14种观赏植物17种真菌病害的病原鉴定

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学校代码：10564学号：2013308813分类号：S432.1密级：硕士学位论文14种观赏植物17种真菌病害的病原鉴定王晓阳第一指导教师：刘海涛副教授第二指导教师：学院名称：林学与风景园林学院专业学位类别：农业推广硕士领域：园艺答辩委员会主席：曾宋君研究员中国·广州2016年6月 华南农业大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名：日期：学位论文提交同意书本学位论文符合国家和华南农业大学关于研究生学位论文的相关规定，达到学位授予要求，同意提交。导师签名：日期：学科带头人签名：日期： 摘要本研究从广州地区采集到14种常见的具有病斑的观赏植物，包括九里香（Murrayapaniculata）、阴香（Cinnamomumburmannii）、桂花（Osmanthusfragrans）、发财树（Pachiramacrocarpa）、红花羊蹄甲（Bauhiniablakeana）、狗牙花（Ervatamiadivaricata）、麻竹（Dendrocalamuslatiflorus）、朴树（Celtissinensis）、蜘蛛兰（Hymenocallislittoralis）、夏威夷椰子（Pritchardiagaudichaudii）、龟背竹（Monsteradeliciosa）、金钗石斛（Dendrobiumnobile）、铁皮石斛（Dendrobiumofficinale）和榕树（Ficusmicrocarpa），对这些植物上的真菌性病害进行了调查分析，并对病害标本在实验室条件下进行了组织分离、病原菌培养、纯化以及致病性测定，共得到17种病原菌的菌株。通过形态学和分子生物学方法对这些菌株进行了种类鉴定，现将结果报道如下：红花羊蹄甲叶枯病、桂花炭疽病、阴香叶斑病、铁皮石斛炭疽病和榕树叶斑病的病原菌为小丛壳科（Glomerellaceae）、炭疽菌属（Colletotrichum）的胶孢炭疽菌（C.gloeosporioides）；夏威夷椰子叶枯病和发财树叶枯病的病原菌为假球壳科（Pleosporaceae）、链格孢属（Alternaria）真菌；狗牙花锈病的病原菌为柄锈科（Pucciniaceae）、柄锈菌属（Puccinia）的恩格勒柄锈菌（P.engleriana）；麻竹叶锈菌的病原菌为柄锈科、柄锈菌属真菌；龟背竹叶斑病的病原菌为假球壳目（Agaricales）、茎点霉属（Phoma）真菌；九里香白粉病的病原菌为白粉菌科（Erysiphaceae）、白粉菌属（Erysiphe）的E.quercicola；朴树白粉菌的病原菌为白粉菌科、半内生钩丝壳属（Pleochaeta）的三孢半内生钩丝壳（P.shiraiana）；金钗石斛疫病的病原菌为腐霉科（Pythiaceae）、疫霉属（Phytophthora）的烟草疫霉（P.nicotianae）；金钗石斛炭疽病的病原菌为小丛壳科、炭疽菌属的博宁炭疽菌（C.boninense）；在蜘蛛兰叶斑病分离出有3种病原菌，分别为赤壳科（Nectriaceae）、镰刀菌属（Fusarium）的尖孢镰刀菌（F.oxysporum），假球壳目、茎点霉属真菌以及伞菌科（Agaricaceae）真菌。其中，由胶孢炭疽菌引起的红花羊蹄甲叶枯病是国内首次报道；由恩格勒柄锈菌引起的狗牙花锈病是广东省首次报道；由三孢半内生钩丝壳引起的朴树白粉病是首次采用了分子生物学方法进行鉴定，并首次使用光学显微镜拍摄了其分生孢子形态。关键词：观赏植物；病原真菌；鉴定I TheIdentificationofPathogensfor17FungalDiseasesof14OrnamentalPlantsWangXiaoyang（CollegeofForestryandLandscapeArchitecture,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou,510642,China）Abstract:Inthisstudy,14kindsofcommonornamentalplantswithdiseasespotwerecollectedfromGuangzhouarea,whichincludedMurrayapaniculata,Cinnamomumburmannii,Osmanthusfragrans,Pachiramacrocarpa,Bauhiniablakeana,Ervatamiadivaricata,Dendrocalamuslatiflorus,Celtissinensis,Hymenocallislittoralis,Pritchardiagaudichaudii,Monsteradeliciosa,Dendrobiumnobile,DendrobiumofficinaleandFicusmicrocarpa.Then,thefungaldiseasesoftheseplantswereinvestigatedandanalyzed.Besides,thetissueisolation,pathogensculture,purificationandpathogenicityidentificationwerealsoconductedforthediseasespecimensunderlaboratoryconditionsinordertoobtain17kindsofpathogenicfungusstrains.Also,thespeciesidentificationofthesefungusstrainswasconductedthroughmorphologyandmolecularbiologymethod.Theresultswerereportedasfollows:ThepathogenicfungusofB.blakeanaleafblight,O.fragransanthracnose,C.burmanniileafspot,D.officinaleanthracnoseandF.microcarpaleafspotbelongtotheColletotrichumgloeosporioides；AndthepathogenicfungusofP.gaudichaudiileafblightandP.macrocarpaleafblightbelongtoAlternariasp.；ThepathogenicfungusofE.divaricatarustdiseasebelongtoPucciniaengleriana；Also,thepathogenicfungusofD.latiflorusrustfungibelongtoPucciniasp.；ThepathogenicfungusofM.deliciosaleafspotdiseasebelongtoPhomasp.；ThepathogenicfungusofM.paniculatapowderymildewbelongtotheErysiphequercicola；ThepathogenicfungusofCeltissinensispowderymildewbelongtoPleochaetashiraiana；ThepathogenicfungusofD.nobilephytophthoradiseasebelongtoPhytophthoranicotianae；ThepathogenicfungusofD.nobileepidemicdiseasebelongtoColletotrichumboninense；ThreepathogenicfungusisolatedfromH.littoralisleafspotweretheFusariumoxysporum,Phomasp.,Agaricaceae,respectively.Amongthem,theB.blakeanaleafblightcausedbyC.gloeosporioideswasdomesticallyreportedforthefirsttime.TheE.divaricatacausedbyP.englerianawasfirstreportedinGuangdong.TheC.sinensispowderymildewcausedbyP.shiraianawasfirstidentifiedbymolecularbiologymethod.Besides,thegraphofitsmorphologicalfeaturesII wastakenforthefirsttimethroughusinganopticalmicroscope.Keywords:Ornamentalplant；Fungaldiseases；IdentificationIII 目录1前言......................................................................................................................................11.1国外观赏植物真菌病害研究概况..................................................................................11.2国内观赏植物真菌病害研究概况..................................................................................11.3广东观赏植物真菌病害的研究现状..............................................................................31.4真菌病害病原菌的鉴定方法...........................................................................................31.4.1形态学鉴定方法............................................................................................................31.4.2分子生物学鉴定方法....................................................................................................31.5本研究的目的与意义.......................................................................................................42试验材料与方法.................................................................................................................52.1病害标本的采集..............................................................................................................52.1.1病原菌的形态学观察...................................................................................................52.2培养基的制作..................................................................................................................52.2.1PDA的制作...................................................................................................................52.2.2LB培养基的制作..........................................................................................................52.2.3SOB培养液...................................................................................................................52.3病原菌的分离培养..........................................................................................................62.3.1病原菌的组织分离.......................................................................................................62.3.2病原菌的纯化...............................................................................................................62.4病原菌的人工接种和病害症状观察..............................................................................72.5病原菌的形态学鉴定......................................................................................................72.6病原菌的分子生物学鉴定..............................................................................................72.6.1病原菌的DNA提取....................................................................................................72.6.2PCR扩增.......................................................................................................................8IV 2.6.3电泳...............................................................................................................................82.7PCR片段的克隆转化......................................................................................................92.7.1目的片段与质粒DNA的连接....................................................................................92.7.2转化...............................................................................................................................92.7.3阳性克隆的收集、检测...............................................................................................92.8序列分析........................................................................................................................102.9狗牙花锈病以及九里香白粉病病菌的自然发病状态观察........................................103结果与分析.......................................................................................................................113.1红花羊蹄甲叶枯病的症状描述及病原鉴定................................................................113.1.1危害症状.....................................................................................................................113.1.2形态学鉴定.................................................................................................................113.1.3rDNA-ITS序列分析...................................................................................................123.2狗牙花锈病的症状描述及病原鉴定............................................................................133.2.1危害症状......................................................................................................................133.2.2形态学鉴定.................................................................................................................133.2.3rDNA-ITS序列分析...................................................................................................143.3桂花炭疽病的症状描述及病原鉴定.............................................................................153.3.1危害症状.....................................................................................................................153.3.2形态学鉴定.................................................................................................................163.3.3rDNA-ITS序列分析...................................................................................................173.4发财树叶枯病的症状描述及病原鉴定........................................................................183.4.1危害症状.....................................................................................................................183.4.2形态学鉴定.................................................................................................................183.4.3rDNA-ITS序列分析...................................................................................................193.5九里香白粉病的症状描述及病原鉴定........................................................................20V 3.5.1危害症状.....................................................................................................................203.5.2形态学鉴定.................................................................................................................213.5.3rDNA-ITS序列分析...................................................................................................213.6阴香叶斑病的症状描述及病原鉴定............................................................................223.6.1危害症状.....................................................................................................................223.6.2形态学鉴定.................................................................................................................233.6.3rDNA-ITS序列分析...................................................................................................233.7金钗石斛疫病的症状描述及病原鉴定.........................................................................243.7.1危害症状.....................................................................................................................243.7.2形态学鉴定.................................................................................................................253.7.3rDNA-ITS序列分析...................................................................................................253.8麻竹叶锈病的症状描述及病原鉴定............................................................................263.8.1危害症状.....................................................................................................................263.8.2形态学鉴定.................................................................................................................263.8.3rDNA-ITS序列分析...................................................................................................273.9朴树白粉病的症状描述及病原鉴定............................................................................283.9.1危害症状......................................................................................................................283.9.2形态学鉴定.................................................................................................................283.9.3rDNA-ITS序列分析...................................................................................................283.10夏威夷椰子叶枯病的症状描述及病原鉴定..............................................................293.10.1危害症状....................................................................................................................293.10.2形态学鉴定...............................................................................................................303.10.3rDNA-ITS序列分析.................................................................................................303.11铁皮石斛炭疽病的症状描述及病原鉴定..................................................................313.11.1危害症状....................................................................................................................31VI 3.11.2形态学鉴定................................................................................................................323.11.3rDNA-ITS序列分析..................................................................................................323.12金钗石斛炭疽病的症状描述及病原鉴定...................................................................333.12.1危害症状....................................................................................................................333.12.2形态学鉴定...............................................................................................................333.12.3rDNA-ITS序列分析.................................................................................................343.13榕树叶斑病的症状描述及病原鉴定...........................................................................353.13.1危害症状....................................................................................................................353.13.2形态学鉴定................................................................................................................353.13.3rDNA-ITS序列分析.................................................................................................363.14龟背竹叶斑病的症状描述及病原鉴定.......................................................................373.14.1危害症状....................................................................................................................373.14.2形态学鉴定................................................................................................................373.14.3rDNA-ITS序列分析.................................................................................................383.15蜘蛛兰叶斑病的症状描述及病原鉴定.......................................................................383.15.1危害症状....................................................................................................................383.15.2病原物尖孢镰刀菌的鉴定........................................................................................393.15.3病原物茎点霉的鉴定................................................................................................403.15.4病原物伞菌科的鉴定................................................................................................424结论与讨论.......................................................................................................................444.1红花羊蹄甲叶枯病及其病原菌.....................................................................................444.2狗牙花锈病及其病原菌.................................................................................................444.3桂花炭疽病及其病原菌.................................................................................................444.4发财树叶枯病及其病原菌.............................................................................................454.5九里香白粉病及其病原菌.............................................................................................46VII 4.6阴香叶斑病及其病原菌.................................................................................................464.7金钗石斛疫病及其病原菌.............................................................................................474.8麻竹叶锈病及其病原菌.................................................................................................474.9朴树白粉病及其病原菌.................................................................................................484.10夏威夷椰子叶枯病及其病原菌...................................................................................484.11铁皮石斛炭疽病及其病原菌.......................................................................................494.12金钗石斛炭疽病及其病原菌.......................................................................................494.13榕树叶斑病及其病原菌...............................................................................................494.14龟背竹叶斑病及其病原菌...........................................................................................494.15蜘蛛兰叶斑病及其病原菌锈病及其病原菌...............................................................504.16关于菌物鉴定方法的讨论与改进...............................................................................51致谢.......................................................................................................................................52参考文献...............................................................................................................................53VIII 1前言观赏植物遍布世界各地，是各种各样的活动和场合必备的植物之一。然而随着人们对观赏植物需求量的增多和观赏植物品种的不断丰富，其栽培方式和适应的环境发生了变化，随之而产生的病害成为困扰观赏植物生产和发展的重要问题。关于观赏植物病害方面的研究，国内外都做了大量的报道。1.1国外观赏植物真菌病害研究概况国外方面，对于观赏植物病害的研究起步较早。Pirone（1978）编著的《DiseasesandPestsofOrnamentalPlants》是一本关于观赏植物病虫害的权威性专著，描述了病、虫及其它因素导致的观赏植物病害近500种。美国Strider（1983）主编的《Diseasesoffloralcrops》，详细介绍了观赏花卉、草本花卉和盆栽花卉的常见病害及病害的防治对策。《Compendium》（论文集）是美国首次出版的关于商业性观赏花卉病害的系列丛书。Horst（1983）编著的《CompendiumofRoseDiseases》，系统介绍了玫瑰常见的真菌病害、细菌病害、病毒病害以及非侵染性病害，并且提供了大量的玫瑰危害症状彩图以及病原菌显微图片。Coyier（1986）编著的《CompendiumofRhododendronandAzaleaDiseases》，是一本关于杜鹃属植物病虫害的专注，系统介绍了杜鹃属植物真菌、细菌、病毒性病害、虫害以及非侵染性病害，并对每一种病害从发病症状、病原鉴定以及防治技术等方面做了详细的描述。Chase（1987）编著的《CompendiumofOrnamentalFoliagePlantDiseases》，是一本关于观叶植物病害的专注，书中从危害症状、发病因素、寄主范围、病害流行及病害控制方面对50个属的观叶植物病害作了详细而全面的描述，同时附有病害症状、菌落培养及病原菌等彩色图片，其中由真菌引起的病害危害最多。1.2国内观赏植物真菌病害研究概况我国运用现代分类学方法研究真菌始于20世纪初，当时己经有不少涉及花卉病害的学术论文和研究报告，如1961年张祖纯发表了关于我国真菌的第一篇报告:“北京附近发生最盛之植物病害调查表”，鉴定了当时在北京地区所发生的花卉病害及病原真菌47种。20世纪中后期，中国真菌病害有了迅猛的发展。戚佩坤等（1966）编写的《吉林省栽培植物真菌病害志》，主要记载了吉林省400多种植物上的1600余种真菌病害，并详细对各种病害的症状、病原、病情及分布情况进行了描述。戴芳斓（1979）编著的《中国真菌总汇》，记录真菌总数共约7000种左右，其中包括很多1 花卉病害的记载。1987年，中国植病学会、中国花卉协会和全国植保总站在昆明市联合召开了我国第一届花卉病害学术讨论会，对一些重要病害的病原菌进行了鉴定研究，初步掌握了病害的发生和流行规律，同时在防治上取得一定成绩。学术会议的召开使我国对真菌病害的研究有了突飞猛进的发展。王瑞灿等（1988）编写的《中国园林植物病害名录》、张中义（1992）主编的《观赏植物真菌病害》、陆家云（2000）编著的《植物病原真菌学》等著作，对我国常见的观赏花卉病害的症状、病原菌、侵染循环、发病规律及防治方法进行了较为详细的介绍。欧阳秩等（1992）编写的《观赏植物病害》，对我国花卉病害进行调查，鉴定出740种病害。雷增普（2005）主编的《中国花卉病虫害诊治图谱》，搜集了1360余种花卉病虫害资料，对每一种病虫害的危害症状、发生特点和实用的防治技术，做了详尽的描述，从中也可以看出“病害的发生种类和防治技术”己经成为研究花卉病害的重点。我国对花卉病害的调查研究工作起步晚，研究基础比较薄弱。自20世纪80年代以来我国各省市对花卉病害的调查研究工作大力开展起来。张中义等（1987）研究园林花卉作物病害130种，鉴定出病原真菌22种。张中义等（1988）报道了昆明、重庆、成都三市的涉及34种寄主植物上的45种真菌病害，其中24种病害为当地首次报道。孙树权等（1990）调查真菌病害548种，其中有200余种为山西省首次记录病害。杨雪莲（1997）报道了西藏13种常见花卉病害。张陶等（1994）先后报道了云南、四川、新疆、昆明等地60余种园林花卉植物病害62种，其中国内新记录种31种，省内寄主新记录病害32种。近年来随着花卉品种的不断丰富和栽培面积的不断扩大，花卉真菌病害及新病害问题口益突显。易小平等（2001）对海南省海口、琼山、通什、檐州等市（县）花卉基地41个品种花卉进行了病害普查，共查出病害100种，其中真菌性病害83种，报道了国内新病害6种，在这些病害中以疫霉菌引致的非洲菊根腐病和红掌的根腐病最为严重。郑晓慧等（2001）鉴定了真菌病害38种，报道了其中的3个新种，分别为由苞叶芋帚梗柱抱霉（CylindrocladiumspathiphylliSchoultiesetal.）引起的苞叶芋褐腐病、由Pucciniapaullulaf.sp.monsteraeH.Sydow&P.Sydow引起的龟背竹锈病和拟茎点霉Phomopsissp.引起的千年健褐斑病。桑维钧等（2006）通过对贵州省贵阳市园林植物的病害种类调查，鉴定出28种真菌病害，主要危害观赏树木、宿根园林植物、木本花卉植物、地被植物。可见，观赏植物病害鉴定工作己经成为观赏植物产业发展的研究热点。2 1.3广东观赏植物真菌病害的研究现状在广东省内病害的观赏植物病害的调查研究相对较少，郭桢等（2006）对广州地区常见观赏植物真菌病害调查的基础上,选择了18种常见观赏植物真菌病害进行了病原鉴定,初步鉴定结果表明其病原分别为灰葡萄孢、砖红镰刀菌、假格链格孢、天南星柱帚霉、细极链格孢、镰刀菌属、拟茎点霉属、炭疽菌、链格孢、盘多毛孢、拟盘多毛孢、叶点霉、匍柄霉、杜鹃盘多毛孢、棕榈拟盘多毛孢、炭疽菌、齐整小核菌和炭疽菌。还有一些病害研究针对的是某一类群或某一种的观赏植物，如习平根等（2003）对棕榈科观赏植物的真菌病害进行了鉴定，郑晓慧等（2001）对广州地区天南星科观赏植物上的几种新真菌病害进行了鉴定研究，施祖荣等（2012）广东主要兰花真菌病害进行了鉴定以及药剂的筛选试验，曾莉等（2004）对广东省姜科观赏植物真菌病害的病原鉴定，冯淑杰等（2008）对观赏凤梨叶斑病病原鉴定及其防治药剂筛选，刘杰（2012）研究了广州市内蜘蛛兰病害的病情指数以及药剂防治措施。1.4真菌病害病原菌的鉴定方法1.4.1形态学鉴定方法形态学鉴定方法是基于菌种细胞形态、大小、排列、运动性、特殊构造和染色反应及菌落形态、在培养基中的生长状态等形态指标进行鉴定分类的一种方法。植物病原真菌的分类与鉴定，主要是采用运用光学显微镜或电子显微镜来观察菌丝、孢子形态和子实体特征及菌落质地和产生的色素等基本特点的。目前所用的分类系统都是建立在形态分类学基础之上的，例如我们通常用的真菌分类鉴定的书籍《中国真菌志》一系列丛书都是根据形态学而编制的，因此形态学鉴定方法依然是真菌分类鉴定的最直观最常用的方法（王丽霞，2012）。1.4.2分子生物学鉴定方法相对于传统的真菌形态学鉴定方法，rDNA-ITS方法是目前采用较多的菌种分子生物学鉴定方法，rDNA-ITS序列分析用于真菌鉴定更客观、省时、简便、快速，通过PCR扩增与测序的方法测得待检真菌菌株的rDNA-ITS序列，从GENBANK获取相似序列,使用BLAST工具对rDNA-ITS序列进行比对分析。ITS（internaltranscribedspacers）内部转录间隔区，包含2个不同的非编码区域的ITS1和ITS2。在ITS两侧的18S、5.8S和28S编码区具有非常保守的区域，便3 于设计引物。由于真核生物核糖体DNA（rDNA）的重复片段中，ITS区进化速度较快且片段长度适中，该片段在基因组不同重复单元间十分一致。通过PCR扩增，克隆测序，最后利用测序结果来分析物种ITS区同源性关系，则可以找到物种种间相关系统进化关系，使得ITS成为高等真菌种间及种群系统性研究的重要核基因标记，具有很高的应用价值（燕勇等，2008）。1.5本研究的目的与意义观赏植物病害是制约其产业持续发展的一个重要因素，广州地区观赏植物品种丰富，种植多样化，随着种植面积的不断扩大，病原菌寄主范围变广，某些次要病害上升为主要病害，与此同时新病害问题口益凸显，从而产生了许多有待我们研究的观赏植物病害。关于观赏植物病害发生的有关报道，大多是根据症状来进行防治的，对于观赏植物病害病原真菌的研究报道相对较少，具有盲目性，为病害的根本防治带来了诸多问题。本研究从广州地区的观赏植物上采集病害标本，以形态学与分子生物学相结合的方法对这些病害的病原真菌进行鉴定，为生产上对这些病害进行科学防治提供理论依据，也将为观赏植物的高品质的安全生产奠定一定的基础。有利于进一步研究广东观赏植物病害的发生发展规律和特点，为观赏植物的保护及养护提供有益参考，完善观赏植物保护措施。4 2试验材料与方法2.1病害标本的采集供试的具有病斑的病害标本共15种，采集于广州地区的公共绿地和花卉生产基地。观察植物的发病情况，取发病典型的样本带回实验室进行病原鉴定。2.1.1病原菌的形态学观察用灭菌挑针挑取病原菌孢子少许做成临时玻片，运用OPTEC显微镜（型号BK-DM320），借助OPTPRO2008软件，仔细观察形态特征并拍照，测量病原菌分生孢子大小、分生孢子梗长度等（邓维萍等，2013）。部分病原菌采用蔡司正置光学显微镜ZEISSAxioImagerD2型观察及测量。2.2培养基的制作2.2.1PDA的制作（1）称量。称量去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂17g。（2）将马铃薯切成小块，放入锅中，加水1000mL，煮沸20min。用纱布滤去马铃薯残渣。（3）将马铃薯滤液放回锅中，加入琼脂，加热熔化。在琼脂熔化的过程中，需要用玻璃棒不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。（4）加入葡萄糖。葡萄糖溶解后，加入适量的水以补充加热过程中损失的水分，定容至1000mL。（5）分装。将配制的培养基分装于三角瓶内。分装三角瓶的容量以不超过三角瓶容积之一半为宜。（6）加塞。在瓶口塞上胶塞。（7）包扎。加塞后，将三角瓶口用报纸包好，再在报纸外扎上橡皮筋。（8）灭菌。将上述培养基以0.103MPa，121℃，高压蒸气灭菌20min。2.2.2LB培养基的制作10g细菌学蛋白胨，5g酵母提取物，5gNaCL（固体平板含1.3%Agar），加双蒸水定容至1000mL，pH调节至7.0，高压湿热灭菌。2.2.3SOB培养液20g胰蛋白胨，5g酵母粉，2mL5mol/LNaCl，2.5mL5mol/LKCl，加双蒸水定容至1000mL，pH调节至7.0，高压湿热灭菌。5 2.2.4SOC培养液1/100的2mol/L（1mol/LMgCl2+1mol/LMgSO4），1/100的2mol/L葡萄糖加到SOB溶液中。2.2.5清水琼脂平板（WA）的制备琼脂20g，蒸馏水1000ml，121℃高压灭菌20min。用于单孢分离的WA平板培养基应保证浓度在3%左右，避免过软造成解剖刀无法整块转移、挑针刺破等问题；用于挑取单孢的WA平板要求有较高的透光性及洁净度。同时，在制作WA时也应注意，培养基厚度应在2~3mm左右，过厚影响其透光性，过薄又难以整块从培养皿中取下转移至载玻片上。2.3病原菌的分离培养2.3.1病原菌的组织分离组织分离是在无菌条件下取发病材料在培养基上培养（黄金凤，2012）。分离方法如下：（1）用自来水冲洗发病材料，在病健交接处剪下0.2cm×0.2cm大小的组织5块。（2）将剪下的分离组织置于75%的酒精中浸泡10s，消除附在组织表皮的气泡，以免消毒剂不能与寄主表面直接接触影响消毒效果。（3）将组织迅速转移至0.2%升汞液中浸泡13s，消菌杀毒，杀死组织表面的杂菌。（4）再次转移到无菌水中洗涤3次，除去材料表面残留的消毒剂。然后将组织移到有培养基平板的培养皿内，每皿均匀地放5块组织。（5）在培养皿上标注病害名称、分离日期，然后放到26℃培养箱内培养。2.3.2病原菌的纯化3~4d后挑选由分离材料上长出的典型而无杂菌的菌落，转移到新的PDA培养基上进行纯化。待产孢后，在培养基中加入4mL的无菌水，用灭过菌的勺子刮下培养基表面的菌丝，制成孢子悬浮液。用灭菌的玻璃棒蘸取一滴制备好的悬浮液于载玻片，并在显微镜下计数，将孢子浓度调节到40倍镜下每视野10个以下孢子，以备涂平板。将制备好的孢子悬浮液涂在水琼脂平板上。将上述制备好的孢子悬浮液涂布在WA平板上。在此步骤中，因为孢子悬浮液中还含有断裂的菌丝和培养基中其他杂质，所以在涂布前应将孢子悬浮液静置1~2min，尽量只使用培养基上半部分的孢子悬浮液进行涂布。之后置于28℃培养箱中培养12h6 左右，待其萌发后用于单孢的分离。经孢子悬浮液涂布后并在28℃黑暗培养条件下的WA培养基上，病菌孢子已经萌发，但未形成大面积菌丝以及孢子与孢子间菌丝交叠的情况，此时便可以进行单孢分离。首先用刀片将涂布中有病原孢子悬浮液的WA平板切成1cm左右的方块，然后置于40倍显微镜下观察并调节视野，保证已经萌发的羊蹄甲叶枯病病菌孢子位于视野中央，而未有其他孢子出现在此视野中。最后用接种针挑取切得的琼脂块，转移至PDA培养基中培养。在此步骤中，接种针用酒精灯火焰灼烧后应先在无菌水中冷却。为避免接种针触碰到其他孢子，落针点应为划痕范围内的琼脂块上（邱小燕等，2011）。2.4病原菌的人工接种和病害症状观察（1）采健康植株的的嫩叶，用清水冲洗叶片。（2）用灭菌的梅花针在每片接种植物的叶片上刺3个伤口。（3）将大小为5×5mm2的含有菌丝的培养基贴在伤口处，取三块含有菌丝的培养基放于同一片叶片的没有伤口的地方。将脱脂棉在无菌水中浸湿盖在培养基块上保湿。（4）将大小为5×5mm2的空白培养基放在另一片的伤口处。将脱脂棉在无菌水中浸泡盖在培养基块上保湿。室温条件下进行保湿处理。（5）24h后去掉脱脂棉，每隔两天观察发病情况，记录病部症状，并再次进行分离培养，确定病原物。2.5病原菌的形态学鉴定参照常用的真菌鉴定文献资料（戴芳澜，1979；陆家云，2001；巍景超，1979；许志刚，2009；张天宇，2003；张中义等，1988），对上述分离、纯化得到的各种不同颜色与形态的真菌菌株进行分类鉴定，确定其所属的种类。2.6病原菌的分子生物学鉴定2.6.1病原菌的DNA提取按照试剂盒（GenomicDNAExtractionKitVer.5.0试剂盒，TaKaRa公司）的说明步骤进行。（1）将菌丝置于1.5mL的离心管中。（2）加入180μL的BufferGL、20μL的ProteinaseK和10μL的RNaseA（10mg/ml），于56℃水浴温浴至组织完全裂解（2h）。7 （3）将SpinColumn安置于CollectionTube上，溶液转移至SpinColumn中，12，000rpm离心2min，弃滤液。（4）将500μL的BufferWA加入至SpinColumn中，12，000rpm离心1min，弃滤液。（5）将700μL的BufferWB加入至SpinColumn中，12，000rpm离心1min，弃滤液。（确认BufferWB中已经加入指定体积的100%乙醇）。（6）重复上一步骤。（7）将SpinColumn安置于CollectionTube上，12，000rpm离心2min。（8）将SpinColumn安置于新的1.5mL的离心管，在SpinColumn膜的中央处加入50μLElutionBuffer，室温静置5min（将ElutionBuffer加热至65%使用时有利于提高洗脱效率）。（9）12，000rpm离心2min洗脱DNA。（10）基因组DNA定量。2.6.2PCR扩增选用真菌ITS扩增的通用引物ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′），对供试的菌株进行ITS区段PCR扩增（陈希芹，2004）。反应扩增体系为50µL，各组分如下：5μL的10×反应缓冲液，4μL的dNTPs，2μL的正向引物，2μL的反向引物，0.25μL的ExTaqDNA聚合酶，2μL的DNA，34.8μL的ddH2O。混合均匀后，短暂离心，放入PCR仪中。PCR的扩增程序为：94℃预变性4min，然后94℃变性30s，54℃退火45s，72℃延伸1min，进行30个循环；最后72℃延伸5min，温度降到10℃即完成扩增。扩增产物取出之后于4℃冰箱保存、备用。2.6.3电泳反应结束后，取5μL扩增产物，利用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，然后于凝胶成像系统中观察扩增产物的大小，并拍照留存。如果出现特异性的扩增条带，直接将PCR产物公司进行测序；如果条带不特异，则将符合预期大小的ITS扩增条带切下，进行克隆，然后送公司测序。（1）制胶1.0%琼脂糖凝胶：称取0.4g琼脂糖，加入40mL的0.5×TBE缓冲液（pH=8.0），然后在微波炉内中高火加热1.5min，取出充分溶解的琼脂糖溶液，略为冷却后加入28 µLGoldview指示剂，摇匀；然后调制模具呈水平状态，插好梳子，等到凝胶不烫手后将其倒入制胶模具（如有气泡要把气泡赶出）。（2）电泳待凝胶完全凝固后，拔出梳子，将制胶板置于电泳槽中。然后取5.0µL的PCR产物加入3.0µLBuffer，摇匀稍微离心后点样，然后接通电泳槽与电泳仪，设定电压（80V）和时间（22min）。2.7PCR片段的克隆转化2.7.1目的片段与质粒DNA的连接（1）连接反应体系反应体系为10μL，所用各成分如下：0.5μL的pMD18-T载体，5μL的SolutionⅠ，1μL的DNA，3.5μL的ddH2O。（2）连接反应反应混合液摇匀，并离心，然后在PCR仪上按下列程序进行连接反应：10℃3min→从10℃经历3min升至16℃→16℃3min→18℃1min，20~25个循环，然后65℃5min。结束后将连接反应液于-20℃冰箱保存、备用。2.7.2转化（1）平板的制备：LB固体培养基中加入2%体积的氨芐青霉素溶液（Amp，50μg/mL），转化前1d，倒置平板，保存；（2）取上述连接反应液5μL，加入50μL的感受态细胞悬浮液，摇匀，冰中放置30min，然后于42℃水浴中保温45s，再迅速放置冰中冷却1min；（3）向上述管中加入945μL的SOC液体培养基，使总体体积达到1mL，摇匀后于37℃振荡培养60min；（4）在超净工作台上取0.1mL培养液，20μLIPTG（1mol/L）和20μLX-gal（20mg/mL）涂布于含有的Amp的LB平板培养基上，涂匀。（5）在菌液完全被培养基吸收后，培养皿倒置于37℃培养箱中培养16h。2.7.3阳性克隆的收集、检测用枪头随机挑取白斑于装有10μL双蒸水的PCR管中，洗去枪头的菌液，然后取1μL洗涤液进行PCR扩增，检测挑取的白斑是否含有插入子。PCR扩增所用引物，反应体系、程序、产物检测均同PCR扩增。剩余的9μL洗涤液于1.5mlLB（含有50μg/mL的Amp）的培养管中，150~2009 rpm培养8h，以碱裂解法提取质粒DNA。质粒DNA用EcoRI和SalI进行酶切，37℃酶切2h，检测是否含有插入子和插入子的不同类型。具体酶切反应体系（20μL）如下：2μL的Hbuffer，1μL的SalL，1μL的EcoRI，1μL的DNA，15μL的ddH2O。根据PCR检测和酶切检测的结果，确定带有插入目的片段的克隆送去生科公司测序。2.8序列分析将测得的序列在GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行BLAST比对分析。以DNA同源性为基础，将菌株在分子水平上给以界定。一般来说，同一种内的菌株必须是DNA同源性≥70%。2.9狗牙花锈病以及九里香白粉病病菌的自然发病状态观察目前，本试验的部分专性寄生菌采用了曲利苯兰透明法来观察其自然发病情况。真菌类在合成培养基上无法培养时，大体上可把这种真菌视为专性寄生菌，如本试验中的锈菌和白粉菌。将采回的发病狗牙花锈菌和九里香白粉的新鲜病叶用曲利苯兰透明法进行处理，然后于显微镜下进行观察各个时期的病症表现（朱书生，2006）。具体步骤如下：（1）样品放入曲利苯兰-酒精乳酚油中沸水浴10min；（2）将样品再放入酒精乳酚油中沸水浴3min；（3）将样品置于饱和水合三氯乙醛溶液中脱色过夜；（4）24h后，将样品置于贮存液中，然后进行镜检观察。10 3结果与分析经过实验室组织分离、PDA培养基培养、纯化、玻片标本制作，并进行显微观察，以及分子生物学鉴定，共鉴定出由植物病原真菌引起的观赏植物病害的病原菌17种。下面分别就17种病原物引起的病害症状特点、病原菌及其形态特征等方面进行逐一的论述。3.1红花羊蹄甲叶枯病的症状描述及病原鉴定3.1.1危害症状红花羊蹄甲炭疽病主要危害羊蹄甲的叶片，可全年危害。发病初期，叶尖和叶缘出现轻微的褪绿斑，叶片中央有不规则形的褐色病斑，并逐步向叶片其他区域扩展。病害发展到后期，叶片形成大面积黑褐色病斑，并且病斑中央着生黑褐色小点，叶柄褪绿变黄。病斑常连接成片，严重时引起叶片脱落。图1羊蹄甲叶斑病发病症状A：羊蹄甲自然发病症状B：羊蹄甲离体接种发病症状3.1.2形态学鉴定在光学显微镜下观察，可看到羊蹄甲叶枯病病菌的分生孢子单孢，无色，椭圆形，分生孢子长为12.3~15.5μm，平均约为13.8μm；宽为5.3~7.5μm，平均约为6.5μm。（图2-B）。分生孢子盘黑色，丛生，无刚毛（图2-A）。分生孢子梗无色，具分隔，顶生分生孢子，孢子梗长度为17.3~35.8μm，平均为26.8μm，宽为2.8~4.0μm，平均为3.6μm。分生孢子的两端生出芽管，芽管顶端膨大，形成褐色、厚壁、球形的附着胞（图2-C、图2-D）。鉴定结果表明，该病原菌的培养及形态特征基本符合魏景超11 （1979）、邓叔群（1963）提出的关于胶孢炭疽的分类标准。因此初步认定该病原菌为胶孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）。图2羊蹄甲炭疽菌的形态学观察A：炭疽菌的分生孢子盘B：炭疽菌的分生孢子C、D：炭疽菌的附着孢3.1.3rDNA-ITS序列分析用ITS4/ITS5引物，对羊蹄甲炭疽病的rDNA的ITS区进行扩增，产生一个大小约564bp的DNA片段（图3）。序列经过手工校正和分析后，提交到GenBank中进行核苷酸的序列比对，通过BLAST搜索核酸数据库显示，羊蹄甲炭疽病菌株的ITS区序列与GenBank中已登录的胶孢炭疽菌C.gloeosporioides等多个菌株序列的同源性均在99%以上。因此，结合羊蹄甲叶枯病菌的形态学特征和ITS分析，将其鉴定为：子囊菌门（Ascomycota）、盘菌亚门（Pezizomycotina）、粪壳菌纲（Sordariomycetes）、粪壳菌亚纲（Sordariomycetidae）、小丛壳科（Glomerellaceae）、炭疽菌属（Colletotrichum）的胶孢炭疽菌（C.gloeosporioides）。12 图3ITS4/ITS5对和羊蹄甲炭疽病菌株的PCR扩增结果泳道1：羊蹄甲炭疽病菌株；2：分子量标记DL20003.2狗牙花锈病的症状描述及病原鉴定3.2.1危害症状狗牙花锈病主要危害狗牙花的叶片，气温升高则病状减轻。叶片染病后，叶片正面出现褪绿斑，病斑中央深褐色（图4-A）；叶片背面着生黄褐色到铁锈色的孢子堆（图4-B）。图4自然状态下狗牙花发病状态A：发病狗牙花叶片正面B：发病狗牙花叶片背面3.2.2形态学鉴定用曲利苯兰透明法处理狗牙花叶片后，在显微镜下观察。在叶片背面可以观察到13 深褐色椭圆形双细胞的冬孢子，浅褐色近圆形或不规则形，单孢的夏孢子（图5-A）。狗牙花锈病以冬孢子和夏孢子为害，在受害部位背面产生大量的孢子堆，冬孢子堆显微镜下为褐色，曲利苯兰不能将其染色；夏孢子颜色较浅。冬孢子堆和夏孢子堆周围的植物组织被严重侵染。在光学显微镜下观察，可看到冬孢子双胞，长度平均约为37.3μm，宽度平均约为24.7μm；椭圆形，深褐色；壁双层；表面有刺，刺长度平均约为1.8μm；有柄，柄长度平均约为31μm；基部发生膨大，膨大部分长度平均约为13.6μm（图5-B）。夏孢子单孢，浅褐色，近圆形，小于冬孢子；直径约为27.8μm，表面有微刺（图5-C），该病菌形态特征及危害寄主皆同庄剑云等（2012）描述相同，因此将该菌鉴定为担子菌门（Basidiomycota）、柄锈菌纲（Pucciniomycetes）、柄锈菌目（Pucciniales）、柄锈科（Pucciniaceae）、柄锈菌属（Puccinia）的恩格勒柄锈菌（P.engleriana）。图5狗牙花锈病的形态学鉴定A：曲利苯兰染色后狗牙花锈病的冬孢子堆和夏孢子堆B：狗牙花锈菌的冬孢子C：狗牙花锈菌的夏孢子3.2.3rDNA-ITS序列分析用ITS4/ITS5引物，对狗牙花的DNA的ITS区进行扩增，产生一个大小约672bp14 的DNA片段（图6）。序列经过手工校正和分析后，提交到GenBank中进行核苷酸的序列比对，通过BLAST搜索核酸数据库显示，同源性分析结果显示，狗牙花锈菌菌株未在GenBank检测到有同源性的病菌。因此无法根据其同源性序列将其分类。图6ITS4/ITS5对和狗牙花锈菌菌株的PCR扩增结果泳道1：狗牙花锈菌菌株；2：分子量标记DL20003.3桂花炭疽病的症状描述及病原鉴定3.3.1危害症状桂花炭疽病主要为害桂花的叶片，偶有为害叶柄、嫩枝、茎干，南方梅雨季节和北方雨季是病害高发期，广州地区一般以春末夏初和秋季多雨时发病较重。发病初期，叶片正面出现水渍状的褐色小斑（图7a、b），随后逐渐扩展为圆形或不规则的大型斑块，稍凹陷，病斑灰褐色，有时脆裂，边缘颜色较深（图7c、d）。后期病部出现黑色小粒点，严重时，几个病斑相连，全叶干枯面积可达1/3-1/2，甚至造成整叶干枯。abcd图7桂花炭疽病不同时期的自然发病症状a、b:桂花炭疽病初期发病症状；c、d:桂花炭疽病后期发病症状15 3.3.2形态学鉴定分离提纯到的6个菌株的形态特征较为相近，在PDA培养基上呈等径辐射生长，菌落圆形，菌落正面灰白色，背面橘黄色，绒毛状。约10d后，菌落表面可以形成橘红色的粘孢子团（图8a、b）。ab图8桂花炭疽菌菌落形态特征a:桂花炭疽菌菌落正面；b:桂花炭疽菌菌落背面在光学显微镜下观察，可看到桂花炭疽菌分生孢子单孢一般为长椭圆型或圆筒型，两端钝圆，大小为（11.0～17.5）μm×（3.8～6.0）μm（图9），平均约为14.9μm×5.0μm（n=30）。图9桂花炭疽菌分生孢子形态特征在清水中25℃培养24h，可见病菌的分生孢子萌发并产生附着孢。附着孢褐色，16 近圆形，边缘齐整（图10a、b）。ab图10桂花炭疽菌分生孢子附着孢形态特征鉴定结果表明，该病原菌的培养及形态特征基本符合魏景超（1979）、邓叔群（1963）提出的关于胶孢炭疽的分类标准。因此初步认定本实验中桂花炭疽病的病原菌为胶孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）。3.3.3rDNA-ITS序列分析用ITS4/TS5引物，对桂花的rDNA的ITS区进行扩增，产生一个大小约620bp的DNA片段（图11）。序列经过手工校正和分析后，提交到GenBank中进行核苷酸的序列比对，通过BLAST搜索核酸数据库（blast）显示，桂花炭疽菌菌株的ITS区序列与GenBank中已登录的胶孢炭疽菌（C.gloeosporioides）（GU353170）等多个菌株序列的同源性均在99%以上。根据病原菌的形态特征，以及ITS序列比较的结果，按照炭疽菌属种内菌株间的同源性，至少要在97%以上的原则，确定本实验桂花炭疽病的病原菌为子囊菌门（Ascomycota）、盘菌亚门（Pezizomycotina）、粪壳菌纲（Sordariomycetes）、粪壳菌亚纲（Sordariomycetidae）、小丛壳科（Glomerellaceae）、炭疽菌属（Colletotrichum）的胶孢炭疽菌（C.gloeosporioides）。17 图11ITS4/ITS5对桂花炭疽菌菌株的PCR扩增结果泳道1：分子量标记DL20002：桂花炭疽菌菌株3.4发财树叶枯病的症状描述及病原鉴定3.4.1危害症状发财树叶枯病主要为害发财树的叶片。初期产生圆形、黑色的小斑点，随后斑点逐渐扩大，近圆形或不规则形，内部产生灰色如日灼症状的病斑，稍凹陷，边缘黑褐色（图12a、b）。后期在病斑上产生一些黑色小粒点，病斑逐渐向叶基部延伸，严重时，整个叶片变为褐色至灰褐色，叶片萎凋、干枯。图12发财树叶枯病初期的自然发病症状3.4.2形态学鉴定分离提纯到的6个菌株的形态特征极为相近，在PDA培养基上呈等径辐射生长，菌落圆形，最初菌落为灰白色，后变为深色，青褐色，背面深褐色，绒毛状，菌落有明显轮纹（图13a、b）。18 图13发财树病原菌菌落形态特征a:发财树链格孢菌菌落正面；b:发财树链格孢菌菌落背面发财树病原菌分生孢子单孢一般为卵型、倒棒状或倒梨型，脐部十分明显，淡褐或深褐色，孢子具有横隔，表面光滑，多数具喙（图14a、b、c）。abc图14发财树病原菌分生孢子形态特征鉴定结果表明，该病原菌的培养及形态特征基本符合张天宇（2003）提出的关于链格孢的分类标准。因此初步认定该病原菌为链格孢（Alternariasp.）。3.4.3rDNA-ITS序列分析用ITS4/TS5引物，对发财树的rDNA的ITS区进行扩增，产生一个大小约550bp的DNA片段（图15）。序列经过手工校正和分析后，提交到GenBank中进行核苷酸的序列比对，通过BLAST搜索核酸数据库（blast）显示，发财树链格孢菌菌株的ITS区序列与GenBank中已登录的链格孢属（Alternaria）真菌多个菌株序列的同源性均在99%以上。根据病原菌的形态特征，以及ITS序列比较的结果，确定发财树叶枯病的病原菌为子囊菌门（Ascomycota）、座囊菌纲（Dothideomycetes）、假球壳目（Pleosporales）、19 假球壳科（Pleosporaceae）、链格孢属（Alternaria）真菌。图15ITS4/ITS5对发财树链格孢菌菌株的PCR扩增结果泳道1：分子量标记DL20002：发财树链格孢菌菌株3.5九里香白粉病的症状描述及病原鉴定3.5.1危害症状九里香白粉病危害叶片、叶柄和嫩枝上，主要发生在叶片正面。发病初期先形成近圆形的白霉斑，然后逐步蔓延至整个叶片；在嫩枝上发病时，随着病情的加重，整个叶片逐步萎黄、皱缩、卷曲甚至凋谢（如图16）。图16九里香白粉病发病症状把发病的九里香叶片进行脱色染色后在光学显微镜下可观察到病原物的菌丝和分生孢子（如图17），病原物的菌丝和分生孢子均被染成蓝色，其形态特征与没有进行脱色染色所观察到的菌丝和孢子相同。20 图17九里香白粉病自然发病状态下病原菌的症状a：分生孢子；b：病原菌菌丝3.5.2形态学鉴定在光学显微镜下观察，可看到病原菌能产生分生孢子和分生孢子梗，分生孢子椭圆形到圆柱形；分生孢子长29.36-43.76um，平均长（38.42±2.32um），宽14.22-22.48um，平均宽（19.24±2.41um）；分生孢子梗直立不分枝，近圆柱形，48.57-78.35um长，平均大小为（67.43±9.81um）；圆柱形足细胞长27.65-46.53um，平均大小为（40.8±3.11um）（如图18）。图18九里香白粉菌病原菌的孢子形态特征a：分生孢子；b：分生孢子梗；c：足细胞；d：萌发的孢子3.5.3rDNA-ITS序列分析用ITS4/TS5作为引物，对进行克隆之后的白粉菌病原菌的rDNA的ITS区进行21 扩增，产生一个大小约580bp的DNA片段（如图19）。序列经过手工校正和分析后，提交到GenBank中进行核苷酸的序列比对，通过BLAST搜索核酸数据库（blast）显示，白粉菌病原菌的ITS区序列与GenBank中已登录的Erysiphequercicola等多个序列的同源性均在99%以上。病原菌的形态特征与分子序列的同源性均与中国检验检疫科学研究院所报道的E.quercicola一致，因此可以鉴定九里香白粉病的病原菌是子囊菌门（Ascomycota），锤舌菌纲(Leotiomycetes)，白粉菌目（Erysiphales），白粉菌科（Erysiphaceae），白粉菌属（Erysiphe）的E.quercicola。图19ITS4/ITS5对白粉菌病原菌的PCR扩增结果泳道a：白粉菌病原菌1号条带；b：白粉菌病原菌2号条带；m：分子量标记DL20003.6阴香叶斑病的症状描述及病原鉴定3.6.1危害症状阴香叶斑病主要发生于叶片上，感病叶片初期呈赤褐色，感病部位四周有宽黄色环晕的小点，扩大为圆形或不规则的病斑，黄褐色，最后中央为灰白色，病健交界处显深褐色，发病严重时病斑周围发黄枯烂（如图20）。22 图20阴香叶斑病的发病症状a：阴香自然状态发病症状b：阴香离体接种发病症状3.6.2形态学鉴定在光学显微镜下观察，可看到病原菌能产生分生孢子和附着胞。分生孢子圆柱形，单孢，无色，长15.58-29.37μm，平均长（17.48±3.55μm），宽3.56-10.24μm，平均宽（5.89±3.22μm）；未发现孢子囊，分生孢子盘圆形或近圆形，黑褐色；分生孢子梗无色，其上着生单个孢子，称为附着孢；菌落呈圆形，地毯状，无褶皱，气生菌丝生长密集，初期白色，后期菌落的正面颜色变灰黑色，背面可见近橙色（分生孢子团），也能见到黑色圆点散布其中（如图21）。鉴定结果表明，该病原菌的培养及形态特征基本符合魏景超（1979）、邓叔群（1963）提出的关于胶孢炭疽的分类标准。因此初步认定该病原菌为胶孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）。图21阴香叶斑病病原菌的形态特征a：附着孢b：分生孢子盘c：菌落正面d:菌落背面3.6.3rDNA-ITS序列分析利用通用引物ITS4/ITS5对病原菌的rDNA的ITS区进行扩增，产生一个大小约610bp的DNA片段（图22）。序列经过手工校正和分析后，提交到GenBank中进行核苷酸的序列比对，通过BLAST搜索核酸数据库（blast）显示，阴香叶斑病病原23 菌的ITS区序列与GenBank中已登录的胶孢炭疽菌等多个序列的同源性均在99%以上。病原菌的形态特征与分子序列的同源性均与黄金风等（2012年）在西南农业学报刊登的报告中描述的较为一致，因此可以鉴定阴香叶斑病的病原菌是子囊菌门（Ascomycota）、盘菌亚门（Pezizomycotina）、粪壳菌纲（Sordariomycetes）、粪壳菌亚纲（Sordariomycetidae）、小丛壳科（Glomerellaceae）、炭疽菌属（Colletotrichum）的胶孢炭疽菌（C.gloeosporioides）。图22ITS4/ITS5对阴香叶斑病病原菌的PCR扩增结果泳道a：阴香叶斑病病原菌条带；m：分子量标记DL20003.7金钗石斛疫病的症状描述及病原鉴定3.7.1危害症状金钗石斛由茎基部开始腐烂，扩散开，而后病部软化，病斑向下扩展造成根系死亡，也可见病斑向上沿茎扩展至叶片。图23金钗石斛疫病发病症状24 3.7.2形态学鉴定金钗石斛疫病病菌在PDA培养基上，菌丝体白色絮状，菌落边缘不规则，呈轮纹花状。在光学显微镜下观察，可看到菌丝无色，宽4~12μm，不具隔膜，少数成熟菌丝具隔膜，孢子囊多为柠檬形或宽卵形，少数球形及无规则，大小变化较大，通常为24~54μm×18~30μm，具明显乳突，多为1个，极少具2个乳突，脱落孢子囊具短柄。游动孢子大多经孢囊口释放，少数经泡囊放出。休止孢球形，厚垣孢子球形，顶生或间生，具明显壁。无卵孢子。鉴定结果表明，该病原菌的培养及形态特征基本符合郑小波（1997）、余永年（1998）提出的关于烟草疫霉的分类标准。因此初步认定该病原菌为烟草疫霉（Phytophthoranicotianae）。图24金钗石斛疫病病原菌的形态特征3.7.3rDNA-ITS序列分析以疫霉菌株DNA为模板，通用引物ITS4/ITS5扩增得到1条898bp的清晰条带（图25），将此PCR产物测序后提交到GenBank中，经BLAST比对后发现，病原真菌的rDNA-ITS序列与Phytophthoranicotianae的序列相似度高达97%。结合形态学与分子生物学鉴定，确定金钗石斛疫病的致病菌为卵菌门（Oomycota）、卵菌纲（Oomycetes）、腐霉目（Pythiales）、腐霉科（Pythiaceae）、疫霉属（Phytophthora）25 的烟草疫霉（P.nicotianae）。图25ITS4/ITS5对金钗石斛疫病病原菌的PCR扩增结果泳道1：分子量标记DL10002：金钗石斛疫病菌株3.8麻竹叶锈病的症状描述及病原鉴定3.8.1危害症状可侵染成竹、幼苗，发病初期在病叶上密生许多黄色针点状斑点，随着病害的逐渐加重，叶背上生出很多锈褐色粉状物（即病菌的夏孢子堆），严重时病叶枯黄，最后脱落。图26麻竹叶锈病的发病症状3.8.2形态学鉴定夏孢子堆的特征与柄锈菌相似，淡黄色至褐色，表面有细刺，卵圆形或近圆形、倒卵形、宽倒卵形，大小为20~36μm×25~30μm，壁上密被小刺，夏孢子堆上侧丝较26 多，观察期间未见该菌冬孢子的产生，只观察到夏孢子的存在。结合文献对夏孢子大小和症状的描述，鉴定为柄锈菌属（Puccinia）。图27麻竹叶锈病病原菌的形态特征3.8.3rDNA-ITS序列分析用ITS4/ITS5引物，对竹叶锈菌的DNA的ITS区进行扩增，产生一个大小约998bp的DNA片段（图28）。序列经过手工校正和分析后，提交到GenBank中进行核苷酸的序列比对，通过BLAST搜索核酸数据库显示，同源性分析结果显示，竹叶锈菌菌株在GenBank检测到有同源性96%。因此，麻竹叶锈病的病原菌鉴定为担子菌门（Basidiomycota）、柄锈菌纲（pucciniomycetes）、柄锈菌目（Pucciniales）、柄锈科（Pucciniaceae）、柄锈菌属（Puccinia）的真菌。图28ITS4/ITS5对和竹叶锈菌菌株的PCR扩增结果泳道1：分子量标记DL2000；2：竹叶锈菌菌株27 3.9朴树白粉病的症状描述及病原鉴定3.9.1危害症状朴树白粉病是朴树常见病害之一，叶片上可见白色粉状物（病原菌的菌丝体，分生孢子）和黑色球形颗粒（闭囊壳）。图29朴树白粉病的发病症状3.9.2形态学鉴定菌丝体叶背生，存留，一般形成明显及较厚的斑片，较少形成不明显而薄的斑片，最后往往覆盖全叶；分生孢子梗细长，具2-4个隔膜，宽约5.1-8.1μm，长约96-170μm，基部旋扭2-4周；分生孢子单生，长椭圆形、倒棍棒-椭圆形，顶端钝尖或钝圆，大小40.6~63.5μm×12.7~17.8μm。图30朴树白粉病病原菌的形态特征3.9.3rDNA-ITS序列分析用ITS4/ITS5引物，对进行克隆之后的朴树白粉菌的DNA的ITS区进行扩增，28 产生一个大小约1000bp的DNA片段。序列经过手工校正和分析后，提交到GenBank中进行核苷酸的序列比对，通过BLAST搜索核酸数据库显示，同源性分析结果显示，朴树白粉菌菌株在GenBank检测到Pleochaetashiraiana有同源性99%，结合形态确定该病原菌为子囊菌亚门（Ascomycotion）、不整囊菌纲（Plectomycetes）、白粉菌目（Erysiphales）、白粉菌科（Erysiphaceae）的三孢半内生钩丝壳（Pleochaetashiraiana）。图31ITS4/ITS5对朴树白粉病病原菌的PCR扩增结果泳道1：分子量标记DL2000；2：朴树白粉菌株3.10夏威夷椰子叶枯病的症状描述及病原鉴定3.10.1危害症状从叶缘、叶尖侵染发生，病斑由小到大不规则状，红褐色至灰褐色，病斑连片成大枯斑，干枯面积达叶片的1/3-1/2，病斑边缘可见黄色晕圈。后期在病斑上产生一些黑色小粒点。图32夏威夷椰子叶枯病的发病症状29 3.10.2形态学鉴定在PDA培养基上，菌落起初为灰白色，逐渐变为灰黑色。菌丝灰色至黑色，生长迅速，扩散快。在光学显微镜下观察，可看到分生孢子梗单生或簇生、直立、直或膝状弯曲，淡褐色，大小为54~91μm×4.5~8.5μm，分生孢子单生，倒棒状或卵形，淡褐色，表面光滑或者有小刺，具有隔膜3~7个，多数具喙，大小变化较大，通常为19.5~39.5μm×3.5~5.0μm。鉴定结果表明，该病原菌的培养及形态特征基本符合张天宇（2003）提出的关于链格孢的分类标准。因此初步认定该病原菌为链格孢（Alternariasp.）。图33夏威夷椰子叶枯病病原菌的形态特征3.10.3rDNA-ITS序列分析用ITS4/ITS5引物，对克隆后的夏威夷椰子的rDNA的ITS区进行扩增，产生一个大小约1044bp的DNA片段（图34）。序列经过手工校正和分析后，提交到GenBank中进行核苷酸的序列比对，通过BLAST搜索核酸数据库显示，夏威夷椰子链格孢菌菌株的ITS区序列与GenBank中已登录的链格孢属（Alternaria）多个菌株序列的同源性均为100%。因此，夏威夷椰子叶枯病的病原菌鉴定为病原菌属于子囊菌门（Ascomycota）、30 座囊菌纲（Dothideomycetes）、假球壳目（Pleosporales）、假球壳科（Pleosporaceae）、链格孢属（Alternaria）的真菌。图34ITS4/ITS5对夏威夷椰子链格孢菌菌株的PCR扩增结果泳道1：分子量标记DL20002：夏威夷椰子链格孢菌菌株3.11铁皮石斛炭疽病的症状描述及病原鉴定3.11.1危害症状该病原菌为害叶缘和叶尖，严重时，使大半叶片枯黑死亡。发病初期在叶片上呈现圆形、椭圆形红褐色小斑点，后期扩展成深褐色圆形病斑，中央则由灰褐色转为灰白色，而边缘则呈紫褐色或暗绿色，有时边缘有黄晕，最后病斑转为黑褐色，并产生轮纹状排列的小黑点。图35铁皮石斛炭疽病的发病症状31 3.11.2形态学鉴定菌株在PDA培养基上菌落呈圆形生长，气生菌丝较发达，初期为白色，培养5~6d后逐渐变为浅灰色至灰黑色，后期产生橘红色分生孢子团；在光学显微镜下观察，可看到分生孢子梗无色至褐色，具分隔，分生孢子无色，单胞，棍棒形、圆柱形或椭圆形，多数两端钝圆，内含多个油滴，大小为（15.0~25.0）μm×（4.0~7.5）μm。萌发时产生1~2根芽管。鉴定结果表明，该病原菌的培养及形态特征基本符合魏景超（1979）、邓叔群（1963）提出的关于胶孢炭疽的分类标准。因此初步认定该病原菌为胶孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）。图36铁皮石斛炭疽病病原菌的形态特征3.11.3rDNA-ITS序列分析用ITS4/ITS5引物，对铁皮石斛炭疽病的rDNA的ITS区进行扩增，产生一个大小约554bp的DNA片段（图37）。序列经过手工校正和分析后，提交到GenBank中进行核苷酸的序列比对，通过BLAST搜索核酸数据库显示，铁皮石斛炭疽病菌株的ITS区序列与GenBank中已登录的胶孢炭疽菌C.gloeosporioides等多个菌株序列的同源性均在99%以上。因此，铁皮石斛炭疽病的病原菌鉴定为为子囊菌门（Ascomycota）、粪壳菌纲32 （Sordariomycetes）、小丛壳科（Glomerellaceae）、炭疽菌属（Colletotrichum）的胶孢炭疽菌（C.gloeosporioides）。图37ITS4/ITS5对铁皮石斛炭疽菌株的PCR扩增结果泳道1：分子量标记DL20002：铁皮石斛炭疽菌菌株3.12金钗石斛炭疽病的症状描述及病原鉴定3.12.1危害症状该病原菌危害较疫病来说相对较轻，症状类似，也是从茎的基部或者根部开始发病，而后病部软化，蔓延至其他部位。不同的是病部有白色霉层。图38金钗石斛炭疽病的发病症状3.12.2形态学鉴定从图中可以看出，金钗石斛炭疽病菌落在PDA培养基上生长均匀，菌落圆形，菌丝致密较厚，向上丛生呈毛毡状；边缘平整较不明显，背面略浅黄色。分生孢子梗单生、无色，圆筒形或棍棒形，菌丝隔较多。刚毛褐色，长条形。分生孢子单孢、无33 色，透明光滑无隔膜，圆柱形两头钝圆、直圆柱形或椭圆形，大小12.0~20.5μm×6.0~8.5μm。萌发时产生1~2根芽管。根据培养形状及形态特征初步鉴定该菌为博宁炭疽菌。图39金钗石斛炭疽病病原菌的形态特征3.12.3rDNA-ITS序列分析以炭疽菌的DNA进行PCR扩增得到1条593bp的清晰条带（图40），将扩增产物送去测序后得到序列，进行Blast比对。结果显示，炭疽病原菌的rDNA-ITS序列与Colletotrichumboninense的序列相似度达99%，结合形态鉴定，确定该致病菌为子囊菌门（Ascomycota）、粪壳菌纲（Sordariomycetes）、小丛壳科（Glomerellaceae）、炭疽菌属（Colletotrichum）的博宁炭疽菌（C.boninense）。34 图40ITS4/ITS5对金钗石斛炭疽菌株的PCR扩增结果泳道1：分子量标记DL10002：金钗石斛炭疽菌菌株3.13榕树叶斑病的症状描述及病原鉴定3.13.1危害症状叶片上初生黑褐色小圆斑，后扩大为黑褐色不规则病斑、导致叶片腐烂，天气潮湿时病部有灰白色霉层。图41榕树叶斑病的发病症状3.13.2形态学鉴定菌株在PDA培养基上菌落呈圆形生长，气生菌丝较发达，初期为白色，培养5—6d后逐渐变为浅褐色至灰黑色，后期产生有明显的小黑点。不易产生分生孢子，分生孢子圆柱形，两端钝圆，有的略弯，单胞，无色，大小为8.5~19.5μm×4.5~5.5μm，萌发时产生1~2根芽管。鉴定结果表明，该病原菌的培养及形态特征基本符合魏景超（1979）、邓叔群（1963）提出的关于胶孢炭疽的分类标准。因此初步认定该病原菌35 为胶孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）。图42榕树炭疽病病原菌的形态特征3.13.3rDNA-ITS序列分析用ITS4/ITS5引物，对榕树炭疽病的rDNA的ITS区进行扩增，产生一个大小约570bp的DNA片段（图43）。序列经过手工校正和分析后，提交到GenBank中进行核苷酸的序列比对，通过BLAST搜索核酸数据库显示，榕树炭疽病病菌株的ITS区序列与GenBank中已登录的胶孢炭疽菌C.gloeosporioides等多个菌株序列的同源性均在99%以上。因此，结合榕树炭疽病病菌的形态学特征和ITS分析，将其鉴定为子囊菌门（Ascomycota）、粪壳菌纲（Sordariomycetes）、小丛壳科（Glomerellaceae）、炭疽菌属（Colletotrichum）的胶孢炭疽菌（C.gloeosporioides）。图43ITS4/ITS5对榕树叶斑病菌株的PCR扩增结果泳道1：分子量标记DL20002：榕树叶斑病菌菌株36 3.14龟背竹叶斑病的症状描述及病原鉴定3.14.1危害症状多从叶边缘伤损处开始发病。受害后，病斑初为黑色斑点，扩大后呈椭圆形或不规则状，病部周边为淡黄色。边缘黑褐色内灰褐色。图44龟背竹叶斑病的发病症状3.14.2形态学鉴定在PDA上产生灰白色气生菌丝，而后逐渐形成褐色至暗褐色菌落。培养6～10d后，菌落中央多处出现褐色点状物导致了菌落后期形成的褐色。菌丝本色或褐色、有隔，菌丝柄为透明至淡黄色。因其在PDA上较难产孢，未观察到其孢子形态，尚未从形态学方面得到验证。图45龟背竹叶斑病病原菌的形态特征37 3.14.3rDNA-ITS序列分析用ITS4/ITS5引物，对龟背竹叶斑病的rDNA的ITS区进行扩增，产生一个大小约529bp的DNA片段（图46）。序列经过手工校正和分析后，提交到GenBank中进行核苷酸的序列比对，通过BLAST搜索核酸数据库显示，龟背竹叶斑病病菌株的ITS区序列与GenBank中已登录的茎点霉属Phoma多个菌株序列的同源性均为99%，因此可以基本认定该病原菌为子囊菌门（Ascomycota）、座囊菌纲（Dothideomycetes）、假球壳目（Agaricales）、茎点霉属（Phoma）的真菌。图46ITS4/ITS5对龟背竹叶斑病菌株的PCR扩增结果泳道1：分子量标记DL20002：龟背竹叶斑病菌菌株3.15蜘蛛兰叶斑病的症状描述及病原鉴定3.15.1危害症状病斑常常始发于叶上半部分，初期是红褐色的小斑点，与健康部分分界明显，接着扩大成圆形、椭圆形或不规则病斑；继续扩大后病斑中央呈干枯状，外部呈褐色或红褐色，病斑边缘有黄色晕圈；后期病斑连成片，呈褐色或黑色，最终导致叶片病部枯死或整张叶片坏死，病叶脱落。38 图47蜘蛛兰叶斑病的田间症状3.15.2病原物尖孢镰刀菌的鉴定（1）形态学鉴定在PDA上的气生菌丝生长茂盛，菌落初为白色，然后中央和背面变为浅紫色。显微镜下观察，粉红孢子堆即为小型及大型的分生孢子。小型分生孢子数量多，0～1分隔，长柱形，椭圆形或卵圆形，大小为4.5~15μm×2.0~4.0μm。大型分生孢子数量少，2~5分隔，多为3分隔，壁薄，镰刀形，向两端比较均匀地逐渐收缩变尖，顶细胞稍呈钩状，基胞足跟明显。3分隔的孢子大小为32.5~46μm×3.2~4.6μm。鉴定结果表明，该病原菌的培养及形态特征基本符合布斯（1998）、王拱辰等（1996）提出的关于尖孢镰刀菌的分类标准。因此初步认定该病原菌为尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）。图48蜘蛛兰叶斑病病原菌的形态特征39 （2）rDNA-ITS序列分析用ITS4/ITS1引物，对蜘蛛兰叶斑病的rDNA的ITS区进行扩增，产生一个大小约519bp的DNA片段（图49）。序列经过手工校正和分析后，提交到GenBank中进行核苷酸的序列比对，通过BLAST搜索核酸数据库显示，蜘蛛兰叶斑病病菌株的ITS区序列与GenBank中已登录的尖孢镰刀菌Fusariumoxysporum多个菌株序列的同源性均为99%，因此可以基本认定该病原菌为子囊菌门（Ascomycota）、粪壳菌纲（Sordariomycetes）、肉座菌目（Hypocreales）、赤壳科（Nectriaceae）、镰刀菌属（Fusarium）的尖孢镰刀菌（F.oxysporum）。图49ITS4/ITS1对蜘蛛兰叶斑病菌株的PCR扩增结果泳道1：分子量标记DL10002：蜘蛛兰叶斑病尖孢镰刀菌菌株3.15.3病原物茎点霉的鉴定（1）形态学鉴定在PDA上，气生菌丝生长茂盛，菌落圆形，初为白色，然后中央和背面变为褐色，且在且在菌丝底部靠近培养基的部分形成黏状层。菌丝褐色、有隔，因其在PDA上较难产孢，未观察到其孢子形态，尚未从形态学方面得到验证。40 图50蜘蛛兰叶斑病病原菌的形态特征（2）rDNA-ITS序列分析用ITS4/ITS1引物，对克隆后的蜘蛛兰叶斑病的rDNA的ITS区进行扩增，产生一个大小约1000bp的DNA片段（图51）。序列经过手工校正和分析后，提交到GenBank中进行核苷酸的序列比对，通过BLAST搜索核酸数据库显示，蜘蛛兰叶斑病病菌株的ITS区序列与GenBank中已登录的茎点霉属Phoma多个菌株序列的同源性均为99%，因此可以基本认定该病原菌为子囊菌门（Ascomycota）、座囊菌纲（Dothideomycetes）、假球壳目（Agaricales）、茎点霉属（Phoma）的真菌。图51ITS4/ITS1对蜘蛛兰叶斑病菌株的PCR扩增结果泳道1：分子量标记DL20002：蜘蛛兰叶斑病茎点霉菌株41 3.15.4病原物伞菌科的鉴定（1）形态学鉴定在PDA菌落上气生菌丝非常茂盛，菌落呈现白色，疏松状，绒状。本研究的病原菌经过PDA的培养，并未产生孢子。气生菌丝较长较细，有分隔。图52蜘蛛兰叶斑病病原菌的形态特征（2）rDNA-ITS序列分析用ITS4/ITS1引物，对克隆后的蜘蛛兰叶斑病的rDNA的ITS区进行扩增，产生一个大小约1000bp的DNA片段（图53）。序列经过手工校正和分析后，提交到GenBank中进行核苷酸的序列比对，通过BLAST搜索核酸数据库显示，蜘蛛兰叶斑病病菌株的ITS区序列与GenBank中已登录的伞菌科Agaricaceae多个菌株序列的同源性均为99%，因此可以基本认定该病原菌为担子菌门（Basidiomycota）、伞菌纲（Agaricomycetes）、伞菌目（Agaricales）、伞菌科（Agaricaceae）的真菌。由于过去鲜见伞菌科真菌引起植物病害的报道，所以，本研究经过柯赫氏法则验证，证实该伞菌科真菌确实是引起蜘蛛兰叶斑病的病原菌，但因其在PDA上较难产孢，未观察到其孢子形态，尚未从形态学方面得到验证。42 图53ITS4/ITS1对蜘蛛兰叶斑病菌株的PCR扩增结果泳道1：分子量标记DL20002：蜘蛛兰叶斑病伞菌科菌株43 4结论与讨论4.1红花羊蹄甲叶枯病及其病原菌红花羊蹄甲花期长，花繁叶茂，可植于庭院或作园林风景树，也可作行道树，为华南常见花木。关于红花羊蹄甲的病害鉴定研究较少，刘晓妹等（2013）通过形态学和分子生物学鉴定方法确定枝状枝孢（Cladosporiumcladosporioides）能引起海南儋州的红花羊蹄甲叶霉病；雷增普（2005）简要报道了红花羊蹄甲的灰斑病（PhyllostictabauhiniaeCooke）及褐斑病（Pseudocercosporabauhiniicola）；Padhya等（1965）报道了一种寄主为总状花羊蹄甲（BauhiniaracemosaLam.）的细菌性叶部病害。本试验当中通过形态学和分子生物学结合的方法鉴定红花羊蹄甲叶枯病的病原菌为胶孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides），属于国内首次报道。4.2狗牙花锈病及其病原菌狗牙花栽培于中国南部各省区，叶可药用，是广东常见的园林植物（崔大方等，2009）。该病原菌在世界范围内首次记载是1904年Henning在非洲东南部的布隆迪首都布琼布拉的夹竹桃科植物CarvalhoamacrophyllaK.Schum.上发现。在亚洲首次被记录是在印度的狗牙花TabernaemontanaheyneanaWall.和T.coronaria（Sydowetal，1912）以及在菲律宾的狗牙花T.coronaria和T.pandacaquiLam.（Sydow，1910）以及新几内亚岛的狗牙花Tabernaemontanasp.（Cummins，1941）。庄剑云等（2012）在我国云南海拔700米处采集了的狗牙花锈菌的病害标本，并对其夏孢子、冬孢子的形态进行了观察，鉴定出该菌为恩格勒柄锈菌（Pucciniaengleriana）。对于狗牙花病害的研究，国内报道过由胶孢炭疽菌引起的叶枯病（柳岸峰等，2004）、葡萄孢属真菌引起的狗牙花灰霉病（吴小瑶，2015）。在广东尚未见到狗牙花锈病的报道，本试验采集了广州地区的狗牙花锈菌的夏孢子、冬孢子，由于其ITS序列的同源性搜索，未能在GenBank数据库中找到同源序列，故无法用分子生物学方法将其分类。因此，本试验根据该菌的形态特征，鉴定出狗牙花锈病的病原菌为柄锈菌科、柄锈菌属的恩格勒柄锈菌（P.engleriana），与庄剑云等（2012）的鉴定出的病原菌是一致的。4.3桂花炭疽病及其病原菌桂花是我国传统的十大观赏名花之一,其具有重要的食用和药用价值。在我国,桂花被广泛的用于道路和庭院等地方的绿化,桂花叶部病害一年四季都很常见。44 李延浩（2010）报道了河南开封的桂花炭疽病，并用形态学和分子生物学方法将病原菌鉴定为胶孢炭疽菌（C.gloeosporioides）；贲海燕（2008）报道了用形态学和分子生物学方法鉴定北京市桂花叶斑病的病原菌为芒果球座菌（Guignardiamangiferae）、木犀拟茎点霉（PhomopsisosmanthiDzhalagonkiya）、葡萄座腔菌（Botryosphaeriadothidea）、木犀叶点霉（PhyllostictaosmanthiTassi）；卢伟（2013）用形态学和分子生物学方法鉴定河南洛阳桂花叶斑病的病原菌为葡萄座腔菌（B.dothidea）；广西农科院微生物研究所的学者报道了南宁桂花叶斑病的病原为葡萄座腔菌（B.dothidea）（Lingetal.,2010）；张振等（2009）采用分子生物学方法鉴定了陕西杨凌和略阳地区的桂花炭疽病病原菌是胶孢炭疽菌（C.gloeosporioides）；王丽霞（2012）采用形态学与分子生物学相结合的方法鉴定了广州市桂花炭疽病病原菌是胶孢炭疽菌（C.gloeosporioides）；张中义等（1987）调查根据形态学鉴定云南地区的桂花叶部病害病原菌为木犀叶点霉（P.osmanthiTassi）盘多毛孢属（Pestalotiasp.）盾壳霉属（Coniothyriumsp.）壳二孢属（Ascochytaspp.）；刘娜等（2011）鉴定桂花叶片病原真菌,确定胶孢炭疽菌（C.gloeosporioides）、细丽拟盘多毛孢（Pestalotiopsisgracilis）和细极链格孢（Alternariatenuissima）三者为病原物；McRitchie（1997）确定胶胞炭疽病菌能引起桂花炭疽病；容汉诠等（1987）初步鉴定出银川地区桂花病害的病原菌为链格孢（Aternariasp.）灰霉菌（Botrytissp.）以及炭疽菌（Colletotrichumsp.）；林志伟（2006）通过形态初步鉴定厦门桂花的致病菌为木犀生尾孢菌（Cercosporaosmanthicola）、胶孢炭疽菌（C.gloeosporioides）和叶点霉（Phyllostictaosmanthicola）。本试验通过形态学和分子生物学结合的方法鉴定出桂花炭疽病的病原菌为胶孢炭疽菌（C.gloeosporioides），与李延浩、张振等、林志伟鉴定出的桂花炭疽病病原菌是一致的。4.4发财树叶枯病及其病原菌发财树又称马拉巴栗，属木棉科多年生乔木，曾被联合国环保组织评为世界十大室内观赏花木之一（俞仲辂等，2001）。有关发财树病原真菌的报道很多，其中习平根等（2000）鉴定了发财树的8种病原真菌：大果拟茎点霉、榴莲拟茎点霉、可可球二孢、胶孢炭疽、细丽拟盘多毛孢、粉红聚端孢、新月弯孢霉、和细极链格孢，其中榴莲拟茎点霉引起的叶斑病和可可球二孢引起的茎枯病在生产上危害较重；李琳等（2011）报道了广东由棕榈疫霉（Phytophthorapalmivora）引起的发财树疫病；林石明等（2012）报道了台湾地区有45 害木层孔菌（Phellinusnixius）引起的发财树褐根病；陈育新等（2003）鉴定了在云南采集的发财树叶斑病的致病菌瓜栗拟盘多孢（Pestalotiopsispachirae）；Ann等（2002）报道了台湾地区的发财树根褐腐病；尚巧霞等（2004）鉴定了发财树茎基腐烂病的致病菌为两种镰刀菌属的真菌Fusariumudum和Fusariumsolani；章桂明等（1992）报道了毛色二孢属（Lasiodiplodiasp.）真菌引起发财树腐烂病；谭志琼等（2009）报道华丽腐霉（PythiumsplendensBraun）是海南省发财树茎基腐烂病的致病菌。习平根等（2000）对广州地区发财树链格孢的病原菌的鉴定当中，采用形态学的常规方法，参考有关文献进行种的鉴定，该研究弄清了细极链格孢危害发财树叶片的发病症状以及描述了该菌的显微形态，并鉴定到了种一级。本试验当中仅鉴定到链格孢属一级，本试验鉴定方法的改进在于除了常规形态学鉴定外，采用了分子生物学方法，鉴定结果更为客观，并拍摄了链格孢菌落形态及其分生孢子的显微图像。本试验通过形态学和分子生物学结合的方法鉴定出发财树叶枯病的病原菌为链格孢（Alternariasp.），与习平根等鉴定出的病原菌是一致的。4.5九里香白粉病及其病原菌九里香属常绿灌木，株姿优美，枝叶秀丽，花香浓郁，我国南部地区多用作围篱材料，或作花圃及宾馆的点缀品，亦作盆景材料。对九里香病害的研究，国内报道很少，刘先宝等（2013）报道过海南的白粉菌Erysiphequercicola侵染九里香的研究，对此白粉病菌的rDNA-ITS序列进行扩增和测序，与GenBank上公布的序列进行同源性比对，进行分类，并且发现该白粉菌还会侵染橡胶树、马占相思和红木。此外,E.quercicola是一种比较少见的白粉菌属的病菌，国内的报道很少，台湾地区的Kirschner等（2014）发现了该白粉病菌的新寄主番樟和月橘。国际上首次有关于E.quercicola的报道是在2012年，巴西报道了E.quercicola侵染凤凰木（Dallagnoletal.，2012）；韩国的Lee（2015）首次报道了该白粉菌的新寄主橡树。本实验发现的九里香白粉病是一种少见的白粉病病害，研究其病原菌的形态特征及作用机制，可对有效预防白粉菌提供一套科学的理论依据。本试验通过形态学和分子生物学结合的方法鉴定出九里香白粉病的病原菌为E.quercicola，与刘先宝等鉴定出的病原菌是一致的。4.6阴香叶斑病及其病原菌阴香树冠伞形或近圆球形，四季常青，株态优美，清香自然，近年来作为庭荫树、46 行道树、风景林而遍布城乡。阴香叶斑病的报道非常少，刘秀娟（1987）简要报道了在广西南宁的阴香炭疽病病原菌为胶孢炭疽菌（C.gloeosporioides）；揭育泽等（2015）初步报道了广东省阴香叶斑病的发生，并未对其病原菌进行鉴定；Yuelian（2014）报道了用形态学和分子生物学方法鉴定导致广东省阴香叶斑病的病原菌为小蓟叶点霉（Phyllostictacirsii）和樟生拟茎点霉（Phomopsiscinnamomicola）。本试验当中通过形态学和分子生物学结合的方法鉴定阴香叶斑病的病原菌为胶孢炭疽菌（C.gloeosporioides），与刘秀娟的鉴定结果是一致的。4.7金钗石斛疫病及其病原菌金钗石斛有非常高的药用价值，也可做盆栽观赏。引起金钗石斛疫病的病原菌烟草疫霉（Phytophthoranicotianae）、引起金钗石斛炭疽病的博宁炭疽菌（C.boninense）以及引起铁皮石斛炭疽病的胶孢炭疽菌（C.gloeosporioides）在国内还没有相关分类与鉴定的研究报道。其中，本试验的金钗石斛疫病与金钗石斛炭疽病症状类似、但疫病的危害较重，有可能是两种病原菌单独或共同引起的。与李静等（2008）的研究参照讨论，金钗石斛与铁皮石斛同为石斛属植物，综合结论表明烟草疫霉菌均可危害以上2种石斛属植物，为石斛属植物的病害防治提供了进一步的研究参考。本试验与李静等（2008）的试验均采用了形态学与分子生物学相结合的鉴定方法，李静还采用了交配型的观察分析。4.8麻竹叶锈病及其病原菌麻竹是中国南方栽培最广的竹种，笋味甜美，竿亦供建筑和篾用，庭园栽植，观赏价值也高，竹类的叶锈病，由于该病没有造成明显直接的经济损失，在生产中常被忽视，有关竹叶锈菌病害的文献很多，MohananC（1997）报道过菲律宾由Phakopsoraloudetiae引起的麻竹叶锈菌。此外，国外还报道有Dasturellaspp.、Pucciniaspp.、Uredospp.、Tunicopsorabagchii的竹叶锈病，《真菌鉴定手册》收录我国亦有5种竹叶锈病的病原（巍景超，1979）。罗集丰等（2011）和李瑞军等（2009）报道了广东省揭东县以及云南省陇川县的麻竹叶锈病，与本研究的麻竹锈病症状类似，以锈褐色粉状物为主，用形态学方法鉴定其病原菌为柄锈菌（Pucciniasp.），与本研究的结果相符。竹类的叶部病害虽种类繁多，发生普遍，但在短期内危害小。尤其对其研究报道较少（周春来等，2010）。近年来我国竹叶锈病病原包括层锈菌科1种（Dasturella47 divana）、鞘锈菌科18种（Pucciniaspp.，Sphaerophragmiumsp.）、半知锈菌类4种（Uredospp.）、夏孢锈菌属1种（Physopellainflexa）和桂林锈菌属（Kweilingiabambusae）。这些锈菌很多系在台湾发生和报道的，内地研究报道较少（徐梅卿等，2006）。4.9朴树白粉病及其病原菌朴树是行道树品种，主要用于绿化道路，栽植公园小区，景观树等，朴树白粉病在广东省内的报道极少，郑儒永等（1987）编著的《中国真菌志：白粉菌目》首次用形态学鉴定了三孢半内生钩丝壳（Pleochaetashiraiana）是朴树白粉病的病原菌，并指出该病害在广州有分布；陈建文等（1988）在昆明地区报道了该菌的寄主朴树，对该菌形态学上鉴定为三孢内半内生钩丝壳；郑晓慧等（2009）对四川省攀西地区木本植物上的白粉菌进行了调查和研究，初步鉴定出木本植物上有三孢内半生钩丝壳引起的白粉病，具体寄主不详。《中国真菌志：白粉菌目》记录了该病原菌在国内各地的广泛分布，但少见报道，所以，本研究的意义在于首次用形态学与分子生物学方法相结合，准确客观的鉴定出朴树白粉病的病原为三孢内半生钩丝壳，与郑儒永等（1987）报道的一致，并且本试验首次用光学显微镜拍摄其分生孢子形态，为今后进一步研究奠定了基础。4.10夏威夷椰子叶枯病及其病原菌夏威夷椰子不仅株姿优美，且易开花结籽，外观枝叶茂密、叶色浓绿，并富有光泽，羽片雅致，给人以端庄、文雅、清秀之美感，能长期摆放于室内，可花、果、叶、茎共赏，有利于净化空气，美化环境。对夏威夷椰子病害的研究，金亮等（2000）报道了由病原菌壳二孢（Ascochytasp.）引起的叶斑病；洪伟雄（2008）用形态学方法鉴定了夏威夷椰子链格孢属真菌（Alternariasp.）病害；林秀香等（2009）报道了漳州、厦门地区分别由棕榈盾壳霉（Coithyriumsp.）以及由链格孢（Alternariasp.）引起的夏威夷椰子叶斑病；陈宏波等（2009）报道了上海市由胶孢炭疽菌引起的夏威夷椰子炭疽病。洪伟雄（2008）的研究介绍了病害症状以及病原特征，并且拍摄了切片观察的链格孢显微图；林秀香等（2009）对福建省内主要栽培的棕榈科植物病害种类进行系统调查，采集病害标本，通过形态学鉴定出由链格孢（Alternariasp.）引起的夏威夷椰子叶斑病，但报道中并未提及症状以及病原菌的特征和相应图片。与洪伟雄、林秀香48 等的研究结果相比较，本试验采用柯赫氏法则，对病原菌进行了培养、纯化，并用形态学与分子生物学方法鉴定出夏威夷椰子叶枯病病原菌链格孢，结果更为精确、可靠，与洪伟雄（2008）和林秀香等（2009）的鉴定结果一致。4.11铁皮石斛炭疽病及其病原菌铁皮石斛有非常高的药用价值，也可做盆栽观赏。李向东等（2011）鉴定了引起金钗石斛和铁皮石斛软腐病的病原菌为终极腐霉（Pythiumultimum）；张翊等（2014）报道了胶孢炭疽菌引起的金钗石斛炭疽病；曹星星（2015）明确了4种常见铁皮石斛病害的病原菌：分别是引起茎腐病铁皮石斛白绢病的齐整小核菌（Sclerotiumrolfsii）、引起铁皮石解黑斑病的极细链格孢（Alternariatenuissima）、引起铁皮石斛茎腐病的砖红镰孢菌（Fusariumincarnatum）或层出镰孢菌（F.proliferatum）和引起铁皮石斛灰霉病的灰葡萄孢菌（Botrytiscinerea）；孙惠芳等（2016）报道了茄病镰孢菌（F.solani）对铁皮石斛有致病性；李静等（2008）报道了引起浙江义乌铁皮石斛疫病的病原菌为烟草疫霉菌（Phytophthoranicotianae）。在铁皮石斛炭疽病的鉴定方面，本试验与张翊等（2014）的试验参照，同样采用了形态学与分子生物学相结合的鉴定方法，本试验用数码相机拍摄了症状图、用光学显微镜拍摄了显微孢子形态图等，更为直观。4.12金钗石斛炭疽病及其病原菌在金钗石斛炭疽病的鉴定方面，本试验确认了其病原菌为博宁炭疽菌（Colletotrichumboninense）。与张翊等（2014）的试验参照，同样采用了形态学与分子生物学相结合的鉴定方法，本试验用数码相机拍摄了症状图、用光学显微镜拍摄了显微孢子形态图等，更为直观。4.13榕树叶斑病及其病原菌榕树，大乔木，在景观园林设计中，榕树作为行道树树种，国内很少有榕树叶斑病的报道，王谨（2006）简要报道了厦门市榕树叶斑病的病原菌为胶孢炭疽菌。本试验通过形态学和分子生物学结合的方法，鉴定出阴香叶斑病的病原菌为胶孢炭疽菌（C.gloeosporioides），与王谨（2006）的鉴定结果是一致的。4.14龟背竹叶斑病及其病原菌龟背竹，攀援灌木，福建、广东、云南栽培于露地，原产墨西哥，各热带地区多引种栽培供观赏。关于龟背竹叶斑病的报道较少，王丽霞（2012）采用形态学与分子49 生物学相结合的方法，鉴定了广州市龟背竹叶斑病病原菌是广生茎点霉（PhomaomnivirensAveskamp,Verkley&Gruyter）、海南海口的龟背竹叶斑病病原菌是（C.gloeosporioides）；容汉诠等（1987）初步鉴定出银川地区龟背竹叶斑病的病原菌为叶点霉（Phyllostictasp.）；久保田まや等（1995）在日本用形态学方法鉴定出龟背竹叶斑病的病原菌为茎点霉属的Phomaexigua。本试验当中通过形态学和分子生物学结合的方法，鉴定龟背竹叶斑病病原菌是茎点霉（Phomasp.），与王丽霞（2012）及久保田まや（1995）的鉴定结果是一致的。4.15蜘蛛兰叶斑病及其病原菌锈病及其病原菌蜘蛛兰叶形美丽，花型别致，且花芬香，因而具有较高的观赏价值（陈博君，2000）。蜘蛛兰的叶斑病在国内报道很多，张育声等（2012）和刘素青（2012）分别在广东省惠州市、云南省昆明市有发现蜘蛛兰炭疽病的危害；吴小瑶（2015）报道的广州地区葡萄孢属（BotrytisMicheli）真菌引起的蜘蛛兰灰霉病；陈冠州等（2015）报道了通过形态特征及分子生物学鉴定广州市区的蜘蛛兰红斑病致病菌为水仙花壳多孢（Stagonosporacurtisii）；刘杰（2012）鉴定了导致广州地区蜘蛛兰叶斑病的病原菌，经形态学和分子生物学鉴定草茎点霉（PhomaherbarumWestend）和串珠镰刀菌（FusariummoniliformeSheld），以上两种菌的致病性较强。此外，经形态学鉴定，炭疽菌（Colletotrichumsp.）和拟茎点霉菌（Phomopsissp.）也是蜘蛛兰叶斑病的病原菌，但致病性相对较弱。此外，谭舒心等（2009）报道了通过形态特征鉴定了重庆地区的蜘蛛兰褐斑病的病原菌为炭疽属（Colletotrichumsp.）和拟盘多毛孢（Pestalotiopsissp.）；刘雅婷等（2009）报道了昆明市蜘蛛兰上的病害症状表现为沿叶脉出现系统性黄斑和坏死、同心环纹，由分子生物学鉴定该病害是由番茄斑萎病毒属（Tospovirus）病毒引起的病毒病。本研究鉴定出蜘蛛兰叶斑病的病原菌有尖孢镰刀菌（F.oxysporum）、茎点霉（Phomasp.）和伞菌科（Agaricaceae）3种真菌。尖孢镰刀菌采用形态学与分子生物学相结合的方法鉴定，与刘杰（2012）的鉴定结果相一致。茎点霉与伞菌科真菌采用分子生物学方法鉴定，其中茎点霉的鉴定结果也与刘杰（2012）的报道相一致。最后，伞菌科Agaricaceae真菌导致蜘蛛兰叶斑病的研究国内外鲜有报道，该科作为食用菌的种类较多（卯晓岚，1988）。本试验用柯赫氏法则验证了该菌株的致病性，并用分子生物学方法鉴定其分类。但是没有相关的关于该菌致病机理的报道与研究，有可能该菌单独或者与茎点霉、镰刀菌共同致病，也可能为蜘蛛兰内生真菌。50 4.16关于菌物鉴定方法的讨论与改进在真菌学研究中，传统的菌物分类以形态特征和生理生化指标为分类基础，但大部分菌物的种类多、分布广、形态特征复杂，而且少数形态特征和生理生化指标随着环境的变化而不稳定，因此，传统的菌物分类常引起分类系统的不稳定或意见分歧。近年来随着分子生物学的发展，同时也是真菌学自身发展的客观需求，分子生物学技术在真菌学研究中得到了广泛而深入地应用。一些分类地位不明确、亲缘关系不清楚的物种通过该技术得到了验证（陈剑山等，2007）。相对于传统的真菌形态学鉴定方法，rDNA-ITS序列分析用于真菌鉴定更客观、省时、简便、快速，但目前也存在一定的应用限制（受基因库的完善程度、高度同源性序列的多少以及具体物种ITS区的可变程度等影响）并不能鉴定出所有真菌，宜与传统的形态学鉴定方法相结合用于真菌鉴定（郝芳等，2009）。除此之外，还有一些分子生物学技术应用于真菌的分类研究中，但需要指出的是任何一种好的分类学技术指标仍不能单独用于物种分类，必须结合多个可靠的分类指标，如形态性状、生理性状、生化性状乃至基因水平的指标综合考虑，在此基础上才可能建立符合客观规律的自然分类系统（燕勇等，2008）。51 致谢本论文是在导师刘海涛副教授的悉心指导下完成的，从论文选题、方案设计、试验开展，到文章的撰写定稿和答辩整个过程中，刘老师倾注了大量的心血。导师知识渊博，教风严谨，思想深邃，在与其学习相处中收获了无穷的积极正能量；其勤恳务实的优良作风和在花卉领域的专注、喜好与坚持让我深刻感受到把握正确方向脚踏实地干实事的悠然与收获；同时老师在植物栽培养护方面的专业知识和丰富经验带予我不尽的启迪。导师宽容豁达的心胸气度，热情忘我的工作精神，对我今后的学习和工作将产生积极影响。读研期间，导师除了在学习科研上对我悉心教导外，在生活中给予我足够的鼓励和帮助关怀，让我的研究生时光充实而又温暖的度过。值此毕业之际，谨向导师表示崇高的敬意和衷心的感谢！同时，感谢实验室冯淑杰、张荣以及吴启松老师在整个试验过程中对我的热心指导和帮助。三位老师从把我引进实验室并指导各项操作，帮助解决试验中的各种技术问题，不时提点我出现的问题和应对措施，后期调整改进试验方案等各个环节中都给予了我悉心的指导。感谢整个试验过程中与三位老师的相处，他们严谨的科研精神和乐观的生活态度令我受益匪浅。在此，一并表示感谢！本试验还得到了李万英、宋凤鸣两位师姐，伍春贤、何英伟师弟，以及王俊和王东栋的热心指导和帮助，在此表示诚挚的感谢！还要感谢我的父母、亲人和朋友对我的关心和支持，使我能够顺利完成学业！谨以此论文献给所有帮助过我的老师、同学、亲人和朋友，衷心地感谢您们，在今后道路我会更加努力以更好成绩回报社会！感谢这篇论文所涉及到的各位学者的研究成果带来的启发。最后感谢各位论文评审专家，感谢他们对本论文工作给予真切指导和提出宝贵意见！52 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