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时间：2021-12-15
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1、微生物基因工程李刚副教授教学内容一、PCR引物的设计与实验操作技巧； 二、基因组文库的建立与筛选； 三、定向进化技术在微生物酶制剂研究中的应用； 四、原核表达系统的选择和高效表达策略；五、真核表达系统的选择和高效表达策略。四、原核表达系统的选择和高效表达策略原核生物表达系统主要包括：大肠杆菌表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系统等,其中应用最广泛的是大肠杆菌表达系统。原核表达系统的优点1、细菌培养操作简单、生长繁殖快、价格低廉；2、外源基因表达产物的水平高(如大肠杆菌中目的蛋白的表达量可超过细菌总蛋白量的80%)；3、基因背景和表达特性清楚。大肠杆菌表达系统自20世纪
2、70年代以来,大肠杆菌一直是基因工程中应用最为广泛的表达系统。尤其是进入后基因组时代以来,有关蛋白结构以及功能研究的开展,对基因表达的要求更高,这时大肠杆菌往往是表达的第一选择。大肠杆菌表达系统的优缺点优点：大肠杆菌具有培养条件简单、生长繁殖快、安全性好、可以高效表达不同外源基因产物等特点,是许多外源基因表达系统中最好的一种,是目前研究最深入、发展也最完善的表达系统,大量的有价值的多肽和蛋白质已在大肠杆菌中获得了超量表达。缺点：大肠杆菌表达体系与其他表达体系相比,也具有一些缺点:①高效表达易形成包涵体。②不能进行翻译后的加工修饰,如糖基化、磷酸化及酰基化等。大肠杆菌表达系统的
3、操作流程大肠杆菌表达系统操作的一般程序如下： 获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测。大肠杆菌表达系统的基本概念首先讲述一些大肠杆菌表达的基本概念：一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株，如果是特殊的诱导表达还包括诱导剂，如果是融合表达还包括纯化系统或者Tag检测等等。选择表达系统通常要根据实验目的来考虑，比如表达量高低，目标蛋白的活性，表达产物的纯化方法等等。主要归结在表达载体的选择上。表达载体：我们关心的质粒上的元件包括启动子，多克隆位点，终止密码，融合Tag
4、（如果有的话），复制子，筛选标记/报告基因等。通常，载体很贵，我们可以通过实验室之间交换得到免费的载体。但是要小心，辗转多个实验室和多个实验室成员之手的载体是否保持原来的遗传背景？MCS是否还是原来那个MCS？是我们要特别注意的。大肠杆菌表达系统的基本概念复制子：通常表达载体都会选用高拷贝的复制子。pSC101类质粒是严谨方式复制，拷贝数低，pCoE1，pMBI(pUC)类的复制子的拷贝数高达500以上
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