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R394公开分类号：____________密级：______________ＵＤＣ：____________单位代码：______________11646硕士学位论文论文题目：中国汉族人群2型糖尿病早期筛查的研究学号：_________________________1011075022姓名：_________________________杨海莲生物化学与分子生物学专业名称：_________________________医学院学院：_________________________周细武指导教师：_________________________刘宁生_________________________论文提交日期：2013年06月07日 AThesisSubmittedtoNingboUniversityfortheMaster’sDegreeTheStudyofEarlyScreeningofType2DiabetesinChineseHanPopulationCandidate：YangHailianSupervisors：ProfessorZhouXiwuLiuNingshengFacultyofMedicineNingboUniversityNingbo315211，ZhejiangP.R.CHINAJune7,2013 独创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得宁波大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。签名：___________日期：____________关于论文使用授权的声明本人完全了解宁波大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。（保密的论文在解密后应遵循此规定）签名：___________导师签名：___________日期：____________ 宁波大学硕士学位论文中国汉族人群2型糖尿病早期筛查的研究摘要目的：2型糖尿病（type2diabetes,T2D）是一种极为普遍的流行性疾病，在我国患者人数居世界首位。目前T2D的临床诊断主要通过糖化血红蛋白、空腹血糖和糖耐量的相应指标来评估，但由于T2D早期发病的症状轻微而且这种诊断标准没有涉及发病的本质原因，大部分糖尿病患者不能被尽早的发现和诊断，从而延误了预防和治疗，加重病情。由于T2D是一种多基因遗传疾病，如果能将相关突变基因与个性化分子检测相结合，对人群进行早期的基因筛查，将有可能显著地减少或者延缓糖尿病的发生。本研究根据全基因组的筛查结果将检测11个与T2D患病高度相关的基因，以期建立针对中国人的早期基因筛查模型。方法：1、采用病例-对照的研究方法，所有受试者均来自无血缘关系的宁波地区汉族人群。样本收集自2011年5月到2012年8月，对纳入研究的病例组及正常组进行体格检查和临床生化指标的检测。2、查找全基因组关联研究（genome-wideassociationstudy,GWAS）或候选基因法报道的T2D高风险致病基因，并结合国外已用于T2D筛查的单核苷酸多态(singlenucleotidepolymorohism,SNP)位点，确定研究11个与T2D高度相关的易感基因上的SNP位点。3、采用全血基因组提取试剂盒提取受试者血液中的DNA，根据位点的序列设计引物进行PCR，将PCR产物测序进行基因分型。4、数据分析：对计量资料采用单因素方差分析(ANOVA)进行正态性检验和方差齐性检验，用Hardy-Weinberg平衡原理估测样本的群体代表性，对测序结果应用软件Arlequinprogram(version3.5)、CLUMP22和卡方检验比较病例-对照组间的基因型频率分布、等位基因型频率分布、优势及劣势基因型的差异，并计算出相应的卡方值(Χ2)、比值比(OR)及95%的可信区间（95%CI）。I 中国汉族人群2型糖尿病早期筛查的研究5、通过对中外数据库的检索，收集、整理针对中国人群的基因KCNQ1的SNP位点rs2237892，基因CDKAL1的SNP位点rs7756992和基因CDKN2B的SNP位点rs10811661与T2D相关性的文献资料，6、采用Statasoftware11.0版本进行荟萃关联分析，用Egger’s线性回归检验检测所收集资料是否存在发表偏倚。运用DersimonianandLairdQ检验来计算各研究之间的异质性大小。结果：1、共纳入362名受试者，其中T2D病例组222例（男124例，女98例，平均年龄52.6±20.5岁），正常对照组140例（男61，女79，平均年龄59.4±15.2岁）。纳入研究的对照组及正常组在体质指数（bodymassindex，BMI）、TG、CHOL、HDLC和LDLC方面存在显著差异。2、完成了11个基因SNP位点的测序及基因分型：rs5219，rs1801282，rs7903146，rs4402960，rs7756992，rs13266634，rs1111875，rs4430796，rs2237892，rs10010131，rs10811661。3、通过对病例-对照组的测序结果进行Hardy-Weinberg遗传平衡定律的检验，发现所选样本的11个SNP位点中基因SLC30A8的SNP位点rs13266634和基因TCF7L2的SNP位点rs7903146不具有群体代表性（P<0.001），其余基因的SNP位点均具有群体代表性（P>0.05）。4、通过对病例-对照组的测序结果进行基因型频率的分布趋势比较，发现基因KCNQ1的SNP位点rs2237892，基因CDKAL1的SNP位点rs7756992和基因CDKN2B的SNP位点rs10811661的基因型分布趋势在T2D病例和对照组中有显著性差异（P<0.05），是T2D发病的风险基因;在对年龄、性别及BMI进行校正后，三个位点与T2D的相关性仍然显著。基因KCNJ11的SNP位点rs5219经过年龄、性别、BMI校正后，该位点呈现与T2D的发病相关性（P=0.034）。PPARG的SNP位点rs1801282，IGF2BP2的SNP位点rs4402960，HHEX的SNP位点rs1111875，HNF1β上的SNP位点rs4430796，WFS1的SNPII 宁波大学硕士学位论文位点rs10010131的基因型和等位基因频率分布在T2D病例和对照组中无显著性差异（P>0.05）,与中国汉族人群的T2D发病无关。5、病例-对照组的等位基因频率的比较中显示中国人群中携带rs2237892的C等位基因、rs7756992的G等位基因、rs10811661的T等位基因会使T2D的发病风险增加(rs2237892OR(95%CI):1.45(1-2.08)，rs7756992OR(95%CI):1.6(1.19-2.17)，rs10811661OR(95%CI):1.32(0.98-1.79))。6、在荟萃分析部分，筛选针对中国人群中，基因KCNQ1的SNP位点rs2237892与T2D患病相关的文章共有14篇，包括20562例病例和18565例对照；基因CDKAL1的SNP位点rs7756992与T2D患病相关的文章，共有8篇，包括14512例病例和16280例对照；基因CDKN2B的SNP位点rs10811661与T2D患病相关的文章，共8篇，包括10291例病例和11309例对照。7、对以上文献资料进行发表偏倚评估、异质性检验和统计学分析，发现各位点收集的相关资料发表偏倚小、存在异质性，合并后的总OR值及95%可信区间进一步说明了中国人群中携带rs2237892的C等位基因、rs7756992的G等位基因、rs10811661的T等位基因会使T2D的发病风险增加（rs2237892OR=1.32,95%CI=1.24-1.41,P<0.0001；rs7756992OR=1.23,95%CI=1.19-1.27,P<0.0001；rs10811661OR=1.24,95%CI=1.16-1.33,P<0.0001）。结论：首先，中国宁波地区人群中基因KCNQ1的SNP位点rs2237892，基因CDKAL1的SNP位点rs7756992和基因CDKN2B的SNP位点rs10811661与T2D相关。其次，通过荟萃关联分析证实了中国人群中携带rs2237892的C等位基因、rs7756992的G等位基因、rs10811661的T等位基因会使T2D的发病风险增加。最后SNP位点rs2237892，rs7756992和rs10811661可作为重要的中国人群T2D风险预测生物标记。关键词：2型糖尿病，早期基因筛查，单核苷酸多态性，荟萃分析III 中国汉族人群2型糖尿病早期筛查的研究TheStudyofEarlyScreeningofType2DiabetesinChineseHanPopulationAbstractType2diabetes(T2D)isacommonbutandcomplexdisease.Withaprevalence,itisbothhighandincreasing.Diabeteshasbecomeamajorpublichealthproblemaroundtheworld,includingChina.Atpresenttheglycatedhemoglobin,fastingbloodsugarandsugartolerancecorrespondingindicatorsmainlyclinicaldiagnosisofT2D,werediagnosedbytheglycatedhemoglobin,fastingbloodsugarandsugartolerance,butthisdiagnosticstandardsarenotinvolvedintheessentialreasonofthedisease,somostofthepatientshavenotbeenfoundasatearlyaspossiblestage.GiventheheritabilityofT2D,itisveryimportanttotheidentificationetheofnovelsusceptibilitygeneshasbeenthesubjectofsignificantresearch.TheabilitytoidentifySNPsthatconferriskofcommondiseasesisaninvaluabletoolsfortodevelopingeclinicscreeningmeaningfultestsforscreening,aswellasimprovedpreventionandearlyintervention.Wehaveselected11SNPswereselectedtobeinvestigatedbasedonfrompreviousreports,whichaimtodevelopageneticsusceptibilitymodelforT2DintheChinesepopμlation.Methods1.Atotalof362individuals,including222patientswithT2Dand140controlsubjects,wereincludedinthepresentstudy.AllparticipantswereunrelatedandsampleswerecollectedbetweenMay2011andApril2012fromNingboLihuiliHospital,China.Wetestedtheclinicalfeaturesoftheparticipants,whichincludebodyheight,bodyweight,bloodpressure,fastingbloodglucose(FPG),totalcholesterol(CHOL),highdensitylipoproteincholesterol(HDL),lowdensitylipoproteincholesterol(LDL)andtriglyceride(TG).2.ElevenSNPsidentifiedinrecentGWASorlargecandidategenestudieswereselectedforanalysis.IV 宁波大学硕士学位论文3.GenomicDNAwasisolatedfromspecimensusingaWholeBloodDNAExtractionKitaccordingtothemanufacturer’sinstructions.Toassessgeneticloci,primerpairsweredesignedbasedonthepublishedSNPsequences,usingaPCRMasterMix.thepolymerasechainreactionproductsweresequencedandanalyzed.4.StatisticalAnalysis：QuantitativedatawithnormaldistributionvariableswereanalyzedbyOne-wayANOVAtest.TheHardy-WeinbergEquilibrium(HWE)testwasperformedtoassesstheindividualpolymorphisminthecontrolgroups.Logisticregressionanalysiswasusedtomeasurethecrudeoddsratios(ORs)andadjustedORsbyage,sex,andBMIvariables.Theresμltsincludedtheaddictive,recessiveanddominantmodels.TheORswith95%confidenceintervals(CIs)areshown.5.GeneticassociationstudiesonT2Dandrs2237892intheKCNQ1gene,rs7756992intheCDKAL1geneandrs10811661intheCDKN2Bgeneweresystematicallyreviewed.6.Statasoftware11.0wasusedtoevaluatetheheterogeneitybetweencaseandcontrol,Egger’sregressiontestwasconductedtoidentifypublicationbias,HeterogeneityacrossindividualstudieswascalculatedusingtheDersimonianandLairdQtest.Results：1.Triglycerides,totalcholesterol,highdensitylipoprotein,andbodymassindexweresignificantlyhigheramongcasesthancontrols.P<0.05.2.Aftertheprimerpairsweredesigned,wefinishedgenotypingelevenSNPswhichincluders5219，rs1801282，rs7903146，rs4402960，rs7756992，rs13266634，rs1111875，rs4430796，rs2237892，rs10010131，rs10811661.3.ConsistencyofthegenotypefrequencieswithHardy–Weinbergequilibrium(HWE)wasanalyzedbytheArlequinprogram,rs13266634andrs7903146werenotinHWE（P<0.001）,OthertestedSNPwereinHWE.4.Trendanalysisofgenotypesdistributionbetweencaseandcontrolgrouprevealedrs2237892intheKCNQ1gene,rs7756992intheCDKAL1geneandrs10811661intheCDKN2BgenewereassociatedwithT2D(P<0.05).Afteradjustingtheconfoundersofage,genderandBMI,theaboveresultsremainsignificantandtheassociationbetweenT2Dandrs5219alsodiscovered.NosignificantdifferencesV 中国汉族人群2型糖尿病早期筛查的研究wasfoundbetweenthecaseandcontrolgroupsofrs1801282,rs4402960,rs1111875andrs4430786(P>0.05）.5.TheriskCalleleofrs2237892,riskGalleleof7756992andriskTalleleofrs10811661weresignificantlyassociatedwithT2D（rs2237892OR(95%CI):1.45(1-2.08)，rs7756992OR(95%CI):1.6(1.19-2.17)，rs10811661OR(95%CI):1.32(0.98-1.79)）。6.Thisstudycollectedpapersinclude:14papersabouttheassociationofKCNQ1(rs2237892site)genepolymorphismwithtype2diabetes,included20562casesofT2Dand18565controls;8papersabouttheassociationofCDKAL1(rs7756992site)genepolymorphismwithtype2diabetes,included14512casesofT2Dand16280controls;8papersabouttheassociationofCDKN2B(rs10811661site)genepolymorphismwithtype2diabetes,included10291casesofT2Dand11309controls.7.ThereisnovisualpublicationbiasinthefunnelplotwiththeSNP,Significantheterogeneitywaspresentamongthedatasets,rs2237892Calleleappearedtobeoneofthegeneticriskfactorsforsusceptibilitytotype2diabetes;rs7756992Galleleappearedtobeoneofthegeneticriskfactorsforsusceptibilitytotype2diabetes;rs108116611Talleleappearedtobeoneofthegeneticriskfactorsforsusceptibilitytotype2diabetes.ConclusionsFirst,rs2237892intheKCNQ1gene,rs7756992intheCDKAL1geneandrs10811661intheCDKN2BgenewereassociatedwithT2D.Second,theriskCalleleofrs2237892,riskGalleleof7756992andriskTalleleofrs10811661weresignificantlyassociatedwithT2D,Finally,rs2237892,rs7756992andrs10811661canbeusedaspredictivebiomarkersinChinese.KeyWords：type2diabetesmellitus,earlyscreening,singlenucleotidepolymorphisms,Meta-analysis,VI 宁波大学硕士学位论文目录引言.............................................................................................................................1第一部分11个SNP位点与T2D的相关性研究..........................................................11研究内容和技术路线..................................................................................................31.1研究内容..........................................................................................................31.1.1筛选2型糖尿病患者及正常对照受试者.....................................31.1.2SNP位点的筛选.................................................................................31.1.3基因组DNA的提取与检测.............................................................31.1.4引物设计与测序................................................................................31.1.5统计分析测序结果............................................................................41.2技术路线...........................................................................................................42材料与方法.................................................................................................................42.1材料...................................................................................................................42.1.1主要仪器.............................................................................................42.1.2主要试剂.............................................................................................52.1.3实验样本.............................................................................................62.1.4数据库和分析数据软件...................................................................62.2方法...................................................................................................................62.2.1筛选2型糖尿病患者及正常对照受试者..............................................62.2.2候选基因的确定与基因定位...........................................................62.2.3引物设计与合成................................................................................72.2.4基因组DNA的提取与鉴定.............................................................72.2.5PCR扩增目的片段.............................................................................92.2.6PCR产物电泳检测.............................................................................92.2.7测序....................................................................................................102.2.8测序结果统计学分析......................................................................113结果...........................................................................................................................11VII 中国汉族人群2型糖尿病早期筛查的研究3.1样本收集........................................................................................................113.1.1研究对象............................................................................................113.1.2体格检查及临床生化指标检测.....................................................123.2SNP的确定与定位..........................................................................................123.3引物设计与PCR.............................................................................................153.4测序.................................................................................................................173.5测序结果数据分析..........................................................................................183.5.1病例-对照组的Hardy-Weinberg平衡检验...............................183.5.2病例-对照组基因型比较................................................................183.5.3病例-对照组等位基因的比较.......................................................204讨论.........................................................................................................................21第二部分荟萃关联分析..............................................................................................24引言.............................................................................................................................241研究内容和技术路线.................................................................................................251.1研究内容........................................................................................................251.1.1确定纳入研究的文献..........................................................................251.1.2发表偏倚评估......................................................................................251.1.3荟萃分析.............................................................................................251.2技术路线.........................................................................................................262材料与方法................................................................................................................262.1对象..................................................................................................................262.2文章筛选标准如下：.......................................................................................262.3统计学分析......................................................................................................273结果...........................................................................................................................273.1文章筛选..........................................................................................................273.2发表偏倚的验证...............................................................................................293.2.1rs2237892发表偏倚的验证..................................................................29VIII 宁波大学硕士学位论文3.2.2rs7756992发表偏倚的验证..................................................................303.2.3rs10811661发表偏倚的验证................................................................313.3等位基因的荟萃分析......................................................................................323.3.1rs2237892与T2D.................................................................................323.3.2rs7756992与T2D.................................................................................333.3.3rs1811661与T2D.................................................................................344讨论............................................................................................................................35全文总结.......................................................................................................................36参考文献.......................................................................................................................43附录A缩略词..........................................................................................................43附录B综述..............................................................................................................44在学研究成果...............................................................................................................55致谢.......................................................................................................................56IX 宁波大学硕士学位论文引言T2D是一种极为普遍的流行性疾病，全世界患病率不断地快速增加，目前我国糖尿病在成人中发病率已为9.7％，糖尿病人达到9200多万人，患者人数居世界首位[1]，并且还存在大量的血糖不正常，但还未到糖尿病的糖尿病前期高危人群，其患病率更高达15.5％，因此大约1亿五千万人即将成为糖尿病患者[2]。T2D不仅与环境因素如高糖摄入、缺乏运动等相关，还与遗传因素高度相关，是由多个基因突变影响的遗传性复杂疾病，与SNP位点高度相关。其它突变如：缺失、重复及插入也可能会起一定的作用，但这些突变发生率较低。SNP位点是在人类基因组DNA中某个位点上的单个核苷酸变异，这种变异主要包括单个核苷酸的替代、缺失和插入。它是一种最常见的能稳定遗传的突变[3]，在人类基因组中广泛存在且在不同人群中的分布频率不同，是造成个体的表型、对药物的耐受性和对疾病（如糖尿病、高血压等）的易感性差异的主要原因。因此在遗传性疾病的研究中，利用检测易感个体中的SNP来识别SNP多态性与疾病的相关性将成为研究个体疾病的遗传差异的重要手段[4]。随着研究手段和技术的进步，T2D的遗传学研究大致可分为两个阶段。第一阶段采用微卫星标记和家系连锁分析技术，主要发现了PPARG、KCNJ11和TCF7L2等相关基因[5,6]。2003年人类基因组计划和2005年国际HapMap计划的相继完成，使得T2D的遗传研究进入一个新的阶段：应用GWAS进行相关性研究，该方法采用简便的频率检验从而发现与特定复杂疾病相关联的遗传变异(SNP、基因或DNA区域)[7]。由于GWAS的各种研究设计方法以及遗传统计方法无法从根本上消除人群混杂、多重比较造成的假阳性，因此需要通过重复研究来保证遗传标记与疾病间的真关联。但不同种族之间的人群差异和环境差异，使同一基因的突变在不同人群中表现程度不同，不同研究的结果很少能互相验证和重复。因此有必要将针对同一种疾病的各个GWAS研究集中联合分析，以便提高统计把握度检测出更多的遗传关联，也便于对各个研究结果的一致性和异质性进行考察和评估，这样Meta-分析越来越得到重视和应用。随着GWAS和荟萃分析（meta-analyses）的发展，发现了一批与T2D发病相关的SNP，这些位点所在的基因在胰腺β细胞内，通过作用于β细胞不同生理病理环节来影响β细胞功能。-1- 中国汉族人群2型糖尿病早期筛查的研究T2D是多因素影响下的复杂疾病，早期干预（饮食、运动、药物等）可以减缓甚至逆转病程。美国糖尿病预防研究组（USDP）针对T2D高危人群，分别比较了生活方式干预及二甲双胍类药物治疗对T2D的患病病程的影响，发现在2.8年的跟踪试验中，生活方式的干预可以使患T2D的风险降低58%，二甲双胍的治疗亦使患病风险降低31%[8]。目前T2D的临床诊断主要依据2010年ADA（美国糖尿病协会）糖尿病诊断标准，即通过糖化血红蛋白、空腹血糖和糖耐量的相应指标来评估个体患有T2D的风险性。但由于T2D早期发病的症状轻微而且这种诊断标准并没有涉及发病的本质原因，大部分糖尿病患者并没有被尽早的发现和诊断，从而延误了预防和治疗，加重病情。为此，我们根据全基因组的筛查结果并结合国外已用于T2D筛查的SNP位点，将检测11个与T2D高相关度的基因的SNP[9]。这11个基因分别为KCNJ11、PPARG、TCF7L2、IGF2BP2、CDKAL1、SLC30A8、HHEX、HNF1B、KCNQ1、WFS1、CDKN2B。其中KCNJ11基因多态性的研究比较透彻，功能也基本明确，该基因编码ATP依赖的钾离子通道亚单位—内向整流钾通道蛋白（Kir6.2），在心肌、骨骼肌、平滑肌、神经组织中均有表达，并在胰腺细胞高度表达[10]。PPARG基因属于转录因子的核激素受体超家族，在脂肪细胞的分化，脂肪细胞特异基因的表达和调节胰岛素敏感性方面发挥重要作用[11]。TCF7L2是至今发现的与T2D相关性最高的基因，编码核转录因子7类似物2，参与WNT信号通路，与β-catenin构成二聚体，调节多种基因的转录包括胰岛素基因、肠高血糖素原基因、肠降胰岛素受体相关基因、胰岛素前体降解相关蛋白基因以及对β细胞分裂至关重要的基因等[12]。IGF2BP2是编码胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白2的基因，与RNA定位、稳定性及翻译等功能有关，在胰岛细胞中高度表达，连合胰岛素信号分子IGF2，参与胰腺的发育、生长以及刺激胰岛素分泌[13]。CDKALl编码细胞周期依赖蛋白激酶5的调节亚单位相关蛋白1，在人类胰腺和骨骼肌细胞中高度表达[14]，可参与调解KATP离子通道[15]。SLC30A8编码蛋白锌转运体-8，位于胰岛β细胞中含有胰岛素颗粒的囊泡2 宁波大学硕士学位论文中，该蛋白有可能通过调节胰岛素分泌小泡上的锌积聚，来调节胰岛素的生物合成、活化及贮存[16]。HHEX是干细胞表达的同源基因，其编码的蛋白作为一种转录因子，是胚胎中肝脏和胰腺发育所必需的，该基因突变与新生儿体重降低有关[17]。HNF-1B不仅对丙酮酸激酶等有转录激活作用，而且参与胰腺、肾小管、胆管、卵巢等组织的正常发育[18]。KCNQ1基因编码膜电位控制钾离子通道的α亚单位，由该蛋白构成的IKs与胰岛素的分泌有关[19]。WFS1主要分布于胰腺β细胞内质网上，其突变可能会改变内质网的稳态，继而影响胰岛素的合成及前体的折叠[20]。CDKN2B过表达会导致胰岛发育不良[21]。我们将检测上述基因上的11个SNP位点，以期建立针对中国人的早期基因筛查模型。通过以上研究的数据分析已发现，在检测的11个基因的SNP位点中，基因KCNQ1的SNP位点rs2237892，基因CDKAL1的SNP位点rs7756992和基因CDKN2B的SNP位点rs10811661与中国人群的T2D发病有关。为进一步验证我们的结论，我们对三个基因的SNP位点进行荟萃分析。荟萃分析可以对特定问题的多个相互独立的研究结果进行系统地综合分析。由于独立的研究揭示本身外显率低的基因的能力是有限的，那么通过结合多个不一致的研究结果，使样本含量增大，可以更加客观且科学的评价并发现与T2D有关的易感基因。在进行荟萃分析时应尽可能的将特定问题的相关研究收集完整，并对所收集的研究进行评估，排除低质量的研究结果，然后进行统计学分析合并数据，得出结论。近年来，多篇文章报道了基因KCNQ1的SNP位点rs2237892，基因CDKAL1的SNP位点rs7756992和基因CDKN2B的SNP位点rs10811661与的T2D发病有关。CDKAL1基因定位于染色体6p22.3区域，2007年，有5篇文章相继研究发现了CDKAL1可能为欧洲和亚洲人群T2D的易感基因[22]。2008年，GWAS结果显示该基因的rs7756992与中国人群T2D的发病风险显著相关[23]。KCNQ1基因是首次以亚洲人群为对象发现的与T2D发病存在相关的易感基因，2008年，以韩国人群为研究对象发现-3- 中国汉族人群2型糖尿病早期筛查的研究了该基因的SNP位点rs2237892与T2D发病相关[24]。同年，在德国人群的T2D研究中发现基因CDKN2B的SNP位点rs10811661T等位基因是T2D的发病风险基因。目前已有多篇文章分析了以上三个SNP位点与T2D发病的相关性，但是尚没有专门针对中国人群的这三个SNP位点的荟萃关联分析。因此，本部分工作的主要目的是对已经发表的有关基因KCNQ1的SNP位点rs2237892，基因CDKAL1的SNP位点rs7756992和基因CDKN2B的SNP位点rs10811661与T2D相关的研究数据进行系统性地收集和整理，合并数据，然后进一步的确定这些位点是否与中国人群T2D的发病密切相关，同时，对各独立研究间的异质性进行分析。4 宁波大学硕士学位论文第一部分11个SNP位点与T2D的相关性研究1研究内容和技术路线1.1研究内容1.1.1筛选2型糖尿病患者及正常对照受试者（1）依据2006年公布的WHO糖尿病诊断标准筛选2型糖尿病患者和正常对照组受试者。（2）对受试者进行体格检查及临床生化指标检测。1.1.2SNP位点的筛选（1）选择在中国人群中已经识别与T2D发病有关的易感基因SNP位点。（2）查询国外生物公司已用于糖尿病早期筛查的易感基因SNP位点。1.1.3基因组DNA的提取与检测（1）采用全血基因组提取试剂盒对2型糖尿病患者和正常对照组受试者的血液进行DNA的提取。（2）依据A260/A280的比值估计提取基因组的浓度。1.1.4引物设计与测序（1）采用软件PrimerPremier5.0和Oligo6.0进行易感基因SNP位点的引物设计。（2）使用测序仪对易感基因SNP位点测序并分析基因型。1.1.5统计分析测序结果（1）对计量资料采用单因素方差分析(ANOVA)进行正态性检验和方差齐性检验。（2）对测序结果用Hardy-Weinberg平衡原理估测样本的群体代表性，计算组内基因型频率、等位基因型频率、劣势及优势基因型的差异，计算卡方值、优势比及其可信区间。-5- 中国汉族人群2型糖尿病早期筛查的研究1.2技术路线样本收集筛选易感基因SNP位点体格检查和临床生化检查设计引物2型糖尿病患者血液正常对照组血液基因组DNA的提取进行测序及基因分型统计学分析2材料与方法2.1材料2.1.1主要仪器òPCR仪(GeneAmp®PCRSystem9700美国，ABI公司)ò超低温冰箱（中国，海尔公司）ò低温高速离心机（德国，Eppendorf公司）ò低温平板离心机（德国，Eppendorf公司）òDNA浓度测量仪(Nanodrop-1000，美国，NanoDrop公司)ò凝胶成像系统（厦门，百维信生物科技有限公司）ò电子分析天平（北京，赛多利斯科学仪器有限公司）ò漩涡仪（上海，精科）ò电泳仪（北京，六一仪器厂）ò测序仪（ABIPRISM310，美国应用生物系统公司）ò微波炉（佛山，格兰仕）ò恒温水槽（上海，精宏）ò高速冷冻离心机（德国哈瑙市，Heraeus）6 宁波大学硕士学位论文ò纯水系统（美国马萨诸塞州比尔里卡市，Millipore）ò立式压力蒸汽灭菌器（上海，申安）ò干燥箱（上海，精宏）òBD采血空针(上海碧迪医疗器械有限公司)òBD真空采血管(EDTA抗凝，上海碧迪医疗器械有限公司)ò加样枪(Eppendorf,Gilson)2.1.2主要试剂òDNA提取试剂：北京百泰克DNA全血基因组提取试剂盒（离心柱型）ò琼脂糖（上海，申能博彩）ò溴化乙锭（上海，申能博彩）òDNAMaker（DL2000，美季）ò引物（上海，美季）ò测序仪所用缓冲液（ABI3730xl，美国应用生物系统公司）òPCR试剂：大连，宝生物有限公司TaqDNA聚合酶（5U/μl）dNTP混合物（各2.5mM）2＋10×PCRBuffer(MgPlus)ddH2Oò50×Tris-醋酸（TAE）Tris242g0.5MEDTA（pH8.0）100ml冰醋酸57.1ml加蒸馏水定容,至1L，使用时稀释50倍。òBigDye测序反应试剂盒主要试剂是BigDyeMix，内含PE专利四色荧光标记的ddNTP和普通dNTP，AmpliTaqDNApolymeraseFS，反应缓冲液等。ò70%乙醇和无水乙醇（杭州，长征）ò3mol/L醋酸钠(pH5.2)：称取40.8g醋酸钠溶于70ml蒸馏水中，冰醋酸调pH至5.2，定容至100ml，高压灭菌后分装。ò模板抑制试剂(TSR)（ABI）ò10×电泳缓冲液（ABI）-7- 中国汉族人群2型糖尿病早期筛查的研究2.1.3实验样本采用病例-对照的研究方法，所有受试者均来自无血缘关系的宁波地区汉族人群。T2D病例组来源于宁波市李惠利医院糖尿病专科门诊及住院患者，正常对照组来源于本市健康体检者。2.1.4数据库和分析数据软件ò美国国立医学图书馆：http://www.ncbi.nlm.nih.govhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ò基因序列以及所在位置查询：http://genome.ucsc.edu/index.htmlòSNP的确定及所在位置查询：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/http://demo.decodeme.comhttps://www.23andme.comò引物设计软件：PrimerPremier5.0和Oligo6.0ò数据分析软件：Arlequinprogram(version3.5),CLUMP22,Statasoftwareversion11.0(StataCorporation,CollegeStation,TX),SPSS16.0forwindows2.2方法2.2.1筛选2型糖尿病患者及正常对照受试者(1)纳入标准T2DM组受试者纳入依据是：符合2006年公布的WHO糖尿病诊断标准：空腹血糖浓度≥7.0mmol/L(126mg/dl)或口服75克葡萄糖后2小时静脉血浆（OGGT）血糖≥11.1mmol/L(200mg/dl)。正常对照组的纳入依据是：年龄>25岁；空腹血糖浓度<6.1mmol/L(110mg/dl)且OGGT<6.1mmol/L(110mg/dl)；与T2D患者无亲属关系；无T2D及其他代谢类疾病。(2)体格检查及临床生化指标检测对纳入研究的对照组及正常组进行体格检查（y、kg、m）和临床生化指标(TG、CHOL、LDLC、HDLC）的检测。将所有样本统一编码并使用SPSS16.0forwindows软件建立T2D的遗传数据库。2.2.2候选基因的确定与基因定位（1）目前随着基因组关联研究和Meta-分析的发展，发现了与T2D发病相关的易感基因，进入Pubmed（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）主页，搜索关键字“Type2Diabetes”、“Type2DiabetesMellitus”、8 宁波大学硕士学位论文“T2D”、“T2DM”“Single-nucleotidePolymorphism”、“SNP”、“SNPs”和“association”，进入OMIM主页（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/），搜索关键字“Type2Diabetes”、“Type2DiabetesMellitus”、“T2D”、“T2DM”，对与T2D发病风险相关的阳性基因进行查询，记录基因上所包含的SNP、比值比（OR）和95%的可信区间，保留相关性较高的基因及SNP信息。（2）进入deCODEme公司（http://demo.decodeme.com）和23andMe公司（https://www.23andme.com）网页查询用于早期基因筛查的SNP位点，并与上述记录信息相比较，确立可用于早期筛查的SNP位点。（3）利用UCSC(http://genome.ucsc.edu/index.html)网站查询所研究的易感基因在染色体上的位置和基因序列。（4）进入NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/）的遗传变异数据库查询SNP位点的基本信息，主要包括染色体定位、等位基因变化、风险等位基因及中国人群的风险等位基因的频率。2.2.3引物设计与合成（1）利用引物设计软件PrimerPremier5.0进行引物设计，将目的SNP所在位置的基因序列导入软件，根据片段信息设定引物参数（产物长度、引物长度等），自动搜索，选择无发卡二聚体或错配的一组引物，利用Oligo6.0对引物进行分析评价。选择引物时应注意：由于引物也作为测序引物，因此要求上下游引物序列尽可能地避免相似性较高的序列；应当避免在引物的3’端使用碱基A；引物的长度一般为15-30bp。（2）引物的合成：本课题所有的引物均由上海美季公司合成。2.2.4基因组DNA的提取与鉴定2.2.4.1基因组DNA的提取按百泰克公司说明使用全血基因组DNA快速提取试剂盒提取基因组DNA，具体步骤如下：（1）留取全部受试者外周血5ml放入EDTA·Na2抗凝管，4℃，2000rpm离心10分钟，去血浆后，在白细胞层吸取血液，及时提取DNA或-80℃冻存。（2）吸取300μl新鲜或冻存的白细胞层血液（冻存血需在使用前恢复到室温）加入1.5ml的离心管中，加入900μl人红细胞裂解液，颠倒6-8次确保充分混匀。室温放置10min，在此期间可用涡旋仪震荡混匀。-9- 中国汉族人群2型糖尿病早期筛查的研究（3）12000rpm离心30s，弃红色上清，并小心尽可能多的吸弃上清液，然后再加入人红细胞裂解液，重复混匀、静置及离心，直至管底沉淀为白色白细胞团。（4）加入200μl缓冲液BB涡旋振荡，使白细胞团重悬，充分分散白细胞团。（5）加入20μl蛋白酶K(20mg/ml)溶液，室温放置15min在此期间颠倒混匀几次），加入200μl结合液CB，立刻颠倒混匀，70℃水浴锅中放置10min，溶液应变清亮。（6）加入100μl异丙醇（放置时间久的血需加200μl异丙醇），剧烈颠倒，保证充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。（7）将所得溶液和絮状沉淀加入一个吸附柱中，吸附柱放入收集管中，10000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液。（8）加入500μl抑制物去除液，12000rpm离心30s，弃废液。（9）加入700μl已加入无水乙醇的漂洗液，12000rpm离心30s，弃掉废液。重复该步骤。（10）尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应，13000rpm离心2min。（11）取出吸附柱，放入一个干净的1.5ml离心管中，在吸附膜的中间部位加入100μl灭菌水（65-70℃水浴中预热），室温放置3-5min，12000rpm离心1min。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12,000rpm离心1min。（12）将提取的DNA放置-20℃，为以后实验做准备。2.2.4.2基因组DNA的鉴定（1）紫外定量：取5μlDNA样品以灭菌水稀释至100μl，紫外分光光度计测定260nm和280nm处的吸光度。A260/A280用于估计模板的浓度：若比值在1.6～1.8之间，说明样品中核酸较纯；若比值<1.6，说明样品中蛋白质未去除干净；若比值>1.8，说明有RNA污染。10 宁波大学硕士学位论文（2）电泳鉴定：取2μlDNA于0.5%琼脂糖凝胶进行电泳，80V电压40min，凝胶成像仪照像。若为一清晰带，说明提取的核酸较纯；若有多条杂带，则核酸已降解或有其他核酸污染。2.2.5PCR扩增目的片段以提取的人血液基因组DNA为模板，配制反应液见表2.2：表2.2PCR反应体系Tab.2.2ReactionsystemofPCR试剂体积10×PCRBuffer(Mg2+Plus)5μlTaKaRarTaq(5U/μl)0.5μlForwardPrimer(10μM)1μlReversePrimer(10μM)1μldNTPMixture(各2.5mM)4μlDNA模板2μlddH2O36.5μl总体积50μl将配好的反应液放置于500μl的离心管中，离心数秒，以使溶液聚集在管底，置于PCR仪中，按如下反应条件进行PCR反应：预变性：95℃10min变性：95℃30s退火：见表130s40个循环延伸：72℃45s延伸：72℃10min，所得的PCR产物进行电泳检测。2.2.6PCR产物电泳检测（1）称取0.4g琼脂糖放于锥形瓶中，再量取40ml的1×TAE溶液混合，放于微波炉中煮沸，至溶液清彻透明为止，大约需1分40秒。（2）冷却到60℃时加2μlEB染料，摇匀。（3）组装好制胶器，并调至水平。将胶倒于制胶器中，插好梳子。待40min胶冷却凝固后，就可放于倒好1×TAE电泳缓冲液的电泳槽中进行点样。-11- 中国汉族人群2型糖尿病早期筛查的研究（4）PCR反应结束后，每管吸取反应液5μl至于新的离心管中，加入6×LoadingBuffer混合，离心数秒后进行点样。（5）每排第一个胶孔中点入10μlDL2000Maker，电压100V，时间约30min，电泳结束后在凝胶成像系统下观察并拍照。2.2.7测序PRISM310自动测序仪式基于毛细管电泳和荧光标记技术，4种脱氧核苷酸分别有不同的荧光标记，在通过毛细管时，不同长度的DNA片段上的4中荧光基团被激光激发，发出不同颜色的荧光，被CCD检测系统识别，并直接翻译成DNA序列。2.2.7.1PCR测序反应体系表2.3PCR反应体系Tab.2.3ReactionsystemofPCR试剂体积BigDye(2.5×)4μlBigDyeSeqBuffer(5×)2μl待测DNA的单向引物（3.2μmol/L）1μlDNA模板1μlddH2O12μl总体积20μl盖紧PCR管，用手指弹管混匀，稍离心。测序PCR热循环条件：预变性：96℃1min变性：96℃10s退火：50℃5s25个循环延伸：60℃4min扩增结束后设置4℃保温。12 宁波大学硕士学位论文2.2.7.2醋酸钠/乙醇法纯化PCR产物(1)将扩增产物转移到1.5mlEP管中。(2)加25μl醋酸钠/乙醇混合液，振荡充分，置冰上10min以沉淀DNA。4℃12000r/min离心30min，弃上清。(3)加入70%的乙醇50μl，洗涤沉淀，重复2次。4℃12000r/min离心5min，弃上清，真空干燥沉淀10～15min。2.2.7.3电泳前测序PCR产物的处理。(1)加入12μl的模板抑制试剂于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解DNA沉淀，稍离心。(2)将溶液转移至0.2mlPCR管中，离心数秒。(3)在PCR仪上进行热变性(95℃2min)，冰中骤冷，待上机。2.2.7.4上机操作ABIPRISM310基因分析仪将自动灌胶至毛细管，1.2kV预电泳5min，按编程次序自动进样，再预电泳(1.2kV，20min)，在7.5kV下电泳2h。仪器将自动进行序列分析。2.2.8测序结果统计学分析：对计量资料利用SPSS16.0建立T2D的遗传资料数据库，采用单因素方差分析(one-wayanalysisofvariance，ANOVA)进行正态性检验和方差齐性检_验，计量资料用平均数±标准差（x±s）表示。将所有的测序结果进行基因分型，用Hardy-Weinberg平衡原理估测样本的群体代表性，对测序结果应用软件Arlequinprogram(version3.5)、CLUMP22和卡方检验比较病例-对照组间的基因型频率分布、等位基因型频率分布、优势及劣势基因型的差异，并计算出相应的卡方值(Χ2)、比值比(OR)及95%的可信区间（95%CI）。3结果3.1样本收集3.1.1研究对象本研究采用病例-对照的方法，共纳入362名受试者，所有受试者均来自无血缘关系的宁波地区汉族人群。其中T2D病例组222例（男124例，女98例，平均年龄-13- 中国汉族人群2型糖尿病早期筛查的研究52.6±20.5岁），正常对照组140例（男61，女79，平均年龄59.4±15.2岁）。3.1.2体格检查及临床生化指标检测T2D病例组及正常组的男女比例、年龄（y）、体重（kg）、身高（m）、BMI值和临床生化指标甘油三脂(TG)、总胆固醇（CHOL）、低密度胆固醇（LDLC）、高密度胆固醇（HDLC）的检测结果见表3.1。病例组与正常对照组的身高、低密度胆固醇没有显著性差异（P>0.05），但性别组成、年龄、体重、体质指数、总胆固醇、高密度胆固醇和甘油三脂有明显差异，病例组明显比正常对照组要高（P<0.05）。表3.1样本临床资料统计表Table1ClinicalCharacteristicsoftheParticipantsCASECONTROLForPvalueZMale/Female61/79124/980.023Ageatexamination(years)59.4±15.252.6±20.513.10.0003TG1.0-2.10.8-1.55.9<0.001CHOL4.6±1.24.4±0.94.10.04HDLC(mmol/L)0.9-1.21.0-1.54.3<0.001LDLC(mmol/L)2.0-3.32.0-2.51.20.24Weight（kg）57.0-72.86.01-65.85.1<0.001Height（m）1.6±0.081.6±0.080.670.422BMI(kg/m)24.1±3.521.90±3.136.5<0.0013.2SNP的确定与定位T2D是由胰岛素抵抗及β细胞分泌缺陷引起，受到环境，遗传等多因素的影响，其中遗传因素在T2D的发生发展中起到重要的作用。因此参与胰岛素分泌信号通路以及脂肪、糖代谢信号通路的基因是研究T2D的重要候选基因。目前随着基因组范围关联研究技术和Meta-分析的发展，发现了一批与T2D发病相关的易感基因，通过系统地对PubMed、Embase、OMIM数据库的检索及查阅相关文献，对比分析发现与T2D高度相关的风险基因及SNP信息列入表3.2。14 宁波大学硕士学位论文表3.2T2D高度相关的候选基因及SNPTab3.2CandidategeneandSNPofT2DChRroefDiscoverCandidatmVariantEffecterFullgenenameyProbablemechanismeGeneosinvolvedsizeenmethodocemesLarge-[25TranscriptionscaleWntsignaling1.37(1.31TCF7L210rs7901695,factor7-like2associatipathway–1.43)26]onTCF2Hepatocyte[27rs4430796Candidat1.10(1.07（HNF1Bnuclearfactor1-17Transcriptionfactor,e-1.14)alpha28]）[26FatmassandInvolved1.17Candidat,FTOobesity16rs8050136innucleicacid(1.12–e29-associatedmodification1.22)31]Calciumchannel[20WolframCandidat1.12(1.09WFS14rs10010131involvedinunfolded,syndrome1e–1.15)proteinresponse32]Homeobox,hematopoieticallTranscriptionfactor/1.15[33HHEX/IDrs1111875yexpressed10GWAinsulin-degrading(1.10–,Einsulin-degradingenzym1.19)34]enzymePotassiumPotassiumvoltage-voltage-gatedgatedchannel/1.30[24rs2237892KCNQ1channel,KQT-11GWAhormoneand(1.10–,likesubfamilyelectrolytetransport1.52)35]member1processesInhibitsthe[36Melatoninrs108309631.09(1.05MTNR1B11GWAformationofcGMP,receptor–1.12)andcAMP,37]Potassiuminwardly[10rs5215CandidatSubunitoftheKATP1.14(1.10KCNJ11rectifying11,echannel–1.19)channel,38]subfamilyJ,-15- 中国汉族人群2型糖尿病早期筛查的研究member11CDK5regulatory[15subunitRegulateKATP1.14(1.11CDKAL16rs10946398GWA,associatedchannel–1.17)39]protein1-like1Insulin-likeRNAlocalization,[13growthfactor2rs44029601.14(1.11IGF2BP23GWAstability,and,mRNAbinding–1.18)translation40]protein2Juxtaposedwith[41rs8647451.10(1.07JAZF1anotherzink7GWATranscriptionfactor,–1.13)fingergene142]Solutecarrier[16family30[zincPancreaticisletzinc1.15(1.12,SLC30A88rs13266634GWAtransporter],transporter–1.19)43-member3045]Celldivisioncycle123Cell-divisionhomolog[46CDC123/rs12779790cycle/Calcium-1.11(1.07calcium10GWA,CAMK1Ddependentprotein–1.14)calmodulin-47]kinasedependentproteinkinaseIDTranscriptionfactorPeroxisomeinvolvedin1.14proliferator-Candidat[29PPARG3rs1801282adipocyte(1.08–activatede]differentiationand1.20)receptorgammaglucosehomeostasisGWAEncodesareceptor[291.1.3(1.08NOTCH2Notchhomolog21rs10923931formembranebound,–1.17)ligands48]ThyroidGWA[37Implicatedinthyroid1.15(1.10THADAadenoma2rs7578597,adenomas–1.20)associated49]GWA[49Cell-surface1.09(1.06TSPAN8Tetraspanin812rs7961581-glycoprotein.–1.12)51]ADAMGWAMetalloprotease[45ADAMTS1.09(1.06metallopeptidase3rs4607103expressedinskeletal,9–1.12)withmuscleandpancreas49]16 宁波大学硕士学位论文thrombospondintype1motif,9上述基因涵盖面太广，因此我们综合考虑风险基因与中国人群的相关性以及deCODEme公司、23andMe公司用于早期基因筛查的SNP位点信息，确立本研究用于中国人群早期筛查SNP位点11个，查阅UCSC、NCBI相关网站确定这些SNP的染色体定位、等位基因变化、风险等位基因等信息，列入表3.3。表3.3研究中选择的T2D易感基因及SNP位点Tab3.2ListofT2DsusceptiablegenesandSNPsselectedforthisstudyGeneSNPAlternativeRiskBandPositionAlleleAlleleKCNJ11rs5219C,TT11p15.117409572WFS1rs10010131A,GG4p16.16292915HHEXrs1111875A,GG10q23.3394462882PPARGrs1801282C,GC3p25.212393125KCNQ1rs2237892C,TC11p15.42839751IGF2BP2rs4402960T,CT3q27.2185511687CDKAL1rs7756992G,AG6p22.320679709SLC30A8rs13266634T,CT8q24.11118184783HNF1Brs4430796A,GA17q1236098040CDKN2Brs10811661T,CT9p21.322134094TCF7L2rs7903146C,TC10q25.21147583493.3引物设计与PCR根据我们所研究的SNP位点所在基因的序列，设计各SNP位点的引物。为验证引物是否可用并且摸索各组引物最适退火温度，我们以提取的人血液全基因组DNA为模板，分别以上述引物在不同的退火条件下进行PCR反应，将反应产物电泳，观察条带，从而确定退火温度（表3.4，图2.1）。-17- 中国汉族人群2型糖尿病早期筛查的研究表3.4PCR引物序列Tab3.4PrimersequenceforPCRSNPandPrimerAnnealingSizetemp(bp)rs5219F:TGTAAAACGACGGCCAGTAAGGAAGGCAGACGAGAA60℃542R:CAGGAAACAGCTATGACCAGGTGGAGGTAAGGAAGAGrs7903146F:TGTAAAACGACGGCCAGTCGTGAGCCACCGAGTTTAG60℃546R:CAGGAAACAGCTATGACCGAGATGAAATGTAGCAGTGAAGTGrs10811661F:TGTAAAACGACGGCCAGTAAAGGAGCCATTCTATCGTGA52℃611R:CAGGAAACAGCTATGACCGCCACCACGCCCAACTArs4402960F:TGTAAAACGACGGCCAGTCTAAAGCACTGAGAGAAACA65℃438R:CAGGAAACAGCTATGACCAGCCTTGGCAATGTAGTGAGArs13266634F:TGTAAAACGACGGCCAGTACAGAAAGAGTTCCCATAGCG65℃427R:CAGGAAACAGCTATGACCATAGCAGCATGTTTGAAGGTGrs1111875F:TGTAAAACGACGGCCAGTGCCTCAGGCAAATGGTACTTAG65℃448R:CAGGAAACAGCTATGACCTTTGGGATGGGCTGTGArs7756992F:TGTAAAACGACGGCCAGTCTCAAGCAACCCTCCTCC60℃711R:CAGGAAACAGCTATGACCCCAAGACACATCCTAATAAACCCrs2237892F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCCAACTATTCCCAAACTCTATC60℃728R:CAGGAAACAGCTATGACCGTGCTAAGGACCCAACAGGrs1801282F:TGTAAAACGACGGCCAGTAGCCAATTCAAGCCCAGTC60℃369R:CAGGAAACAGCTATGACCAAACAAACACAACCTGGAAGACrs10010131F:TGTAAAACGACGGCCAGTCTTGAGTGAGCCAGAACA60℃688R:CAGGAAACAGCTATGACCCGGTCTCTACAGGAAGGTrs4430796F:GTCCCTTCCTCAGCATCTTG60℃344R:GCAACATGAGAGCTGTTTGC18 宁波大学硕士学位论文图2.1SNPs电泳图Fig.2.1SNPselectropherogramM:DL2000MakerSNP:1-11rs2237892,rs7756992,rs10010131,rs4430796,rs10811661，rs7903146,rs1111875,rs4402960,rs13266634,rs1801282,rs52193.4测序为进一步的测定引物是否构建成功，我们将PCR反应的产物进行了预测序，然后扩大测序范围，完成了362名（T2D病例组222例，正常对照组140例）样本的11个SNP位点的测序及基因分型。以rs7903146的测序和基因分型为例（图2.2）。图2.2rs7903146的测序和基因分型Tab2.2sequenceandgenotypeofrs7903146-19- 中国汉族人群2型糖尿病早期筛查的研究3.5测序结果数据分析3.5.1病例-对照组的Hardy-Weinberg平衡检验为评估群体调查资料的可靠性，验证所选样本的群体代表性，对测序后的基因型结果进行Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验（表3.5）。在表中我们可以看出所选样本的11个SNP位点中基因SLC30A8的SNP位点rs13266634和基因TCF7L2的SNP位点rs7903146不具有群体代表性（P<0.001），其余基因的SNP位点均具有群体代表性（P>0.05），提示本研究的样本来自可随机婚配的稳定大群体，可以代表群体的基因分布情况。表3.5Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验Tab3.5TestforHWEGeneAlternativeHWE*(PSNPRiskalleleAllelevalue)rs5219KCNJ11C,TT0.2rs10010131WFS1A,GG0.06rs1111875HHEXA,GG0.8rs1801282PPARGC,GC0.7rs2237892KCNQ1C,TC0.5rs4402960IGF2BP2T,CT0.3rs7756992CDKAL1G,AG0.6rs13266634SLC30A8T,CT<0.001rs4430796HNF1BA,GA0.3rs10811661CDKN2BT,CT0.7rs7903146TCF7L2C,TC<0.0013.5.2病例-对照组基因型比较经Hardy-Weinberg遗传平衡定律的检验，发现在11个SNP位点中rs13266634、rs7903146不具有群体代表性，因此将这两个SNP排除。为了辨别9个SNP位点在实验组和对照组中的基因型的差异，对9个SNP位点的基因型进行比较，计算出X2和P值（表3.7）。结果发现基因，PPARG的SNP位点rs1801282，IGF2BP2的SNP位点rs4402960，HHEX的SNP位点rs1111875，HNF1β上的SNP位点rs4430796，WFS1的SNP位点rs10010131的基因型频率分布在T2D病例和对照组中无显著性差异（P>0.05）。20 宁波大学硕士学位论文基因KCNQ1的SNP位点rs2237892是T2D发病的风险基因（P=0.003），病例组CC、CT、TT的基因型频率分别为55.4%、39.2%、5.4%，正常对照组CC、CT、TT的基因型频率分别为42.9%、42.1%、15%，T2D危险等位基因CC要高于对照组，经过年龄、性别、BMI校正，SNP位点rs2237892与T2D的相关性仍显著（P=0.018）。基因CDKAL1的SNP位点rs7756992与中国人群的T2D发病有关（P=0.007），病例组GG、AG、AA的基因型频率分别为33.3%、50.5%、16.2%，正常对照组GG、AG、AA的基因型频率分别为21.4%、50.7%、27.9%，T2D组的危险基因型GG明显高于对照组，经过年龄、性别、BMI校正，SNP位点rs7756992与中国人群的T2D发病相关性仍然存在（P=0.05）。基因CDKN2B的SNP位点rs10811661是T2D的风险基因（P=0.036），病例组TT、CT、CC的基因型频率分别为33.3%、50%、16.7%，正常组TT、CT、CC的基因型频率分别为30.7%、41.4%、27.9%，T2D组的危险基因型TT以及CT均明显高于对照组，单因素Logistic回归分析在调整了年龄、性别、BMI等因素后，SNP位点rs10811661与T2D相关性更显著（P=0.012）。对于上述基因型趋势分析中P值<0.05的SNP位点分别进行病例-对照组间的优势(Dominant)及劣势(Recessive)基因型的比较（表3.8），进一步验证基因KCNQ1、CDKAL1、CDKN2B是T2D发病的风险基因。表3.7病例-对照组基因型的比较Tab3.7Genotypictestincase-controlstudyAlternativeX2PvaluePvalue*SNPCase(%)Control(%)AlleleT/T32(14.4)19(13.6)0.250.880.034rs5219C/T116(52.3)59(42.1)C/C74(33.3)62(44.3)G/G202(91)127(90.7)4.590.10.822rs10010131A/G18(8.1)12(8.6)A/A2(0.9)1(0.7)rs1111875G/G19(8.6)11(7.9)0.180.910.722-21- 中国汉族人群2型糖尿病早期筛查的研究A/G89(40.1)54(38.6)A/A114(51.4)75(53.6)C/C198(89.2)125(89.3)010.733rs1801282C/G23(10.4)14(10)G/G1(0.5)1(0.7)C/C123(55.4)60(42.9)11.530.0030.018rs2237892C/T87(39.2)59(42.1)T/T12(5.4)21(15)T/T12(5.4)3(2.1)4.150.120.084rs4402960G/T90(40.5)46(32.9)G/G120(54.1)91(65)G/G74(33.3)30(21.4)9.850.0070.050rs7756992A/G112(50.5)71(50.7)A/A36(16.2)39(27.9)A/A130(58.6)71(50.7)1.910.380.081rs4430796A/G76(34.2)56(40)G/G16(7.2)13(9.3)T/T74(33.3)43(30.7)6.650.0360.012rs10811661C/T111(50)58(41.4)C/C37(16.7)39(27.9)注：*，对年龄、性别和BMI进行校正。表3.8病例-对照组的优势及劣势基因型比较Tab3.8Dominantandrecessivegenotypictestincase-controlstudyDominantmodelRecessivemodelSNPGenePvalueOR(95%CI)PvalueOR(95%CI)rs2237892KCNQ10.0033.09(1.47-6.5)0.021.66(1.08-2.54)rs7756992CDKAL10.0082(1.19-3.33)0.0151.83(1.12-2.99)rs10811661CDKN2B0.0121.93(1.16-3.22)0.6041.13(0.72-1.78)3.5.3病例-对照组等位基因的比较为了辨别9个SNP位点在实验组和对照组中的等位基因的差异，对9个SNP位点的风险等位基因进行比较（表3.9）。结果发现基因KCNQ1的SNP位点rs2237892，基因CDKAL1的SNP位点rs7756992和基因CDKN2B的SNP位点rs10811661的等位基因在T2D病例和对照组中有显著性差异（P<0.05），从表中我们可以看出基因KCNQ1的SNP位点rs2237892C等位基因携带者患T2D的风22 宁波大学硕士学位论文险是T等位基因携带者的1.45倍(OR=1.45,95%CI=1-2.08,P=0.001)，基因CDKAL1的SNP位点rs7756992G等位基因携带者患T2D的风险是A等位基因携带者的1.6倍(OR=1.6,95%CI=1.19-2.17,P=0.019)，基因CDKN2B的SNP位点rs1811661T等位基因携带者患T2D的风险是C等位基因携带者的1.32倍(OR=1.32,95%CI=0.98-1.79,P=0.036)。基因KCNJ11的SNP位点rs5219，PPARG的SNP位点rs1801282，IGF2BP2的SNP位点rs4402960，HHEX的SNP位点rs1111875，HNF1B上的SNP位点rs4430796，WFS1的SNP位点rs10010131的等位基因频率分布在T2D病例和对照组中无显著性差异（P>0.05）。表3.9病例-对照组风险等位基因的频率分布Tab3.9DistributionofriskallelefrequenciesofSNPsincaseandcontrolgroupsAlternatRiskalleleRiskiveCaseControlfrequencyOR(95%CI)PvalueSNPallelAllele(BB/Bb/bb)(BB/Bb/bb)contrecaseolC,T0.41.29(0.94-1.75）0.11rs5219T74:116:3262:59:190.351A,G0.01.16(0.6-2.25）0.65rs10010131G2:18:2021:12:1270.0550A,G0.21.08(0.77-1.5）0.67rs1111875G114:89:1975:54:110.279C,G0.01.01(0.52-1.96)0.98rs1801282C198:23:1125:14:10.057560.71.69(1.22-2.34)0.001rs2237892C,TC123:87:1260:59:210.6450.21.45(1-2.08)0.07rs4402960T,CT120:90:1291:46:30.1960.51.6(1.19-2.17)0.0019rs7756992G,AG36:112:7439:71:300.4790.71.26(0.89-1.76)0.18rs4430796A,GA130:76:1671:56:130.7160.51.32(0.98-1.79)0.036rs10811661T,CT74:111:3743:58:390.518-23- 中国汉族人群2型糖尿病早期筛查的研究4讨论目前已发现早期干预（饮食、运动、药物等）可以减缓甚至逆转T2D的病程。但由于T2D早期发病的症状轻微，目前的诊断标准并不能尽早的发现和诊断大部分糖尿病患者，而延误了预防和治疗，加重病情。T2D的发病不仅与环境因素如高糖摄入、缺乏运动等相关，还与遗传因素高度相关，是由多个基因突变影响的遗传性复杂疾病。随着GWAS和荟萃分析的发展，发现了一批与T2D发病相关的SNP，这些位点所在的基因在胰腺β细胞内，通过作用于β细胞不同生理病理环节来影响β细胞功能。筛查这些遗传变异用于糖尿病患病的危险性评估，成为基因诊断的研究热点。样本收集筛选易感基因SNP位点体格检查和临床生化检查设计引物2型糖尿病患者血液正常对照组血液[52]基因组DNA的提取进行测序及基因分型统计学分析Qi等首次研究西方饮食习惯与T2D易感基因相互作用对T2D的影响，其中包括CDKN2B(rs10811661),CDKAL1(rs7756992),HHEX(rs1111875),CDKAL1(rs7756992),IGF2BP2(rs4402960),SLC30A8(rs13266634),WFS1(rs10010131),TCF7L2(rs12255372),PPARG(rs1801282),andKCNJ11(rs5219)，发现携带危险等位基因数量<10的人群中，这种饮食习惯并没有增加T2D的易感程度，而携带数>12的人群中，这种饮食习惯导致T2D的危险度高达2.06(95%:1.48-2.88)。因此上述基因型共同存在时，T2D的患病风险更高，若加之不健康的饮食和生活习惯，后果更加严重，因此对这些易感基因异型的携带者进行早期的基因筛查，及时进行采取干预措施，对T2D的预防有重大意义。本课题进一步检测中国人群中的T2D发病相关位点，以期建立针对中国人的早期基因筛查模型。本研究共纳入362名受试者，所有受试者均来自无血缘关系的宁波地区汉族人群。其中T2D病例组222例，正常对照组140例，整理受试者的体质指数与临床生化指标（表3.1），发现体重、体质指数、总胆固醇、高密度胆固醇和甘油三脂在病例-对照组中有明显差异，病例组明显比正常对照组要高。通过对国内外文献的查阅，我们确立了11个与T2D发病风险高度相关的基因上的11个SNP位点：rs5219，rs1801282，rs7903146，rs4402960，rs7756992，rs13266634，rs1111875，rs4430796，rs2237892，rs10010131，rs10811661，对这11个SNP位点设计了引物（表3.4），进行预实验确定各位点的PCR最适退火温度，经过电泳及24 宁波大学硕士学位论文测序的验证，确定了相关引物可用，然后对362个样本进行测序及基因分型，完成统计分析，得到以下4个有意义、值得关注的结果。第一，在中国汉族T2D患者人群中，本研究进一步验证了基因KCNQ1的SNP位点rs2237892是T2D发病的风险基因（P=0.003），经过年龄、性别、BMI校正，上述相关性仍显著（P=0.018），且rs2237892C等位基因携带者患T2D的风险是T等位基因携带者的1.45倍(OR=1.45,95%CI=1-2.08,P=0.001)，结果说明：rs2237892与中国人群的T2D发病相关性不依赖年龄、性别、BMI，且本位点携带等位基因C更容易患病。Yasuda等[12]在日本、中国人群的研究中均认为在KCNQ1基因内含子15上，rs2237892与T2D相关，本研究验证了这一结论。此前发现的多种与T2D相关的遗传基因多以欧美人为对象，KCNQ1基因是首次以亚洲人为对象确定的T2D相关易感基因，对亚洲及东欧人种而言，KCNQ1基因与T2D密切相关。KCNQ1基因编码膜电位控制钾离子通道的α亚单位，推测该基因有可能通过影响胰腺B细胞膜的动作电位，间接影响细胞内的钙离子浓度，进而影响胰岛素的分泌[19]。第二，CDKALl编码细胞周期依赖蛋白激酶5的调节亚单位相关蛋白1，在人类胰腺和骨骼肌细胞中高度表达[14]。本研究进一步说明了基因CDKAL1的SNP位点rs7756992与中国人群的T2D发病有关（P=0.007），经过年龄、性别、BMI校正，这种相关性仍然存在（P=0.05），rs7756992携带G等位基因能够增加中国人群T2D基因的易感性(OR=1.6,95%CI=1.19-2.17,P=0.019)。本研究位点rs7756992的OR值，相较于以往中国人群[53,54]所报道的OR值要稍微高一些，暗示了该位点致病风险性的大小，在不同地域有一定的差异。有研究证明携带CDKAL1rs7756992风险等位基因G的T2D患者，经磺脲类药物治疗后空腹血糖明显降低[15]，因此研究rs7756992位点与T2D的相关性可更好的使其服务于糖尿病的药物治疗的探究。根据以往的研究推测CDKAL1突变降低胰岛β细胞中第一时相的葡萄糖刺激的胰岛素分泌有可能是通过调节细胞内的ATP浓度，减缓K+输出和降低Ca2+通道的活性[39]。ATP的K第三，SNP位点rs10811661位于染色体9p，距离基因CDKN2B上游125Kb，有研究显示CDKN2B过表达会导致胰岛发育不良[21]。在本研究中我们发现SNP位点rs10811661是T2D的风险基因（P=0.036），单因素Logistic回归分析在调整了年龄、性别、BMI等因素后，这种相关性更显著（P=0.012），且rs1811661T等位基因携带者患病风险增加(OR=1.32,95%CI=0.98-1.79,P=0.036)。这种相关性在日本人群[55]、韩国人群[24]中得到-25- 中国汉族人群2型糖尿病早期筛查的研究了进一步的证实，但是在法国人群[55]中发现rsl0811661与T2D无关，其OR为0.74，这种差异部分归因于人群的不同生活环境和种族的不同。第四，在本研究中基因SLC30A8的SNP位点rs13266634和基因TCF7L2的SNP位点rs7903146不具有群体代表性，说明我们的样本量对于此位点的验证相对较少，PPARG的SNP位点rs1801282，IGF2BP2的SNP位点rs4402960，HHEX的SNP位点rs1111875，HNF1β上的SNP位点rs4430796，WFS1的SNP位点rs10010131的基因型频率和等位基因频率分布在T2D病例和对照组中无显著性差异（P>0.05），但在以往的研究结果报道中[45,56-58]，以上基因确实是T2D的风险基因。本研究结果可以归因为样本量不够大或不同人群的不同易感基因出现频率不同，因此尚需进一步的验证与完善。在本研究中基因KCNJ11的SNP位点rs5219经过年龄、性别、BMI校正后，该位点呈现与T2D的发病相关性（P=0.034），因此我们认为这个位点还有待于更大量样本的重复研究。本研究尚有一些不足之处，首先，本研究收集的样本的临床资料并不详细，比如缺少血压，2hOGTT等，因此尚且不能根据临床资料的差异，进行多个角度分析，其次，由于T2D本身就是复杂多因素性疾病，因此本实验的研究过程并不能够完全的避免假阳性和假阴性的出现，第三，本研究组的样本量相对较少，许多位点需更多更大的样本量来验证，最后，尚且需要对这些位点进行进一步的功能性研究，从而揭示这些相关SNP位点影响T2D的发病的潜在分子机制。26 宁波大学硕士学位论文第二部分荟萃关联分析1研究内容和技术路线1.1研究内容1.1.1确定纳入研究的文献（1）检索Pubmed数据库、Embase数据库、维普数据库、万方数据库、中国期刊全文数据库中关于基因KCNQ1的SNP位点rs2237892，基因CDKAL1的SNP位点rs7756992和基因CDKN2B的SNP位点rs1811661的所有与中国人群T2D发病有关的文章。（2）依据纳入标准，将不合格文献剔除。1.1.2发表偏倚评估用Egger’s线性回归检验检测是否存在发表偏倚，漏斗图是否分布均匀。1.1.3荟萃分析运用DersimonianandLairdQ检验来计算各研究之间的异质性大小，采用Statasoftware11.0版本进行荟萃分析。1.2技术路线确定检索策略，收集资料剔除不合格资料整理资料偏倚估计统计学分析异质性检验敏感分析分析结果及评价-27- 中国汉族人群2型糖尿病早期筛查的研究2材料与方法2.1对象检索Pubmed、Embase等英文数据库，搜索关键字：Chinese，Type2Diabetes，Type2DiabetesMellitus，T2D，T2DM，Single-nucleotidePolymorphism，SNP，SNPs，association，KCNQ1，rs2237892，CDKAL1，rs7756992，CDKN2B和rs10811661等，检索中文维普数据库、万方数据库、中国期刊全文数据库等，检索词包括：2型糖尿病，单核苷酸多态性，电压依赖性钾离子通道，细胞周期依赖蛋白激酶5的调节亚单位相关蛋白1，KCNQ1，rs2237892，CDKAL1，rs7756992，CDKN2B和rs10811661等，查阅所有与中国人群T2D发病相关的，涉及rs2237892、rs7756992、rs10811661的文章。2.2文章筛选标准如下：ò各文章的原始数据不同；òT2D的诊断标准符合1999年WHO的标准；ò文章数据包含或可计算样本量、比值比和可信区间；ò基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡；ò文章所用研究方法，统计方法等描述详细。检索完成后，将作者、发表时间、病例-对照人数、比值比、95%可信区间等信息归纳出来。2.3统计学分析采用Statasoftware11.0版本进行Metal-分析，用Egger’s线性回归检验检测是否存在发表偏倚。运用DersimonianandLairdQ检验来计算各研究之间的异质性大小，P<0.05有统计学意义。若各研究间有异质性，则选择随机效应模式进行数据分析；若无异质性，则可任意选择随机效应模式及固定效应模式。用I2来度量异质性的大小：若I2<25%则异质性低；若25%
