重组中东呼吸综合征病毒刺突蛋白S1亚基及其编码DNA接种小鼠的抗血清水平研究

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分类号：Q71密级：公开学校代码：11065学号：2015021039专业硕士学位论文重组中东呼吸综合征病毒刺突蛋白S1亚基及其编码DNA接种小鼠的抗血清水平研究作者姓名张倩倩指导教师李荣贵教授专业领域生物工程培养单位生命科学学院答辩日期2018年5月19日 摘要中东呼吸综合征是（MiddleEastrespiratorysyndrome,MERS）是一种由单链RNA冠状病毒引起的使人畜发生急性致死性呼吸道传染病疾病。2013年，世界卫生组织（WHO）正式命名该病毒为“中东呼吸综合征病毒（MERS-CoV）”，并宣布该冠状病毒具有能在动物与动物，动物与人，人与人之间传播的高度危险性，因此引起全球各界的关注。本研究根据MERS-CoV刺突蛋白S1亚基的基因序列设计一对引物，通过PCR扩增技术，以合成序列为模板，进行PCR扩增，获得刺突蛋白的S1亚基基因片段，其大小为2253bp，将MERS-CoV刺突蛋白S1亚基基因片段克隆到真核表达载体pEAK13CD5LTEVhIgGFc构建重组pEAK13CD5LS1TEVhIgGFc。重组质粒pEAK13CD5LS1TEVhIgGFc经限制性酶切消化后转染至HEK293E细胞，利用嘌呤霉素筛选出稳定表达重组蛋白S1-Fc的阳性克隆细胞株。培养阳性克隆细胞株，进行融合蛋白（S1-Fc）的重组表达，收集培养细胞的上清培养基，过蛋白A亲和柱进行纯化，获得了大小约为122kD的重组蛋白，Westernblotting分析表明，该蛋白即为目的蛋白。将重组质粒pEAK13CD5LS1TEVhIgGFc、重组S1-Fc蛋白以及重组质粒pEAK13CD5LS1TEVhIgGFc与S1-Fc蛋白混合物分别接种小鼠，以提纯的MERS-CoV刺突蛋白亚S1亚基-Fc融合蛋白（S1-Fc）作为抗原，利用ELISA及Westernblotting实验检测了小鼠血清中的抗体滴度及特异性。研究结果表明，三种接种方法均能诱导小鼠产生特异性抗S1血清。其中，接种重组S1-Fc蛋白与同时接种重组质粒pEAK13CD5LS1TEVhIgGFc和S1-Fc蛋白的小鼠，在首次接种就产生高滴度抗S1血清，但仅接种质粒的小鼠，在第3次接种后才产生了特异性抗S1血清，并且其抗S1血清滴度明显低于前两者。两种含重组S1-Fc蛋白的接种方法诱导产生的抗S1血清滴度基本一致，并且均显著高于仅接种质粒的小鼠的抗S1血清。本研究证明了MERS-CoV刺突亚蛋白S1的蛋白质疫苗和重组质粒pEAK13CD5LS1TEVhIgGFc疫苗均能使小鼠产生抗S1血清，在短期内重组蛋白疫苗更快速有效，产生的抗S1血清的浓度更高，这为MERS-CoV疫苗的研发提供了理论和技术支持。关键词：中东呼吸综合征冠状病毒；S1亚基；重组S1-Fc蛋白；接种；抗S1血清滴度 AbstractMiddleEastrespiratorysyndrome(MERS)isanacutelylethalrespiratorydiseasecausedbyasingle-strandedRNAcoronavirus.In2013,theWorldHealthOrganization(WHO)formallynamedthevirus"MERS-CoV"andannouncedthattheviruscouldspreadbetweenanimalsandanimals,animalsandhumans,humanandhumans.Becauseofitshighrisk,thevirusattractedworldwideattention.Inthisstudy,apairofprimerswasdesignedbasedonthegenesequenceofSpikeproteinS1subunitofMERSvirus.S1subunitgenefragmentof2253bpwasamplifiedbyPCRandclonedintotheeukaryoticexpressionvectorpEAK13CD5LTEVhIgGFctoconstructtherecombinantplasmidpEAK13CD5LS1TEVhIgGFc.RecombinantplasmidpEAK13CD5LS1TEVhIgGFcwasdigestedbyrestrictionendonucleasesandtransfectedintoHEK293Ecells.PositiveclonecelllinesstablyexpressingtherecombinantS1-Fcproteinwereselectedbypuromycin.ThesupernatantofthepositiveclonecelllineswascollectedandTheS1-Fcfusionproteinwitharelativemolecularweightof122kDinthesupernatantwaspurifiedthroughproteinAaffinitycolumn.TherecombinantproteinwasidentifiedasatargetproteinbyWesternblottinganalysis.RecombinantplasmidpEAK13CD5LS1TEVhIgGFc,recombinantS1-Fcprotein,mixofrecombinantplasmidpEAK13CD5LS1TEVhIgGFcandS1-Fcproteinswereinoculatedintomicerespectively.TheantibodytiterandspecificityintheserumofmicewasdetectedbyELISAandWesternblottingusingthepurifiedrecombinantS1-Fcasantigen.Theresultsshowedthatallthreemethodsofinoculationcouldinducemicetoproducespecificanti-S1serum.Amongthem,mouseanti-S1serumvaccinatedwithrecombinantS1-Fcandsimultaneouslyinoculatedwithrecombinantplasmidsandproteinsproducedhigh-titerantiserawhenfirstvaccinated,whileplasmid-inoculatedmiceproducedspecificanti-S1serumafterthethirdinoculation,andanti-S1serumtiterwassignificantlylowerthantheothers.Thetitersofanti-S1seruminducedbythetworecombinantS1-Fcproteincontaininginoculationmethodswerebasicallythesame,andbothsignificantlyhigherthanthatoftheplasmid-inoculatedmicealone.ThisstudydemonstratedthattheproteinvaccineandrecombinantplasmidvaccineoftheS1proteinoftheMERSviruscouldproduceanti-S1seruminmice.Intheshortterm,therecombinantproteinvaccineismorerapidandeffective,resultinginahighertiterofanti-S1serum.ThisstudyprovidestheoreticalandtechnicalsupportforthedevelopmentofvaccinesfortheMERSvirus.Keyword：MiddleEastrespiratorysyndromecoronavirus;S1subunit;RecombinantS1-Fc;Inoculation;Anti-S1serumtiter 目录引言...........................................................................................................................11实验材料....................................................................................................................31.1质粒和菌株.........................................................................................................................31.2细胞株................................................................................................................................31.3实验小鼠.............................................................................................................................41.4主要试剂.............................................................................................................................41.5主要仪器设备.....................................................................................................................41.6主要溶液配方.....................................................................................................................51.6.1大肠杆菌(E.coli)培养基的配制..................................................................................51.6.2质粒DNA提取（大量法）相关溶液的配制............................................................51.6.3DNA琼脂糖凝胶电泳缓冲液及1%琼脂糖凝胶的配制..........................................51.6.4细胞冻存液及细胞裂解液的配制..............................................................................51.6.5SDS-PAGE配置蛋白胶及相关缓冲液的配制..........................................................61.6.6Westernblotting相关缓冲液的配制..........................................................................61.6.7蛋白纯化相关缓冲液配制..........................................................................................71.6.8常用缓冲液的配制......................................................................................................72实验方法....................................................................................................................82.1基因表达载体的构建.........................................................................................................82.1.1蛋白序列的密码子优化..............................................................................................82.1.2引物设计......................................................................................................................82.1.3引物稀释......................................................................................................................82.1.4PCR扩增......................................................................................................................82.1.5PCR产物回收..............................................................................................................92.1.6S1目的基因与载体的双酶切消化.............................................................................92.1.7双酶切产物纯化回收................................................................................................112.1.8目的基因与pEAK13CD5LTEVIgGhFc真核表达载体的连接..............................112.1.9重组质粒的转化........................................................................................................122.1.10重组质粒DNA的小量提取与鉴定........................................................................122.1.11重组质粒DNA的大量提取....................................................................................142.1.12重组质粒DNA酶切线性化及纯化回收................................................................152.2细胞实验..........................................................................................................................152.2.1HEK293T和HEK293E细胞的复苏........................................................................152.2.2HEK293T和HEK293E细胞的传代........................................................................162.2.3pEAK13CD5LS1TEVIgGFc表达质粒瞬时转染HEK293T细胞..........................162.2.4稳定表达细胞株的构建............................................................................................162.2.5细胞裂解....................................................................................................................172.2.6Westernblotting检测.................................................................................................172.2.7细胞冻存....................................................................................................................182.2.8蛋白纯化....................................................................................................................182.2.9BCA法测定蛋白质浓度...........................................................................................192.3动物实验..........................................................................................................................192.4免疫实验..........................................................................................................................202.4.1Westernblotting验证接种小鼠是否产生抗S1血清..............................................202.4.2ELISA检测抗S1血清滴度......................................................................................203实验结果.................................................................................................................213.1MERS-CoV刺突蛋白（S）编码基因序列的密码子优化...........................................21 3.2MERS-CoVS1亚基基因片段PCR扩增.......................................................................233.3pEAK13CD5LTEVIgGFc表达载体与S1基因片段的酶切纯化回收..........................243.4小量提取pEAK13CD5LS1TEVIgGFc重组质粒鉴定..................................................243.5重组质粒的双酶切验证..................................................................................................253.6重组质粒序列分析..........................................................................................................263.7大量提取pEAK13CD5LS1TEVIgGFc重组质粒鉴定...................................................313.8重组表达质粒瞬时转染HEK293T后的蛋白表达鉴定................................................313.9重组质粒的酶切线性化验证..........................................................................................323.10稳定表达细胞株的筛选鉴定........................................................................................333.11S1-Fc融合蛋白纯化后PAGE胶检测结果..................................................................343.12Westernblotting验证抗S1血清的特异性...................................................................353.13ELISA检测小鼠抗S1血清的高滴度...........................................................................374结论.........................................................................................................................394.1成功构建重组质粒pEAK13CD5LS1TEVhIgGFc.........................................................394.2在人源HEK293E细胞中成功表达了S1-Fc融合蛋白................................................394.3Westernblotting和ELISA检测到小鼠抗血清对重组S1-Fc融合蛋白具高度特异性..................................................................................................................................................395讨论.........................................................................................................................40综述.............................................................................................................................44摘要.............................................................................................................................44参考文献.....................................................................................................................50附录或缩略词表..........................................................................................................50致谢.........................................................................................................................58攻读学位期间的研究成果.........................................................................................59 青岛大学硕士学位论文引言中东呼吸综合征（MiddleEastrespiratorysyndrome,MERS），是一种新型的由冠状病毒引发的急性、高致病性的呼吸道传染性疾病。中东呼吸综合征冠状病毒（MiddleEastrespiratorysyndromecoronavirus,MERS-CoV）能够感染多种包括人类在内的灵长类动物和非灵长类哺乳动物，极易引发呼吸道感染，并伴发多器官功能衰竭等一系列[1]疾病。该病毒于2012年首次在中东沙特阿拉伯地区被发现，2013年由世界卫生组织(WHO)命名，并宣布将该种病毒引起的人畜传染性疾病正式称为“中东呼吸综合[2-3]征”(MERS)。据世界卫生组织（WHO）统计资料显示，自2012年发现MERS-CoV至今，全球检测出MERS-CoV病毒感染的病例与日趋增，已报告了2000多例实验室确诊的阳性病例，导致700多人死亡，致死率极高。该疾病绝大多数病例主要集中在中东阿拉伯半岛地区，但在西亚、欧洲、非洲和北美洲等地区也有阳性病例发现，病史记录表明，中东地区以外国家报告的原发病例均有与中东通过商务、宗教、旅游等[4]不同形式的密切交流史。蝙蝠可能是MERS-CoV的天然储库，并在传播中起关键作[5-6]用。另外，根据研究报道，骆驼也是MERS-CoV的重要储库寄主，它们似乎是导[7]致人类感染的唯一动物宿主。据研究资料显示，单峰驼骆驼感染MERS-CoV后出现流鼻涕，寒颤，喷嚏等呼吸道感染症状后，人类与感染的骆驼接触后也发生MERS-Co[8-9]V感染，为骆驼-人类传播MERS-CoV提供了证据。MERS-CoV是由一条单链正义RNA组成、具有包膜的β型冠状病毒，也是目前为止发现的C亚群中唯一一个能[10]够感染人的病毒，其基因组全长为30Kb，编码多种结构蛋白和非结构蛋白。其中刺突蛋白（Spike，S）是病毒颗粒表面的4大重要结构蛋白之一，在侵染靶细胞过程中起重要作用。MERS-CoV的S蛋白是I型跨膜糖蛋白，包含1353个氨基酸残基，在病毒感染过程中被蛋白酶切割成S1亚基和S2亚基两个部分，S蛋白质、S1亚基、S2亚基以三聚体状态呈现在病毒表面。MERS-CoV利用二肽基肽4（DPP4，也称为[11-12]CD26）作为其在宿主细胞上的受体。MERS-CoVS1亚基的C端含有结合DPP4的受体结合结构域（RBD），其功能是能够与宿主细胞DPP4受体结合和识别，继而导致S2亚基上的HR1和HR2七肽重复区两个膜结构域发生构象改变，介导病毒与靶细[13-16]胞的结合。S蛋白质、S1亚基、S2亚基以及S蛋白上的其他结构域均可作为[15]MERS-CoV疫苗研究的主要对象。现今，尚无临床验证有效的抗MERS-CoV的疫苗和治疗药物被批准用于人类感染。大多数的疫苗和药物研究仍还只停留在实验室阶段或动物试验阶段，其主要原因是目前中东呼吸综合征病毒的传播途径和致病性尚未明了，且该病毒的高致病性和危险性，使得人类临床试验较难开展。因此，研制针对MERS-CoV的高效抗体，对中东呼吸综合征病毒的预防和控制具有至关重要的作用。本课题意在利用克隆技术构建MERS-CoV表面刺突S蛋白S1亚基基因的重组真核表达载体，获得了稳定表达S1-Fc融合蛋白的细胞株，经纯化获得了重组S1-Fc融合蛋白。分别通过将含有S1亚基基因的重组质1 青岛大学硕士学位论文粒，重组S1-Fc融合蛋白以及重组质粒和重组S1-Fc融合蛋白联合接种小鼠，以检测小鼠是否发生免疫反应，并检测三种不同的接种方式接种小鼠产生的抗S1血清滴度是否存在区别，为能够研制出预防中东呼吸综合征病毒的疫苗提供技术支持。2 青岛大学硕士学位论文1实验材料1.1质粒和菌株pEAK13CD5LTEVIgGFc真核表达载体由中国医学科学院基础医学研究所蒋澄宇课题组优化保存，含有CMV等强启动子，在开放阅读框（ORF）及可编码蛋白处插入目的基因片段即可在哺乳动物细胞中高量表达目的蛋白。同时，在ORF前端加入了分泌表达序列CD5L，能够引导目的蛋白分泌表达，并在表达基因CD5L末端加入了带有TEV蛋白酶切位点的人源IgGFc基因序列，利于后期目的蛋白的纯化工作。pEAK13CD5LTEVIgGFc真核表达载体本身含有氨苄青霉素和嘌呤霉素抗性基因，可分别用于大肠杆菌和哺乳动物细胞抗性筛选，同时pEAK13系列载体还能够在AvrII限制性内切酶的酶切消化下线性化以后，极易转染到细胞基因组中，有利于高效且快速的筛选获得稳定表达的阳性克隆细胞株。大肠杆菌（DH5α），购于北京天根有限公司，主要用于重组质粒的转化与扩增。1.2细胞株HEK293T细胞株和HEK293E细胞株均购自于中国医学科学院基础医学细胞中心。3 青岛大学硕士学位论文1.3实验小鼠SPF级6~8周龄雌性BALB/C小鼠（编号：ACUC-A02-2017-008，北京药品生物制品鉴定所实验动物资源中心）。1.4主要试剂限制性核酸内切酶NheI、BamHI、AvrII，10×Cutsmart酶切缓冲液，T4DNA连接酶，牛血清白蛋白等均购自美国NewEnglandBioLabs公司；2×PfuPCRMasterMix，氨苄青霉素，D15000+2000DNAMarker，D2000DNAMarker，1kBDNAMarker，BCA蛋白质定量试剂盒，薄型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，质粒小量提取试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司；6×LoadingBuffer，碱性磷酸酶（CIAP）购自日本Takara公司；QIAquickPCRPurificationKit购自北京智杰方远科技有限公司；琼脂糖（Agarose），SDS，DTT，EDTA，EB，Tris甘氨酸均购自美国Promega公司；TritonX-100和TWEEN®20购自北京公司；琼脂粉（AgarPowder）购自美国InvitrogenLifeTechnology公司；NP-40购自美国Fluka公司；硝酸纤维素膜购自Amersham公司；PMSF购自Amcesco公司；DMSO，DEPC，IgGFc抗体，细胞筛选抗性嘌呤霉素购自美国Sigma公司；Opti-MEMI减血清培养基，DMEM培养基，胎牛血清，0.05%胰酶消化液，青霉素,链霉素等购自北京太和华美医药科技股份有限公司；转染试剂NeofectTMDNATransfectionReagent购自北京零客创智生物技术公司；蛋白酶抑制剂Cocktail购自ThermoScientificInc；150mm、100mm、60mm细胞培养平皿，96孔、48孔、24孔、12孔和6孔细胞培养板购自北京太和华美医药科技股份有限公司；1×YMBELISASubstrateSolution，核酸染料（Dured,009-500µL）购自美国R&D公司；5mLEDTA抗凝采血管，手术刀，1mL注射器购自中国医学科学院基础医学细胞中心；实验小鼠固定架购自上海艾研生物科技有限公司；山羊抗小鼠带有HRP标记的二抗购自杭州联科生物技术股份有限公司；Westernblotting化学反应发光显色液，蛋白胨（Tryptone），酵母提取物（YeastExtract）购自德国MerckMillipore公司；氯仿（分析纯）、异丙醇（优级纯）、无水乙醇（优级纯）购自北京化学试剂公司，除此之外其它普通实验耗材和化学试剂均为国产。1.5主要仪器设备台式离心机（Eppendorf，Centrifuge5415D），台式低温离心机（BeckmanComlter，Microfuge22RCentrifuge），台式冷冻低速离心机(BeckmanComlter，AllegraX-12RCentrifuge)，电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9023A），电子天平（Sartorius，BS110S/Sartorius2000S），电热恒温水箱（SHHW21600），超速离心机（BeckmanComlter，NVT-90），电泳仪（DYY-6C），凝胶成像仪（MolecµLarImagerGelDocXR,Bio-Rad），微量紫外分光光度计NanoDrop2000（ThermoScientific），光4 青岛大学硕士学位论文学显微镜（OLYMPUS，FV1000），细胞CO2培养箱（SANYO），-80℃超低温冰箱（SANYO，MDF-382E），Mili-Qplus超纯水制备机（Millipore公司），电热恒温培养箱（XMTDHH.B11-600），台式恒温振荡器（THZ-D），全温振荡器（HZQ-Q），多功能酶标仪Synogen4（Gene公司），磁力搅拌器（IKARH-KT/C），pH计（ThermoOrion868），ÄKTAavant蛋白纯化系统，（GE医疗集团），ProteinA蛋白纯化亲和层析柱（GE医疗集团），PCR仪（Biometro），DNA旋转混匀仪（HS-3）。1.6主要溶液配方1.6.1大肠杆菌(E.coli)培养基的配制LB液体培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，溶于900mL蒸馏水中，定容至1L，121°C高压灭菌20min。LB固体培养基：蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，NaCl1g，琼脂粉1.5g，溶于90mL蒸馏水中，定容至100mL，混匀，121°C高压灭菌20min，分装至100mm培养皿中，冷却后保存于4°C冰箱备用。1.6.2质粒DNA提取（大量法）相关溶液的配制溶液I：10mmol/LEDTA，pH8.0。溶液II：0.1mmol/LNaOH，1%SDS，使用前新鲜配制。溶液III：2.5mmol/LKAc，2.5mol/LHAc，pH4.7，4°C保存。饱和正丁醇：850mL饱和正丁醇中加入1mmol/LNaCl100mL，继续加饱和正丁醇定容至1L，上下颠倒充分混匀后，静置10min分层，即可使用。1.6.3DNA琼脂糖凝胶电泳缓冲液及1%琼脂糖凝胶的配制10×TAE1L：Tris48.4g，HAc11.42mL，0.5mol/LEDTA(pH8.0)20mL，加蒸馏水定容至1L。1×TAE2L：10×TAE200mL加入1800mL蒸馏水定容至2L。1％琼脂糖凝胶：1×TAE100mL，加入1g琼脂糖，加热溶解，冷却至60°C以下时加入10µLDured核酸染料，混匀后倒入放有移胶板的胶室中，冷却凝固。1.6.4细胞冻存液及细胞裂解液的配制90%FBS和10%DMSO充分混匀后4°C保存备用。2×LoadingBuffer10mL：2mL10%SDS，0.5g5%蔗糖，0.02g0.1%溴酚蓝，0.5mL5%β-巯基乙醇溶于10mL无菌双蒸水中，混匀，4°C保存备用。5 青岛大学硕士学位论文1.6.5SDS-PAGE配置蛋白胶及相关缓冲液的配制SDS-PAGE分离胶的配制如下表：表1SDS-PAGE8%和10%分离胶配方组分8%分离胶（mL）10%分离胶（mL）无菌双蒸水1.31.730%Acr-Bis(29:1)1.71.31mmol/LpH8.8Tris-HCl1.91.910%SDS0.050.0510%AP0.050.05TEMED0.0050.005总体积55SDS-PAGE浓缩胶的配制如下表：表2SDS-PAGE5%浓缩胶配方组分5%浓缩胶（mL）无菌双蒸水1.430%Acr-Bis(29:1)0.331mol/LpH6.8Tris-HCl0.2510%SDS0.0210%AP0.02TEMED0.002总体积2SDS-PAGE蛋白凝胶上样缓冲液：500mmol/LTris-HCl(pH6.8)，100mmol/Lβ-巯基乙醇，2％SDS，10％甘油，0.15％溴酚兰。考马斯亮蓝染色液：将0.25g考马斯亮蓝R250溶于45mL甲醇中，置于磁力搅拌器上搅拌充分溶解，相继加入10mLHAc，40mL双蒸水，定容至100mL，用定性滤纸过滤后方可使用，可以反复使用。脱色液：甲醇450mL，100mLHAc，加双蒸水定容至1L，可加热后使用。1.6.6Westernblotting相关缓冲液的配制TBS：12.1gTris或100mL1mol/LTris-HCl(pH8.0)，17.52gNaCl或75mL46 青岛大学硕士学位论文mol/LNaCl，加双蒸水定容至2L。TBST：含有0.1%TritonX-100TBS，即500mLTBS加0.5mLTritonX-100。电泳缓冲液（10×）：15.14gTris，93.84g甘氨酸，50mL10%SDS，加蒸馏水至1L，使用时稀释成1×。转膜缓冲液：2.42gTris，11.52g甘氨酸定容到800mL蒸馏水，然后加200mL甲醇定容至1L，使用前低温预冷。封闭液：称取5g牛奶溶于100mL的TBST溶液中，于磁力搅拌器上充分搅拌均匀，4°C保存备用。1.6.7蛋白纯化相关缓冲液配制结合缓冲液（BindingBuffer）：11.54mol/LNa2HPO4，8.46mol/LNaH2PO4，1mol/LEDTA，pH7.0。清洗缓冲液（WashingBuffer）：11.54mmol/LNa2HPO4，8.46mmol/LNaH2PO4，0.15mol/LNaCl，1mmol/LEDTA，pH7.0。洗脱缓冲液（ElutionBuffer）：0.1mol/L甘氨酸，pH3.0。中和缓冲液（NeutralizingBuffer）：1mol/LTris，pH9.0。1.6.8常用缓冲液的配制PBS：NaCl8.0g，KCl0.2g，Na2HPO4⋅12H2O3.58g，KH2PO40.27g，溶于950mL蒸馏水，充分搅拌均匀，调节pH7.4，定容至1L，121°C高压灭菌20min。TE缓冲溶液：10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA，pH8.0，121°C高压灭菌20min。DEPC处理的水：取1mLDEPC于双蒸水中，定容至1L，室温放在磁力搅拌器上搅拌2h，121°C高压灭菌30min后，低温保存。7 青岛大学硕士学位论文2实验方法2.1基因表达载体的构建2.1.1蛋白序列的密码子优化中东呼吸综合征病毒（MERSCoV）颗粒表面刺突蛋白（S）的蛋白序列来源于NCBI基因数据库（登录号：KF961222.1），通过密码子优化网站(http://www.jcat.de/)，用氨基酸的高频密码子将S蛋白转换成可编码的cDNA序列。将所得核苷酸序列两端都连上同pEAK13CD5LTEVIgGFc表达载体相应的酶切位点BamHI、NheI，并用次高频密码子替换核苷酸序列中可能出现的NheI，BamHI、EcoRI、NcoI、HindIII、AvrII等酶切位点和剪接位点以及复杂的二级结构，送由苏州泓迅生物科技有限公司合成。2.1.2引物设计根据MERS病毒刺突蛋白S基因中S1亚基的编码序列设计一对引物，F:5'-CGCGCTAGCCATGATCCACAGC-3';R:5'-CGCGGATCCTTCACGCTTCTAGGGGTCAG-3'，其中，F引物含有NheI酶切位点，R引物含BamHI酶切位点，由北京擎科生物技术有限公司合成。2.1.3引物稀释1）将含有引物粉末的EP管，6000rpm离心2min。2）加去离子水使引物浓度为10mmol/L，颠倒混匀，并于涡旋振荡仪上振荡20s，瞬时离心后，保存于-20°C冰箱备用。2.1.4PCR扩增以MERS刺突蛋白S基因序列为模板，进行目的基因S1的PCR扩增反应。1）根据表3配制PCR反应体系，每管总反应体系为50µL。表350µLPCR反应体系组分体积（µL）模板1引物F1引物R1252×PfuPCRMasterMix22无菌双蒸水8 青岛大学硕士学位论文2）将所有溶液加入PCR管后轻弹混匀，瞬时离心，放入PCR仪，设置具体的PCR参数：A：94°C预变性5min。B：94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸90s，重复35个循环。C：变性-退火-延伸循环反应结束后，72°C继续终延伸10min，置4°C保存。3）取2µLPCR反应产物混合1µL的6×LoadingBuffer进行1%琼脂糖凝胶电泳，90V电压下电泳45min，在凝胶成像仪下观察分析目的条带，检测正确的PCR产物进行回收。2.1.5PCR产物回收使用QIAquickPCRPurificationKit试剂盒纯化回收PCR产物，具体实验步骤按照其说明书操作如下：1）将PCR反应产物和5倍体积的结合液PB于无菌Eppendorf管中充分混匀，将混合液全部加入收集管中，室温静置2min，12000rpm离心1min，弃废液。2）向收集管中加入600µL漂洗液PW，上下颠倒几次，使柱内空间充分被清洗，室温静置2min，12000rpm离心1min，弃掉收集管中的废液。3）重复步骤2)。4）将空的收集管12000rpm离心2min，去除废液，室温晾置10min，尽可能地晾干收集管内膜，尽可能的去除漂洗液PW，以免影响下一步实验。5）将收集管放置于一个新的无菌Eppendorf管中，向内膜正中间悬空滴加30µLEB洗脱缓冲液，室温放置2min，12000rpm离心2min，离心下来的液体即为PCR反应纯化回收产物，取1µL用微量紫外分光光度计NanoDrop2000检测浓度，其余保存于4°C备用。2.1.6S1目的基因与载体的双酶切消化1)按照表4配制S1目的基因的限制性核酸内切酶双酶切体系，每管总反应体系为50µL。9 青岛大学硕士学位论文表450µLS1目的基因的双酶切体系组分体积（µL）S1目的基因（2µg）1010×CutsmartBuffer5限制性内切酶NheI0.5限制性内切酶BamHI0.5无菌双蒸水34.5按照表5配制pEAK13CD5LTEVhIgGFc真核表达载体限制性核酸内切酶双酶切体系，每管总反应体系为50μL。表550µLpEAK13CD5LTEVhIgGFc载体的双酶切体系组分体积（µL）pEAK13CD5LSSU72TEVIgGFc质粒910×CutsmartBuffer5限制性内切酶NheI0.5限制性内切酶BamHI0.5CIAP0.5无菌双蒸水34.5依次加入各个组分，轻轻混匀，低速瞬时离心，于37°C水浴锅中消化1~3h。在pEAK13CD5LTEVIgGFc真核表达载体限制性核酸内切酶双酶切体系中加入0.5µL碱性磷酸酶，切掉载体末端5'-磷酸基团。2）配制含有1:10000的DuRed1%琼脂糖凝胶10mL，倒在放有胶梳和移胶板的胶室中，冷却凝固。3）拔去胶梳，置于电泳槽中，加满1×TAE缓冲液，S1目的基因和pEAK13CD5LTEVIgGFc真核表达载体的酶切产物分别与2×LoadingBuffer的混合后加样，同时加DNAMarker样品，如：D15000+2000等作对照，以确定S1目的基因的大小。4）电泳90V，1h，将电泳结束后的1%琼脂糖凝胶转移到凝胶成像仪下，观察分析，并切下目的条带。10 青岛大学硕士学位论文2.1.7双酶切产物纯化回收使用薄型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收双酶切消化的S1目的基因和pEAK13CD5LTEVhIgGFc真核表达载体，具体实验步骤按照其说明书操作如下：1)从1%琼脂糖凝胶中分别切下含有S1目的基因和pEAK13CD5LTEVIgGFc真核表达载体的凝胶条带放入无菌Eppendorf管中称重。2）每100mg琼脂糖凝胶加入100µLBindingSolution，于50~60°C水浴锅中温浴3~5min，每隔1min进行轻微的上下颠倒混匀，使凝胶融化充分。3）将上述溶化后的凝胶溶液分别移至套有2mL收集管的吸附柱GC-2u中，室温放置2min，使S1目的基因和pEAK13CD5LTEVIgGFc真核表达载体充分吸附在吸附柱内膜上，6000rpm室温离心1min，倒掉收集管中废液。4）分别重新放置吸附柱GC-2u于收集管中，加入WASolution500µL，12000rpm，室温离心1min，弃掉收集管中废液。5）分别将吸附柱GC-2u重新放置后，加入500µLWashSolution，室温12000rpm，离心1min，倒弃收集管中废液。6）重复步骤5）一次。7）分别重新放置吸附柱GC-2u于收集管中，室温12000rpm，离心2min，打开吸附柱GC-2u的盖子，室温放置10min，以彻底晾干吸附柱GC-2u中的WashSolution。8）将吸附柱GC-2u放入无菌收集管中，分别取20µLElutionBuffer对两个吸附柱内膜正中间位置悬空滴加，盖紧收集管盖子，于37°C水浴锅中温浴2min，12000rpm离心2min，即两个收集管中的液体分别为S1目的基因溶液和pEAK13CD5LTEVIgGFc表达载体溶液。2.1.8目的基因与pEAK13CD5LTEVIgGhFc真核表达载体的连接根据表6配制目的基因与真核表达载体的连接体系，总反应体系为20µL。表620µL目的基因与真核表达载体的连接体系组分体积（µL）目的基因/无菌双蒸水8pEAK13CD5LTEVIgGFc载体5T4DNA连接酶111 青岛大学硕士学位论文10×CutsmartBuffer5无菌双蒸水1各个组分添加完毕后，用移液器轻轻吸打混匀，低速瞬时离心，16°C水浴连接反应3h。2.1.9重组质粒的转化1）迅速从-80°C冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞DH5α置于冰上融化，同时将含氨苄青霉素含（100mg/mL）的固体培养皿置于37°C孵箱中预热。2）大肠杆菌感受态细胞DH5α融化5min后，分别迅速加入重组质粒的连接产物和阴性对照，每100µL大肠杆菌感受态细胞中加入10µL连接产物，轻轻混匀，立刻冰浴30min。3）37°C水浴锅热激5min，迅速取出置于冰上放置5min。4）在无菌超净台上，每个感受态细胞体系中加600µL无抗生素的LB液体培养基，于37°C摇床，200rpm振荡培养1h。5）将两支Eppendorf管1000rpm离心5min，使菌体完全沉淀管底。6）将450µL上清液体吸出弃掉，用剩下的150µL的LB液体培养基重悬细胞。7）在无菌超净工作台上，用涂布器将150µL悬液均匀涂布在LB固体培养基上，正向放入37°C培养箱中培养1h，再倒置培养16h。2.1.10重组质粒DNA的小量提取与鉴定1）取过夜培养的固体培养皿于无菌超净工作台中，将镊子置于酒精灯火焰上灼烧1min灭菌，夹取无菌牙签挑取单克隆菌落，接种于4mL含100mg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，置于37°C恒温培养箱，200rpm振荡过夜培养16h。2）按照质粒小提试剂盒说明书提取重组质粒DNA。①柱平衡步骤：将500µL的平衡液BL加入到吸附柱CP3（吸附柱放入收集管）中，室温下12000rpm离心1min，弃掉收集管中的废液，重新放置吸附柱于收集管中。②将过夜培养16h的菌液，分批加入无菌Eppendorf管中，室温12000rpm，离心1min，弃去上清。③用250µL溶液P1加入含有菌体沉淀的无菌Eppendorf管中，用移液器重新悬浮菌体沉淀，充分混匀。④然后加入250µL溶液P2，温和地上下颠倒混匀使无菌Eppendorf管内菌体充12 青岛大学硕士学位论文分裂解，直至溶液变得澄清透亮。⑤最后加入350µL溶液P3，立即上下颠倒混匀，直到无菌Eppendorf管内出现白色絮状沉淀时，室温12000rpm离心15min。⑥离心结束后，白色絮状沉淀沉入管底，用移液器移取上清液至吸附柱CP3中，严禁吸出沉淀，室温12000rpm离心1min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新归置收集管中。⑦向吸附柱CP3中加入600µL漂洗液PW,12000rpm离心1min，弃掉收集管中的废液，重新放置吸附柱CP3。⑧重复上一步操作步骤。⑨将上述含有吸附柱CP3的收集管12000rpm离心2min，尽可能地将吸附柱中残留的漂洗液PW尽数去除，并弃掉收集管。⑩将吸附柱CP3重新放置于一个无菌Eppendorf管中，放置室温中数分钟，使漂洗液PW尽可能的挥发干，用移液器向吸附柱内膜正中间部位滴加50µL洗脱液EB，室温静置2min，使洗脱液EB与吸附柱内膜充分结合，12000rpm离心3min，使质粒溶液尽可能的收集到无菌Eppendorf管中。3）取5µL质粒做限制性核酸内切酶双酶切检测，反应体系如表7：表720µL重组质粒pEAK13CD5LTEVFc双酶切反应体系组分体积（µL）重组质粒5NheI0.5BamHI0.510×CutsmartBuffer5无菌双蒸水9各个组分添加完毕后，低速瞬时离心，使各个组分都混匀在Eppendorf管底部，置于37°C水浴锅中，酶切消化1.5h，进行1%琼脂糖凝胶电泳，90V，1h，在凝胶成像仪下观察，分析。4）将5µL重组质粒和剩余菌液送往北京擎科生物技术有限公司进行测序鉴定。13 青岛大学硕士学位论文2.1.11重组质粒DNA的大量提取1）将高压灭菌后的1LLB液体培养基，室温冷却至60°C以下后，在无菌超净工作台上，加入100mg/mL的氨苄青霉素500µL，用灭菌镊子夹无菌牙签挑取阳性单克隆菌落至冷却后的LB液体培养基中，放入37°C恒温摇床，200rpm，过夜培养16h。2）在无菌超净工作台内，用移液器取500µL菌液至无菌Eppendorf管中，加等体积甘油，充分混匀，做好标记，保存于-80°C冰箱中。3）其余菌液分批加入500mL离心瓶中，4°C，6000rpm离心10min。4）弃去上清液，用40mL溶液I充分的重悬细菌沉淀。5）加入80mL溶液II，用前新鲜配制，温和地上下颠倒混匀6~8次，直至溶液变得澄清透亮。6）加入40mL溶液III，上下颠倒6~8次，使混合液充分混匀出现白色絮状沉淀，静置10min分层，6000rpm离心15min。7）将含有质粒DNA的上清用四层灭菌纱布过滤至新的500mL离心瓶中，加入100mL异丙醇，再次上下颠倒混匀，6000rpm离心15min，弃去上清液，将含有DNA沉淀的离心瓶倒置在干净的纸巾上，使残余液体尽可能控干。8）加入3.8mL溶液I于离心瓶中，开盖将其放入恒温摇床中，25°C，100rpm摇30min，直至DNA沉淀完全溶解。9）称取5.5gCsCl于50mL离心管中，将DNA溶液与其充分混匀，加入100µL2%TritonX-100，300µLEB(10mg/mL)，置于脱色摇床上，最低旋转振荡15min，4°C，10000rpm离心10min。10）用移液器移取上清液于5mL超离管中，将其置于避光处过夜沉淀。11）45000rpm离心5h，用5mL注射器将含有DNA条带缓慢吸出于50mL离心管中，加入25mL1mol/LNaCl饱和正丁醇，上下颠倒充分混匀，萃取EB。12）静置分层后，再次用5mL注射器将底层溶液尽数吸出于新的50mL离心管中，再次加入25mL1mol/LNaCl饱和正丁醇，混匀，再次萃取EB，直至底层溶液颜色变淡至透明。13）用5mL注射器吸取含有DNA的下层溶液至新的50mL离心管中，加入与DNA溶液等体积的1mol/LNH4Ac，2.5倍体积的无水乙醇，10000rpm离心10min，缓慢弃掉上清液。14）加入10mL70%乙醇清洗DNA沉淀，10000rpm离心10min，弃掉上清，用滤纸尽可能的吸去上清液，将50mL离心管置于室温晾至半干。14 青岛大学硕士学位论文15）加入500µLTE缓冲溶液充分溶解DNA沉淀，将其等体积分成两份于1.5mL无菌Eppendorf管中。16）加入1/10体积的3MNaAc（pH5.2），以及2.5倍体积的无水乙醇，混匀，室温静置30min,13000rpm离心10min，弃掉上清液，用70%乙醇漂洗DNA沉淀，13000rpm离心10min，弃掉上清液。17）置于无菌超净工作台内晾至半干，根据DNA沉淀的大小加入适量的TE缓冲溶液溶解，将其放在DNA旋转混匀仪上旋转过夜溶解。18）使用微量紫外分光光度计Nanodrop2000检测重组质粒DNA的浓度，取1µLTE缓冲溶液作为空白对照，取1µL待测重组质粒DNA，测其浓度。2.1.12重组质粒DNA酶切线性化及纯化回收取10µg大量提取所得的重组质粒DNA做酶切线性化，其酶切体系如表8：表8100µL重组质粒DNA酶切线性化反应体系组分体积（µL）重组质粒DNA5.5AvrII1010×CutsmartBuffer10无菌双蒸水74.5各个组分添加完毕后，低速瞬时离心，使各个组分都沉淀在Eppendorf管底部，用移液器轻轻吹打混匀，置于37°C水浴锅中，过夜酶切消化。取5µL酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，90V，1h。在凝胶成像仪下观察，分析。检测其是否酶切完全，将剩余的酶切产物用QIAquickPCRPurificationKit试剂盒纯化回收（具体详细步骤详见2.1.5），并测定回收产物浓度用于细胞转染。2.2细胞实验2.2.1HEK293T和HEK293E细胞的复苏1）用镊子将HEK293T和HEK293E细胞的冻存管从液氮罐中取出，立即放入一只EP手套中，迅速放入37°C水浴锅中来回摇晃，使其快速融化，最多时间不超过5min。2）细胞融化完全后，1,000rpm，离心10min。15 青岛大学硕士学位论文3）弃掉细胞冻存液上清，尽可能的弃掉，以免细胞冻存液影响后期细胞生长，加入1mL含10％FBS的DMEM细胞培养基，轻轻吹打重悬细胞。4）用移液器将重悬细胞液移至含有10％FBS的15mLDMEM细胞培养基的100mm细胞培养皿中，十字交叉混匀，放于5%CO2，37°C培养箱培养。2.2.2HEK293T和HEK293E细胞的传代当HEK293T和HEK293E细胞生长至超过九成满时，倒掉DMEM细胞培养基，加2mLPBS轻轻摇晃清洗，弃掉PBS，加入1mL胰酶消化液轻轻摇晃使其覆盖消化整个皿的细胞1min。在光学显微镜下，观察到细胞被消化变圆成单个，弃掉胰酶消化液，加入2mL含有10％FBS的DMEM细胞培养基，用移液器将培养皿上的贴壁细胞全部吹打下来。取1/3或1/4的细胞（根据细胞生长速度决定去留比例）至新的100mm的细胞培养皿中，补齐含有10％FBS的DMEM细胞培养基至15mL，十字交叉混匀，放入5%CO2，37°C培养箱培养。2.2.3pEAK13CD5LS1TEVIgGFc表达质粒瞬时转染HEK293T细胞1）当HEK293T细胞生长至超过九成满时，重复上述步骤，取1/3或1/4吹打下来的细胞至15mL离心管中，添加含有10％FBS无抗生素的DMEM培养基至12mL，温和地上下颠倒混匀，用移液器将吹打均匀的细胞悬液添加至12孔细胞培养板，每孔1mL。2）24h后，当HEK293T细胞长到80%左右时，分别用脂质体(NeofectTMDNATransfectionReagent)转染PBS（阴性对照）、1.5µgpEAK13CD5LTEVIgGhFc质粒（阳性对照）及1.5µgpEAK13CD5LS1TEVIgGhFc重组质粒DNA（根据NeofectTMDNATransfectionReagent试剂盒提供的操作方法进行操作）。3）转染HEK293T细胞后，放于5%CO2，37°C培养箱中培养48h，取细胞培养液Westernblotting检测。2.2.4稳定表达细胞株的构建1）当HEK293E细胞生长至超过90%满时，重复上述步骤，取1/3或1/4吹打下来的细胞至15mL离心管中，添加含有10％FBS无抗生素的DMEM培养基至12mL，温和地上下颠倒混匀，用移液器将颠倒混匀的细胞悬液转移至6孔细胞培养板，每孔2mL。2）24h后，当HEK293E细胞长到80%左右时，分别用脂质体(NeofectTMDNATransfectionReagent)转染PBS（阴性对照）、1.5µg酶切线性化后的pEAK13CD5LS1TEVIgGhFc重组质粒DNA（根据NeofectTMDNATransfectionReagent试剂盒说明书提供的操作方法进行操作）。16 青岛大学硕士学位论文3）培养48h后，将细胞悬液以一传三的比例分至新的6孔细胞培养板，梯度加入终浓度分别为0.6µg/mL、0.8µg/mL、1.0µg/mL和1.2µg/mL的细胞筛选抗性抗生素药物嘌呤霉素，杀死未转入重组质粒DNA的细胞。4）培养72~96h后，阴性对照细胞全部死亡，将转入重组质粒DNA的细胞有存活的药物浓度所对应的阳性细胞进行扩增。5）将存活的细胞传至新的6孔细胞培养板中，继续加入筛选药物嘌呤霉素相应的浓度进行培养，随后逐步扩大培养至60mm细胞培养皿和100mm细胞培养皿。6）取小部分细胞用有限稀释法分单个细胞至96孔板细胞培养板中培养，培养10d左右，将96孔板置于光学显微镜下挑选克隆细胞株，进行检测，并逐级扩增培养。2.2.5细胞裂解1）按照配方配制细胞裂解液并预冷，使用前按1:100的比例加入蛋白酶抑制剂Cocktail及PMSF（终浓度为1mmol/L）。2）取培养48h后的小量转染细胞以及用嘌呤霉素筛选出的克隆细胞株先用PBS轻轻漂洗一次后，加入适量体积强RIPA裂解液，冰上裂解15min，使细胞尽可能破碎。3）用移液器将细胞裂解液与细胞碎片尽可能地吹打混匀，转移至一个新的Eppendorf管，4℃，10000rpm，离心10min。4）取上清液转移至一个新的Eppendorf管，加入等量的2×LoadingBuffer（含还原剂二巯基乙醇的Buffer），冰上放置10~30min后，95°C变性10min，用人源IgGFc抗体进行Westernblotting检测，或保存于-80°C冰箱。2.2.6Westernblotting检测1）按照配方配制8%分离胶和浓缩胶，灌制SDS-PAGE胶，从固定框架上取下灌胶玻璃板，并按照说明书将其组合装至电泳槽装置中，用1×电泳缓冲液灌满整个电泳槽。2）用2~20µL量程的移液器将20µL预先经过加热变性的蛋白样品依次加入到凝胶加样孔内，留一个孔加蛋白Marker，按照说明书正确连接电泳装置。3）接通电源，开始电泳，起始电压为80V，当溴酚兰染料进入到分离胶后，将电压调升至120V，继续电泳，溴酚兰染料全部跑出凝胶后继续再电泳15min，关闭电源(大约需要135min)。4）按照配方配制1L转膜缓冲液，置于4°C冷室中预冷。电泳结束后，切断电源打开电泳槽，将槽内的玻璃板取出，切去浓缩胶，将分离胶转移至预先已灌了部分转17 青岛大学硕士学位论文膜缓冲液的容器中。5）切一块大于分离胶的硝酸纤维素膜和两块滤纸，并将它们与两块海绵一起浸润于盛有转膜缓冲液的容器中。6）按照转膜槽说明书，依次在转膜黑色夹板上铺上海绵、滤纸、分离胶、硝酸纤维素膜、滤纸、海绵，最后用白色夹板覆盖夹紧，转膜，恒定电流300mA，时间120min。7）转膜结束后，弃去滤纸和SDS-PAGE胶，用镊子将硝酸纤维素膜小心夹取，浸泡于5％牛奶封闭液里，放在脱色摇床上室温封闭1h。8）按照1:8000的比例，用5％牛奶封闭液稀释含有HRP过氧化物酶的人源IgGFc抗体，置于脱色摇床上4°C孵育过夜，抗原抗体结合反应结束后，用TBST缓冲液清洗3次，每次10min。9）按照说明书配制Westernblotting化学发光显色液，并将其均匀滴加于膜结合蛋白的一侧，使膜充分的浸泡显色液，在20min内立即将膜放置在凝胶成像仪下显影，分析。2.2.7细胞冻存1）用嘌呤霉素筛选出的克隆细胞株传至100mm细胞培养皿内生长至80~90%以上满，用PBS清洗一遍，弃掉PBS。2）取胰酶消化液消化1min，弃去胰酶消化液，用含有10％FBS的DMEM细胞培养基将细胞吹打下来，成单个细胞。3）用移液器移取至无菌的2mL离心管中，1000rpm，离心10min。4）弃去上清，加入10%DMSO和90%FBS细胞冻存液重悬成细胞悬液，做好标记。5）用棉花将冻存管包裹到一定厚度后，用塑料橡胶手套包裹棉花球，放入-80°C冰箱保存（24h后，转移至液氮罐，可长期保存在液氮）。2.2.8蛋白纯化S1-Fc融合蛋白采用ÄKTAavant蛋白质快速纯化仪器和ProteinA蛋白亲和层析柱进行纯化。1）收集稳定表达克隆细胞株培养48h的细胞培养液，共收集10d，4°C，4500rpm离心30min。2）过滤：将收集的细胞培养液用0.45µM滤膜进行过滤。3）纯化：将过滤细胞培养液经过ÄKTAavant蛋白质快速纯化仪器，使用Protein18 青岛大学硕士学位论文A蛋白亲和层析柱，（按照GE医疗集团提供的产品说明书）进行蛋白纯化。4）浓缩：将纯化所得的样品中加入终浓度为1.0mmol/L的PMSF与DTT，转移至超滤管（10kD）。4°C，4000rpm离心1h，期间更换PBS3次。5）当蛋白纯化样品浓缩至小于1mL时,取少量样品跑SDS-PAGE胶进行考马斯亮蓝染色与Westernblotting鉴定。6）取小量蛋白样品用BCA法来测定蛋白浓度，蛋白样品保存于-80°C冰箱备用。2.2.9BCA法测定蛋白质浓度BCA法测定蛋白质浓度按照北京天根生化科技有限公司购买的BCA试剂盒提供的说明书操作。1）蛋白（BSA）标准品的稀释：将4mg/mLBSA标准溶液按照BSA标准浓度配制表用PBS稀释成终浓度分别为2000µg/mL、1500µg/mL、1000µg/mL、750µg/mL、500µg/mL、250µg/mL、125µg/mL、25µg/mL和0µg/mL。2）BCA工作液的配制：BCA试剂A与BCA试剂B按照50:1比例，配制满足实验需求的BCA工作液，充分混匀，在尽可能短的时间内使用，避免长时间的放置后再使用。3）蛋白浓度检测：分别取25µL新鲜配制的不同终浓度的BSA标准品和不同待测蛋白样品加入到96孔板中，若待测蛋白样品较浓，则用BSA标准品稀释液即PBS稀释后再加，记录待测蛋白样品的体积。加入200µL新鲜配制BCA工作液于各实验孔中，敷上透明塑料薄膜，置于台式恒温振荡器上振荡2min，放入37°C培养箱30min，通过紫外分光光度计于562nm处的吸光度。通过BSA标准品的吸光度值作出标准曲线，按照记录的待测蛋白样品体积计算出重组S1-Fc融合蛋白。2.3动物实验1）取6～8周龄的BALB/C小鼠，共20只，随机分为4组，每组5只，分笼并做好标记。2）接种：第1组，每只小鼠后腿肌肉内侧注射100µg重组pEAK13CD5LS1TEVhIgGFc质粒；第2组，每只小鼠腹腔注射20µg重组S1-Fc融合蛋白与等体积的弗氏完全佐剂的混合物；第3组，每只小鼠腹腔注射20µg重组S1-Fc融合蛋白与等体积的弗氏完全佐剂的混合物，同时后腿肌肉内侧注射100µg重组pEAK13CD5LS1TEVhIgGFc质粒；第4组，小鼠腹腔注射200µL生理盐水作为对照组。4）每隔1周用同样剂量的样品再次接种，共接种3次，每次接种1周后，小鼠尾静脉取血，4°C，2000rpm，离心10min，分离血清并保存于-80°C冰箱中备用。19 青岛大学硕士学位论文2.4免疫实验2.4.1Westernblotting验证接种小鼠是否产生抗S1血清将通过不同接种方式获得的小鼠血清分别稀释1000倍和2000倍，以10pmol和1pmol重组S1-Fc融合蛋白作为抗原，通过Westernblotting检测接种小鼠血清中是否存在抗S1血清。以人源IgGFc抗体作为抗S1血清的阳性对照，埃博拉病毒GP1-Fc融合蛋白作为抗原的阴性对照（具体Westernblotting步骤参照2.2.6）。2.4.2ELISA检测抗S1血清滴度将保存在-80℃冰箱的小鼠血清置于冰盒上解冻后，使用ELISA对其进行检测。1）包被抗原：用PBS将重组S1-Fc融合蛋白抗原稀释成50µg/mL的包被液后，每孔100µL加入96孔酶标板，板子表面覆盖锡箔纸封闭，4°C冷室静置过夜。2）封闭：移去包被液，用PBS洗涤96孔酶标板3次，3min/次，加入pH7.4，5%BSA封闭液100µL/孔，封闭非特异性结合位点，板子表面覆盖锡箔纸封闭，室温放置2h，移去封闭液，用PBS洗涤96孔酶标板3次，3min/次。3）加入人源IgGFc抗体作为抗S1血清阳性对照，取接种生理盐水组小鼠的血清作为抗S1血清阴性对照，用pH7.4，含5%BSA的PBS稀释液稀释接种小鼠血清适当的倍数，100µL/孔，板子表面覆盖锡箔纸封闭，室温放置2h，移去样品，用PBS洗涤96孔酶标板3次，3min/次。4）加入用5%牛奶按照适当的比例稀释带有辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体，100µL/孔，板子表面覆盖锡箔纸封闭，室温放置2h，移去山羊抗小鼠IgG抗体，用PBS洗涤96孔酶标板3次，3min/次。5）显色：加入1×YMBELISASubstrateSolution，100µL/孔，室温避光显色反应5~10min，观察颜色变化。6）终止：加入2mol/LH2SO4，50µL/孔，观察溶液由蓝色逐渐转变成黄色。7）将96孔酶标板放置于酶标仪测定450nm波长处测定吸光度值，630nm作为参考波长。组间比较采用F检验进行统计学分析，以P<0.05为差异显著，有统计学意义，采用GraphPadPrism7软件作图。20 青岛大学硕士学位论文3实验结果3.1MERS-CoV刺突蛋白（S）编码基因序列的密码子优化MERS-CoVS蛋白基因序列来源于NCBI基因数据库，S基因编码1353个氨基酸，大小为4059bp，目的基因S1编码751个氨基酸，大小为2253bp。具体的S1蛋白序列及在S蛋白中的位置(下划线部分为S1蛋白序列)如下：ProteinID：S-KF961222.1(1353aa)MIHSVFLLMFLLTPTESYVDVGPDSVKSACIEVDIQQTFFDKTWPRPIDVSKADGIIYPQGRTYSNITITYQGLFPYQGDHGDMYVYSAGHATGTTPQKLFVANYSQDVKQFANGFVVRIGAAANSTGTVIISPSTSATIRKIYPAFMLGSSVGNFSDGKMGRFFNHTLVLLPDGCGTLLRAFYCILEPRSGNHCPAGNSYTSFATYHTPATDCSDGNYNRNASLNSFKEYFNLRNCTFMYTYNITEDEILEWFGITQTAQGVHLFSSRYVDLYGGNMFQFATLPVYDTIKYYSIIPHSIRSIQSDRKAWAAFYVYKLQPLTFLLDFSVDGYIRRAIDCGFNDLSQLHCSYESFDVESGVYSVSSFEAKPSGSVVEQAEGVECDFSPLLSGTPPQVYNFKRLVFTNCNYNLTKLLSLFSVNDFTCSQISPAAIASNCYSSLILDYFSYPLSMKSDLSVSSAGPISQFNYKQSFSNPTCLILATVPHNLTTITKPLKYSYINKCSRLLSDDRTEVPQLVNANQYSPCVSIVPSTVWEDGDYYRKQLSPLEGGGWLVASGSTVAMTEQLQMGFGITVQYGTDTNSVCPKLEFANDTKIASQLGNCVEYSLYGVSGRGVFQNCTAVGVRQQRFVYDAYQNLVGYYSDDGNYYCLRACVSVPVSVIYDKETKTHATLFGSVACEHISSTMSQYSRSTRSMLKRRDSTYGPLQTPVGCVLGLVNSSLFVEDCKLPLGQSLCALPDTPSTLTPRSVRSVPGEMRLASIAFNHPIQVDQLNSSYFKLSIPTNFSFGVTQEYIQTTIQKVTVDCKQYVCNGFQKCEQLLREYGQFCSKINQALHGANLRQDDSVRNLFASVKSSQSSPIIPGFGGDFNLTLLEPVSISTGSRSARSAIEDLLFDKVTIADPGYMQGYDDCMQQGPASARDLICAQYVAGYKVLPPLMDVNMEAAYTSSLLGSIAGVGWTAGLSSFAAIPFAQSIFYRLNGVGITQQVLSENQKLIANKFNQALGAMQTGFTTTNEAFQKVQDAVNNNAQALSKLASELSNTFGAISASIGDIIQRLDVLEQDAQIDRLINGRLTTLNAFVAQQLVRSESAALSAQLAKDKVNECVKAQSKRSGFCGQGTHIVSFVVNAPNGLYFMHVGYYPSNHIEVVSAYGLCDAANPTNCIAPVNGYFIKTNNTRIVDEWSYTGSSFYAPEPITSLNTKYVAPQVTYQNISTNLPPPLLGNSTGIDFQDELDEFFKNVSTSIPNFGSLTQINTTLLDLTYEMLSLQQVVKALNESYIDLKELGNYTYYNKWPWYIWLGFIAGLVALALCVFFILCCTGCGTNCMGKLKCNRCCDRYEEYDLEPHKVHVH通过对编码序列优化后合成如下的cDNA序列（4080bp）：ggatccgccaccATGATCCACAGCGTGTTCCTGCTGATGTTCCTGCTGACCCCTACAGAGAGCTACGTGGACGTGGGACCAGATAGCGTGAAGAGCGCTTGCATCGAGGTGGACATCCAGCAGACCTTCTTCGACAAGACTTGGCCCCGGCCTATTGACGTGTCCAAGGCCGACGGCATCATCTACCCTCAGGGCCGGACCTACAGCAACATCACCATCACCTACCAGGGCCTGTTCCCTTACCAGGGAGACCACGGCGACATGTACGTGTACTCAGCCGGACACGCCACAGGAACAACCCCTCAGAAGCTGTTCGTGGCCAACTACAGCCAGGACGTGAAGCAGTTCGCCAACGGCTTCGTCGTGAGGATCGGAGCAGCCGCCAATTCTACAGGCACAGTGATCATCAGCCCTAGCACCAGCGCCACCATCAGGAAGATCTACCCCGCCTTCATGCTGGGCTCTTCCGTGGGCAACTTCAGCGACGGCAAGATGGGCCGGTTCTTCAACCACACCCTGGTGCTGCTGCCAGACGGTTGCGGAACACTGCTGAGGGCCTTCTATTGCATCCTGGAGCCCAGGAGCGGCAATCATTGTCCAGCCGGCAACAGCTACACCAGCTTCGCCACCTACCACACCCCAGCTACCGATTGCAGCGACGGCAACTACAACCGGAACGCCAGCCTGAACAGCTTCAAGGAGTACTTCAACCTGCGGAATTGCACCTTCATGTACACCTACAACATCACCGAGGACGAGATCCTGGAGTGGTTCGGCATCACCCAGACAGCTCAGGGCGTGCACCTGTTCAGCAGCAGATACGTGGACCTGTACGGCGGCAACATGTTCCAGTTCGCCACACTGCCCGTGTACGACACCATCAAGTACTACAGCATCATCCCCCACAGCATCCGGAGCATCCAGAGCGACAGAAAGGCTTGGGCCGCCTTCTACGTGTACAAGCTGCAGCCTCTGACCTTCCTGCTGGACTTCAGCGTGGACGGATACATCAGGAGGGCCATCGATTGCGGCTTCAACGACCTGAGCCAGCTGCATTGCAGCTACGAGAGCTTCGACGTGGAGAGCGGAGTGTACAGCGTGTCCAGCTTCGAGGCCAAGCCTTCAGGAAGCGTGGTGGAACAGGCCGAAGGAGTGGAGT21 青岛大学硕士学位论文GCGACTTCTCTCCTCTGCTGAGCGGCACCCCTCCCCAGGTGTACAACTTCAAGCGGCTGGTGTTCACCAATTGCAACTACAACCTGACCAAGCTGCTGAGCCTGTTCTCCGTGAACGACTTCACTTGCAGCCAGATCAGCCCAGCCGCCATTGCCAGCAATTGCTACAGCAGCCTGATCCTGGACTACTTCAGCTACCCCCTGAGCATGAAGAGCGACCTGAGCGTGTCCAGCGCAGGCCCCATCAGCCAGTTCAACTACAAGCAGAGCTTCAGCAACCCCACTTGCCTGATCCTGGCCACAGTGCCTCACAACCTGACCACAATCACCAAGCCCCTGAAGTACAGCTACATCAACAAGTGCAGCAGGCTGCTGAGCGACGACAGAACCGAAGTGCCTCAGCTGGTGAACGCCAACCAGTACAGCCCTTGCGTGTCCATCGTGCCATCTACCGTGTGGGAGGACGGTGACTATTACAGGAAGCAGCTGAGCCCTCTGGAGGGAGGAGGATGGCTGGTGGCTTCAGGAAGCACAGTGGCTATGACCGAGCAGCTGCAGATGGGATTCGGCATCACCGTGCAGTACGGCACCGATACCAACAGCGTCTGCCCCAAGCTGGAGTTCGCTAACGACACCAAGATCGCCAGCCAGCTGGGCAATTGCGTGGAGTACAGCCTGTACGGCGTGAGCGGAAGGGGCGTGTTCCAGAATTGCACCGCAGTGGGCGTGAGACAGCAGAGATTCGTCTACGACGCCTACCAGAACCTCGTGGGATACTACAGCGACGACGGCAACTACTACTGCCTGAGAGCTTGCGTGTCCGTGCCAGTGTCAGTGATCTACGACAAGGAGACCAAGACCCACGCCACACTGTTCGGATCAGTGGCTTGCGAGCACATCAGCAGCACCATGAGCCAGTACAGCAGAAGCACCCGGAGCATGCTGAAGAGGAGGGATAGCACCTACGGCCCTCTGCAGACACCAGTGGGTTGCGTGCTGGGACTGGTGAACTCTAGCCTGTTCGTGGAGGATTGCAAGCTGCCCCTGGGACAGAGTCTCTGCGCTCTGCCAGACACACCTAGCACCCTGACCCCTAGAAGCGTGAGAAGCGTGCCAGGAGAGATGAGGCTGGCCAGCATCGCCTTCAACCACCCCATCCAGGTGGACCAGCTGAACAGCAGCTACTTCAAGCTGAGCATCCCCACCAACTTCAGCTTCGGCGTGACCCAGGAGTACATCCAGACCACCATCCAGAAGGTCACCGTCGACTGCAAGCAGTACGTCTGCAACGGCTTCCAGAAGTGCGAGCAGCTGCTGAGGGAGTACGGCCAGTTTTGCAGCAAGATCAACCAGGCCCTGCACGGAGCTAACCTGAGACAGGACGACAGCGTGCGGAACCTGTTCGCCAGCGTGAAGAGCAGCCAGTCTTCTCCTATCATCCCCGGCTTCGGCGGAGACTTCAACCTGACACTGCTGGAGCCCGTGTCCATCTCTACAGGCAGCAGAAGCGCTAGAAGCGCCATCGAGGACCTGCTGTTCGACAAGGTCACCATCGCCGACCCAGGATATATGCAGGGCTACGACGATTGCATGCAGCAGGGACCAGCCAGCGCCAGGGACCTGATTTGCGCCCAGTACGTGGCAGGATACAAGGTGCTGCCCCCTCTGATGGACGTGAACATGGAGGCCGCTTACACCAGCAGCCTGCTGGGAAGCATTGCAGGAGTGGGTTGGACAGCCGGACTGAGCTCTTTTGCCGCCATCCCTTTCGCCCAGAGCATCTTCTACCGGCTGAACGGCGTGGGAATTACCCAGCAGGTGCTGAGCGAGAACCAGAAGCTGATCGCCAACAAGTTCAACCAGGCCCTGGGCGCTATGCAGACAGGATTCACCACCACCAACGAGGCCTTCCAGAAGGTGCAGGACGCCGTGAACAACAACGCCCAGGCTCTGTCTAAGCTGGCCAGCGAGCTGAGCAACACCTTTGGCGCCATCAGCGCCTCTATCGGCGACATCATCCAGAGGCTGGACGTGCTGGAACAGGACGCTCAGATCGACAGGCTGATCAACGGCAGGCTGACCACACTGAACGCCTTCGTGGCTCAGCAGCTCGTCAGATCCGAGTCTGCAGCTCTGAGCGCTCAGCTGGCCAAAGACAAGGTCAACGAGTGCGTGAAGGCCCAGTCCAAGAGAAGCGGCTTTTGCGGCCAGGGAACCCACATCGTGTCCTTCGTCGTGAACGCCCCTAACGGCCTGTACTTCATGCACGTGGGCTACTACCCCAGCAACCACATCGAGGTGGTGTCAGCTTACGGCCTCTGCGACGCAGCCAATCCTACAAATTGCATCGCCCCCGTGAACGGCTACTTCATCAAGACCAACAACACCCGGATCGTGGACGAGTGGAGCTACACAGGGTCTTCCTTCTACGCCCCAGAGCCTATCACCAGCCTGAACACCAAATACGTGGCCCCCCAGGTCACCTACCAGAACATCAGCACCAACCTGCCCCCTCCTCTGCTGGGAAATAGCACCGGCATCGACTTCCAGGACGAGCTGGACGAGTTCTTCAAGAACGTGTCCACCAGCATCCCCAACTTCGGCAGCCTGACCCAGATCAACACCACCCTGCTGGACCTGACCTACGAGATGCTGAGCCTGCAGCAGGTCGTGAAGGCCCTGAACGAGAGCTACATCGACCTGAAGGAGCTGGGCAACTACACCTACTACAACAAGTGGCCTTGGTACATTTGGCTGGGCTTTATCGCAGGACTGGTGGCTCTGGCCCTCTGCGTGTTCTTCATCCTCTGTTGCACCGGCTGCGGAACCAATTGCATGGGCAAGCTCAAGTGCAACCGCTGTTGCGACCGCTACGAGGAGTACGACCTGGAACCCCACAAGGTGCACGTGCACTGAgaattcMERS-CoVS1蛋白表达序列结构图示如下：22 青岛大学硕士学位论文图1MERS-CoVS1蛋白表达序列结构图示如上图所示，拟纯化的MERS-CoVS1蛋白表达序列包含了完整的受体结合结构域（RBD），并用CD5L信号肽代替了原来的信号肽CP以助于目的蛋白的分泌表达，有利于后期的蛋白纯化。3.2MERS-CoVS1亚基基因片段PCR扩增以人工合成的MERS-CoVS基因为模板，通过S基因中MERS-CoVS1亚基基因的cDNA编码序列设计出一对引物，通过PCR技术扩增S1目的基因。经过1%琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2所示。图2MERS-CoVS1基因的PCR扩增a,DNAMarker1kB;b,MERS-CoVSPCR扩增产物;c,MERS-CoVS1PCR扩增产物23 青岛大学硕士学位论文结果表明，在2000bp左右出现一条明显的扩增亮带为S1目的片段。3.3pEAK13CD5LTEVIgGFc表达载体与S1基因片段的酶切纯化回收pEAK13CD5LSSU72TEVIgGFc质粒经限制性核酸内切酶NheI和BamHI双酶切后，经琼脂糖凝胶电泳，结果如下图。图3表达载体pEAK13CD5LTEVIgGFc的酶切以及S1基因片段的纯化回收鉴定A:a,pEAK13CD5LSSU72TEVIgGFc质粒酶切产物;b,DNAMarker2000;B:a,DNAMarker1kB;b,DNAMarker2000;c,pEAK13CD5LTEVIgGFc表达载体纯化回收产物;d,S基因片段纯化回收产物；e,S1基因片段纯化回收产物图3A结果表明，产生两条条带，大的DNA片段与表达载体pEAK13CD5LTEVIgGFc大小一致，小的DNA片段大小在500~750bp之间符合SSU72基因大小，表明限制性核酸内切酶NheI和BamHI已成功将表达载体pEAK13CD5LTEVIgGFc与SSU72基因片段酶切开。使用薄型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收经限制性核酸内切酶NheI和BamHI双酶切消化的S1目的基因和pEAK13CD5LTEVhIgGFc真核表达载体，结果如图3B。3.4小量提取pEAK13CD5LS1TEVIgGFc重组质粒鉴定按照质粒小提试剂盒说明书提取重组质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳，结果如图4所示。24 青岛大学硕士学位论文图4小量提取重组质粒DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定a,DNAMarker1kB;b,DNAMarker2000;c,pEAK13CD5LS1TEVIgGFc重组质粒结果表明，重组质粒pEAK13CD5LS1TEVIgGFc基因片段大小大于1kB，与预期中的大小相符合。3.5重组质粒的双酶切验证为了检测MERS-CoVS1亚基基因与真核表达载体pEAK13CD5LTEVIgGFc是否连接成功，对重组质粒pEAK13CD5LS1TEVIgGFc进行限制性内切酶NheI和BamHI双酶切验证。双酶切产物经过1%琼脂糖凝胶电泳检测结果如图5：25 青岛大学硕士学位论文图5重组质粒pEAK13CD5LS1TEVIgGFc双酶切验证a,pEAK13CD5LS1TEVIgGFc/NheI,BamHI;b,DNAMarker15000+2000；从图5可以看出，重组质粒pEAK13CD5LS1TEVIgGFc经限制性核酸内切酶双酶切消化之后，出现了两条明亮的条带，10000~15000bp之间出现的明亮条带为pEAK13CD5LTEVIgGFc真核表达载体，2000~2500bp之间出现的明亮条带为S1目的基因。利用限制性核酸内切酶双酶切重组质粒DNA，进一步验证了S1目的基因已经连接到真核表达载体。3.6重组质粒序列分析利用DNAMAN对重组质粒pEAK13CD5LS1TEVIgGFc小量提取的测序结果进行DNA序列比对(图6)，结果表明S1目的基因序列大小准确。S1目的基因编码751个氨基酸，为2253bp,通过蛋白分子量计算器（http://www.sciencegateway.org/tools/proteinmw.htm），估计其蛋白分子量大小为82kD。26 青岛大学硕士学位论文27 青岛大学硕士学位论文28 青岛大学硕士学位论文29 青岛大学硕士学位论文图6重组质粒pEAK13CD5LS1TEVIgGFcDNA序列的测序结果比对30 青岛大学硕士学位论文3.7大量提取pEAK13CD5LS1TEVIgGFc重组质粒鉴定将DNA序列比对正确的阳性克隆菌株按照碱裂解法的步骤大量提取提取pEAK13CD5LS1TEVIgGFc重组质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳，结果如下：图7大量提取重组质粒pEAK13CD5LS1TEVIgGFc鉴定a,DNAMarker1kB;b,DNAMarker2000;c,pEAK13CD5LS1TEVIgGFc重组质粒图7中琼脂糖凝胶电泳结果表明，重组质粒pEAK13CD5LS1TEVIgGFc基因片段大小与预期中的大小相符，大于1kB，且条带明亮。3.8重组表达质粒瞬时转染HEK293T后的蛋白表达鉴定将重组质粒pEAK13CD5LS1TEVIgGFc、阳性对照和阴性对照转染至HEK293T细胞中，转染48h后，收集各组细胞上清，通过Westernblotting方法用抗人IgGFc抗体检测重组融合蛋白表达情况，结果如图8所示。31 青岛大学硕士学位论文图8pEAK13CD5LS1TEVIgGFc表达质粒转染293T细胞后蛋白分泌表达检测结果a,PBS细胞上清液（阴性对照）;b,pEAK13CD5LTEVIgGFc细胞培养液（阳性对照）;c,pEAK13CD5LS1TEVIgGFc细胞培养液；根据Westernblotting结果表明，转染PBS的阴性对照在细胞培养液中不表达，相比不含S1目的基因的重组表达载体的阳性对照pEAK13CD5LTEVIgGFc细胞培养液在40kD附近出现一条很明显的条带，这与之前预测的Fc标签的大小相吻合。转染pEAK13CD5LS1TEVIgGFc重组表达质粒能在哺乳动物细胞HEK293T细胞培养液中分泌表达重组S1-Fc融合蛋白，且表达大小正确。以上结果提示，重组质粒pEAK13CD5LS1TEVIgGFc转染的细胞株可以用于细胞扩增培养。3.9重组质粒的酶切线性化验证用限制性核酸内切酶AvrII37℃过夜酶切pEAK13CD5LS1TEVhIgGFc重组表达质粒，酶切产物经过1%琼脂糖凝胶电泳检测结果如下：32 青岛大学硕士学位论文图9重组质粒酶切线性化验证a,DNAMarker15000+2000;b,pEAK13CD5LS1TEVIgGFc,AvrII图9结果表明，pEAK13CD5LS1TEVhIgGFc重组质粒酶切消化后出现完全线性化,pEAK13CD5LTEVhIgGFc载体与切下条带已完全分开，用QIAquickPCRPurificationKit试剂盒进行纯化回收酶切产物，使用紫外分光光度计Nanodrop2000测定纯化回收后的酶切产物浓度为165.9ng/µL。3.10稳定表达细胞株的筛选鉴定用酶切线性化pEAK13CD5LS1TEVIgGFc重组表达质粒转染HEK293E细胞，并加入0.6µg/mL、0.8µg/mL、1.0µg/mL和1.2µg/mL不同终浓度的嘌呤霉素筛选出构建稳定表达的克隆细胞株。稳定表达重组S1-Fc融合蛋白的细胞株分泌表达检测结果如下：33 青岛大学硕士学位论文图10不同细胞株蛋白分泌表达检测a,0.6µg/mL嘌呤霉素筛选出的细胞株的细胞培养液;b,0.8µg/mL嘌呤霉素筛选出的细胞株的细胞培养液;c,1.0µg/mL嘌呤霉素筛选出的细胞株的细胞培养液;d,1.2µg/mL嘌呤霉素筛选出的细胞株的细胞培养液用不同浓度的嘌呤霉素加入细胞中培养72~96h后，阴性对照细胞全部死亡，在光学显微镜观察下加入0.6µg/mL浓度的培养孔中细胞生长密集状态良好只出现极少量的死亡细胞，0.8µg/mL浓度的培养孔中细胞出现小部分的死亡细胞，1.0µg/mL浓度的培养孔中细胞出现大量的死亡细胞，1.2µg/mL浓度的培养孔中细胞几乎全部死亡只出现个别极少量的贴壁细胞。由Westernblotting结果可知，其中0.8µg/mL嘌呤霉素筛选得到的细胞株表达量最高，重组S1-Fc融合蛋白表达量达到4.5mg/L，在以后的蛋白表达过程中，使用0.8µg/mL筛选得到的细胞株进行细胞扩增。3.11S1-Fc融合蛋白纯化后PAGE胶检测结果将稳定表达S1-Fc融合蛋白的HEK293E细胞株，使用普通的150mm培养皿大量扩增并传代培养。收集稳定表达S1-Fc融合蛋白的HEK293E细胞培养液，用ProteinA亲和层析柱纯化的重组S1-Fc融合蛋白，纯化后的蛋白样品用超滤管进行浓缩，取纯化和浓缩后的蛋白样品进行SDS-PAGE胶染色，结果如下：34 青岛大学硕士学位论文图11S1-Fc融合蛋白纯化浓缩后SDS-PAGE胶的考马斯亮蓝染色结果a,ProteinMarker;b,纯化的S1-Fc融合蛋白;c,浓缩的S1-Fc融合蛋白;d,超滤管洗涤液从结果中可以看出，纯化所得的蛋白主要为完整的重组S1-Fc融合蛋白，有极小部分蛋白发生降解。使用本方法共计表达纯化了100mg的重组S1-Fc融合蛋白。3.12Westernblotting验证抗S1血清的特异性将分别接种了重组pEAK13CD5LS1TEVhIgGFc质粒、重组S1-Fc融合蛋白、重组S1-Fc融合蛋白和重组pEAK13CD5LS1TEVhIgGFc质粒获得的小鼠血清，按照1:1000和1:2000比例稀释，通过Westernblotting分别检测其与10pmol和1pmol纯化的S1-Fc融合蛋白抗原的反应情况，其结果如图12：35 青岛大学硕士学位论文图12Westernblotting验证接种小鼠S1血清对S1-Fc抗原的特异性A：分别从接种了重组pEAK13CD5LS1TEVhIgGFc质粒、重组S1-Fc融合蛋白、重组S1-Fc融合蛋白和重组pEAK13CD5LS1TEVhIgGFc质粒的小鼠获取抗S1血清在1:1000的稀释条件下，检测10pmol和1pmol重组S1-Fc蛋白抗原的特异性；B：分别从接种了重组pEAK13CD5LS1TEVhIgGFc质粒、重组S1-Fc融合蛋白、重组S1-Fc融合蛋白和重组pEAK13CD5LS1TEVhIgGFc质粒的小鼠获取抗S1血清在1:2000的稀释条件下，检测10pmol和1pmol重组S1-Fc蛋白抗原的特异性；C：在1:1000的稀释条件下，用从接种重组S1-Fc融合蛋白的小鼠获取的抗S1血清检测10pmolS1-Fc融合蛋白和10pmol埃博拉GP1-Fc抗原的特异性，GP1-Fc大约170kD（左），用IgGFc抗体检测10pmolS1-Fc和1pmolS1-Fc抗原的特异性（中）和用S1-Fc蛋白免疫获得的抗S1血清检测10pmolS1蛋白和10pmolS1-Fc抗原的特异性（右）。结果所示，在1:1000的稀释条件下，通过Westernblotting验证接种重组S1-Fc融合蛋白及同时接种S1-Fc融合蛋白和重组pEAK13CD5LS1TEVhIgGFc质粒的小鼠血清能明显与10pmol和1pmol的S1-Fc融合蛋白抗原发生反应，并产生了明显的反应条带，但只接种了重组pEAK13CD5LS1TEVhIgGFc质粒的小鼠血清能与10pmol重组S1-Fc融合蛋白发生反应产生清晰的反应条带，但与1pmolS1-Fc融合蛋白反应较弱，其反应条带模糊不清（图12A）。接种重组S1-Fc融合蛋白及同时接种重组S1-Fc融合蛋白和重组pEAK13CD5LS1TEVhIgGFc质粒的小鼠血清，在1:2000稀释条件下，可以明显与10pmol的S1-Fc融合蛋白发生反应且反应条带清晰，但与1pmol重组S1-Fc融合蛋白反应相当微弱，几乎看不到反应条带，而仅接种了重组pEAK13CD5LS1TEVhIgGFc质粒小鼠血清，在1：2000的稀释条件下，只能与10pmol36 青岛大学硕士学位论文S1-Fc融合蛋白发生轻微反应，其反应条带模糊不清，而与1pmol重组S1-Fc融合蛋白的反应条带完全检测不到（图12B）。图12C结果显示，在1:1000的稀释条件下，接种重组S1-Fc融合蛋白的小鼠血清能够与重组S1-Fc融合蛋白反生反应，且反应条带明显，而无法与埃博拉GP1-Fc融合蛋白发生反应，未检测到反应条带。而在相同条件下，用S1-Fc蛋白免疫获得的抗S1血清能够分别与10pmolS1蛋白和10pmolS1-Fc融合蛋白发生反应。在1:1000的稀释条件下，IgGFc抗体能够明显检测到10pmol和1pmol的重组S1-Fc融合蛋白，反应条带清晰明显。通过Westernblotting验证结果显示，3种不同接种方法均可以诱导小鼠产生抗S1血清，但不同的方法诱导产生的抗S1血清浓度存在差异，且接种小鼠体内产生了特异性抗S1血清，只能与S1-Fc融合蛋白发生反应。3.13ELISA检测小鼠抗S1血清的高滴度小鼠分别接种重组pEAK13CD5LS1TEVhIgGFc质粒、重组S1-Fc融合蛋白、重组S1-Fc融合蛋白和重组pEAK13CD5LS1TEVhIgGFc质粒以及生理盐水后定期取血并分离血清，其中以接种生理盐水的小鼠血清作为阴性对照，以纯化的重组S1-Fc融合蛋白作为抗原，用ELISA检测接种小鼠血清中抗S1血清的滴度，其检测结果如下：0.20ControlDNA****0.15Protein****450DNA+ProteinOD0.10********0.05***0.0007142128Dayspostvaccination图13ELISA检测不同接种时间小鼠的抗S1血清滴度（*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001）从图13可以看出，接种重组质粒pEAK13CD5LS1TEVhIgGFc接种7d后，小鼠血清中均未检测出抗S1血清，接种21d后，出现了极少量抗S1血清，但浓度均未达到显著水平，直到接种28d后，小鼠血清中才出现了显著高于对照组的抗S1血清浓度（P<0.001）。接种重组S1-Fc融合蛋白及同时接种重组S1-Fc融合蛋白和重组质粒pEAK13CD5LS1TEVhIgGFc两种方法均能够诱导小鼠产生高水平的抗S1血清。初次37 青岛大学硕士学位论文接种7d后，均出现了明显的抗S1血清，接种21d后，这两种接种方法均诱导小鼠产生了高滴度的抗S1血清，其抗S1血清浓度显著高于对照组（P<0.0001）。接种28d后，两组接种小鼠血清中抗S1血清滴度明显达到了极高的水平，极显著的高于对照组（P<0.0001）。接种重组S1-Fc融合蛋白与联合接种重组S1-Fc融合蛋白和重组质粒pEAK13CD5LS1TEVhIgGFc两组之间的数值未见显著差异，故而两者的接种效果相同，但该两种接种方法产生的抗S1血清滴度均明显高于只接种重组pEAK13CD5LS1TEVhIgGFc质粒的数值。因此，在短期内为达到高水平抗S1血清应答，综合考虑成本等因素，接种重组S1-Fc融合蛋白的效果较好。38 青岛大学硕士学位论文4结论4.1成功构建重组质粒pEAK13CD5LS1TEVhIgGFc通过优化编码序列，加入蛋白分泌表达引导序列以及便于后期纯化的融合Fc标签，经过PCR扩增，限制性双酶切，目的基因与pEAK13CD5LTEVIgGFc载体的连接，质粒提取鉴定等步骤成功构建pEAK13CD5LS1TEVhIgGFc重组质粒。4.2在人源HEK293E细胞中成功表达了S1-Fc融合蛋白将脂质体与pEAK13CD5LS1TEVhIgGFc重组质粒按比例转染HEK293E细胞，用不同终浓度的细胞筛选抗性抗生素药物嘌呤霉素，成功筛选出稳定表达细胞株，并通过ProteinA亲和层析柱纯化获得了100mg高浓度的重组S1-Fc融合蛋白。4.3Westernblotting和ELISA检测到小鼠抗血清对重组S1-Fc融合蛋白具高度特异性获得了接种重组S1-Fc融合蛋白、接种重组质粒pEAK13CD5LS1TEVhIgGFc以及共同接种重组S1-Fc融合蛋白和重组质粒pEAK13CD5LS1TEVhIgGFc小鼠的抗血清，三种不同接种方法均可以诱导小鼠产生抗血清，但不同的接种方法产生的抗血清浓度存在差异。接种S1-Fc融合蛋白以及共同接种重组S1-Fc融合蛋白和重组质粒pEAK13CD5LS1TEVhIgGFc小鼠的抗S1血清水平显著高于只接种了重组质粒pEAK13CD5LS1TEVhIgGFc小鼠的抗S1血清水平。39 青岛大学硕士学位论文5讨论中东呼吸综合征病毒刺突蛋白（Spikes,S）是中东呼吸综合征病毒表面重要的四大结构蛋白之一。MERS-CoVS蛋白在该病毒的吸附和侵入其他靶细胞的过程中发挥着[15,17,18]重要作用，同时也是MERS-CoV疫苗研究的主要靶抗原。在感染过程中，MERS-CoV的S蛋白被切割成受体结合亚基S1和膜融合亚基S2两个部分，其三者[19-22]以三聚体的形式存在。MERS-CoVS1亚基含有与宿主细胞表面蛋白二肽基肽酶4[17,19,20,26]（DPP4）的受体结合的结构域（RBD），介导病毒与靶细胞的结合，从而引导MERS-CoV进入宿主细胞。MERS-CoVRBD可以选择性地结合包括人，骆驼，白鼬和蝙蝠等在内的不同宿主细胞的DPP4，MERS-CoV的易感性与宿主物种存在极大关[6,23,24]系，但其具体传播机制的谜底仍未解开，因此，有限的信息为MERS-CoV更深入的研究产生了局限性。随着分子生物学技术的快速发展，相应的生物制药，疫苗学，免疫学也随之迅速发展，而抗体、疫苗、多肽和重组蛋白等生物制品的需求也越来越广泛，对其要求也越来越精准，首先克隆载体的选择尤为重要，其决定了实验后期的诸多事项，再次许多病毒蛋白在原核生物和酵母体内表达量极低，必须在哺乳动物细胞中的才能达到高量表达的要求。哺乳动物细胞种类繁多，培养方式各异，培养条件严格，但其表达量高，蛋白的要求更精纯，因此，哺乳动物细胞的培养技术具有潜在意义。本文选择了通过序列优化，含有蛋白分泌表达引导序列以及加入了便于后期蛋白纯化的融合Fc标签的pEAK13CD5LTEVhIgGFc中间载体构建重组质粒，且选择了高表达量易转染的HEK293E贴壁细胞，进行大规模的培养，且快速的纯化了大量重组S1-Fc融合蛋白，为其他蛋白的表达纯化提供了参考。本文通过比较短期内接种重组S1-Fc融合蛋白、重组质粒pEAK13CD5LS1TEVhIgGFc以及二者联合接种小鼠的抗S1血清水平，证实三种接种方式均可诱导小鼠产生抗S1血清，接种重组S1-Fc融合蛋白组和联合接种重组S1-Fc融合蛋白和重组质粒pEAK13CD5LS1TEVhIgGFc组小鼠产生了高水平的抗S1血清，且明显高于只接种重组质粒pEAK13CD5LS1TEVhIgGFc组的小鼠的抗S1血清水平。其原因有可能是单纯的重组质粒接种小鼠后，小鼠体内并不存在质粒DNA的主动运输过程，即重组质粒不能主动进入细胞，而重组质粒必须输到细胞核内才能被转录成mRNA，进而诱导小鼠产生对该抗原蛋白的体液免疫和细胞免疫，小鼠体内合成抗原[25]蛋白需要一定时间过程。因此，短时间内DNA重组质粒接种小鼠所激发产生的免疫反应强度相对较弱，免疫保护效果也很微弱，在小型动物的试验中可能会检测到免疫反应，但会因实验动物体型的增大，而DNA接种的免疫效果会降低，尤其对人类以及[26]大动物的免疫实验。此外，DNA接种免疫存在一定的不安全性，DNA接种的导入有可能会发生基因整合，激活内源性原癌基因，或诱发染色体的不稳定性，产生遗传40 青岛大学硕士学位论文[27-29]性或致癌反应，该方法更适合在体外难以表达的蛋白，较多的适用于小型动物。而含有融合蛋白接种所获得小鼠抗体血清，结果显示短时间内产生体液免疫的免疫效果更为快速，其原因可能是本研究是将构建的重组质粒导入哺乳动物细胞，通过嘌呤霉素药物筛选出稳定表达的克隆细胞株，表达出大量的抗原蛋白，通过ÄKTAavant蛋白质快速纯化仪器和ProteinA亲和柱提纯，将获得的融合蛋白同弗氏完全佐剂充分混匀制得亚单位疫苗。该亚单位疫苗的免疫抗原纯度高，稳定好，可直接在体内产生体液免疫，且有弗氏完全佐剂辅助，大大地增强了其免疫效果，可用于需短期内产生抗体的免疫以及病原体难以培养或有潜在免疫病理作用的研究。蛋白质疫苗抗S1血清稀释1:2000时仍能够很好的检测到1pmol的S1-Fc融合蛋白，结果显示蛋白疫苗产生体液免疫的免疫效果更为快速，该蛋白质疫苗在MERSCoV研究中具有潜在的应用价值。在将来的研究过程中，还将继续尝试一下几个方面：1）大规模的哺乳动物细胞表达培养是一个比较大的工程，以期在以后的应用中逐步完善培养条件，获得更高的表达量。2）对实验小鼠进行重组质粒接种，延长其继续接种的间隔时间，检测其免疫反应情况。3）对MERS-CoVS1亚基进行杂交瘤实验，制作S1的单克隆抗体。41 青岛大学硕士学位论文参考文献[1]YusofMF,EltahirYM,SerhanWS,etal.PrevalenceofMiddleEastrespiratorysyndromecoronavirus(MERS-CoV)indromedarycamelsinAbuDhabiEmirate,UnitedArabEmirates[J].VirusGenes,2015,50(3):509-513．[2]ZakiAM,vanBoheemenS,BestebroerTM,etal．IsolationofanovelcoronavirusfromamanwithpneumoniainSaudiArabia[J].NewEnglandJournalofMedicine,2012,367(19):1814-1820．[3]GrootRJD,BakerSC,BaricRS,etal.MiddleEastrespiratorysyndromecoronavirus(MERS-CoV):announcementoftheCoronavirusStudyGroup[J].Journalofvirology,2013,87(14):7790-7792.[4]AssiriA,McGeerA,PerlTM,etal.HospitaloutbreakofMiddleEastrespiratorysyndromecoronavirus[J].NewEnglandJournalofMedicine,2013,369(5):407-416.[5]YangY,LiuC,DuL,etal.Twomutationswerecriticalforbat-to-humantransmissionofMiddleEastrespiratorysyndromecoronavirus[J].Journalofvirology,2015,89(17):9119-9123.[6]YangY,DuL,LiuC,etal.ReceptorusageandcellentryofbatcoronavirusHKU4provideinsightintobat-to-humantransmissionofMERScoronavirus[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2014,111(34):12516-12521.[7]MohdHA,Al-TawfiqJA,MemishZA.MiddleEastRespiratorySyndromeCoronavirus(MERS-CoV)originandanimalreservoir[J].Pathogens＆GlobalHealth,2016,13(1):87-90.[8]SmitsSL,RajVS,PasSD,etal.ReliabletypingofMERS-CoVvariantswithasmallgenomefragment[J].JournalofClinicalVirology,2015,(64):83-87.[9]WerneryU,LauSK,WooPC.Genomicsandzoonoticinfections:MiddleEastrespiratorysyndrome[J].RevueScientifiqueEtTechnique,2016,35(1):191-202.[10]CottonM,LamTT,WatsonSJ,etal.Full-genomedeepsequencingandphylogeneticanalysisofnovelhumanbetacoronavirus[J].EmergingInfectiousDiseases,2013,19(5):736-742.[11]LiW,MooreMJ,VasilievaN,etal.Angiotensin-convertingenzyme2isafunctionalreceptorfortheSARScoronavirus[J].Nature,2003,426(6965):450-454.[12]RajVS,MouH,SmitsSL,etal.Dipeptidylpeptidase4isafunctionalreceptorfortheemerginghumancoronavirus-EMC[J].Nature,2013,495(7440):251-254.[13]LiF.Receptorrecognitionmechanismsofcoronaviruses:adecadeofstructuralstudies[J].Journalofvirology,2015,89(4):1954-1964.[14]LuG,HuY,WangQ,etal.MolecularbasisofbindingbetweennovelhumancoronavirusMERS-CoVanditsreceptorCD26[J].Nature,2013,500(7461):227-231.[15]ZhangN,JiangS,DuL.CurrentadvancementsandpotentialstrategiesinthedevelopmentofMERS-CoVvaccines[J].ExpertRevVaccines,2014,13(6):761-774.42 青岛大学硕士学位论文[16]DuL,ZhaoG,KouZ,etal.Identificationofareceptor-bindingdomainintheSproteinofthenovelhumancoronavirusMiddleEastrespiratorysyndromecoronavirusasanessentialtargetforvaccinedevelopment[J].Journalofvirology,2013,87(17):9939-9942.[17]SongF,FuXR,ProvaciaLB,etal.MiddleEastrespiratorysyndromecoronavirusspikeproteindeliveredbymodifiedvacciniavirusAnkaraefficientlyinducesvirus-neutralizingantibodies[J].Journalofvirology,2013,87(21):11950-11954.[18]ColemanCM,LiuYV,MuH,etal.Purifiedcoronavirusspikeproteinnanoparticlesinducecoronavirusneutralizingantibodiesinmice[J].Vaccine,2014,32(26):3169-3174.[19]LiF.Receptorrecognitionmechanismsofcoronaviruses:adecadeofstructuralstudies.Journalofvirology,2015,89(4):1954-1964.[20]LuG,HuY,WangQ,etal.MolecularbasisofbindingbetweennovelhumancoronavirusMERS-CoVanditsreceptorCD26[J].Nature,2013,500(7461):227-231.[21]GaoJ,LuG,QiJ,etal.StructureofthefusioncoreandinhibitionoffusionbyaheptadrepeatpeptidederivedfromtheSproteinofMiddleEastrespiratorysyndromecoronavirus[J].Journalofvirology,2013,87(24):13134-13140.[22]WangN,ShiX,JiangL,etal.StructureofMERS-CoVspikereceptorbindingdomaincomplexedwithhumanreceptorDPP4[J].CellResearch,2013,23(8):986-993.[23]BarlanA,ZhaoJ,SarkarMK,etal.ReceptorvariationandsusceptibilitytoMiddleEastrespiratorysyndromecoronavirusinfection[J].Journalofvirology,2014,88(9):4953-4961.[24]vanDoremalenN,MiazgowiczKL,Milne-PriceS,etal.HostspeciesrestrictionofMiddleEastrespiratorysyndromecoronavirusthroughitsreceptor,dipeptidylpeptidase4[J].Journalofvirology,2014,88(16):9220-9232.[25]WolffJA,MaloneRW,WilliamsP,etal.Directgenetransferintomousemuscleinvivo[J].Science,1990,2(17):1465-1468.[26]EganMA,IsraelZR.TheuseofcytokinesandchemokinesasgeneticadjuvantsforplasmidDNAvaccines[J].ClinicalandAppliedImmunologyReviews,2002,2(4-5):255-287.[27]PillingAM,HarmanRM,JonesSA,etal.Theassessmentoflocaltolerance,acutetoxicity,andDNAbiodistributionfollowingparticle-mediateddeliveryofaDNAvaccinetominipigs[J].Toxicologicpathology,2002,30(3):298-305[28]SchroderAR,ShinnP,ChenH,etal.HIV21integrationinthehumangenomefavorsactivegenesandlocalhotspots.Cell,2002,110(4):521-529.[29]LewinskiMK,BushmanFD.RetroviralDNAintegration—mechanismandconsequences[J].Advancesingenetics,2005,55:147-181.43 青岛大学硕士学位论文综述摘要中东呼吸综合征是2012年在沙特阿拉伯发现的一种能够引起急性呼吸系统障碍综合征的新兴人畜共患病。该病毒最终正式被确定为冠状病毒，并命名其为中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）。近年来，该病毒病例主要集中在中东地区，并以阿拉伯半岛为点向四周乃至全球范围内的广泛传播，高致病性，高致死率，引起全球各界广泛的关注，针对该病毒的抗病毒药物和疫苗的开发迫在眉睫。在本综述中，我们主要讨论了MERS-CoV的基因组结构，流行病学，临床特征、病毒的复制和治疗目标。关键词：中东呼吸综合征冠状病毒；急性呼吸系统障碍；中东地区；基因组结构；流行病学引言中东呼吸综合征病毒（MiddleEastrespiratorysyndromecoronavirus,MERS-CoV）是2012年6月从沙特阿拉伯吉达一家医院的一名患有严重呼吸系统疾病的病人身上分[1]离出来的，该患者最终死于肾和呼吸衰竭。“中东呼吸综合征（MiddleEastrespiratorysyndrome，MERS）”,世界卫生组织（WHO）[2-3]2013年对该类传染性疾病正式命名。自2012年发现MERS-CoV截止2017年7月，全球包括中东，欧洲，亚洲和北非等范围内已经有27个国家报告了MERS-CoV，全球共报告2000多例MERS-CoV实验室确诊病例，已导致712人死亡，其死亡率高达35%，其中绝大多数病例均与阿拉伯半岛有过宗教、商务、旅游等不同形式的密切交流史，[4-8]沙特阿拉伯阳性病例尤为突出。本综述主要介绍MERS-CoV的基因组结构，流行病学，临床特征、病毒的复制和治疗目标。1.MERS-CoV的基因组结构冠状病毒是一组能引起人类上呼吸道感染的人畜共患病毒，冠状病毒科属于正链ＲNA病毒纲、巢状病毒目，包括4个属:即α(包括G1a和G1b亚群)，β(包括G2a、G2b、G2c和G2d亚群)、γ(包括G3a、G3b和G3c亚群)和δ冠状病毒属。MEＲS-CoV属于套式病毒目冠状病毒科βCoVC亚群，是C亚群中第一个能感染人[9-10]的冠状病毒，和第六能感染人的冠状。在发现MEＲSCoV以前，C亚群仅有两个蝙蝠冠状病毒，一个是扁颅蝠属蝙蝠冠状病毒HKU4(Ty-BatCoV-HKU4)，它们是从扁颅蝠和伏翼蝠体内发现的，另一个是伏翼属蝙蝠冠状病毒HKU5(Pi-BatCoV-HKU5)，44 青岛大学硕士学位论文[10-13]前者是2006年在香港发现的，这两种冠状病毒在系统发生上与MEＲS-CoV相关。MERS-CoV是一种基因组为线性非节段的单股正链RNA病毒。MERS病毒粒子呈球形，直径约120~160nm，基因组全长约30kb,含有至少10个开放阅读框（openreadingframe，ORF），其中由4个主要的结构蛋白包括表面刺突糖蛋白（Spike，S）、小包膜蛋白（Envelope，E）、基质蛋白（Membrane，M）、核衣壳蛋白（NUCLEOCAPSID，N）、及5个非结构蛋白即辅助蛋白ORF3、ORF4a、ORF4b、ORF5和ORF8构成。其中由ORF1a／ORF1b编码的复制酶多聚蛋白，顺式共同转译后由2个病毒蛋白PP1apro和PP1ab分裂成包括nsp3（其含有假定的木瓜蛋白酶样蛋白酶（PL），nsp5（假定pro的胰凝乳蛋白酶样蛋白酶（3CL），nsp12（假定的RdRp），nsp13（推定的解旋酶（Hel））和其他未知功能的蛋白质在内的16个功能性非结构蛋白共同构成病毒RNA[11,14-15]合成和重组。2.MERS-CoV的流行病学冠状病毒普遍存在于多种哺乳动物和禽类中，包括人、牛、羊、猪、骆驼、禽类等，且具有高突变率，易重组以及倾向于跨种族的宿主。MERS-CoV属于大方向的冠状病毒中的一员，MERS-CoV与SARS-CoV在某方面极其相似，人们担心MERS-CoV在新环境的适应下将获得毒力并增强其传播能力，但事实上并没有如此。从2012年在中东地区发现MERS-CoV开始至2017年全球多个国家与地区在不同的人群中出现的多数感染病例，甚至在2014年与2015年出现了局部大爆发，不同地区、不同季节、不同种族中分离的流行病毒株仍为从沙特阿拉伯分离出的同一种MERS-CoV株，目前并未出现人们所担心的状况。自MERS-CoV出现人类感染患者以后，与其相似的冠状病毒序列陆续在世界各地的蝙蝠血液中检测得到，表明与MERS-CoV相似的病毒普遍存在于蝙蝠体内且处于隐性状态。蝙蝠是几个病毒，导致人类疾病，包括狂犬病，亨德[16-19]拉，尼帕，马尔堡病毒，严重急性呼吸综合征冠状病毒等诸多病毒在内的天然宿主。蝙蝠CoV通常是宿主特异性的;据相关研究显示，在非洲，美洲，亚洲和欧洲全球范围内许多蝙蝠科中发现了与MERS有关的CoVs，其中与从首例沙特中东呼吸综合征病例身上分离得到的病毒ＲNA比对最相似的是MEMISHZA等人在埃及墓蝠的粪便中分离出的病毒ＲNA样本，显示核苷酸100%同源，证明蝙蝠是MERS-CoV的携带者[20-26]。蝙蝠是可以直接跨物种传播到人类的，由于蝙蝠的生活习性以及其分泌物同人类直接接触的可能性有限，因此蝙蝠与人类之间还存在中间宿主，也可以通过中间宿主[27]接触受感染的蝙蝠或它们的排泄物而传播。为此检测中东地区几乎所有的家畜，发现中东地区的骆驼血清内检测到MERS-CoV抗体且均为阳性。尤其是从单峰骆驼身上[28-30]分离出的MERS-CoV株的遗传特征与人类分离株几乎相同，骆驼是MERS-CoV[31]的重要储库寄主，它们似乎是导致人类感染的唯一动物宿主。此外，单峰驼骆驼在45 青岛大学硕士学位论文MERS-CoV接种后主要发生上呼吸道感染，并且在与病骆驼密切接触后人们感染了[32-33]MERS-CoV，为骆驼-骆驼和骆驼-人传播MERS-CoV提供了证据。3.临床症状MERS-CoV的首位感染者的年龄为60岁，目前，在所有病例中，发病率约为36％，[3]65％为中老年男性患者以及具有其他慢性免疫障碍性合并症的患者。人类冠状病毒首[34-36]先是从无任何症状特征迅速发展成为急性上呼吸道感染和下呼吸道感染，即呼吸系[37-38]统障碍综合症，肾损伤，肾衰竭乃至多器官衰竭，甚至死亡。初始症状往往与普通凡人流感症状相似，及其的非特异性，患者会出现低烧，寒颤，鼻涕，呼吸困难，咳[39-40]嗽，头晕，头疼以及肌肉疼痛等全身不适症状。部分症状与SARS冠状病毒感染者相似，会表现出喉咙疼痛，厌食，腹痛，恶心，腹泻，呕吐，腹痛，腹泻等消化道[41-43]疾病。严重的重症患者中一般先前患有胃肠道疾病，慢性疾病综合征，其中包括糖尿病，高血压，肥胖，心血管疾病，慢性肺病，癌症，肾脏损伤以及其他免疫系统低[44-45]下等。一项关于儿童感染MERS-CoV的病例研究发现，该名9个月大的儿童患有[46]婴儿型肾病综合征，其并发症导致了严重的呼吸道症状，多器官功能障碍乃至死亡。另外对11例儿童MERS-CoV阳性病例进行调查发现，其中两名严重的患者分别患有唐氏综合征和囊性纤维化，该调查表明患有严重潜在疾病的儿童也可能发生严重的[37]MERS-CoV感染。以上病例表明，患有严重潜在疾病的老人儿童更易感染MERS-CoV疾病。实验室检测发现MERS-CoV患者会出现血小板减少，消耗性凝血障碍，嗜中性粒细胞增加，红细胞减少，白细胞减少，淋巴细胞减少，乳酸脱氢酶升高，血清肌[47-48]酸酐和肝酶会发生改变。另外胸部X光片和计算机断层扫描（CT）结果显示大多数患者单侧或双侧肺侵润异常，双侧气道阴影，偶尔有胸腔积液和肺小叶增厚，主要[49]位于基底肺区域和胸膜下存在广泛的玻璃影。MERS-CoV可在呼吸道分泌物,气管分泌物和支气管-肺泡灌洗液中检测到，其病毒载量比鼻涕更高的，其中下呼吸道比上呼吸道的病毒载量更高。该病毒也存在于患者血清，唾沫，尿液，粪便等分泌物中，患者临床症状出现后大约10天病毒载毒量排泄达到最高峰，临床症状完全康复的患者可[50-53]通过呼吸道分泌物释放长达25天的活病毒。因此，在医疗保健机构中，对于MERS-CoV患者的所有可能接触到的用品做好安全防护及杀菌措施。4.MERS-CoV的复制MERS-CoV病毒的复制可以分为以下几个主要阶段：病毒吸附细胞，病毒-细胞融合和基因组RNA的释放细胞质，从而启动病毒复制。46 青岛大学硕士学位论文4.1MERS-CoVS1-RBD介导的受体结合位于MERS-CoV病毒颗粒表面的S糖蛋白在病毒感染过程中被蛋白酶切割成受体[54-57]结合亚基S1和膜融合亚基S2，三者以三聚体的形式存在。受体结合亚基S1上含有的受体结合结构域(receptorbindingdomain，RBD)，它能与宿主细胞表面受体二肽基肽酶-4(DipeptylPeptidase4，DPP4，也称为CD26)相互结合，介导病毒附着于宿主细[54-58]胞表面。S1-RBD能够有选择的与包括人类，非人灵长类动物，骆驼，山羊，马，兔子，灵猫，猪，蝙蝠等宿主的DPP4结合,但也有部分动物不易受MERS-CoV感染，[59]比如小鼠，狗，猫，雪貂和仓鼠等动物,其结合力也会因宿主的不同而不同，以此确[54-61]定MERS-CoV感染的宿主物种限制和易感性。4.2MERS-CoVS2介导的膜融合MERS-CoVS1-RBD与受体DPP4结合的过程中，MERS-CoVS2亚基的构象发生极大的变化，S2亚基与S1亚基解离，S2亚基上的两个七肽重复区HR1和HR2形成[62-65]6-螺旋结构，使其插入宿主细胞膜中，从而介导了病毒-细胞膜融合。4.3基因组RNA释放至细胞质病毒基因组RNA中的开放阅读框ORF1a／ORF1b编码的复制酶多聚蛋白，翻译[66]成2个病毒蛋白PP1a和PP1ab，他们被病毒编码的蛋白酶木瓜蛋白酶样蛋白酶（PLpro）和3C样半胱氨酸蛋白酶（3CLpro,主要蛋白酶）切割成16种成熟的非结构蛋白（nsps）[67][68]。负链亚基因组长度RNA作为复制病毒基因组RNA的模板。合成的S,M,E蛋白聚集在内质网中并将其转运至内质网与高尔基的中间隔室与病毒颗粒表面的N蛋白与[69]细胞质中的基因组RNA组装在一起，形成病毒颗粒。病毒颗粒在高尔基体中发展成[69-70]熟，然后释放至细胞质中，进行病毒复制。5.治疗目标针对MERS-CoV的广泛传播，目前没有经FDA批准用于人类的特效药物与疫苗，主要依靠严格控制卫生来预防该疾病，对于大多数并发症的患者主要用特定的抗菌药物和抗病毒治疗。根据已知MERS-CoV感染的相关信息，研究者们进行了多方面的尝试，主要包括以下几方面：5.1MERS-CoVS蛋白的靶标用于治疗药物的开发如文中前面提到的，MERS-CoVS蛋白的结构和功能决定了该蛋白作为研发治疗MERS药物和疫苗的重要靶向目标。S蛋白中的特定靶点包括位于S1亚基上能够与47 青岛大学硕士学位论文DPP4受体结合的受体结构域RBD,S2亚基上能够促进病毒与靶细胞膜融合的两个七肽[37]重复区HR1与HR2。这些特定的靶点都是能够促进病毒成功复制的重要因素，这些靶标开发的治疗剂被表征为抗MERS-CoV中和mAbs，多肽抑制剂，DPP4拮抗剂，肽融合抑制剂，抗DPP4mAb，蛋白酶抑制剂，siRNA和其他小分子化合物。这些抗MERS-CoV试剂的原理主要是为了阻断RBD与DPP4的受体结合，以及阻断病毒与宿主细胞的膜融合，从而抑制MERS-CoV的感染。晶体学研究报道，MERS-CoVS1亚[57]基的RBD结构域的残基范围是367~606，且划分为核心和外部结构域两个部分，其中受体结合部位处于外部结构域上，外部结构域上的Y499，L506，W513和E553残基是受体结合所必需的，因此致使这些残基突变能够有效的抑制RBD与DPP4的相互[59]结合。据相关报道，破坏HR1和HR2结构域能够有效的阻断MERS-CoVS蛋白诱[71]导的膜融合。最近的体内研究实验表明，稳定表达MERS-CoVS蛋白所修饰的痘苗[72]病毒Ankara能够有效的抑制MERS-CoV复制。Xia等人对用于控制MERS-CoV感[73]染的有效抑制剂的靶向RBD进行了详细的描述。5.2DPP4宿主受体[74-75]DPP4主要在人类上皮细胞上表达，是一个含有766个氨基酸的Ⅱ型跨膜糖蛋白。据晶体研究结果显示，腺苷脱氨酶，DPP4结合蛋白已被鉴定出可作为阻碍DPP4与[76]RBD结合的抑制剂。抗CD26多克隆抗体与抗DPP4人源化单克隆抗体mAbys110[77-78]均能够抑制MERS-CoV感染。5.3辅助蛋白质MERS-CoV基因组编码多种非结构蛋白，它们不参与MERS-CoV病毒颗粒结构，[79-83]但能在病毒复制的过程中其重要的作用，且能阻碍宿主发生免疫反应。干扰素主要是由病毒感染宿主细胞时分泌，蛋白质3，4a,4b和5已被验证参与Ⅰ型干扰素的产生，[84-86]并对蛋白质4a具有抑制作用，能够影响病毒的发病机制。5.4其他疗法Zhang等人针对SARS-CoV与MERS-CoV相似性，对MERS-CoV亚单位疫苗的[87]可行性进行了综述。MERS-CoV感染能够被培养细胞中的Ⅰ型干扰素IFN-α且特别[87-88]是IFN-β）抑制,霉酚酸，环孢菌素A药物对其也有抑制作用，IFNα2b与利巴韦林[89]组合使用能够减少小鼠肺损伤并适度地降低肺部滴度。在相似的实验中，洛哌丁胺，[90]氯丙嗪，洛匹那韦和氯喹等药物经鉴定能够有效的抑制MERS冠状病毒复制。48 青岛大学硕士学位论文6.问题与展望MERS-CoV是一种高致病性的人畜共患冠状病毒，发展迅速，现已成为全球关注的焦点。迄今为止，MERS-CoV存在诸多尚未可知的谜底，其中包括MERS-CoV具体的传播机制，空间分布情况，中间宿主的种类等等。MERS-CoV复杂的蛋白结构，高致病性，高致死率以及人与人之间的传播等特点，使得人类临床上研制有效的抗病毒药物和疫苗存在了很大的阻碍，距今为止，尚未得到开发和批准。MERS-CoV的毒力强弱与患者体内是否存在其他的并发症存在必然的联系，存在并发症的患者其感染率与死亡率更高，据以往病例统计，男性患者多与女性患者，目前对于MERS-CoV病毒的复制能力不甚了解，且需要进一步挖掘。综上所述，本文从MERS-CoV的基因组结构、流行病学、临床特征、病毒的复制和治疗目标等方面进行了阐述。MERS-CoV病例的扩散已经引起全球学者们的关注，已经充分利用其已知的信息对其进行更全面，更深入的研究。随着对MERS-CoV致病机理的研究，相信MERS-CoV的中间宿主以及治疗方法会很快被研究出来。49 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青岛大学硕士学位论文附录或缩略词表缩略语英文名中文名AmpAmpicillin氨苄青霉素ATPAdenosineTriphosphate三磷酸腺苷bpBasePair碱基对BSABovineSerumAlbumin牛血清白蛋白CIAPCalfintestinalalkalinephosphatase牛小肠碱性磷酸酶DMEMDµLbecco’sModifiedEagleMediumDMEM培养基DMSODimethylSµLfoxide二甲基亚砜DTTDithiothreitol二硫苏糖醇EBEthidiumBromide溴化乙锭EDTAEthyenediamineTetraceticAcid乙二胺四乙酸ELISAEnzyme-linkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附实验FBSFetalBovineSerum胎牛血清HRPHorseradishperoxidase辣根过氧化物酶kDKilodalton千道尔顿LBLuriaBertaniLB培养基ODOpticalDensity光密度PAGEPolyacrylamideGelElectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳PBSPhosphate-bufferedSaline磷酸盐缓冲液PCRPolymeraseChainReaction多聚酶链式反应PMSFPhenylmethylsµLfonylFluoride苯甲基磺酰氟化物SDSSodiumDodecylSµLfate十二烷基磺酸钠TETris-HClEDTATE缓冲液TEMEDN,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine四甲基乙二胺TrisTrihydroxumethylaminomethane三羟甲基氨基甲烷57 青岛大学硕士学位论文致谢由衷感谢导师李荣贵教授！从课题的选择到论文的最终完成，李老师始终都给予了细心地指导和帮助，老师在百忙之中为我指导实验、审阅论文，不断提高我的实验技能和论文质量。感谢李老师在学术和生活上对我的帮助和鼓励！感谢刘康泰，韩宗晟对我研究工作的指导和帮助。感谢刘飞，梁竹，商道真，常佳慧，张雨晴等所有同学给我的帮助与鼓励。58 青岛大学硕士学位论文攻读学位期间的研究成果张倩倩,李荣贵,刘康泰,韩宗晟等.重组中东呼吸综合征病毒刺突蛋白S1亚基及其编码DNA接种小鼠的抗血清水平研究.生物技术通报，2018，（10）.59 青岛大学硕士学位论文60