《猪呼吸道疾病综合征六种病原基因芯片检测方法的建立》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
单位代码106351学号1120133280019131硕士学位论文猪呼吸道疾病综合征六种病原基因芯片检测方法的建立论文作者：保雨指导教师：刘力副教授李应国研究员学科专业：预防兽医学研究方向：动物检测及动物性食品检验检疫提交论文日期：2016年5月26日论文答辩日期：2016年6月4日学位授予单位：西南大学中国·重庆2016年6月 DissertationforMasterDegreeofSouthwestUniversityDevelopmentandPreliminaryApplicationofOligonucleotideMicroarrayforSimultaneousDetectionofSixPathogensCausingPorcineRespiratoryDiseaseComplexCandidate:BaoYuDirectedby:AssociateProfessorLiuLiProfessorLiYingguoMajor:PreventiveVeterinaryMedicineField:QuarantineofAnimalsandQualityInspectionofAnimalProductsChongqing·ChinaJun,2016 目录i 西南大学硕士学位论文目录摘要......................................................................................................................................................IABSTRACT......................................................................................................................................III第1章文献综述...............................................................................................................................11.1基因芯片技术及其在病原检测及研究中的应用.............................................................11.1.1基因芯片技术...........................................................................................................11.1.2基因芯片在病原检测及研究中的应用..................................................................21.2六种重要猪病病原微生物研究进展..................................................................................61.2.1猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒研究进展...................61.2.2猪传染性胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌研究进展......................................91.2.3猪肺炎支原体研究进展.........................................................................................10第2章引言.....................................................................................................................................132.1研究目的及意义................................................................................................................132.2研究内容............................................................................................................................142.2.1基因序列分析、引物和探针的设计....................................................................142.2.2单一病原基因芯片检测方法的建立....................................................................142.2.3六种病原同步检测基因芯片方法的建立............................................................142.3技术路线............................................................................................................................15第3章单一病原基因芯片检测方法的优化及建立..................................................................173.1材料....................................................................................................................................173.1.1病毒及细菌.............................................................................................................173.1.2主要试剂.................................................................................................................173.1.3主要材料及仪器.....................................................................................................183.1.4主要试剂的配制.....................................................................................................183.2单一病原基因芯片检测方法的建立及优化...................................................................193.2.1引物及探针的设计.................................................................................................193.2.2细菌的培养.............................................................................................................213.2.3核酸提取.................................................................................................................223.2.4目的基因的扩增.....................................................................................................233.2.5目的基因克隆.........................................................................................................233.2.6单一病原基因芯片检测方法的优化及建立........................................................25ii 目录3.3结果....................................................................................................................................303.3.1病原核酸PCR扩增结果.......................................................................................303.3.2重组质粒PCR鉴定结果.......................................................................................303.3.3六种病原PCR扩增退火温度优化结果...............................................................323.3.4六种病原检测探针筛选结果.................................................................................343.3.5探针点样浓度优化结果.........................................................................................353.3.6杂交液的优化结果.................................................................................................353.3.7PCR外循环数优化结果.........................................................................................363.3.8杂交温度优化.........................................................................................................383.3.9杂交时间优化结果.................................................................................................403.3.10方法评估试验结果...............................................................................................423.4讨论....................................................................................................................................473.4.1靶基因序列的选择.................................................................................................473.4.2标记方法的选择.....................................................................................................483.4.3探针的筛选及杂交条件的优化.............................................................................483.5小结....................................................................................................................................49第4章六种病原基因芯片检测方法的建立及初步应用............................................................514.1材料、试剂及仪器............................................................................................................514.1.1标准毒株及细菌.....................................................................................................514.1.2主要试剂.................................................................................................................514.1.3主要仪器.................................................................................................................514.1.4主要试剂配制.........................................................................................................514.2六种病原基因芯片检测方法的建立及应用...................................................................514.2.1六对特异性嵌合引物浓度优化.............................................................................514.2.2杂交温度优化.........................................................................................................524.2.3杂交时间优化.........................................................................................................534.2.4方法评估.................................................................................................................534.3结果....................................................................................................................................534.3.1多重PCR扩增中引物浓度优化结果...................................................................534.3.2多重PCR反应外循环数优化结果.......................................................................554.3.3杂交温度优化结果.................................................................................................554.3.4杂交时间优化结果.................................................................................................564.3.5特异性试验结果.....................................................................................................564.3.6敏感性试验结果.....................................................................................................56iii 西南大学硕士学位论文4.3.7重复性试验结果.....................................................................................................574.3.8基因芯片保存期试验结果.....................................................................................584.3.9临床检测结果.........................................................................................................594.4讨论....................................................................................................................................604.4.1多重PCR扩增影响因素.......................................................................................604.4.2多病原检测芯片的方法评估.................................................................................614.4.3研究中存在的部分问题.........................................................................................614.5小结....................................................................................................................................62第5章结论.....................................................................................................................................63参考文献...........................................................................................................................................65缩略词表...........................................................................................................................................71声明...............................................................................................................................................73致谢...................................................................................................................................................75在读期间发表的文章、参与的专利及项目...................................................................................77iv 摘要猪呼吸道疾病综合征六种病原基因芯片检测方法的建立预防兽医学专业硕士研究生保雨指导教师刘力副教授李应国研究员摘要猪呼吸道疾病综合征（Porcinerespiratorydiseasecomplex，PRDC）是由病毒、细菌、支原体、寄生虫及环境应激等多种因素引起，以呼吸困难、咳嗽、发热、生长迟缓等为临床特征的一类猪常见疾病。病原学分析发现，引起PRDC的主要病原包括猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacilluspleuropneumoniae,APP）、副猪嗜血杆菌（Haemophilusparasuis,HPS）、猪肺炎支原体（Mycoplasmahyopneumoniae,Mhp）、猪圆环病毒2型（Porcinecircovirustype2,PCV-2）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV）、猪瘟病毒（Classicalswinefevervirus,CSFV）、猪细小病毒（Porcineparvovirus,PPV）、猪流感病毒（Swineinfluenzavirus,SIV）等，其中APP、HPS、Mhp、PCV-2、PRRSV及CSFV六种病原在我国较为常见，规模化养猪中多病原的混合感染或继发感染大大增加了临床诊断的难度。目前，对APP、HPS、Mhp、PCV-2、PRRSV和CSFV六种病原的检测多进行单一病原的分离培养、血清学检测、PCR扩增等，缺少可同步鉴别检测六种病原的方法。因此，建立一种可同时检测PRDC六种重要病原的方法，节省成本，提高检测效率，对猪病的流行病学调查、疫病监控、进出境检疫等具有重要意义。本研究以APP、HPS、Mhp、PCV-2、PRRSV及CSFV作为研究对象，建立了可同步鉴别检测六种病原的基因芯片，该方法具有较好的特异性和稳定性。其主要研究内容及结果如下：1.引物和探针的设计根据GenBank中登录的APP、HPS、Mhp、PCV-2、PRRSV及CSFV的基因序列，使用生物学软件Mega5、PrimerPremier5.0和Oligo6.0进行分析比对、设计6对特异性引物和多条探针。对六种病原核酸进行PCR扩增，构建T-克隆载体，基于电泳检测和测序比对结果筛选阳性质粒。2.探针筛选和单一病原基因芯片检测方法的建立参考GeXP的标记方法，对靶序列进行Cy3荧光标记，与固定于醛基基片表面的探针进I 西南大学硕士学位论文行避光杂交，扫描杂交结果，筛选特异性高且荧光信号强的探针。在探针筛选的基础上，进行退火温度、外循环次数、杂交探针浓度、杂交液、杂交温度和杂交时间的优化，确定退火温度为56～58℃和外循环25～30次进行扩增，PCR产物与自配杂交液混合，42℃避光杂交3h。对单一病原基因芯片检测方法的特异性、敏感性、稳定性进行评估，结果显示：该方法具有较好的特异性和稳定性，其中敏感性分别为APP2.97×102拷贝/μL、HPS4.38×103拷贝/μL、Mhp8.26×102拷贝/μL、PCV-23.78×102拷贝/μL、PRRSV1.38×103拷贝/μL、CSFV3.32×10拷贝/μL。该方法的检测敏感性与普通PCR扩增相比高10～100倍。3.六种病原基因芯片单管同步检测方法的建立和初步应用在单一病原基因芯片检测方法的基础上，通过正交试验优化六种病原特异性嵌合引物的浓度，初步建立六种病原同步检测的基因芯片方法。优化杂交温度和时间，进行方法评估。特异性试验：对伪狂犬病病毒、猪细小病毒、日本乙型脑炎病毒、猪水疱病病毒、水泡性口炎病毒、口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、小反刍兽疫病毒和沙门氏菌的核酸进行扩增杂交，验证构建芯片的特异性。结果显示，该方法与上述病原均无交叉反应。敏感性试验：将六种病原的阳性质粒进行混合后倍比稀释，以其为模板进行敏感性试验。结果显示：APP5.8×102拷贝/μL、HPS7.8×103拷贝/μL、Mhp6.8×103拷贝/μL、PCV-26.3×102拷贝/μL、PRRSV4.8×103拷贝/μL、CSFV5.5×102拷贝/μL。因此，综合考虑六种病原的检出限，多病原单管同步检测基因芯片的敏感性为103拷贝/μL。重复性试验：选取同一批次制备的6张基片和不同批次制备的6张基片，进行组内和组间重复性试验。结果显示：组内组间试验均具有较高的可重复性。保存期试验：本试验进行了为期4个月的保存期试验，确定芯片的最优保存条件。结果显示：该方法制备的芯片至少可在-20℃条件下保存4个月。临床初步应用：对重庆地区采集的186份样品分别使用本研究建立方法与现行标准方法进行对比分析，结果显示：基因芯片方法检出单一病原感染34份，多病原混合感染11份；现行标准方法检出单一病原感染28份，多病原混合感染13份。将两种方法检出的阳性样品进行测序分析，测序结果与基因芯片方法检出结果一致，说明基因芯片方法可用于多种病原的临床鉴别检测。本研究建立了一种可同步鉴别检测APP、HPS、Mhp、PCV-2、PRRSV及CSFV六种重要病原的基因芯片方法，为基因芯片在动物疫病中的研究和应用提供理论基础，也为PRDC病原的鉴别检测提供技术支撑。关键词：基因芯片；APP；HPS；Mhp；PCV-2；PRRSV；CSFVII AbstractDevelopmentandPreliminaryApplicationofOligonucleotideMicroarrayforSimultaneousDetectionofSixPathogensCausingPorcineRespiratoryDiseaseComplexCandidate:BaoYuDirectedby:AssociateProfessorLiuLiProfessorLiYingguoABSTRACTPorcinerespiratorydiseasecomplex（PRDC）isacommondiseasecharacterizedbydyspnea,cough,feverandgrowthretardation,whichiscausedbyacombinationofmanyfactors,suchasviruses,bacteria,mycoplasma,parasitesandenvironmentalstress.AccordingtotheEtiologyanalysis,Porcinecircovirustype2(PCV-2),Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV),Mycoplasmahyopneumoniae(Mhp),Actinobacilluspleuropneumoniae(APP),Haemophilusparasuis(HPS),Classicalswinefevervirus(CSFV),Porcineparvovirus(PPV)andSwineinfluenzavirus(SIV)werethemainpathogens.Amongthem,APP,HPS,Mhp,PCV-2,PRRSV,andCSFVarecommoninourcountry.Themuti-pathogenmixedinfectionorsecondaryinfectionsignificantlyincreasesdifficultyintheclinicaldiagnosis.However,atpresent,therearesomediagnosismethodsdetectingthesingleone,suchasseparationofculture,serologicaldetectionandPCRamplification,lackingofawaytodetectthesixpathogenssimultaneously.Therefore,theestablishmentofthisspecialmethodscouldsavethetestcostandimprovethedetectionrate,contributingtotheepidemiologicalinvestigation,diseasesurveillanceandentryandexitinspectionandquarantine.Inthisstudy,weselectedAPP,HPS,Mhp,PCV-2,PRRSVandCSFVastheresearchobjects,anddevelopedanoligonucleotidemicroarraydetectionofsixpathogens,whichpossessedmorespecificandstablecharacteristics.Themaincontentsandresultsareasfollows.1.Designprimersandprobes.BasedonthesequenceofAPP,HPS,Mhp,PCV-2,PRRSVandCSFV,wedesigned6pairsofspecificprimersandapluralityofprobeswiththesoftwareofMega5,PrimerPremier5.0andOligo6.0,andamplifiednucleicacidofsixpathogensbyPCRandconstructedT-cloningvectors.2.Probescreeningandtheestablishmentofasinglepathogenicgenechipdetectionmethod.ReferencedthemarkingmethodofGeXP,weusedCy3labelingtargetsequenceandhybridizedwithprobesthatwasspottedonthealdehydeslide,thenscannedtheresultofhybridizationandscreenedthespecificprobes.Onthebasisoftheselectionoftheprobe,weoptimizedannealingIII 西南大学硕士学位论文temperature,outercycles,theconcentrationofhybridizationprobe,hybridizationsolution,andhybridizationtemperatureandtime.Theoptimizedreactionconditionsfollowedasannealingtemperaturewas56～58℃,outerloop30timesofamplification,andthePCRproductsmixedwithhybridizationsolutionwasprotectedfromavoidedlightandhybridizedfor3hat42℃.Dependedonthespecificitytest,sensitivitytestandstabilitytesttoevaluatedetectionmethod,theresultsindicatedthatthemethodwasspecificandstable.What’smore,thedetectionlimitsofoligonucleotidemicroarraywere2.97×103copies/μLforAPP,4.38×103copies/μLforHPS,8.26×102copies/μLforMhp,3.78×102copies/μLforPCV-2,1.38×103copies/μLforPRRSVand3.32×10copies/μLforCSFV,respectively.Besides,ComparedwithordinaryPCR,thesensitivityofoligonucleotidemicroarraywas10～100timesmorethanthecommonone.3.Theestablishmentandassessmentofoligonucleotidemicroarrayformulti-pathogen.Onthebasisofsinglepathogendetectionmethod,optimizingtheconcentrationofsixpairsofspecificchimericprimersthroughorthogonalexperiment,andpreliminaryestablishinganoligonucleotidemicroarraytodetectsixkindsofpathogenssynchronously.Weoptimimzedthehybridizationtemperatureandtime,thenevaluatedthemethod.Specificitytest:weconductedtheamplificationandhybridizationofPseudorabiesvirus,Porcineparvovirus,JapaneseBencephalitisvirus,Swinevesiculardiseasevirus,Vesicularstomatitisvirus,Foot-and-mouthdiseasevirus,Bluetonguevirus,PestedespetitsruminantsvirusandSalmonella,andverifiedthespecificityofmicroarray.Theresultssuggestedthattherewasnocross-reactionwithmentionedpathogens.Sensitivitytest:wetestedwiththemixedsixpositiveplasmidsasatemplatewhichwasdilutedproportionally..Theresultsmanifestedthatthedetectionlimitsofoligonucleotidemicroarraywere5.8×102copies/μLforAPP,7.8×103copies/μLforHPS,6.8×103copies/μLforMhp,6.3×102copies/μLforPCV-2,4.8×103copies/μLforPRRSVand5.5×102copies/μLforCSFV,respectively.Therefore,thedetectionlimitsofoligonucleotidemicroarraywas103copies/μLthroughsyntheticalconsideration.Repeatabilitytest:weselectedsixsubstratesofthesamebatchandsixsubstratesofdifferentbatchestodointra-assayandinter-assaytest.Theresultsshowedthattheintra-assayandinter-assaycoefficientsofvariationweresmallerthan5.0%.Preservetimetest:themicroarraywaspreservedforfourmonthsandwegropedtheoptimumstoragetemperatureandtimeofthechip.Theresultselucidatedthatthepreservetimeofgenechipwasfourmonthsat-20℃.Preliminaryclinicalapplication：wedetectedthe186nasalswabssamplesinChongQingusingthegenechipandstandardmethod,respectively.Theresultsindicatedthatthesingleinfectionwas34andmixedinfectionwas11bygenechip,andthesingleinfectionwas28andthemixedinfectionwas13bythestandardmethod.Subsequently,thepositivesamplesweresenttosequence,theresultsandthedetectionrateofoligonucleotidemicroarrayandsequencewereidentical,whichIV Abstractsuggestedtheoligonucleotidemicroarrayapplytotheclinicaltestofmuti-pahtogen.Inthisstudy,wehaveestablishedtheoligonucleotidemicroarray,whichprovidesarapidandhigh-throughputmethodforsixpathogenicepidemiologyinvestigationandclinicaldiagnosis,andlaysthefoundationoftheapplicationandresearchofthismethodinanimaldisease.Keywords:OligonucleotideMicroarray;APP;HPS;Mhp;PCV-2;PRRSV;CSFVV 第1章文献综述第1章文献综述1.1基因芯片技术及其在病原检测及研究中的应用1.1.1基因芯片技术1.1.1.1基因芯片技术简介自上世纪90年代初，美国Affymetrix公司的Fodor博士提出基因芯片技术以来，基因芯片技术呈爆炸式发展[1]。基因芯片（Genechip）是生物芯片的一种，也称为DNA芯片（DNAchip），该技术将基因或基因产物有序地固着在玻璃、尼龙膜、硅片等基质载体上，按照碱基互补配对原则与标记后的靶基因在一定条件下杂交，根据荧光信号强弱对待检样品进行定性或定量分析[2]。该技术具有高通量、并行性、自动化、微型化等特点，大规模应用于表达图谱分析、癌症研究、测序分析、疾病诊断、药物筛查等方面[3]。基因芯片技术的原理遵循经典的Watson-Crick碱基互补配对原则，即DNA双螺旋结构中A-T和C-G碱基对相互识别和配对。将单链的DNA或cDNA作为探针，与经过荧光、生物素等标记的靶序列进行杂交，杂交后通过荧光信号对待检样品进行定性或定量分析。基因芯片的分类方法很多。根据探针本身的不同，可分为cDNA芯片和基因芯片。cDNA芯片多用于大规模样品的普查筛选以及基因表达研究，其主要是将长链DNA(0.5-2kb)分子通过高速点样法固定在固相载体上，与标记后的待检样品进行杂交[4]。基因芯片指采用原位合成法或点样法将寡核苷酸探针（十几mer到70mer）固定于载体表面，与标记的靶序列按照碱基互补配对原则进行杂交，扫描分析检测结果。该技术既可应用多条探针来检测同一靶基因降低假阳性率，又可集成多种病原的基因探针对病原进行鉴别检测和基因分型。基于探针制备方式的差异，可分为原位合成芯片和合成点样芯片。原位合成芯片是采用光诱导印刷（photolithography）、压电打印（piezoelectricprinting）、分子印章等技术在芯片的特定部位用4种核苷酸原位合成寡核苷酸探针（18-70mer），常见的包括Affymetrix®芯片和Nimblegen®芯片[5-7]。与原位合成相比，合成点样相对简单，只需将PCR产物、寡核苷酸探针或基因组DNA通过自动点样装置直接点于基质上，且大片段DNA和寡核苷酸均可使用直接点样法制备芯片。根据基质的不同，基因芯片也可分为玻璃芯片、尼龙膜芯片、硅片芯片等，其中玻璃芯片最常见。按照芯片不同的用途，又可分为表达谱芯片、诊断芯片、测序芯片、指纹图谱芯片等[8]。根据结构的不同，还可分为单通道芯片、双通道芯片和芯片实验室。1.1.1.2基因芯片技术流程基因芯片的技术核心主要包括制备芯片、标记待检样品、杂交反应和检测分析荧光信号。1 西南大学硕士学位论文制备芯片的主要方法为原位合成和直接点样两种，直接点样法因易于控制、成本较低常应用于实验室小规模探索研究中。待检样品的有效标记直接关系到基因芯片技术成功与否。根据标记物的不同，可以分为生物素标记、荧光素标记、放射性同位素标记、胶体金标记等，其中荧光标记主要是通过在5’或3’末端引入红色荧光基团Cy5或绿色荧光基团Cy3。与其他标记法相比，荧光素标记方法与常规的PCR扩增大致相同，操作简单，标记效果稳定，但需要借助特定的仪器设备观察结果。根据标记方法的不同，可分为直接掺入法、间接标记法、随机引物标记法等[9]。随机引物法适用于未知病原或者基因序列大规模筛查检测，但该方法敏感性相对较低。直接掺入法和间接标记法由于敏感性较高，所以使用频率相对较高。探针与目标基因间的杂交过程属于固液反向杂交，即固定在基质表面的探针分子与液相靶分子进行反应。该技术涉及的实验步骤较多，因此影响杂交结果的因素也很多，包括探针GC含量、探针长短、连接臂长度、杂交液成分及浓度、杂交温度、杂交时间等。不同杂交目的对杂交条件具有不同要求，例如用于基因表达检测的芯片，杂交条件的严格性较低，而用于突变检测的芯片要求杂交温度高，杂交时间短，因此杂交条件相对严苛[10]。试验过程中，需要综合考虑各个因素，严格筛选最佳的杂交条件。杂交信号检测分析的方式由标记方式决定。荧光素标记的待检样品需要用激光共聚焦芯片扫描仪激发荧光素，再对荧光信号强度进行分析比较，进而对样品进行定性或定量分析；同位素标记的待检样品进行杂交信号检测时，需通过放射自显影技术进行检测分析；生物素标记的待检样品则先将亲和素—碱性磷酸酶复合物与生物素结合后作用于底物显色，再通过CCD芯片扫描仪扫描结果或是直接通过肉眼进行观察[11]。胶体金标记的靶基因，具有良好的特异性和敏感性，不仅可直接用肉眼观察结果，而且信号检测强度是荧光标记法的100倍[12]。因此，胶体金标记制备的可视化芯片是基因芯片发展的一个大方向。1.1.2基因芯片在病原检测及研究中的应用1998年，美国纳米公司构建了首个微芯片实验室，美国科学促进会将基因芯片技术列为该年度自然科学领域十大进展之一，该技术在生物芯片中发展最为成熟应用最广，广泛应用于病原微生物的鉴别检测、分型、耐药性研究、致病机制研究等。在病原微生物的检测研究中，可同步检测多种病原体或同步检测多个样品，具有特异、快速等优点，避免了传统核酸印记杂交技术操作繁琐、自动化程度低、效率低等缺陷，在病原微生物的检测及研究中具有广阔的应用前景。1.1.2.1病原微生物的鉴别检测病原分离培养和血清学检测作为传统的病原检测方法，存在操作繁琐、检测周期长、检测单一等不足。基因芯片可集成多条探针实现多种病原的同步检测，或一张芯片多个矩阵完成多个样品的并行检测，因此常应用于细菌、病毒、寄生虫等多种病原微生物的实验室鉴别2 第1章文献综述检测。对于细菌，常基于核糖体基因或特异基因设计引物和探针，国内外建立了多种鉴别检测细菌的基因芯片方法。Sugihara等选取84种细菌（易引发自发性胸膜腹膜炎的病原菌30种和临床上重要的细菌54种）基于16SrRNA和3个可变区构建了一种芯片检测方法，与病原分离培养相比，检出率相似，且节约了3/4的检出时间，有利于肝硬化病人的早期治疗[13]。Jane等根据细菌的16SrRNA的可变区设计寡核苷酸探针，制备可将炭疽芽孢杆菌与六种常见细菌区分的基因芯片[14]。黄爱华等基于食源性致病菌的16SrRNA设计寡核苷酸探针，结合生物素标记法，探索一种新的基因芯片方法。该方法检出限低至10CFU/mL，基于量子点的基因芯片在食源性致病菌检测中具有较大潜力[15]。毛正果等以细菌的16SrRNA为靶基因建立了可区分大肠埃希氏菌、蜡状芽孢杆菌、副溶血弧菌等14种肠道致病菌，最低检出限浓度为103CFU/mL，可快速准确地对引起腹泻的常见肠道致病菌做初步筛查[16]。除以16srRNA作为靶基因外，还可选取23SrRNA、16～23SrRNA间隔区和特异基因作为靶基因建立基因芯片方法。冯松凯以16srDNA基因和gyrB基因为研究对象，建立了一种可检测布氏杆菌、大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、丹毒杆菌、铜绿假单胞杆菌6种动物皮毛中常见致病菌的基因芯片检测方法[17]。高兴等以金黄色葡萄球菌、志贺菌、霍乱弧菌、单增李斯特菌等11种细菌的特异基因为靶标，建立了基于多重PCR扩增的食源性细菌基因芯片检测方法，可满足部分食源性致病菌通量检测的要求[18]。细菌性疾病普遍存在于养猪业中，疾病的快速有效诊断有利于临床用药。程亚楼通过对猪常见致病菌的基因序列进行分析，通过靶标与探针杂交试验和杂交条件优化试验，建立了由6条寡核苷酸探针和1对通用引物构成的猪常见致病菌基因芯片的检测方法，可实现多杀性巴氏杆菌、猪人肠杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌和猪链球菌6种致病菌的同步快速检测[19]。此外，基因芯片技术也常用于环境监测中未知菌的大规模筛查检测[20-21]。近年来，病毒性疾病多呈混合感染或继发感染，迫切需要建立可同时检测多种病毒的方法。叶芬等基于多重PCR建立了可同时检测猪瘟、猪圆环病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因芯片检测方法，与PCR/RT-PCR方法具有较高的符合率，有利于三种疾病的快速诊断[22]。杨若松等以四种猪常见病毒的阳性质粒为模板制备探针，建立可检测猪瘟病毒、高致病性猪蓝耳病病毒、猪圆环病毒2型和猪细小病毒的cDNA芯片检测方法，具有良好的特异性、敏感性和重复性[23]。姜永厚等根据猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒及猪圆环病毒1型和2型的特异保守序列设计引物和寡核苷酸探针，建立可检测上述病原的芯片方法，该方法的检测敏感性比琼脂糖凝胶电泳高10倍[24]。符芳等将猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV-2）的特异cDNA片段作为探针点制于氨基修饰的玻片上，进行不对称PCR扩增制备靶物，经绿色荧光染料Cy3标记后，分别与cDNA微阵列的芯片探针进行杂交，建立了分别检测上述5种病原的cDNA芯片[25]。随着芯片技术的发展，液相芯片和可视化片也应用于猪病毒性疾病3 西南大学硕士学位论文的检测中。王小强等结合胶体金标记技术建立了可同时检测猪圆环病毒、伪狂犬病病毒、猪流感病毒、猪瘟病毒、口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪细小病毒的可视化芯片，该芯片不需借助特殊设备便可获得检测结果[26]。詹爱军等通过分析比较鹿流行性出血热病毒的VP7基因、阿卡斑病毒的N基因、蓝舌病病毒的VP7基因和水泡性口炎病毒的NP基因后，结合荧光编码微球技术，建立一种更方便快捷的液相芯片方法[27]。基因芯片技术除用于猪病毒性病原的检测外，也常用于人类和其他动物病毒性疾病检测[28-29]。基因芯片技术也可应用于寄生虫性疾病的检测中。巴贝斯焦虫是一种人畜均可感染的寄生虫，Lau等建立一种用于监测牛巴贝斯焦虫的微阵列方法，并呈现了牛巴贝斯焦虫感染红细胞的表达图谱[30]。Tares等通过同源性DNA合成松材线虫特异性探针，并将其固定到硅片、玻璃、塑料、尼龙膜等固相载体上制成基因芯片，用于快速精确检测松材线虫[31]。另外，国内也建立了检测弓形虫、旋毛虫和日本血吸虫的芯片方法。当前能够同步检测病原体种类最多的芯片是“泛微生物芯片”，该芯片包含29455条的寡核苷酸探针，能同时检测1710种脊椎动物病毒、135种细菌、73种真菌和63种寄生虫属，在临床样品检测中与传统方法符合率很高，并能准确检测出患者的多重感染[32]。1.1.2.2病原微生物的分型自然界中的病原微生物多具有不同亚型，不同亚型间存在地域性、致病性及流行性的差异。对病原微生物亚型的准确鉴别有利于指导临床用药和做好疫病防控。根据不同型间的差异基因设计引物和探针，将多条探针点至同一芯片实现病原分型。姜永厚等根据猪圆环病毒的复制酶基因设计引物和探针，成功构建了准确鉴别检测猪圆环病毒基因型的基因芯片方法，该方法对58份临床样本进行检测，敏感性比普通PCR高5倍，适用于猪圆环病毒的分型检测[33]。口蹄疫是全世界普遍存在一种烈性传染病，共有7种血清型。BaxiM.K.等设计了155条口蹄疫病毒种属特异性寡核苷酸探针和血清型特异性探针，可区分口蹄疫病毒所属的血清型[34]。猪繁殖与呼吸综合征病毒是引起猪繁殖与呼吸综合征的主要病原，而高致病性蓝耳病的爆发使其备受关注。郭焕成等对Nsp2基因片段进行扩增，建立可准确区分高致病性PRRSVNsp2缺失株和经典美洲株的芯片方法，可有效用于高致病性PRRSV的临床诊断和流行病学调查[35]。日本乙型脑炎是一种中枢系统人畜共患急性传染病，薛斐等结合生物素标记技术，制备了针对日本乙型脑炎病毒Ⅰ型与Ⅲ型的分型及鉴定可视化基因芯片，为JEV的检测及分型提供一种快速、准确、高通量的方法[36]。美国科罗拉多大学与美国疾病控制和预防中心合作研发了一种“M芯片”，可快速检测包括H5N1禽流感病毒在内的各种流感病毒，且M芯片只需7小时就可检出人是否感染H5N1。此外，韩雪清等根据禽流感16个HA亚型和9个NA亚型的基因序列，设计合成了25对特异性引物、1对通用引物和52条亚型特异的探针，结合多重RT-PCR制备了禽流感病毒分型鉴定的芯片[37]。Ruettger和Sachse等均通过AT实验（个体样本）和AS实验（高通量样本）基于ompA基因建立了对4 第1章文献综述沙眼衣原体和鹦鹉热嗜衣原体分型的基因芯片方法[38-39]。基因芯片除应用于动物疫病病原的分型外，也常用于人乳头瘤病毒、乙肝病毒、结核分支杆菌等人类疾病病原的分型检测中。1.1.2.3病原微生物致病机制及耐药性的研究病原微生物与宿主细胞的相互作用引发机体疾病。掌握二者间的作用机制不仅有利于建立有效疾病诊断方法，而且有利于选取药物作用的靶位点和研发新的药物。传统技术主要通过病原基因产物的生化活动、交互作用和突变体表型对病原的致病机制进行研究，而基因芯片技术通过检测感染宿主细胞基因表达情况对致病机制进行研究，为致病机制研究提供新的平台。Cantacessi等通过基因芯片技术和生物信息学分析，探索捻转血矛线虫与犬钩虫间的转录保护机制及通过高频率的邻堆杂交技术（CSH）对捻转血矛线虫的表达序列标签进行生物信息学分析，研究发现犬钩虫中血清活化或未活化的L3s是转录保守的[40]。食品安全问题一直备受关注，其中由单增李斯特菌等食源性致病菌引起的食品安全问题危害较为严重。Baldwin等通过含有22594个人类基因组cDNA的表达谱芯片比较单增李斯特菌野生型与突变型感染人肠道上皮细胞后的转录水平，发现细菌侵入机体后如何逃避机体的免疫保护和机体对感染的反应均受NFκB调节，说明机体对单增李斯特菌感染反应是非特异的[41]。AfonsoC.L.等通过猪cDNA芯片比较了非洲猪瘟病毒经典株与多基因家族360/530基因缺失株感染巨噬细胞的转录水平变化，结果发现缺失株感染的巨噬细胞出现IFN-α基因的转录，而经典毒株感染的巨噬细胞则没有发生该基因转录，研究揭示了非洲猪瘟病毒多基因家族360/530抑制干扰素产生的效应[42]。Bigger等利用Affymetrix公司制备的包含7000个基因的HumanFL芯片，检测生理和病理状态下黑猩猩的肝细胞中基因的表达情况，发现众多干扰素诱导基因表达改变显著，为进一步研究提供科学依据[43]。Shi等也使用Affymetrix公司制备的猪全基因表达图谱芯片，分析了猪瘟病毒感染后猪外周血白细胞的转录变化，建立了外周血白细胞凋亡相关基因的作用网络[44]。表达图谱芯片的广泛应用，实现了不同组织、不同发育阶段、不同刺激下细胞内mRNA或cDNA进行大规模平行检测和分析，为病原的致病机制提供了高通量平台。为避免抗菌药物的无指征滥用，临床上常进行耐药基因筛查和药敏实验。基因芯片技术既可同时检测同一耐药菌的多个不同耐药基因，也可同时检测多种耐药菌的同一或不同耐药基因。Wang等利用基因芯片技术筛选肿瘤细胞中相关耐药基因，其中发现c-Yes和c-Flip两个新耐药基因[45]。耐药性结核分支杆菌的广泛流行已成为结核病控制的重要难题，张春蕾等建立了链霉素、乙胺丁醇、异烟肼和利福平耐药检测的芯片方法，与罗氏绝对浓度法药敏试验同时对74例临床样本进行耐药性检测，两种方法符合率为52.7%[46]。此外，美国（NRBC）利用研制出的基因芯片来检测结合杆菌对利福平、乙胺丁醇及异烟肼的耐药性，检出率分别为75%、70%及50%，基因芯片技术可弥补传统药敏试验耗时长的不足。Borel等使用特异性23SAT基因芯片检测猪衣原体时发现，12只6周龄患结膜炎的种猪检出猪衣原体，检出1份粪样本和1份眼部拭子具有耐四环素编码基因。另外，对10份健康猪群的眼部拭子进行检5 西南大学硕士学位论文测，结果显示猪衣原体及耐四环素编码基因均为阳性。该实验建立了一种快速筛选经抗生素治疗的耐四环素猪衣原体方法[47]。此外，芯片技术也用于发现新基因、致病基因、毒力基因、药物作用基因等其他基因。基因芯片技术随着科学技术的发展不断完善丰富，实现了多靶标或多样本的并行高通量检测，推动了环境监测、疫病监控、食品卫生、司法鉴定、新药研发、转基因检测等领域的发展。1.2六种重要猪病病原微生物研究进展1.2.1猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒研究进展1.2.1.1猪圆环病毒2型研究进展猪圆环病毒相关疾病（porcinecircovirusassociateddisease，PCVAD）主要由猪圆环病毒2型（Porcinecircovirustype2，PCV2）引起的一类重要免疫抑制性疾病，包括断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪呼吸道综合征（PRDC）、新生仔猪先天性震颤（CT）及猪皮炎与肾病综合征（PDNS）等。另外，PCV-2引发的免疫抑制，为其他病原的并行或继发感染创造了条件。目前，国内外学者对PCV-2从分子生物学特征、致病机理、诊断方法等方面开展了大量研究。PCV-2属圆环病毒科圆环病毒属，无囊膜、共价闭合、负股、单链DNA病毒，含有1767～1768个核苷酸。PCV-2基因组可能含有11个开放阅读框，其中编码Rep蛋白的ORF1和编码Cap蛋白的ORF2为主要的阅读框。Rep蛋白是病毒复制所需的蛋白，基因序列的突变均会影响病毒的复制。Cap是病毒的主要结构蛋白和主要免疫原，该蛋白是PCV2免疫学研究的焦点。此外，包含于ORF1中的ORF3不参与病毒的复制，但可引起p53磷酸化、抑制pPirh2表达，从而诱导侵入细胞凋亡。目前，PCV-2呈世界性流行，我国各地区均有PCV2感染存在，且不同地区、不同日龄猪群的抗体水平介于10%～90%之间。由于PCV-2流行范围广、传播途径多、危害严重，因此，迫切需要建立快速、有效的诊断方法对该病原进行科学监测。病毒分离培养与电镜观察是PCV2实验室诊断的常规方法。将肺、淋巴结、肝、肾或脾脏等病变组织制成超薄切片，使用电镜进行观察，根据病毒本身所具有的形态、结构和大小等不同特征做出诊断。郎洪武等将北京和河北两地发病猪的脾脏和淋巴结组织的制成超薄切片经醋酸铀--柠檬酸铅染色后，通过电镜观察到了大量直径17nm、圆形、无囊膜的PCV病毒粒子[49]。另外，也可通过PK-15细胞培养病毒，再通过电镜或分子生物学技术进行诊断。病毒分离培养是最为准确的技术，但存在耗时费力等缺点，不利于疾病的快速诊断。同样地，IFA、IPMA、ELISA、GICA等病毒抗体检测方法因操作繁琐、重复性差等限制，不利于临床样本的大规模筛查。目前，分子生物学技术正广泛应用于各种疾病的诊断中，其中PCR技术是PCV病原学诊断和分型中最常用的技术。针对PCV的特异保守序列，建立了普通PCR、竞争PCR、多重PCR、巢式PCR、荧光定量PCR等多种PCR技术。Liu等用已知浓度的DNA作为竞争6 第1章文献综述模板，设计PCV1和PCV2特异性引物，建立了竞争PCR，可检测临床样品中PCV1和PCV2的核酸含量[49]。针对猪群可能存在PCV2、PPV、PRRSV、CFSV和ASFV多病原感染情况，Giammarioli等建立一种多重PCR，可同时对5种病毒进行快速检测[50]。Brunborg等建立了以TaqMan-MGB探针为基础的实时荧光定量PCR方法，用于血清、血浆及组织样品中的PCV2的定量检测[51]。Chung等建立了用于PRRSVcDNA和PCV2DNA的检测实时定量PCR方法[52]。PCR-RFLP、LAMP、ISH及基因芯片等多种技术也应用于PCV病原的诊断和分型中。An等基于PCV不同血清型基因序列差异性，构建了能鉴别检测PCV1和PCV2的基因芯片，具有重复性好、敏感性和特异性强等优点[53]。肖驰等在分析CSFV、PCV2和PRRSV靶基因序列基础上，成功研制了基于核酸探针的cDNA基因芯片，可同时检测CSFV、PCV2和PRRSV三种病原。1.2.1.2猪繁殖与呼吸综合征病毒研究进展猪繁殖与呼吸综合征俗称蓝耳病，由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV）引起的一种以繁殖障碍和呼吸系统疾病为主要特征的重大接触性传染病，临床表现为怀孕母猪流产、早产、仔猪及育成猪呼吸系统症状[54]。PRRSV属动脉炎病毒科动脉炎病毒属，病毒粒子呈球形，有囊膜，核衣壳呈20面体对称，单股正链RNA病毒，基因组全长约15kb。根据基因组的差异，PRRSV可分为欧洲型和美洲型，我国流行的PRRSV为美洲型和以Nsp2基因发生不连续缺失突变的高致病性PRRSV。高致病性PRRSV也属于美洲型，与代表株VR2322相比，Nsp2第481位和532-560位共缺失30个氨基酸，分子生物学中常以此作为二者鉴别检测的切入点。PRRSV作为呼吸道疾病综合征的原发性病原体，主要分布于扁桃体、上呼吸道及肺泡巨噬细胞和树突状细胞中，常通过损坏呼吸道粘膜及纤毛、减缓肺泡和血管内巨噬细胞的吞噬作用、改变T淋巴细胞亚群来抑制机体免疫机能，增强机体对其他病原的易感性，诱发更严重的肺部损伤及其他临床表现。诊断猪繁殖与呼吸综合症最精确的方法是病毒的分离培养（VI），适用于分离培养PRRSV的细胞系主要是猴肾细胞系Marc-145或MA104、猪原代肺泡巨噬细胞（PAM）及CL2621等。将肺脏、淋巴结、扁桃体、脾脏和血清等病料处理后接种于敏感细胞，对出现典型PRRSV细胞病变的分离物再进行IFA、RT-PCR、IPMA等进行验证。此外，大量的血清学检测方法也应用于PRRSV的诊断。其中，商业化PRRSVELISA检测试剂盒被许多国家列为标准或法定的操作方法。胶体金免疫层析法（GICA）凭借特异、敏感、不需要特殊仪器设备、结果判断较直观等优点，大量应用于基层兽医部门的快速诊断检测中，但该方法局限于只能检测美洲型PRRSV。目前，用于检测PRRSV的分子生物学技术包括RT-PCR、原位杂交技术、LAMP及基因芯片。1994年，Suarez等首次建立了PRRSV的RT-PCR检测方法。2006年，国内爆发高致病性PRRSV，周丹等针对Nsp2基因建立了区分PRRSV经典株和变异株的RT-PCR检测方法[55]。7 西南大学硕士学位论文为区分美洲株、欧洲株和变异株，施开创等针对Nsp2、ORF5、ORF7基因序列设计3对引物，建立可区分三种毒株的多重RT-PCR。近年来，国内外也建立了大量用于检测PRRSV的荧光定量PCR检测方法。Kleiboeker等建立了可区分欧洲株和美洲株的real-timePCR[56]。在国内，宋志军等首次建立的real-timePCR，敏感性高于普通RT-PCR。针对突变频率较高的PRRSV，Balka等建立了允许探针位置多点突变的实时荧光定量RT-PCR，克服了荧光探针对靶位点绝对保守的苛刻要求[57]。LAMP首次出现于2000年，近年来也开始应用于PRRSV检测。RoviraA等针对欧洲株和美洲株的ORF7设计引物，成功建立了检测PRRSV的二重反转录LAMP[58]。GaoM等选择保守的ORF6基因，建立了可鉴别检测美洲株和变异株的RT-LAMP[59]。基因芯片技术又称为DNA微阵列，郭焕成等根据变异株和经典株的核苷酸序列差异，设计双重PCR引物，并分别设计针对两种株型且长度为31-35nt的探针，建立了可以区分变异株与经典株的DNA微阵列。叶芬等根据PRRSV、CSFV、PCV2的基因序列，设计特异性引物和寡聚核苷酸探针，在多重PCR的基础上，成功建立了可区分三种病毒及欧洲株和美洲株的基因芯片检测方法。多种检测方法的建立为PRRSV的疫情监控、疾病诊断及进出境检疫提供可靠保障。1.2.1.3猪瘟病毒研究进展猪瘟是由黄病毒科瘟病毒属的猪瘟病毒（classicalswinefevervirus，CSFV）引起的一种以高热、出血为主要临床特征的接触性烈性传染病。世界动物卫生组织OIE列为必须报告的动物传染病，我国农业部列为一类动物疫病。CSFV粒子呈球形，核衣壳为二十面体对称，具有囊膜，电镜照片上可见到病毒粒子表面的纤突结构病毒粒子。目前，CSFV持续感染或与PRRSV、PCV2、Mhp等病原体混合感染的现象比较严重，一定程度上影响了我国养猪业的发展。病毒的分离培养是CSFV检测的“黄金法则”。通常，将染病或病死动物的组织悬液、全血、血清或血浆接种于猪瘟病毒的易感细胞PK15或SK6传代细胞系中，借助IFT或IPMA来检测是否感染CSFV。易感仔猪、兔体等动物接种试验也是检测猪瘟病毒的敏感方法。在血清学检测方法中，Robertson首次将荧光抗体技术用于猪瘟病料和组织培养物中CSFV的检测，随后荧光抗体法发展为国内外实验室诊断CSFV最常用的方法之一[60]。另外，ELISA检测方法是目前使用最多、发展最快的免疫检测技术，Saunders对640份血清进行ELISA和中和试验，二者的符合率大于90%，并且可在1～2h内完成检测[61]。以不同蛋白作为抗原建立的ELISA方法检测效果不同。MinLin等以嵌合蛋白C21EmsE2作为抗原建立的ELISA方法优于单独用Ems和E2蛋白片段作为抗原建立的ELISA方法[62]。目前，国内外均有商品化试剂盒，可用于临床样品的大批量筛查检测。分子生物学方法可实现病原的早期、微量检测，现已经建立了可检测单一或多种病原的RT-PCR、套式RT-PCR和荧光定量RT-PCR。LiuSS等采用多重RT-PCR的方法鉴别检测出HP-PRRSV、CSFV及猪捷申病毒（PTV）的混合感染。多重RT-PCR可同时检测多种病原，但对于多对引物的要求较高，检测病原种类越多敏感性越差。YangLi8 第1章文献综述等设计了CSFV的通用引物、C株疫苗株及野毒株的特异性引物，建立复合套式PCR，不仅能够检测出CSFV，而且还能够区分出野毒株和C株疫苗株[63]。荧光定量PCR方法不仅可以实现病原的定量检测，而且检测敏感性常高于普通PCR。XiaHY等采用基于引物探针能量转移模式的新型Real-timeRT-PCR方法对猪瘟病毒进行检测，经过PCR扩增以及熔解曲线分析后可区分野毒株和疫苗株。DNA微阵列是新一代的基因快速诊断技术。NeilLeBlanc等将TaqManReal-time与芯片技术有效结合，利用荧光定量PCR先进行瘟病毒属间鉴别检测，然后再借助芯片技术进一步进行种间检测。二者技术的结合既发挥两者的优点，又排除了荧光定量假阳性的干扰[64]。1.2.2猪传染性胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌研究进展1.2.2.1猪传染性胸膜肺炎放线杆菌研究进展猪传染性胸膜肺炎是一种由猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacilluspleuropneumoniae,APP）引起的，以急性出血性纤维素性胸膜肺炎或慢性纤维素性坏死性胸膜肺炎为主要特征的急性、热性、传染性呼吸道疾病。APP为革兰氏阴性小球杆菌，具有多形性，有荚膜，不形成芽孢，兼性厌氧，常需在二氧化碳的环境中生长。APP具有15个血清型，均具有致病性。我国主要流行的血清型为1型、2型、3型和7型。由于血清型众多，各血清型之间很少有交叉免疫保护，进而限制了疫苗的使用。APP耐药性增加和诊断不确定性一定程度上加重了其对规模化养猪业的危害。分离病原菌对其进行理化鉴定可初步检测APP，确诊还需进行乳胶凝聚试验、对流免疫电泳、ELISA、PCR及核酸杂交等实验。对流免疫电泳能在1小时内完成对1200份感染猪组织中APP的快速分离与分型，准确率高达99%，但该方法仅能诊断慢性带菌病例。ELISA在APP的诊断检测中也比较常用。姜宏泽等通过原核表达获得APP溶血外毒素ⅣA（ApxⅣA）重组蛋白，并以其为抗原建立了APP抗体的Dot-PPA-ELISA检测方法，该方法检测特异性强、敏感性高，可检测到胸膜肺炎放线杆菌标准阳性血清IgG的最低含量为8.374×10-9g[65]。由于APP血清型较多，而ELISA方法多针对相应地区的血清型进行研究建立。PCR方法可以直接检测病料组织、鼻腔和扁桃体悬液或间接检测肺组织、鼻腔和扁桃体拭子等混合培养物，也可检测经福尔马林固定、石蜡包埋组织中的APP，敏感性高于血清学和细菌分离法。国外学者分别根据APP的外膜蛋白（omlA）、荚膜基因（cpx）、荚膜合成（cps）基因、aroA基因、apxIVA基因、dsbE-like基因等特异保守序列，设计引物，成功建立了APP的诊断及分型方法。基因芯片技术可通过多条检测探针实现在单一检测中从种、亚种、型和亚型水平上同时鉴定多种病原体。肖国生根据APP、Mhp和PM的多个基因建立了APP-Mhp-PM联合共检及APP分型的cDNA芯片，有利于APP的快速检测和分型[66]。程亚楼以APP、PM、HPS、猪大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、猪链球菌6种猪常见致病菌为目标细菌，选取16-23SrRNA基因为靶基因，建立了由6条寡核苷酸探针和1对通用引物构成的猪常见致病菌基因芯片的检测方法，9 西南大学硕士学位论文可快速准确的鉴别检测猪常见致病菌[19]。1.2.2.2副猪嗜血杆菌研究进展副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌（Haemophilusparasuis,HPS）引起的一种以纤维素性浆膜炎、脑膜炎和多发性关节炎等为临床特征的接触性传染病。HPS是无芽孢、无鞭毛、无运动性的革兰氏阴性小杆菌，具有15个以上的血清型且各血清型间毒力差异较大。我国流行的HPS主要为4型（24.2%）、5型（19.2%）和13型（12.5%）。HPS是猪上呼吸道的常驻菌，作为一种机会菌种在PRRSV和PCV-2等免疫抑制性疾病感染的情况下危害较大，主要影响2～16周龄的猪，尤其是断奶前后和保育期的仔猪，发病率通常在10%~15%，严重时死亡率可达50%左右。随着我国养猪业的规模化、集约化的发展，该病的流行越来越广泛，严重危害我国养猪业的发展。将疑似病猪的胸腹腔积水、心包液、心血和关节液进行无菌采集，并分别接种于副嗜血杆菌培养基（+辅酶）中，置于5%CO2培养箱中，37℃条件下培养24～48h，观察结果若长出无色、透明、湿润、光滑的露珠样细小菌落则可初步判定为HPS。细菌分离仅可初步诊断依据，确诊仍需进行生化鉴定、血清学检测或分子生物学检测。血清学方法中间接ELISA是检测HPS病原较为敏感、特异的方法，与间接血凝试验相比更准确、敏感、客观。OliveiraS利用HPS超声波破碎抗原盐析物的技术建立相应的ELISA检测法，该法能特异地检测出仔猪母源抗体及被免疫猪的抗体[67]。王艳等将福尔马林灭活的HPS全菌作为包被抗原，建立了高特异性和重复性的HPS抗体检测间接ELISA方法[68]。此外，国内外建立了多种检测HPS的PCR方法。OliveiraS等建立的一种快速、特异检测HPS的PCR方法，其敏感性远远高于常规的细菌分离法，最低检测量为102CFU/mL[69]。基于15株参考菌株的16SrRNA序列，Angen等进行优化并建立了一种新的复合PCR检测法，可准确区分HPS与猪放线杆菌、吲哚放线杆菌及微小放线杆菌四种细菌[70]。其他快速诊断HPS的方法还包括基因芯片、原位杂交、LAMP等。1.2.3猪肺炎支原体研究进展猪支原体肺炎是由猪肺炎支原体（Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp）所引发的一种以气喘为主要症状，以肺部对称性肉变为主要病理变化的高发病率、低死亡率慢性接触性呼吸道传染病，普遍存在于世界各地，严重危害规模化养猪业的健康发展。支原体是一类介于细菌和病毒之间自行繁殖的原核生物，革兰氏染色阴性，结构简单，仅有细胞膜、核糖体和细胞核3种细胞器。该病原微生物主要存在于猪气管及支气管的纤毛上皮细胞和呼吸道黏膜层细胞中，阻碍机体免疫应答，破坏巨噬细胞的功能，极易诱发继发感染和混合感染，进而导致临床症状加剧和死亡率升高。最常见的继发性病原微生物主要包括猪繁殖与呼吸综合征病毒、圆环病毒、肺炎球菌、副猪嗜血杆菌、猪鼻支原体和多杀性巴氏杆菌等。两种以上病原微生物引起的混合感染或继发感染，大大增加了病原的诊断难度，不利于疾病的有效防治。10 第1章文献综述与其他病原体不同，受生长缓慢和菌落特征不明显等影响，分离培养不是Mhp的主要检测方法。Mhp的检测主要依靠血清学和分子生物学诊断方法。血清学诊断方法主要包括免疫荧光技术、凝集试验、放射免疫酶试验、补体结合试验、间接血凝试验和酶联免疫吸附试验（ELISA），其中间接血凝试验、补体结合试验和ELISA最为常用。然而，待检测血清中抗体可能与猪絮状支原体等其它微生物的抗原存在交叉反应，干扰Mhp的血清学检测结果，导致假阳性的出现。另外，血清学检测还存在无法区分Mhp抗体来自自然感染还是疫苗免疫的局限。因此，针对Mhp的特异保守序列，建立了大量PCR扩增、核酸探针、基因芯片及LAMP等基因层面的检测方法。Stemke等分别建立了检测Mhp、猪絮状支原体及猪鼻衣原体的普通PCR和套式PCR[71-72]。Zeeh等建立了可从活猪鼻拭子中检出Mhp的Real-timePCR，特异性达100%。顾盼盼等以16SrRNA为靶序列设计6条特异性引物，建立了30min即可完成的MhpLAMP快速检测方法。在国内，肖国生等根据Mhp的16SrRNA、P36和P46基因的差异序列，使用PCR标记Cy3探针，建立鉴定Mhp的芯片。核酸探针技术也用于Mhp的检测，但存在特异性不强、易产生交叉反应、需动物解剖样本等缺点，不利于快速诊断。多种检测方法的建立和结合，可快速鉴别多病原的混合或继发感染，为动物疫病的防控提供技术平台。11 西南大学硕士学位论文12 第2章引言第2章引言2.1研究目的及意义猪支原体肺炎（Mycoplasmapneumoniaeofswine，MPS）、猪传染性胸膜肺炎（Porcinecontagiouspleuropneumonia，PCP）、猪多发性浆膜炎与关节炎（Swinepolyserositisandarthrithis）、猪圆环病毒相关疾病（Porcinecircovirusassociateddisease，PCVAD）、猪繁殖与呼吸综合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS）和猪瘟（Classicalswinefever，CSF）分别是由猪肺炎支原体（Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp）、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacilluspleuropneumoniae，APP）、副猪嗜血杆菌（Haemophilusparasuis，HPS）、猪圆环病毒（Porcinecircovirustype2，PCV2）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV）和猪瘟病毒（Classicalswinefevervirus，CSFV）引起的一类急性、接触性传染病，广泛存在于世界各地，一定程度上限制了各国养猪业的规模化、集约化发展进程。90年代中期，北美提出猪呼吸道疾病综合征（Porcinerespiratorydiseasecomplex,PRDC）概念，该综合征是由病毒、细菌、支原体、寄生虫及不当管理条件等综合因素引起的以呼吸困难、咳嗽、发热、生长迟缓等为临床特征的一类呼吸道疾病，普遍存在于中国、美国、丹麦等多个国家。该病多发于保育猪（6-10周龄）和育肥猪（13-20周龄），发病率为10%-40%，死亡率可达2%-20%。保育猪发生PRDC，死亡率较高；生长育肥猪暴发PRDC，病程较长，生长迟缓，饲料转化率较低，养殖成本增加，为集约化养猪造成巨大的经济损失。流行病学调查发现，PRRSV、PCV-2、Mhp、APP、HPS和CSFV均为造成PRDC的主要病原体，且临床上常见多病原的混合感染或继发感染[73-74]。多病原的混合感染或继发感染不仅加重了患病猪群的病理变化，而且大大增加了病原诊断的难度。目前，PRDC病原的检测多进行单一病原的分离培养、血清学检测、PCR扩增等，缺少可同时检测多种病原的检测方法[75]。另外，PRDC缺乏代表性的临床症状和病理变化，一定程度上增加了对该病的诊断难度。因此，建立一种可同时检测多种PRDC病原的方法，节省检测成本，提高检测效率，对PRDC病原的流行病学调查和临床检测具有重要意义。基因芯片是将寡核苷酸探针（十几mer到70mer）有序固定于载体表面，与标记的靶序列按照碱基互补配对原则进行杂交，扫描分析检测结果。该技术既可应用多条探针来检测同一靶基因降低假阳性率，又可集成多种病原的基因探针对病原进行鉴别检测和基因分型，具有特异、快速、敏感、自动化等优点。现已有多种芯片方法应用于PCV-2、PRRSV、PPV及CSFV等多种猪病病原的检测，但尚无可同时检测APP、HPS、Mhp、PCV-2、PRRSV及CSFV六种病原的基因芯片方法。在不同国家、不同地区、不同养殖场，由于地理环境、饲养管理水平及品种差异，PRDC病原谱也存在显著差异。因此，针对我国引起PRDC的六种重要病原，建立同时检测六种病原的基因芯片方法不仅为基因芯片在疫病检测中的应用奠定了研究基础，而且该方法的建立也为PRDC六种重要病原的检测和监控提供了技术支持。13 西南大学硕士学位论文2.2研究内容2.2.1基因序列分析、引物和探针的设计根据GenBank登录的APP、HPS、Mhp、PCV-2、PRRSV和CSFV的不同株型序列，使用Mega5软件分析序列，选取每种病原的特异保守序列作为目的片段，分别使用PrimerPremier5.0和Oligo6.0软件设计特异性引物和探针。验证引物和探针的可用性和特异性。2.2.2单一病原基因芯片检测方法的建立优化PCR扩增的退火温度、外循环数和点样探针浓度、杂交液、杂交温度、杂交时间，分别建立六种病原单一检测的基因芯片方法。同时，对单一病原基因芯片检测方法进行特异性、敏感性、重复性试验，评估单一病原基因芯片检测方法。2.2.3六种病原单管同步检测基因芯片方法的建立在六种单一病原基因芯片检测方法的基础上，通过正交试验优化六对特异性嵌合引物的浓度，优化PCR外循环数和杂交时间、温度，建立可同步鉴别检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒和猪肺炎支原体六种病原的基因芯片方法。同时，通过特异性试验、敏感性试验、重复性试验、保存期试验、临床样本检测对方法进行客观、科学的评估。14 第2章引言2.3技术路线基因分析病毒的增殖或细菌及支目的基因选择原体的培养PCR引物设计核酸提取引物验证及PCR重要参数优化构建阳性质粒探针的设计与合成制备基因芯片特异性和敏感性试验重复性和稳定性试验方法比对及验证试验临床初步应用15 西南大学硕士学位论文16 第3章单一病原基因芯片检测方法的优化及建立第3章单一病原基因芯片检测方法的优化及建立3.1材料3.1.1病毒及细菌猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（APP，AP76）、副猪嗜血杆菌（HPS，SH0165）、猪肺炎支原体（Mhp，168-L）、猪圆环病毒2型（PCV-2，PM167）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV，BIAH-001）、猪瘟病毒疫苗株（CSFV，石门株）和沙门氏菌（Sal，实验室分离保存）均由重庆出入境检验检疫局技术中心动物检疫实验室培养保存。蓝舌病病毒（BTV，BTV4型）和小反刍兽疫病毒（PPRV，Nigeria75/1）由云南省出入境检验检疫局技术中心动物检疫实验室惠赠。猪水疱病病毒（SVDV）、水泡性口炎病毒（VSV，IND型）、口蹄疫病毒疫苗株（FMDV，OS株+JSL株）由中国农业科学院兰州兽医研究所惠赠。伪狂犬病病毒疫苗株（PRV，Bartha-K61）、猪细小病毒疫苗株（PPV，cp99）、日本乙型脑炎病毒疫苗株（JEV，SA14-14-2）由四川农业大学惠赠。3.1.2主要试剂试验中所使用的主要试剂见表3.1。表3.1主要试剂Table3.1ThePrimaryReagents试剂名称生产批号生产厂家ExTaqDNA聚合酶RR003宝生物工程（大连）有限公司支原体基础培养基20120814青岛高科园海博生物技术有限公司血琼脂平板20141226北京陆桥技术股份有限公司胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）9042242Becton,DickinsonandCompany胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）8276260Becton,DickinsonandCompanypMD®19T-VectorRR055A宝生物大连有限公司晶芯®基因芯片点样液0106141512博奥生物有限公司硼氢化钠2014081901成都市科龙化工试剂厂氯化钠（Nacl）20141001重庆川东化工（集团）有限公司氯化钾（KCl）20120301重庆川东化工（集团）有限公司磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）20141101重庆川东化工（集团）有限公司磷酸二氢钾（KH2PO4）20120901重庆川东化工（集团）有限公司柠檬酸三钠·2H2O20090721重庆川东化工（集团）有限公司十二烷基磺酸钠（SDS）A623BA0014LifeScienceProducts&Services17 西南大学硕士学位论文QIAamp®cador®PathogenMiniKitNO.54106QIAGEN公司细菌基因组DNA提取试剂盒DP302-02天根生化科技（北京）有限公司PremeScriptTMOneStepRT-PCRRR055A宝生物大连有限公司kitVer.2E.Z.N.ATMGelExtractionkit（50T）D2500-01宝生物大连有限公司PlasmidMiniKitI（100T）D6942-01*OMEGA公司3.1.3主要材料及仪器试验中使用的主要材料和仪器见表3.2。表3.2主要材料和仪器Table3.2Themainmaterialsandequipments仪器名称型号生产厂家晶芯®光学级醛基基片01810141504、00204151510博奥生物有限公司晶芯®4样品芯片围栏20110401博奥生物有限公司晶芯®4样品芯片盖片20100906博奥生物有限公司梯度PCR扩增仪ABIVerti基因有限公司全自动生物芯片点样仪TelecheSpotbot2+SciGence成都基因有限公司晶芯®微阵列扫描仪LuxScan10K博奥生物有限公司恒温水浴锅JuLaBoSW22M82650-33北京长风仪器仪表公司电泳仪及电泳槽3000Pac美国Bio-Rad公司全自动紫外凝胶成像系统SIM200E西蒙生物技术（国际）有限公司Ⅱ级生物安全柜ESCO新加坡ESCO公司CO2培养箱626083-10003美国Thermo公司超级纯水仪MilliQPlus美国Millipore公司制冰机FM130美国GRANT公司分光光度计V3.0012K1NO78002美国Thermo公司3.1.4主要试剂的配制支原体基础培养基：称取33g支原体基础培养基溶于1000mL超纯水中，搅拌使其完全溶解，121℃高压灭菌15min，待培养基冷却后严格按照无菌操作加入马血清100mL、青霉素80万单位及10%醋酸铊10mL，充分混匀后置于4℃条件下密封保存备用。TSB培养基：称取30g胰蛋白胨大豆肉汤溶于1000mL超纯水中，加热使其完全溶解，121℃高压灭菌15min，待培养基冷却后严格按照无菌操作加入新生牛血清50mL、1%NAD10mL，充分混匀后置于4℃条件下密封保存备用。TSA培养基：称取40g胰蛋白胨大豆琼脂溶于1000mL超纯水中，加热搅拌使其完全溶18 第3章单一病原基因芯片检测方法的优化及建立解，121℃高压灭菌15min，待培养基冷却到45～50℃左右倒平板，待平板完全凝固置于4℃冰箱中保存备用。营养肉汤培养基：称取19g营养肉汤溶于1000mL超纯水中，搅拌使粉末完全溶解，121℃高压灭菌15min，4℃条件保存备用。营养琼脂培养基（+Amp）：称取6.6g营养琼脂溶于200mL超纯水中，121℃高压灭菌15min，待培养基冷却至50℃左右，按照1:1000的比例加入200μL氨苄青霉素，混匀后倒平板，待平板完全凝固置于4℃冰箱中保存备用。引物稀释：将合成的引物干粉以6000rpm离心5min，根据nmol数计算加入DEPCH2O量溶解引物，制成100μM的贮存液。使用时，按照试验需求，将贮存液分别按照1:9和1:8的比例稀释成10μM和20μM，置于-20℃冰箱中保存。探针稀释：将合成的探针干粉以6000rpm离心5min，根据合成单溶解成100μM探针，将其置于-20℃冰箱中保存。2%琼脂糖凝胶：称量2g琼脂糖溶于100mL的1×TAE缓冲液中，微波加热使其完全溶解，待冷却至一定温度加入适量溴化乙锭，振荡混匀。20×SSC：称取NaCl175.2g，柠檬酸三钠·2H2O100.5g，溶解于800mL蒸馏水中，加热使其完全溶解，调节pH至7.0后定容至1L。使用0.22μm的无菌过滤器过滤后，121℃高压灭菌15min，室温保存。10×PBS：称取NaCl80g、KCl2g、Na2HPO4·12H2O35.8g、KH2PO42.7g，溶于800mL蒸馏水中，调节溶液的pH值至7.4后定容至1L。使用0.22μm的无菌过滤器过滤后，121℃高压灭菌15min，室温保存。10%SDS：称取SDS10g，溶于90mL蒸馏水中，加热使其完全溶解后，定容至100mL。使用0.22μm的无菌过滤器过滤后，室温保存。洗液Ⅰ：取蒸馏水588mL，加入10%SDS12mL，搅拌混匀。现配现用。芯片封闭液：取蒸馏水450mL和10×PBS45mL充分混匀后，加入NaBH41.5g，迅速搅拌使其完全溶解，加入无水乙醇150mL，充分搅拌混匀。现配现用。芯片杂交液（1mL）：取20×SSC500μL、10%SDS10μL及DEPCH2O于1.5mL离心管中，振荡均匀，-20℃保存备用。洗液Ⅱ：2×SSC+0.2%SDS。根据试验按比例配制，试验中常取528mL蒸馏水、60mL20×SSC和12mL10%SDS搅拌混匀，制备600mL洗液Ⅱ。现配现用。洗液Ⅲ：0.2×SSC。根据试验按比例配制，试验中常取594mL蒸馏水和6mL20×SSC搅拌混匀，制备600mL洗液Ⅲ。现配现用。3.2单一病原基因芯片检测方法的建立及优化3.2.1引物及探针的设计19 西南大学硕士学位论文3.2.1.1引物的设计试验中参考GeXP多重遗传分析系统中的标记方式，使用特异性嵌合引物和通用引物共同完成PCR产物的Cy3荧光标记。通用引物的设计：通用引物为一段非生物源性核苷酸序列。上游引物的5’端使用Cy3荧光标记，下游引物未作修饰，见表3.3。特异性嵌合引物的设计：根据GenBank登录的APP、HPS、Mhp、PCV-2、PRRSV和CSFV6种病原的多条基因序列，使用DNAStar中的MegAlign进行序列比对，基于APP的omIA基因、HPS的16SrRNA、Mhp的P46基因、PCV-2的外膜蛋白基因、PRRSV的GP5基因及CSFV的全基因序列选取特异保守的目的片段，使用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物。在特异性引物的5’端添加未作荧光修饰的通用标签F和通用标签R，见表3.4。表3.4中带下划线碱基为接头。所有引物均由宝生物工程（大连）有限公司合成。表3.3通用引物序列Table3.3Thesequencesofthegeneralprimer引物名称引物及探针序列（5’—3’）引物大小（bp）通用引物（F）Cy3-AGGTGACACTATAGAATA18通用引物（R）GTACGACTCACTATAGGGA19表3.4六对特异性嵌合引物序列Table3.4Thesequencesofspecificchimericprimers病原引物名称引物及探针序列（5’—3’）目的片段大小（bp）APP-FAGGTGACACTATAGAATATAGTGCTTACCGCATGTAGTGGAPPAPP-RGTACGACTCACTATAGGGATGGCTGCTCCGCTTTTGG145HPS-FAGGTGACACTATAGAATAAGCCGCGAGGTGGAGTGHPSHPS-RGTACGACTCACTATAGGGAGGTAAACGCCCCCTTTCA241Mhp-FAGGTGACACTATAGAATAGCCGAACAAGCAATCACCAAMhpMhp-RGTACGACTCACTATAGGGAACCCGAAGAACTTCAACAGCA213PCV-FAGGTGACACTATAGAATAGGGAGGAGTAGTTTACATAGGGGPCV-2PCV-RGTACGACTCACTATAGGGAATCAAGCGAACCACAGTCA308PRRSV-FAGGTGACACTATAGAATAGCGATTGCTTTCTTTGTGGTPRRSVPRRSV-RGTACGACTCACTATAGGGATGTCAAGGAAATGGCTGGT270CSFV-FAGGTGACACTATAGAATAGACCGCTGGTGACTTCGTCSFVCSFV-RGTACGACTCACTATAGGGAATCCCATTCCTTCTTTACTTTG2213.2.1.2探针的设计根据3.2.1.1选取的目的片段序列，使用PrimerPremier5.0和oligo6针对6种病原的特异保守序列分别设计多条特异性探针，使用NCBI中的BLAST进行初步筛查比对，理论上保证探针的特异性。同时，选取两段随机序列作为位置质控和杂交质控。杂交质控用作阳性对照，20 第3章单一病原基因芯片检测方法的优化及建立监控整个杂交过程。除位置质控序列外，其余探针的5’端均加15个碱基T和进行氨基修饰。位置质控仅在5’端进行氨基修饰，见表3.5。所有探针均由上海生工生物工程股份有限公司合成。表3.5寡核苷酸探针序列Table3.5Thesequenceofoligonucleotideprobes名称探针序列（5’—3’）探针长度（bp）APPNH2-T15-GTTCATCGCCTAAACCAAATTCGGAATCTACGCC49HPSNH2-T15-GAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTG53MhpNH2-T15-AAACTTTTATCAAAGACGGCGATCAAAATATGAC49PCV-2NH2-T15-GGTGACAGGGGAGTGGGCTCCAGTGCTGTTATTCTAG52PRRSVNH2-T15-GCTGTAGATGGGAGCTGCTGTCGTTGCTGGCGTTG50CSFVNH2-T15-ACTACTGGCTTCTGCTTCACCCACTTATACATCACCT52位置质控NH2-GCTGCCTCGGCAAGGAGT-Cy318杂交质控NH2-T15-AATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGAC53杂交质控阳性品Cy3-GTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATT383.2.2细菌的培养3.2.2.1APP的培养将实验室保存的APP菌种划线接种到血琼脂平板表面，含5%二氧化碳条件下，37℃培养24～48h，挑取露珠样的单菌落于胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）中进行扩大培养，无菌条件下使用1.5mL离心管分装菌液，并保存于-80℃冰箱。剩余菌液置于4℃冰箱中或直接提取细菌核酸。3.2.2.2HPS的培养将实验室保存的HPS菌种划线接种胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA平板），37℃、5%CO2培养箱中培养24～48h，挑取无色、透明、湿润、光滑、边缘整齐、针头大小的单菌落于TSB中进行扩大培养，无菌条件下使用1.5mL离心管分装菌液，并保存于-80℃冰箱。剩余菌液置于4℃冰箱中或直接提取细菌核酸。3.2.2.3Mhp的培养将实验室保存的Mhp干粉挑取少量接种于支原体基础培养基中，37℃、5%二氧化碳条件下培养2～3周，无菌条件下使用1.5mL离心管分装菌液，并保存于-80℃冰箱。剩余菌液置于4℃冰箱中或直接提取核酸。21 西南大学硕士学位论文3.2.3核酸提取3.2.3.1细菌DNA的提取取适量APP和HPS的菌液，采用天根生化科技（北京）有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA，根据试剂盒说明书按如下步骤提取：（1）取细菌培养液3～5mL，1000rpm离心1min，弃上清保留菌体沉淀物。（2）向离心管中加入200μL缓冲液GA，充分振荡至沉淀完全悬浮。（3）加入20μLProteinaseK，涡旋振荡混匀。（4）向离心管中加入220μL缓冲液GB，涡旋振荡15sec，70℃放置10min，待溶液变清亮后简短离心去除管内壁的水珠。（5）向离心管中加入220μL无水乙醇，充分涡旋振荡混匀（可能出现絮状沉淀），简短离心去除管内壁的水珠。（6）将步骤（5）中所得溶液和絮状沉淀加入吸附柱CB3中，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。（7）向吸附柱CB3加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱CB3放回收集管中。（8）向吸附柱CB3加入600μL缓冲液PW，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱CB3放回收集管中。（9）重复步骤（8）。（10）将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温下3～5min，尽量晾干残留的漂洗液。（11）将吸附柱CB3转入一个无菌的离心管中，加入50～200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2～5min，12000rpm离心2min，将洗脱液收集到离心管中，使用分光光度计测定核酸浓度并将核酸-80℃保存备用。3.2.3.2Mhp、PRRSV、PCV-2和CSFV核酸的提取取实验室保存的PCV-2、PRRSV、CSFV的细胞培养物和Mhp的菌液，按照QIAGEN公司的QIAamp®cador®PathogenMiniKit说明书步骤提取病原的DNA/RNA，具体操作步骤如下:（1）根据样品数量取等量灭菌的干净离心管，加入20μLproteinaseK。（2）加入200μL细胞培养物/菌液，不足200μL的样品加入PBS/生理盐水补足。（3）加入100μLBufferVXL，涡旋振荡混匀，20～25℃孵育15min。（4）加入350μLBufferACB，涡旋振荡混匀，简短离心以去除管壁内水珠。（5）将上述所得混合溶液转移至吸附柱中，8000rpm离心1min，更换2mL收集管。（6）加入600μLBufferAW1，8000rpm离心1min，更换2mL收集管。（7）加入600μLBufferAW2，8000rpm离心1min，更换2mL收集管。22 第3章单一病原基因芯片检测方法的优化及建立（8）将吸附柱置于干净的收集管中，14000rpm离心2min。（9）将吸附柱转入一个无菌的离心管中，加入50～150μLBufferAVE，室温放置2～5min，14000rpm离心1min，将溶液收集到离心管中，将提取的核酸-80℃保存备用。3.2.4目的基因的扩增3.2.4.1PRRSV和CSFVRNA的反转录以PRRSV和CSFV病毒的RNA为模板，反转录为cDNA，反转录体系见表3.6。将反转录体系按照42℃，60min；95℃，5min的条件进行反应。反转录后产物保存于-80℃冰箱中。表3.6反转录体系组成Table3.6Thereversetranscriptionsystem成分体积（μL）5×RT缓冲液410mmol/LdNTP2RNA酶抑制剂1M-MLV反转录酶1下游引物（20μM）1RNA5DEPCH2O63.2.4.2目的基因的PCR扩增分别以APP、HPS、Mhp、PCV-2的DNA和PRRSV、CSFV的cDNA为模板，进行普通PCR扩增，扩增体系如下：表3.7普通PCR扩增体系Table3.7TheamplificationsystemofPCR成分体积（μL）ExTaq酶12.5上游引物（20μM）1下游引物（20μM）1DNA/cDNA5DEPCH2O5.5扩增条件：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃25s，35个循环；72℃10min；4℃保存。取5μLPCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，电泳条件：110V，30min，观察结果。3.2.5目的基因克隆3.2.5.1PCR产物纯化按照E.Z.N.A.TMGelExtractionKit说明书的操作步骤，进行胶回收纯化PCR产物，PCR23 西南大学硕士学位论文产物纯化步骤如下：（1）按照50μLPCR扩增体系制备6种病原的PCR产物，取50μL产物进行2%琼脂糖凝胶电泳。在紫外灯下迅速切取所需目的条带。（2）称取凝胶块的重量，根据1g凝胶加入1mLBindingBuffer的比例加入BindingBuffer，55～60℃水浴加热至凝胶完全溶解。（3）将完全溶解的DNA/凝胶混合液转移至置于2mL收集管内的HiBindDNA柱子中，1000×g离心1min，倒弃滤液，将柱子放回收集管。注意事项：HiBindDNA柱一次性最多可装700μL溶液，若混合液超过700μL，每次转移700μL至柱子中，然后重复步骤（3）。（4）加入300μLBindingBuffer，1000×g离心1min，倒弃滤液，将柱子放回收集管。（5）加入700μLSPWWashBuffer，1000×g离心1min，倒弃滤液，将柱子放回收集管。（6）重复步骤（5）。（7）空柱以13000×g离心2min。（8）将柱子装至灭菌的1.5mL离心管中，加入50μL65℃预热的ElutionBuffer，室温静置2～5min。13000×g离心2min，洗脱溶液保存于-20℃。3.2.5.2胶回收产物的连接转化pMD19-TVector是一种高效克隆PCR产物的专用载体，在微量离心管中配制连接体系（见表3.8），总体积为10μL。连接条件：16℃连接2h。表3.8连接体系Table3.8Theconnectionsystem组成体积（μL）pMD19-TVector（50ng/μL）1DNA4SolutionI5将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，具体操作步骤如下：（1）取出-80℃保存的DH5α感受态细胞（100μL），放于冰上融化；（2）向感受态细胞中加入10μL连接产物，冰中放置30min；（3）42℃加热90s，立即置于冰上2～3min；（4）加入890μL37℃预热好的营养肉汤（不含氨苄青霉素），使其终体积为1mL，37℃振荡培养1.5～2h；（5）对培养的菌液4000rpm离心5min，弃900μL上清；（6）涡旋振荡使沉淀完全悬浮，取适量涂布于平板上，37℃倒置过夜培养。（7）挑取大小适中的单菌落，使用5mL含氨苄青霉素的营养肉汤进行扩大培养。培养条件：37℃，150rpm，过夜培养。24 第3章单一病原基因芯片检测方法的优化及建立3.2.5.3重组质粒的提取及鉴定采用E.Z.N.APlasmidMiniprepProtocol质粒小规模提取试剂盒提取pMD19T-APP、pMD19T-HPS、pMD19T-Mhp、pMD19T-PCV2、pMD19T-PRRSV和pMD19T-CSFV，操作规程如下：（1）取2.5.2中扩大培养的菌液1.5～5mL室温条件10000×g离心1min；（2）弃除上清，加入250μL溶液I（含RNaseA），涡旋振荡使菌体完全悬浮；（3）加入250μL溶液II，室温颠倒4～6次，室温孵育2min；（4）加入350μL溶液III，温和颠倒数次，至出现白色絮状沉淀，10000×g离心10min；（5）将上清转移至装配好离心管的吸附柱中，尽量避免取到沉淀和细胞碎片，10000×g离心1min，倒弃滤液；（6）加入500μLBufferHB，10000×g离心1min，倒弃滤液；（7）加入750μLWashBuffer清洗吸附柱，10000×g离心1min，倒弃滤液；（8）重复步骤（7）；（9）将吸附柱置于离心管中，12000×g离心2min，弃滤液及离心管；（10）将吸附柱放入灭菌的1.5mL离心管中，向吸附柱滤膜中心加入30～50μLElutionBuffer，室温静置2～5min，12000×g离心1min，-20℃保存离心管中的溶液。（11）筛选阳性质粒：以步骤（10）中获得的质粒为模板，按照2.4.2体系进行普通PCR扩增，PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳。将电泳结果阳性的质粒送上海桑尼测序有限公司进行测序分析，测序结果采用DNAStar和Blast进行分析。测序正确的质粒分别命名为：pMD19T-APP、pMD19T-HPS、pMD19T-Mhp、pMD19T-PCV2、pMD19T-PRRSV和pMD19T-CSFV。将构建的阳性质粒作为后期试验的模板，-20℃保存。3.2.6单一病原基因芯片检测方法的优化及建立3.2.6.1单重PCR扩增退火温度的优化在试验中涉及到特异性嵌合引物和通用引物的使用，查询文献可知，通用引物的退火温度多为50℃，因此，未对通用引物的退火温度进行优化。试验中，根据表1的扩增体系对六对特异性嵌合引物的退火温度进行优化，反应条件：94℃5min；94℃30s，54～64℃30s，72℃25s，12个循环；94℃30s，50℃30s，72℃25s，20个循环；72℃10min；4℃保存。表3.9PCR扩增体系Table3.9TheamplificationsystemofPCR组成体积（μL）ExTaq酶12.5上游特异性嵌合引物（10μM）0.2下游特异性嵌合引物（10μM）0.2上游通用引物（20μM）1下游通用引物（20μM）125 西南大学硕士学位论文模板1DEPCH2O9.13.2.6.2基因芯片制备3.2.6.2.1基因芯片矩阵设计APP、HPS、Mhp、PCV-2、PRRSV和CSFV基因芯片设计微阵列为8×7阵列（见图3.1）：1-6分别为APP、HPS、Mhp、PCV-2、PRRSV和CSFV的检测探针，均有4个点的重复；P为位置质控探针，共有16个点的重复；H为杂交质控探针，共有4个点的重复，监控杂交过程；N为阴性对照，共有12个点的重复。PPPPPPPPHHHHNNNN111122223333444455556666NNNNNNNNPPPPPPPPP:位置质控;H:杂交质控;N:阴性对照;1:APP;2:HPS;3:Mhp;4:PCV-2;5:PRRSV;6:CSFV图3.1探针点样示意图Fig.3.1DiagramofthechipsquarewithprobesofsixpathogensP:Postioncontrol;H:hybridizationcontrol;N:Negativecontrol;1:APP;2:HPS;3:Mhp;4:PCV-2;5:PRRSV;6:CSFV3.2.6.2.2基因芯片点样模式使用全自动生物芯片点样仪将探针点样于醛基基片，每个样品重复点样4次。点样模式为每张基片4个矩阵，每个矩阵为8（列）×7（行）。点样参数见表3.10。表3.10点样参数Table3.10TheparametersofSampleApplicationPinType946MP4PinsPinConfiguration2×1PlatesPartialLastMicroplateSpotSpacing300μmMicroarraysSubgridDimensions8×7Printoffset8.0×25.5mmSubstratesPre-printSpotsPerSample2026 第3章单一病原基因芯片检测方法的优化及建立Sampleloading0.1secMotionPre-printing0.1secPrinting0.1secNumberofWash/Drycycles12次Wash/DryDuringWashDuration2.0secPrintingDryDuration2.0secDifferentDurayionsLastcycleWashDuration3.0secForLastcycleLastcycleDryDuration15.0secEndofprintRunNumberofWash/Drycycles10次Wash/DryEndofWashDuration2.0secPrintRunDryDuration2.0secDifferentDurayionsLastcycleWashDuration3.0secForLastcycleLastcycleDryDuration15sec3.2.6.2.3芯片点样后处理将点制芯片置于湿盒中，37℃避光水化过夜，然后按照如下步骤进行封闭固定：（1）配制SolutionI：在烧杯中加入588mL超纯水，同时加入12mL10%SDS。将湿盒中取出的芯片放在芯片架上置于清洗液中，室温，100rpm摇动5min。（2）将芯片架转移至另外一个装有750mL～800mL超纯水的烧杯中，迅速提拉芯片架40次，换干净的超纯水重复一次。（3）配制封闭液：在烧杯中加入405mL超纯水，同时加入45mL10×PBS，搅拌混匀。称取1.5g硼氢化钠，加入到烧杯中，迅速搅拌使其完全溶解后，加入150mL无水乙醇，搅拌混匀。将超纯水洗涤后的芯片置于封闭液中，室温，100rpm摇动5min。（3）芯片架转移至另外一个装有750mL～800mL超纯水的烧杯中，迅速提拉芯片架40次，换干净的超纯水重复一次。将芯片快速装于50mL离心管中，1000rpm离心3min，去除芯片表面水珠。固定封闭后芯片避光保存于4℃冰箱中。3.2.6.2.4样品标记以制备的APP、HPS、Mhp、PCV-2、PRRSV和CSFV的阳性质粒为模板，按照2.6.1中的体系进行PCR扩增，扩增条件为：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃25s，12个循环；94℃30s，50℃30s，72℃25s，20个循环；72℃10min；4℃避光保存。3.2.6.2.5芯片杂交取8μL荧光标记的PCR产物、7.9μL杂交缓冲液和0.1μL杂交质控混合均匀后，放入PCR扩增仪中95℃变性8min，立即置于冰上5min。打开芯片杂交盒，将杂交盒底部凹槽27 西南大学硕士学位论文内加入约200μL灭菌水。放上芯片盖片，通过加样孔缓慢加入15μL变性后的杂交液。盖紧杂交盒盖，安装上铝合金封条，置42℃水浴锅中避光杂交3h。3.2.6.2.6芯片洗涤避光杂交3h后取出芯片，立即浸入42℃预热的SolutionⅡ中，120rpm清洗5min；将芯片转移至42℃预热的SolutionⅢ中，120rpm清洗5min；最后将芯片转移至42℃预热的超纯水中，120rpm清洗5min，转移至离心管，2000rpm离心2min甩干芯片表面的水珠，立即扫描分析结果。3.2.6.2.7芯片扫描及信号分析打开LuxScan10K的Cy3绿色荧光通道，设置芯片扫描仪的参数：Power：90%、PMT：850、扫描分辨率：10μM，结果保存为TIF格式。使用扫描仪自带的分析软件分析信号，参数设置为：Block8×7矩阵，样点直径为100μM，行间距和列间距均为300μM。分析获得数据，当样点荧光信号强度中位值大于空白荧光信号中位值和信噪比SNR（样点荧光信号中位值/背景荧光信号中位值）大于1.5时判定为阳性。3.2.6.3基因芯片方法条件优化3.2.6.3.1点样探针浓度的优化将探针使用DEPCH2O稀释成100μM，使用点样缓冲液（北京博奥公司）将探针稀释成20μM、40μM、50μM、60μM、80μM。将不同浓度的探针点至醛基基片，37℃过夜水化，固定封闭，42℃避光杂交，选择最佳点样探针浓度。3.2.6.3.2杂交液的优化按照表3.11，配制三种不同的杂交液，以Mhp和PRRSV的阳性质粒为模板，按照步骤2.6.2进行扩增杂交，比较不同杂交液的效果，筛选最佳的杂交液。表3.11.不同杂交液的配制Table3.11Thecompoundofdifferenthybridizationsolution杂交液1杂交液2杂交液3甲酰胺48μL甲酰胺25μL20×SSC50μL20×SSC50μL20×SSC15μL10%SDS1μL10%SDS2μL50×Dehardt’s10μLDEPCH2O49μL10%SDS2μLDEPCH2O48μL3.2.6.3.3PCR外循环数优化28 第3章单一病原基因芯片检测方法的优化及建立样品标记的多少对荧光信号强弱具有直接的影响，本实验对PCR扩增过程中的外循环数进行优化，设计外循环数为15、20、25、30、35和40次进行PCR扩增，扩增产物按照步骤2.6.2进行杂交，分析比较杂交结果，最终确定最佳循环数。3.2.6.3.4杂交温度优化杂交温度是影响芯片杂交的重要因素之一。本实验以APP、HPS、Mhp、PCV-2、PRRSV和CSFV的阳性质粒为模板，选取同一批次制备的芯片，保证其他杂交条件最佳情况下进行杂交，杂交温度依次设置为室温、37℃、42℃、50℃、55℃和60℃进行杂交，根据扫描分析结果确定最佳杂交温度。3.2.6.3.5杂交时间优化杂交时间的长短也是影响芯片杂交效果的重要因素。本实验以APP、HPS、Mhp、PCV-2、PRRSV和CSFV的阳性质粒为模板，选取同一批次制备的芯片，在其他优化条件的基础上，优化杂交时间，杂交时间依次设置为1h、2h、3h、4h、5h和6h，根据扫描分析结果确定最优杂交时间。3.2.6.4单一病原基因芯片方法学评估3.2.6.4.1特异性试验以伪狂犬病病毒、猪细小病毒、日本乙型脑炎病毒、猪水疱病病毒、水泡性口炎病毒、口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、小反刍兽疫病毒和沙门氏菌的核酸为模板，分别按照六种病原优化后的体系进行特异性试验。3.2.6.4.2敏感性试验使用分光光度计测定六种阳性质粒的浓度，再根据公式copies/μL=(6.02×1023)×(ng/μL×10-9)/(DNAlength×660)计算拷贝数。据换算可知：六种质粒的浓度分别为APP:2.97×108拷贝/μL、HPS:4.38×109拷贝/μL、Mhp:8.26×108拷贝/μL、PCV-2:3.78×108拷贝/μL、PRRSV:1.38×109拷贝/μL和CSFV:3.32×108拷贝/μL。分别将六种质粒进行10倍倍比稀释，进行基因芯片方法敏感性试验。同时，将PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，与基因芯片方法进行比较分析。3.2.6.4.3重复性和稳定性试验选取4张不同批次制备的基因芯片，分别以六种阳性质粒为模板，进行PCR扩增后杂交，每种质粒进行3个矩阵的重复，进行方法的重复性和稳定性试验。29 西南大学硕士学位论文3.3结果3.3.1病原核酸PCR扩增结果分别以六种病原的DNA/cDNA为模板，使用未加接头的特异性引物进行PCR扩增，扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，结果显示均出现与预期条带大小一致、清晰明亮的目的条带（图3.2）。M1234562000bp1000bp750bp308bp270bp500bp213bp221bp241bp145bp250bp100bpM:DL2000Marker;1:APP;2:Mhp;3:CSFV;4:HPS;5:PRRSV;6:PCV-2图3.2.目的片段特异性扩增电泳图Fig.3.2AmplificationofsixgenefragmentsbysinglePCR3.3.2重组质粒PCR鉴定结果采用未加接头的特异性引物，进行PCR扩增，分别构建六种病原的重组质粒。将电泳结果为阳性的重组质粒，送至上海桑尼测序有限公司测序，测序结果经Blast比对结果显示目的片段与GenBank中已发表的序列几乎完全符合（见图3.3-图3.8），说明设计的引物符合实验要求，可对目的片段进行特异性扩增。图3.3.APP阳性质粒测序Blast结果Fig.3.3ThesequenceblastresultsofAPPpositiveplasmid30 第3章单一病原基因芯片检测方法的优化及建立图3.4.HPS阳性质粒测序Blast结果Fig.3.4ThesequenceblastresultsofHPSpositiveplasmid图3.5.Mhp阳性质粒测序Blast结果Fig.3.5ThesequenceblastresultsofMhppositiveplasmid图3.6.PCV-2阳性质粒测序Blast结果Fig.3.6ThesequenceblastresultsofPCV-2positiveplasmid31 西南大学硕士学位论文图3.7.PRRSV阳性质粒测序Blast结果Fig.3.7ThesequenceblastresultsofPRRSVpositiveplasmid图3.8CSFV阳性质粒测序Blast结果Fig.3.8ThesequenceblastresultsofCSFVpositiveplasmid3.3.3六种病原PCR扩增退火温度优化结果以六种病原的阳性质粒为模板，使用特异性嵌合引物和通用引物进行不同退火温度的PCR扩增，根据电泳结果确定最佳的退火温度。综合六种病原PCR产物电泳结果可知，最佳退火温度的范围为56～58℃（图3.9～图3.14）。32 第3章单一病原基因芯片检测方法的优化及建立M123456M1234562000bp2000bp1000bp1000bp750bp750bp500bp500bp250bp250bp100bp100bp图3.9.APP退火温度优化结果图3.10.HPS退火温度优化结果M:DL2000DNAMarker;1:54℃;2:56℃;3:58℃;4:60℃;M:DL2000DNAMarker;1:54℃;2:56℃;3:58℃;5:62℃;6:64℃4:60℃;5:62℃;6:64℃Fig.3.9TheresultsofAPPannealingtemperatureFig.3.10TheresultsofHPSannealingM:DL2000DNAMarker;1:54℃;2:56℃;3:58℃;4:60℃;temperature5:62℃;6:64℃M:DL2000DNAMarker;1:54℃;2:56℃;3:58℃;4:60℃;5:62℃;6:64℃M123456M1234562000bp2000bp1000bp1000bp750bp750bp500bp500bp250bp250bp100bp100bp图3.11Mhp退火温度优化结果图3.12PCV-2退火温度优化结果M:DL2000DNAMarker;1:54℃;2:56℃;3:58℃;M:DL2000DNAMarker;1:54℃;2:56℃;3:58℃;4:60℃;5:62℃;6:64℃4:60℃;5:62℃;6:64℃Fig.3.11TheresultsofMhpannealingFig.3.12TheresultsofPCV-2annealingtemperaturetemperatureM:DL2000DNAMarker;1:54℃;2:56℃;3:58℃;M:DL2000DNAMarker;1:54℃;2:56℃;3:58℃;4:60℃;5:62℃;6:64℃4:60℃;5:62℃;6:64℃33 西南大学硕士学位论文M123456M1234562000bp2000bp1000bp1000bp750bp750bp500bp500bp250bp250bp100bp100bp图3.13PRRSV退火温度优化结果图3.14CSFV退火温度优化结果M:DL2000DNAMarker;1:54℃;2:56℃;3:58℃;4:60℃;5:62℃;6:64℃M:DL2000DNAMarker;1:54℃;2:56℃;3:58℃;4:60℃;5:62℃;6:64℃Fig.3.13TheresultsofPRRSVannealingtemperatureFig.3.14TheresultsofCSFVannealingtemperatureM:DL2000DNAMarker;1:54℃;2:56℃;3:58℃;4:60℃;5:62℃;6:64℃M:DL2000DNAMarker;1:54℃;2:56℃;3:58℃;4:60℃;5:62℃;6:64℃3.3.4六种病原检测探针筛选结果根据六种病原的目的片段，分别设计两条检测探针，并将其点制于醛基基片上。以六种阳性质粒为模板进行扩增标记，与封闭后的醛基进行杂交，筛选可用的检测探针。图3.15中A-F分别为APP、HPS、Mhp、PCV-2、PRRSV和CSFV质粒的芯片检测结果，位置质控和杂交质控探针处均出现稳定的杂交信号，APP、Mhp、CSFV和PRRSV对应的检测探针位置均出现稳定的杂交信号。HPS和PCV-2对应检测探针出现的杂交信号较弱，根据初筛结果，重新设计HPS和PCV-2的检测探针，结果见图3.15中的G和H。ABCDEFGH图3.15特异性检测探针筛选结果A:APP;B:HPS;C:Mhp;D:PCV-2;E:PRRSV;F:CSFV;G:HPS第二条探针;H:PCV-2第二条探针Fig.3.15ThescreeningresultsofspecificdetectionprobeA:APP;B:HPS;C:Mhp;D:PCV-2;E:PRRSV;F:CSFV;G:TheotherHPSprobe;H:TheotherPCV-2probe34 第3章单一病原基因芯片检测方法的优化及建立3.3.5探针点样浓度优化结果以位置质控探针为例进行探针点样浓度的优化，结果见图3.16和3.17：杂交位点的荧光信号中位值随探针浓度不断增加而加强，当探针浓度为50μM时，荧光信号中位值达到饱和。因此，选择50μM为点样探针浓度。ABCDE图3.16点样探针浓度优化A:20μM;B:40μM;C:50μM;D:60μM;E:80μMFig.3.16TheoptimizationresultsofprobeconcentrationA:20μM;B:40μM;C:50μM;D:60μM;E:80μM图3.17不同探针浓度对杂交信号的影响Fig3.17Theinfluenceofdifferentprobeconcentrationformedianfluorescence3.3.6杂交液的优化结果以PRRSV和Mhp的PCR产物进行杂交，比较三种不同杂交液的杂交效果，结果见图3.18。由图可知，三种杂交液的效果相差较小，未加入甲酰胺也可得到稳定的杂交信号，且杂交背景较弱。因此，选择第三种杂交液：20×SSC50μL、10%SDS1μL和DEPCH2O49μL。35 西南大学硕士学位论文图3.18不同杂交液对杂交信号的影响Fig.3.18Thedifferencebetweendifferenthybridizationsolution3.3.7PCR外循环数优化结果试验中，使用通用标签将PCR产物进行荧光标记，涉及通用标签作用的扩增循环数一定程度影响了荧光信号的强弱。试验优化时，分别以每一种病原的质粒为模板，对外循环数进行优化，结果如图3.19～图3.25。根据杂交结果可知，外循环数为25～30次均可达到较优的杂交结果。ABCDEF图3.19APP外循环数的优化结果A:15次;B:20次;C:25次;D:30次;E:35次;F:40次Fig3.19TheresultsofAPPoutercyclenumbersA:15times;B:20times;C:25times;D:30times;E:35times;F:40timesABCDEF图3.20HPS外循环数的优化结果A:15次;B:20次;C:25次;D:30次;E:35次;F:40次Fig3.20TheresultsofHPSoutercyclenumbersA:15times;B:20times;C:25times;D:30times;E:35times;F:40times36 第3章单一病原基因芯片检测方法的优化及建立ABCDEF图3.21Mhp外循环数的优化结果A:15次;B:20次;C:25次;D:30次;E:35次;F:40次Fig3.21TheresultsofMhpoutercyclenumbersA:15times;B:20times;C:25times;D:30times;E:35times;F:40timesABCDEF图3.22PCV-2外循环数的优化结果A:15次;B:20次;C:25次;D:30次;E:35次;F:40次Fig3.22TheresultsofPCV-2outercyclenumbersA:15times;B:20times;C:25times;D:30times;E:35times;F:40timesABCDEF图3.23PRRSV外循环数的优化结果A:15次;B:20次;C:25次;D:30次;E:35次;F:40次Fig3.23TheresultsofPRRSVoutercyclenumbersA:15times;B:20times;C:25times;D:30times;E:35times;F:40timesABCDEF图3.24CSFV循环数的优化A:15次;B:20次;C:25次;D:30次;E:35次;F:40次Fig3.24TheresultsofCSFVoutercyclenumbersA:15times;B:20times;C:25times;D:30times;E:35times;F:40times37 西南大学硕士学位论文图3.25六种病原不同外循环数对荧光信号中位值的影响Fig3.25Theinfluenceofdifferentoutercyclenumbersformedianfluorescence3.3.8杂交温度优化本实验分别以六种病原的阳性质粒为模板，取同一批次制备的芯片进行室温、37℃、42℃、50℃、55℃和60℃六种不同温度的杂交，杂交结果如图3.26～图3.32。综合分析六种模板不同温度的杂交结果，确定最佳杂交温度为42℃。ABCDEF图3.26APP杂交温度优化结果A:室温;B:37℃;C:42℃;D:50℃;E:55℃;F:60℃Fig3.26TheoptimizationresultsofAPPhybridizationtemperatureA:roomtemperature;B:37℃;C:42℃;D:50℃;E:55℃;F:60℃ABCDEF图3.27HPS杂交温度优化结果A:室温;B:37℃;C:42℃;D:50℃;E:55℃;F:60℃Fig3.27TheoptimizationresultsofHPShybridizationtemperatureA:roomtemperature;B:37℃;C:42℃;D:50℃;E:55℃;F:60℃38 第3章单一病原基因芯片检测方法的优化及建立ABCDEF图3.28Mhp杂交温度优化结果A:室温;B:37℃;C:42℃;D:50℃;E:55℃;F:60℃Fig3.28TheoptimizationresultsofMhphybridizationtemperatureA:roomtemperature;B:37℃;C:42℃;D:50℃;E:55℃;F:60℃ABCDEF图3.29PCV-2杂交温度优化结果A:室温;B:37℃;C:42℃;D:50℃;E:55℃;F:60℃Fig3.29TheoptimizationresultsofPCV-2hybridizationtemperatureA:roomtemperature;B:37℃;C:42℃;D:50℃;E:55℃;F:60℃ABCDEF图3.30PRRSV杂交温度优化结果A:室温;B:37℃;C:42℃;D:50℃;E:55℃;F:60℃Fig3.30TheoptimizationresultsofPRRSVhybridizationtemperatureA:roomtemperature;B:37℃;C:42℃;D:50℃;E:55℃;F:60℃ABCDEF图3.31CSFV杂交温度优化结果A:室温;B:37℃;C:42℃;D:50℃;E:55℃;F:60℃Fig3.31TheoptimizationresultsofCSFVhybridizationtemperatureA:roomtemperature;B:37℃;C:42℃;D:50℃;E:55℃;F:60℃39 西南大学硕士学位论文图3.32六种病原不同杂交温度对荧光信号中位值的影响Fig3.32Theinfluenceofdifferenthybridizationtemperatureformedianfluorescence3.3.9杂交时间优化结果本实验分别以六种病原的阳性质粒为模板，取同一批次制备的芯片进行1h、2h、3h、4h、5h和6h六种不同时间的杂交，杂交结果如图3.33～图3.39。综合分析六种模板不同杂交时间的杂交结果，确定最佳杂交时间为3h。ABCDEF图3.33APP不同杂交时间的杂交结果A:1h;B:2h;C:3h;D:4h;E:5h;F:6hFig3.33ThehybridizationresultsofAPPhybridizationtimeA:1h;B:2h;C:3h;D:4h;E:5h;F:6hABCDEF图3.34HPS不同杂交时间的杂交结果A:1h;B:2h;C:3h;D:4h;E:5h;F:6hFig3.34ThehybridizationresultsofHPShybridizationtimeA:1h;B:2h;C:3h;D:4h;E:5h;F:6h40 第3章单一病原基因芯片检测方法的优化及建立ABCDEF图3.35Mhp不同杂交时间的杂交结果A:1h;B:2h;C:3h;D:4h;E:5h;F:6hFig3.35ThehybridizationresultsofMhphybridizationtimeA:1h;B:2h;C:3h;D:4h;E:5h;F:6hABCDEF图3.36PCV-2不同杂交时间的杂交结果A:1h;B:2h;C:3h;D:4h;E:5h;F:6hFig3.36ThehybridizationresultsofPCV-2hybridizationtimeA:1h;B:2h;C:3h;D:4h;E:5h;F:6hABCDEF图3.37PRRSV不同杂交时间的杂交结果A:1h;B:2h;C:3h;D:4h;E:5h;F:6hFig3.37ThehybridizationresultsofPRRSVhybridizationtimeA:1h;B:2h;C:3h;D:4h;E:5h;F:6hABCDEF图3.38CSFV不同杂交时间的杂交结果A:1h;B:2h;C:3h;D:4h;E:5h;F:6hFig3.38ThehybridizationresultsofCSFVhybridizationtimeA:1h;B:2h;C:3h;D:4h;E:5h;F:6h41 西南大学硕士学位论文图3.39六种病原不同杂交时间对荧光信号中位值的影响Fig3.39Theinfluenceofdifferenthybridizationtimeformedianfluorescence3.3.10方法评估试验结果3.3.10.1特异性试验结果以APP为例，使用APP的特异性嵌合引物和通用引物分别对伪狂犬病病毒、猪细小病毒、日本乙型脑炎病毒、猪水疱病病毒、水泡性口炎病毒、口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、小反刍兽疫病毒和沙门氏菌的核酸进行PCR扩增，扩增产物进行42℃避光杂交3h，扫描结果显示，除位置质控和杂交质控外，其余探针区域均未检测到荧光信号（见图3.40）。ABCDEFGHIJ图3.40APP特异性试验结果A:伪狂犬病病毒;B:猪细小病毒;C:日本乙型脑炎病毒;D:口蹄疫病毒;E:水泡性口炎病毒;F:猪水疱病病毒;G:蓝舌病病毒;H:小反刍兽疫病毒;I:沙门氏菌;J:阴性对照Fig3.40ThespecificitytestofoligonucleotidemicroarrayA:PRV;B:PPV;C:JEV;D:FMDV;E:VSV;F:SVDV;G:BTV;H:PPRV;I:Sal;J:negativecontrol42 第3章单一病原基因芯片检测方法的优化及建立3.3.10.2单重敏感性试验结果分别将六种病原的阳性质粒进行10个梯度的10倍倍比稀释，按照单重体系进行PCR扩增，将扩增产物分别进行杂交和电泳，结果显示，APP的芯片敏感性为2.97×102拷贝/μL，电泳敏感性为2.97×104拷贝/μL；HPS的芯片敏感性为4.38×103拷贝/μL，电泳敏感性为4.38×104拷贝/μL；Mhp的芯片敏感性为8.26×102拷贝/μL，电泳敏感性为8.26×104拷贝/μL；PCV-2的芯片敏感性为3.78×102拷贝/μL，电泳敏感性为3.78×103拷贝/μL；PRRSV的芯片敏感性为1.38×103拷贝/μL，电泳敏感性为1.38×105拷贝/μL；CSFV的芯片敏感性为3.32×10拷贝/μL，电泳敏感性为3.32×103拷贝/μL。基因芯片方法的检测敏感性通常比普通PCR扩增高10～100倍，特异性引物和探针的有效结合可以提高检测方法的敏感性，并有效降低普通PCR中的假阳性结果。ABCDEF图3.41APP敏感性试验杂交结果A:2.97×107拷贝/μL;B:2.97×106拷贝/μL;C:2.97×105拷贝/μL;D:2.97×104拷贝/μL;E:2.97×103拷贝/μL;F:2.97×102拷贝/μL;Fig3.41ThesensitivitytestofAPPforoligonucleotidemicroarrayA:2.97×107copies/μL;B:2.97×106copies/μL;C:2.97×105copies/μL;D:2.97×104copies/μL;E:2.97×103copies/μL;F:2.97×102copies/μL;ABCDEF图3.42HPS敏感性试验杂交结果A:4.38×108拷贝/μL;B:4.38×107拷贝/μL;C:4.38×106拷贝/μL;D:4.38×105拷贝/μL;E:4.38×104拷贝/μL;F:4.38×103拷贝/μL;Fig3.42ThesensitivitytestofHPSforoligonucleotidemicroarrayA:4.38×108copies/μL;B:4.38×107copies/μL;C:4.38×106copies/μL;D:4.38×105copies/μL;E:4.38×104copies/μL;F:4.38×103copies/μL;ABCDEF图3.43Mhp敏感性试验杂交结果A:8.26×107拷贝/μL;B:8.26×106拷贝/μL;C:8.26×105拷贝/μL;D:8..26×104拷贝/μL;E:8.26×103拷贝/μL;F:8.26×102拷贝/μL;Fig3.43ThesensitivitytestofMhpforoligonucleotidemicroarrayA:8.26×107copies/μL;B:8.26×106copies/μL;C:8.26×105copies/μL;D:8..26×104copies/μL;E:8.26×103copies/μL;F:8.26×102copies/μL;43 西南大学硕士学位论文ABCDEF图3.44PCV-2敏感性试验杂交结果A:3.78×107拷贝/μL;B:3.78×106拷贝/μL;C:3.78×105拷贝/μL;D:3.78×104拷贝/μL;E:3.78×103拷贝/μL;F:3.78×102拷贝/μL;Fig3.44ThesensitivitytestofPCV-2foroligonucleotidemicroarrayA:3.78×107copies/μL;B:3.78×106copies/μL;C:3.78×105copies/μL;D:3.78×104copies/μL;E:3.78×103copies/μL;F:3.78×102copies/μL;ABCDEF图3.45PRRSV敏感性试验杂交结果A:1.38×108拷贝/μL;B:1.38×107拷贝/μL;C:1.38×106拷贝/μL;D:1.38×105拷贝/μL;E:1.38×104拷贝/μL;F:1.38×103拷贝/μL;Fig3.46ThesensitivitytestofPRRSVforoligonucleotidemicroarrayA:1.38×108copies/μL;B:1.38×107copies/μL;C:1.38×106copies/μL;D:1.38×105copies/μL;E:1.38×104copies/μL;F:1.38×103copies/μL;ABCDEF图3.46CSFV敏感性试验杂交结果A:3.32×106拷贝/μL;B:3.32×105拷贝/μL;C:3.32×104拷贝/μL;D:3.32×103拷贝/μL;E:3.32×102拷贝/μL;F:3.32×10拷贝/μL;Fig3.45ThesensitivitytestofCSFVforoligonucleotidemicroarrayA:3.32×106copies/μL;B:3.32×105copies/μL;C:3.32×104copies/μL;D:3.32×103copies/μL;E:3.32×102copies/μL;F:3.32×10copies/μL;M12345678M123456789102000bp2000bp1000bp1000bp750bp500bp500bp250bp250bp100bp100bp图3.47APP敏感性试验电泳结果图3.48HPS敏感性试验电泳结果M:DL-2000DNAMarker;1～7:2.97×107～2.97×10拷贝/μL;8:阴性对照M:DL-2000DNAMarker;1～9:4.38×109～4.38×101拷贝/μL;10:阴性对照Fig3.47ThesensitivitytestofAPPforPCRFig3.48ThesensitivitytestofHPSforPCRM:DL-2000DNAMarker;1～7:2.97×107～2.97×10copies/μL;8:negativecontrolM:DL-2000DNAMarker;1～9:4.38×109～4.38×101copies/μL;10:negativecontrol44 第3章单一病原基因芯片检测方法的优化及建立M123456789M1234567892000bp2000bp1000bp1000bp750bp750bp500bp500bp250bp250bp100bp100bp图3.49Mhp敏感性试验电泳结果图3.50PCV-2敏感性试验电泳结果M:DL-2000DNAMarker;1～8:8.26×108～8.26×10拷贝/μL;M:DL-2000DNAMarker;1～8:3.78×108拷贝/μL～3.78×10copies/μL;9:阴性对照9:阴性对照Fig3.49ThesensitivitytestofMhpforPCRFig3.50ThesensitivitytestofPCV-2forPCRM:DL-2000DNAMarker;1～8:8.26×108～8.26×10拷贝/μL;M:DL-2000DNAMarker;1～8:3.78×108拷贝/μL～3.78×10copies/μL;9:negativecontrol9:negativecontrolM123456789M123456782000bp2000bp1000bp1000bp750bp750bp500bp500bp250bp250bp100bp100bp图3.51PRRSV敏感性试验电泳结果图3.52CSFV敏感性试验电泳结果M:DL-2000DNAMarker;1～8:1.38×109～1.38×102copies/μL;9:阴性对照M:DL-2000DNAMarker;1～7:3.32×108～3.32×102copies/μL;Fig3.51ThesensitivitytestofPRRSVforPCR8:阴性对照M:DL-2000DNAMarker;1～8:1.38×109～1.38×102copies/μL;9:negativeFig3.52ThesensitivitytestofCSFVforPCRcontrolM:DL-2000DNAMarker;1～7:3.32×108～3.32×102copies/μL;8:negativecontrol3.3.10.3单重重复性试验结果选取四张不同批次制备的醛基基片，进行单重组间重复性试验，重复性试验结果显示，六种病原对应的探针杂交信号稳定、可重复性高（见图3.53-图3.58）。45 西南大学硕士学位论文ABCD图3.53APP重复性试验结果A：批次1；B：批次2；C：批次3；D：批次4Fig3.53TheInter-repeatabilitytestofAPPforoligonucleotidemicroarrayA:Thefirstgroup;B:Thesecondgroup;C:Thethirdgroup;D:Theforthgroup;ABCD图3.54HPS重复性试验结果A：批次1；B：批次2；C：批次3；D：批次4Fig3.54TheInter-repeatabilitytestofHPSforoligonucleotidemicroarrayA:Thefirstgroup;B:Thesecondgroup;C:Thethirdgroup;D:Theforthgroup;ABCD图3.55Mhp重复性试验结果A：批次1；B：批次2；C：批次3；D：批次4Fig3.55TheInter-repeatabilitytestofMhpforoligonucleotidemicroarrayA:Thefirstgroup;B:Thesecondgroup;C:Thethirdgroup;D:Theforthgroup;ABCD图3.56PCV-2重复性试验结果A：批次1；B：批次2；C：批次3；D：批次4Fig3.56TheInter-repeatabilitytestofPCV-2foroligonucleotidemicroarrayA:Thefirstgroup;B:Thesecondgroup;C:Thethirdgroup;D:Theforthgroup;46 第3章单一病原基因芯片检测方法的优化及建立ABCD图3.57PRRSV重复性试验结果A：批次1；B：批次2；C：批次3；D：批次4Fig3.57TheInter-repeatabilitytestofPRRSVforoligonucleotidemicroarrayA:Thefirstgroup;B:Thesecondgroup;C:Thethirdgroup;D:Theforthgroup;ABCD图3.58CSFV重复性试验结果A：批次1；B：批次2；C：批次3；D：批次4Fig3.58TheInter-repeatabilitytestofCSFVforoligonucleotidemicroarrayA:Thefirstgroup;B:Thesecondgroup;C:Thethirdgroup;D:Theforthgroup;3.4讨论3.4.1靶基因序列的选择基因芯片技术是基于特异保守靶基因序列设计的检测方法，因此准确选择特异保守的目的序列是该试验成功的关键。试验前期，根据GenBank中已经发表的六种病原微生物的基因序列分别进行比对，筛选每种病原的特异保守序列，针对靶基因序列设计特异性引物。PCR扩增具有较强的实验性，需通过实验操作验证引物的可用性和特异性。根据基因序列比对结果，APP、HPS、Mhp、PCV-2、PRRSV和CSFV分别选取omIA基因、16SrRNA基因、P46基因、外膜蛋白基因、GP5基因和全基因序列中的特异保守序列作为靶基因，设计特异性引物和探针。另外，目的片段的长短与探针条数密切相关。因此，该试验中将目的片段的长度控制在300bp左右，避免目的片段过长引起的非特异性杂交结果。基因芯片方法主要根据探针序列对目的片段进行区分，无需借助电泳检测，所以在靶基因片段大小的确定过程中，不需要考虑靶基因间片段大小差异。靶基因相差几bp也可以准确区分。在引物和探针的设计中，严格按照引物和探针的设计原则，将多对引物的退火温度差控制在5℃内，进而保证多重PCR扩增时退火温度一致。本研究中使用的探针为寡核苷酸探针，探针的设计也是芯片技术的关键点。寡核苷酸探针的设计遵循以下原则：（1）长度一般为30～50bp，过长者杂交时间较长，合成量低，过短者，特异性较差；（2）碱基中(G＋C)含量应在40％～60％，超出此范围则会增加非特异性杂交；（3）探针序列间避免出现碱基互补配对区，否则会出现干扰探针杂交的“发夹”状结构；（4）避免同一碱基连续出现。在引物和探针的设计过47 西南大学硕士学位论文程中，尽量遵循设计原则进行设计，同时设计多对引物或多条探针进行实验验证。3.4.2标记方法的选择待检样品的有效标记是建立基因芯片方法的关键步骤之一。不同的待检样品和研究目的要求的标记方式不同。目前，主要通过荧光素、生物素或同位素对靶基因进行标记，其中荧光素标记使用最多。荧光标记方法包括直接掺入法和间接标记法。末端标记是间接标记法中的常用方法，指先合成5’或3’末端荧光标记的引物，再通过PCR扩增得到末端标记的靶基因。本研究参考GeXP多重遗传分析系统的荧光标记方式，通过特异性嵌合引物和通用引物将Cy3有效标记于靶基因，该方法只需对一条通用引物末端进行荧光标记，与其他需对多条特异引物进行末端标记的方法相比，有效降低标记成本[76]。另外，与常用的巢式PCR标记相比，该标记方式一次反应完成，可有效降低多次PCR转移过程中的污染。多重PCR技术结合芯片技术，在多重PCR过程中进行扩增富集和标记靶基因，结合特异性探针的选择性杂交，可大大提高芯片检测的特异性和敏感性。3.4.3探针的筛选及杂交条件的优化基因芯片可以同时点制多条探针鉴别检测多种病原，也可针对同一病原设计多条探针提高检测的特异性。试验中，根据选定的靶序列设计多条探针，同时在探针的5’端增加15个T作为间隔臂，进行小规模的实验筛选探针。潘继红等多个关于间隔臂和探针长度研究表明，当间隔臂选取15个Poly(dT）时变异系数最小，芯片重复性和稳定性最好[77]。芯片杂交过程中，杂交信号受温度、杂交时间、洗液浓度等多种因素的影响。因此，筛选特异性杂交探针后，对退火温度、点样探针浓度、杂交液配比、杂交温度、杂交时间等条件进行优化，有助于得到最佳杂交结果。退火温度直接影响靶序列的扩增富集，扩增产物越多，检测到的杂交信号越强。试验中，分别对每一种病原对应的退火温度进行优化，由结果可知，六种病原对应的最佳退火温度范围为56～58℃。在该范围区间内，六种病原均扩增得到明亮、清晰的目的条带。评价点样探针浓度最优的标准是最低的浓度达到最佳的杂交结果，经过点样浓度的优化可知，当探针浓度为50μmol时，杂交信号强度已达到饱和，继续加大点样探针浓度仅是增加成本。此外，甲酰胺可提高探针序列与目的片段间的杂交结合，且可有效降低杂交背景信号。因此，杂交液配制中多使用甲酰胺溶液。然而，甲酰胺对人体具有一定的危害性，试验中仅使用SSC和SDS配制杂交液，杂交效果也较好，因此未使用甲酰胺配制杂交液。对杂交温度的优化过程中，杂交温度过低，探针序列与靶基因不能充分杂交结合且易发生非特异性杂交。随着杂交温度的升高，杂交效率随之提高。但当杂交温度高于临界值时，碱基间难以配对，杂交效率又降低。理论上，杂交效率随杂交时间的增加不断提高，当杂交时间超过某一临界值时，由于杂交液的挥发、荧光染料氧化等因素，杂交效率随之下降。因此，在一定范围内优化杂交温度和时间，避免非特异性杂交，降低杂交背景信号，制备特异、灵敏的基因芯片。48 第3章单一病原基因芯片检测方法的优化及建立3.5小结1、通过查阅大量文献，获得六段靶序列。使用本章设计的未加接头的引物分别扩增六种病原的核酸，均获得明亮、清晰、大小与预期完全相符的目的片段。同时，构建pMD19T-APP、pMD19T-HPS、pMD19T-Mhp、pMD19T-PCV2、pMD19T-PRRSV和pMD19T-CSFV六种阳性质粒。克隆质粒测序结果在NCBI中Blast比对后，同源性均高于97%，符合试验要求。2、将合成后的探针点制醛基基片，进行水化过夜、封闭等处理后，与标记后样品进行杂交，筛选出可分别检测六种病原的特异性探针，从而制备可分别检测APP、HPS、Mhp、PCV-2、PRRSV及CSFV六种病原的基因芯片检测方法。3、为提高芯片检测方法的敏感性和特异性，本研究对退火温度、点样探针浓度、杂交液、杂交温度、杂交时间等多个条件进行优化，获得单一病原检测的最佳杂交条件为：点样探针浓度50μmol、退火温度56～58℃、使用自配杂交液42℃避光杂交3h。4、在优化后条件的基础上，进行特异性、敏感性、重复性实验评估单一病原基因芯片检测方法。特异性实验结果显示，该芯片方法特异性良好，与伪狂犬病病毒、猪细小病毒、日本乙型脑炎病毒、猪水疱病病毒、水泡性口炎病毒、口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、小反刍兽疫病毒及沙门氏菌等九种病原无交叉反应。针对单一病原进行敏感性实验，芯片方法的敏感性分别为APP：2.97×102拷贝/μL；HPS：4.38×103拷贝/μL；Mhp：8.26×102拷贝/μL；PCV-2：3.78×102拷贝/μL；PRRSV：1.38×103拷贝/μL；CSFV：3.32×10拷贝/μL。与普通PCR扩增相比，基因芯片的检测敏感性高10～100倍，并且特异性引物和探针的双重作用，有效降低普通PCR中的假阳性结果。另外，重复性实验说明该芯片方法具有较高的重复性和稳定性。综合考虑特异性、敏感性和重复性实验的结果，建立的单一病原基因芯片检测方法可大规模应用于六种病原微生物的临床鉴别检测。49 西南大学硕士学位论文50 第4章六种病原基因芯片检测方法的建立及初步应用第4章六种病原基因芯片检测方法的建立及初步应用本研究在已建立的六种病原单重检测芯片方法的基础上，拟构建六种病原单管同步鉴别检测的多重基因芯片方法。根据正交试验，优化六对特异性嵌合引物浓度配比，优化杂交温度、杂交时间。另外，进行特异性、敏感性、重复性和稳定性试验评估建立的检测方法，进行4个月的保存期试验探究芯片最佳的保存条件。同时，对重庆地区采集的186份临床样本提取核酸进行临床检测，并与现有标准方法进行比较，评估方法的可行性。4.1材料、试剂及仪器4.1.1标准毒株及细菌见第三章3.1中3.1.1部分。4.1.2主要试剂见第三章3.1中表3.1。4.1.3主要仪器见第三章3.1中表3.2。4.1.4主要试剂配制见第三章3.1中3.1.4部分。4.2六种病原基因芯片检测方法的建立及应用4.2.1六对特异性嵌合引物浓度优化分别采用10μmol/L的特异性嵌合引物和20μmol/L的通用引物进行六对特异性嵌合引物浓度的优化。每次试验前混合适量特异性嵌合引物的上下游引物。按照特异性嵌合引物浓度（上、下游混合）为1μmol/L、2μmol/L、3μmol/L、4μmol/L和5μmol/L进行正交试验优化反应体系。反应体系见表4.1。正交表使用正交设计助手V3.1软件进行设计，见表4.2。表4.1.多重PCR反应体系Table4.1ThereactionconditionsofmultiplexPCRAPPHPSMhpPCV-2PRRSVCSFV上游通用引物（20μmol/L）1μL1μL1μL1μL1μL1μL下游通用引物（20μmol/L）1μL1μL1μL1μL1μL1μL上、下游特异性嵌合引物0.1～0.5μL0.1～0.5μL0.1～0.5μL0.1～0.5μL0.1～0.5μL0.1～0.5μL（10μmol/L）混合模板3μL3μL3μL3μL3μL3μL注：ExTaq的使用量为12.5μL，使用DEPCH2O补足25μL。51 西南大学硕士学位论文表4.2特异性嵌合引物的正交试验表Table4.2TheOrthogonaltestofprimer因素APPHPSPRRSVPCV-2CSFVMhyo实验10.10.10.10.10.10.1实验20.10.20.20.20.20.2实验30.10.30.30.30.30.3实验40.10.40.40.40.40.4实验50.10.50.50.50.50.5实验60.20.10.20.30.40.5实验70.20.20.30.40.50.1实验80.20.30.40.50.10.2实验90.20.40.50.10.20.3实验100.20.50.10.20.30.4实验110.30.10.30.50.20.4实验120.30.20.40.10.30.5实验130.30.30.50.20.40.1实验140.30.40.10.30.50.2实验150.30.50.20.40.10.3实验160.40.10.40.20.50.3实验170.40.20.50.30.10.4实验180.40.30.10.40.20.5实验190.40.40.20.50.30.1实验200.40.50.30.10.40.3实验210.50.10.50.40.30.2实验220.50.20.10.50.40.3实验230.50.30.20.10.50.4实验240.50.40.30.20.10.5实验250.50.50.40.30.20.14.2.2杂交温度优化根据优化后的PCR扩增体系和条件，以六种质粒等量混合为模板制备PCR产物。设置杂交温度为室温、37℃、42℃、50℃、55℃和60℃，其他条件均保持不变优化杂交温度。52 第4章六种病原基因芯片检测方法的建立及初步应用4.2.3杂交时间优化按照优化后的PCR扩增体系和杂交温度，以六种质粒的混合物为模板进行PCR扩增，PCR产物根据第三章芯片杂交过程进行杂交。严格控制杂交时间为1h、2h、3h、4h、5h和6h，其余条件均不变优化杂交时间。4.2.4方法评估4.2.4.1特异性试验在最佳PCR反应条件下，对伪狂犬病病毒、猪细小病毒、日本乙型脑炎病毒、猪水疱病病毒、水泡性口炎病毒、口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、小反刍兽疫病毒和沙门氏菌的核酸进行扩增，PCR产物按照第三章步骤进行避光杂交，验证该方法的特异性。4.2.4.2敏感性试验将六种病原的阳性质粒等量混合，进行10倍倍比稀释，每个扩增体系加入3μL模板，按照优化后的条件进行扩增和杂交，确定基因芯片方法的检测敏感性。4.2.4.3重复性试验选取同一批次制备的六张基片，各样品进行三个阵列的重复，分析批内的荧光信号中位值和变异系数；选取不同批次制备的六张基片，各样品进行三个矩阵的重复，分析批间的荧光信号中位值和变异系数，评价该方法的重复性和稳定性。4.2.4.4基因芯片保存期试验取同一批次制备的18张芯片分为三组，进行四个月的保存期试验，以确定芯片的最佳保存温度及保质期。将三组芯片分别置于-20℃、4℃和室温（25℃）避光保存，并按照一周、两周、一个月、两个月、三个月和四个月的时间间隔进行芯片杂交，确定最佳保存条件。4.2.5临床初步应用对采自重庆地区部分猪场的186份样品进行处理后，按照QIAamp®cador®PathogenMiniKit说明书的步骤提取核酸，分别采用研究建立的方法和现有标准方法（APP：SN/T1447-2011、HPS：NY/T2417-2013、Mhp：DB32/T1461-2009、PCV-2：GB/T21674-2008、PRRSV:GB/T18090-2008、CSFV：猪瘟病毒RT-nPCR检测试剂盒）对其进行对比检测，阳性样本进行测序验证，分析比较基因芯片方法与现行标准方法的检测结果。4.3结果4.3.1多重PCR扩增中引物浓度优化结果将六种病原的上下游特异性嵌合引物混合进行正交试验优化，其扩增产物的杂交结果见53 西南大学硕士学位论文图4.1；最终确定的特异性嵌合引物浓度为APP1μmol/L（0.1μL）、HPS2μmol/L（0.2μL）、Mhp2μmol/L（0.2μL）、PCV-21μmol/L（0.1μL）、PRRSV2μmol/L（0.2μL）和CSFV1μmol/L（0.1μL）。具体的反应体系见表4.3。图4.125次正交试验PCR产物杂交结果Fig4.1Thehybridizationresultsoforthogonalexperiment54 第4章六种病原基因芯片检测方法的建立及初步应用表4.3多重PCR扩增体系Table4.3TheamplificationsystemofmultiplexPCR反应组分体积（μL）rTaq酶12.5APP:0.1HPS:0.2特异性引物（F+R）Mhp:0.210μMPCV-2:0.1PRRSV:0.2CSFV:0.1通用引物（F）20μM1通用引物（R）20μM1DEPCH2O6.6模板（六种质粒浓度范围1.0～1.1μg/mL）34.3.2多重PCR反应外循环数优化结果将外循环数分别设为15、20、25、30、35和40次进行PCR扩增，扩增产物进行避光杂交，杂交结果如图4.2。综合分析荧光信号值可确定，外循环数为20～30次均可满足条件，获得明亮、稳定的杂交信号。ABCDEF图4.2多重外循环数优化结果A:15cycles;B:20cycles;C:25cycles;D:30cycles;E:35cycles;F:40cyclesFig4.2TheoptimizationresultsofoutercyclenumbersofmultiplexPCRA:15cycles;B:20cycles;C:25cycles;D:30cycles;E:35cycles;F:40cycles4.3.3杂交温度优化结果分别选取室温、37℃、42℃、50℃、55℃和60℃六个不同的温度进行杂交。结果见图4.3。综合分析六种病原对应探针的荧光信号中位值，确定最佳杂交温度为42℃～50℃。ABCDEF图4.3多重杂交温度优化结果A:室温（27℃）;B:37℃;C:42℃;D:50℃;E:55℃;F:60℃Fig4.3TheoptimizationresultsofhybridizationtemperatureA:roomtemperature（27℃）;B:37℃;C:42℃;D:50℃;E:55℃;F:60℃55 西南大学硕士学位论文4.3.4杂交时间优化结果取6张同批次制备的芯片，将杂交时间分别设为1h、2h、3h、4h、5h和6h进行杂交。结果见图4.4。结合六种病原对应探针的荧光信号中位值，确定最佳杂交时间为3h。ABCDEF图4.4多重杂交时间优化结果A:1h;B:2h;C:3h;D:4h;E:5h;F:6hFig4.4TheoptimizationresultsofhybridizationA:1h;B:2h;C:3h;D:4h;E:5h;F:6h4.3.5特异性试验结果对PRV、PPV、JEV、FMDV、VSV、SVDV、BTV、PPRV和Sal九种病原的核酸进行扩增，扩增产物避光杂交，扫描杂交结果可观察到除位置质控和杂交质控外均扫描不到荧光信号，说明该方法与上述病原间无交叉反应（图4.5）。ABCDEFGHJ图4.5基因芯片特异性试验A：伪狂犬病病毒；B：猪细小病毒；C：日本乙型脑炎病毒；D：口蹄疫病毒；E：水泡性口炎病毒；F：猪水疱病病毒；C：蓝舌病病毒；H：小反刍兽疫病毒；J沙门氏菌Fig.4.5ThespecificitytestofoligonucleotidemicroarrayA:PRV;B:PPV;C:JEV;D:FMDV;E:VSV;F:SVDV;G:BTV;H:PPRV;J:Sal4.3.6敏感性试验结果对等量混合的六种质粒进行10倍倍比稀释后，根据多重PCR扩增条件进行扩增，PCR产物在42℃条件下避光杂交3h，结果显示芯片检测APP的敏感性为5.8×102拷贝/μL；HPS的敏感性为7.8×103拷贝/μL；Mhp的敏感性为6.8×103拷贝/μL；PCV-2的敏感性为6.3×102拷56 第4章六种病原基因芯片检测方法的建立及初步应用贝/μL；PRRSV的敏感性为4.8×103拷贝/μL；CSFV的敏感性为5.5×102拷贝/μL（图4.6）。因此，综合考虑六种病原的检出限，该方法的检测敏感性为103拷贝/μL。ABCDEF图4.6基因芯片敏感性试验A-E:10-100000倍稀释;F:阴性对照Fig.4.6ThesensitivitytestofoligonucleotidemicroarrayA-E:Thedilutionof10to100000;F:Negativecontrol4.3.7重复性试验结果随机选取六张同一批次和六张不同批次制备的芯片，进行批内和批间重复性试验，扫描结果显示，同一批次及不同批次制备的芯片检测荧光信号相对稳定（图4.7和图4.8），批内及批间变异系数均小于5%，说明芯片的重复性较好。另外，以同一批次不同基片/不同批次基片为横坐标，以荧光信号中位值的平均值为纵坐标绘制反应重复性的柱状图（图4.9和4.10）。由柱状图可以看出，该方法批内重复性良好，荧光信号中位值间波动较小，表明该方法具有良好的重复性和稳定性。ABCDEF图4.7基因芯片批内重复性试验A:基片1;B:基片2;C:基片3;D:基片4;E:基片5;F:基片6Fig.4.7TheIntra-repeatabilitytestofoligonucleotidemicroarrayA:genechip1;B:genechip2;C:genechip3;D:genechip4;E:genechip5;F:genechip6ABCDEF图4.8.基因芯片批间重复性试验A:第一批;B:第二批;C:第三批;D:第四批;E:第五批;F:第六批Fig.4.8TheInter-repeatabilitytestofoligonucleotidemicroarrayA:Thefirstgroup;B:Thesecondgroup;C:Thethirdgroup;D:Theforthgroup;E:Thefifthgroup;F:Thesixthgroup57 西南大学硕士学位论文图4.9同一批次制备芯片杂交样点荧光信号中位值柱状图Fig4.9Thehistogramofmedianfluorescenceofthesamebatchchip图4.10不同批次制备芯片杂交样点荧光信号中位值柱状图Fig4.10Thehistogramofmedianfluorescenceofthedifferentbatchchip4.3.8基因芯片保存期试验结果将制备的芯片分别避光保存于室温、4℃和-20℃的条件下，按照一周、两周、一个月、两个月、三个月、四个月的周期间隔进行试验，不同时期的试验结果显示，最佳的芯片保存条件为：-20℃避光保存（见图4.11～4.13）。58 第4章六种病原基因芯片检测方法的建立及初步应用ABCDEF图4.114℃保存芯片在一周、两周、一个月、两个月、三个月和四个月的杂交扫描结果A:一周;B:两周;C:一个月;D:两个月;E:三个月;F:四个月Fig4.11Thehybridizationresultsofdifferenttimeat4℃A:oneweek;B:twoweeks;C:onemonth;D:twomonths;E:threemonths;F:fourmonthsABCDEF图4.12室温保存芯片在一周、两周、一个月、两个月、三个月和四个月的杂交扫描结果A:一周;B:两周;C:一个月;D:两个月;E:三个月;F:四个月Fig4.12ThehybridizationresultsofdifferenttimeatroomtemperatureA:oneweek;B:twoweeks;C:onemonth;D:twomonths;E:threemonths;F:fourmonthsABCDEF图4.13-20℃保存芯片在一周、两周、一个月、两个月、三个月和四个月的杂交扫描结果A:一周;B:两周;C:一个月;D:两个月;E:三个月;F:四个月Fig4.13Thehybridizationresultsofdifferenttimeat-20℃A:oneweek;B:twoweeks;C:onemonth;D:twomonths;E:threemonths;F:fourmonths4.3.9临床检测结果本研究建立的基因芯片检测方法与我国检测六种病原的现行标准（APP：SN/T1447-2011、HPS：NY/T2417-2013、Mhp：DB32/T1461-2009、PCV-2：GB/T21674-2008、PRRSV:GB/T18090-2008、CSFV：猪瘟病毒RT-nPCR检测试剂盒）对186份样品进行检测，检测结果见表4.4。由表可知，基因芯片方法检出单一病原感染34份，多病原混合感染11份；而现行国家标准/地方标准/行业标准检测结果为：单一病原感染28份，多病原混合感染13份。将两种方法检出的阳性样品进行测序分析，测序结果显示基因芯片方法检测结果与测序结果一致，说明高通量的基因芯片方法适用于多病原微生物混合感染或继发感染的临床检测。59 西南大学硕士学位论文表4.4基因芯片方法与标准方法对临床样品的检测结果Table4.4Thetestresultsofoligonucleotidemicroarrayandstandardmethodsforclinicalsamples阳性样品/样品总数检出率病原（Positivesample/Totalsample)（Detectionrates）符合率（Pathogens）GenechipPCR/RT-PCRGenechipPCR/RT-PCR（Coincidencerates）APP572.693.7698.92HPS231.071.6199.46Mhp753.762.6998.92PCV-21185.914.3098.39PRRSV954.842.6997.85PCV-2+PRRSV361.613.2298.39PRRSV+PCV-2+CSFV653.222.6999.46APP+Mhp+PCV-2+PRRSV221.071.071004.4讨论4.4.1多重PCR扩增影响因素多重PCR顾名思义指多个单一PCR的组合，又称之为多重引物PCR或复合PCR。科学界定为在同一PCR反应体系中加入两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。与单重PCR扩增相比，多重PCR具有高效性、系统性、经济简并性等优点。但是，多对引物存在同一反应体系中，引物间的干扰制约了多重PCR的应用。影响多重PCR反应的因素可分为反应体系和反应条件两大类。其中，反应体系包括引物、缓冲液、模板、TaqDNA聚合酶、dNTP、Mg2+等，反应条件涉及退火温度、循环数等[78]。通常情况下，进行多重PCR需首先进行单重PCR，选取相近的条件进行优化。该试验中，涉及六对特异性引物和一对通用引物，在单重试验的基础上确定通用引物的用量，但六对特异性引物的浓度仍需进行正交试验摸索最佳引物浓度配比。按照正交实验的设计要求，分别设定六对特异性引物的浓度为1μmol/L、2μmol/L、3μmol/L、4μmol/L和5μmol/L进行25次正交实验，根据结果可知当六对特异性引物浓度分别为APP1μmol/L（0.1μL）、HPS2μmol/L（0.2μL）、Mhp2μmol/L（0.2μL）、PCV-21μmol/L（0.1μL）、PRRSV2μmol/L（0.2μL）和CSFV1μmol/L（0.1μL）时，杂交结果最佳。退火温度在PCR扩增中是另外一个最重要的调整优化因素。引物设计时需要兼顾多对引物的Tm值，尽量保证各对引物间的Tm值相差不超过5℃。试验中，依据单重PCR扩增的结果，在54～60℃温度区间对退火温度进行优化，结果显示，当退火温度为56℃时，六种病原对应的目的片段均得到较好的扩增。另外，循环数多少直接影响扩增片段的量，扩增的片段少直接影响杂交信号强度。理论上，30个扩增循环就能有效的获得目的片段，再增加循环数不能明显的改变扩增产物的量，因此试验中优化了以通用引物作用为主的第二次循环阶段，力求节60 第4章六种病原基因芯片检测方法的建立及初步应用省时间的同时达到最大扩增。在单重PCR扩增的基础上，对多重PCR的退火温度、引物浓度和第二次循环数进行优化，实现六种病原微生物的同步检测。4.4.2多病原检测芯片的方法评估APP、HPS、Mhp、PCV-2、PRRSV和CSFV是猪呼吸道疾病综合征的常见病原，临床上常出现两种以上病原的混合感染或继发感染。目前针对病原检测的方法多为单一病原的分离培养、血清学检测或PCR扩增等，缺乏可同时检测六种病原的检测方法。多重PCR扩增结合芯片技术，大大的提高了芯片技术的特异性和敏感性。试验中，参考GeXP多重遗传分析系统中的标记方法，借助特异性嵌合引物和通用引物进行扩增标记，节约标记成本，也避免多次PCR产物转移过程中的污染。为评估建立方法的可行性和稳定性，分别进行特异性、敏感性、重复性和保存期实验。猪源性伪狂犬病病毒、猪细小病毒、日本乙型脑炎病毒、猪水疱病病毒、水泡性口炎病毒、口蹄疫病毒及沙门氏菌均是临床上感染猪群的常见病原，特异性实验结果表明，针对猪呼吸道综合征主要病原建立的芯片检测方法与上述病原无交叉反应，芯片方法具有较好的特异性。虽然基因芯片检测方法的敏感性低于荧光定量PCR，但特异性引物和探针的双检测标准大大提高了芯片检测方法的特异性。多病原联合共检芯片检测APP、HPS、Mhp、PCV-2、PRRSV及CSFV的敏感性分别为5.8×102拷贝/μL、7.8×103拷贝/μL、6.8×103拷贝/μL、6.3×102拷贝/μL、4.8×103拷贝/μL、5.5×102拷贝/μL，综合考虑该检测方法的敏感性为103拷贝/μL。目前，检测重要猪病病原的基因芯片方法很多，但特异性、敏感性、稳定性等方面也存在很大差异。符芳等人以PRRSV、CSFV、PPV、PRV及PCV-2的cDNA片段为探针制备可同时检测五种病原的cDNA芯片，但未阐明该方法的检测敏感性[25]。杨若松等建立了可同时检测CSFV、PRRSV、PCV-2及PPV的基因芯片方法，检测敏感性为103拷贝/μL[23]。随着标记技术的不断发展，建立无需借助任何扫描仪器的可视化芯片是该技术的发展方向。王小强等通过胶体金标记建立了可同时检测PCV-2、PPV、PRV、SIV、CSFV、FMDV及PRRSV的可视化芯片，无需借助特殊扫描设备便可直观的获得检测结果，具有较高的基层检验检疫推广价值[26]。赵朴等人建立了一种可同时检测四种猪呼吸道疾病综合征常见病毒的多重PCR方法，该方法对于靶基因间相差的碱基数具有严格要求，使其检测病原数具有一定的局限性[79]。基因芯片技术在多重PCR扩增的基础上，可选取相差较小的目的片段，通过寡核苷酸探针进行准确鉴别检测。通过临床样本的初步验证，基因芯片方法检出率高于普通PCR，并与测序结果完全一致，说明该方法可应用于六种病原的同步鉴别检测。本研究建立的方法可同时鉴别检测多种病原的单一或混合感染，与其他方法相比，具有准确、快速、高通量等优点，适用于多种病原的临床鉴别检测和研究。4.4.3研究中存在的部分问题（1）病料采集和样品制备。研究中涉及的六种重要猪病病原包括病毒、细菌及支原体，六种61 西南大学硕士学位论文病原的主要存在部位也不同。在病料采集中，除采集具有明显病变的部位外，还需采集血液、鼻腔拭子、口腔拭子等。另外，病原核酸中包括RNA和DNA，对于PRRSV和CSFV两种RNA，需要进行反转录后再进行PCR扩增标记。样品标记虽避免多次PCR转移过程中的污染，但是扩增标记仍需要3h，后期亟待研究一种耗时短、效率高的标记方法。（2）检测探针数量局限。单一病原的基因芯片检测方法易于优化杂交条件，多病原基因芯片检测方法涉及多对引物和探针的影响，优化杂交条件较困难。增加每一种病原对应的检测探针条数可以提高检测方法的特异性，但是探针条数过多增加了优化难度。因此，研究中仅针对每一种病原的靶序列筛选了一条特异性检测探针，初步建立六种病原同步检测的基因芯片，后期的试验研究中，需要相应增加每一种病原靶序列对应的探针条数，提高检测方法的特异性。（3）临床样本来源和数量有限。研究中仅对186份鼻腔拭子进行初步检测，后期需要对更多不同的组织样本进行检测验证。4.5小结（1）在单一病原基因芯片检测方法建立的基础上，通过正交试验优化，确定多重PCR扩增体系为rTaq酶12.5μL、10μmol/L特异性上下游引物0.9μL（其中APP：0.1μL、HPS：0.2μL、Mhp：0.2μL、PCV-2：0.1μL、PRRSV：0.2μL、CSFV：0.1μL）、20μmol/L上下游通用引物各1μL、六种病原模板各0.5μL，DEPCH20补足25μL。PCR反应条件：94℃5min；94℃30s、56℃30s、72℃25s，12个循环；94℃30s、50℃30s、72℃25s，30个循环；72℃，7min。PCR产物4℃避光保存。（2）通过对杂交温度、杂交时间等条件进行优化，确定杂交过程为：取PCR产物8μL、2×杂交液7.9μL和2.5μmol/L杂交质控0.1μL混合，95℃变性8min，迅速置于冰上5min。取15μL混合物于42℃避光杂交3h。（3）通过特异性、敏感性和重复性试验评估可知，该检测方法特异性好、重复性高，且检测敏感性可达103拷贝/μL。（4）本方法点制的芯片保质期为-20℃保存4个月，4℃保存3个月，室温保存2个月。62 第5章结论第5章结论本研究通过比对六种重要PRDC病原的基因序列，设计特异性引物和探针，建立并评估单一病原和六病原微生物基因芯片检测方法，进行优化、特异性、敏感性、重复性、保存期、临床样本检测等试验，得出结论如下：（1）参考APP、HPS、Mhp、PCV-2、PRRSV和CSFV六种病原微生物的基因序列，设计特异性引物，构建了六种病原对应的阳性克隆质粒。同时，根据选定的目的序列设计多条探针，并根据试验结果筛选出六种病原对应的特异性检测探针。（2）使用自配的杂交液，不含甲酰胺，在42℃条件下避光杂交3h即可获得较好的杂交效果。（3）建立了六种单一病原基因芯片检测方法，且方法特异性强、敏感性高、重复性好。其中，六种病原对应的敏感性分别为APP：2.97×102拷贝/μL；HPS：4.38×103拷贝/μL；Mhp：8.26×102拷贝/μL；PCV-2：3.78×102拷贝/μL；PRRSV：1.38×103拷贝/μL；CSFV：3.32×10拷贝/μL。与普通PCR扩增相比，基因芯片方法的检测敏感性高10～100倍。（4）首次成功建立了六种重要PRDC病原单管同步鉴别检测的基因芯片方法，且该方法特异性、敏感性、重复性良好。该基因芯片方法检测伪狂犬病病毒、猪细小病毒、日本乙型脑炎病毒、猪水疱病病毒、水泡性口炎病毒、口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、小反刍兽疫病毒及沙门氏菌等九种病原，结果均为阴性。六种病原同步检测的敏感性低至103拷贝/μL，并且具有较好的稳定性和重复性。临床样本检测结果表明：该方法优于现有标准，有效降低PCR方法的假阳性，提高检测结果的准确性。（5）该方法点制的芯片经封闭处理后，可在-20℃至少保存4个月，4℃保存3个月，室温保存2个月。63 西南大学硕士学位论文64 参考文献参考文献[1]SCHENAM,SHALOND,DAVISRW,etal.QuantitativemonitoringofgeneexpressionpatternswithacomplementaryDNAmicroarray[J].Science,1995,270(5235):467-70.[2]M.谢纳.生物芯片分析[M].北京:科学出版社,2004:86-89.[3]邱秀文,吴小芹,黄麟,等.基因芯片技术在生物研究中的应用进展[J].江苏农业科学,2014,05:60-62.[4]王振全.基因芯片方法检测六种动物源性人兽共患病病原[D].吉林大学,2012.[5]BlanehardAP,KaiserRJ,HoodLE.Highdensityoligonueleotidearrary[J].Bioelectronics,1996,11:687-690.[6]McGallG，LabadieJ，BrockP,etal.LightdireetedsynthesisofhighdendityoligonuelcotidearraysusingsemiconducterPhotoresists[J].Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1996,93:13555-13560.[7]冯松凯.检测动物皮毛中6种致病菌的基因芯片技术研究[D].河南农业大学,2013.[8]欧阳达,姜来生,黄小波,等.猪繁殖与呼吸综合征病毒和日本脑炎病毒二联基因芯片的构建与应用[J].中国兽医科学,2015,05:509-516.[9]王洪水,侯相山.基因芯片技术研究进展[J].安徽农业科学,2007,08:2241-2243+2245.[10]李瑶.基因芯片技术一解码生命[M].北京:化学工业出版社,2004.[11]郭永刚,张冠斌,熊强,等.基于磁珠的可见光检测微阵列信号的新方法[J].分析科学学报,2007,23(1):1-4.[12]WATSONJ,CRICKF.Astructurefordeoxyribosenucleicacid[J].Nature,1953,421(6921):397-3988.[13]SugiharaT,KodaM,MaedaY,etal.RapididentificationofbacterialspecieswithbacterialDNAmicroarrayincirrhoticpatientswithpontaneousbacterialperitonitis[J].InterMed,2009,48(1):3-10.[14]毛正果,郑浩轩,王新颖,等.基因芯片检测常见肠道致病菌感染的研究与评价[J].胃肠病学和肝病学杂志,2008,17(10):809-812.[15]HuangA,QiuZ,JinZ,etal.High-throughputdetectionoffood-bornepathogenicbacteriausingoligonucleotidemicroarraywithquantumdotsasfluorescentlabels[J].IntJFoodMicrobiol,2014,185:27-32.[16]BurtonJE,OshotaOJ,NorthE,etal.DevelopmentofamultipathogenoligonucleotidemicroarrayfordetectionofBacillusanthracis[J].MolCellProbes,2005,19(5):349-57.[17]冯松凯,李苗云,徐超,等.毛皮中6种致病菌基因芯片检测方法的建立和应用[J].中国65 西南大学硕士学位论文预防兽医学报,2013,05:379-383.[18]高兴,辛文文,高姗,等.11种(株)食源性细菌基因芯片检测方法的建立[J].生物技术通报,2013,12:123-128.[19]程亚楼.猪的六种常见致病菌基因芯片检测技术的研究[D].河南农业大学,2013.[20]LeeDY,LauderH,CruwysH,etal.Developmentandapplicationofanoligonucleotidemicroarrayandreal-timequantitativePCRfordetectionofwastewaterbacterialpathogens[J].SciTotalEnviron,2008,398(1-3):203-11.[21]JohnJKellya，lilSiripongb，JohnMcCormacka，etal.DNAmicroarraydetectionofnitrifyingbacterial16SrRNAinwastewatertreatmentplantsamples［J.WaterResearch，2005，39(14):3229－3238.[22]叶芬,蔡家利,王昱,等.猪瘟、猪圆环病毒病和猪繁殖与呼吸综合征基因芯片诊断方法的建立与初步应用[J].中国兽医学报,2011,10:1395-1399.[23]杨若松,姜金庆,张志,等.4种猪群常见病毒基因芯片检测方法的建立与应用[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),2012,03:34-38.[24]姜永厚,商晗武,徐辉,等.基于多重PCR的寡核苷酸基因芯片检测猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒及猪圆环病毒1型和2型[J].中国预防兽医学报,2010,03:194-199.[25]符芳,杨玉菊,陈微晶,等.五种重要猪病病毒基因芯片探针的建立及其应用[J].中国兽医科学,2010,05:501-505.[26]WangX,DangE,GaoJ,etal.Developmentofagoldnanoparticle-basedoligonucleotidemicroarrayforsimultaneousdetectionofsevenswineviruses[J].JVirolmethods,2013,191(1):9-15.[27]詹爱军,王新卫,卢体康,等.4种重要虫媒病的核酸液相芯片高通量检测方法的建立[J].畜牧兽医学报,2010,02:240-245.[28]JaaskelainenAJ,PiiparinenH,LappalainenM,etal.Multiplex-PCRandoligonucleotidemicroarrayfordetectionofeightdifferentherpesvirusesfromclinicalspecimens[J].JClinVirol.2006,37(2):83-90.[29]CannonGA,CarrMJ,YandleZ,etal.Alowdensityoligonucleotidemicroarrayforthedetectionofviralandatypicalbacterialrespiratorypathogens[J].JVirolMethods..2010,163(1):17-24.[30]LauAO,TibbalsDL,McElwainTF.Babesiabovis:Thedevelopmentofanexpressionoligonucleotidemicroarray[J].ExpParasitol,2007,117(1):93-8.[31]SophieTares,PierreAbad,NadineBruguier,etal.IdentificationandevidenceforrelationshipsamonggeographicalisolatesofBursaphelenchusspp.(pinewoodnematode)usinghomologousDNAprobes[J].Heredity,1992,68,157–164.66 参考文献[32]PalaciosG,QuanPL,JabadoOJ,etal.Panmicrobialoligonucleotidearrayfordiagnosisofinfeetiousdiseases[J].EmergInfectDis.2007,13(1):73-81.[33]姜永厚,商晗武,陈伟杰,等.猪圆环病毒检测与分型基因芯片的建立及应用[J].中国兽医学报,2008,10:1174-1180.[34]BaxiMK1,BaxiS,ClavijoA,etal.Microarray-baseddetectionandtypingoffootandmouthdiseasevirus[J].VetJ.2006,172(3):473-81.[35]郭焕成,席进,李江南,等.高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2缺失变异株与经典美洲型毒株基因芯片鉴别方法的建立[J].中国生物制品学杂志,2010,11:1254-1259.[36]薛斐,辛舒,田宇飞,等.乙型脑炎病毒可视化分型基因芯片的制备[J].生物技术通讯,2014,03:377-380+390[37]韩雪清,林祥梅,侯义宏,等.禽流感病毒分型基因芯片的研制[J].微生物学报,2008,09:1241-1249.[38]RuettgerA1,FeigeJ,SlickersP,etal.GentypingofChlamydiatrachomatisstrainsfromcultureandclinicalsamplesusinganompA-basedDNAmicroarrayassay[J].MolCellProbes,2011,25(1):19-27.[39]SachseK,LaroucauK,HotzelH,etal.GentypingofChlamydophilapsittaciusinganewDNAmicroarrayassaybasedonsequenceanalysisofompAgene[J].BMCMicrobiol,2008,8:63.[40]CantacessiC1,LoukasA,CampbellBE,etal.ExploringtranscriptionalconservationbetweenAncylostomacaninumandHaemonchuscontortusbyoligonucleotidemicroarrayandbioinformaticanalyses[J].MolCellProbes,2009,23(1):1-9.[41]BaldwinDN1,VanchinathanV,BrownPOetal.Agene-expressionprogramreflectingtheinnateimmuneresponseofculturedintestinalepithelialcellstoinfectionbyListeriamonocytogenes[J].GenomeBiol,2003,4(1):R2.[42]AfonsoCL1,PicconeME,ZaffutoKM,etal.Africanswinefevervirusmultigenefamily360and530genesaffecthostinterferonresponse[J].JVirol,2004,78(4):1858-64.[43]BiggerCB，BraskyKM，LanfordRE.DNAmicroarrayanalysisofchimpanzeeliverduringacuteresolvinghepatitisCvirusinfection［J］.JVirology,2001,75:7059-7066.[44]ShiZ,SunJ,GuoH,etal.Genomicexpressionprofilingofperipheralbloodleukocytesofpigsinfectedwithclassicalswinefevervirus[J].JGenVirol,2009,90(Pt7):1670-80.[45]WangW,CassidyJ,O'BrienV,etal.Mechanisticandpredictiveprofilingof5-Fluorouracilresistanceinhumancancercells[J].CancerRes,2004,64(22):8167-76.[46]张春蕾,赵立娜,任宏.应用基因芯片技术检测四种结核药物敏感试验的研究[J].哈尔医药,2015,03:182-184.[47]BorelN,RegenscheitN,DiFrancescoA,etal.Selectionfortera-cycline-resistantChlamydia67 西南大学硕士学位论文suisintreatedpigs[J].VetMicrobiol,2012,156(1-2):143-6.[48]郎洪武,王力,张广川,程君生,宋立.猪圆环病毒分离鉴定及猪断奶多系统衰弱综合征的诊断[J].中国兽医科技,2001,03:4-6.[49]LiuQ,WangL,WillsonP,etal.Quantitative,competitivePCRanalysisofporcinecircovirusDNAinserumfrompigswithpostweaningmultisystemicwastingsyndrome[J].Journalofclinicalmicrobiology,2000,38(9):3474-3477.[50]GiammarioliM,PellegriniC,CasciariC,etal.Developmentofanovelhot-startmultiplexPCRforsimultaneousdetectionofclassicalswinefevervirus,Africanswinefevervirus,porcinecircovirustype2,porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusandporcineparvovirus[J].Veterinaryresearchcommunications,2008,32(3):255-262.[51]BrunborgIM,MoldalT,JonassenCM.Quantitationofporcinecircovirustype2isolatedfromserum/plasmaandtissuesamplesofhealthypigsandpigswithpostweaningmultisystemicwastingsyndromeusingaTaqMan-basedreal-timePCR[J].Journalofvirologicalmethods,2004,122(2):171-178.[52]ChungWB,ChanWH,ChaungHC,etal.Real-timePCRforquantitationofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusandporcinecircovirustype2innaturally-infectedandchallengedpigs[J].Journalofvirologicalmethods,2005,124(1):11-19.[53]AnDJ,SongDS,ParkJY,etal.ADNAminiarraysystemforsimultaneousvisualdetectionofporcinecircovirustype1(PCV1)and2(PCV2)inpigs[J].Veterinaryresearchcommunications,2009,33(2):139-147.[54]DoneSH,PatonDJ,WhiteMEC.Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS):areview,withemphasisonpathological,virologicalanddiagnosticaspects[J].BritishVeterinaryJournal,1996,152(2):153-174.[55]周丹,郭万柱,漆信桥,等.PRRSV普通株与变异株鉴别诊断RT-PCR方法的建立与临床应用[J].中国兽医学报,2012,32(3):367-370.[56]KleiboekerSB,SchommerSK,LeeSM,etal.SimultaneousDetectionofNorthAmericanandEuropeanPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirusUsingReal-TimeQuantitativeReverseTranscriptase–PCR[J].Journalofveterinarydiagnosticinvestigation,2005,17(2):165-170..[57]BalkaG,HornyákÁ,DánÁ,etal.PriProETbasedmeltingpointanalysesonPRRSVpositivefieldsamples[J].Molecularandcellularprobes,2010,24(6):411-414.[58]RoviraA,AbrahanteJ,MurtaughM,etal.Reversetranscriptionloop-mediatedisothermalamplificationforthedetectionofPorcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus[J].Journalofveterinarydiagnosticinvestigation,2009,21(3):350-354.68 参考文献[59]GaoM,CuiJ,RenY,etal.Developmentandevaluationofanovelreversetranscriptionloop-mediatedisothermalamplification(RT-LAMP)assayfordetectionoftypeIIporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus[J].Journalofvirologicalmethods,2012,185(1):18-23.[60]RobertsonA,GreigAS,AppelM,etal.HogCholera:IV.DetectionoftheVirusinTissueCulturePreparationsbytheFluorescentAntibodyTechnique[J].Canadianjournalofcomparativemedicineandveterinaryscience,1965,29(9):234.[61]SaundersGC,ClinardEH,BartlettML,etal.Applicationoftheindirectenzyme-labeledantibodymicrotesttothedetectionandsurveillanceofanimaldiseases[J].Journalofinfectiousdiseases,1977,136(Supplement2):S258-S266.[62]LinM,TrottierE,PasickJ.AntibodyResponsesofPigstoDefinedEmsFragmentsafterInfectionwithClassicalSwineFeverVirus[J].Clinicalanddiagnosticlaboratoryimmunology,2005,12(1):180-186.[63]LiY,ZhaoJJ,LiN,etal.AmultiplexnestedRT-PCRforthedetectionanddifferentiationofwild-typevirusesfromC-strainvaccineofclassicalswinefevervirus[J].Journalofvirologicalmethods,2007,143(1):16-22.[64]LeBlancN,LeijonM,JobsM,etal.AnovelcombinationofTaqManRT-PCRandasuspensionmicroarrayassayforthedetectionandspeciesidentificationofpestiviruses[J].Veterinarymicrobiology,2010,142(1):81-86.[65]姜宏泽,李英,文心田,黄小波,伍锐,文翼平,张俊,杨瑞晨,曹三杰.胸膜肺炎放线杆菌抗体ApxⅣ-Dot-PPA-ELISA检测方法的建立[J].中国兽医科学,2015,06:633-638.[66]肖国生.胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体和多杀性巴氏杆菌基因芯片检测与分型研究[D].四川农业大学,2006.[67]OliveiraS,PijoanC.Haemophilusparasuis:diagnosis,epidemiologyandcontrol[J].AvancesenTecnologíaPorcina(España),2005.[68]王艳,夏万田,姜平,等.副猪嗜血杆菌间接ELISA抗体检测方法的建立[J].畜牧与兽医,2006,38(3):5-6.[69]OliveiraS,PijoanC.Haemophilusparasuis:diagnosis,epidemiologyandcontrol[J].AvancesenTecnologíaPorcina(España),2005.[70]AngenØ,OliveiraS,AhrensP,etal.DevelopmentofanimprovedspeciesspecificPCRtestfordetectionofHaemophilusparasuis[J].Veterinarymicrobiology,2007,119(2):266-276.[71]StemkeGW,PhanR,YoungTF,etal.DifferentiationofMycoplasmahyopneumoniae,Mflocculare,andMhyorhinisonthebasisofamplificationofa16SrRNAgenesequence[J].Americanjournalofveterinaryresearch,1994,55(1):81-84.69 西南大学硕士学位论文[72]StemkeGW.Geneamplification(PCR)todetectanddifferentiatemycoplasmasinporcinemycoplasmalpneumonia[J].Lettersinappliedmicrobiology,1997,25(5):327-330.[73]BOCHEVI.Porcinerespiratorydiseasecomplex(PRDC):Areview.I.Etiology,epidemiology,clinicalformsandpathoanatomicalfeatures[J].BulgarianJournalofVeterinaryMedicine,2007,10(3):131-146.[74]刘远佳,余伟权,李庆阳,等.猪呼吸道疾病综合症病原谱分析及防控原则[J].猪业科学,2014,31(9):52-54.[75]BOCHEVI.Porcinerespiratorydiseasecomplex(PRDC):Areview.II.Diagnostics,treatmentandprevention[J].BulgarianJournalofVeterinaryMedicine,2008,11(4):219-234.[76]ZHOUBL,XIAOJW,LIUSF,etal.Simultaneousdetectionofsixfood-bornepathogensbymultiplexPCRwithaGeXPanalyzer[J].FoodControl,2013,32,198-204.[77]潘继红,韩金祥.间隔臂和探针长度与基因芯片重复性相关性研究[J].生物技术通讯,2003,01:12-15.[78]刘志杰,李如举,曾智勇,周莉,汤德元,李谦,肖超能.多重PCR反应的影响因素及其优化[J].黑龙江畜牧兽医,2011,13:26-28.[79]赵朴,郑玉姝,赵坤,等.猪呼吸道疾病综合征常见病毒多重PCR方法的建立及应用[J].华北农学报,2014,29(3):64-67.70 缩略词表缩略词表Abbreviation英文缩写英文全称中文名称APPActinobacilluspleuropneumoniae猪传染性胸膜肺炎放线杆菌HPSHaemophilusparasuis副猪嗜血杆菌MhpMycoplasmahyopneumoniae猪肺炎支原体PCV-2Porcinecircovirustype2virus猪圆环病毒2型PorcinereproductiveandrespiratoryPRRSV猪繁殖与呼吸综合征病毒syndromevirusCSFVClassicalswinefevervirus猪瘟病毒VSVVesicularstomatitisvirus水疱性口炎病毒FMDVFoot-and-Mouthdiseasevirus口蹄疫病毒PRVPseudorabiesvirus伪狂犬病病毒BTVBluetonguevirus蓝舌病病毒PPRVPestedespetitsruminantsvirus小反刍兽疫病毒PPVPorcineparvovirus猪细小病毒JEVJapaneseBencephalitisvirus日本乙型脑炎病毒SVDVSwinevesiculardiseasevirus猪水疱病病毒SalSalmonella.沙门氏菌TSBTrypticaseSoyBroth胰酪胨大豆肉汤培养基TSATryptoseSoyaAgar胰蛋白胨大豆琼脂培养基SLSSampleLoadSolution甲酰胺溶液AmpAmpicilline氨苄青霉素SSCSodiumcitratebuffer柠檬酸钠缓冲液SDSSodiumdodecylsulfonate十二烷基磺酸钠PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应PBSphosphatebuffersaline磷酸缓冲盐溶液71 西南大学硕士学位论文72 声明声明本研究论文得到重庆出入境检验检疫局承担的质检公益性行业科研项目《重要动物疫病快速集成化检测新技术研究及标准化试剂的制备》（项目编号：201310093）和质检总局科研项目《大肠杆菌分子分型和沙门氏菌夹心DNA杂交技术研究》（项目编号：2014IK247）的资助，以此表示感谢！73 西南大学硕士学位论文74 致谢致谢一转眼，即将结束在西南大学求学的七个春秋冬夏，心中有太多的不舍和留恋。七年，结交了许多的朋友，承载了太多的故事，成长了年幼无知的我。一路上，遇见很多的人，特别想感谢他们。常怀感恩之心，感谢问题和困难，感谢伸出援手的人们，感谢不断成长的自己。值此论文完成之际，借助这个平台，对那些曾经帮助过我的人表示衷心的感谢。首先，特别感谢我的导师刘力副教授。一日为师，终身为母。刘老师在过去的学习生活中，如慈母一般细心周到的关心着我们的生活学习。另外，刘老师治学严谨、爱岗敬业、兢兢业业的工作态度和方式，为我树立了良好的学习榜样，引导我树立正确的工作态度和方式。除了传授理论知识，在论文的选题、试验设计、数据分析、论文撰写修改等方面刘老师给予极大的帮助。不仅及时帮助我解决实验中遇见的难题，而且耐心的一遍又一遍的帮我修改毕业论文。在整个学习过程中，刘老师针对理论水平、科研能力、为人处世等各个方面给予足够的锻炼机会。非常感谢刘老师的悉心栽培和谆谆教导，让我通过三年的学习锻炼，不断沉淀，成为自己理想中的模样。其次，感谢重庆出入境检验检疫局的李应国老师、聂福平老师、王昱老师、杨俊老师。在为期一年半的科研实习中，感谢他们提供的技术平台和机会。尤其感谢聂福平老师、王昱老师、杨俊老师在试验过程中给予的技术指导和生活中的关心照顾，衷心祝愿他们能在今后的工作生活中工作顺利、生活顺心。再次，感谢西南大学的聂奎教授、彭远义教授、王豪举副教授等动物科技学院老师在课程学习中言传身教，不仅传输理论知识，而且在科研课题中大力支持和指导。另外，特别感谢我本科的班主任王炜老师，感谢她七年来对我学习和生活中的照顾和关心。王老师是我学习和生活中的朋友，在我迷茫时，耐心倾听我的烦恼，并为我指明前进的方向。在我得意时，真心为我鼓掌，并轻轻告诉我再接再厉。感谢在这个满校玉兰桂花的学校中，遇见的所有老师，衷心祝愿你们事业顺心、生活甜美。身边的小伙伴也是我要感谢的一群人，感谢刘绍林、刘亚娟、吉佳乐、任静静、李乐天、李海娥、龚川南等多位朋友在三年研究生生活学习中陪伴、关心和帮助。感谢方仁东师兄、袁曾壮师兄、叶自霞师姐、荣霞师姐在试验过程和生活学习中的热心帮助。香樟树下的年华，因为你们的陪伴，变得更加美好。最后，感谢我的父母和弟弟，感谢求学二十年来的理解和支持，尤其是母亲大力的物质和精神层面给予的支持。同时，感谢家里其他的亲戚朋友，感谢他们的理解和包容，以及我不在时对家里的关照。衷心祝愿你们身体健康、工作顺利。在最好的年纪，遇见一所美丽的学校，遇见一群特别的人，感谢在这里遇见的老师、朋友、同学和我最亲爱的家人们，祝愿你们一切安好。保雨2016年2月14日75 西南大学硕士学位论文76 在读期间发表的文章、参与的专利及项目在读期间发表的文章、参与的专利及项目发表的文章：1.保雨,聂福平,杨俊,王昱,刘亚娟,王国民,李贤良,李应国,张超,刘力.猪六种重要病原寡核苷酸芯片检测方法的初步建立[J].中国兽医科学,2016,02:142-148.2.保雨,聂福平,王昱,杨俊,袁曾壮,叶自霞,刘亚娟,张姜琳,吴蕊,田郡,王国民,刘力,李应国.流产嗜衣原体TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的建立[J].中国预防兽医学报,2015,07:536-540.3.保雨,刘亚娟,刘力,彭祥伟,张昌莲.动物源性葡萄球菌多重耐药基因cfr研究进展[J].动物医学进展,2015,06:122-125.4.刘力,彭义,荣霞,保雨,王永康.重庆市肉兔肌肉组织中重金属残留量检测分析[J].中国畜牧杂志,2013,24:56-595.荣霞,彭义,保雨,刘力,王永康.重庆市部分地区肉兔肌肉组织中农药、兽药多残留检测分析[J].西南大学学报(自然科学版),2015,06:7-12.6.刘亚娟,保雨,彭祥伟,刘力,石宝石.宿主miRNA调节沙门氏菌感染的研究进展[J].中国预防兽医学报,2015,12:973-977.7.刘亚娟,聂福平,张超,杨俊,王昱,石宝石,保雨,王国民,李贤良,李应国,刘力.沙门菌夹心DNA杂交检测方法的建立[J].中国兽医科学,2015,12:1260-1265.8.刘亚娟,聂福平,杨俊,王昱,石宝石,保雨,叶自霞,王国民,李贤良,李应国,肖进文,刘力.猪传染性胸膜肺炎放线杆菌LAMP方法的建立[J].中国兽医学报,2016,02:200-205.9.叶自霞,杨俊,聂福平,王昱,袁曾壮,李应国,王国民,李贤良,保雨,刘亚娟,刘力.家畜嗜衣原体TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的建立[J].中国兽医科学,2015,04:380-384.参与的专利：1.李应国,王昱,聂福平,保雨,杨俊,艾军,张强,王国民.用于六种猪病病原鉴别的基因芯片及其检测方法[P].重庆：CN105063237A,2015-11-18.2.聂福平,王昱,杨俊,李应国,王国民,保雨,艾军,李贤良,张强.用于七种猪病病原鉴定的基因芯片及其检测方法[P].重庆：CN105063760A,2015-11-18.3.王昱,杨俊,聂福平,李应国,保雨,李贤良,王国民,张超,艾军.用于检测猪传染性胃肠炎病毒的基因芯片及其检测方法[P].重庆：CN105040110A,2015-11-11.4.王昱,聂福平,杨俊,李应国,王国民,保雨,艾军,张强,李贤良.用于检测小反刍兽疫病毒的基因芯片及其检测方法[P].重庆：CN104611469A,2015-05-13.77 西南大学硕士学位论文参与的项目：1.国家科技支撑计划“三峡库区肉兔健康养殖关键技术集成与示范”子课题--兔产品加工研发与应用（项目编号：2011BAD36B03）；2.国家质检公益性行业科研专项“重要动物疫病快速集成化检测新技术研究及标准化试剂的制备”(项目编号：201310093)；3.国家质检总局科研项目“大肠杆菌分子分型和沙门氏菌夹心DNA杂交技术研究”（项目编号：2014IK247）。78
此文档下载收益归作者所有
