径中关键蛋白的相互作用关系；同时探讨这种相互作用是否有其它调节因子依赖性；进而确定V蛋白与RLRs与IFNs信号转导途径中关键蛋白相互作用的区域及精确位点，最终阐明V蛋白抑制IFN产生和信号转导的分子机制。具体如下：1.真核表达PPRVV蛋白在宿主细胞中对于IFN产生的拮抗效应。2.PPRVV蛋白拮抗RLRs信号通路的分子机制研究。3.检测PPRVV蛋白对于IFNs活化的信号通路的拮抗效应。4.PPRVV蛋白拮抗IFNssignaling通路的分子机制研究。5.综合分析PPRVV蛋白对于先天性免疫系统的逃逸机制和分子疫苗设计的展望。1.3.2技术路线实验设计总体路线图：25 中国农业科学院博士学位论文第二章PPRVV蛋白拮抗MDA5介导的IFNs产生的分子机制及其功能位点的确定第二章PPRVV蛋白拮抗MDA5介导的IFNs产生的分子机制2.1前言PPRVV蛋白由PPRVP基因起始形成的转录本，经过转录后编辑在751bp插入碱基G，形成的非结构蛋白。V蛋白不参与成熟的病毒粒子的包装，预测分子量大小约为32kDa左右，但在真核细胞中，V蛋白的实际分子量约为34-40kDa。目前尚不清楚是何种原因导致分子量上的差异，可能存在细胞内的表达修饰。目前，PPRVV蛋白对先天性免疫系统及病毒毒力影响的相关研究很少。SatoshiIkegame等研究证实，MDA5与RIG-I两者都参与麻疹病毒感染细胞IFN的产生(Ikegameetal.,2010)。副粘病毒科病毒V蛋白作为毒力因子通过抑制MDA5的活性，进而逃避先天性免疫应答(Ramachandranetal.,2010)。MDA5和RIG-I是非常重要的RLRs模式识别受体，RIG-I主要识别无加帽的5’ppp的短的dsRNA，而MDA5识别较长的dsRNA，无需5’ppp存在。病毒RNA一旦结合RIG-I和MDA5，就会引起IRF3和NF-κB的活化，最终导致I型IFN的产生。目前RIG-I和MDA5识别合成的模式分子的研究较为清楚，但是RIG-I和MDA5识别的模式分子的类型研究尚不清楚，如：缺失MDA5的小鼠对EMCV的感染不产生IFN应答(Gitlinetal.,2006,Katoetal.,2006)；RIG-I基因敲除的小鼠，对RNA病毒感染的IFN应答丧失。基因敲除小鼠研究表明，LGP2在IFN应答过程中发挥复杂的功能。IFN的合成过程中，LGP2基因敲除小鼠成纤维细胞中IFN的mRNA表达水平在poly（I：C）或VSV刺激后上升，小鼠对于VSV的感染抵抗力增强(Venkataramanetal.,2007)。在LGP2基因敲除的巨噬细胞中，出现对EMCV的感染产生IFN应答水平降低的现象。这说明LGP2在IFN的产生过程中起到正负两种调节功能。这种正负调节可能与病毒类型或活化的模式识别受体相关。相关研究发现，LGP2对于一些病毒活化的RIG-I也有正调控作用(Satohetal.,2010)．副粘病毒科病毒V蛋白通过结合MDA5抑制IFN的产生，阻止dsRNA与MDA5的结合以及MDA5的多聚化(Andrejevaetal.,2004,Childsetal.,2007,Childsetal.,2009)。相反，V蛋白不能直接结合RIG-I，抑制RIG-I介导的IFN的产生。研究显示，副粘病毒科病毒能活化RIG-I和MDA5，V蛋白可通过结合MDA5而抑制IFN的产生；其它的病毒激活RIG-I，则通过其C或W蛋白抑制RIG-I介导的IFN产生(Shawetal.,2005,Strahleetal.,2007)。然而，许多的病毒不编码C或W蛋白。所以到目前为止，副粘病毒科病毒V蛋白对于RIG-I的抑制机制不是很清楚，对于PPRVV蛋白对RLRs介导的IFN的产生的影响也无相关研究。所以本研究将探讨V蛋白抑制RLRs介导的IFN产生的分子机制。2.2实验材料和方法2.2.1实验耗材、试剂及其试剂配制方法试剂primerSTARDNApolymerase（Takara）；限制性内切酶如NheI、ClaI、EcoRI和SmaI等、T4-DNAligase（NEB）；dNTP（Takara）；RNA酶抑制剂、M-MLV反转录酶、质粒提取试26 中国农业科学院博士学位论文第二章PPRVV蛋白拮抗MDA5介导的IFNs产生的分子机制及其功能位点的确定剂盒、DNA纯化试剂盒、荧光素酶检测试剂盒（Promega）；无内毒素质粒提取试剂盒（Omega）；脂质体2000、TRIzol（Invitrogen）；无填料层析柱（NEB）；GST纯化填料（Novagen）；鼠源抗flag、鼠源抗HA；鼠源抗GST抗体、兔源抗Flag单克隆抗体、兔源抗HA单抗；辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG等抗体均购自于Sigma公司；蛋白预染或非预染Marker（Fermentas公司）；Pro-lightHRP化学发光试剂（北京天根生化科技有限公司）；BCA浓度测定试剂盒（北京博奥森）；医用X射线胶片（Kodak）；真核细胞蛋白酶抑制剂cocktail（罗氏公司）；PVDF、NC膜（Millipore）；proteinA/GSepharoseBeads（Abmart）；poly（I:C）、蛋白胶制作试剂（Sigma）；DMEM培养基、1640培养基（Hyclone）；胰酶、小牛血清（Gibco）；细胞培养瓶、细胞培养皿（Corning）；LB培养基配置试剂（Oxoid）。病毒、细胞、质粒、菌株：PPRV、SeV、VSV；HEK293T细胞、Cos7细胞、A549细胞、E.coliDH5α、BL21、pEGX4T-1、pMD-19-T（实验室保存）；pCAGGs（Addgene）实验器材倒置显微镜；梯度PCR仪；酶标仪；制冰机；超净工作台；恒温水浴锅；低温冷冻高速离心机；高压灭菌器；超低温冰箱；电子天平；pH计；磁力搅拌器；核酸电泳仪；蛋白电泳仪；凝胶成像仪；超纯水净化仪器；涡旋振荡器；荧光素酶检测仪；恒温摇床；核酸、蛋白浓度检测仪；荧光显微镜；激光共聚焦显微镜等仪器均由中国农业科学院兰州兽医研究所提供。试剂配置细胞裂解buffer150mmol/LNaCl，50mmol/LTris-HCl(pH7.4)，0.1%NP-40，0.25%脱氧胆酸钠，10%甘油。4℃保存，使用前加入罗氏公司购买的cocktail蛋白酶抑制剂。10×GST洗涤BufferpH7.243mmol/LNa2HPO4，14.7mmol/LKH2PO4，1.37mmol/LNaCl，27mmol/LKCl，工作液浓度使用1×GST洗涤Buffer。4℃保存10×GST洗脱Buffer500mmol/LTris-HCl(pH8.0)，100mmol/LReducedGlutathione，还原性谷胱甘肽的工作液浓度为10mmol/L。4℃保存2×SDS-PAGE上样缓冲液100mmol/LTris-HCl(pH6.8)，4%SDS，0.2%溴酚蓝，20%甘油，2%β-巯基乙醇。4℃保存细胞培养液购买自Hyclone公司的无血清培养基，在使用前加入10%的小牛血清，4℃保存。5×Tris甘氨酸缓冲液15.1gTris碱，94g甘氨酸，5gSDS溶解于800ml双蒸水中，定容至1000ml，使用前稀释为1×工作液，室温保存转膜缓冲液27 中国农业科学院博士学位论文第二章PPRVV蛋白拮抗MDA5介导的IFNs产生的分子机制及其功能位点的确定3.02gTris碱，14.4g甘氨酸，溶解于500ml双蒸水中，加入200ml甲醇，定容至1000ml，常温保存（尽快使用）PBST洗膜缓冲液8.0gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4加入800ml双蒸水中，溶解后定容至1L，121℃，高压灭菌30min，室温保存。使用时加入0.5‰Tween-20，完全混匀使用。蛋白封闭液PBST中加入5%的脱脂奶粉（Ameresco），即用即配。50×核酸电泳缓冲液（TAE）：242gTris碱，57.1ml冰乙酸，37.2gNa2EDTA·2H2O，加入到700ml双蒸水中，溶解后定容至1000ml，室温保存，使用工作液浓度为1×TAE。30%丙烯酰胺购买自上海生工，4℃避光保存。1.5MTris.HCl（pH8.8）181.7gTris碱，加入到800ml双蒸水中，用浓盐酸调节pH至8.8，定容至1000ml，室温保存。1.0MTris.HCl（pH=6.8）121.1gTris碱，加入到800ml双蒸水中，用浓盐酸调节pH至6.8，定容于1000ml，室温保存。10%SDS：10gSDS溶解于100ml双蒸水中，室温保存（沉淀可以加热后溶解）。10%过硫酸铵（AP）：1g过硫酸铵溶解于10ml双蒸水中，4℃保存。TEMED具有毒性，4℃保存。6×蛋白上样buffer购自于Takara，-20℃保存。6×核酸电泳上样缓冲液：40%（m/V）蔗糖，0.25%（m/V）溴酚蓝，4℃保存。2.2.2实验方法2.2.2.1病毒或者细胞RNA提取●耗材灭菌：瓶皿需高压处理，使用枪头均购自于Takara。●材料处理：将离心后的病毒液或收集的需处理的细胞按照不超过10%/ml的体积比加入到TRIzol液体中。●快速混匀室温静置5min；加入0.2ml的氯仿液体（此处按照1ml的TRIzol为基准），快速涡旋15s，室温静置5min。28 中国农业科学院博士学位论文第二章PPRVV蛋白拮抗MDA5介导的IFNs产生的分子机制及其功能位点的确定●12000rmp，4℃离心15min，收集上层水相，切勿吸取到沉淀。●加入等体积的异丙醇，混匀，静置10min，12000rpm，4℃离心15min，弃上清。●加入1ml75%乙醇（RNAasefree）洗涤，12000rpm离心，弃上清，室温晾干乙醇。●加入无RNAase的双蒸水，60℃，15min，溶解RNA。●使用oligo（dT）引物按照以下体系反转录RNA为cDNARNA2μg引物1μg加热至70℃，恒温3min，冰浴5min加入以下试剂M-MLV5×reactionbuffer5μldNTP1.25μlRNAaseinhibitor1μlM-MLV反转录酶1μl加入水（RNAasefree）补齐至25μl，42℃恒温孵育90min●反转录后的cDAN提供后续工作。2.2.2.2V-HA-pCAGGs及V-pGEX-4T-1及V蛋白缺失突变体和点突变体重组质粒的构建●合成V基因（GenBank:JF939201.1），使用含有HA标签和EcoRⅠ酶切位点的上游引物和含有NheⅠ酶切位点下游引物将V基因插入真核表达载体pCAGGs的多克隆位点，同时使用含有EcoRI的上游引物和含有SmaI酶切位点的下游引物，将V基因插入到原核表达载体pGEX-4T-1的多克隆位点。PCR引物序列参考引物列表1与2（表中所列为第二章和第三章所需引物参考序列）●STAT系列基因来源于Cos7细胞，MDA5、RIG-I、LGP2来源于HEK293T细胞。各重组质粒构建均按分子克隆的操作步骤进行（参考《分子克隆》）。pCAGGs为氨苄青霉素抗性，构建载体由北京金维智生物公司进行测序验证。2.2.2.3细胞转染●细胞于细胞培养板培养24h，形成单层细胞，细胞密度达到70%-80%为宜。●转染前，弃去细胞培养液，使用Opti-MEM（Invitrogen）清洗一遍细胞，然后再次加入Opti-MEM，37℃细胞培养箱培养。●分别将提取无内毒素的重组质粒pCAGGs-V，加入Opti-MEM中混匀，将Lipofectamine2000与质粒按2:1的比例混匀于Opti-MEM（需要非常轻柔，防止破坏脂质体结构）中，静置5min。●将分别混匀的质粒和脂质体置于一管轻柔混匀，静置30min。●混匀的液体逐滴加入到含有Opti-MEM的细胞培养板中，37℃细胞培养箱培养。5-6h后，细胞板的Opti-MEM用细胞培养液替换，24h收集细胞进行检测。2.2.2.4荧光素酶检测●将荧光素酶报告基因与目的基因重组质粒进行共转染实验所需细胞。具体的步骤按照双荧光素酶检测试剂盒提供说明书操作（Promega）。●共转染24h后，弃去24孔细胞培养板的培养液，使用冰冷的PBS轻轻洗涤3次，吸干多29 中国农业科学院博士学位论文第二章PPRVV蛋白拮抗MDA5介导的IFNs产生的分子机制及其功能位点的确定余PBS。●细胞培养板中加入荧光素酶检测试剂盒自带的细胞裂解液，裂解细胞。●倾斜细胞板，使得细胞板中细胞碎片迅速沉淀，吸取上清至专用荧光素酶检测96孔板中，加入Luciferase检测底物，迅速在Glomax发光检测仪上进行检测。●检测完后加入Stop&Glo®试剂，终止Luciferase检测，迅速在Glomax发光检测仪上检测，读取海肾荧光素酶荧光值。●分析数据。2.2.2.5Westernblot分析●共转染或单独转染48h的细胞，反复冻融一次，使用PBS轻柔吹打收集，离心，弃去PBS，加入细胞裂解液，冰浴孵育20min（摇床）。●制备10-15%不等浓度的SDS-PAGE胶，蛋白样品与上样buffer混合后，沸水中煮沸10min，离心，上样电泳（条件80V浓缩胶，120V分离胶），蓝色溴酚蓝指示带到达底部停止电泳。●电泳后，恒压15V转膜30min（半干转）。●转膜后的PVDF膜，用5%的脱脂奶粉浸泡，室温封闭2h。●PBST3×5min清洗封闭后的PVDF膜，将PVDF膜浸泡在含有抗HA或FLAG抗体的5%的脱脂奶粉中（一抗浓度按照不同抗体说明书操作），4℃摇床过夜。●PBST3×5min清洗孵育过一抗的PVDF膜，将其浸泡到含有抗IgG的5%的脱脂奶粉中，室温孵育1h。●PBST3×5min清洗二抗孵育后的PVDF膜，在PVDF膜上滴加ECL发光液（碧云天），然后在暗室曝光。2.2.2.6V蛋白及其突变体的原核表达与纯化●将重组原核表达质粒转化至BL21（DE3）中，37℃、200r/min培养（扩大培养：菌液OD600值为0.6~0.8时按照1:100的比例扩大培养）。●130r/min下用终浓度为0.8mmol/L的IPTG诱导，30℃恒温摇床培养8h后，收集菌体，4℃超声处理，离心收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE分析，鉴定目的蛋白表达和可溶性情况。●将目的蛋白进行大量表达，收集上清。●参考GST•BindTMKits（Novagen）的原理和步骤，将收集的上清加入到1mL的GST树脂柱，室温孵育30min，用10mLGST纯化洗涤缓冲液轻柔洗涤柱体4次，然后使用4mLGST洗脱缓冲液（还原性谷胱甘肽浓度为10mmol/L）洗脱目的蛋白3次，分别收集上述各组份进行SDS-PAGE分析，观察目的蛋白纯化效果。●根据纯化效果检测后，大量纯化蛋白待用。2.2.2.7免疫共沉淀验证V蛋白及其突变体与MDA5的相互作用●Cos7细胞铺于6孔板，24h培养后，密度达到70-80%。30 中国农业科学院博士学位论文第二章PPRVV蛋白拮抗MDA5介导的IFNs产生的分子机制及其功能位点的确定●分别用V蛋白或V蛋白突变体的重组质粒与MDA5的重组质粒共转染Cos7细胞（质粒与脂质体按照1:2的比例转染）。具体步骤参考细胞转染。●转染48h后，收集细胞，裂解后离心收集上清细胞裂解液分为两部分，分别加入抗HA或Flag抗体，4℃、低速摇床孵育2h，然后再分别加入50μL的proteinA/Gbeads，4℃、低速孵育2h，收集孵育混合物，4000r/min、4℃离心5min，弃上清（初始实验留上清作为对照分析），沉淀用冰冷细胞裂解液洗4遍，弃上清，取沉淀加入上样缓冲液，煮沸后进行SDS-PAGE。●SDS-PAGE蛋白分离后，转膜，然后用抗Flag抗体或抗HA抗体（1:3000稀释，室温孵育2h）进行Western-bolt分析。2.2.2.8Pull-down验证V蛋白及其突变体与MDA5的相互作用●取600μl纯化后的V蛋白及其突变体蛋白分别加入不同离心管中，取50μl的GST-Resin，低速4℃结合2h后，使用1ml1×GST洗涤缓冲液4000r/min、4℃离心5min轻柔洗涤结合珠4次，分别加入300μlCos细胞表达的MDA5或STAT蛋白细胞裂解上清。同时加PBS（pH7.4）补齐至800μl，轻柔混匀，低速4℃结合2-4h。●结合后的混合物用冰冷的PBS（pH7.4）轻柔洗涤4×5min（离心条件4℃、4000r/min离心5min）。●收集沉淀，加入上样缓冲液，煮沸进行SDS-PAGE。●转膜后，分别用抗GST（1:10000室温孵育30min-1h）抗体和抗Flag抗体（1:3000，室温孵育1-2h）进行Western-blot分析。具体步骤参考westen-blot分析步骤。2.3实验结果2.3.1PPRVV蛋白对RLRs介导的IFN产生的影响2.3.1.1重组质粒的构建合成的V基因分别克隆至真核表达载体pCAGGs和原核表达载体pGEX4T-1，同时利用不同的突变引物（参考引物序列列表）扩增V蛋白的缺失或单位点突变体。图9A是扩增的V-HA-pCAGGs质粒（1：pCAGGs对照；2：V-HA-pCAGGs重组质粒；3：V-HA-pCAGGs的双酶切鉴定；4：V-HA-pCAGGs质粒的V基因PCR扩增鉴定；M：5000bpmarker；V基因：897bp）；图9B是扩增的V-pGEX4T-1重组质粒（5：pGEX4T-1对照；6：V-pGEX4T-1重组质粒；7：V-pGEX4T-1的双酶切鉴定；8：V-pGEX4T-1质粒的V基因PCR扩增鉴定；M：5000bpmarker；V基因：897bp）；图9C是VNT-HA-pCAGGs与VCT-HA-pCAGGs的酶切鉴定图（9：VNT-HA-pCAGGs酶切图；10：VCT-HA-pCAGGs酶切图）；D图是筛选后的V单位点突变体克隆到pCAGGs的重组质粒（1-31的位点参考V蛋白突变位点列表）。V蛋白及其突变体同时插入到pGEX4T-1中，由于重组质粒较多，上述图作为代表表示。31 中国农业科学院博士学位论文第二章PPRVV蛋白拮抗MDA5介导的IFNs产生的分子机制及其功能位点的确定图9前期质粒构建代表示意图(A)V基因插入到pCAGGs质粒示意图（Ｍ：5000bpmarker;1:V-HA-pCAGGs;2:V-Flag-pCAGGs;3:V-HA-pCAGGs酶切鉴定图；４：V-Flag-pCAGGs酶切鉴定图）；（B）V基因插入到pCAGGs质粒示意图(M:5000bpmarker;5,6:V-HA-pGEX4T-1;7,8:V-HA-pGEX4T-1酶切鉴定图)；(C)VCT/PNT-HA-pCAGGs质粒示意图(9:PNT-HA-pCAGGs酶切鉴定图;10:VCT-HA-pCAGGs酶切鉴定图;11:V-HA-pCAGGs酶切鉴定图)；(D)V基因突变体插入到pCAGGs质粒示意图(Ｍ:marker)Fig.9Plasmidconstructs(A)VgenewasinsertedintopCAGGsplasmid(M:5000bpmarker;1:V-HA-pCAGGs;2:V-Flag-pCAGGs;3:V-HA-pCAGGsrestrictionenzymeanalysisdiagram;4:V-Flag-pCAGGsidentificationchart);(B)VgenewasinsertedintopCAGGsplasmid(M:5000bpmarker;5,6:V-HA-pGEX4T-1;7,8:V-HA-pGEX4T-1restrictionenzymeanalysisdiagram);(C)diagramofVCT/PNT-HA-pCAGGsplasmid(9:PNT-HA-pCAGGsenzymedigestionidentificationchart;10:VCT-HA-pCAGGsenzymedigestionidentificationchart;11:V-HA-pCAGGsrestrictionenzymedigestionidentificationchart);(D)themutantionofVgeneinsertedintothepCAGGsplasmid(M:marker)2.3.1.2重组蛋白及其突变体的原核表达及纯化32 中国农业科学院博士学位论文第二章PPRVV蛋白拮抗MDA5介导的IFNs产生的分子机制及其功能位点的确定V蛋白洗脱优化条件，如图10所示。图10所示Ｖ蛋白经过2-15泳道的洗涤后，使用10mM还原性谷光甘肽洗脱液洗脱（17，18泳道），说明V蛋白的纯化效果较好。纯化蛋白较多，以V蛋白纯化效果图代表。图10V-GST蛋白纯化代表示意图Fig.10V-GSTproteinpurification2.3.1.3PPRVV蛋白抑制I-IFN的产生为研究西藏株PPRVV蛋白能否抑制IFN的产生，分别用PPRV感染Cos7细胞、HEK293T细胞和A549细胞，检测其对细胞的易感性。根据报道Cos7细胞不能产生内源性IFN。因此，用HEK293T细胞作为研究对象，通过PPRV感染经SeV处理的HEK293T细胞，发现细胞能产生大量的IFN(图11)。细胞感染PPRV后，经过7天就出现蚀斑。而未经SeV处理的HEK293T发生细胞病变的时间明显早于经过SeV处理的细胞（图11B）。说明PPRV能显著减弱SeV诱导的I型IFN产生（图11Ｃ）。以上结果说明，PPRV能干扰I-IFN的产生。为明确PPRV蛋白是否参与IFN产生的抑制过程，用IFN-β荧光素酶报告基因质粒和pRL-TK-luc海肾荧光素酶报告基因质粒，分别与PPRV的N、F、H、M、V、P基因重组质粒共转染HEK293T细胞，24h后用SeV处理细胞，24h后检测荧光素酶报告基因的活性。如图11D所示，V蛋白抑制IFN产生的量与对照相比,降低了10倍以上，这说明PPRVV蛋白明显抑制SeV诱导的IFN的产生。PPRV能感染Cos7细胞、HEK293T细胞和A549细胞，同时PPRV能抑制SeV诱导IFN的产生。通过荧光素酶检测筛选，最终确定PPRVV蛋白抑制IFN产生的效果最为明显（图11）。33 中国农业科学院博士学位论文第二章PPRVV蛋白拮抗MDA5介导的IFNs产生的分子机制及其功能位点的确定图11：PPRVV蛋白抑制IFN的产生（A）：PPRV能够感染Cos7细胞（一抗：抗PPRVN蛋白血清，绿色；DAPI染细胞核，蓝色）。（B）通过SeV处理PPRV感染的HEK293K细胞的病变时间延长。（C）PPRV干扰SeV诱导的I型IFN的产生，mean±SD,n=3。（D）筛选PPRV发挥抑制IFN产生的功能蛋白。V蛋白抑制INF的产生效果明显。Fig.11PPRVVproteininhibitstypeIIFNproductionandblockstypeIIFNactivation.(A)Cos7cellswereinfectedwithPPRV.CellswerestainedwithantiseratoPPRVnucleoproteinN(Yanetal.,)andstainednucleiwithDAPI(blue).Mergeofthetwostainingisshownontherightpanel.(B)HEK293TcellsmorphologyinfectedbySeVinpriortoPPRVbecameirregularrapidly.(C)PPRVinterferestheproductionofIFN-α/βinducedbySeV.HEK293TcellsweretransfectedwithIFN-βluciferasereporterplasmid,at18hpost-transfection,cellswereeitherinfectedwithPPRVorleftuninfected.At36hpost-infection,cellswereinfectedwithSeVfor12handthenluciferaseactivitywasmeasured.Graphshowsmean±SD,n=3.(D)ScreeningproteinsofPPRVwhichinterferetheproductionofIFN-βinducedbySeV.2.3.1.2PPRVV蛋白抑制RLRs介导的I-IFN的产生参考2.3.1.1的结果，SeV核酸能激活RIG-I，导致IFN的产生。图11D说明V蛋白能抑制RIG-I介导的I型IFN的产生。研究证实，V蛋白能结合RLRs中MDA5和LGP2模式识别受体，进而抑制IFN的产生。V蛋白通过其CTD区特异性结合MDA5和LGP2，但不能结合RIG-I(Andrejevaetal.,2004,Parisienetal.,2009)。根据HiromiTakaki等研究发现，麻疹病毒的不同毒株对于MDA5介导的IFN34 中国农业科学院博士学位论文第二章PPRVV蛋白拮抗MDA5介导的IFNs产生的分子机制及其功能位点的确定产生不同的影响，PPRVV蛋白对于IFN影响研究不多。为了阐释PPRVV蛋白对于RLRs介导的IFN产生的影响，本研究利用HEK293T细胞为研究对象，V蛋白分别与RIG-I和MDA5转染HEK293T细胞，检测IFN-β报告基因的荧光素酶变化。图12A显示，与对照比较，PPRVV蛋白与V蛋白的C端部分导致IFN产生的荧光素酶的表达量降低了至少10倍，这说明PPRVV蛋白及其C端区域能够抑制poly（I:C）诱导的IFN的产生。但V蛋白的N端对于IFN产生与对照相比无明显影响。由于Poly（I:C）能够同时被MDA5和RIG-I识别，所以MDA5或者RIG-I单独都能激活IFN的产生。图12B和图12C通过分别检测V蛋白对于MDA5介导的或者RIG-I介导的IFN产生的影响。图12B和图12C转染不同剂量的V基因重组质粒（400ng-1200ng）和2ng的MDA5/RIG-I的重组质粒。结果显示当MDA5的转染量保持恒定，分别增加V蛋白的表达量，能够导致MDA5介导的IFN的表达量逐渐降低，这说明V蛋白能够非常有效的抑制MDA5介导的IFN的产生具有剂量依赖性，然而对于RIG-I介导的IFN的产生与对照相比并无明显抑制效果。从图案12A可以得知V蛋白的C端对于IFN产生的抑制起到关键作用，所以实验中检测了V蛋白的不同区域对于MDA5或者RIG-I介导的IFN产生的影响。结果显示V蛋白的N端（VNT）随着剂量增大对于MDA5介导的IFN的产生无明显影响（图12D图12E）。与图案12A相似的是V蛋白C端（VCT）抑制MDA5介导的IFN的产生具有剂量依赖性（图12F）。同样，分别增加VCT的转染量发现，VCT不影响RIG-I介导的IFN的产生（图12G）。35 中国农业科学院博士学位论文第二章PPRVV蛋白拮抗MDA5介导的IFNs产生的分子机制及其功能位点的确定图12：PPRVV蛋白抑制RLRs介导的I-IFN的产生(A)V蛋白及其缺失突变体VCT抑制poly(I:C)诱导的I-IFN的产生，但V蛋白的N端抑制不能抑制其产生；(B)V蛋白抑制MDA5介导的I-IFN的产生，同时这种抑制具有V蛋白剂量依赖性；(C)V蛋白不能抑制RIG-I介导的I-IFN的产生；(D)V蛋白的N端不能抑制RIG-I介导的I-IFN的产生；(E)V蛋白的N端不能抑制MDA5介导的I-IFN的产生；(F)V蛋白的C端不能抑制RIG-I介导的I-IFN的产生；(G)V蛋白抑制C端抑制MDA5介导的I-IFN的产生，同时这种抑制具有VCT蛋白剂量依赖性Fig.12PPRVVproteininhibitsRLRsmediatedI-IFNproduction(A)VproteinandVCTinhibitspoly(I:C)inducedI-IFNproduction,VNTcannotsuppresstheproductionofI-IFN;(B)VproteininhibitsMDA5-mediatedI-IFNproduction,theinhibitionisinaVproteindose-dependentmanner;(C)VproteincouldnotinhibitRIG-ImediatedI-IFNproduction;(D)PNTcouldnotinhibitRIG-ImediatedI-IFNproduction;(E)NterminalofVproteincouldnotinhibitsMDA5mediatedI-IFNproduction;(F)VCTcouldnotinhibitRIG-ImediatedI-IFNproduction;(G)VproteininhibitsMDA5-mediatedI-IFNproduction,andthisproductioninaVproteindose-dependentmanner.36 中国农业科学院博士学位论文第二章PPRVV蛋白拮抗MDA5介导的IFNs产生的分子机制及其功能位点的确定结果说明PPRVV蛋白能够抑制poly(I:C)或者RLR介导的IFN的产生，V蛋白的C端在这种抑制作用中发挥着关键作用。同时结果显示PPRVV蛋白和V蛋白的C端抑制IFN的方式具有剂量依赖性。2.3.2PPRVV蛋白对RLRs介导的IFN产生的影响2.3.2.1PPRVV蛋白及VCT突变体分别与LGP2协同抑制RLRs介导的I-IFN的产生LGP2在IFN的产生过程中起到正负两种调节功能。这种正负调节可能与病毒类型或活化的模式识别受体相关。相关研究发现LGP2对于一些病毒活化的RIG-I也有正调控作用(Satohetal.,2010)。为了阐释PPRVV蛋白及缺失突变体分别与LGP2协同抑制RLRs介导的I-IFN的产生，本研究利用HEK293T细胞为研究对象，LGP2和V蛋白分别与RIG-I和MDA5共转染，检测IFN-β报告基因的荧光素酶变化。图13A和图13C显示PPRVV蛋白在LGP2存在的情况下,抑制RIG-I介导的IFN产生的能力与对照相比明显提高，图案13A同时发现PPRVV蛋白在LGP2存在时抑制RIG-I介导的IFN产生具有剂量依赖性；图13C结果显示V蛋白的C端在LGP2协助下，与对照比较，IFN的产生降低大约四倍。这说明V蛋白促进LGP2负调控RIG-I介导的IFN的产生。图13B和图13D显示PPRVV蛋白在LGP2存在的情况下,抑制MDA5介导的IFN产生的能力与对照相比显著增强，图案13B同结果表明PPRVV蛋白在LGP2存在时抑制MDA5介导的IFN产生具有剂量依赖性；图13D结果表示V蛋白的C端在LGP2协助下，与对照比较，IFN的产生降低大约两倍。这说明通过分别检测V蛋白及VCT突变体对于促进LGP2抑制MDA5介导IFN的产生且具有计量依赖性。以上结果总体说明V及VCT蛋白能够与LGP2协同抑制RLRs介导的I-IFN的产生。37 中国农业科学院博士学位论文第二章PPRVV蛋白拮抗MDA5介导的IFNs产生的分子机制及其功能位点的确定图13PPRVV蛋白及VCT突变体分别与LGP2协同抑制RLRs介导的I-IFN的产生(A)V蛋白与LGP2协同抑制RIG-I介导的I-IFN的产生；(B)V蛋白与LGP2协同抑制MDA5介导的I-IFN的产生；(C)V蛋白与LGP2协同抑制RIG-I介导的I-IFN的产生；但V蛋白的N端不参与抑制；(D)VCT蛋白与LGP2协同抑制MDA5介导的I-IFN的产生，同时这种抑制具有VCT蛋白剂量依赖性Fig.13PPRVVproteinorVCTcoordinatewithLGP2toinhibitRLRs-mediatedI-IFNproduction(A)VproteincoordinatewithLGP2toinhibitRIG-I-mediatedI-IFNproduction;(B)VproteincoordinatewithLGP2toinhibitMDA5-mediatedI-IFNproduction;(C)VproteincoordinatewithLGP2toinhibitRIG-ImediatedI-IFNproduction,butPVTofVproteinisnotinvolvedintheinhibition;(D)VCTproteincoordinatewithLGP2toinhibitMDA5-mediatedI-IFNproductioninaVCTdose-dependentmanner38 中国农业科学院博士学位论文第二章PPRVV蛋白拮抗MDA5介导的IFNs产生的分子机制及其功能位点的确定2.3.2.2PPRVV蛋白结合MDA5进而抑制I-IFN产生的关键区域和氨基酸确定PPRVV蛋白虽然可以通过LGP2协同抑制RIG-I介导的IFN的产生，但是免疫共沉淀实验没有发现V蛋白能够通过LGP2结合RIG-I。麻疹病毒属病毒可以利用自身V蛋白结合MDA5抑制IFN的产生，V蛋白的C端以及C端的半胱氨酸对于结合MDA5非常重要。本研究比对麻疹病毒属病毒V蛋白，将PPRVV蛋白的C255和C272及保守的W240和W250位的氨基酸突变为丙氨酸，破坏PPRVV蛋白的锌指结构。在Cos7细胞中MDA5蛋白，与PPRVV蛋白突变体通过免疫共沉淀，验证PPRVV蛋白结合MDA5的必需氨基酸位点。图14A显示PPRVV蛋白可以结合MDA5，在免疫共沉淀实验结果中也发现MDA5条带有两个，推测为MDA5二聚体。说明V蛋白可以和MDA5的多聚体形式结合。多聚体的V蛋白是否可以和MDA5多聚体形成大的复合体有待于进一步的证实。图案14A结果同样显示PPRVV蛋白不能结合RIG-I，这和其它的副粘病毒科病毒V蛋白的研究一致。PPRVV蛋白N端和C端存在不同功能，图14B结果显示PPRVV蛋白的C端（VCT）能够结合MDA5，PPRVV蛋白的N端以及C255和C272的突变体图14PPRVV蛋白及其突变体结合MDA5进而抑制I-IFN产生的关键区域和氨基酸确定(A)PPRVV蛋白结合MDA5，不能结合RIG-I；(B)V蛋白的C端参与结合MDA5，C端的半胱氨酸残基对于V蛋白的结合起关键作用。Fig.14ThecriticalaminoacidofPPRVVproteinforVproteininhibitMDA5mediateI-IFNproduction39 中国农业科学院博士学位论文第二章PPRVV蛋白拮抗MDA5介导的IFNs产生的分子机制及其功能位点的确定(A)PPRVVproteinbindswithMDA5,notwithRIG-I;(B)CterminalofVproteininvolvedinbindingtotheMDA5,cysteineresiduesofVCTplayakeyroletobindwithMDA5丧失结合MDA5的能力，但W240和W250突变体与MDA5的结合没有受到影响。这说明PPRVV蛋白在与MDA5的结合过程中，其C端起决定作用，C端保守的Trp没有特异性功能，N端不参与MDA5的结合，N端和Ｃ端的Trp安基酸不参与抑制MDA5介导的IFN的产生。2.4结论本研究通过荧光素酶检测和免疫共沉淀实验验证PPRVV蛋白能够抑制IFN的产生。实验结果显示V蛋白可以抑制RLRs通路介导的IFN的产生，由于V蛋白能够结合MDA5和LGP2，与RIG-I不能形成复合体，同时LGP2不参与向MAVS蛋白传递信号，只具有调节RIG-I和MDA5的功能。所以在实验V蛋白和LGP2分别与MDA5和RIG-I共转染发现，V蛋白可以通过与LGP2协同抑制RLRs通路介导的IFN的产生。MDA5介导的IFN产生的抑制，可能是由于PPRVV蛋白直接结合MDA5导致MDA5的构型发生变化，使得MDA5不能向MAVS蛋白传递活化信号。V蛋白不能结合RIG-I，在同时存在LGP2的时候，却能够抑制RIG-I介导的IFN的产生，V蛋白通过何种方式结合或者抑制RIG-I介导的IFN的产生，有待于进一步的阐述。后期实验将使用LGP2的miRNA干扰实验确认V蛋白与LGP2协同抑制RIG-I介导IFN产生的分子机制，希望通过一些新技术提供三者同时存在的证据。40 中国农业科学院博士学位论文第三章PPRVV拮抗STAT介导的IFNs信号转导的功能位点的确定第三章PPRVV蛋白拮抗和干扰STAT蛋白介导的干扰素信号转导的分子机制及其功能位点的确定3.1前言干扰素（IFNs），尤其I型干扰素介导先天性抗病毒免疫应答(Cardenas2010,Takakietal.,2013,Wangetal.,2010)。IFNs识别细胞表面受体，激活与受体相关的JAK-Tyk2信号转导激酶，然后该激酶磷酸化STAT1和STAT2。STAT1和STAT2互相结合，进入细胞核并与干扰素调节因子9（IRF9）形成转录因子复合体（ISGF3），该复合体结合到IFN刺激应答元件，导致宿主细胞进入抗病毒状态。研究显示，CDV、MV、PPRV及RPV的V蛋白能干扰Tyk2激酶的磷酸化，从而有效抑制IFN诱导的STAT蛋白的磷酸化。麻疹病毒的V蛋白与STAT蛋白具有不同的亲和力，V蛋白抑制IFN信号转导的途径也不相同。V蛋白通过结合STAT蛋白抑制其进入细胞核，进而抑制IFN抗病毒状态的产生(Chinnakannanetal.,2013)。研究证实，MVV蛋白能通过拮抗JAK介导的STAT1的磷酸化，进而抑制I型IFN的信号转导(Caignardetal.,2007)。还有报道显示，MVV蛋白主要以STAT2为靶标，拮抗IFN的信号转导(Ramachandranetal.,2008)。MVV蛋白的锌指结构对STAT2的结合和IFN的信号转导是必需的。CTD内许多保守的氨基酸对于结合STAT2起到关键作用。PPRVV蛋白对STAT蛋白的影响研究较少。本研究推测PPRVV蛋白可能通过特异性的功能位点抑制STAT蛋白的信号转导。研究结果显示PPRVV蛋白通过结合STAT1/2抑制IFN的信号转导，同时PPRVV蛋白可以导致STAT蛋白的分布发生变化。STAT1和STA2的结合位点在V蛋白的N端和C端也被证实，保守的Cys和Trp对于STAT2的结合至关重要，275和277位氨基酸对于IFN的抗病毒活性抑制也起到一定作用。3.2实验材料和方法3.2.1实验耗材、试剂及其试剂配制方法参考第二章3.2.2实验方法3.2.2.1VSV病毒感染转染V蛋白后的Cos7细胞●抗病毒应答检测使用带有绿色荧光的VSV病毒。细胞使用Cos7细胞。●细胞铺板24h后，转染空载体，野生型V蛋白载体或者V蛋白突变体载体。●转染24h，细胞使用IFN处理8h后，使用OPTI-MEM培养基清洗。●加入9×105PFU/well的VSV-GFP重组病毒，37℃孵育1h，使用OPTI-MEM培养基培养。●培养18h后，检测细胞的荧光情况。41 中国农业科学院博士学位论文第三章PPRVV拮抗STAT介导的IFNs信号转导的功能位点的确定3.3实验结果3.3.1PPRVV蛋白拮抗IFN的产生以及IFN的活性。图案11中已经证实PPRVV蛋白能够抑制IFN的产生（图11）。为了进一步的验证PPRV抑制I型和II型干扰素的活性，HEK293T在分别使用PPRV的不同蛋白：N、F、H、M、V、P和pISRE-luc或者pGAS-Luc共转染。24h后，细胞使用1000U/ml的IFN-β或者IFN-γ进行处理，处理后24h，收集细胞检测荧光素酶的活性。实验结果显示IFN-β能够有效的激活含有ISGF3转录因子应答元件的ISRE荧光素酶报告基因，同时发现PPRV的N、P、V蛋白分别能够有效的抑制IFN-β处理后的细胞的ISRE报告基因的表达（图15E）。同样图15F结果显示IFN-γ能够有效的激活含有STAT1依赖的IFN-γ活化因子应答元件的GAS荧光素酶报告基因，PPRV的N、P、V蛋白有效的抑制IFN-γ处理后的细胞的GAS报告基因的表达（图15F）。这说明PPRVN、P、V能够有效的抑制IFN的活性，结果中也显示PPRVV蛋白较PPRVN或者P蛋白更加有效的抑制IFN的活性。实验证实PPRV在感染的宿主细胞中能够利用其自身蛋白抑制IFN的信号转导。图15PPRVV蛋白拮抗IFN的产生以及IFN的活性(A)(B)(C)(D)参考图11；(E)PPRVV蛋白、N蛋白、P蛋白抑制IFN-β诱导的ISRE的活化，V蛋白抑制效果最为显著；(F)PPRVV蛋白、N蛋白、P蛋白抑制IFN-γ诱导的GAS的活化，V蛋白抑制效果最为显著。Fig.15VproteininhibitstheproductionofIFNandIFNactivation42 中国农业科学院博士学位论文第三章PPRVV拮抗STAT介导的IFNs信号转导的功能位点的确定(A)(B)(C)(D)withreferencetofigure11;(EandF)IdentificationofproteinsofPPRVwhichinterferetheactionsofIFNs.Theresultsrepresentmean±SDfortriplicatesamples.3.3.2PPRVV蛋白通过抑制STAT1/2的入核而非降解STAT1/2的方式拮抗IFN的信号转导，同时这种方式具有剂量依赖性IFN从感染病毒细胞中通过旁分泌方式将信号传递给相邻细胞，而IFN诱导的抗病毒的产生需要STAT1和STAT2的参与。3.3.1的结果显示PPRVV蛋白能够抑制STAT介导的IFN抗病毒信号转导。过表达PPRVV蛋白能够抑制IFN诱导的ISRE和GAS启动子的活化。图15显示，在HEK293T细胞中过表达PPRVV蛋白能够有效的抑制IFN-α/β诱导的ISRE的活化。通过增加PPRVV蛋白的转染量显示，这种抑制具有剂量依赖性（图16A）。同时过表达PPRVV蛋白也能有效的抑制IFN-γ诱导的GAS的活化。研究证实PPRV拮抗IFN诱导的STAT1和STAT2的磷酸化进而抑制STAT蛋白的入核(Chinnakannanetal.,2013)。为了证实PPRVV蛋白对IFN诱导的STAT蛋白入核的影响，V蛋白与STAT1或者STAT2分别共转染Cos7细胞，使用激光共聚焦检测V蛋白及STAT蛋白的细胞分布。图16B和图16C显示，I型干扰素诱导的STAT蛋白的入核与出核被PPRVV蛋白抑制，而且V蛋白C端和N端都参与了STAT蛋白的入核抑制。在没有IFN诱导的Cos7细胞中发现，V蛋白、PNT以及VCT蛋白在细胞质和细胞核中都存在。根据confocal的结果，当STAT蛋白分别与V、VNT、VCT蛋白共转染IFN诱导后的Cos细胞，STAT蛋白的细胞分布发生变化，STAT蛋白不穿梭于细胞质和细胞核中，只存在于细胞质中。图16B和图16C显示IFN诱导后的细胞中，PPRVV蛋白能够调整STAT蛋白的分布，PNT蛋白能够抑制STAT1的入核，而VCT抑制STAT2的入核。副粘病毒科病毒V蛋白能够通过结合STAT蛋白进而促进STAT蛋白的泛素化降解STAT蛋白，使之不能在细胞核中富集。为了证实PPRVV蛋白改变STAT蛋白的分布是否为降解STAT蛋白所引起，使用MG132检测STAT蛋白的降解情况（图16D）。图中显示V蛋白抑制STAT蛋白在细胞核内的富集不是通过降解STAT蛋白。总之，PPRVV蛋白抑制IFN诱导的ISRE和GAS启动子的活性，V蛋白抑制STAT蛋白的入核不是通过降解STAT蛋白的方式。43 中国农业科学院博士学位论文第三章PPRVV拮抗STAT介导的IFNs信号转导的功能位点的确定图16PPRVV蛋白通过抑制STAT1/2的入核而非降解STAT1/2的方式拮抗IFN的信号转导，同时这种方式具有剂量依赖性（A）PPRVV蛋白能够有效的抑制IFN-α/β诱导的ISRE的活化。这种抑制具有剂量依赖性；（B和C）I型干扰素诱导的STAT蛋白的入核与出核被PPRVV蛋白抑制，而且V蛋白C端和N端都参与了STAT蛋白的入核抑制；（D）V蛋白抑制STAT蛋白在细胞核内的富集不是通过降解STAT蛋白Fig.16.PPRVVproteinblocksIFNssignalingtransductioninadose-dependentmannerbyinhibitionofSTAT1/2translocationnotinadegradationway.(A)PPRVVproteininhibitstheactivationoftheISREpromoterinducedbytypeIIFNinadose-dependentmanner.(+)44 中国农业科学院博士学位论文第三章PPRVV拮抗STAT介导的IFNs信号转导的功能位点的确定treatedand(-)leftuntreated.Graphshowsmean±SD,n=3.(B)PPRVVproteincannotinhibitthenucleartranslocationofSTAT1/2withouttypeIIFNtreated.(C)PPRVVproteininhibitsnucleartranslocationofSTAT1/2proteinsinducedbyIFN-α/β.(D)PPRVVproteincombineswithSTATproteinbutnotpromotesSTATproteindegradation.ImmunoblotingofSTAT1,GAPDHandVprotein.＋/－V-HADNAtransfectionofCos7cells,andallthecellsampletransfectedwithSTAT1-FLAG,treated＋/－MG132for4h.3.3.3PPRVV蛋白通过结合STAT蛋白抑制IFN诱导的信号转导的功能区确定。图17V蛋白N端和C端抑制IFN诱导的IFN的信号转导（A）V蛋白N端和C端抑制IFN诱导的IFN的信号转导；（B）免疫共沉淀显示VNT与STAT1结合，与STAT2不能结合；（C）GSTpull-down实验显示VCT与STAT2结合。Fig.17PNTandVCTinhibitIFN-inducedsignalingtransduction(A)PNTandVCTinhibitIFN-inducedsignalingtransduction;(B)byusingCo-IP,VNTcombinewithSTAT1,notwithSTAT2;(C)byusingGSTpull-down,VCTcombinewithSTAT2研究证实V蛋白的N端和C端都参与抑制STAT蛋白介导的干扰素信号转导。图17显示PNT和VCT与对照相比都能抑制IFN诱导的信号转导。图17B结果显示PNT能够结合STAT1，而与STAT2没有反应。由于VCT蛋白较小，不易检测，所以使用体外结合实验检测而VCT能够STAT245 中国农业科学院博士学位论文第三章PPRVV拮抗STAT介导的IFNs信号转导的功能位点的确定（图17B和17C）。为了检测PPRVV蛋白C端Cys决定簇对STAT蛋白结合的影响，构建V蛋白Cys的突变体。V蛋白的保守区域和一些保守的氨基酸对于STAT蛋白的结合非常重要。如hPIV2V蛋白通过Trp基序结合STAT1/2，同时V蛋白的Y110位氨基酸对于结合STAT1非常关键。MVV蛋白抑制STAT1/2的入核，但是MVV蛋白这种抑制作用采用的是不同的方式。所以为了证实PPRVV蛋白是否具有相似的与STAT蛋白结合的关键氨基酸位点，实验将V蛋白、V蛋白缺失体、V蛋白的氨基酸单位点突变体分别于STAT1/2共转染Cos7细胞。利用免疫共沉淀和pull-down实验，验证V蛋白结合STAT蛋白的功能位点。图17显示，当V蛋白C端的Trp（W240A/W250A）发生突变，V蛋白不能和STAT蛋白形成复合体。在副粘病毒科病毒V蛋白的比对中发现，如hPIV2,W178氨基酸也非常保守，在PPRV中这个氨基酸被L236取代，所以将PPRVV蛋白L236位氨基酸也进行突变，检测其对STAT蛋白结合的影响。结果显示，V蛋白单独的Trp突变导致与STAT2蛋白的结合能力丧失，但不影响与STAT1的结合。同时发现W250A突变体结合STAT1的能力也降低。当V蛋白的D248位氨基酸突变后，PPRVV蛋白失去结合STAT2的能力。C端区域的Cys决定簇与C端232位组氨酸（His）形成锌指结构，所以构建Cys和His的单位点突变体，结果显示任何一个Cys或者His突变，导致锌指结构破坏，都将使PPRVV蛋白丧失结合STAT2的能力。此实验过程中，利用激光共聚焦显微镜也检测了V蛋白突变体对于STAT蛋白细胞内分布的影响，图17E中显示以255/250/236为例，阐释了Trp和Cys也能够影响STAT2蛋白的亚细胞分布。总之，PPRVV蛋白的C端的锌指结构中的Cys、Trp以及D248位氨基酸对于STAT2的结合非常重要，但不影响与STAT1的结合。V蛋白Y110位氨基酸对于STAT1-V复合体的形成也至关重要。46 中国农业科学院博士学位论文第三章PPRVV拮抗STAT介导的IFNs信号转导的功能位点的确定图18PPRVV蛋白通过结合STAT蛋白抑制IFN诱导的信号转导的功能区确定（A和B）确定PPRVV蛋白结合STAT1的关键氨基酸；（C和D）确定PPRVV蛋白结合STAT2的关键氨基酸；（E）V蛋白结合STAT蛋白的关键氨基酸对STAT蛋白在细胞中分布的影响。Fig.18ZincstructureofPPRVVproteinareessentialforformationofVprotein-STAT2complexformation.(A)MutationsweregeneratedbysitesubstitutiontotestthefunctionofTrpmotifandY110aminoacidresidueforbindingSTAT1protein.(B)SitemutationsweregeneratedtotesttheroleoffingerdomaininbindingSTAT1proteinprocess.(C)Like(A)buttesttheabilityofVmutationscombinewithSTAT2protein.(D)Samesitemutationsfrom(B),usingCo-IPassaytotesttheabilitiesofmutationstobindwithSTAT2protein.(E)MutationsofC255/C272/C269-276ofVproteinsdonothaveabilitiestoblocktheassociationwithSTAT2.(F)MutationsofVproteinshavedifferentabilitiestoblockthetranslocationofSTAT2.The255/250mutantsdonotinterferetranslocationofSTAT2,butL236mutantstillhastheabilitytoblocktheSTAT2translocation.3.3.4PPRVV蛋白突变体导致抑制IFN诱导的抗病毒能力的丧失许多研究证实，MVV蛋白的保守区域抑制IFN-α/β诱导的抗病毒活性的能力不同。为了证实PPRVV蛋白保守区域抑制IFN-α/β诱导的抗病毒活性，实验比较了PPRVV蛋白和其突变体拮抗IFN活性。使用荧光素酶检测方法和VSV-GFP病毒复制实验验证V蛋白及其突变体在生理状态下的抗病毒效果。V蛋白及其突变体分别转染Cos7细胞，24h后，细胞使用10,100,1000IU/ml的47 中国农业科学院博士学位论文第三章PPRVV拮抗STAT介导的IFNs信号转导的功能位点的确定IFN-β处理检测V蛋白与其突变体表达了表达量。结果显示V蛋白与其突变体具有相似表达量的情况下（图18A），抑制IFN诱导的ISRE的活化程度不同（图18）。V蛋白、D248、Trp和Cys突变体干扰IFN-α/β诱导的信号转导，相比较，其它突变体对于IFN-α/β诱导的信号转导影响较小（图18B）。V蛋白及其突变体分别转染Cos7细胞，24h后，细胞使用10,100,1000IU/ml的IFN-β处理，然后细胞经过MOI=0.1的VSV-GFP感染。16h后，荧光观察VSV复制情况。图18C显示的结果和图10B的结果相一致。PPRVV蛋白的Trp和锌指结构对于IFN诱导的抗病毒状态非常关键。同时V蛋白D248和Y110位氨基酸突变体对于VSV的复制也有影响。图19PPRVV蛋白突变体对抑制IFN诱导的抗病毒能力影响（A）V蛋白及其突变体分别转染Cos7细胞，24h后，细胞使用10,100,1000IU/ml的IFN-β处理检测V蛋白与其突变体表达量相似；（B）V蛋白及其突变体分别转染Cos7细胞，细胞使用IFN-β处理后检测V蛋白与其突变体抑制IFN诱导的ISRE的活化程度；（C）V蛋白及其突变体分别转染Cos7细胞，24h后，细胞使用10,100,1000IU/ml的IFN-β处理后，检测对于VSV-GFP复制影响。Fig.19MutationsofPPRVVproteinresultinloseoftheabilitiestoblocktypeIIFNaction.(A)PPRVVproteinanditsmutantswithHAtagwereexpressedatsimilarlevels;(B)ThesameexperimentprocesslikeaboveforISRE-lucluciferaseassaybutusemutationVproteins;(C)VSV-GFPinfectionassayforthetypeIIFN-inducedantiviralstatus.48 中国农业科学院博士学位论文第三章PPRVV拮抗STAT介导的IFNs信号转导的功能位点的确定3.4结论本研究通过荧光素酶，免疫共沉淀、pull-down等实验手段，证实PPRV西藏毒株V蛋白参与抑制IFN诱导的信号转导。PPRVV蛋白可以通过抑制STAT介导的IFN的信号转导，确定了结合STAT1/2进而拮抗STAT1/2细胞分布的V蛋白关键氨基酸位点。V蛋白C端的Trp和Cys氨基酸对于结合STAT2蛋白至关重要。在抑制I型干扰素诱导的信号转导过程中，Trp和Cys不可或缺。同时发现D248也对于STAT2的结合很关键。V蛋白N端的Y110位氨基酸参与抑制STAT1介导的I型和II型干扰素诱导的信号转导。49 中国农业科学院博士学位论文第四章全文讨论第四章全文讨论副粘病毒科病毒感染宿主引起先天性免疫系统抑制。粘病毒科病毒采用有效的方式逃避先天性免疫系统。第一，拮抗IFN的产生(Huangetal.,2014,Ikegameetal.,2010,Komatsuetal.,2004,Ningetal.,2014)，如牛瘟病毒、麻疹病毒、犬瘟热病毒以及小反刍兽疫病毒拮抗IFN的产生。本研究研究结果显示PPRV能够抑制SeV诱导的IFN-β产生（图11）；第二，通过病毒自身蛋白抑制IFN诱导的的抗病毒蛋白(Metzetal.,2012,Zhaoetal.,2013)；第三，是结合IFN诱导的信号转导通路蛋白导致其降解或者形成失活状态从而干扰IFN诱导的抗病毒应答(Chinnakannanetal.,2013,Devauxetal.,2007,Nakatsuetal.,2008,Ramachandranetal.,2008,Sunetal.,2004)。PPRVV蛋白是一个潜在的IFN信号转导途径抑制子(Chinnakannanetal.,2013)。不同的病毒，不同的毒株以及不同的研究单位研究结果不尽相同(Ulaneetal.,2002,Ulaneetal.,2003)。通过荧光素酶检测证实PPRVV蛋白干扰IFN-β的产生，PPRVN、P、V蛋白都能够限制ISRE和GAS启动子的活性进而抑制IFN信号转导，V的抑制能力非常显著。可能是由于STAT1蛋白是N蛋白或者P蛋白的主要抑制因子，而V蛋白可同时抑制STAT1和STAT2。实验证实V蛋白在IFN的产生和IFN的信号转导过程中是不可忽视的抑制因子。实验结果同时显示PPRV可能存在不同方式确保抑制IFN的产生或者IFN抗病毒的应答。IFN的产生的激活途径很多，对于RNA病毒而言，RLRs途径是激活IFN产生的主要途径。RLRs途径中MDA5、RIG-I、LGP2三种模式识别受体对于dsRNA的识别至关重要。但MDA5和RIG-I活化后才能将级联信号传递到下游，导致IFN的启动子活化，IFN的表达上升。RNA病毒可以利用自身蛋白干扰RLRs途径，进而抑制IFN的产生。本实验结果显示过表达PPRVV蛋白，可以抑制MDA5介导的IFN的产生，对于RIG-I介导的IFN的产生没有影响。这说明PPRVV蛋白对RIG-I蛋白没有直接的影响，而对于MDA5蛋白有直接影响。LGP2的功能目前还不确定，有报道显示LGP2正调控MDA5，负调控RIG-I的产生。本实验发现，PPRVV蛋白在LGP2存在下，能抑制RIG-I介导的IFN的产生。这间接说明V蛋白可以抑制RIG-I介导的IFN的产生，但抑制效果需要LGP2协同完成。这个实验结果产生新的问题：LGP2是如何协同调节RIG-I介导的IFN的产生？LGP2参与的这种调节如何达到一种平衡？V蛋白如何与LGP2协同工作的？这些问题后期实验需要探讨。实验结果同时显示V蛋白可以通过与LGP2协同，抑制MDA5介导的IFN的产生。这种协同抑制的分子机制后期也需要研究。通过免疫共沉淀实验证实PPRVV蛋白可以直接结合MDA5，最终使得信号传递能力丧失。推测PPRVV蛋白结合MDA5，导致MDA5构型发生变化，不能发生活化。确定了PPRVV蛋白的C端的保守氨基酸Cys对于结合MDA5至关重要。V蛋白不能直接结合RIG-I蛋白，间接证实V蛋白调控RIG-I介导的IFN的产生需要LGP2的协同。在副粘病毒科病毒中，部分病毒V蛋白结合STAT1/2蛋白抑制抗病毒应答，如：瞬时转染SV5病毒的V蛋白可以有效抑制IFN-β的应答，而且SV5V蛋白通过降解STAT1蛋白从而拮抗IFN的信号转导。MuV和SV41病毒V蛋白也能够降低STAT1的表达水平。典型的hPIV2V蛋白不能够结合STAT1但是可以结合STAT2进而拮抗IFN的信号转导。有文献报道，MVV蛋白50 中国农业科学院博士学位论文第四章全文讨论主要优先结合STAT2抑制IFN-α/β信号转导(Cardenas2010,Martensetal.,2006,Pooleetal.,2002,Ramachandranetal.,2008,Takakietal.,2013,Wangetal.,2010)。还有副粘病毒科病毒V蛋白通过改变STAT蛋白的分布进而抑制IFN的活性。NipahV蛋白通过结合STAT1/2抑制STAT蛋白不能入核最终拮抗IFN的信号转导，同时MVV蛋白N端和C端分别结合STAT1和STAT2(Chinnakannanetal.,2013,Ramachandranetal.,2008)。PPRVV蛋白导致STAT蛋白及其自身蛋白细胞分布发生变化，与轮状病毒V蛋白有着明显的不同。但是PPRVV蛋白对于没有IFN诱导的STAT蛋白的细胞分布没有影响。一些副粘病毒科病毒V蛋白限制STAT蛋白的分布可以通过加入LMB（leptomycinB）而丧失功能。对于MVV蛋白干扰STAT蛋白的入核却独立于Crm1依赖的核输出系统(Palosaarietal.,2003)。PPRVV蛋白和MVV蛋白非常相似，其C端也很保守。所以本研究假设PPRVV蛋白也通过相似的机制改变STAT蛋白的分布。副粘病毒科病毒也可以通过干扰STAT蛋白的磷酸化或者促进STAT蛋白的降解从而抑制IFN的活性(Caignardetal.,2007,Devauxetal.,2007,Martensetal.,2006,Preciousetal.,2005,Ramachandranetal.,2008)，如：hPIV2，V蛋白与STAT1/2结合，其C端非常有效的促进STAT2蛋白的降解(Ulaneetal.,2002)。本研究也推测PPRVV蛋白是否具有这样的功能。通过实验验证PPRVV蛋白不能通过降解STAT蛋白抑制IFN的信号转导。文献报道，MV、RPV以及HeV的V蛋白通过“俘获”STAT蛋白从而抑制其入核而非降解的方式抑制IFN抗病毒应答。以往的报道证实VCT不能够结合JAK激酶(Caignardetal.,2007)，PPRV的V蛋白C端可以改变STAT2的细胞分布。这些说明VCT不能诱导STAT2的泛素化，同时VCT不能抑制JAK激酶的活化。实验结果推测V蛋白可能干扰STAT蛋白的上下游蛋白，抑制STAT蛋白的入核。如：PPRV可能调节核输入蛋白。有报道显示核定位信号（NLS）或者Npap60/Nup50对于核输入蛋白复合体的富集或者解体起到关键作用(Matsuuraetal.,2005,Nishioetal.,2005)。所以推测V蛋白可能通过调节NLS或者NLS结合蛋白karyopherin-α或者辅助蛋白Npap60/Nup50导致STAT蛋白的入核失败。图19显示推测的示意图，推测需要进一步的验证，本研究为深入探讨PPRV逃避先天性免疫的机制提供一个全新的思路。51 中国农业科学院博士学位论文第四章全文讨论图20PPRVV蛋白抑制STAT入核推测示意图Fig.20ThewayofPPRVVproteinblocksIFNsignaling.（1）VproteinblocksJAK-mediatedSTAT1phosphorylationtoinhibitIFNsignaling.(2)VproteininteractswithSTAT1/2toblockIFNsignalingorinteractswithDDB1tofacilitateSTAT2degradation.(3)PPRVVproteinblocksSTATproteinstotranslocateintonuclearandrecentlystudiesshowedVproteincouldinhibitJAK-mediatedSTAT1phosphorylation,butanotherreportsuggestedSTAT2istheprimarytargetfortheinteractionbyVprotein,wespeculatethatVproteininhibitsSTATproteintranslocationmayhaveanotherwaythroughinterferingthefunctionofkaryopherinorotherimportinproteins.52 中国农业科学院博士学位论文第五章全文结论第五章全文结论1.PPRVV蛋白可以抑制RLRs介导的IFN的产生同时也抑制STAT蛋白介导的IFN的信号转导。2.PPRVV蛋白与LGP2协同抑制RLRs介导的IFN的产生。3.PPRVV蛋白的C端参与MDA5的结合，C端的Cys对于结合MDA5至关重要，但V蛋白不能结合RIG-I。4.PPRVV蛋白可以直接结合STAT蛋白，而V蛋白的N端Y110位氨基酸是结合STAT1的功能位点，V蛋白的C端保守氨基酸Cys和Trp是结合STAT2的功能位点，V蛋白抑制IFN诱导的STAT蛋白介导的信号转导方式不是通过促进STAT蛋白降解导致IFN信号转导能力的丧失，同时V蛋白改变了STAT蛋白的亚细胞分布。5.推测PPRVV蛋白可能通过调节STAT蛋白的下游分子或者NLS分子或者NLS结合蛋白，影响STAT蛋白的入核。53 中国农业科学院博士学位论文参考文献参考文献1.信爱国，等。小反刍兽疫研究进展。中国预防兽医学报2003，25(2)：73-76.2.AaronsonDS.,etal.Aroadmapforthosewhodon'tknowJAK-STAT.Science2002,296(5573):1653-1655.3.AdombiCM.,etal.MonkeyCV1celllineexpressingthesheep-goatSLAMprotein:ahighlysensitivecelllinefortheisolationofpestedespetitsruminantsvirusfrompathologicalspecimens.Journalofvirologicalmethods2011,173(2):306-313.4.AkiraS.,etal.MolecularcloningofAPRF,anovelIFN-stimulatedgenefactor3p91-relatedtranscriptionfactorinvolvedinthegp130-mediatedsignalingpathway.Cell1994,77(1):63-71.5.AlcamiA.,etal.Viralmechanismsofimmuneevasion.Trendsinmicrobiology2000,8(9):410-418.6.AlexopoulouL.,etal.Recognitionofdouble-strandedRNAandactivationofNF-kappaBbyToll-likereceptor3.Nature2001,413(6857):732-738.7.AndrejevaJ.,etal.DegradationofSTAT1andSTAT2bytheVproteinsofsimianvirus5andhumanparainfluenzavirustype2,respectively:consequencesforvirusreplicationinthepresenceofalpha/betaandgammainterferons.Journalofvirology2002,76(5):2159-2167.8.AndrejevaJ.,etal.TheVproteinsofparamyxovirusesbindtheIFN-inducibleRNAhelicase,mda-5,andinhibititsactivationoftheIFN-betapromoter.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica2004,101(49):17264-17269.9.AtmacaHT.,etal.Examinationofepithelialtissuecytokineresponsetonaturalpestedespetitsruminantsvirus(PPRV)infectioninsheepandgoatsbyimmunohistochemistry.Histologyandhistopathology2012,27(1):69-78.10.BaileyD.,etal.Fullgenomesequenceofpestedespetitsruminantsvirus,amemberoftheMorbillivirusgenus.Virusresearch2005,110(1-2):119-124.11.BaronMD.,etal.RinderpestviruseslackingtheCandVproteinsshowspecificdefectsingrowthandtranscriptionofviralRNAs.Journalofvirology2000,74(6):2603-2611.12.BaronMD.,etal.Cloningandsequenceanalysisofthematrix(M)proteingeneofrinderpestvirusandevidenceforanotherbovinemorbillivirus.Virology1994,200(1):121-129.13.BaslerCF.,etal.EvasionofinterferonresponsesbyEbolaandMarburgviruses.Journalofinterferon&cytokineresearch:theofficialjournaloftheInternationalSocietyforInterferonandCytokineResearch2009,29(9):511-520.14.BaumgartnerW.,etal.PersistentinfectionofVerocellsbyparamyxoviruses.Amorphologicalandimmunoelectronmicroscopicinvestigation.Intervirology1987,27(4):218-223.15.BelgnaouiSM.,etal.Orchestratingtheinterferonantiviralresponsethroughthemitochondrialantiviralsignaling(MAVS)adapter.Currentopinioninimmunology2011,23(5):564-572.54 中国农业科学院博士学位论文参考文献16.BelliniWJ.,etal.MeaslesvirusPgenecodesfortwoproteins.Journalofvirology1985,53(3):908-919.17.BerkeIC.,etal.MDA5cooperativelyformsdimersandATP-sensitivefilamentsuponbindingdouble-strandedRNA.TheEMBOjournal2012,31(7):1714-1726.18.BlomN.,etal.Sequenceandstructure-basedpredictionofeukaryoticproteinphosphorylationsites.Journalofmolecularbiology1999,294(5):1351-1362.19.BlumbergBM.,etal.MeaslesvirusLproteinevidenceselementsofancestralRNApolymerase.Virology1988,164(2):487-497.20.BodjoSC.,etal.MappingthePestedesPetitsRuminantsvirusnucleoprotein:identificationoftwodomainsinvolvedinproteinself-association.Virusresearch2008,131(1):23-32.21.BoxerEL.,etal.Therinderpestvirusnon-structuralCproteinblockstheinductionoftype1interferon.Virology2009,385(1):134-142.22.BrownDD.,etal.'Rescue'ofmini-genomicconstructsandvirusesbycombinationsofmorbillivirusN,PandLproteins.TheJournalofgeneralvirology2005,86(Pt4):1077-1081.23.BrunsAM.,etal.TheinnateimmunesensorLGP2activatesantiviralsignalingbyregulatingMDA5-RNAinteractionandfilamentassembly.Molecularcell2014,55(5):771-781.24.BugnoM.,etal.Identificationoftheinterleukin-6/oncostatinMresponseelementintherattissueinhibitorofmetalloproteinases-1(TIMP-1)promoter.Nucleicacidsresearch1995,23(24):5041-5047.25.CaignardG.,etal.MeaslesvirusVproteinblocksJak1-mediatedphosphorylationofSTAT1toescapeIFN-alpha/betasignaling.Virology2007,368(2):351-362.26.CardenasWB.Evasionoftheinterferon-mediatedantiviralresponsebyfiloviruses.Viruses2010,2(1):262-282.27.CarteeTL.,etal.IdentificationofasingleaminoacidchangeinthehumanrespiratorysyncytialvirusLproteinthataffectstranscriptionaltermination.Journalofvirology2003,77(13):7352-7360.28.CebullaCM.,etal.Viralinhibitionofinterferonsignaltransduction.Intervirology1999,42(5-6):325-330.29.ChambersR.,etal.Hostspecificityoftheanti-interferonandanti-apoptosisactivitiesofparainfluenzavirusP/Cgeneproducts.TheJournalofgeneralvirology2009,90(Pt8):1906-1915.30.ChardLS.,etal.Fullgenomesequencesoftwovirulentstrainsofpeste-des-petitsruminantsvirus,theCoted'Ivoire1989andNigeria1976strains.Virusresearch2008,136(1-2):192-197.31.ChatziandreouN.,etal.Differencesininterferonsensitivityandbiologicalpropertiesoftworelatedisolatesofsimianvirus5:amodelforviruspersistence.Virology2002,293(2):234-242.32.ChildsK.,etal.ParamyxovirusVproteinsinteractwiththeRNAHelicaseLGP2toinhibitRIG-I-dependentinterferoninduction.Journalofvirology2012,86(7):3411-3421.55 中国农业科学院博士学位论文参考文献33.ChildsK.,etal.mda-5,butnotRIG-I,isacommontargetforparamyxovirusVproteins.Virology2007,359(1):190-200.34.ChildsKS.,etal.Mechanismofmda-5InhibitionbyparamyxovirusVproteins.Journalofvirology2009,83(3):1465-1473.35.ChinnakannanSK.,etal.Morbillivirusvproteinsexhibitmultiplemechanismstoblocktype1andtype2interferonsignallingpathways.PloSone2013,8(2):e57063.36.CiancanelliMJ.,etal.MutationofYMYLintheNipahvirusmatrixproteinabrogatesbuddingandalterssubcellularlocalization.Journalofvirology2006,80(24):12070-12078.37.ClemensMJ.,etal.Thedouble-strandedRNA-dependentproteinkinasePKR:structureandfunction.Journalofinterferon&cytokineresearch:theofficialjournaloftheInternationalSocietyforInterferonandCytokineResearch1997,17(9):503-524.38.ColamoniciO.,etal.DirectbindingtoandtyrosinephosphorylationofthealphasubunitofthetypeIinterferonreceptorbyp135tyk2tyrosinekinase.Molecularandcellularbiology1994,14(12):8133-8142.39.Couacy-HymannE.,etal.Evaluationofthevirulenceofsomestrainsofpeste-des-petits-ruminantsvirus(PPRV)inexperimentallyinfectedWestAfricandwarfgoats.Veterinaryjournal2007,173(1):178-183.40.Couacy-HymannE.,etal.Earlydetectionofviralexcretionfromexperimentallyinfectedgoatswithpeste-des-petitsruminantsvirus.Preventiveveterinarymedicine2007,78(1):85-88.41.DasSC.,etal.Recoveryandcharacterizationofachimericrinderpestviruswiththeglycoproteinsofpeste-des-petits-ruminantsvirus:homologousFandHproteinsarerequiredforvirusviability.Journalofvirology2000,74(19):9039-9047.42.DavidM.,etal.Anucleartyrosinephosphatasedownregulatesinterferon-inducedgeneexpression.Molecularandcellularbiology1993,13(12):7515-7521.43.deYucatánFUA.,etal.EvaluationofVaccinationwithBrucellaabortusS19VaccineinCattleNaturallyInfectedwithBrucellosisinProductiveSystemsFoundintheMexicanTropic.2009,44.DeddoucheS.,etal.IdentificationofanLGP2-associatedMDA5agonistinpicornavirus-infectedcells.eLife2014,3:e01535.45.DelendaC.,etal.SendaiviruseswithalteredP,V,andWproteinexpression.Virology1998,242(2):327-337.46.DevauxP.,etal.Tyrosine110inthemeaslesvirusphosphoproteinisrequiredtoblockSTAT1phosphorylation.Virology2007,360(1):72-83.47.DialloA.,etal.Comparisonofproteinsinducedincellsinfectedwithrinderpestandpestedespetitsruminantsviruses.TheJournalofgeneralvirology1987,68(Pt7):2033-2038.48.DialloA.,etal.Cloningofthenucleocapsidproteingeneofpeste-des-petits-ruminantsvirus:relationshiptoothermorbilliviruses.TheJournalofgeneralvirology1994,75(Pt1):233-237.56 中国农业科学院博士学位论文参考文献49.DidcockL.,etal.TheVproteinofsimianvirus5inhibitsinterferonsignallingbytargetingSTAT1forproteasome-mediateddegradation.Journalofvirology1999,73(12):9928-9933.50.DidcockL.,etal.Sendaivirusandsimianvirus5blockactivationofinterferon-responsivegenes:importanceforviruspathogenesis.Journalofvirology1999,73(4):3125-3133.51.EzeibeMC.,etal.Persistentdetectionofpestedepetitsruminantsantigeninthefaecesofrecoveredgoats.Tropicalanimalhealthandproduction2008,40(7):517-519.52.FAO).FaAOotUN.RecognizingPestedesPetitsRuminants:afieldmanua[Z].Rome:FAO,2000,53.FearnsR.,etal.Evidencethattheparamyxovirussimianvirus5canestablishquiescentinfectionsbyremaininginactiveincytoplasmicinclusionbodies.TheJournalofgeneralvirology1994,75(Pt12):3525-3539.54.FujiiN.,etal.Suppressionofinterferonresponsegeneexpressionincellspersistentlyinfectedwithmumpsvirus,andrestorationfromitssuppressionbytreatmentwithribavirin.Virusresearch1999,65(2):175-185.55.FujiiN.,etal.Suppressionofinterferon-inducedoligo-2',5'-adenylatesynthetaseinductioninpersistentinfection.TheJournalofgeneralvirology1990,71(Pt12):3071-3074.56.GackMU.,etal.Phosphorylation-mediatednegativeregulationofRIG-Iantiviralactivity.Journalofvirology2010,84(7):3220-3229.57.GackMU.,etal.RolesofRIG-IN-terminaltandemCARDandsplicevariantinTRIM25-mediatedantiviralsignaltransduction.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica2008,105(43):16743-16748.58.GackMU.,etal.TRIM25RING-fingerE3ubiquitinligaseisessentialforRIG-I-mediatedantiviralactivity.Nature2007,446(7138):916-920.59.GaleM,Jr..,etal.Molecularmechanismsofinterferonresistancemediatedbyviral-directedinhibitionofPKR,theinterferon-inducedproteinkinase.Pharmacology&therapeutics1998,78(1):29-46.60.Garcia-SastreA.Inhibitionofinterferon-mediatedantiviralresponsesbyinfluenzaAvirusesandothernegative-strandRNAviruses.Virology2001,279(2):375-384.61.GarciaJ.,etal.Cytoplasmicinclusionsofrespiratorysyncytialvirus-infectedcells:formationofinclusionbodiesintransfectedcellsthatcoexpressthenucleoprotein,thephosphoprotein,andthe22Kprotein.Virology1993,195(1):243-247.62.GiraudonP.,etal.AntigenicanalysisofAfricanmeaslesvirusfieldisolates:identificationandlocalisationofoneconservedandtwovariableepitopesitesontheNPprotein.Virusresearch1988,10(2-3):137-152.63.GitlinL.,etal.Essentialroleofmda-5intypeIIFNresponsestopolyriboinosinic:polyribocytidylicacidandencephalomyocarditispicornavirus.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica2006,103(22):8459-8464.57 中国农业科学院博士学位论文参考文献64.GoodbournS.,etal.Interferons:cellsignalling,immunemodulation,antiviralresponseandviruscountermeasures.TheJournalofgeneralvirology2000,81(Pt10):2341-2364.65.GotohB.,etal.Paramyxovirusaccessoryproteinsasinterferonantagonists.Microbiologyandimmunology2001,45(12):787-800.66.GubbayO.,etal.Sendaivirusgenomesynthesisandassemblyarecoupled:apossiblemechanismtopromoteviralRNApolymeraseprocessivity.TheJournalofgeneralvirology2001,82(Pt12):2895-2903.67.HaigDM.Subversionandpiracy:DNAvirusesandimmuneevasion.Researchinveterinaryscience2001,70(3):205-219.68.HasanMK.,etal.VersatilityoftheaccessoryCproteinsofSendaivirus:contributiontovirusassemblyasanadditionalrole.Journalofvirology2000,74(12):5619-5628.69.HaspelRL.,etal.AnuclearproteintyrosinephosphataseisrequiredfortheinactivationofStat1.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica1999,96(18):10188-10193.70.HaspelRL.,etal.TherapidinactivationofnucleartyrosinephosphorylatedStat1dependsuponaproteintyrosinephosphatase.TheEMBOjournal1996,15(22):6262-6268.71.HeB.,etal.Recoveryofparamyxovirussimianvirus5withaVproteinlackingtheconservedcysteine-richdomain:themultifunctionalVproteinblocksbothinterferon-betainductionandinterferonsignaling.Virology2002,303(1):15-32.72.HerbermanRB.Effectofalpha-interferonsonimmunefunction.Seminarsinoncology1997,24(3Suppl9):S9-78-S79-80.73.HiscottJ.,etal.Cytokines.Currentopinioninimmunology2011,23(5):561-563.74.HoffmanMA.,etal.Precisemappingofthereplicationandtranscriptionpromotersofhumanparainfluenzavirustype3.Virology2000,269(1):201-211.75.HorikamiSM.,etal.Structure,transcription,andreplicationofmeaslesvirus.Currenttopicsinmicrobiologyandimmunology1995,191:35-50.76.HorikamiSM.,etal.Anamino-proximaldomainoftheLproteinbindstothePproteininthemeaslesvirusRNApolymerasecomplex.Virology1994,205(2):540-545.77.HuangC.,etal.Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusnonstructuralprotein4antagonizesbetainterferonexpressionbytargetingtheNF-kappaBessentialmodulator.Journalofvirology2014,88(18):10934-10945.78.HuberM.,etal.Measlesvirusphosphoproteinretainsthenucleocapsidproteininthecytoplasm.Virology1991,185(1):299-308.79.IkegameS.,etal.BothRIG-IandMDA5RNAhelicasescontributetotheinductionofalpha/betainterferoninmeaslesvirus-infectedhumancells.Journalofvirology2010,84(1):372-379.80.IrieT.,etal.Inhibitionofinterferonregulatoryfactor3activationbyparamyxovirusVprotein.58 中国农业科学院博士学位论文参考文献Journalofvirology2012,86(13):7136-7145.81.JacobsJL.,etal.MechanismsofMAVSregulationatthemitochondrialmembrane.Journalofmolecularbiology2013,425(24):5009-5019.82.JanewayCA,Jr..,etal.Innateimmunerecognition.Annualreviewofimmunology2002,20:197-216.83.JiangX.,etal.Ubiquitin-inducedoligomerizationoftheRNAsensorsRIG-IandMDA5activatesantiviralinnateimmuneresponse.Immunity2012,36(6):959-973.84.JohanssonK.,etal.CrystalstructureofthemeaslesvirusphosphoproteindomainresponsiblefortheinducedfoldingoftheC-terminaldomainofthenucleoprotein.TheJournalofbiologicalchemistry2003,278(45):44567-44573.85.JonesL.,etal.ProtectionofgoatsagainstpestedespetitsruminantswithavacciniavirusdoublerecombinantexpressingtheFandHgenesofrinderpestvirus.Vaccine1993,11(9):961-964.86.KalvakolanuDV.Virusinterceptionofcytokine-regulatedpathways.Trendsinmicrobiology1999,7(4):166-171.87.KarlinD.,etal.Substitutionoftworesiduesinthemeaslesvirusnucleoproteinresultsinanimpairedself-association.Virology2002,302(2):420-432.88.KatoA.,etal.Theparamyxovirus,Sendaivirus,Vproteinencodesaluxuryfunctionrequiredforviralpathogenesis.TheEMBOjournal1997,16(3):578-587.89.KatoA.,etal.Importanceofthecysteine-richcarboxyl-terminalhalfofVproteinforSendaiviruspathogenesis.Journalofvirology1997,71(10):7266-7272.90.KatoH.,etal.Length-dependentrecognitionofdouble-strandedribonucleicacidsbyretinoicacid-induciblegene-Iandmelanomadifferentiation-associatedgene5.TheJournalofexperimentalmedicine2008,205(7):1601-1610.91.KatoH.,etal.DifferentialrolesofMDA5andRIG-IhelicasesintherecognitionofRNAviruses.Nature2006,441(7089):101-105.92.KawaiT.,etal.IPS-1,anadaptortriggeringRIG-I-andMda5-mediatedtypeIinterferoninduction.Natureimmunology2005,6(10):981-988.93.KawanoM.,etal.Recoveryofinfectioushumanparainfluenzatype2virusfromcDNAclonesandpropertiesofthedefectiveviruswithoutV-specificcysteine-richdomain.Virology2001,284(1):99-112.94.KeitaD.,etal.IdentificationandmappingofaregiononthemRNAofMorbillivirusnucleoproteinsusceptibletoRNAinterference.Antiviralresearch2008,80(2):158-167.95.KimTK.,etal.Regulationofinterferon-gamma-activatedSTAT1bytheubiquitin-proteasomepathway.Science1996,273(5282):1717-1719.96.KingstonRL.,etal.Characterizationofnucleocapsidbindingbythemeaslesvirusandmumpsvirusphosphoproteins.Journalofvirology2004,78(16):8630-8640.59 中国农业科学院博士学位论文参考文献97.KolakofskyD.,etal.ViralDNApolymerasescanningandthegymnasticsofSendaivirusRNAsynthesis.Virology2004,318(2):463-473.98.KomatsuT.,etal.CandVproteinsofSendaivirustargetsignalingpathwaysleadingtoIRF-3activationforthenegativeregulationofinterferon-betaproduction.Virology2004,325(1):137-148.99.KomuroA.,etal.RNA-andvirus-independentinhibitionofantiviralsignalingbyRNAhelicaseLGP2.Journalofvirology2006,80(24):12332-12342.100.KoyamaS.,etal.Innateimmuneresponsetoviralinfection.Cytokine2008,43(3):336-341.101.KozakM.PointmutationsdefineasequenceflankingtheAUGinitiatorcodonthatmodulatestranslationbyeukaryoticribosomes.Cell1986,44(2):283-292.102.KubotaT.,etal.CterminalCYS-RICHregionofmumpsvirusstructuralVproteincorrelateswithblockofinterferonalphaandgammasignaltransductionpathwaythroughdecreaseofSTAT1-alpha.Biochemicalandbiophysicalresearchcommunications2001,283(1):255-259.103.KumarH.,etal.Pathogenrecognitionintheinnateimmuneresponse.TheBiochemicaljournal2009,420(1):1-16.104.KurotaniA.,etal.SendaivirusCproteinsarecategoricallynonessentialgeneproductsbutsilencingtheirexpressionseverelyimpairsviralreplicationandpathogenesis.Genestocells:devotedtomolecular&cellularmechanisms1998,3(2):111-124.105.LaineD.,etal.Measlesvirus(MV)nucleoproteinbindstoanovelcellsurfacereceptordistinctfromFcgammaRIIviaitsC-terminaldomain:roleinMV-inducedimmunosuppression.Journalofvirology2003,77(21):11332-11346.106.LatorreP.,etal.ThevariousSendaivirusCproteinsarenotfunctionallyequivalentandexertbothpositiveandnegativeeffectsonviralRNAaccumulationduringthecourseofinfection.Journalofvirology1998,72(7):5984-5993.107.LeeJK.,etal.ReversibleinhibitionofthefusionactivityofmeaslesvirusFproteinbyanengineeredintersubunitdisulfidebridge.Journalofvirology2007,81(16):8821-8826.108.LeungDW.,etal.MolecularmechanismsofviralinhibitorsofRIG-I-likereceptors.Trendsinmicrobiology2012,20(3):139-146.109.LeungS.,etal.RoleofSTAT2inthealphainterferonsignalingpathway.Molecularandcellularbiology1995,15(3):1312-1317.110.LevyDE.,etal.Thevirusbattles:IFNinductionoftheantiviralstateandmechanismsofviralevasion.Cytokine&growthfactorreviews2001,12(2-3):143-156.111.LevyDE.,etal.CytoplasmicactivationofISGF3,thepositiveregulatorofinterferon-alpha-stimulatedtranscription,reconstitutedinvitro.Genes&development1989,3(9):1362-1371.112.LiX.,etal.FunctionalsubdomainsofSTAT2requiredforpreassociationwiththealphainterferonreceptorandforsignaling.Molecularandcellularbiology1997,17(4):2048-2056.60 中国农业科学院博士学位论文参考文献113.LibeauG.,etal.AcompetitiveELISAusinganti-Nmonoclonalantibodiesforspecificdetectionofrinderpestantibodiesincattleandsmallruminants.Veterinarymicrobiology1992,31(2-3):147-160.114.LinGY.,etal.Theparamyxovirussimianvirus5Vproteinslowsprogressionofthecellcycle.Journalofvirology2000,74(19):9152-9166.115.ListonP.,etal.ProteininteractionsenteredintobythemeaslesvirusP,V,andCproteins.Virusresearch1995,38(2-3):241-259.116.LooYM.,etal.ImmunesignalingbyRIG-I-likereceptors.Immunity2011,34(5):680-692.117.MahapatraM.,etal.Sequenceanalysisofthephosphoproteingeneofpestedespetitsruminants(PPR)virus:editingofthegenetranscript.Virusresearch2003,96(1-2):85-98.118.MaharajNP.,etal.ConventionalproteinkinaseC-alpha(PKC-alpha)andPKC-betanegativelyregulateRIG-Iantiviralsignaltransduction.Journalofvirology2012,86(3):1358-1371.119.MalurAG.,etal.RoleofahighlyconservedNH(2)-terminaldomainofthehumanparainfluenzavirustype3RNApolymerase.Journalofvirology2002,76(16):8101-8109.120.MartensS.,etal.Theinterferon-inducibleGTPases.Annualreviewofcellanddevelopmentalbiology2006,22:559-589.121.MatsuuraY.,etal.Nup50/Npap60functioninnuclearproteinimportcomplexdisassemblyandimportinrecycling.TheEMBOjournal2005,24(21):3681-3689.122.McCartneySA.,etal.MDA-5recognitionofamurinenorovirus.PLoSpathogens2008,4(7):e1000108.123.MetzP.,etal.IdentificationoftypeIandtypeIIinterferon-inducedeffectorscontrollinghepatitisCvirusreplication.Hepatology2012,56(6):2082-2093.124.MeyerG.,etal.Thenucleotidesequenceofthefusionproteingeneofthepestedespetitsruminantsvirus:thelonguntranslatedregioninthe5'-endoftheF-proteingeneofmorbillivirusesseemstobespecifictoeachvirus.Virusresearch1995,37(1):23-35.125.MeylanE.,etal.CardifisanadaptorproteinintheRIG-IantiviralpathwayandistargetedbyhepatitisCvirus.Nature2005,437(7062):1167-1172.126.Mitra-KaushikS.,etal.IdentificationofacytotoxicT-cellepitopeontherecombinantnucleocapsidproteinsofRinderpestandPestedespetitsruminantsvirusespresentedasassemblednucleocapsids.Virology2001,279(1):210-220.127.MollM.,etal.Importanceofthecytoplasmictailsofthemeaslesvirusglycoproteinsforfusogenicactivityandthegenerationofrecombinantmeaslesviruses.Journalofvirology2002,76(14):7174-7186.128.MotzC.,etal.ParamyxovirusVproteinsdisruptthefoldoftheRNAsensorMDA5toinhibitantiviralsignaling.Science2013,339(6120):690-693.129.MurphySK.,etal.RNAreplicationfortheparamyxovirussimianvirus5requiresaninternalrepeated(CGNNNN)sequencemotif.Journalofvirology1999,73(1):805-809.61 中国农业科学院博士学位论文参考文献130.MuthuchelvanD.,etal.Comparativesequenceanalysisofthelargepolymeraseprotein(L)geneofpeste-des-petitsruminants(PPR)vaccinevirusofIndianorigin.Archivesofvirology2005,150(12):2467-2481.131.NakatsuY.,etal.MeaslesviruscircumventsthehostinterferonresponsebydifferentactionsoftheCandVproteins.Journalofvirology2008,82(17):8296-8306.132.NallagatlaSR.,etal.NucleosidemodificationsmodulateactivationoftheproteinkinasePKRinanRNAstructure-specificmanner.Rna2008,14(6):1201-1213.133.NallagatlaSR.,etal.5'-triphosphate-dependentactivationofPKRbyRNAswithshortstem-loops.Science2007,318(5855):1455-1458.134.NanicheD.,etal.Evasionofhostdefensesbymeaslesvirus:wild-typemeaslesvirusinfectioninterfereswithinductionofAlpha/Betainterferonproduction.Journalofvirology2000,74(16):7478-7484.135.NingYJ.,etal.ViralsuppressionofinnateimmunityviaspatialisolationofTBK1/IKKepsilonfrommitochondrialantiviralplatform.Journalofmolecularcellbiology2014,6(4):324-337.136.NishioM.,etal.ThecarboxylsegmentofthemumpsvirusVproteinassociateswithStatproteinsinvitroviaatryptophan-richmotif.Virology2002,300(1):92-99.137.NishioM.,etal.Highresistanceofhumanparainfluenzatype2virusprotein-expressingcellstotheantiviralandanti-cellproliferativeactivitiesofalpha/betainterferons:cysteine-richV-specificdomainisrequiredforhighresistancetotheinterferons.Journalofvirology2001,75(19):9165-9176.138.NishioM.,etal.IdentificationofparamyxovirusVproteinresiduesessentialforSTATproteindegradationandpromotionofvirusreplication.Journalofvirology2005,79(13):8591-8601.139.NishioM.,etal.Interactionbetweennucleocapsidprotein(NP)andphosphoprotein(P)ofhumanparainfluenzavirustype2:oneofthetwoNPbindingsitesonPisessentialforgranuleformation.TheJournalofgeneralvirology1996,77(Pt10):2457-2463.140.Nistal-VillanE.,etal.NegativeroleofRIG-Iserine8phosphorylationintheregulationofinterferon-betaproduction.TheJournalofbiologicalchemistry2010,285(26):20252-20261.141.NovickD.,etal.Thehumaninterferonalpha/betareceptor:characterizationandmolecularcloning.Cell1994,77(3):391-400.142.OksayanS.,etal.Subcellulartraffickinginrhabdovirusinfectionandimmuneevasion:anoveltargetfortherapeutics.Infectiousdisordersdrugtargets2012,12(1):38-58.143.OnoN.,etal.VdomainofhumanSLAM(CDw150)isessentialforitsfunctionasameaslesvirusreceptor.Journalofvirology2001,75(4):1594-1600.144.OshiumiH.,etal.TheubiquitinligaseRipletisessentialforRIG-I-dependentinnateimmuneresponsestoRNAvirusinfection.Cellhostµbe2010,8(6):496-509.145.PalosaariH.,etal.STATproteininterferenceandsuppressionofcytokinesignaltransductionbymeaslesvirusVprotein.Journalofvirology2003,77(13):7635-7644.62 中国农业科学院博士学位论文参考文献146.ParisienJP.,etal.STAT2actsasahostrangedeterminantforspecies-specificparamyxovirusinterferonantagonismandsimianvirus5replication.Journalofvirology2002,76(13):6435-6441.147.ParisienJP.,etal.SelectiveSTATproteindegradationinducedbyparamyxovirusesrequiresbothSTAT1andSTAT2butisindependentofalpha/betainterferonsignaltransduction.Journalofvirology2002,76(9):4190-4198.148.ParisienJP.,etal.TheVproteinofhumanparainfluenzavirus2antagonizestypeIinterferonresponsesbydestabilizingsignaltransducerandactivatoroftranscription2.Virology2001,283(2):230-239.149.ParisienJP.,etal.AsharedinterfacemediatesparamyxovirusinterferencewithantiviralRNAhelicasesMDA5andLGP2.Journalofvirology2009,83(14):7252-7260.150.ParkMS.,etal.Newcastlediseasevirus(NDV)-basedassaydemonstratesinterferon-antagonistactivityfortheNDVVproteinandtheNipahvirusV,W,andCproteins.Journalofvirology2003,77(2):1501-1511.151.PattersonJB.,etal.VandCproteinsofmeaslesvirusfunctionasvirulencefactorsinvivo.Virology2000,267(1):80-89.152.PawarRM.,etal.EffectofsiRNAmediatedsuppressionofsignalinglymphocyteactivationmoleculeonreplicationofpestedespetitsruminantsvirusinvitro.Virusresearch2008,136(1-2):118-123.153.PazS.,etal.AfunctionalC-terminalTRAF3-bindingsiteinMAVSparticipatesinpositiveandnegativeregulationoftheIFNantiviralresponse.Cellresearch2011,21(6):895-910.154.PeisleyA.,etal.CooperativeassemblyanddynamicdisassemblyofMDA5filamentsforviraldsRNArecognition.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica2011,108(52):21010-21015.155.PichlmairA.,etal.RIG-I-mediatedantiviralresponsestosingle-strandedRNAbearing5'-phosphates.Science2006,314(5801):997-1001.156.PlemperRK.,etal.Measlesvirusenvelopeglycoproteinshetero-oligomerizeintheendoplasmicreticulum.TheJournalofbiologicalchemistry2001,276(47):44239-44246.157.PloeghHL.Viralstrategiesofimmuneevasion.Science1998,280(5361):248-253.158.PooleE.,etal.TheVproteinsofsimianvirus5andotherparamyxovirusesinhibitinductionofinterferon-beta.Virology2002,303(1):33-46.159.PortnerA.,etal.LocalizationandcharacterizationofSendaivirusnonstructuralCandC'proteinsbyantibodiesagainstsyntheticpeptides.Virusresearch1986,6(2):109-121.160.PreciousB.,etal.Simianvirus5Vproteinactsasanadaptor,linkingDDB1toSTAT2,tofacilitatetheubiquitinationofSTAT1.Journalofvirology2005,79(21):13434-13441.161.PreciousB.,etal.InducibleexpressionoftheP,V,andNPgenesoftheparamyxovirussimianvirus5incelllinesandanexaminationofNP-PandNP-Vinteractions.Journalofvirology63 中国农业科学院博士学位论文参考文献1995,69(12):8001-8010.162.QureshiSA.,etal.FunctionofStat2proteinintranscriptionalactivationbyalphainterferon.Molecularandcellularbiology1996,16(1):288-293.163.RahamanA.,etal.Thefusioncorecomplexofthepestedespetitsruminantsvirusisasix-helixbundleassembly.Biochemistry2003,42(4):922-931.164.RahamanA.,etal.Phosphoproteinoftherinderpestvirusformsatetramerthroughacoiledcoilregionimportantforbiologicalfunction.Astructuralinsight.TheJournalofbiologicalchemistry2004,279(22):23606-23614.165.RamachandranA.,etal.Dissociationofparamyxovirusinterferonevasionactivities:universalandvirus-specificrequirementsforconservedVproteinaminoacidsinMDA5interference.Journalofvirology2010,84(21):11152-11163.166.RamachandranA.,etal.STAT2isaprimarytargetformeaslesvirusVprotein-mediatedalpha/betainterferonsignalinginhibition.Journalofvirology2008,82(17):8330-8338.167.RandallRE.,etal.NP:PandNP:Vinteractionsoftheparamyxovirussimianvirus5examinedusinganovelprotein:proteincaptureassay.Virology1996,224(1):121-129.168.RandallRE.,etal.Interferonsandviruses:aninterplaybetweeninduction,signalling,antiviralresponsesandviruscountermeasures.TheJournalofgeneralvirology2008,89(Pt1):1-47.169.RenukaradhyaGJ.,etal.MappingofB-cellepitopicsitesanddelineationoffunctionaldomainsonthehemagglutinin-neuraminidaseproteinofpestedespetitsruminantsvirus.Virusresearch2002,90(1-2):171-185.170.RiedlP.,etal.Measlesvirusmatrixproteinisnotcotransportedwiththeviralglycoproteinsbutrequiresvirusinfectionforefficientsurfacetargeting.Virusresearch2002,83(1-2):1-12.171.RodriguezJJ.,etal.NipahvirusVproteinevadesalphaandgammainterferonsbypreventingSTAT1andSTAT2activationandnuclearaccumulation.Journalofvirology2002,76(22):11476-11483.172.RodriguezJJ.,etal.HendravirusVproteininhibitsinterferonsignalingbypreventingSTAT1andSTAT2nuclearaccumulation.Journalofvirology2003,77(21):11842-11845.173.RodriguezJJ.,etal.IdentificationofthenuclearexportsignalandSTAT-bindingdomainsoftheNipahvirusVproteinrevealsmechanismsunderlyinginterferonevasion.Journalofvirology2004,78(10):5358-5367.174.RomeroCH.,etal.Protectionofgoatsagainstpestedespetitsruminantswithrecombinantcapripoxvirusesexpressingthefusionandhaemagglutininproteingenesofrinderpestvirus.Vaccine1995,13(1):36-40.175.RothenfusserS.,etal.TheRNAhelicaseLgp2inhibitsTLR-independentsensingofviralreplicationbyretinoicacid-induciblegene-I.Journalofimmunology2005,175(8):5260-5268.176.RungeS.,etal.InvivoligandsofMDA5andRIG-Iinmeaslesvirus-infectedcells.PLoSpathogens2014,10(4):e1004081.64 中国农业科学院博士学位论文参考文献177.SaitoT.,etal.RegulationofinnateantiviraldefensesthroughasharedrepressordomaininRIG-IandLGP2.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica2007,104(2):582-587.178.SatoH.,etal.MorbillivirusnucleoproteinpossessesanovelnuclearlocalizationsignalandaCRM1-independentnuclearexportsignal.Virology2006,352(1):121-130.179.SatohT.,etal.LGP2isapositiveregulatorofRIG-I-andMDA5-mediatedantiviralresponses.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica2010,107(4):1512-1517.180.ScheidA.,etal.Thehemagglutinatingandneuraminidaseproteinofaparamyxovirus:interactionwithneuraminicacidinaffinitychromatography.Virology1974,62(1):125-133.181.SchindlerC.,etal.Transcriptionalresponsestopolypeptideligands:theJAK-STATpathway.Annualreviewofbiochemistry1995,64:621-651.182.SchleeM.,etal.siRNAandisRNA:twoedgesofonesword.Moleculartherapy:thejournaloftheAmericanSocietyofGeneTherapy2006,14(4):463-470.183.SchleeM.,etal.Recognitionof5'triphosphatebyRIG-Ihelicaserequiresshortbluntdouble-strandedRNAascontainedinpanhandleofnegative-strandvirus.Immunity2009,31(1):25-34.184.ServandeAlmeidaR.,etal.ControlofruminantmorbillivirusreplicationbysmallinterferingRNA.TheJournalofgeneralvirology2007,88(Pt8):2307-2311.185.SethS.,etal.ThefusionproteinofPestedespetitsruminantsvirusmediatesbiologicalfusionintheabsenceofhemagglutinin-neuraminidaseprotein.Virology2001,289(1):86-94.186.SethS.,etal.Thehemagglutinin-neuraminidaseproteinofpestedespetitsruminantsvirusisbiologicallyactivewhentransientlyexpressedinmammaliancells.Virusresearch2001,75(2):169-177.187.ShawML.,etal.NuclearlocalizationoftheNipahvirusWproteinallowsforinhibitionofbothvirus-andtoll-likereceptor3-triggeredsignalingpathways.Journalofvirology2005,79(10):6078-6088.188.ShuaiK.,etal.AsinglephosphotyrosineresidueofStat91requiredforgeneactivationbyinterferon-gamma.Science1993,261(5129):1744-1746.189.SilvermanRH.Ascientificjourneythroughthe2-5A/RNaseLsystem.Cytokine&growthfactorreviews2007,18(5-6):381-388.190.SinnathambyG.,etal.Immuneresponsesingoatstorecombinanthemagglutinin-neuraminidaseglycoproteinofPestedespetitsruminantsvirus:identificationofaTcelldeterminant.Vaccine2001,19(32):4816-4823.191.StrahleL.,etal.ActivationofthebetainterferonpromoterbyunnaturalSendaivirusinfectionrequiresRIG-IandisinhibitedbyviralCproteins.Journalofvirology2007,81(22):12227-12237.65 中国农业科学院博士学位论文参考文献192.SunM.,etal.Conservedcysteine-richdomainofparamyxovirussimianvirus5Vproteinplaysanimportantroleinblockingapoptosis.Journalofvirology2004,78(10):5068-5078.193.SuryanarayanaK.,etal.TranscriptioninhibitionandotherpropertiesofmatrixproteinsexpressedbyMgenesclonedfrommeaslesvirusesanddiseasedhumanbraintissue.Journalofvirology1994,68(3):1532-1543.194.SutharMS.,etal.TheRIG-I-likereceptorLGP2controlsCD8(+)Tcellsurvivalandfitness.Immunity2012,37(2):235-248.195.SweetmanDA.,etal.RinderpestvirusCandVproteinsinteractwiththemajor(L)componentoftheviralpolymerase.Virology2001,281(2):193-204.196.TakahasiK.,etal.NonselfRNA-sensingmechanismofRIG-Ihelicaseandactivationofantiviralimmuneresponses.Molecularcell2008,29(4):428-440.197.TakakiH.,etal.TheMyD88pathwayinplasmacytoidandCD4+dendriticcellsprimarilytriggerstypeIIFNproductionagainstmeaslesvirusinamouseinfectionmodel.Journalofimmunology2013,191(9):4740-4747.198.TakeuchiO.,etal.Patternrecognitionreceptorsandinflammation.Cell2010,140(6):805-820.199.TatsuoH.,etal.[Thecellularreceptorformeaslesvirus:SLAM(CDw150)].Uirusu2000,50(2):289-296.200.TatsuoH.,etal.SLAM(CDw150)isacellularreceptorformeaslesvirus.Nature2000,406(6798):893-897.201.tenHoeveJ.,etal.IdentificationofanuclearStat1proteintyrosinephosphatase.Molecularandcellularbiology2002,22(16):5662-5668.202.ToberC.,etal.ExpressionofmeaslesvirusVproteinisassociatedwithpathogenicityandcontrolofviralRNAsynthesis.Journalofvirology1998,72(10):8124-8132.203.TortorellaD.,etal.Viralsubversionoftheimmunesystem.Annualreviewofimmunology2000,18:861-926.204.UlaneCM.,etal.ParamyxovirusesSV5andHPIV2assembleSTATproteinubiquitinligasecomplexesfromcellularcomponents.Virology2002,304(2):160-166.205.UlaneCM.,etal.STAT3ubiquitylationanddegradationbymumpsvirussuppresscytokineandoncogenesignaling.Journalofvirology2003,77(11):6385-6393.206.VarsanyiTM.,etal.Protectionagainstlethalmeaslesvirusinfectioninmicebyimmune-stimulatingcomplexescontainingthehemagglutininorfusionprotein.Journalofvirology1987,61(12):3896-3901.207.VealsSA.,etal.Subunitofanalpha-interferon-responsivetranscriptionfactorisrelatedtointerferonregulatoryfactorandMybfamiliesofDNA-bindingproteins.Molecularandcellularbiology1992,12(8):3315-3324.208.VenkataramanT.,etal.LossofDExD/HboxRNAhelicaseLGP2manifestsdisparateantiviralresponses.Journalofimmunology2007,178(10):6444-6455.66 中国农业科学院博士学位论文参考文献209.VongpunsawadS.,etal.Selectivelyreceptor-blindmeaslesviruses:IdentificationofresiduesnecessaryforSLAM-orCD46-inducedfusionandtheirlocalizationonanewhemagglutininstructuralmodel.Journalofvirology2004,78(1):302-313.210.WangJ.,etal.NF-kappaBRelAsubunitiscrucialforearlyIFN-betaexpressionandresistancetoRNAvirusreplication.Journalofimmunology2010,185(3):1720-1729.211.WansleyEK.,etal.NaturallyoccurringsubstitutionsintheP/Vgeneconvertthenoncytopathicparamyxovirussimianvirus5intoavirusthatinducesalpha/betainterferonsynthesisandcelldeath.Journalofvirology2002,76(20):10109-10121.212.WatanabeM.,etal.Delayedactivationofalteredfusionglycoproteininachronicmeaslesvirusvariantthatcausessubacutesclerosingpanencephalitis.Journalofneurovirology1995,1(2):177-188.213.WatanabeN.,etal.BindingoftheVproteinstothenucleocapsidproteinsofhumanparainfluenzatype2virus.Medicalmicrobiologyandimmunology1996,185(2):89-94.214.WuB.,etal.StructuralbasisfordsRNArecognition,filamentformation,andantiviralsignalactivationbyMDA5.Cell2013,152(1-2):276-289.215.XuLG.,etal.VISAisanadapterproteinrequiredforvirus-triggeredIFN-betasignaling.Molecularcell2005,19(6):727-740.216.YanH.,etal.Phosphorylatedinterferon-alphareceptor1subunit(IFNaR1)actsasadockingsiteforthelatentformofthe113kDaSTAT2protein.EMBOJ1996,15(5):1064-1074.217.YokooJ.,etal.Replication-incompetentSendaiviruscansuppresstheantiviralactionoftypeIinterferon.Archivesofvirology1999,144(6):1043-1055.218.YokosawaN.,etal.Poorinductionofinterferon-induced2',5'-oligoadenylatesynthetase(2-5AS)incellspersistentlyinfectedwithmumpsvirusiscausedbydecreaseofSTAT-1alpha.Archivesofvirology1998,143(10):1985-1992.219.YokosawaN.,etal.C-terminalregionofSTAT-1alphaisnotnecessaryforitsubiquitinationanddegradationcausedbymumpsvirusVprotein.Journalofvirology2002,76(24):12683-12690.220.YokotaS.,etal.Measlesvirussuppressesinterferon-alphasignalingpathway:suppressionofJak1phosphorylationandassociationofviralaccessoryproteins,CandV,withinterferon-alphareceptorcomplex.Virology2003,306(1):135-146.221.YoneyamaM.,etal.TheRNAhelicaseRIG-Ihasanessentialfunctionindouble-strandedRNA-inducedinnateantiviralresponses.Natureimmunology2004,5(7):730-737.222.YoneyamaM.,etal.SharedanduniquefunctionsoftheDExD/H-boxhelicasesRIG-I,MDA5,andLGP2inantiviralinnateimmunity.Journalofimmunology2005,175(5):2851-2858.223.YoungDF.,etal.Paramyxoviridaeusedistinctvirus-specificmechanismstocircumventtheinterferonresponse.Virology2000,269(2):383-390.224.ZengW.,etal.ReconstitutionoftheRIG-Ipathwayrevealsasignalingroleofunanchored67 中国农业科学院博士学位论文参考文献polyubiquitinchainsininnateimmunity.Cell2010,141(2):315-330.225.ZhangX.,etal.Identificationandcharacterizationofaregulatorydomainonthecarboxylterminusofthemeaslesvirusnucleocapsidprotein.Journalofvirology2002,76(17):8737-8746.226.ZhaoC.,etal.Interferon-inducedISG15pathway:anongoingvirus-hostbattle.Trendsinmicrobiology2013,21(4):181-186.227.ZhongZ.,etal.Stat3:aSTATfamilymemberactivatedbytyrosinephosphorylationinresponsetoepidermalgrowthfactorandinterleukin-6.Science1994,264(5155):95-98.68 中国农业科学院博士学位论文附录附录V蛋白突变体的位点69 中国农业科学院博士学位论文附录实验所用引物列表70 中国农业科学院博士学位论文附录71 中国农业科学院博士学位论文致谢致谢论文完成之际，感恩安拉对我的眷顾，经历五年的博士生涯，是我人生非常宝贵的一笔财富。这五年，让我对于科研有了更加深刻的认识，对于团队的协作有了特别深刻的体会，同时对于学习和管理的经验有了更加深入的了解。再次我怀着最真诚的心感谢每一位关心和帮助我的老师，同学，朋友和家人。是您们教会了我很多，让我自己离梦想更进一步。在此，我真心的祝福您们，百尺竿头，更进一步。我需要特别感谢您们中的几位，让我得到很多。首先，感谢我的导师才学鹏研究员，您既是恩师也是我最尊敬的长辈，成为您的学生，是我的幸运。记得2010年4月我第一次见您的时候，您对学生的态度，让我终身难忘，亲切和蔼没有丝毫架子，您让我学习到包容和爱护。当成为您的学生以后，第一次和您讨论课题研究方向的时候，谢谢您的教诲，您竭尽全力帮我们解决实验上的困难，让我学习到对科研的态度和不遗余力的探索精神。您在学术上的涉猎广度和深度，以及您在学术上的许多非常新鲜的想法和创新探索的宝贵经验也为我提供了学习的榜样。在科研的过程中，您给予我们充分的信任，而且不断的鼓励我们，对于实验中的失误，您会与我们讨论实质性的问题，给出建设性的意见，努力解决问题的包容心态，让我在生活工作学会成长成熟。当然在生活方面，您的关心和教诲，至今记忆犹新，记得来兰州兽医研究所实习了一个月的时候，你见面后，关心我的住宿问题，现在想起仍然感觉到温暖。从您身上不仅学习到了知识，同样学习到做人的道理，最重要的是您看问题和解读问题的视角，让我对许多事情的看法和角度更为宽广，您身上有太多我要学习的品德，感谢您的教诲和帮助，成为您的学生，让我感到自豪。学生再此向我的恩师表示感谢，也祝福恩师事业顺利，身体健康。其次，感谢朱启运研究员，虽然经历很多事情，但在您实验室我得到了成长，您的学术态度和严谨的科研思维帮助了很多，实验的顺利离不开您的贡献，在您身上我学习了很多。在此感谢我的师弟张学虎，恕我叫你“张秘书”，学虎师弟是我的良师益友。学虎师弟在整个实验中给予了我非常大的帮助。学虎师弟思维活跃，但做事非常细心，对于问题具有非常高的好奇心和非常好的探索精神，从你身上我也学习到了很多，每次与你的讨论让我受益匪浅，记得在摸索蛋白纯化过程中，学虎师弟表现的非常坚韧有担当，是个负责的助手和老师。在学习生活中，没有给予你太多的帮助，反而是你帮助了我很多，在此，非常真心的谢谢学虎师弟给予我的支持。感谢宫晓炜博士，苏君鸿博士，你们是我人生路上非常重要的两个朋友，宫博士我常引为知己，真心的希望能够和你成为一生的朋友，谢谢你的帮助和信任；苏博士是我信仰和生活中的良师益友，你所做的很多事情，都是在帮助我，谢谢你在生活中的提醒和我人生道路中的指点。你们对我有非常重要的意义，任何语言表达不了我内心的感受，再次谢谢你们的帮助。我还要感谢我博士期间的好友，闫鸿斌博士、李继东博士、王秋霞博士、曲自刚博士、付钰广、吉艳红以及刘彬等，你们中有我的兄长，也有我的师弟，不论年长或小于我，你们都给予我实验中非常多的帮助和思想上很关键的启发。闫鸿斌博士的宽容和心胸、李继东博士的坚韧和博学、王秋霞博士的细心和柔和、曲自刚博士的真诚和热心，付钰广的涉猎之广，尤其在生物技术掌握方面让我尤为敬佩；吉艳红的细心和责任心让我一生受用，从你们身上我学到了很多，将让72 中国农业科学院博士学位论文致谢我受用一生。再次感谢窦永喜副研究员，骆学农研究员以及所有的师第师妹们，谢谢你们的帮助，实验室有你们才让我不觉得孤单，有你们，我的想法和你们才得以交流，同时祝师第师妹早日顺利完成学业。最后感谢我的家人，你们是我生命中的火种，是我航行的方向，对你们的感谢只能默默的真心的表示谢意，因为你们的付出和理解是我坚持的动力，有了你们的支持，我才少了后顾之忧，我一直关注自己的梦想，很少做到关心你们，但你们在行动和言语上给予我最大的支持，谢谢你们的无私。在此特别感谢辇晓峰和马佳航，谢谢你们的无私、默默的帮助以及给予我欢乐和理解。本论文在以下基金的支持下完成，在此感谢：Agro-scientificResearchinthePublicInterest(No.201303059),theNationalHighTechnologyResearchandDevelopmentProgram(863program)ofChina(No.2011AA10A211)and.theearmarkedfundforChinaAgricultureResearch(No.CARS-40-10)。73 中国农业科学院博士学位论文作者简介作者简介马旭升，男，1986年3月出生。宁夏中卫人，硕士毕业于兰州大学生命科学院（攻读遗传学，从事人类遗传学和肿瘤治疗方面的研究）。2010年考入中国农业科学院兰州兽医研究所攻读预防兽医学专业，导师为才学鹏研究员，主要从事疫苗设计与分子免疫学方向。同时涉及到PPR病毒基础方面的研究。以下为参与项目和发表论文索引（四篇博士论文：一篇accept；三篇underreview）。09/2010-至今,参与于中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原学国家重点实验室参与中国农业科学院科技创新工程（试点）重大命题---农业生物天然免疫利用以及绒毛用羊产业体系项目的相关研究。09/2010-至今，参与兰州兽医研究所禽病毒病研究小组进行禽流感；新城疫以及小反刍兽疫病毒抑制先天性免疫机制的研究，参与疫苗设计和检测。09/2007-07/2010,完成硕士阶段学校并参与国家自然科学基金项目(30870586)和(10675151),博士后基金项目(20070410232)以及教育部新世纪优秀人才计划项目(NCET-05-0885)。主要从事肿瘤细胞NADPH氧化酶对于重离子辐射敏感性的研究并且参与SNP位点与糖尿病关系的研究。09/2005-04/2006,参与细胞培养基的研发。1.IdentificationofPPRVVproteinamino-acidresiduesforSTAT1andSTAT2proteinsassociationintheprocessoftypeIIFNinhibiton.Virology483(2015)54–63.XushengMa,XingYang,XiaofengNian,ZhidongZhang,Yongxi,Dou,XuehuZhang,XuenongLuo,JunhongSu,QiyunZhu,XuepengCai2.AdjuvanteffectsofL.acidophilusLW1onimmuneresponsestothefoot-and-mouthdiseasevirusDNAvaccineinmice.PLoSOne.2014Aug13;9(8):e104446.doi:10.1371/journal.pone.0104446.eCollection2014.SuJ,LiJ,ZhengH,YouY,LuoX,LiY,LiX,MaX,LiJ,DouY,CaiX.3.小反刍兽疫病毒China／Tib／07株V蛋白的原核表达及纯化，畜牧兽医学报，2013年第11期,张学虎马旭升付钰广曾巧英才学鹏朱启运4Mappingcodonusageofthetranslationinitiationregioninporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusgenome.VirolJ.2011Oct21;8:476.Doi:10.1186/1743-422X-8-476.SuJH,MaXX,HeYL,LiJD,MaXS,DouYX,LuoXN,CaiXP.5.NOX基因家族-潜在的放射增敏新靶点。生物物理学报,2009.刘箐张红王晓妍杜斌斌马旭升74
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