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１０７巧Ｓ４３２：．１学校代码分类号：１３３１０２００４９密级：：公开学号獲《和拿硕古学位论文｛新疆甜菜上两种检疫性有害生物快速检测及甜菜霜霉巧药剂巧治技术研究ＳｔｕｄｏｎＲａｉｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＴｗｏ拉ｎｄｓｏｆｕａｒａｎｔｉｎｅＰｅｓｔｓｏｆｙＱｐＳｕａｒａｎｄＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｎｔｒｏｌｏｆＤｏｗｎＭｉｌｄｅｗｉｎＸｉｎｉａｎｇＢｅｅｔｙｊｇ研究生姓葦李京导师姓名及巧称张祥林研究员合作导师姓名及职称罗明教投学位口类缓别衣学硕击专业名称祖物病巧学—．．？＿研究方向枝物拴疫社病害所在学院农学席新疆？乌鲁木齐二〇—六年六月 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加Ｋ标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发衷或撰写过的研究成果，也不包含为获得新疆农业大学或其他教育单位的学位或证书而使用过的材料一。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年／月／／曰关于学位论文使用授权的说明本人完全了解新疆农业大学有关保留、使用学位论文的规定，目Ｐ：新疆农业大学有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子义档，可封采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，允许论文被查阅和借阅。本人授权新疆农业大学将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可抖公布（包括刊登）论文的全部或部分内容。（保密的学位论文在解密后应遵守此协议）研究生签名：时间：ｉＳ年Ｂ來复导师签名：时间：如年月／曰／ 新疆甜菜上两种检疫性有害生物快速检测及甜菜霜霉病药剂防治技术研究摘要甜菜霜霉病（Peronosporaschachtii）和甜菜胞囊线虫（Heteroderaschachtii）是两种对甜菜造成毁灭性危害病原生物，于2007年被我国政府列为进境植物检疫性有害生物。目前国内有关甜菜霜霉病和甜菜胞囊线虫的相关研究报道很少，有关它们的快速检测方法的研究报道也很少，对甜菜霜霉病田间药效试验的研究也相对简单。本项目对甜菜霜霉病菌和甜菜胞囊线虫的分子检测技术及甜菜霜霉病的田间药效防治试验进行研究，建立了甜菜霜霉病菌和甜菜胞囊线虫的分子快速检测方法，并筛选出防治甜菜霜霉病效果较好的处理方式、药剂及其用量。主要研究结果如下：（1）开展了甜菜霜霉病菌分子检测技术研究，建立了甜菜霜霉病菌的快速检测方法。1）常规PCR检测方法：根据AS-PCR的原理，采用通用引物P-cox2F/P-cox2R扩增甜菜霜霉病菌mt-DNAcox2的基因序列，设计了特异性引物对BSP-F/BSP-R，通过对6种对照样品的检测验证，确定该对引物的特异性较好，最低能检测到10pg/µL的甜菜霜霉病菌质粒DNA。2）TaqMan实时荧光PCR检测方法：根据ASPPAA-PCR原理，采用通用引物对P-cox2F/P-cox2R扩增甜菜霜霉病菌mt-DNA基因cox2的序列，设计TaqManMGB探针BETEV-probe与引物BETEV-F/BETEV-R，该探针与引物通过对6种对照样品的检测验证其特异性较好，该探针/引物的浓度为800nM/400nM时扩增效果最佳，最低检测10fg/µL的甜菜霜霉病菌质粒DNA。（2）开展了甜菜胞囊线虫的分子检测技术研究，建立了甜菜胞囊线虫的TaqMan实时荧光PCR检测方法。利用通用引物D2A/D3B扩增甜菜胞囊线虫的28SrRNA基因序列，设计了TaqMan探针HS-28s-Probe和引物HS-28s-F/HS-28s-R，通过对照样品的检测验证，确定该探针和引物的特异性较好，最低能检测100fg/µL的甜菜胞囊线虫DNA。（3）采用叶面喷雾、药剂拌种、种子熏蒸等三种处理方法开展防治甜菜霜霉病的田间药剂试验，其中三种处理方法中叶面喷雾防治效果最好，最佳药剂50%烯酰吗啉可湿性粉剂用量为40g/667m2。结果如下：1）叶面喷雾处理防治效果：50%烯酰吗啉可湿性粉剂用量为40g/667m2时，防治效果为92.17%，防治效果最好；66.8%霉多克可湿性粉剂稀释倍数为1500倍液时，防治效果为66.15%，防治效果最差。2）药剂拌种处理防治效果：35%精甲霜灵乳剂用量为0.60%时，防治效果为67.19%，效果最好；95%敌克松可湿性粉剂0.20%防治效果为42.40%，防治效果最差。3）种子熏蒸处理防治效果：99%硫酰氟用量为40g/m3时，防治效果为58.48%，防治效果最好；56%磷化铝用量为3g/m3时，防治效果为37.37%，防治效果最差。关键词：甜菜霜霉病菌；甜菜胞囊线虫；分子检测；药剂防治I StudyonRapidDetectionofTwoKindsofQuarantinePestsofSugarBeetandChemicalControlofDownyMildewinXinjiangAbstractSugarbeetdownymildew(Peronosporaschachtii)andsugarbeetcystnematode(Heteroderaschachtii)aretwokindsofpathogenswhichcancausedevastatingdiseasestosugarbeet.Theywerelistedasentryplantquarantinepestsbythegovernmentofourcountryin2007.Sofar,studiesaboutdownymildewandcystnematodeofsugarbeetwerereportedless,andstudiesaboutmoleculardetectionmethodsofbothwerereportedlesstoo.Meanwhile,studiesaboutthecontrollingexperimentinthefiledwasrelativesimple.Thesestudywasabouttherapiddetectiontechnologyofsugarbeetdownymildewandsugarbeetcystnematodeandpesticidecontrolofsugarbeetdownymildew.Inthisstudy,weestablishedrapidmoleculardetectionmethodsofdownymildewandcystnematodeofsugarbeetandscreenedtheefficienttreatment,pesticideandits’dosagewhichhadabettercontrolagainstsugarbeetdownymildewinthefield.Theresultswereasfollows:(1)Astudywascarriedoutwhichwasaboutmoleculardetectiontechnologyofsugarbeetdownymildewandarapiddetectionmethodofsugarbeetdownymildewwasestablished.1)AconventionalPCRdetectionmethod:AccordingtoAS-PCR,thisstudyuseduniversalprimers(P-cox2F/P-cox2R)toamplifythetargetfragmentsofmt-DNAcox2geneofsugarbeetdownymildewpathogen.ThenthespecificprimersBSP-F/BSP-Rweredesignedwhichwerehighlyspecificitythroughother6kindsofcontrolsamplesandtheminimumdetectableconcentrationofplasmidofsugarbeetdownymildewpathogenwas10pg/µL.2)ATaqManreal-timePCRdetectionmethod:AccordingtoASPAA-PCR,thisstudyuseduniversalprimers(P-cox2F/P-cox2R)toamplifythetargetfragmentsofmt-DNAcox2geneofsugarbeetdownymildewpathogen.ThenTaqManMGBprobeBETEV-probeandprimersBETEV-F/BETEV-Rweredesignedwhichwerehighlyspecificitythroughdetectingother6kindsofcontrolsamplesandtheminimumdetectableconcentrationofplasmidDNAofsugarbeetdownymildewwas10fg/µL,andtheoptimalconcentrationwas800nM/400nM(primer/probe).(2)Astudywasstartedwhichwasaboutmoleculardetectiontechnologyofsugarbeetcystnematodeandareal-timePCRdetectionmethodofsugarbeetcystnematodewasestablished.Thesequenceof28SrRNAgeneofsugarbeetcystnematodewasamplifiedwithuniversalprimersD2A/D3B.TaqManprobeHS-28s-ProbeandprimersHS-28s-F/HS-28s-RwasdesignedwhichwerehighlyspecificitythroughdetectingothercontrolsamplesandtheminimumdetectableconcentrationofsugarbeetcystnematodeDNAwas100fg/µL.(3)Achemicalexperimentwascarriedoutincludingfoliarspray,seeddressingandseedfumigations,inwhichtheresultoffoliarsprayhadabettercontrolagainstsugarbeetdownymildewandtheoptimalpesticidewas50%dimethomorphWPat40g/667m2.Theresultswereasfollowed:1)Thecontroleffectoffoliarspraytreatments:50%dimethomorphWPat40g/667m2hadthebestcontroleffectwhichwas92.17%;66.8%propinebWPat1500timesdilutionhadtheworstcontroleffectwhichwas66.15%.2)Thecontroleffectofseeddressingtreatments:35%metalaxyl-Memulsionat0.60%dosagehadthebestcontroleffectwhichwas67.19%;95%fenaminosulfWPat0.20%dosagehadtheworstcontroleffectwhichwas42.2%.3)Thecontroleffectofseedfumigationtreatments:99%vikaneat40g/m3hadthebestcontroleffectwhichwas58.48%;56%aluminiumphosphidehadtheworstcontroleffectwhichwas37.37%.Keywords:Peronosporaschachtii;Heteroderaschachtii;Moleculardetection;ChemicalcontrolII 目录第1章绪论.........................................................................................................11.1研究背景.....................................................................................................................11.1.1甜菜霜霉病概况...............................................................................................11.1.2甜菜胞囊线虫概况...........................................................................................11.2研究现状.....................................................................................................................21.2.1常见作物霜霉病研究现状...............................................................................21.2.2甜菜霜霉病研究现状.......................................................................................41.2.3甜菜胞囊线虫研究现状...................................................................................51.3研究目的及意义.........................................................................................................71.4本项目研究内容.........................................................................................................71.4.1甜菜霜霉病的分子检测方法的建立与优化...................................................71.4.2甜菜胞囊线虫TaqMan实时荧光PCR检测方法的建立与优化..................81.4.3防治甜菜霜霉病的药效试验...........................................................................8第2章甜菜霜霉病菌分子检测技术研究........................................................92.1材料与方法.................................................................................................................92.1.1试验材料来源...................................................................................................92.1.2仪器及试剂.......................................................................................................92.1.3形态学鉴定.....................................................................................................102.1.4致病性研究.....................................................................................................102.1.5分子检测技术.................................................................................................102.2结果与分析...............................................................................................................152.2.1形态鉴定结果.................................................................................................152.2.2甜菜霜霉病致病性研究.................................................................................162.2.3甜菜霜霉病分子检测技术.............................................................................172.3小结与讨论...............................................................................................................25第3章甜菜胞囊线虫分子检测技术研究......................................................273.1材料与方法...............................................................................................................273.1.1试验材料.........................................................................................................27III 3.1.2仪器及试剂.....................................................................................................273.1.3形态学鉴定.....................................................................................................283.1.4分子生物学检测技术.....................................................................................283.2结果与分析...............................................................................................................293.2.1形态鉴定结果.................................................................................................293.2.2通用引物D2A/D3B扩增结果......................................................................303.2.3测序及比对.....................................................................................................313.3小结与讨论...............................................................................................................33第4章甜菜霜霉病的田间药效试验..............................................................354.1材料与方法...............................................................................................................354.1.1试验材料.........................................................................................................354.1.2试验设计.........................................................................................................354.1.3试验方法.........................................................................................................374.1.4调查及统计方法.............................................................................................374.1.5防治效果计算方法.........................................................................................384.2结果与分析...............................................................................................................384.2.1叶面喷雾处理.................................................................................................384.2.2药剂拌种处理.................................................................................................414.2.3种子熏蒸处理.................................................................................................434.2.4安全性调查.....................................................................................................464.3小结与讨论...............................................................................................................46第5章结论.......................................................................................................481建立了巢式PCR检测甜菜霜霉病菌的方法............................................................482建立了实时荧光PCR检测甜菜霜霉病菌的方法....................................................483建立了实时荧光PCR检测甜菜胞囊线虫的方法....................................................484筛选出有效防治甜菜霜霉病的处理方式和药剂种类及用量..................................48参考文献...............................................................................................................50致谢.......................................................................................................................55作者简历...............................................................................................................56IV 常用缩略语中英文对照表英文缩写英文全称中文全称mt-DNAMitochondrialDNA线粒体DNAAEAmplificationefficiency扩增效率AS-PCRAllele-specificPCR等位基因特异性PCRAllele-specificprobeandprimeramplification等位基因特异性探针和引物的扩增ASPPAA-PCRassayPCR试验bpBasepair碱基对cox2CytochromecoxidasesubunitII细胞色素氧化酶亚基II28SrDNA28SribosomalDNA16S核糖体DNAfgFemtogram飞克GGram克hHour小时minMinute分钟mLMilliliter毫升molMole摩尔ngNanogram纳克nmol（nM）Nanomolar纳摩尔PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应pgPicogram皮克R2Relativecoefficientvalue相关系数SCSuspensionconcentrate悬浮剂SDStandarddeviation标准差secSecond秒SNPSinglenucleotidepolymorphisms单核苷酸多态性μLMicrolitre微升WPWettablePowder可湿性粉剂V 新疆农业大学硕士学位论文第1章绪论甜菜（Betavulgaris），又名菾菜，属藜科（Chenopodiaceae）甜菜属（Beta）[1]，原产于欧洲西部和南部沿海，大约在公元1500年左右从阿拉伯国家传入中国。甜菜作为世界上主要的糖料作物之一，其产量仅次于甘蔗。我国主要的甜菜种植区分布在新疆、黑龙江、内蒙古。据统计，20世纪90年代末至21世纪初，甜菜种植面积由78.3万hm2降到15.8万hm2。从2005年以后，甜菜种植面积有所回升，2005～2011年甜菜种植面积平均为20.6万hm2[1]，2011～2014年种植面积呈上升趋势。新疆是我国主要的的制糖地区之一，是全国最大的甜菜种植区、产糖区，其糖产量居全国首位。由于我国每年从德国等地进口大量的甜菜种子，使得甜菜上多种外来的有害生物随引种传入[2-3]，对我国甜菜的种植构成了潜在的威胁。1.1研究背景1.1.1甜菜霜霉病概况甜菜霜霉病（Peronosporaschachtii）是甜菜上毁灭性病害之一[4]。2007年甜菜霜霉病被列为我国进境检疫性有害生物。甜菜霜霉病19世纪末始于法国，后来在俄罗斯、美国等一些国家大面积的爆发，给当地甜菜生产造成了极为严重的经济损失[5]。20世纪60至90年代在我国贵州、四川以及新疆伊犁州相继发生此病，造成了甜菜一定程度的减产[6]。1.1.2甜菜胞囊线虫概况甜菜胞囊线虫（Heteroderaschachtii）是甜菜上一种具有重要经济意义的寄生性的线虫[7-8]。甜菜胞囊线虫的发生与甜菜种植密度关系密切[9-15]，该线虫寄主范围较广，能危害23个科，95个属，共200多种植物[16-17]，其中大多数的寄主植物为藜科和十字花科[18]。迄今为止，甜菜胞囊线虫在欧洲、亚洲、美洲大约40多个国家均有发生记录[19-21]，该胞囊线虫影响糖用甜菜的糖产量，造成严重的经济损失。在一些欧洲国家每年因甜菜胞囊线虫造成的损失约为9000亿欧元，约合人民币6.6兆[22]。2015年在新疆新源县和1 新疆甜菜上两种检疫性有害生物快速检测及甜菜霜霉病药剂防治技术研究额敏县的甜菜田间相继发现该线虫病，对当地甜菜生产危害极大。1.2研究现状1.2.1常见作物霜霉病研究现状1.2.1.1霜霉病症状特点感染霜霉病的作物，其症状均表现为叶片正面有黄色病斑，叶片背面有白色或灰白色霉层产生。不同作物在感染霜霉病后所表现的症状也存在差异。2002年宋雅坤等人[23]提出向日葵感染霜霉病后叶片出现淡黄色病斑，后期湿度大时在叶片病斑部位的背面产生白色霉层。2006年陈敏等人[24]提出玉米在感染霜霉病后叶片正面出现淡绿或黄色、白色或紫色的条纹或条斑，在环境湿度高时叶背面产生白色霉层。2010年李明远等人[25]提出莴苣感染霜霉病后叶片正面褪绿病斑，后期湿度大时病斑部位背面产生白色霉状物。2013年秦文韬等人[26]提出葡萄感染霜霉病后其叶片正面出现无规则黄斑，后期湿度大时病斑部位背面则产生片状白色粉状物。1.2.1.2分子检测技术研究（1）环介导恒温扩增法（LAMP）LAMP（Loop-mediatedisothermalamplification）是Notomi等[27]在2000研发一种新兴的DNA扩增技术，该技术针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶（BstDNApolymerase）的作用下，60～65℃恒温扩增，15～60min左右即可实现109～1010倍的核酸扩增。2013年秦文韬[26]以ITS为靶序列，利用LAMP技术建立了快速检测葡萄霜霉病的方法。2013年戴婷婷等人[28]以ITS为靶序列，利用LAMP技术建立了的快速检测橡树疫霉菌的方法。2015年赵伟等人[29]以PsYpt1为靶序列，利用LAMP技术建立了快速检测辣椒疫霉菌方法。（2）锁式探针检测方法（PLP）PLP（PadlockProbe）即锁式探针，即环式寡核苷酸探针（OCP），它是一种较长的单链寡核苷酸片段，两个末端和靶标序列毗邻互补，中间的一段连接序列对检测结果没有影响，可以作为通用引物的结合位点[30]。锁式探针的特异性和灵敏性较高，并且可以实现多个靶位点的同步检测。2013年秦文韬[26]以mt-DNA基因cox2为靶序列利用PLP2 新疆农业大学硕士学位论文方法实现了葡萄霜霉病快速检测。（3）常规PCR检测常规PCR的检测方法是最为基础的，同时也是人们最为常用的用于检测病原物的方法。这种检测方法因为具有快速、准确、灵敏的特点，因此在植物病菌的检测方法中占有重要的地位。1998年Lindqvist等人[31]以ITS为靶序列，利用常规PCR检测方法成功的检测到了北极树莓上发生的霜霉病。2012年乾义柯等人[32]以28SrDNA为靶序列对甜菜霜霉病原物形态进行了鉴定，并且采用通用引物NL1/NL4对病原物的28SrDNA进行扩增并简要分析了甜菜霜霉病的病原物与近缘种基因序列的系统发育关系。2014年Testen等人[33]以ITS为靶序列，利用常规PCR的检测方法设计特异性检测藜麦霜霉病的引物，并对其系统发育关系进行分析。（4）实时定量PCR检测实时荧光PCR（Real-timePCR）技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出，它是一种利用特殊的荧光探针进行扩增，根据相应的荧光信号积累来检测病原菌的方法。实时荧光定量PCR检测技术中以TaqMan实时荧光PCR检测方法应用最为广泛。该检测方法是在常规PCR的基础上，增加了一条有荧光标记的特异性的探针，根据荧光信号的积累对扩增结果进行判断。美国北卡州立大学利用荧光定量PCR检测方法成功检测出烟草霜霉病[34-35]。2014年Feng等人[36]以ITS为靶序列通过双重荧光定量PCR法成功建立了特异性检测菠菜霜霉病菌的荧光定量PCR方法。2015年Klosterman[37]根据单核苷酸多态性（SNP），以18SrDNA为靶序列利用TaqMan实时荧光PCR检测技术分别设计出能特异性扩增菠菜霜霉病菌与甜菜霜霉病菌的探针和引物。（5）基于蛋白质特征的病菌检测同工酶作为一种基因产物的蛋白质，它的结构多样性与不同种群DNA的组成和生物体遗传的多样性存在一定的联系[24]。Bonde[38]采用同工酶电泳技术对菲律宾指霜霉、甘蔗指霜霉等12种同工酶谱带特征进行了分析，认为菲律宾指霜霉与甘蔗指霜霉二者同工酶相似；此后，Micales[39]检测了菲律宾指霜霉、甘蔗指霜霉等在26种同工酶水平上的变异，证明菲律宾指霜霉与甘蔗指霜霉在22种酶的带谱相同，因此推断二者可能为同一种霜霉病菌。3 新疆甜菜上两种检疫性有害生物快速检测及甜菜霜霉病药剂防治技术研究1.2.2甜菜霜霉病研究现状1.2.2.1病原菌和症状研究甜菜霜霉病菌（Peronosporafarinosaf.sp.betaeByford），异名：（PeronosporaschachtiiFckl）属于卵菌门（Oomycota）、卵菌纲（Oomycetes）、霜霉目（Peronosporales）、霜霉科（Peronosporaceae）、霜霉属（Peronospora）。严进、郭文超、查红英、Kim等人[40-43]对甜菜霜霉病的症状及病原菌形态进行了概述：该病原菌的孢囊梗淡色（250～600μm）×（7.0～10μm），呈二叉状直角或锐角分支，多数分支为4～7次，以6次分支为主，孢子囊呈卵圆形或椭圆形，大小为（21.5～30.0μm）×（17.5～22.5μm），其长与宽的比值为1.17～1.35[43]。2010年Kim[43]等人提出甜菜感染霜霉病后，叶片由淡绿色变成淡黄色，且叶片变色部位背面有灰色霉层出现，大多数情况下，霉层出现在叶片背面，但当环境湿度足够的情况下，叶片正面也会有霉层出现。1.2.2.2致病性研究Russell、Byford等人[44-45]对甜菜霜霉病的致病性进行了研究，具体步骤如下：甜菜种子种植于已灭菌堆肥的育苗钵中，正常条件下生长发育；然后将甜菜霜霉病叶用自来水或实验室内用蒸馏水冲洗以获取含有游动孢子的接菌液；最后将接菌液装入无菌的喷壶中，喷洒至甜菜叶片背面，直至叶片喷洒的接菌液以水滴状滴落，将接菌的甜菜立即放入湿度室培养2d以上，每隔7d观察一次该甜菜叶片有无病害症状出现。2014年Klosterman等人[41]简要介绍了甜菜霜霉病的致病性研究试验步骤，其步骤如下：制备接菌剂：将病叶放入装有遇冷蒸馏水（4℃）的三角瓶中，剧烈摇动3～5h；然后用纱布将叶片及一些杂物滤除；甜菜种子种植21d后即子叶期进行接菌，将其放在露水室中（相对湿度：100%，18℃）生长24h，最后将植株移到生长室中（12h光照、12h黑暗，18～20℃）。国内未见有关甜菜霜霉病的致病性研究的相关报道。1.2.2.3田间防治措施研究（1）加大植物检疫力度胡白石等人[25]提出，有效控制甜菜霜霉病的发生需要加大口岸检疫力度，禁止购入甜菜霜霉病疫区的甜菜种子，加强国外引种的检疫力度，防止甜菜霜霉病的二次传播与4 新疆农业大学硕士学位论文扩散。（2）农业防治邓集汉等人提出，避免连作，尽可能的做到轮作倒茬，选用抗病性较好的甜菜品种如“苏垦8312”和“HYB13”，合理种植。使得田间能够良好通风，合理灌溉，降低田间湿度，增施有机肥料，做好田间调查及管理工作[46]。（3）药剂防治国内外对甜菜霜霉病的田间药效防治的相关报道较少。1963年Byford与Hull[47]采用田间叶面喷雾处理方式的药剂防效试验，经田间调查结果分析认为：田间甜菜霜霉病的防治效果发生与种植环境有关，若甜菜试验田与感病的甜菜种植区的距离较近，则会影响试验效果，若距离较远，叶面喷雾则会取得较好的防治效果；相比波尔多液、氧化亚铜等其他药剂，代森锰锌对甜菜霜霉病的防治效果更好。1994年邓集汉等人[46]提出：播种前用70%敌克松可湿性粉剂和增产菌进行拌种处理，甜菜幼苗期，用粉锈宁或70%甲基托布津可湿性粉剂喷洒叶面。1999年胡白石等人[25]提出利用75%百菌清、58%甲霜灵锰锌和40%增效瑞毒霉粉剂采用叶面喷雾或叶面喷雾与药剂拌种相结合的方法来防治甜菜霜霉病。2014年于生[48]进行甜菜霜霉病田间药剂筛选试验，结果表明：72%锰锌·霜脲可湿性粉剂为500倍液、50%烯酰·吗啉可湿性粉剂为600倍液、69%锰锌·烯酰可湿性粉剂为500倍液均对甜菜霜霉病具有较好的防治效果。1.2.3甜菜胞囊线虫研究现状1.2.3.1形态特征研究甜菜胞囊线虫（Heteroderaschachtii）属于垫刃目（Tylenchida）、垫刃亚目（Tylenchina）、垫刃总科（Tylenchoidea）、异皮科（Heteroderidae），异皮亚科（Heteroderinae），异皮线虫属（Heterodera），是我国进境检疫性有害生物[49-51]。甜菜胞囊线虫胞囊柠檬形，末端的阴门锥为两侧半膜孔型；雌虫有胞囊期，形状、大小与胞囊相似，口针平直或略弯曲；胞囊内含卵，后发育成二龄幼虫，虫体表面具纵向褶皱其体型细长；幼虫逐渐发育成雄成虫体型细长，发育成雌虫则虫体逐渐膨大成柠檬形，老熟后即成胞囊[16]。5 新疆甜菜上两种检疫性有害生物快速检测及甜菜霜霉病药剂防治技术研究1.2.3.2分子检测技术（1）常规PCR检测技术常规PCR技术是一种通过一对引物对目的片段进行扩增，然后根据电泳结果进行结果判断的技术。该技术成功应用于物种的分化并且在DNA诊断的发展过程中被认为是一项重要的里程碑。利用该技术能同时检测一种或多种线虫并且缩短了诊断所需的时间及费用[52-57]。1998年Uehara等人[56]通过常规PCR方法扩增咖啡短体（根腐）线虫与卢斯短体（根腐）线虫的rDNA序列，然后设计出特异性引物将二者成功区分开。2001年Subbotin等人[58]利用通用引物及特异性引物进行双重PCR从大豆胞囊线虫、甜菜胞囊线虫、三叶草胞囊线虫、禾谷胞囊线虫等8种不同胞囊线虫中特异性检测出大豆胞囊线虫。（2）荧光PCR检测技术实时荧光PCR可以通过杂交探针（TaqMan技术）或双链染料（SYBRGreenI染料技术）持续的监测样品的PCR扩增过程，该技术可以通过电脑屏幕上收集的荧光信号数据所呈现的对数线性区域与对照样品比对进行结果的判断。2005年Mehrdad等人[59]通过SYBRgreenI嵌合荧光法检测出马铃薯胞囊线虫、甜菜胞囊线虫。（3）随机扩增多态性DNA分析（RAPDs）RAPD（Randomamplifiedpolymorphism）技术是以8～l0bp的随机寡核苷酸片段作为引物，然后PCR扩增样品的基因组DNA，将PCR产物通过PAGE电泳或琼脂糖凝胶电泳进行检测，以此来研究DNA的多态性。1992年Edward等人[60]通过RAPD方法成功检测到甜菜胞囊线虫、大豆胞囊线虫及各胞囊线虫的6个小种，并将它们区分开。1997年Williamson等人[55]运用RAPD方法将北方根结线虫、奇氏根结线虫的单个幼虫区分开。（4）限制性片段长度多态性分析（RFLPs）RFLP（Restrictionfragmentlengthpolymorphism）技术的原理是DNA经限制性内切酶酶切后，利用常规PCR方法进行扩增形成特定大小的DNA片段，以此来区分不同的病原物。1997年Allen等人[61]通过PCR-RFLP方法分析了从各不同国家与地区收集的甜菜胞囊线虫、玉米胞囊线虫、豌豆胞囊线虫、大豆胞囊线虫的ITS区的种内、种间差异6 新疆农业大学硕士学位论文性。2002年Said等人[62]通过PCR-RFLP方法选用限制性内切酶FokI和MvaI[63]将甜菜胞囊线虫、甜菜异皮线虫、三叶草胞囊线虫、苜蓿胞囊线虫进行酶切，根据酶切片段的大小将甜菜胞囊线虫与其他三种线虫区分开。（5）电泳检测技术电泳检测技术作为一种较为简便的检测技术，广泛应用于病原物的检测。杨泽君等人[7]根据异皮属线虫的酯酶表型，通过PAGE凝胶电泳及等电聚焦电泳技术来检测线虫种类；同时指出可根据同工酶图谱的差异性，通过同工酶电泳来鉴定线虫种类。（6）血清学技术血清学技术的是一种根据抗原与抗体的特异性结合进行检测的技术。2004年梁定东等人[51]根据抗原与抗体的反应，成功的将马铃薯金线虫与马铃薯白线虫区分开。1.3研究目的及意义迄今为止，有关甜菜霜霉病的相关研究虽已取得了一些成就，但在一些方面还存在很多不足。对于甜菜霜霉病的分子检测方法还未建立，对于甜菜霜霉病田间药效的相关研究存在不足。为了解决这些问题，本文结合国内外的相关报道，展开了甜菜霜霉病的相关研究，建立了甜菜霜霉病的分子检测方法。甜菜霜霉病菌快速检测技术及其田间药剂筛选试验分别为口岸的进出境监测与检测提供了科学依据及后人的相关田间药剂筛选试验提供参考。迄今为止，有关甜菜胞囊线虫的相关研究虽已取得了部分成就，但在在某些方面还存在很多不足。对于甜菜胞囊线虫的TaqMan实时荧光PCR检测方法尚未建立。为了解决这一问题，本文结合相关文献报道，开了甜菜胞囊线虫的相关研究，建立了甜菜胞囊线虫TaqMan实时荧光PCR检测方法，为口岸的进出境的监测与检测提供科学的技术保障。1.4本项目研究内容1.4.1甜菜霜霉病的分子检测方法的建立与优化本研究以mt-DNA基因cox2为靶序列，采用通用引物P-cox2F/P-cox2R进行PCR7 新疆甜菜上两种检疫性有害生物快速检测及甜菜霜霉病药剂防治技术研究扩增。根据AS-PCR的原理，设计特异性扩增甜菜霜霉病菌的引物，并进行优化；根据ASPPAA-PCR的原理，设计出特异性扩增甜菜霜霉病菌的TaqMan探针与引物，并进行优化。1.4.2甜菜胞囊线虫TaqMan实时荧光PCR检测方法的建立与优化本研究以28SrRNA为靶序列，利用通用引物D2A/D3B进行扩增，然后设计特异性扩增甜菜胞囊线虫的TaqMan探针与引物，并进行优化。1.4.3防治甜菜霜霉病的药效试验本项研究通过叶面喷雾处理、药剂拌种处理、种子熏蒸处理三种不同的处理方法进行田间试验，其中每一类处理选用三种药剂，每种药剂设置3种不同剂量，以不施药的甜菜为对照，进而筛选出各处理最佳的药剂浓度及最佳的处理方式。8 新疆农业大学硕士学位论文第2章甜菜霜霉病菌分子检测技术研究甜菜霜霉病菌是专性寄生菌，不能人工分离培养，主要依据疑似病样上的病原物进行形态鉴定。目前国内对于甜菜霜霉病的报道较少，对于甜菜霜霉病分子检测方法尚未确立，因此建立甜菜霜霉病菌的分子鉴定和检测技术是非常必要的。本研究以mt-DNAcox2基因为靶序列，利用AS-PCR的原理建立快速检测甜菜霜霉病菌的常规PCR检测技术；依据ASPPAA-PCR原理建立实时荧光PCR检测技术，为后续甜菜霜霉病的相关研究提供了理论依据及技术支持。2.1材料与方法2.1.1试验材料来源供试的甜菜霜霉病叶均采于伊犁州尼勒克县；同时采集其他寄主植物的霜霉病样包括杖藜霜霉病叶、杂配藜霜霉病叶、葡萄霜霉病叶、菠菜霜霉病叶、莴苣霜霉病叶(表2-1)。供试甜菜种子：品种为KWS2409，由新疆检验检疫局技术中心提供。表2-1本研究的供试材料、寄主和来源Table2-1Thematerials,hostsandtheirsourcesofthisstudy来源序号分类地位寄主Sequenceno.ClassificationstatusHostSource1Peronosporaschachtii甜菜/Betavulgaris伊犁州尼勒克县2Peronosporaeffuse菠菜/Spinaciaoleracea乌鲁木齐市三坪农场3Peronosporavariabilis杖藜/Chenopodiumgiganteum伊犁州尼勒克县4Peronosporafarinosaf.sp.chenopodii杂配藜/Chenopodiumhybridum伊犁州尼勒克县5Plasmoparaviticola葡萄/Vitisvinifera五家渠市、伊犁州尼勒克县6Plasmoparaangustiterminalis苍耳/Xanthiumstrumarium伊犁州尼勒克县7Bremialactucae莴苣/Lactucasativa乌鲁木齐市2.1.2仪器及试剂试验使用的仪器：AppliedBiosystems®ProFlexTMPCR热循环仪，ABIQuantStudioTM7Flex实时荧光PCR仪，IS-2200数字图象分析仪，ND-1000分光光度计，TY-C型多功能电泳仪，尼康80i荧光显微镜，高速冷冻离心机，高压灭菌锅，震荡培养箱，恒温恒压培养箱。试验使用的试剂：植物基因组DNA提取试剂盒与RealMasterMix（Probe）9 新疆甜菜上两种检疫性有害生物快速检测及甜菜霜霉病药剂防治技术研究试剂盒购于天根生化科技有限公司，常规PCR所用试剂均购于北京鼎国生物有限公司，胶回收试剂盒、PMD19-T载体克隆试剂盒及质粒提取试剂盒均购于大连宝生物公司，引物、探针购于上海英潍捷基公司。2.1.3形态学鉴定采集田间疑似感染霜霉病的甜菜叶片并保湿，带回试验室用灭菌的手术刀轻轻刮取样品病斑部位的霉层，制片镜检，观察供试样品霜霉病菌的形态并拍照。2.1.4致病性研究2.1.4.1寄主植物的培育将甜菜种子用35%精甲霜灵乳剂拌种处理后播种于营养钵内，置于恒温恒湿培养箱内（12h的光周期：12h的光照，12h的黑暗；25℃），待甜菜发芽后，将其移栽至较大的花盆内，待甜菜长出5-8片真叶后，进行接种试验[64]。2.1.4.2接菌液的制备无菌操作下，用灭菌的刀片将甜菜霜霉病叶的病斑部位切下，放入含有灭菌水（4℃）的锥形瓶内，震荡3～5h即可获得含有游动孢子的接菌液[65]。2.1.4.3接种寄主植物将接菌液装入无菌的喷壶中，喷洒至甜菜叶片背面，直至叶片的喷洒的接菌液以水滴状滴落。2.1.4.4培养与观察将已接菌的甜菜放置在恒温恒湿培养箱内（100%的相对湿度，18℃），接种12h后，调节培养箱温度至22℃、相对湿度80%，重复上述步骤直至有霜霉病症出现[34]。在致病性试验中，共接种了5盆健康甜菜植株，甜菜之间隔离（套袋）处理，防止后期发病甜菜的交叉感染影响试验结果的真实性。2.1.5分子检测技术2.1.5.1样品DNA提取无菌操作条件下，用解剖刀切取甜菜霜霉病叶患病部位，置于研钵中加液氮充分研磨，用植物基因组DNA提取试剂盒提取甜菜霜霉病菌DNA，-20℃保存备用，本研究10 新疆农业大学硕士学位论文对照样品的DNA提取方法同上。2.1.5.2DNA扩增采用卵菌纲通用引物P-cox2F/P-cox2R[66]扩增供试样品mt-DNA基因cox2的序列，该引物序列如下：P-cox2F:5’-GGCAAATGGGTTTTCAAGATCC-3’P-cox2R:5’-CCATGATTAATACCACAAATTTCACTAC-3’PCR反应体系：2×TaqPCRGreenMix12.5µLP-cox2F/P-cox2R各1µLddH2O8.5µL模板DNA2µL总体积25µLPCR扩增程序：96℃，4min；96℃，30s；50℃，30s；72℃，1min共30个循环；72℃，4min。将PCR扩增产物在1.0%琼脂糖凝胶，1×TAE电泳缓冲液，100V电压条件下电泳35min，置于凝胶成像系统中紫外照射观察并分析。2.1.5.3克隆在紫外照射仪下，用刀片切下含甜菜霜霉病菌DNA的电泳胶块；采用琼脂糖凝胶回收试剂盒胶回收目的片段，并将胶回收目的片段与PMD19-T进行连接反应；转化到DH5α感受态细胞中；在含有氨苄的LB培养基上涂板，37℃条件下培养12～16h；挑取单个菌落进行培养；用质粒提取试剂盒提取质粒。将提取的质粒DNA进行PCR检测。2.1.5.4酶切重组质粒将提取的质粒DNA进行酶切，其酶切体系：重组质粒8µLEcoRI1µLddH2O11µL总体积20µL37℃条件下水浴过夜，将该产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测。11 新疆甜菜上两种检疫性有害生物快速检测及甜菜霜霉病药剂防治技术研究2.1.5.5测序及比对将提取的质粒DNA送至北京鼎国昌盛生物技术有限公司测序。将测序结果在NCBI网站上进行BlASTN比对，鉴定各测序结果的病原物种类。2.1.5.6系统发育分析首先将甜菜霜霉病菌与其他6种对照样品测序得到的序列以及GenBank数据库下载的与所测甜菜霜霉病的病原物同源性较高的病原物的mt-DNA基因cox2序列进行编辑，然后运用clustalW软件[67-69]进行序列的整合，最后用Meg5.05软件构建系统发育树。2.1.5.7常规PCR检测技术（1）设计特异性引物将甜菜霜霉病菌及其他6种对照霜霉病菌的基因序列上传到GenBank，并获得序列号（表2-2）。从GenBank数据库下载已发布的与甜菜霜霉病的病原物同源性较高的其他mt-DNAcox2基因序列，用DNAMAN8.0及GENEDOC进行比对、分析，选取cox2的保守区，根据AS-PCR的原理[70-74]，对甜菜霜霉病病原物序列第279位点碱基与其他对照组及同源性较高病原物的该位置的碱基的不同，采用PrimerPermier5.0软件设计了一对引物BSP-F/BSP-R，送至生物技术公司合成。（2）巢式PCR检测利用通用引物P-cox2F/P-cox2R进行首轮扩增，再用特异性引物BSP-F/BSP-R进行第二轮扩增（将首轮扩增的PCR产物作为第二轮扩增的模板）。其中，两轮的PCR反应体系一致。PCR反应体系：2×TaqPCRGreenMix12.5µL上、下游引物各1µL质粒DNA2µLddH2O8.5µL总体积25µL首轮PCR扩增程序：96℃，4min；96℃，30s；50℃，30s；72℃，1min共30个循环；72℃，4min。第二轮PCR扩增程序：94℃，5min；94℃，30s，53℃，30s，72℃，12 新疆农业大学硕士学位论文1min共38个循环；72℃，10min。（3）特异性引物灵敏度检测将提取的甜菜霜霉病菌的质粒DNA进行倍比稀释，共设置了7个浓度梯度分别是：1pg/µL、10pg/µL、100pg/µL、1ng/µL、10ng/µL、20ng/µL、40ng/µL，然后用特异性引物进行PCR扩增，其产物经凝胶电泳检测，查看该引物能检测到的最低质粒DNA浓度。表2-2霜霉菌种类、寄主、来源及序列号Table2-2Listoforganisms,hosts,sourcesandsequencesGenBankaccessionnumber病原物寄主来源序列号OrganismHostOrigonGenBankaccessionno.Peronosporaschachtii*甜菜/Betavulgaris本项研究KT944079P.farinosaf.sp.beta甜菜/BetavulgarisGenBankFJ649394P.schachtii甜菜/BetavulgarisGenBankKP330616.1P.schachtii甜菜/BetavulgarisGenBankKP330606.1P.effuse*菠菜/Spinaciaoleracea本项研究KT944073P.variabilis*杖藜/Chenopodiumgiganteum本项研究KT944074P.farinosaf.sp.chenopodii*杂配藜Chenopodiumhybridum本项研究KT944076P.lepigoni牛漆姑草属/SpergulariarubraGenBankKP330661.1P.obovata牛漆姑草属/SpergulaarvensisGenBankKP330651.1P.polycarpi多荚草属/PolycarpondiphyllumGenBankKP330620.1P.rumicis酸模属/RumexacetosellaGenBankKP330634.1P.Sp.2709酸模属/RumexarifoliusGenBankKP330635.1P.Sp.HV2657酸模属/RumexacetosaGenBankKP330630.1P.Sp.1164牛漆姑草属/SpergulariamarinaGenBankKP330655.1Plasmoparaangustiterminalis*苍耳/Xanthiumstrumarium本项研究KT944075Pl.viticola*葡萄/Vitisvinifera本项研究KT944077Bremialactucae*莴苣/Lactucasativa本项研究KT944078注：符号（*）表示为本试验所采集材料及病原物的鉴定均由本文作者完成，其中这些病原物的序列也已经上传到GenBank并获得了序列号。其余未标注的序列为GenBank下载。Note:Thesignals(*)indicatethatallspecimenswerecollectedanddeterminedbytheauthorandthesequencesofwhichweresubmittedtoGenBankandobtainedtheaccessionnumber.InformationoftheseorganismswithoutsignalweredownloadedfromGenBank.2.1.5.8实时荧光PCR检测技术（1）TaqMan-MGB探针与引物设计根据样品的测序结果与下载的已发布的同甜菜霜霉病病原物同源性较高序列的比对结果，然后再根据ASPPAA-PCR原理[75-76]，利用DNAMAN8.0及GENEDOC进行比13 新疆甜菜上两种检疫性有害生物快速检测及甜菜霜霉病药剂防治技术研究对分析选取基因cox2的保守区，设计一对引物BETEV-F/BETEV-R与MGB探针BETEV-probe，引物与探针由上海英潍捷基公司合成。（2）TaqManMGB探针特异性验证为了验证引物BETEV-F/BETEV-R与TaqManMGB探针BETEV-probe的特异性，将供试材料：甜菜霜霉病菌DNA；菠菜霜霉病菌DNA；杖藜霜霉病菌DNA；杂配藜霜霉病菌DNA；苍耳霜霉病菌DNA；葡萄霜霉病菌DNA；莴苣霜霉病菌DNA进行实时荧光PCR检测。PCR反应体系：ComponentVolume/Tube2.5×realMasterMix8µLBETEV-F/BETEV-R1µLBETEV-probe0.5µL20×ProbeEnhancersolution1µL质粒DNA2µLddH2O7.5µL总体积20µL实时荧光PCR反应程序：94℃，2min；94℃，20sec，54℃，20sec，68℃，1min共40个循环。（3）TaqManMGB探针浓度优化用无菌水稀释引物BETEV-F/BETEV-R与TaqManMGB探针（上、下游引物均为800nM，探针为400nM）。共设置6个浓度梯度（引物/探针）：800nM/400nM；400nM/200nM；200nM/100nM；100nM/50nM；50nM/25nM；25nM/12.5nM，以无菌水代替甜菜霜霉病菌质粒DNA加入反应体系作为空白对照。（4）TaqManMGB探针灵敏度检测用无菌水稀释将提取的甜菜霜霉病菌的质粒DNA进行倍比稀释，设置7个浓度梯度：10fg/µL、100fg/µL、1pg/µL、10pg/µL、100pg/µL、1ng/µL、10ng/µL及以无菌水代替甜菜霜霉病菌加入反应体系作为空白对照，然后进行荧光PCR检测。以稀释的质粒DNA浓度为横坐标,以C2t值为纵坐标绘制其标准回归线，分析其AE、R、SD，其14 新疆农业大学硕士学位论文中AE的计算公式为AE=(10(1/slope)-1)×100[77-80]。2.2结果与分析2.2.1形态鉴定结果田间感染霜霉病菌的甜菜叶片症状：染病甜菜叶片背面病斑初期由浅绿色变成淡黄色，中期该病斑部位出现浅灰色霉层，后期病斑部位霉层由浅灰色变成深棕色（图2-1，A-B）。经显微镜观察，甜菜霜霉病菌、菠菜霜霉病菌、藜霜霉病菌的孢囊梗形态较为接近，但前两者是属于主干单轴分支，后者为二叉状分支，且前两者的孢囊梗比较直或者稍微有点弧度，后者的孢囊梗是整体平滑、弯曲（图2-2，A-I）。在甜菜霜霉病与其他6种对照样品霜霉病的孢囊梗中，甜菜霜霉病菌的孢囊梗形态与菠菜霜霉病菌最为接近，但在孢囊梗分支的末端，甜菜霜霉菌孢囊梗末端锥形，不尖锐，同时，甜菜霜霉病菌的孢囊梗呈透明状，其形态呈单轴二叉状分支，锐角或直角分支3～8次，末端分支（21～30µm）×（17.5～22.5µm），小梗末端稍平钝，孢子卵圆形或椭圆形，大小（21.5～30.0µm）×（17.5～22.5µm），镜检过程中未发现卵孢子。ABA：感病叶片初期症状（红色圆圈标示）；B：感病叶片后期症状（红色圆圈标示）A:Initialsymptomofdiseaseleafmarkedwitharedcircle;B:Thelatesymptomofdiseaseleafmarkedwithredcircles图2-1甜菜霜霉病叶症状Figure2-1Thesymptomofsugarbeetdownymildew15 新疆甜菜上两种检疫性有害生物快速检测及甜菜霜霉病药剂防治技术研究ABCDEFGHIA-B：甜菜霜霉病菌的孢囊梗；C:甜菜霜霉病菌的孢子；D：菠菜霜霉病菌；E：杖藜霜霉病菌；F：杂配藜霜霉病菌；G：苍耳霜霉病菌；H：葡萄霜霉病菌；I：莴苣霜霉病菌A-B:Sporangiophoresofsugarbeetdownymildewpathogen;C:Conidiaofsugarbeetdownymildewpathogen;D:DownymildewpathogenofSpinaciaoleracea;E:DownymildewpathogenofChenopodiumgiganteum;F:DownymildewpathogenofChenopodiumhybridum;G:DownymildewpathogenofXanthiumstrumarium;H:DownymildewpathogenofVitisvinifera;I:DownymildewpathogensofLactucasativa图2-2甜菜霜霉病菌与其他对照样品的镜检形态图Figure2-2Themorphologyofsugarbeetdownymildewpathogenandothercontrolsgroupofoomycotathroughmicroscopy(Thisfigureobtainedfromthisstudy)2.2.2甜菜霜霉病致病性研究将甜菜霜霉病菌重复接种至甜菜叶片上，引起健康的甜菜叶片发病，接种的5盆甜菜植株上部分叶片均出现症状。病叶的症状表现为：接种的甜菜叶片初期出现褪绿斑并逐渐演变成黄色斑块，后期部分甜菜叶片的黄斑部位出现浅灰色霉层并逐渐演深棕色。接种甜菜叶片的症状与田间甜菜霜霉病发病症状基本相同，经镜检观察病原菌形态，确定该病原菌的形态与甜菜霜霉病菌的形态相同（图2-3，A-D）。因此确认接菌甜菜感染了霜霉病，说明制备的接菌液在适宜温度条件下对健康甜菜具有致病性。16 新疆农业大学硕士学位论文ABCDA：接种前健康植株；B：接种植株的发病叶片出现黄褐斑；C：黄斑部位出现灰白色霉层；D：发病部位镜检结果A:Thehealthyplantbeforeinoculation;B:Typicalsymptomsofsugarbeetdownymildewwithyellowishfoliarlesions;C:Typicalsymptomofsugarbeetdownymildewwithgreyishfungalonlowersurface;D:Themorphologyofsugarbeetdownymildewthroughmicroscopy图2-3甜菜接菌叶片霜霉病发病症状与病原镜检图Figure2-3Symptomsofsugarbeetinoculatedwithinoculumand.themorphologyofdownymildew2.2.3甜菜霜霉病分子检测技术2.2.3.1通用引物扩增及测序结果采用卵菌纲通用引物P-cox2F/P-cox2R对甜菜霜霉病菌及其他供试霜霉病菌进行PCR扩增，扩增产物经电泳后，结果显示：甜菜霜霉病叶与6种对照样品均能扩增出大小约为630bp左右的DNA片段（图2-4）。M123456789750bp500bpM：2000bpDNAladder；1：阳性对照；2：甜菜霜霉病菌；3-8：杖藜霜霉病菌、苍耳霜霉病菌、杂配藜霜霉病菌、葡萄霜霉病菌、菠菜霜霉病菌、莴苣霜霉病菌；9：空白对照M:2000bpDNAladder;1:Positivecontrol;2:DownymildewpathogenofBetavulgaris;3-8:DownymildewpathogensofChenopodiumgiganteum,Xanthiumstrumarium,Chenopodiumhybridum,Vitisvinifera,Spinaciaoleracea,actucasativarespectively;9:Blank图2-4引物P-cox2F/P-cox2R的扩增结果Figure2-4ThePCRamplifiedresultbyprimerP-cox2F/P-cox2R17 新疆甜菜上两种检疫性有害生物快速检测及甜菜霜霉病药剂防治技术研究2.2.3.2重组质粒鉴定结果经蓝白斑筛选、PCR鉴定及EcoRI酶切鉴定，筛选出含有正确插入片段的重组质粒。结果表明：甜菜霜霉病重组质粒经PCR扩增，电泳结果均可得到大小约为630bp左右的片段，其大小与插入的片段大小相同（图2-5）。甜菜霜霉病重组质粒DNA经EcoRI酶切后，其电泳结果显示：上方片段大小与PMD19-T（大小为2692bp）一致，下方片段与插入片段大小一致，片段大小约为630bp（图2-6）。M123750bp500bpM：2000bpDNAladder；1-2：甜菜霜霉病菌；3：空白对照M:2000bpDNAladder;1-2:Sugarbeetdownymildewpathogen;3:Blank图2-5甜菜霜霉病菌重组质粒扩增结果Figure2-5ThePCRamplifiedresultofrecombinantplasmidofsugarbeetdownymildewM123750bp500bpM：2000bpDNAladder；1：空白对照；2-3：甜菜霜霉病菌M:2000bpDNAladder;1:Blank;2-3:Sugarbeetdownymildewpathogen图2-6甜菜霜霉病菌重组质粒酶切结果Figure2-6Therecombinantenzymeresultsofsugarbeetdownymildew2.2.3.3测序及同源性分析结果甜菜霜霉病菌质粒DNA及对照样品（菠菜霜霉病菌、杖藜霜霉病菌属、杂配藜霜霉18 新疆农业大学硕士学位论文病菌、苍耳霜霉病菌、葡萄霜霉病菌、莴苣霜霉病菌）的质粒DNA送至测序公司测序，其测序结果显示:甜菜霜霉病菌片段大小为631bp（图2-7）。测序结果逐一在NCBI上进行BlAST比对，比对结果显示：甜菜霜霉病菌与Peronosporaschachtii同源性最高达100%，因此可认为该甜菜霜霉病菌属于Peronosporaschachtii。其他供试材料比对结果：其片段大小与甜菜霜霉病菌片段大小相差不大，均为630bp左右，其中菠菜霜霉病菌为Peronosporaeffuse；杖藜霜霉病菌为Peronosporavariabilis；杂配藜霜霉病菌为Peronosporafarinosaf.Sp.chenopodii；苍耳霜霉病菌为Plasmoparaangustiterminalis；葡萄霜霉病菌Plasmoparaviticola；莴苣霜霉病菌为Bremialactucae。将7种供试材料的cox2的基因序列上传至GenBank，获得７个序列号具体见表2-2。TGGCAAATGGGTTTTCAAGATCCAGCAACCCCAGTTATGGAAGGTATTATTAACTTTCATCATGATTTAATGTTTTTTTTAATTATCGTTACTGTATTTGTTTGTTGGATGTTATTTAGAGTAATTACTCTTTTTGATGAAAAAAAAAATAAAATTCCAGCAACAGTAGTACACGGAGCTACTATTGAAATTATTTGGACTTCTATTCCAGCTTTAATTTTATTAATGGTTGCAGTACCTTCTTTTGCATTATTATATTCAATGGATGAAGTAATTGACCCTATTATCACATTAAAAGTAATTGGTAATCAATGGTATTGGAGTTACGAGTATTCAGATAATTTAGAGTTTTCAGATGAACCTTTAATTTTTGATAGTTATATGGTACAAGAAGATGATTTAGCTATAGGCCAATTCCGACTTTTAGAAGTAGATAATCGTGTAGTAGTTCCCACTAATAGTCATATTAGAATATTAATTACTGCTTCTGATGTTTTACATTCATGGGCTATCCCATCATTAGGTATTAAATTGGATGCCTGTCCTGGACGTTTAAATCAAACATCAATGTTTATTAAAAGAGAAGGTGTTTTTTATGGGCAATGTAGTGAAATTTGTGGGGTAAATCACG图2-7引物P-cox2F/P-cox2R测得的甜菜霜霉病菌的序列Figure2-7SequenceofsugarbeetdownymildewamplifiedbyP-cox2F/P-cox2R2.2.3.4系统发育分析根据测序得到的甜菜霜霉病菌和6种对照样品的基因序列以及从Genbank数据库中下载的相关序列，运用分支进化学法构建了系统发育树（图2-8）。经过系统进化分析，其中四种甜菜霜霉菌的线粒体DNAcox2基因序列：Peronosporaschachtii（KT944079）与GenBank下载的相关序列Peronosporafarinosaf.sp.beta（FJ649394）、Peronosporaschachtii（KP330616.1）、Peronosporaschachtii（KP330606.1）包含在了一个分支单元组内，在系统发育树中验证可信度值93%，可认为本项研究甜菜上测得序列为Peronosporaschachtii。但这些序列与寄主为杖藜、牛漆姑草属、杂配藜、苍耳、葡萄、莴苣的遗传关系较远，同时该系统发育树也揭示了Peronosporaschachtii、Peronosporaeffuse、Peronosporarumicis、Peronospora.sp.2709、Peronospora.sp.HV2657（后两者的寄主为酸模属）形成了一个较大的分支，系统发育树中验证可信度值82%。19 新疆甜菜上两种检疫性有害生物快速检测及甜菜霜霉病药剂防治技术研究Peronosporaschachtii(KT944079)*93Peronosporaschachtii(KP330606.1)Peronosporafarinosaf.sp.beta(FJ649394.1)82Peronosporaschachtii(KP330616.1)Peronosporaeffuse(KT944073)*Peronosporarumicis(KP330634.1)100Peronosporasp.2709(KP330635.1)7290Peronosporasp.HV2657(KP330630.1)Peronosporasp.1164(KP330655.1)72Peronosporalepigoni(KP330661.1)70Peronosporaobovata(KP330651.1)67100Peronosporapolycarpi(KP330620.1)Peronosporafarinosaf.sp.chenopodii(KT944076)*Peronosporavariabilis(KT944074)*Bremialactucae(KT944078)*Plasmoparaangustiterminalis(KT944075)*95Plasmoparaviticola(KT944077)*0.005分支显示的数字是经过1000bootstapreplicates得到，且bootstap值均大于60%，符号（*）表示本研究采集的样品所获得的序列，实心黑三角形（）表示本研究获得的的Peronosporaschachtii，对照样品用空心三角形（）标注Numbersofthebranchesrepresentbootstapvaluesabove60%obtainedfrom1000bootstapreplicates.Signal(*)denotesequencesobtainedfromthisstudy.ThePeronosporaschachtiiofthisstudyisshownwithasolidblacktriangle(),othercontrolgroupsofthisstudyisshownwithhollowtriangle()图2-8基于线粒体cox2基因的甜菜霜霉病菌的系统发育树Figure2-8Phylogenetictreeinferredfromaneighbor-joininganalysisofsugarbeetdownymildewbasedonthemt-DNAgenecox22.2.3.5常规PCR检测技术（1）特异性引物的设计根据GenBank数据库下载同源性较高的序列以及该试验测序获得的甜菜霜霉病菌及其他6种对照霜霉病的mt-DNA基因cox2的序列，按照表2-2从上到下的顺序进行序列比对其中，根据甜菜霜霉病（KT944079）与其他霜霉病菌第279位点（TC）等位基因的不同处，但该位点与GenBank数据库下载的其他三个甜菜霜霉病基因序列相同（图2-9）。根据AS-PCR原理设计特异性引物BSP-F/BSP-R，其具体序列如下（加粗碱基为SNP位点）：BSP-F：5’-CAATGGATGAAGTAATTGAC-3’BSP-R：5’-GGTTCATCTGAAAACTCTAA-3’20 新疆农业大学硕士学位论文BSP-FBSP-R垂直向下的箭头指示的是SNP位点的位置TheverticalarrowshowedthepositionoftheSNP图2-9设计的特异性引物（BSP-F/BSP-R）具体位置Figure2-9Thelacationsofdesignedspecificprimers(BSP-F/BSP-R)（2）巢式PCR及特异性检测巢式PCR电泳结果表明，第一步卵菌纲通用引物P-cox2F/P-cox2R能将所有的供试材料扩增出来，片段大小均为630bp左右。用本研究所设计的特异性引物BSP-F/BSP-R来扩增第一步得到的PCR产物，经电泳检测，仅甜菜霜霉病菌出现条带，片段大小为103bp（图2-10）。M123456789250bp100bpM:2000bpDNAladder；1：空白；2-3：甜菜霜霉病菌；4-9：杖藜霜霉病菌、苍耳霜霉病菌、杂配藜霜霉病菌、葡萄霜霉病菌、菠菜霜霉病菌、莴苣霜霉病菌M:2000bpDNAladder;1:Blank;2-3:DownymildewpathogensofBetavulgaris;4-9:DownymildewpathogensChenopodiumgiganteum,Xanthiumstrumarium,Chenopodiumhybridum,Vitisvinifera,Spinaciaoleracea,Lactucasativa图2-10特异性引物BSP-F/BSP-R扩增结果Figure2-10ThePCRamplifiedresultbyprimerBSP-F/BSP-R（3）特异性引物灵敏度检测21 新疆甜菜上两种检疫性有害生物快速检测及甜菜霜霉病药剂防治技术研究将甜菜霜霉病菌的质粒DNA倍比稀释，浓度分别为：1pg/µL、10pg/µL、100pg/µL、1ng/µL、10ng/µL、20ng/µL、40ng/µL，经PCR扩增，电泳结果显示：随着甜菜霜霉病菌模板浓度的降低，电泳条带越来越暗，当甜菜霜霉病菌DNA浓度为1pg/µL时电泳结果上无条带出现，试验结果显示：试验设计的能检测甜菜霜霉病菌的特异性引物对BSP-F/BSP-R最低能检测到10pg/µL的质粒DNA（图2-11）。M123456789250bp100bpM：2000bpDNAladder；1-8：1pg/µL、10pg/µL、100pg/µL、1ng/µL、10ng/µL、20ng/µL、40ng/µL、100ng/µL；9：空白M:2000bpDNAladder;1-8:1pg/µL,10pg/µL,100pg/µL,1ng/µL,10ng/µL,20ng/µL,40ng/µL,100ng/µL;9:Blank图2-11特异性引物BSP-F/BSP-R灵敏度检测结果Figure2-11TheresultofsensitivitydetectionamplifiedbyspecificprimerBSP-F/BSP-R2.2.3.6实时荧光PCR检测技术（1）TaqMan-MGB探针设计根据GenBank数据库下载同源性较高的序列以及测序获得的甜菜霜霉病菌及其他6种对照霜霉病的mt-DNA基因cox2的序列的比对分析结果，按照ASPPAA-PCR原理，根据甜菜霜霉病菌包括：KT944079（试验测得）、FJ649394、KP330616.1、KP330606.1（后三者为GenBank下载的序列）与其他霜霉病菌（包括：菠菜霜霉病菌、杖藜霜霉病菌、杂配藜霜霉病菌、苍耳霜霉病菌、葡萄霜霉病菌、莴苣霜霉病菌）第279位点（TC）等位基因的不同设计一对引物BETEV-F/BETEV-R与MGB探针BETEV-probe（图2-12）。设计的探针、引物具体序列如下（下划线的碱基为人为引入的错配碱基；加粗碱基为SNP位点）：BETEV-F：5’-GCTACTATTGAAATTATTTGGAC-3’BETEV-R：5’-ACTTTTAATGTGATAATCGGGT-3’BETEV-probe：5’-FAM-ATGGATGAAGTAATTGACCC-MGB-NFQ-3’22 新疆农业大学硕士学位论文BETEV-FBETEV-probeBETEV-R单线标注的为错配碱基，加粗线为SNP位点Thesinglestraightshowedthesiteofmismatchbase;andtheboldlineshowedthepositionofSNP图2-12特异性引物与探针（BETEV-F/BETEV-R，BETEV-probe）的具体位置Figure2-12Thelacationsofdesignedspecificprimersandprobe(BETEV-F/BETEV-R,BETEV-probe)（2）TaqManMGB探针特异性验证结果利用设计的TaqManMGB探针扩增甜菜霜霉病菌及其他6种对照霜霉病菌，扩结果显示：甜菜霜霉病菌出现的荧光信号呈指数增加（Ct=25），其他6种对照霜霉病菌未出现荧光信号增加（图2-13）。ABCDEFGHIA-B：甜菜霜霉病菌；C-H：杖藜霜霉病菌、苍耳霜霉病菌、杂配藜霜霉病菌、葡萄霜霉病菌、菠菜霜霉病菌、莴苣霜霉病菌；I：空白A-B:DownymildewpathogensofBetavulgaris;C-H:DownymildewpathogensofChenopodiumgiganteum,Xanthiumstrumarium,Chenopodiumhybridum,Vitisvinifera,Spinaciaoleracea,Lactucasativarespectively;I:Blank图2-13实时荧光PCR验证TaqManMGB探针与引物特异性Figure2-13TheSpecificityofTaqManMGBprobeandprimersbyreal-timePCR23 新疆甜菜上两种检疫性有害生物快速检测及甜菜霜霉病药剂防治技术研究（3）TaqManMGB探针浓度优化结果引物与探针优化的扩增结果显示：引物和探针的浓度越高，扩增曲线Ct越小并且曲线的高度及斜率的越大；引物和探针的浓度越低，扩增曲线Ct越大，曲线的高度及斜率的越小，结果表明引物浓度为800nM，探针浓度为400nM时，扩增效果最佳（图2-14）。ABCDEFGA-F（引物/探针）：800nM/400nM；400nM/200nM；200nM/100nM；100nM/50nM；50nM/25nM；25nM/12.5nM；G：空白A-F(Primers/probeconcentration):800nM/400nM;400nM/200nM;200nM/100nM;100nM/50nM;50nM/25nM;25nM/12.5nM;G:Blank图2-14TaqManMGB探针与引物浓度优化扩增曲线Figure2-14AmplificationplotsofconcentrationoptimizationsofTaqManMGBprobeandprimers（4）TaqManMGB探针灵敏度检测甜菜霜霉病菌质粒DNA用无菌水稀释成7个浓度梯度，经TaqManMGB探针与引物扩增，结果表明：7个浓度梯度的质粒DNA均出现荧光信号指数增加，但空白对照未出现荧光信号增加（图2-15）。甜菜霜霉病菌质粒DNA浓度分别为：10fg/µL、100fg/µL、1pg/µL、10pg/µL、100pg/µL、1ng/µL、10ng/µL，其对应的的Ct值分别为：31.985、29.049、25.612、22.143、18.687、15.384、12.095。绘制的标准回归线：y=-3.3545log（x）+15.427（截距=15.427；斜率=-3.3545），AE=98.7%，R2=0.9996，0.1035时该浓度下的扩增不被考虑[65]。因此，设计的TaqManMGB探针与引物最低能检测到10fg/µL的甜菜霜霉病菌质粒DNA。24 新疆农业大学硕士学位论文ABCDEFGHA-G（甜菜霜霉病DNA浓度）：10ng/µL、1ng/µL、100pg/µL、10pg/µL、1pg/µL、100fg/µL、10fg/µL；H：空白A-G(DNAconcentrationsofP.schachti):10ng/µL,1ng/µL,100pg/µL,10pg/µL,1pg/µL,100fg/µL,10fg/µL;H:Blank图2-15TaqManMGB探针（BETEV-probe）灵敏度检测扩增曲线Figure2-15TheamplificationplotofsensitivityofBETEV-probeTaqManassay图2-16不同浓度甜菜霜霉病菌质粒DNA的Ct值标准回归线Figure2-16ThestandardregressionlineofdifferentplasmidDNAconcentrationsofsugarbeetdownymildew2.3小结与讨论本研究以mt-DNA基因cox2为靶序列，根据AS-PCR的原理设计了用于检测甜菜霜霉病菌的特异性引物BSP-F/BSP-R，该引物通过对6种对照样品的检测验证其特异性较好，最低能检测10pg/µL的甜菜霜霉病菌质粒DNA；同时根据ASPPAA-PCR的原理，设计检测甜菜霜霉菌TaqManMGB探针（BETEV-probe）与引物（BETEV-F/BETEV-R），25 新疆甜菜上两种检疫性有害生物快速检测及甜菜霜霉病药剂防治技术研究该探针与引物通过对6种对照样品的检测，结果验证其特异性较好，最低能检测10fg/µL的甜菜霜霉病菌质粒DNA，引物/探针浓度为800nM/400nM扩增效果最佳。尽管ITS区一直被看作是霜霉病最常用的分类方法[81]，但由于ITS区高度保守性，且种间差异较小，不能自动的鉴定自身的基因同源性[82]，同时近年来对于mt-DNA检测霜霉病的报道也越来越多。2007年Göker[83]通过对多个基因（LSUrDNA、cox2、β-Tubulin、NADH1）的系统发育进行研究来分析各种霜霉病。2011年Choi等[82]依据线粒体基因cox2、nad1的系统发育关系揭示了菠菜霜霉病菌（Peronosporaeffusa）的种内变异情况。2013年秦文韬等人[30]以mt-DNA基因cox2为靶序列成功建立了葡萄霜霉病的快速检测方法。2014年Annal等[36]根据扩增藜麦霜霉病菌的ITS与mt-DNA基因cox2的基因序列，同时分析不同品种藜麦种子间的遗传变异以及与卵菌门其他病原物的系统发育关系，试验结果显示基于cox2的系统发育关系与ITS的分析结果大致相同，试验证明cox2也可以作为除ITS以外的另一种分类方法。2015年Choi等[84-85]经研究提出了相比cox1，cox2对物种的鉴定成功率更高，并且，对于比较珍贵的标本采用以cox2为靶序列，PCR、测序反应效率更高。本试验常规PCR检测技术是依据AS-PCR的原理建立的，该原理是由Newton等人[86]在1989提出即当引物3’末端碱基与等位基因不互补时，PCR扩增将不能进行，通过单个核苷酸的多态性来达到检测效果，但在有些情况下即便3’碱基不相匹配，扩增也能进行[87-88]，因此为了增加引物的特异性，人为的在3’末端第二、三的位置引入错配碱基[89-91]。本试验的实时荧光PCR检测技术是根据ASPAA-PCR原理建立的，该方法利用等位基因特异性的小沟结合分子（MGB）TaqMan探针及等位基因特异性引物的混合物能够从提取的DNA量化SNP位点。2015年Klosterman[41]通过ASPAA-PCR的方法成功将菠菜霜霉病菌与甜菜霜霉病菌区分开。本项研究以mt-DNA基因cox2为靶序列，建立特异性检测甜菜霜霉病菌的常规PCR检测技术和实时荧光PCR检测技术。本试验将田间采集的甜菜霜霉病叶制备的接菌液成功接菌到室内健康的甜菜上，使健康甜菜植株感染霜霉病。26 新疆农业大学硕士学位论文第3章甜菜胞囊线虫分子检测技术研究甜菜胞囊线虫是危害甜菜的检疫性有害生物，对甜菜产量的影响极大。2015年7月，此病首次在新疆伊犁新源县发生，发病面积达6215亩，发病率高达65%。同年9月在新疆额敏县167团发生，发病田的甜菜植株大片黄化萎蔫，甚至死亡。目前国内其他省区尚无发生报道。国内对于甜菜胞囊线虫病的研究报道极少，仅仅在形态学等方面有综述性报道，尚无对甜菜胞囊线虫分子检测方法，尤其是TaqMan实时荧光PCR检测方法的研究。因此开展甜菜胞囊线虫的分子检测技术研究，建立该线虫快速、灵敏、定量、准确的检测方法，为防范该线虫从疫区扩散、蔓延，或从国外传入具有十分重要的意义。本文以28SrRNA基因为靶序列，建立了甜菜胞囊线虫的实时荧光PCR检测方法。3.1材料与方法3.1.1试验材料供试的甜菜胞囊线虫样品采自新疆伊犁州新源县以及塔城地区额敏县167团甜菜地，大豆胞囊线虫的样品由沈阳农业大学段玉玺教授提供，小麦禾谷胞囊线虫的胞囊由中国检验检疫科学院葛建军研究员提供（表3-1）。将田间采集的含有甜菜胞囊线虫的土壤放入烧杯中，加入适量的蒸馏水，土壤与水的比例按1/50～100g/mL，用玻璃棒搅拌均匀，静置片刻，先用20目网筛过滤，再用80目网筛过滤[92]，用洗瓶重复冲洗，待冲洗物不浑浊时，将网筛上的混合物冲洗到培养皿里，在解剖镜下用移液器枪（事先将枪头用剪刀剪去小部分）吸取混合物里健康胞囊，4℃储存备用。表3-1试验所用线虫来源Table3-1Speciesandpopulationsofnematodestestedinthisstudy种类种族起源采集地点SpeciesPopulationoriginLocation甜菜胞囊线虫Heteroderaschachtii伊犁州新源县甜菜地1甜菜胞囊线虫Heteroderaschachtii伊犁州新源县甜菜地2甜菜胞囊线虫Heteroderaschachtii塔城地区额敏县167团大豆胞囊线虫Heteroderaglycines沈阳农业大学植物保护学院小麦禾谷胞囊线虫Heteroderaavenae中国检验检疫科学研究院3.1.2仪器及试剂27 新疆甜菜上两种检疫性有害生物快速检测及甜菜霜霉病药剂防治技术研究所用仪器：AppliedBiosystems®ProFlexTMPCR热循环仪，ABIQuantStudioTM7Flex实时荧光PCR仪，ND-1000分光光度计，尼康80i荧光显微镜，高速冷冻离心机，ZEISS解剖显微镜。所用试剂：微量样品基因组DNA提取试剂盒、荧光PCR所用RealMasterMix（Probe）试剂盒购于天根生化科技有限公司，常规PCR所用试剂购于北京鼎国生物有限公司，胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒以及引物和探针均购于大连宝生物公司。3.1.3形态学鉴定将田间采集的甜菜胞囊线虫的胞囊在显微镜下镜检观察：首先在解剖镜下观察其甜菜胞囊线虫的胞囊形态；然后在干净的载玻片上滴一滴香柏油，将甜菜胞囊二龄幼虫放入香柏油上，显微镜下镜检观察其形态特征。3.1.4分子生物学检测技术3.1.4.1核酸提取无菌条件下，挑取5个成熟胞囊，研碎，利用微量样品基因组DNA提取试剂盒（DP316）提取甜菜胞囊线虫核酸，-20℃保存备用，本试验对照样品核酸提取方法同上。3.1.4.2DNA扩增采用Deley等人[93]1999年公布的通用引物D2A/D3B扩增部分28SrRNA序列（表3-2）。PCR反应体系：2×TaqPCRGreenMix12.5µL，10μM上、下游引物各0.5µL，ddH2O9.5µL，模板2µL，总体积25µL。PCR反应程序：94℃，4min；94℃，30s；45℃，40s；72℃，1min共10个循环；94℃，30s；55℃，40s；72℃，1min共20个循环；72℃，10min。将PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶，1×TAE电泳缓冲液，100V电压条件下电泳35min，置于凝胶成像系统中观察分析。3.1.4.3测序、同源性分析在紫外照射仪下，用刀片切下含目的DNA的胶块，采用琼脂糖凝胶回收试剂盒胶回收目的片段，并将胶回收目的片段用质粒提取试剂盒提取质粒送至北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司测序。将测序结果在NCBI网站上进行BlASTN比对，检测mt-DNA的基因扩增结果。3.1.4.4实时荧光PCR检测技术28 新疆农业大学硕士学位论文（1）TaqMan探针设计根据样品的测序结果及从GenBank数据库下载已发布与甜菜胞囊线虫同源性较高的其他28SrRNA序列的比对结果，利用DNAMAN8.0及GENEDOC进行序列的比对分析，同时，选取28SrRNA基因的保守区，来设计一对引物HS-28s-F/HS-28s-R与探针HS-28s-Probe。（2）TaqMan探针特异性验证为了验证引物HS-28s-F/HS-28s-R与探针HS-28s-Probe的特异性，将甜菜胞囊线虫DNA、大豆胞囊线虫DNA、小麦禾谷胞囊线虫DNA，进行荧光PCR检测。反应体系20µL：2.5×realMasterMix8µL，上下游引物各1µL，探针0.5µL，20×ProbeEnhancersolution1µL，模板2µL，超纯水8.5µL。反应程序：94℃，2min；94℃，20sec；46℃，20sec；68℃，1min共40个循环。（3）TaqMan探针灵敏度检测用无菌水将甜菜胞囊线虫的DNA进行倍比稀释，共设置7个浓度梯度：100fg/µL、1pg/µL、10pg/µL、100pg/µL、1ng/µL、10ng/µL、100ng/µL，以无菌水作为空白对照，然后进行荧光PCR检测。以稀释的甜菜霜霉病DNA浓度为横坐标，以Ct值为纵坐标绘制其标准回归线。3.2结果与分析3.2.1形态鉴定结果田间采集甜菜胞囊线虫的胞囊寄生在根部，造成甜菜侧根、须根增多，主根的生长受到影响，须根表面有白色雌虫，随后白色雌虫死亡变成褐色胞囊，遗落土壤中（图3-1，A～C）。甜菜胞囊线虫的胞囊多为柠檬形；初为白胞囊，不久变成褐色的失去生命力的胞囊。雌虫有胞囊期，形状、大小与胞囊相似内含有很多卵；卵发育成二龄幼虫，二龄幼虫的体型细长，从头部至尾部逐渐尖锐化，头部半球形、具锥形且细长口针，尾部透明圆锥形，虫体表面具纵向褶皱虫体唇部形态，具4条侧线将虫体侧面区域划分成3个相等的宽度（图3-2，A～J）。29 新疆甜菜上两种检疫性有害生物快速检测及甜菜霜霉病药剂防治技术研究ABCA：甜菜须根部位寄生胞囊（箭头所指）；B：甜菜根部寄生大量胞囊；C：甜菜根部被害状A:Cystsparasitizingafibrousrootofsugarbeet(arrowed);B:Alargenumberofcytsparasitizingtherootofsugarbeet;C:Thesymptomofsugarbeet.图3-1甜菜胞囊线虫及其危害状Figure3-1SugarbeetcystnematodeandthesymptomofsugarbeetCBAA：胞囊及雌虫；B：带卵囊的胞囊C：胞囊虫体；D：二龄幼虫整个虫体E：二龄幼虫虫体前（箭头标注的是线虫的口针）半部位F：二龄幼虫虫体尾部；G：二龄幼虫虫体中间部分H：二龄幼虫面视图；I：二龄幼虫侧线（箭头标注）；J：二龄幼虫虫体中间部位侧线A:Cystsandfemales;B:Cystwithoocyst;C:Cysts;D:Entirebody;E:Anteriorregioninthenematodebodyofsecond-stagejuveniles(thestyletwasarrowed);F:Tailinthenematodebodyofsecond-stagejuveniles;G:Middleregioninthenematodebodyofsecond-stagejuveniles;H:Faceviewofsecond-stagejuveniles;I:Laterallines(arrowed)ofsecond-stagejuveniles;J:Laterallinesinthenematodebodyofsecond-stagejuveniles.图3-2甜菜胞囊线虫Figure3-2Sugarbeetcystnematode3.2.2通用引物D2A/D3B扩增结果30 新疆农业大学硕士学位论文通用引物D2A/D3B扩增甜菜胞囊线虫及对照样品的DNA，经电泳，均出现约800bp左右的条带（图3-3）。M123456750bp500bpM：2000bpDNAladder；1：阳性对照；2-3：甜菜胞囊线虫；4：大豆胞囊线虫；5：小麦禾谷胞囊线虫；6：空白M:2000bpDNAladder;1:Positivecontrol;2-3:Heteroderaschachtii;4:Heteroderaglycines;5:Heteroderaavenae;6:Blank图3-3引物D2A/D3B的扩增结果Figure3-3TheamplifiedresultbyprimerD2A/D3B3.2.3测序及比对测序结果显示:供试材料新源县采集的甜菜胞囊线虫与额敏县采集的甜菜胞囊线虫DNA的扩增的片段完全相同，片段大小为772bp（图3-4），对照样品大豆胞囊线虫DNA、小麦禾谷胞囊线虫DNA的扩增的片段大小与甜菜胞囊线虫的片段大小相差不大均为770bp左右。测序结果逐一在NCBI上进行BlAST比对，比对结果显示：甜菜胞囊线虫与Heteroderaschachtii同源性最高达99%且得分最高。将甜菜胞囊线虫测序得到的序列提交GenBank，获得序列号KX017534。GAGGAAAACAGCTACTAGATGGTTCGATTAGTCTTTCGCCCCTATACCCAAGTCAGACGATCGATTTGCACGTCAGAATCGCTTCGGACTTCCACCAGAGTTTCCTCTGGCTTCATCCTGCTCAGGAATAGTTCACCATCTTTCGGGTCTCAGCGCATACGCTCTGTCTCCGCCCCATCGCATGCGATCGAGACGGGACTATGTTGCGCCCCAACACCGCAGTGCCAGGGATCACACATCAGCTCCGTAAGAAGCCTTCACTTTCATTGCGCCTTTGGGTTTTGAACACCCAATGACTTGCGCATACGCTAAACTCCTTGGTCCGTGTTTCAAGACGGGTCGAACAGATAACCGGCTTTTACACCGAGAACGCACAACTGAGAGCCCGAGCTGGACCGAACTGGTTGCTGGTACGTGTCGCACGCGACCGCCACCGACCCCCAGCTCGAGCCAACACGGACCCGAAACCATTGCACAATTCACCCAGAGTAAACAGCACTCCCCCGATCCGGGTACCAGACCCCGAAAGGCTGGCCTCAAGACCGAGCTCACGCAGCTACTCCGAGCATCTCAGCGCACTCCGCCTGCAAATGCCCCATTCGCCACTGAACAGAAGGACAGCCAACCCCAGTCTGGAGGCTAGCAGCCCAACGTACAGCAACAAACGGGTGAATGCAGACCAGATACGCCAGCTCTGTCCGTTTCCACCTCATCGGTTCACGTCCTCTTTAACTCTCTCTTCAAAGTGCTTTGCAACTTTCCCTCCGGGTAC加粗字体为设计的引物与探针Boldwordsweredesignedprimersandprobe图3-4引物D2A/D3B测得甜菜胞囊线虫的序列Figure3-4SequenceofSugarbeetcystnematodeamplifiedbyprimersD2A/D3B3.2.4实时荧光PCR检测技术31 新疆甜菜上两种检疫性有害生物快速检测及甜菜霜霉病药剂防治技术研究3.2.4.1TaqMan引物与探针的设计根据GenBank数据库下载同源性较高的序列以及该研究测序获得的甜菜胞囊线虫及其对照样品（大豆胞囊线虫DNA与小麦禾谷胞囊线虫DNA）的28SrRNA的基因序列，按照原理设计引物HS-28s-F/HS-28s-R及探针HS-28s-Probe（表3-2）。表3-2试验所需引物序列Table3-2Primersequencesofthisstudy引物序列（5’-3’）引用PrimerSequence(5’-3’)ReferenceD2AACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTGDeley(1999)D3BTCGGAAGGAACCAGCTACTADeley(1999)HS-28s-FATTCGCCACTGAACAGAA本项研究/thisstudyHS-28s-probeFAM-CAGCCAACCCCAGTCTGGAGGC-TAMRA本项研究/thisstudyHS-28s-RCTTTAACTCTCTCTCAAAGTGC本项研究/thisstudy3.2.4.2TaqMan探针特异性验证结果利用设计的引物HS-28s-F/HS-28s-R及探针HS-28s-Probe扩增甜菜胞囊线虫DNA、大豆胞囊线虫DNA、小麦禾谷胞囊线虫DNA，扩增结果显示：甜菜胞囊线虫DNA扩增曲线出现的荧光信号呈指数增加，其中A、B、C的Ct值分别是24.8、24.9、25.1，对照样品大豆胞囊线虫DNA、小麦禾谷胞囊线虫DNA未出现荧光信号指数增加（图3-5，A～F）。ABCDEFA-C：甜菜胞囊线虫；D：大豆胞囊线虫；E：小麦禾谷胞囊线虫；F：空白A-C:Heteroderaschachtii;D:Heteroderaglycines;E:Heteroderaavenae;F:Blank.图3-5实时荧光PCR验证TaqMan探针与引物特异性Figure3-5TheSpecificityofprimersHS-28s-F/HS-28s-RandprobeHS-28s-Probebyreal-timePCR3.2.4.3TaqMan探针灵敏度验证结果甜菜胞囊线虫DNA的7个稀释梯度经引物HS-28s-F/HS-28s-R、探针HS-28s-Probe32 新疆农业大学硕士学位论文扩增均出现荧光信号并呈指数增加，空白对照未出现荧光信号增加（图3-6）。甜菜胞囊线虫DNA浓度分别为：100fg/µL、1pg/µL、10pg/µL、100pg/µL、1ng/µL、10ng/µL、100ng/µL，其对应的的Ct值分别为32.942、29.642、26.202、22.779、19.591、15.885、12.434。绘制的标准回归线为：y=-3.416log（x）+19.366（截距=19.366；斜率=-3.416），R2=0.9998（图3-7）。当甜菜霜霉病菌DNA稀释至10fg/µL时Ct值=36.297，本试验中，当扩增C[80]。因此，试验设计的引物对t值>35时，该浓度下的扩增结果不被考虑在内HS-28s-F/HS-28s-R及探针HS-28s-Probe能检测到100fg/µL的甜菜胞囊线虫DNA。ABCDEFGHA-G甜菜胞囊线虫DNA浓度分别为:100ng/µL、10ng/µL、1ng/µL、100pg/µL、10pg/µL、1pg/µL、100fg/µL；H：空白A-GDNAconcentrationsofHeteroderaschachtii:100ng/µL;10ng/µL;1ng/µL;100pg/µL;10pg/µL;1pg/µL;100fg/µLrespectively;H:Blank图3-6TaqMan引物与探针灵敏度检测扩增曲线Figure3-6Theamplificationplotofsensitivityofprimersandprobetestedbyaten-folddilutionseries图3-7不同浓度甜菜胞囊线虫DNA的标准回归线Figure3-7ThestandardregressionlineofdifferentDNAconcentrationsofHeteroderaschachtii33 新疆甜菜上两种检疫性有害生物快速检测及甜菜霜霉病药剂防治技术研究3.3小结与讨论本研究通过形态学鉴定及TaqMan实时荧光PCR检测方法实现了甜菜胞囊线的快速鉴定。对于甜菜胞囊线虫的分子诊断方法国内外报道很少。1997年Allen等人[61]通过PCR-RFLP法检测不同地域收集的甜菜胞囊线虫、大豆胞囊线虫等四种胞囊线虫的ITS区的种内、种间差异性。2001年Subbotin等人[58]利用通用引物及特异性引物进行双重PCR扩增，从甜菜胞囊线虫、大豆胞囊线虫等其他8种不同胞囊线虫中特异性检测出大豆胞囊线虫。2002年Said等人[62]通过RFLP方法用限制性内切酶FokI和MvaI[33]将甜菜胞囊线虫与三叶草胞囊线虫等其他近缘种胞囊线虫区分开，另外利用常规PCR检测方法设计出了能特异性检测甜菜胞囊线虫的特异性引物。2005年Mehrdad等人[59]通过SYBRgreenI嵌合荧光法进行实时荧光PCR定量检测马铃薯胞囊线虫、甜菜胞囊线虫。2008年葛建军等人[94]用RAPD-PCR方法将马铃薯金线虫、马铃薯白线虫及甜菜胞囊线虫区分开。国内关于甜菜胞囊线虫的鉴定方法主要依据形态学鉴定、RFLP-PCR、常规PCR检测方法、SYBRgreenI嵌合荧光方法。本项研究通过对甜菜胞囊线虫的形态分析同时建立了能特异检测甜菜胞囊线虫的TaqMan实时荧光PCR检测方法。本研究设计的引物与探针通过检测甜菜胞囊线虫、大豆胞囊线虫、小麦禾谷胞囊线虫的DNA，结果证明该引物与探针特异性相对较好；将甜菜胞囊线虫DNA稀释，共设置7个浓度梯度，通过该TaqMan探针与引物检测，结果证明其灵敏度较好能检测到100fg/µL的甜菜胞囊线虫DNA。34 新疆农业大学硕士学位论文第4章甜菜霜霉病的田间药效试验霜霉病发生的严重程度与气候条件关系密切，高湿、低温是导致霜霉病发生的重要因素[95-100]。目前，国内对于甜菜霜霉病田间药效试验报道很少，1999年胡白石等人[25]采用叶面喷雾或叶面喷雾与药剂拌种相结合的方法来防治甜菜霜霉病；2014年于生[48]采用3种高效低毒杀菌剂与常规药剂的叶面喷雾方式筛选药剂。本项研究通过叶面喷雾、药剂拌种、种子熏蒸三种不同的处理方法进行试验，其中每一类处理选用三种药剂，每种药剂设置3种不同剂量，以不施药的甜菜为对照，从而筛选出各处理最佳的处理方式、药剂及其用量。4.1材料与方法4.1.1试验材料供试甜菜品种选用新疆当地主栽品种KWS2409，试验药剂：50%烯酰吗啉可湿性粉剂（巴斯夫中国有限公司），250g/L嘧菌酯悬浮剂（先正达中国投资有限公司），66.8%霉多克可湿性粉剂（拜尔作物科学中国有限公司），95%敌克松可湿性粉剂（江苏奥诺精细化工有限公司），35%精甲霜灵（先正达中国投资有限公司），50%福美双可湿性粉剂（石家庄市绿丰化工有限公司），99.5%溴甲烷（连云港死海溴化物有限公司），56%磷化铝（山东济宁弘发化工有限公司），99%硫酰氟（山东省龙口市化工厂）。使用背负式喷雾器（碧丰牌）进行喷雾。4.1.2试验设计试验地点设在新疆伊犁州尼勒克县农业技术示范园，试验田面积约7337m2，前茬为玉米，共设30个小区（27个处理、3个对照），每个小区面积为250m2（表4-1）。供试甜菜于2015年5月1日播种，行距50cm，株距20～22cm，施底肥量40kg/667m2，土壤为粟钙土，地势平坦，井水灌溉。试验共设置三种处理方式：叶面喷雾、药剂拌种、种子熏蒸。每个处理方式设10个处理，每个处理设2个重复（12行），其中对照组不设置重复，三处理方式共设30个处理（表4-1）。35 新疆甜菜上两种检疫性有害生物快速检测及甜菜霜霉病药剂防治技术研究表4-1甜菜霜霉病田间药剂防治试验小区分布Table4-1Theareadistributionoffieldchemicalcontroltestofsugarbeetdownymildew烯烯烯霉霉霉嘧嘧嘧福福福甲甲甲敌敌敌硫硫硫磷磷磷溴溴溴酰酰酰多多多菌菌菌美美美霜霜霜克克克酰酰酰化化化甲甲甲吗吗吗克克克酯酯酯双双双灵灵灵松松松氟氟氟铝铝铝烷烷烷CKCK啉啉啉CKⅢⅡⅠ3行3行ⅢⅡⅠⅢⅡⅠⅢⅡⅠⅢⅡⅠⅢⅡⅠⅢⅡⅠⅢⅡⅠⅢⅡⅠⅢⅡⅠ3行25025025025025025025025025025025025025025025025025025025025025025025025025025025(m2)(m2)(m2)(m2)(m2)(m2)(m2)(m2)(m2)(m2)(m2)(m2)(m2)(m2)(m2)(m2)(m2)(m2)(m2)(m2)(m2)(m2)(m2)(m2)(m2)(m2)(m2)重重重重重重重重重重重重重重重重重重重重重重重重重重重地地复复复复复复复复复复复复复复复复复复复复复复复复复复复尾头111111111111111111111111111重重重重重重重重重重重重重重重重重重重重重重重重重重重复复复复复复复复复复复复复复复复复复复复复复复复复复复222222222222222222222222222注：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ所代表的浓度由高到低Note:TheconcentrationsofI,IIandIIIisfromhightolow36 新疆农业大学硕士学位论文4.1.3试验方法4.1.3.1叶面喷雾处理该处理方式选用三种药剂，每种药剂设置3种不同剂量：250g/L嘧菌酯悬浮剂稀释倍数为：1000倍液、1500倍液、2000倍液；66.8%霉多克可湿性粉剂稀释倍数分别为：500倍液、1000倍液、1500倍液；50%烯酰吗啉可湿性粉剂用量为：20g/667m2、30g/667m2、40g/667m2；以不施药的甜菜为对照。试验共设10个处理，每个处理设2个重复（12行）。在甜菜叶片出现霜霉病后，进行叶面喷雾处理，每隔10天喷药一次，共喷雾三次。4.1.3.2药剂拌种处理该处理在甜菜播种前3天进行拌种。该处理方式选用三种药剂，每种药剂设置3个浓度：95%敌克松可湿性粉剂用量为：种子量的0.2%、种子量的0.4%、种子量的0.6%；35%精甲霜灵用量为：种子量的0.2%、种子量的0.4%、种子量的0.6%；50%福美双可湿性粉剂用量为：种子量的0.2%、种子量的0.4%、种子量的0.6%；以未经药剂拌种处理的甜菜为对照。试验共设10个处理，每个处理用150g甜菜种子，每个处理设2个重复（12行）。4.1.3.3药剂熏蒸处理该处理方式选用三种不同药剂，每种药剂共设置3个浓度：99.5%溴甲烷用量分别为：30g/m3、40g/m3、50g/m3；56%磷化铝用量分别为：3g/m3、6g/m3、9g/m3；99%硫酰氟用量分别为：20g/m3、30g/m3、40g/m3；以未经药剂熏蒸处理的甜菜为对照。试验共设10个处理，每个处理150g甜菜种子，每个处理设2个重复（12行）。4.1.4调查及统计方法甜菜播种7d后调查各小区出苗率，及田间有无药害情况出现[101-105]。每次叶片喷雾处理后隔一周调查一次（共调查3次），种子熏蒸处理和药剂拌种处理从病害出现后开始调查，每隔一周调查一次（共调查4次）[106-108]。每小区随机调查5点，每点调查10株，每株调查5片叶子。甜菜霜霉病病情分级标准[48]：37 新疆甜菜上两种检疫性有害生物快速检测及甜菜霜霉病药剂防治技术研究0级：无病斑；1级：叶片病斑的面积占整个叶片面积的5%以下；3级：叶片病斑的面积占整个叶片面积的6%～10%；5级：叶片病斑的面积占整个叶片面积的11%～25%；7级：叶片病斑的面积占整个叶片面积的26%～50%；9级：叶片病斑的面积占整个叶片面积的50%以上。4.1.5防治效果计算方法田间药效试验根据式（4-1）统计其发病率，根据式（4-2）、（4-3）分别计算田间甜菜霜霉病病情指数及防治效果，具体公式如下：病叶数发病率100%（4-1)调查总叶数（各级病叶数相对级数值）病情指数100(4-2)调查总叶数9对照病情指数-处理病情指数(4-3)防治效果%100对照病情指数采用Excel软件统计田间调查数据，用SPSSStatistics17.0软件TukeyHSD检验法分析试验统计的数据并进行方差分析，然后利用GraphPadPrism5.0软件对调查的数据进行作图。4.2结果与分析4.2.1叶面喷雾处理根据表4-2结果可以看出，3种药剂均对甜菜霜霉病有较好的防治效果。250g/L嘧菌酯悬浮剂稀释倍数为1000倍液、1500倍液、2000倍液时，第一次施药后7d调查的防治效果分别是90.21%、84.34%、80.42%；第二次施药后7d调查的防治效果分别是89.81%、86.11%、77.78%；第三次施药后7d调查的防治效果分别是90.21%、86.94%、79.59%。66.8%霉多克可湿性粉剂稀释倍数为500倍液、1000倍液、1500倍液时，第一次施药后7d调查的防治效果分别是78.46%、70.63%、62.80%；第二次施药后7d调查38 新疆农业大学硕士学位论文表4-2叶面喷雾对甜菜霜霉病的防治效果Table4-2Controleffectoffoliarsprayagainstsugarbeetdownymildew第一次施药后7d第二次施药后7d第三次施药后7d三次调查防效平均值SevendaysafterthefirstSevendaysafterthesecondSevendaysafterthethirdAverageofinvestigations药剂类型浓度investigationinvestigationinvestigationChemicaltypesConcentration病情指数%防效%病情指数%防效%病情指数%防效%防效%TukeyHSDDiseaseindexControleffectDiseaseindexControleffectDiseaseindexControleffectControleffect1000倍液0.2290.21abAB0.4989.81abAB1.0790.21aA90.08abA250g/L嘧菌酯1500倍液0.3684.34abAB0.6786.11bB1.4286.94bA85.80abAB悬浮剂2000倍液0.4480.42bB1.0777.78cC2.2279.59cdB79.26bcB500倍液0.4978.46bB0.9380.56cC2.0081.63cdB80.22bB66.8%霉多克1000倍液0.6770.63cD1.2075.00cC2.8074.29eC73.31cBC可湿性粉剂1500倍液0.8462.80dD1.6066.67dD3.3868.98fD66.15dC20g/亩0.5376.51bB1.0777.78cC2.2779.19dB77.82bcB50%烯酰吗啉30g/亩0.3186.29bB0.7684.26bBC1.9182.45cB84.33bAB可湿性粉剂40g/亩0.1394.13aA0.3692.59aA1.1189.8abA92.17aA空白对照—2.27—4.80—10.89———（CK）注：同列数据后不同小写字母和大写字母分别表示经TukeyHSD检验法在P<0.05和P<0.01水平差异显著Note:Differentlowercasesanduppercasesindicatesignificantdifferenceat0.05and0.01levelsrespectivelybyTukeyHSDtest39 新疆甜菜上两种检疫性有害生物快速检测及甜菜霜霉病药剂防治技术研究的防治效果分别是80.56%、75.00%、66.67%；第三次施药后7d调查的防治效果分别是81.63%、74.29%、68.98%。50%烯酰吗啉可湿性粉剂用量分别为20g/667m2、30g/667m2、40g/667m2时，第一次施药后调查的防治效果分别是76.51%、86.29%、94.13%；第二次施药后调查的防治效果分别是77.78%、84.26%、92.59%；第三次施药后7d调查的防治效果分别是79.19%、82.45%、89.80%。根据表4-2结果可以看出，250g/L嘧菌酯悬浮剂稀释倍数为1000倍液、1500倍液、2000倍液时，其平均防治效果分别是90.08%、85.80%、79.26%；66.8%霉多克可湿性粉剂稀释倍数为500倍液、1000倍液、1500倍液时，其平均防治效果分别是80.22%、73.31%、66.15%；50%烯酰吗啉可湿性粉剂用量分别为20g/667m2、30g/667m2、40g/667m2时，其平均防治效果分别是77.82%、84.33%、92.17%。方差分析结果表明：各处理间的差异显著，其中50%烯酰吗啉可湿性粉剂用量为40g/667m2时，平均防治效果为92.17%，防治效果最好，与250g/L嘧菌酯悬浮剂稀释倍数为1000倍液、1500倍液时的平均防治效果无显著差异，与50%烯酰吗啉可湿性粉剂用量为30g/667m2时的平均防治效果差异显著，与50%烯酰吗啉可湿性粉剂用量为30g/667m2防治以及66.8%霉多克可湿性粉剂稀释倍数分别为500倍液、1000倍液、1500倍液时的平均防治效果差异极显著（表4-2）。因此，综合表4-2的分析结果，50%烯酰吗啉可湿性粉剂用量为40g/667m2时防治效果最好。图4-1叶面喷雾处理的防治效果Figure4-1Controleffectoffoliarsprayagainstsugarbeetdownymildew40 新疆农业大学硕士学位论文结果显示：防治效果随着药剂用量的增加而增加。50%烯酰吗啉可湿性粉剂用量为40g/亩时，平均防治效果92.17%，防治效果最好；250g/L嘧菌酯悬浮剂稀释倍数为1000倍液时，平均防治效果为90.08%，上述二者对甜菜霜霉病平均防治效果高达90%以上，因此，田间防治甜菜霜霉病可以优先考虑。250g/L嘧菌酯悬浮剂稀释倍数为1500倍液，50%烯酰吗啉可湿性粉剂用量为30g/亩，66.8%霉多克可湿性粉剂稀释倍数为500倍液，上述三种药剂对甜菜霜霉病平均防治效果都在80%以上，在田间可以交替使用，以避免病原菌产生抗药性。66.8%霉多克可湿性粉剂稀释倍数为1500倍液时，平均防治效果为66.15%，防治效果最差（图4-1）。4.2.2药剂拌种处理根据结果可以看出，病害发生后95%敌克松可湿性粉剂用量分别为0.20%、0.40%、0.60%时，第一次调查的防治效果分别是39.49%、41.58%、54.09%；第二次调查的防治效果分别是44.15%、48.81%、54.62%；第三次调查的防治效果分别是42.27%、47.94%、52.58%；第四次调查的防治效果分别是43.7%、50.69%、54.19%。50%福美双可湿性粉剂用量分别为0.20%、0.40%、0.60%时，第一次调查的防治效果分别是52.01%、56.18%、62.44%；第二次调查的防治效果分别是55.79%、56.95%、60.44%；第三次调查的防治效果分别是54.12%、56.7%、60.31%；第四次调查的防治效果分别是51.04%、54.54%、58.39%。35%精甲霜灵乳剂用量分别为0.20%、0.40%、0.60%时，第一次调查的防治效果分别是60.35%、62.44%、70.79%；第二次调查的防治效果分别是54.62%、62.77%、66.26%；第三次调查的防治效果分别是58.76%、59.28%、65.98%；第四次调查的防治效果分别是59.44%、59.09%、65.73%（表4-3）。根据结果看出，95%调查的敌克松可湿性粉剂用量分别为0.20%、0.40%、0.60%时，平均防治效果分别是42.40%、47.26%、53.87%；调查的50%福美双可湿性粉剂用量分别为0.20%、0.40%、0.60%时，平均防治效果分别是51.04%、54.54%、58.39%；调查的35%精甲霜灵乳剂用量分别为0.20%、0.40%、0.60%时，平均防治效果分别是58.29%、60.90%、67.19%（表4-3）。方差分析结果表明：3种药剂按不同比例进行拌种对甜菜霜霉病的防治效果存在着差异。35%精甲霜灵乳剂用量为0.60%时，其平均防治效果为41 新疆甜菜上两种检疫性有害生物快速检测及甜菜霜霉病药剂防治技术研究表4-3药剂拌种对甜菜霜霉病的防治效果Table4-3Controleffectofseeddressingsagainstsugarbeetdownymildew第一次调查第二次调查第三次调查第四次调查四次调查防效平均值ThefirstinvestigationThesecondinvestigationThethirdinvestigationTheforthinvestigationAverageofinvestigations药剂类型用量ChemicaltypesConsumption病情指数%防效%病情指数%防效%病情指数%防效%病情指数%防效%防效%TukeyHSDDiseaseindexControleffectDiseaseindexControleffectDiseaseindexControleffectDiseaseindexControleffectControleffect0.20%1.2939.49eE2.1344.15eE4.9842.27eE7.1643.70dC42.40cB95%敌克松可0.40%1.2441.58eE1.9648.81dD4.4947.94dD6.2750.69cBC47.26bcB湿性粉剂0.60%0.9854.09cdCD1.7354.62cC4.0952.58cCD5.8254.19bcB53.87bB0.20%1.0252.01dD1.6955.79cC3.9654.12cC6.2251.04cBC53.24bB50%福美双可0.40%0.9356.18cC1.6456.95cBC3.7356.7bBC5.7854.54bcB56.09bAB湿性粉剂0.60%0.8062.44bB1.5160.44bB3.4260.31bB5.2958.39bAB60.40abAB0.20%0.8460.35bB1.7354.62cC3.5658.76bBC5.1659.44abAB58.29abAB35%精甲霜灵0.40%0.8062.44bB1.4262.77bAB3.5159.28bBC5.2059.09bAB60.90abAB乳剂0.60%0.6270.79aA1.2966.26aA2.9365.98aA4.3665.73aA67.19aA空白对照—2.13—3.82—8.62—12.71——（CK）注：同列数据后不同小写字母和大写字母分别表示经TukeyHSD检验法在P<0.05和P<0.01水平差异显著Note:Differentlowercasesanduppercasesindicatesignificantdifferenceat0.05and0.01levelsrespectivelybyTukeyHSDtest42 新疆农业大学硕士学位论文67.19%，防治效果最好，与35%精甲霜灵乳剂用量分别为0.20%、0.40%以及50%福美双可湿性粉剂用量为0.60%时的防治效果无显著差异，与50%福美双可湿性粉剂用量分别为0.20%、0.40%以及敌克松可湿性粉剂用量分别为0.20%、0.40%、0.60%时的防治效果差异极显著（表4-3）。因此，综合表4-3的分析结果，35%精甲霜灵乳剂用量为0.60%时，其防治效果最好。图4-2药剂拌种处理的防治效果Figure4-2Controleffectofseeddressingagainstsugarbeetdownymildew结果显示：防治效果随着药剂用量的增加而增加。在3种药剂按3种不同比例拌种（0.2%用量、0.4%用量、0.6%用量）中以按种子量0.6%比例拌种的防治效果最好，其中35%精甲霜灵乳剂用量为0.60%时，平均防治效果是67.19%，居第一位；35%精甲霜灵乳剂用量为0.40%是，平均防治效果是60.90%，居第二位；50%福美双可湿性粉剂用量为0.6%时，平均防治效果是60.40%，居第三位。其他浓度及药剂的防治效果均在60%以下。相对于50%福美双可湿性粉剂（0.2%用量、0.4%用量）和95%敌克松可湿性粉剂（0.2%用量、0.4%用量、0.6%用量）的防治效果，35%精甲霜灵乳剂用量为0.60%时，平均防治效果最好。其中95%敌克松可湿性粉剂0.20%用量的平均防治效果为42.40%，其防治效果最差（图4-2）。4.2.3种子熏蒸处理根据结果可以看出，98.5%溴甲烷用量分别为30g/m3、40g/m3、50g/m3时，第一次的调查的防治效果分别是37.4%、43.66%、47.84%；第二次的调查的防治效果分别是43 新疆甜菜上两种检疫性有害生物快速检测及甜菜霜霉病药剂防治技术研究表4-4种子熏蒸处理对甜菜霜霉病的防治效果Table4-4Controleffectofseedfumigationagainstsugarbeetdownymildew第一次调查第二次调查第三次调查第四次调查四次调查防效平均值ThefirstinvestigationThesecondinvestigationThethirdinvestigationTheforthinvestigationAverageofinvestigations药剂类型用量ChemicaltypesConsumption病情指数%防效%病情指数%防效%病情指数%防效%病情指数%防效%防效%TukeyHSDDiseaseindexControleffectDiseaseindexControleffectDiseaseindexControleffectDiseaseindexControleffectControleffect30g/m31.3337.40cdCD2.8039.73cC5.0744.38cBC7.2944.78bcBC41.57cdCD98.5%溴甲烷40g/m31.2043.66bcBC2.8438.36cC4.6249.26bB7.2045.45bBC44.18cC50g/m31.1147.84bB2.4949.32bcBC4.0955.12abAB6.6249.83abAB50.53bB3g/m31.4731.14dD2.8438.36cC5.6937.55dC7.6042.42cC37.37dD56%磷化铝6g/m31.2939.49cC2.839.73cC5.2941.94cdC7.5642.76cC40.98cdCD9g/m31.2043.66bcBC2.7142.47cC4.7647.8bB6.8448.15bcBC45.52cBC20g/m31.1645.75bcBC2.4450.68bB4.3152.68bAB6.9347.47bB49.15bcBC99%硫酰氟30g/m31.0749.92abAB2.3653.42abAB4.2253.65abAB6.0454.21abAB52.55abAB40g/m30.9356.18aA2.1360.27aA3.8757.56aA5.5657.91aA58.48aA空白对照—2.13—4.09—9.11—13.20——(CK)注：同列数据后不同小写字母和大写字母分别表示经TukeyHSD检验法在P<0.05和P<0.01水平差异显著Note:Differentlowercasesanduppercasesindicatesignificantdifferenceat0.05and0.01levelsrespectivelybyTukeyHSDtest44 新疆农业大学硕士学位论文39.37%、38.36%、49.32%；第三次调查的防治效果分别是44.38%、49.26%、55.12%；第四次调查的防治效果分别是44.78%、45.45%、49.83%。56%磷化铝用量分别为3g/m3、6g/m3、9g/m3时，第一次调查的防治效果分别是31.34%、39.49%、43.66%；第二次调查的防治效果分别是38.36%、39.73%、42.47%；第三次调查的防治效果分别是37.55%、41.94%、47.8%；第四次调查的防治效果分别是42.42%、43.76%、48.15%。99%硫酰氟用量分别为20g/m3、30g/m3、40g/m3时，第一次调查的防治效果分别是45.75%、49.92%、56.18%；第二次调查的防治效果分别是50.68%、53.42%、60.27%；第三次调查的防治效果分别是52.68%、53.65%、57.56%；第四次调查的防治效果分别是47.47%、54.21%、57.91%（表4-4）。根据结果可以看出，98.5%溴甲烷用量分别为30g/m3、40g/m3、50g/m3时，平均防治效果分别是41.47%、44.18%、50.53%；56%磷化铝用量分别为3g/m3、6g/m3、9g/m3时，平均防治效果分别是37.37%、40.98%、45.52%；99%硫酰氟用量分别为20g/m3、30g/m3、40g/m3时，平均防治效果分别是49.15%、52.55%、58.48%（表4-4）。方差分析结果表明：3种药剂按不同比例熏蒸甜菜种子对甜菜霜霉病的防治效果存在差异。99%硫酰氟用量为40g/m3平均防治效果59.48%，防治效果最好，与99%硫酰氟用量为30g/m3平均防治效果无显著差异，与99%硫酰氟用量为20g/m3、56%磷化铝（用量分别为3g/m3、6g/m3、9g/m3）以及98.5%溴甲烷（用量分别为30g/m3、40g/m3、50g/m3）时平均防治效果差异极显著（表4-4）。因此，综合表4-4的分析结果，99%硫酰氟用量为40g/m3时，其防治效果最好。图4-3药剂熏蒸处理的防治效果Figure4-3Controleffectofseedfumigationagainstsugarbeetdownymildew45 新疆甜菜上两种检疫性有害生物快速检测及甜菜霜霉病药剂防治技术研究结果显示：防治效果随药剂用量的增加而增加。98.5%溴甲烷熏蒸处理中（包括：30g/m3、40g/m3、50g/m3），其中用量为50g/m3时的防治效果最好；56%磷化铝熏蒸处理中（包括：3g/m3、6g/m3、9g/m3），其中用量为9g/m3时的防治效果最好；99%硫酰氟熏蒸处理中（包括：20g/m3、30g/m3、40g/m3）其中用量为40g/m3时的防治效果最好。其中99%硫酰氟用量为40g/m3时，平均防治效果58.48%，居第一位；99%硫酰氟用量为30g/m3时，平均防治效果52.55%，居第二位；98.5%溴甲烷用量为50g/m3时，平均防治效果50.53%，居第三位；99%硫酰氟用量为20g/m3时，平均防治效果49.15%，居第四位；56%磷化铝用量为9g/m3、98.5%溴甲烷用量为（30g/m3、40g/m3）、56%磷化铝用量为（3g/m3、6g/m3）时，平均防治效果分别居第五位、六位、七位、八位、九位。其中99%硫酰氟40g/m3时，防治效果最好，56%磷化铝熏蒸处理中用量为3g/m3时，防治效果最差（图4-3）。4.2.4安全性调查经田间调查统计，田间各处理的出苗率均在90%以上。三次叶面喷雾处理后田间甜菜未发现叶片的矮化、腿绿等不良现象。药剂拌种及熏蒸处理区个别甜菜叶片出现了腿绿的现象。试验说明三种处理方法对甜菜是安全的。4.3小结与讨论通过田间试验调查，结果表明：叶面喷雾处理中，50%烯酰吗啉可湿性粉剂用量为40g/667m2的防治效果最好，66.8%霉多克可湿性粉剂稀释倍数为1500倍液时的防治效果最差；药剂拌种处理中，35%精甲霜灵乳剂用量为0.60%时的防治效果最好，95%敌克松可湿性粉剂用量为0.20%时的防治效果最差；种子熏蒸处理中；99%硫酰氟用量为40g/m3时的防治效果最好，56%磷化铝用量为3g/m3时的防治效果最差。本研究叶面喷雾处理的防治效果较好，药剂拌种处理与种子熏蒸处理防治效果不理想，不建议应用到田间防治甜菜霜霉病，其中最佳药剂50%烯酰吗啉可湿性粉剂用量为40g/667m2。国内对于甜菜霜霉病的田间药效试验研究较少，仅1994年邓集汉与2014年于生进行了相关研究。其他霜霉病的田间药效试验相关报道：2008年刘亚敏等人[109]经试验发46 新疆农业大学硕士学位论文现72%锰锌·霜脲WP对黄瓜霜霉病效果较好；2013年杜军辉等[110]经试验发现烯酰吗啉·甲霜灵30%水分散粒剂600倍液，烯酰吗啉40%悬浮剂600倍液等5种药剂对葡萄霜霉病具有良好的防治效果；2013年胡盼等人[111]发现80%代森锰锌较80%波尔多液、75%百菌清等药剂对葡萄霜霉病具有更好的防治效果。2015年欧阳佰柱[112]经试验发现69%代森锰锌·烯酰吗啉WP用量为1035～1380g/hm2对黄瓜霜霉病防治效果较好。2014年张颂函[113]经研究得出霜霉威、百菌清、烯酰吗啉对菠菜霜霉病的防治效果较好，其中烯酰吗啉的防治效果最好。2011年杨丽娟[114]对10种杀菌剂抑制白菜霜霉病菌的效果进行筛选发现69%烯酰吗啉锰锌WP的防治效果最好。试验设置在新疆伊犁州尼勒克县农业技术示范园，一是由于该示范园内无其他甜菜种植且灌溉便利、便于田间管理；二是由于该示范园面积较大并且示范园附近无甜菜种植区，防止试验田甜菜霜霉病的发生影响而其他种植区甜菜的产量。本研究在试验田中，采用叶面喷雾、药剂拌种、种子熏蒸三种不同的处理方法筛选出1～2种防治甜菜霜霉病的高效低毒杀菌剂，以期建立防治甜菜霜霉病的有效措施。经田间防效试验确定叶面喷雾处理方式较药剂拌种和种子熏蒸处理方式的防治效果好，50%烯酰吗啉可湿性粉剂40g/667m2较其他药剂的防治效果好。调查初期并未发现甜菜霜霉病的发生，甜菜长势较好。6月底试验田里甜菜叶片正面出现褪绿黄斑，为了验证该病斑是否为甜菜霜霉病，试验田采集部分褪绿斑甜菜叶片保湿处理送至中国检验检疫科学研究院进行检测，结果显示该病斑为甜菜霜霉病。7月份开始尼勒克县降雨量增多，试验田内甜菜叶片褪绿斑增多，后期叶片背面出现灰白色霉层。7月底开始试验田内甜菜叶片出现褐斑病、蛇眼病等病害以及红蜘蛛、蓟马等虫害，对田间数据的调查造成一定影响。整个试验过程中，甜菜霜霉病情较轻，并未出现大面积的发生。试验过程中，调查了其他甜菜种植区的甜菜病害情况，大部分甜菜种植区管理较好没有病虫害发生，少数甜菜种植区有病害发生，发生的病害以褐斑病为主，霜霉病零星发生。47 新疆甜菜上两种检疫性有害生物快速检测及甜菜霜霉病药剂防治技术研究第5章结论本研究对甜菜上两种检疫性有害生物（甜菜霜霉病、甜菜胞囊线虫）的检测及防治研究，获得以下结果：1建立了巢式PCR检测甜菜霜霉病菌的方法采用卵菌纲通用引物P-cox2F/P-cox2R扩增甜菜霜霉病菌mt-DNAcox2基因序列，经克隆和测序后，设计出特异性引物BSP-F/BSP-R，采用该对引物所建立的巢式PCR检测方法，能特异性地检测到10pg/µL的甜菜霜霉病菌DNA。2建立了实时荧光PCR检测甜菜霜霉病菌的方法采用卵菌纲通用引物P-cox2F/P-cox2R扩增甜菜霜霉病菌mt-DNAcox2基因序列，经克隆和测序后，设计出TaqManMGB探针BETEV-probe与引物BETEV-F/BETEV-R，该探针与引物经验证其特异性较好能检测10fg/µL的甜菜霜霉病菌，同时该探针/引物的浓度为800nM/400nM时扩增效果最佳。3建立了实时荧光PCR检测甜菜胞囊线虫的方法用通用引物D2A/D3B扩增甜菜胞囊线虫的部分28SrRNA基因序列，设计TaqMan探针HS-28s-Probe与引物HS-28s-F/HS-28s-R，该探针与引物通过检测供试样品其特异性较好，能检测到100fg/µL的甜菜胞囊线虫DNA。4筛选出有效防治甜菜霜霉病的处理方式和药剂种类及用量本研究通过采用种子熏蒸处理、药剂拌种处理、叶面喷雾处理三种不同的处理方法对甜菜霜霉病进行田间药剂防治试验，其中每一类处理选用三种药剂，每种药剂设置3种不同剂量，以不施药的甜菜为对照，进而筛选出各处理最合适的药剂浓度及最佳的处理方式。本项研究中筛选出最佳的处理方式为叶面喷雾，最佳的药剂及用量为50%烯酰吗啉可湿性粉剂用量40g/667m2，防治效果达92.17%；而66.8%霉多克可湿性粉剂1500倍液的防治效果最差，仅为66.15%。药剂拌种处理中35%精甲霜灵乳剂用量为0.60%48 新疆农业大学硕士学位论文防治效果最好，为67.19%；95%敌克松可湿性粉剂用量为0.20%防治效果42.4%，其防治效果最差。种子熏蒸处理中99%硫酰氟用量为40g/m3防治效果为58.48%，防治效果最好，而56%磷化铝用量为3g/m3防治效果为37.37%，防治效果最差。49 新疆甜菜上两种检疫性有害生物快速检测及甜菜霜霉病药剂防治技术研究参考文献[1]张翼飞,张晓旭,刘洋,等.中国甜菜产业发展趋势[J].黑龙江农业科学,2013,5(8):156-160.[2]白全江,齐风鸣,闫新元,等.内蒙古西部地区甜菜主要病虫害种类调查[J].内蒙古农业科技,1998(5):20-23.[3]乔志文.我国甜菜病虫草害种类分布及化学防治历程[J].中国糖料,2003,8(4):41-45.[4]Byford,WJ.HostspecializationofPeronosporafarinosaonBeta,SpinaciaandChenopodium[J].TransactionsoftheBritishMycologicalsociety,1967,50(4):603-607.[5]严进.甜菜霜霉病[J].植物检疫,1999,13(2):94-95.[6]郭文超,杨秀荣,谢浩.新疆甜菜霜霉病的初步研究[J].新疆农业科学,1996(3):127-129.[7]杨泽君,吕兴胜.甜菜胞囊线虫的研究进展和鉴定技术[J].植物检疫,2000(5):279-280.[8]HolgerBudahn,HerbertPeterka,MagdiAliAhmedMousaetal.Molecularmappinginoilradish(RaphanussativusL.)andQTLanalysisofresistanceagainstbeetcystnematode(Heteroderaschachtii)[J].TheoreticalandAppliedGenetics,2009,118:775-782.[9]CookeDA.Theeffectofbeetcystnematode,Heteroderaschachtii,ontheyieldofsugar-beetinorganicsoils[J].AnnalsofAppliedBiology,1991,118(4):153-160.[10]EvansK,RoweJA.Distributionandeconomicimportance[M].In:SharmaSB,editor,Thecystnematodes.Dordrecht,TheNetherlands:KluwerAcademicEditors；1998,1-30.[11]FloydR,AbebeE,PapertA,etal.Molecularbarcodesforsoilnematodeidentification[J].MolecularEcology,2002,11(4):839-850.[12]MulhollandV,Cardel,FlemingCC,etal.Useofthepolymerasechainreactiontodiscriminatepotatocystnematodeatthespecieslevel[J].BCPCSymposiumProceedings,1996,65(3):247-252.[13]RasmussenR,MorrisonT,HerrmannM,etal.QuantitativePCRbycontinuousfluorescencemonitoringofadoublestrandDNAspecificbindingdye[J].Biochemica,1998(2):8-11.[14]RirieKM,RasmussenRP,WittwerCT.ProductdifferentiationbyanalysisofDNAmeltingcurvesduringthepolymerasechainreaction[J].AnalyticalBiochemistry,1997,245:154-160.[15]SeinhorstJW.TherelationshipinfieldexperimentsbetweenpopulationdensitiyofGloboderarostochiensisbeforeplantingpotatoesandyieldofpotatotubers[J].Nematologica,1982,28:277-284.[16]张金兰,王仲符,陈品三,等.甜菜胞囊线虫[J].植物检疫,1993(5):346-349.[17]章洁琼,蔡大广,唐桂香.甜菜胞囊线虫抗性基因及遗传工程改良策略[J].中国生物工程杂志,2012,32(10):99-105.[18]SteeleAE.Thehostrangeofthesugarbeetnematode(HeteroderaschachtiiSchmidt)[J].JournalofAmericanSocietyofSugarBeetTechnology,1965,13:573-603.[19]王东,陈立杰,王媛媛,等.胞囊线虫分类研究进展[A].中国植物病理学会.中国植物病理学会2012年学术年会论文集[C].中国植物病理学会,2012.[20]BaldwinJG,Mundo-OcampoM.Heteroderinae,cystandnoncystformingnematodes[M].In:NickelWR(ed).AManualofAgriculturalNematology.:MarcelDekker,1991:275-362.[21]EvansK,RoweJA.Distributionandeconomicimportance[M].In:SharmaSB(ed.).London:TheCystNematodeKluwerAcademicPublishers,1998:1-30.[22]MullerJ.TheeconomicimportanceofHeteroderaschachtiiinEurope[J].Helminthologia,1999,36(3):205-213.[23]宋雅坤,王林,蔡明,等.向日葵霜霉病初报[J].杂粮作物,2002,22(2):124.[24]陈敏,王晓鸣,赵震宇.玉米霜霉病及其检测技术研究进展[J].玉米科学,2006,14(6):141-144.[25]李明远.莴苣霜霉病的发生与防治问答[J].中国蔬菜,2010(9):24-25.[26]秦文韬.葡萄霜霉病菌快速分子检测方法研究[D].北京:中国农业科学院,2013:32-46.[27]MoriY,KandaH,NotomiT.Loop-mediatedisothermalamplication(LAMP):recentprogressinresearchanddevelopment[J].JournalofInfectionandChemotherapy,2013,19(3):404-411.[28]戴婷婷,陆辰晨,沈浩,等.基于环介导等温扩增技术检测橡树疫霉菌[J].南京农业大学学报,2013,36(3):23-28.[29]赵伟,汪涛,戚仁德.利用环介导等温扩增(LAMP)技术快速检测辣椒疫霉菌[J].植物病理学报,2015,45(1):93-96.[30]NilssonM,MalmgrenH,Samiotaki,etal.PadlockProbes:circularizingoligonucleotidesforlocalized50 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新疆挪菜上巧种检疫性有害生物快速检測及就菜霜霉病药荆巧治技术研巧致谢本项研究是在导师张祥林研究员的悉也指导下完成。王年朱，导师渊博的专业知识，。虽，然严谨的工作作风，诲人不倦的生活态度平易近人的人格魅力都深深的感染了我，，仅仅Ｈ年时间，但在这段时间里导师不仅仅教会了我专业知识更教会我做人的态度一让我受益匪浅。本论文从选题到完成，期间几经修改，每个设计都是在导师精也的指导下完成的，倾注了导师无数的汗水和也血，借此机会，我向我的导师张祥林致Ｌ义深深的谢意与诚攀的祝福！感谢新疆出入境检验检疫局技术中也动植检室的领导为我的试验提供了良好的条件，同时感谢王酣老师给予我无微不至的实验指导及照顾；感谢张小菊师姐、李亚伟师让我受益匪浅感谢蒋刚强师兄、王岡巧师、史茜师姐兄在试验上给予的意见及建议，；、、姐在试验仪器使用方面给予的帮助；感谢陈瑞花师姐张燕师姐、刘淑娟师妹巽雪师妹在巧进行甜菜霜霉病室内致病性实验时绝予的帮助。在此感谢各位老师、师兄、师姐、＾，及师妹们给予我的关也与帮助，每当遇到些小麻烦，他们都会毫无怨言地伸出攪手谢谢你们。感谢伊牽州尼勒克县农技推广站王平德老师、刘鹏辉、刘兴阳对我试、朱文革老师。验的支持与帮助，吊间药效试验的顺利完成商不开你们感谢农学院罗、郭、梅、王丽丽、顾爱星等老师对我的关也、帮助和支明庆元李克。持感的同学和朋友，包括刘晓林、张艳南、王龙、潘亚南、盛强、沙那瓦尔、陈谢我君。、冯贝贝、马鹏替、张雅茜、查美琴在Ｓ年的学习生活中苗予的关瓜与帮助谢及亲人，感谢你们感谢你们在我求学道路上给予的关必与支持，我要感我的父母验瓶时给予我的宽慰与包容，感谢你们。感谢你们在我实遇到颈、！最后，感谢所有帮助过我的老师、同学朋友，感谢你们
