A群PoRV+G9P[23]型毒株NSP5与宿主β-tubulin互作及其对病毒复制的影响

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密级：论文编号：中国农业科学院学位论文Ａ群ＰｏＲＶＧ９Ｐ［２３］型毒株ＮＳＰ５与宿主－βｔｉｕｂｕｌｉｉｎ互作及其对病毒复制的影响Ｔｈｅｔ－ｎｄｒｏｕＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｏｆＨｏｓｔｕｂｕｌｉｎａＮＳＰ５ｏｆＧＡＰｏＲＶβｐＧ９Ｐ２３ＳｔｒａｉｎａｎｄｔｈｅＥｆｆｅｃｔｏｆｉｔｏｎＰｏＲＶＲｅｌｉｃａｔｉｏｎ［］ｐ硕士研究生：景朝阳指导教师：冯力研究员申请学位类别：农学硕士专业：预防兽医学研究方向：微生物学及其分生物学培养单位：哈尔滨兽医研究所研究生院２０１８年６月 密级:论文编号:中国农业科学院学位论文A群PoRVG9P[23]型毒株NSP5与宿主β-tubulin互作及其对病毒复制的影响TheInteractionofHostβ-tubulinandNSP5ofGroupAPoRVG9P[23]StrainandtheEffectofitonPoRVReplication硕士研究生：景朝阳指导教师：冯力研究员申请学位类别：农学硕士专业：预防兽医学研究方向：兽医微生物学及其分子生物学培养单位：哈尔滨兽医研究所研究生院2018年6月 Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationTheInteractionofHostβ-tubulinandNSP5ofGroupAPoRVG9P[23]StrainandtheEffectofitonPoRVReplicationM.S.Candidate:JingZhaoyangSupervisor:ProfessorFengLiMajor:PreventiveVeterinaryMedicineSpecialty:VeterinaryMicrobiologyandMolecularBiologyJune2018 摘要A群猪轮状病毒(PorcineRotavirus，PoRV)是导致仔猪腹泻的主要病原之一，属于轮状病毒(Rotavirus，RV)的一种。其非结构蛋白5(NSP5)是病毒质（病毒复制的工厂）的主要组分之一，研究显示NSP5对RV复制具有重要意义，但其在RV复制中如何发挥作用尚不明确。本研究发现NSP5与β-tubulin存在相互作用，且在许多病毒上的研究发现，β-tubulin能够通过与病毒蛋白发生相互作用，从而对病毒复制起着复杂的作用。因此有必要探究β-tubulin对RV复制的影响。本研究以NSP5为研究对象，通过GSTpull-down技术结合蛋白质谱鉴定技术，发现A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株NSP5与宿主细胞(MA104细胞)β-tubulin间存在相互作用；并通过Co-IP技术证明，不仅外源表达的NSP5与β-tubulin存在相互作用，且A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株感染时NSP5与β-tubulin也存在相互作用；本研究进一步利用激光共聚焦扫描显微镜技术证明了A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株NSP5与β-tubulin共定位于细胞质中。至此本研究证明了A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株NSP5与β-tubulin存在相互作用。本研究进一步探究了A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株感染对宿主细胞β-tubulin的影响。首先通过激光共聚焦扫描显微镜技术证明，A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株感染过程中，MA104细胞β-tubulin从微管上解聚，导致微管网络解聚，出现与NSP共定位的颗粒状β-tubulin；而在仅使用诺考达唑（抑制β-tubulin向微管聚合的抑制剂）处理的细胞中，虽然β-tubulin能够从微管上解聚，但胞质中却观察不到颗粒状β-tubulin。结果说明A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株的感染能够诱导β-tubulin从微管上解聚，且病毒的某些成分诱导颗粒状β-tubulin形成。此外，本研究进一步探究了宿主细胞β-tubulin对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制的影响。通过瞬时转染证明，过表达β-tubulin抑制A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株NSP5和VP6蛋白的合成与表达，且抑制病毒的复制；通过siRNA干扰技术证明，下调β-tubulin促进A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株NSP5和VP6蛋白的合成与表达，且促进病毒的复制；通过诺考达唑和ABT-751（抑制β-tubulin向微管聚合的抑制剂）实验证明，抑制β-tubulin向微管聚合，促进A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株NSP5和VP6蛋白的合成与表达，且促进病毒的复制；通过紫杉醇（抑制β-tubulin从微管上解聚的抑制剂）实验证明，抑制β-tubulin从微管上解聚，抑制A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株NSP5和VP6蛋白的合成与表达，且抑制病毒的复制。因此，本研究认为β-tubulin对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株的复制呈现负调控作用。本研究首次证明了NSP5与β-tubulin存在相互作用，且参与A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株的复制，对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制呈负调控作用，提示NSP5可能通过与β-tubulin相互作用，进而影响RV复制。这一研究结果将深入我们理解NSP5对RV复制的意义，也为研制RV疫苗和药物提供新的分子靶标。关键词：A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株，NSP5，β-tubulin，蛋白质相互作用，RV复制I 摘要A群猪轮状病毒(PorcineRotavirus，PoRV)是导致仔猪腹泻的主要病原之一，属于轮状病毒(Rotavirus，RV)的一种。其非结构蛋白5(NSP5)是病毒质（病毒复制的工厂）的主要组分之一，研究显示NSP5对RV复制具有重要意义，但其在RV复制中如何发挥作用尚不明确。本研究发现NSP5与β-tubulin存在相互作，且在许多病毒上的研究发现，β-tubulin能够通过与病毒蛋白相互作用，从而对病毒复制起着复杂的影响。因此有必要探究β-tubulin对RV复制的影响。本研究以NSP5为研究对象，通过GSTpull-down技术结合蛋白质谱鉴定技术，发现A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株NSP5与宿主细胞(MA104细胞)β-tubulin间存在相互作用；并通过Co-IP技术证明，不仅外源表达的NSP5与β-tubulin存在相互作用，且A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株感染时NSP5与β-tubulin也存在相互作用；本研究进一步利用激光共聚焦扫描显微镜技术证明了A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株NSP5与β-tubulin共定位于细胞质中。至此本研究证明了A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株NSP5与β-tubulin存在相互作用。本研究进一步探究了A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株感染对宿主细胞β-tubulin的影响。首先通过激光共聚焦扫描显微镜技术证明，A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株感染过程中，MA104细胞β-tubulin从微管上解聚，导致微管网络解聚，出现与NSP共定位的颗粒状β-tubulin；而在仅使用诺考达唑（抑制β-tubulin向微管聚合的抑制剂）处理的细胞中，虽然β-tubulin能够从微管上解聚，但胞质中却观察不到颗粒状β-tubulin。结果说明A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株的感染能够诱导β-tubulin从微管上解聚，且病毒的某些成分诱导颗粒状β-tubulin形成。此外，本研究进一步探究了宿主细胞β-tubulin对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制的影响。通过瞬时转染证明，过表达β-tubulin抑制A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株NSP5和VP6蛋白的合成与表达，且抑制病毒的复制；通过siRNA干扰技术证明，下调β-tubulin促进A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株NSP5和VP6蛋白的合成与表达，且促进病毒的复制；通过诺考达唑和ABT-751（抑制β-tubulin向微管聚合的抑制剂）实验证明，抑制β-tubulin向微管聚合，促进A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株NSP5和VP6蛋白的合成与表达，且促进病毒的复制；通过紫杉醇（抑制β-tubulin从微管上解聚的抑制剂）实验证明，抑制β-tubulin从微管上解聚，抑制A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株NSP5和VP6蛋白的合成与表达，且抑制病毒的复制。因此，本研究认为β-tubulin对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株的复制呈现负调控作用。本研究首次证明了PoRVNSP5与β-tubulin存在相互作用，且参与A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株的复制，对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制呈负调控作用，提示NSP5可能通过与β-tubulin相互作用，进而影响RV复制。这一研究结果将深入我们理解NSP5对RV复制的意义，也为研制RV疫苗和药物提供新的分子靶标。关键词：A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株，NSP5，β-tubulin，蛋白质相互作用，RV复制II AbstractThegroupAporcinerotavirus(PoRV)isoneofthepathogenscausingdiarrheainswines.Non-structuralprotein5(NSP5)ofPoRVcaninteractwithavarietyofviralproteinsandplayanimportantroleinviralreplication.Studieshavefoundthattubulinbindsaroundtheviroplasmduringthereplicationofrotavirus(RV).However,thespecificmechanismisnotyetclear.ThisstudyfoundthatNSP5interactedwithβ-tubulin,andstudiesonmanyviruseshavefoundthatβ-tubulincaninteractwithviralproteinsandthusplayacomplexroleinvirusreplication.Therefore,itisnecessarytoexploretheeffectofβ-tubulinonRVreplication.Inthisstudy,usingtheGSTpull-downtechnologycoupledwithproteinmassspectrometryanalysis,hostcellproteinβ-tubulininteractingwithNSP5proteinwasidentifiedbyusingprokaryoticexpressionGST-NSP5proteinasbaitprotein.Inordertofurtherverifytheidentificationresultsofmassspectrometry,weusedthecommercializedmonoclonalantibodyofβ-tubulinandtheprokaryoticGST-NSP5proteinasbaitprotein,verifyingtheinteractionbetweenhostcellproteinβ-tubulinandNSP5.Furthermore,theinteractionofNSP5proteinineukaryoticcellswithβ-tubulinwasdemonstratedbyimmunoprecipitationinvitro.AnditisprovedthatNSP5proteincaninteractwithhostcellproteinβ-tubulinbythemethodofCo-IPintheprocessofgroupAPoRV/NMTL/G9P[23]straininfection.Moreover,usingconfocalmicroscopyandimmunofluorescencetechnology,co-localizationofNSP5proteinofgroupAPoRV/NMTL/G9P[23]strainwithhostcellproteinβ-tubulinincytoplasmwasidentified.ThisstudyfurtherexploredtheeffectofNSP5proteininteractionwithhostcellβ-tubulinonthereplicationofgroupAPoRV/NMTL/G9P[23]strain.Firstly,usinglaserconfocalmicroscopyandimmunofluorescencetechnique,β-tubulindepolymerizedfromthemicrotubuleleadingtothedepolymerizationofmicrotubulenetworksingroupAPoRV/NMTL/G9P[23]strain.infectedMA104cells.And,atthesametime,theβ-tubulinofmicrotubulewasreducedandgranularβ-tubulinappearedinthecytoplasmofvirusinfectedMA104cells.IntheMA104cellstreatedbynocodazole(inhibitionofmicrotubulepolymerization)theβ-tubulindidnotexistasaformofgranularβ-tubulin,whichindicatedthatgranular-tubulinintheprocessofgroupAPoRV/NMTL/G9P[23]straininfectionisinducedbysomecomponentsofthevirus.Inaddition,thisstudyfurtherexploredtheeffectofhostcellβ-tubulinonthereplicationofgroupAPoRV/NMTL/G9P[23]strain.Inthefollowingtransientexperiment,itisprovedthatoverexpressionofβ-tubulincannotonlyinhibitthesynthesisandexpressionofNSP5andVP6proteinsofgroupAPoRV/NMTL/G9P[23]strain,butalsoinhibitthereplicationofvirus.ThroughthesiRNAinterference,itisprovedthatthereductionofβ-tubulincannotonlypromotethesynthesisandexpressionofgroupAPoRV/NMTL/G9P[23]strainNSP5andVP6protein,butalsopromotethereplicationofvirus.ByaddingnocodazoleandABT-751(β-tubulininmicrotubulepolymerizationinhibitionon)thatinhibitthepolymerizationofβ-tubulinfrommicrotubules,notonlycanpromotetheexpressionofNSP5andVP6protein,butalsopromotethereplicationofthevirus;Byaddingpaclitaxel(inhibitingtheIII depolymerizationofβ-tubulinonmicrotubules)provedthatinhibitingthedepolymerizationofβ-tubulinfrommicrotubulesnotonlyinhibitedthesynthesisandexpressionofNSP5andVP6protein,butalsoinhibitedthereplicationofvirus.Therefore,thisstudysuggestedthatβ-tubulinnegativelyregulatesthereplicationoftheGroupAPoRV/NMTL/G9P[23]strain.ThisstudydemonstratedtheinteractionbetweenNSP5andβ-tubulinforthefirsttime.β-tubulinistherarehostcellproteinthatcaninteractwithRVNSP5,anditisinvolvedinthereplicationofgroupAPoRV/NMTL/G9P[23]strain.ThenegativeregulationofreplicationofgroupAPoRV/NMTL/G9P[23]strainsuggeststhatNSP5mayinteractwithβ-tubulinandaffectRVreplication.ThisstudywillfurtherourunderstandingofthesignificanceofNSP5forRVreplicationandprovidenewmoleculartargetsforthedevelopmentofRVvaccinesanddrugs.Keywords:GroupAPoRV/NMTL/G9P[23]strain,NSP5,β-tubulin,Proteinsinteraction,RVreplicationIV 目录第一章引言...................................................................................................................11.1轮状病毒的流行概况与结构.....................................................................................11.1.1轮状病毒的流行概况..........................................................................................11.1.2轮状病毒的结构..................................................................................................21.2轮状病毒病及其致病性.............................................................................................21.2.1轮状病毒病..........................................................................................................21.2.2轮状病毒致病性..................................................................................................31.3轮状病毒蛋白.............................................................................................................41.3.1轮状病毒结构蛋白..............................................................................................41.3.2轮状病毒非结构蛋白..........................................................................................41.3.3轮状病毒NSP5....................................................................................................41.4β-tubulin的分子特性..................................................................................................51.5β-tubulin及微管的功能..............................................................................................61.5.1β-tubulin在病毒感染中的作用...........................................................................61.5.2微管的物质运输功能..........................................................................................71.6β-tubulin的相关抑制剂..............................................................................................81.6.1诺考达唑..............................................................................................................81.6.2ABT-751................................................................................................................81.6.3紫杉醇..................................................................................................................91.7NSP5与β-tubulin相关的研究进展...........................................................................91.8本研究的目的意义.....................................................................................................9第二章A群PoRVG9P[23]型毒株NSP5与β-tubulin互作的研究..............................112.1实验材料...................................................................................................................112.1.1毒株和细胞........................................................................................................112.1.2主要仪器与设备................................................................................................112.1.3主要试剂............................................................................................................12V 2.1.4引物....................................................................................................................122.2实验方法...................................................................................................................132.2.1GSTpull-down试验...........................................................................................132.2.2蛋白质谱分析....................................................................................................142.2.3免疫共沉淀(Co-IP)试验....................................................................................142.2.3.1外源表达NSP5与β-tubulin的Co-IP试验结果.....................................142.2.3.2内源表达NSP5与β-tubulin的Co-IP试验..............................................152.2.4激光共聚焦试验................................................................................................152.2.4.1激光共聚焦扫描显微镜观察外源表达的NSP5与β-tubulin...................152.2.4.2激光共聚焦扫描显微镜观察内源表达的NSP5与β-tubulin...................152.3实验结果....................................................................................................................162.3.1GSTpull-down试验及蛋白质谱分析结果.......................................................162.3.2外源表达NSP5与β-tubulin的Co-IP试验结果............................................162.3.3内源表达NSP5与β-tubulin的Co-IP试验结果............................................162.3.4激光共聚焦扫描显微镜观察外源表达的NSP5与β-tubulin的结果............172.3.5激光共聚焦扫描显微镜观察内源表达的NSP5与β-tubulin.........................202.4讨论............................................................................................................................20第三章β-tubulin对A群PoRVG9P[23]型毒株复制的影响.........................................223.1实验材料...................................................................................................................223.1.1细胞、毒株和质粒............................................................................................223.1.2主要仪器与设备................................................................................................223.1.3主要试剂............................................................................................................233.1.4引物及siRNA序列...........................................................................................243.2实验方法...................................................................................................................243.2.1A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株VP6基因的Taqman荧光定量PCR检测方法..............................................................................................................................243.2.2激光共聚焦扫描显微镜试验............................................................................243.2.3过表达β-tubulin对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制影响的探究....25VI 3.2.4下调β-tubulin对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制影响的的研究....263.2.5抑制剂对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制影响的探究.....................263.3实验结果...................................................................................................................273.3.1A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株感染对β-tubulin影响的探究..................273.3.2过表达β-tubulin对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制影响的探究....273.3.3下调β-tubulin对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制影响的探究........293.3.4诺考达唑对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制影响的探究.................313.3.5ABT-751促进A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制..................................323.3.6紫杉醇抑制A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制.....................................333.4讨论...........................................................................................................................34第四章全文结论...............................................................................................................36参考文献.............................................................................................................................37附录.................................................................................................................................45致谢.................................................................................................................................46作者简历.............................................................................................................................47VII 英文缩略表英文缩写英文全称中文名称RVRotavirus轮状病毒Co-IPCoimmunoprecipitation免疫共沉淀CyDncytoplasmicdynein，胞质驱动蛋白GG轮状病毒根据VP7基因的分类方法hpiHourpostinfection感染后小时数MAPsmicrotubule-associatedproteins微管相关蛋白MTOCMicrotubuleorganizingcenter微管组织中心NSP5Non-structuralprotein非结构蛋白5ODOpticalDensity光密度PP轮状病毒根据VP4基因的分类方法PBSPhosphateBufferedSolution磷酸盐缓冲溶液PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应PoRVPorcineRotavirus猪轮状病毒RdRpRNA-dependentRNApolymerasesRNA依赖的RNA聚合酶SDS-PAGESDS-PolyacrylamideGelElectrophoresisSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳VP6Structuralprotein结构蛋白6VIII 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言第一章引言1.1轮状病毒的流行概况与结构1.1.1轮状病毒的流行概况轮状病毒属于呼肠孤病毒科，能感染包括人类在内的多种哺乳动物乃至鸟类，引起其新生动物和幼龄动物腹泻，主要表现为腹泻、呕吐和脱水等症状，如果治疗不及时患病儿童或患病动物常以死亡为转归。据报道，2010年139个低收入国家儿童的腹泻发病人数约为1.7亿(FischerWalkeretal.,2012)。尽管从1990年到2013年全球因腹泻疾病死亡的人数从260万下降到130万(Naghavietal.,2015)。但在发达国家和发展中国家，轮状病毒腹泻仍是威胁其儿童健康的主要病因(Gastanaduyetal.,2013;Khagayietal.,2014)。在猪群中，PoRV是目前导致新生仔猪腹泻的主要病原之一，给全球养猪业造成不可估量的损失。Marthaler等报道称，美国、加拿大和墨西哥2009至2011年收集的腹泻型小猪病料中，A、B和C群PoRV具有较高流行率。2016年，美国报告的最高PoRV流行率为82.1％，加拿大的为79.7％，墨西哥的为73.3％。根据VP6蛋白的抗原关系，将RV分为10个群(A-J)，其中A、B和C群在人和动物中都有报道，而D、E、F、G和H群仅在动物中有过报道(Matthijnssensetal.,2012;Tateetal.,2012)，最近分别在匈牙利的庇护犬和塞尔维亚的蝙蝠中发现I和J群(Matthijnssensetal.,2012;BluttandConner,2007;Banyaietal.,2017)。RV外壳蛋白VP7和VP4能够诱导中和抗体产生，是形成G和P双重分型系统的基础(BluttandConner,2007)。A、B和C群RV(RVA、RVB和RVC)是感染人类和动物的主要RV，其中RVA毒株的流行率最高，是最受公共卫生和兽医领域重视的急性腹泻病原之一。迄今为止，在人类和动物中已经发现27种G基因型和37种P基因型(Matthijnssensetal.,2012;Trojnaretal.,2013)。其中G3、G4、G5、G9和G11型被认为是猪群中最常见的G基因型，并且常与P[5]、P[6]、P[7]、P[13]和P[28]基因型组合。2008年，国际轮状病毒委员会建立了RVA的全基因组分类系统，该分类系统根据RVA基因组11条基因的遗传演化关系进行分类(Matthijnssensetal.,2008)。当不同基因型的RV同时感染同一宿主时，可能产生重组病毒，这是导致轮状病毒基因多样性的主要原因(Jainetal.,2014)。目前，在猪群中A、B、C、E和H群RV已有报道(Wakudaetal.,2011)。1969年，科学家首次通过细胞培养分离了牛RVA，并确认其是犊牛腹泻的病因(Aungetal.,2009)。1973年，Bishop及其同事发现RVA感染人类(Bishopetal.,1973)。随后的研究记录了RVA在幼龄动物（包括犊牛和仔猪）中的广泛流行，并且与1月龄以下的动物腹泻相关。RVC于1980年首次在仔猪中分离获得(Saifetal.,1980)，随后还发现RVC能够感染其它动物以及人类。与RVA和RVC在人类中呈现世界范围流行的趋势不同，RVB感染人类的案例仅在中国、印度和孟加拉国有所报道(Fangetal.,1989)。RVE只在英国的猪群中有报道，血清学调查显示10周龄以上的猪群对该病毒的抗体分布广泛(Aungetal.,2009)。最近，在日本、巴西和美国相继报道了RVH能够感染猪群，并且至少早在2002年就已经开始流行(Wakudaetal.,2011)。1 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言1.1.2轮状病毒的结构RV粒子直径为70-100nm，具有二十面体衣壳，其基因组为双链RNA(dsRNA)。完整的RV具有三层衣壳结构，其三层衣壳结构的病毒粒子被称为TLP(triple-layeredparticle)。电镜下TLP形似车轮，这也是RV名字的由来(Flewettetal.,1974)。通过低温电子显微镜和图像重建数据分析，证明RV粒子的结构如下(Jayarametal.,2004)：其第一层衣壳，由120个VP2构成60个VP2二聚体，组成T=1的结构，5个VP2二聚体在其五重对称轴周围形成了一个十聚体，12个十聚体构成VP2核心蛋白层，除了五重对称轴上的小孔以外，VP2核心蛋白层是均匀的。在五重对称轴的核心内部有一个“五重对称中心”(密度)，这个中心以前被认为是由VP2的N-端聚合而成(McClainetal.,2010)，但最近被认为是VP1的结构(Estrozietal.,2013)。VP1和VP3组成复制酶复合物，位于RV最内层核衣壳，通过VP1与一个特定的基因组dsRNA紧密结合(Perizetal.,2013)。所以，核衣壳内共包含RV基因组的11个dsRNA片段和RVRNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)——VP1和VP3。有研究认为基因组的dsRNA片段在复制复合体周围形成了圆锥形柱状结构(Jayarametal.,2004;Prasadetal.,1996)。在转录活跃的DLP(double-layeredparticle)中，由于核心内的物质相应增加，其中间层衣壳蛋白VP6的含量相应减少。11条dsRNA片段的5’和3’端都有短而保守核酸序列：5’-GGC······ACC-3’。+RNA片段的5’非编码区大小为9-48nt，3’非编码区为17-182nt。5’和3’的末端部分是倒置互补序列，并能够长期的相互作用(Tortoricietal.,2006)。3’端为RdRp识别信号(Tortoricietal.,2003)，并能与NSP3相互作用，参与翻译的激活(ChizhikovandPatton,2000;Vendeetal.,2000)。在2.9Å的分辨率下，获得了RdRp的结构：VP1形成了一个笼状结构，其中插有4个“隧道”（形成分子中心的催化部位），该结构具体功能如下：1.能够允许核苷三磷酸腺苷(NTPs)自由的进入；2.能够允许模板ssRNA进入；3.参与+ssRNA产物的释放；4.参与–ssRNA（用于病毒基因组的翻译）或dsRNA（用于病毒基因组复制）的释放(Luetal.,2008)。“隧道3”定位于VP2内的类I通道(Settembreetal.,2011)，允许+RNA释放到细胞质中；“隧道4”将新复制的dsRNA导向核心内部。RVRdRp的结构，在许多方面都与正呼肠孤病毒中相应的酶的结构相似(Taoetal.,2002)。病毒核心周围是260个VP6的三聚体，VP6构成了中间层(Mathieuetal.,2001)。VP6的三聚体与两个核心蛋白VP2相连(Charpilienneetal.,2002)，其外层是VP7和VP4三聚体，如图1.1。1.2轮状病毒病及其致病性1.2.1轮状病毒病传染性腹泻每年导致约220万人死亡，其中RVA是主要病原之一。RV的非结构蛋白4(NSP4)是一种病毒毒素，可以引起导致腹泻的细胞反应。并且NSP1可以诱导干扰素调节因子IRF3、IRF5和IFR7的退化，从而抑制干扰素产生。另一方面，双歧杆菌和乳酸菌等益生菌与益生元如HMO、scGOS、IcFOS联合使用，可以广谱性提高机体的抗病毒反应，减少RV感染和释放，同时下调NSP4的表达，提高抗RV的特异性IgAs水平。在急性胃肠炎发病过程中，严重的腹泻是导致脱水的主要原因，脱水可引起多种并发症，如2 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言果治疗不及时则引起死亡。而传染性胃肠炎主要导致婴幼儿发病(Boschi-Pintoetal.,2008)，全世界每年儿童死亡数高达57.8万(Boschi-Pintoetal.,2008)。RV是导致五岁以下儿童发生急性胃肠炎的主要病原(Boschi-Pintoetal.,2008)，每年导致全球45.3万名儿童死亡(Boschi-Pintoetal.,2008)图1.1RV粒子结构模式图及RV基因组的构成(Pattonetal.,2007)。左图：RV粒子的模式结构图。右图：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析的RVSA11株基因组。Fig.1.1RVparticleschemagraphandthecompositionoftheRVgenome(Pattonetal.,2007).(Left)AparticleschemagraphofRVparticles.(Right)ThegenomeanalysisofRVSA11strainbypolyacrylamidegelelectrophoresis.1.2.2轮状病毒致病性RV主要感染小肠绒毛顶端非分裂的成熟肠上皮细胞，并在其中复制。尽管系统性轮状病毒病尚有待进一步鉴定，但RV的感染不仅局限于肠，近年来出现了RV抗原血症和病毒血症的报道(Rahmanetal.,2007)。虽然人RV致病性尚不清楚，但在一些动物模型和人肠上皮模型的研究中表明，RV的致病性与多种因素有关，例如：1.RV感染胃肠道内壁成熟肠细胞，导致肠上皮细胞空泡化、隐窝增生和绒毛变短，而绒毛变短导致小肠吸收障碍，但早期也有报道称腹泻的症状与肠上皮细胞损伤有关(Jourdanetal.,1997)，2.RV的NSP4是一种肠毒素，可以通过抑制Na+/葡萄糖共转运蛋白SGLT1，进而诱导依赖Ca2+的Cl−分泌，并可影响紧密连接的整体性，从而改变细胞骨架结构，还可调节Na+/K+泵(Balletal.,1996;LundgrenandSvensson,2001;Ousingsawatetal.,2011)。这种肠上皮细胞内的调节异常伴随着消化酶的下调表达、葡萄糖吸收障碍，以及非依赖性纤维化电导调节分子的分泌，这也可能是导致腹泻的另一原因(Ousingsawatetal.,2011)，3.在RV引起的腹泻中，利用药物阻断肠神经系统通路，证明肠神经系统参与RV诱导的分泌性腹泻和肠蠕动性的增加(Lundgrenetal.,2000)，4.RV可以感染肠嗜铬细胞瘤（EC），诱导EC释放血3 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言清素（5-羟色胺），作用于肠神经系统，通过迷走神经刺激大脑，导致患病动物恶心呕吐(Hagbometal.,2011)。1.3轮状病毒蛋白RV基因组的11个片段，可编码6种结构蛋白(VP1-VP4、VP6和VP7)和5-6种非结构蛋白(NSP1-NSP5/NSP6)。1.3.1轮状病毒结构蛋白VP1是RVRNA依赖的RNA聚合酶，VP2促进病毒装配，VP3具有鸟苷酸转移酶活性，能够促进mRNA成熟。VP4位于RV病毒粒子的最外层衣壳，在RV感染时被胰蛋白酶切割成VP5和VP8两个蛋白，具有血凝素作用，能够与宿主细胞受体结合，决定RV毒力，也是病毒保护性抗原之一。VP6由轮状病毒第6片段编码，在RV粒子中含量最为丰富，占病毒总量的51%，分子量约42kDa。VP6是RV的群抗原和亚群抗原，可根据VP6对RV进行血清学分类(殷震,1997)。根据RV毒株的不同，VP7蛋白可由轮状病毒的第7、8或9片段编码，是位于RV粒子最外层的糖蛋白，分子量约为37kDa，占病毒蛋白总量的30%。VP7是RV的中和抗原。1.3.2轮状病毒非结构蛋白NSP1由RV第5片段编码，是一种富有半胱氨酸的金属蛋白，其具有丰富的基因多样性，能够调节干扰素调节因子(Dunnetal.,1994)。NSP2由RV第7片段编码，能结合RVssRNA，促进病毒复制，还能促进NSP5的磷酸化。根据毒株的不同，NSP3由RV的第7、8或9片段编码，参与+RNA的运输(李学荣,2000)。NSP4由RV第10片段编码，分子量约为28kDa，是一种跨膜糖蛋白，也是一种具有致病性的肠毒素。NSP5和NSP6均由RV第11片段编码，目前认为NSP6对于RV的复制不是必须的，NSP5将在下一节详细介绍。1.3.3轮状病毒NSP5RV的NSP5由第11片段编码，第11片段是轮状病毒基因组中唯一能够编码两种蛋白的基因，其余的每条基因片段只含有一个开放阅读框(openreadingframe,ORF)，只能编码一种蛋白。NSP5是保守的酸性蛋白，其N-端为无规则卷曲(Martinetal.,2011)；其C-端为两亲性α-螺旋，可参与NSP5十聚体形成的（187-198aa）；NSP5共有2个随机结构域：其103-146aa可形成二聚体结合域。以上的特性使NSP5具有细长的结构(Martinetal.,2011)。在NSP5的两个随机结构域之间包含两个富碱性结构域，两个富碱性结构域之间插有一个富酸性结构域。NSP5是一个富有丝氨酸和苏氨酸磷酸化位点的二聚体蛋白。NSP5的翻译后修饰有O-糖基化和磷酸化(Gonzalezand4 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言Burrone,1991;Welchetal.,1989)。目前研究表明，NSP5的磷酸化受细胞因子的调控，而NSP5的磷酸化是通过其ATP酶活性水解高度磷酸化的NSP2，再利用其磷酸自激酶活性来完成NSP5自身的磷酸化(Afrikanovaetal.,1998;Bar-Magenetal.,2007)。有研究认为，NSP5的磷酸化调控mRNA从转录到翻译的命运(Chnaidermanetal.,2002)，也可能与RNA的选择性包装有关(Poncetetal.,1997)。也有实验证明NSP5对RV基因组的复制很重要：通过RNA干扰技术下调NSP5的表达，能够明显降低dsRNA合成(Campagnaetal.,2005;Lopezetal.,2005)。NSP5不仅能与ssRNA结合，还可与dsRNA结合，且不具有序列特异性(Vendeetal.,2002)。NSP5还能与多种RV蛋白结合，包括RNA依赖的RNA聚合酶VP1、核心蛋白VP2(Arnoldietal.,2007)，而VP1和VP2是病毒复制的关键蛋白，并且被招募进入病毒质中(McDonaldandPatton,2011;Trasketal.,2012)。NSP5还与NSP6和NSP2存在相互作用(Torres-Vegaetal.,2000)。在未感染RV的细胞中，共转染NSP5基因和NSP2基因时，NSP5与NSP2能够结合形成颗粒状的类病毒质（viroplasm-like）样结构，被称为VLS(Fabbrettietal.,1999)。有研究认为NSP5能通过其钙结合域DxDxDx与钙结合，进而调控VLS的形成(Senetal.,2007)。另有文献报道显示NSP5具有[2Fe-2S]铁硫簇结构域，且该结构域在RVA、RVC和RVD中具有保守性(Martinetal.,2013)。经SDS-PAGE分析发现，NSP5共有三种亚型，由于发生了不同程度的磷酸化，其大小分为26、28和35kDa(Afrikanovaetal.,1998)。在磷酸酶的作用下，高度磷酸化的NSP5可转化为低磷酸化的NSP5。在体外，NSP5能被酪蛋白激酶(CK)家族的成员磷酸化(Eichwaldetal.,2004)，在RV感染的细胞中，PKC抑制剂能减少高磷酸化的NSP5，增加RV蛋白的翻译(Chnaidermanetal.,2002)。而且有文献报道称磷酸激酶和磷酸酶在NSP5的磷酸化过程中是相对平衡的(Senetal.,2007)。1.4β-tubulin的分子特性β-微管蛋白是真核细胞中一种进化相对保守的球形蛋白，在细胞中主要有两种存在形式，一种是胞浆中游离的β-tubulin，另一种是组装到微管上的β-tubulin。游离的β-tubulin能与α-tubulin组装成微管，微管是细胞骨架成分之一，它们不断地在微管的一端聚合，同时在微管的另一端解聚，正常生理环境下，细胞中微管的聚合与解聚具有动态平衡性(翟中和,2011)。α-tubulin和β-tubulin是结构非常相似的球蛋白亚基，也是组装微管的基本结构单位。细胞中游离的微管蛋白主要以α、β-tubulin异二聚体的形式存在。α-tubulin共450aa，β-tubulin共455aa。两种微管蛋白C-端都为酸性氨基酸，所以微管表面带有负电荷。微管蛋白的翻译后修饰主要有乙酰化、磷酸化、甲基化。其中微管结合蛋白的选择性结合可能参与微管的乙酰化。在进化上，微管蛋白十分保守，从单细胞生物到哺乳动物，微管蛋白都是最保守的蛋白之一。在功能性结构域方面，α-tubulin有一个不可交换位点（nonexchangeablesite，N位点），其实是一个GTP结合位点，由于构象的原因，该位点上的GTP一般不会水解下来，也因此而得名。而β-tubulin上的GTP结合位点是可交换位点（exchangeablesite，E位点），当α、β-tubulin异二聚体组装到微管上后，其上的GTP被水解成GDP；而微管解聚时，β-tubulin上的GDP会被GTP替换，随后再参与微管的组装。除此之外，微管蛋白上还有二价阳离子结合位点、秋水仙素结合位点以及长春花碱5 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言结合位点(Luetal.,2012)。微管蛋白一般是多基因编码的，例如在哺乳动物基因组内，有6种以上的基因可以编码α-tubulin和β-tubulin，并且他们编码的微管蛋白具有相似的序列和结构。虽然不同亚型的微管蛋白在体内具有不同的亚细胞定位和功能，但在体外却能共同组装成微管。微管的结构如图1.2，α-tubulin和β-tubulin串联排列组成原纤丝(protofilament)，13根原纤丝合拢后组成微管壁，这也是电镜下微管截面呈13个球形蛋白亚基的原因。这样的排列导致微管的一端是α-tubulin，而另一端是β-tublin，因此微管具有极性,。由于这种结构上的不对称，微管组装时两端的组装速度有所差异，通常将组装较快的一端称为正极(plusend)，组装较慢的一端称为负极(minusend)。微管一般从微管组织中心延伸，相对稳定的微管负极锚定在微管组织中心，而快速生长的微管正极则向外辐射。图1.2微管的组成与结构(翟中和,2011)Fig.1.2Compositionandstructureofmicrotubules(ZhongheZhai,2011)1.5β-tubulin及微管的功能1.5.1β-tubulin在病毒感染中的作用病毒具有寄生性，它编码有限数量的基因，需要利用或破坏宿主细胞的某些机制来支持它们在细胞、组织或有机体之间的复制和传播。而且，病毒一旦进入细胞，就需要运输到特定的亚细胞位点进行复制，子代病毒还需经过细胞内的转运才能离开受感染的细胞。大量研究表明，许多动物病毒的逆行和顺行转运是由微管及其相关的马达蛋白协助完成的(DoddingandWay,2011;Dohneretal.,2005)。并且，许多病毒已经适应了细胞内依赖微管的转运机制。不同的病毒有不同的复制策略，对微管及马达蛋白的利用程度也有所差异。一些病毒利用微管转运系统将其核酸/蛋白质核心转移到细胞内特定的病毒复制部位，还有一些病毒利用细胞微管6 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言骨架将新组装的子代病毒转移到细胞质膜上，以促进其扩散到周围的细胞和组织中，有些病毒需要破坏微管运输系统，促进其自身复制和传播(GreberandWay,2006;Hirokawa,1998;Ward,2011)。一些研究中，使用破坏微管的药物后，病毒复制能力下降，说明微管对于这些病毒的复制是必须的。一些研究通过活细胞成像技术，将病毒标上荧光，根据病毒粒子运动的速度和轨迹，从而推断微管在病毒感染中的作用(BrandenburgandZhuang,2007;GreberandWay,2006;Seisenbergeretal.,2001;Willard,2002)。有时，将病毒粒子和微管同时标有荧光，在活细胞成像下能够观察到病毒在微管上移动(McDonaldetal.,2002;Rietdorfetal.,2001;Suomalainenetal.,1999)。一些研究通过细胞免疫荧光分析，证实了许多病毒能在复制的不同阶段与微管结合(GreberandWay,2006;Radtkeetal.,2006)。目前已知许多病毒都有与马达蛋白相关的组分(Bremneretal.,2009;GreberandWay,2006;Rietdorfetal.,2001;Sodeiketal.,1997)。可见，微管在病毒感染过程中具有重要意义——决定病毒如何招募和调节其自身活动。1.5.2微管的物质运输功能微管作为细胞骨架之一，其功能十分复杂，其中最主要的功能是负责细胞中的物质运输。在真核细胞中，生物大分子的合成部位和其发挥功能的部位往往并不一致，所以细胞需要精准的物质转运和分选系统，微管为细胞中生物大分子和细胞器提供了运输“轨道”。在光学显微镜下，常观察到细胞器或囊泡沿着微管运动。这种依赖微管的物质运输不仅具有方向性，还需要马达蛋白携带被运输的“货物”与微管蛋白结合，同时需要ATP提供能量。依赖微管的马达蛋白主要有胞质动力蛋白(cytoplasmicdynein，CyDn)和驱动蛋白(kinesin)。一般所说的驱动蛋白指由神经元轴突分离到的、能沿着微管运动的，却有别于动力蛋白和肌球蛋白的马达分子，其结构类似Ⅱ型肌球蛋白。在驱动蛋白的头部具有微管结合位点以及ATP结合位点。驱动蛋白既能沿着微管由微管正极向微管负极运动，又能沿着微管由微管负极向微管正极移动，有的驱动蛋白还能与微管正极或负极结合，使微管处于不稳定的状态。胞质动力蛋白也含有ATP结合位点和微管结合位点，能够水解ATP并沿微管运动，它是已知的最大、移动速度最快的马达蛋白。在细胞间期，微管的主要功能是在细胞内进行物质运输(GoldsteinandYang,2000;Hirokawa,1998)。该功能依赖于马达蛋白与各种“货物”结合(AkhmanovaandHammer,2010;HirokawaandTakemura,2005;Muresan,2000)，通过水解ATP沿着微管进行转运(GennerichandVale,2009;Hirokawa,2011)。胞质动力蛋白和驱动蛋白能识别微管的极性(Pfisteretal.,2005)，并沿着微管运动。大多数马达蛋白携带着“货物”沿着微管做着重复的运动（由构象变化引起）——即马达亚基不断地与微管结合/释放，从而实现位移(Cross,2004;YildizandSelvin,2005)。这种通过马达蛋白携带完成运输的“货物”，其转运一般还需要借助反面高尔基体衍生出的转运囊泡。此外，马达蛋白还可转运无囊泡的“货物”，如胞质蛋白复合物，包括细胞骨架聚合物(Brown,2003)、RNA蛋白复合物、脂质小液滴(Welteetal.,1998)。感染细胞的病原能够劫持细胞的转运机制完成其自身的复制传播(DoddingandWay,2011;Hsiehetal.,2010)。马达蛋白也能运输体积较大的、功能较强的超分子组件和粒子(Scottetal.,2011)，如核糖体(Bartolietal.,2011)。无论货物的性质如何，其转运机制基本相同，无论是较大物质的运输还是前文所述的囊泡运输，都由马达蛋白携带货物7 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言沿微管轨道运动。当“货物”在微管上运输时，微管常发生波动，细胞骨架整体可能在或大或小的范围内发生波动性重新排，并可能导致正在运输的“货物”以及固定在微管上的细胞器发生一致性的位移。微管波动包括微管滑过邻近微管和微管的弯曲，微管的弯曲常导致微管侧向位移。微管发生波动的可能原因是，携带“货物”的囊泡通过不同的马达蛋白，同时附着在两个或更多的微管上，使微管发生交联(Kulicetal.,2008)。由于微管波动的随机性，使其被控制的可能性不大，它对有目的的“货物”运输影响也不大。然而，微管的这种波动可能对细胞内局部区域的细胞器的整体分布很重要。此外，内质网高尔基体中间隔室到高尔基体的正向运输和从高尔基体到内质网的逆向运输，都需要转运货物的囊泡与微管骨架结合(Palmeretal.,2005)。1.6β-tubulin的相关抑制剂1.6.1诺考达唑诺考达唑(Nocodazole)是20世纪70年代DeBrabander和其同事发现的一种抑制微管聚合的药物(DeBrabanderetal.,1976)。诺考达唑相对不溶于水，一般溶解于DMSO后冷冻保存（常规储存浓度为10mM）。尽管诺考达唑化学性质稳定，但当诺考达唑储存液解冻时，DMSO会发生沉淀，为保证药物剂量准确，需要混匀后再使用。一般诺考达唑储存液加热到50℃后会重新溶解，当把诺考达唑的DMSO储存液加入培养基时，也容易产生沉淀，需要仔细混匀以确保溶解。其实，在解聚微管的作用上，诺考达唑的效果不如其他天然药物，这和其水溶性差不无关系。所以一些研究中常用康普瑞汀(CombretastatinA4)或秋水仙胺等类似药物，来解聚组织培养细胞的微管网络。尽管诺考达唑并没有被临床使用，但它可能是基础细胞生物学研究中使用最多的微管解聚药物。诺考达唑能结合β-微管蛋白，常用于阻滞哺乳动物细胞有丝分裂，将其停滞在细胞间期/G1期。有研究显示，当诺考达唑浓度大于500nM时，细胞中微管大量解聚，几乎不存在微管网络，细胞周期被阻滞在间期，有丝分裂停滞，但对有丝分裂激酶具有负调控作用。1.6.2ABT-751ABT-751是一种磺胺类药物，能与β-tubulin的秋水仙素结合位点结合，一定浓度下，抑制微管的聚合，对微管动力学的破坏导致了细胞周期G2/M期的阻滞。高浓度的ABT-751能促进细胞凋亡(Meanyetal.,2010)，但不抑制MDR转运的底物，且对抗Vincristine、Doxorubicin和Cisplatin的细胞系有效。同时与大多数微管抑制剂一样，ABT-751也具有抗癌功效。体外研究报道显示，ABT-751作用于神经母细胞瘤时，IC50为0.6-2.6μM，作用于其他实体瘤细胞系时，IC50为0.7–4.6μM。有研究显示，在临床治疗肿瘤上，ABT-751对微管的影响具有时间和剂量依赖性，而与肿瘤类型无关。8 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言1.6.3紫杉醇紫杉醇是一种从太平洋紫衫树皮及树干中提取的抗癌药物(Wanietal.,1971)。是一种四环二萜化合物，其化学名为5β,20-环氧-1,2α,4,7β,10β,13α-刘羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4,10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13-（2’R,3’S）-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯，分子式为C47H51NO14，分子量为853.92。其固态为白色粉末，易溶于乙醇、二甲基亚砜、三氯甲烷等有机溶剂，几乎不溶于水。紫杉醇能够抑制微管解聚，影响纺锤体的形成。其作用机理是，正常生理条件下微管的聚合需要GTP，但是紫杉醇能够在细胞缺少GTP的情况下使微管蛋白聚合，并能使聚合后的微管稳定而不解聚。紫杉醇更易与组装好的微管结合，而不易与游离的微管蛋白结合，紫杉醇能在微管内表面上与β-微管蛋白N-端结合，并且这种结合是可逆的。在较低浓度的紫衫醇作用下，微管能够稳定而不解聚，在较高浓度的紫杉醇作用，微管的聚合能力则增强，具体的临界浓度随着细胞不同而有所差异(Kellingetal.,2003)。高浓度的紫杉醇能够诱导细胞中DNA断裂，引起细胞发生凋亡。此外，紫杉醇还能诱导细胞内肿瘤坏死因子α的基因表达，促进Raf-1激酶和MAP激酶的磷酸化(Lietal.,2001)。1.7NSP5与β-tubulin相关的研究进展RV复制和病毒装配发生在病毒质中。病毒质主要成分是病毒蛋白NSP5和NSP2(Continetal.,2010)，在病毒感染的早期产生，通过逐步添加和融合病毒蛋白而生长，但是病毒质形成的机制尚不清楚。微管是细胞骨架的组分，在细胞运输中起着核心作用。有研究证明，RV病毒质能与微管共定位，并似乎被微管网络包围(Cabral-RomeroandPadilla-Noriega,2006)。目前关于NSP5与微管蛋白间的相互作用存在争议，一方面实验证明使用T7重组痘苗病毒表达系统共转染NSP5和NSP2，以β-tubulin为诱饵蛋白进行Co-IP试验，证明共同表达NSP2和NSP5的细胞裂解物中的，NSP2和NSP5能与微管蛋白发生免疫共沉淀且当NSP2和NSP5共同表达时，形成类病毒结构。研究人员认为VLS通过NSP2和NSP5中的任意一个或两者与微管结合，而构成RV的其他病毒蛋白或RNA似乎不是RV与微管结合所必需的(Martinetal.,2010)。另有研究者证明，当NSP2、NSP5、VP1、VP2与微管蛋白同时存在时，能够发生免疫共沉淀(Cabral-RomeroandPadilla-Noriega,2006)。另一方面，有研究人员认为，NSP5的高度磷酸化使其带有负电荷，微管也带有负电荷，两者的相互作用是不可能的，该研究者，使用轮状病毒SA11-4F株，用纯化的NSP2蛋白质，证明微管蛋白能直接与SA11-4F株的NSP2在体外相互作用，但不与NSP5相互作用(Criglaretal.,2014)。1.8本研究的目的意义早前有研究通过免疫荧光显微镜技术发现，RV病毒质被微管网络包围(Cabral-RomeroandPadilla-Noriega,2006)，提示RV病毒质的某些组分可能与微管蛋白存在相互作用，且有研究证明9 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言RV的NSP5是形成RV病毒质的主要组分之一（Fabrettietal.,1999），因此本研究探究了NSP5是否与微管蛋白存在相互作用。另一方面，有研究显示敲低NSP5能够抑制RV复制(Lopezetal.,2005)，说明NSP5对RV复制具有重要作用，并且微管蛋白与多种病毒蛋白存在相互作用，并对病毒复制产生复杂的影响。因此我们进一步探究了微管蛋白对RV复制的影响。这一研究成果将有助于我们了解NSP5在RV复制中的功能，深入RV复制的分子机制研究，也为研制RV疫苗和药物提供新的分子靶标。10 中国农业科学院硕士学位论文第二章A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株NSP5与β-tubulin互作的研究第二章A群PoRVG9P[23]型毒株NSP5与β-tubulin互作的研究NSP5能够招募多种RV蛋白组装成病毒质——病毒复制工厂，对RV的复制十分重要，但目前针对NSP5与宿主细胞蛋白相互作用的研究十分有限，对其调控RV复制的分子机制尚不清楚。探索与RVNSP5相互作用的宿主细胞蛋白，有助于深入了解NSP5在RV复制中的功能。本研究通过GSTpull-down和蛋白质谱分析技术，证明NSP5能够与MA104细胞中的β-tubulin相互作用，并通过免疫共沉淀技术(Co-IP)和激光共聚焦扫描显微镜技术进行了验证。2.1实验材料2.1.1毒株和细胞本章研究对象为本实验室分离保存的A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株。本章主要使用两种细胞，均为轮状病毒易感细胞，具体如下：恒河猴肾细胞(MA104细胞)由本实验室保存，培养条件为含10%胎牛血清(FBS)的RPMIMedium1640basic(1×)培养基，37℃含5%CO2细胞培养箱中培养；SV40转化的非洲绿猴肾细胞COS-7，购自ATCC细胞库，使用含10%胎牛血清(FBS)的DMEMbasic(1×)的培养基培养，培养环境为37℃含5%CO2的细胞培养箱中培养。2.1.2主要仪器与设备表2.1主要仪器和设备Table2.1Theinstrumentsandfacilities仪器（设备）名称生产厂家DYY-6C型电泳仪六一仪器厂Centrifuge5424型小型高速离心机德国EppendorfThermoStatplus连接仪德国EppendorfGelDoc凝胶成像分析系统美国Bio-RadAvantiJ-26XPI大型离心机美国BeckmanBCN-1360B型生物洁净工作台东联哈尔仪器制造有限公司台式生物安全柜美国Thermo蛋白电泳系统美国Bio-RadTrans-SD通用型半干转印电泳槽美国Bio-Rad超声细胞破碎仪ULTRASONIC美国ColeParmer激光共聚焦扫描系统LSM880德国蔡司近红外荧光扫描成像系统美国Li-CorMonoclonalAnti-β-Tubulinantibodyproducedinmouse美国Sigma11 中国农业科学院硕士学位论文第二章A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株NSP5与β-tubulin互作的研究2.1.3主要试剂NSP5单抗5E11由本实验室制备。GSTBindingBuffer(500mL):2.92gNaCl、1mL0.5MEDTA、25mL1MTris(pH8.0)、5mLTritonX-100、2.5mL1MDTT。GSTElutionBuffer(100mL):0.615g还原型谷胱甘肽、10mL1MTris(pH8.0)。表2.2试剂Table2.2Thereagents名称生产厂家optiDMEM美国GibcoRPMIMedium1640basic(1×)美国GibcoDMEMbasic(1×)美国Gibco胎牛血清美国Gibco0.25%胰酶美国GibcoLipofectamine2000Reagent转染试剂美国ThermoAnti-betaTubulin抗体-LoadingControl(ab6046)英国AbcamAnti-c-Myc抗体[Y69](ab32072)英国AbcamAnti-DDDDKtag抗体(ab1162)英国AbcamAnti-Myctag抗体[9E10]-ChIPGrade(ab32)英国AbcamMonoclonalANTI-FLAG®M2antibodyproducedinmouse美国SigmaGoatanti-MouseIgG(H+L)HighlyCross-AdsorbedSecondaryAntibody,AlexaFluor633美国ThermoBamHI、XhoI限制性内切酶美国NEBT4DNA连接酶美国NEBAxyPrep质粒DNA小量试剂盒美国AxygenE.Z.N.A.™GelExtractionKit美国OmegaPierceProteinA/GMagneticbeads美国PierceEndoFreePlasmidMaxiKit德国QiagenBCA蛋白浓度测定试剂盒美国ThermoIRDye@800RDgoatanti-mouseIgG美国Li-CorTransBL21(DE3)化学感受态细胞北京全式金生物Trans5α化学感受态细胞北京全式金生物IP裂解液美国Thermo2.1.4引物本章中PCR扩增β-tubulin、NSP5基因所使用的引物情况如表2.3。12 中国农业科学院硕士学位论文第二章A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株NSP5与β-tubulin互作的研究表2.3β-tubulin与NSP5引物的序列及其目的片段大小Table2.3Sequencesofβ-tubulinandNSP5primersandtheirtargetfragmentsize目的片段名称引物名称引物序列片段长度Red-Tubb-F5'CGCTCGAGATGAGGGAAATCGTGCACATCCAGG3'Red-β-tubulin1335bpRed-Tubb-R5'GTGAATTCGGGCCTCCTCTTCGGCCTCCTC3'EGFP-NSP5-F5'ATCTGGATCCTCTCTCAGCATTGACGTAACG3'EGFP-NSP5594bpEGFP-NSP5-R5'GAACTCGAGTTACAAATCTTCGATCAATTGCATT3'Myc-NSP5-F5'ATCTGAATTCGGTCTCTCAGCATTGACGTAACG3'Myc-NSP5594bpMyc-NSP5-R5'GTCTCGAGTTTACAAATCTTCGATCAATTGCATT3'Flag-Tubb-F5'GAGAATTCAAGGGAAATCGTGCACATCCAGGC3'Flag-β-tubulin1335bpFlag-Tubb-R5'GTGGTACCTTAGGCCTCCTCTTCGGCCTCCTC3'2.2实验方法2.2.1GSTpull-down试验通过GST-NSP5捕获MA104细胞中的蛋白，初步获得能与NSP5相互作用宿主细胞蛋白，具体步骤分为以下两方面：一、GST-NSP5的原核表达及纯化1)将pGEX-6p-NSP5重组质粒与pGEX-6p-1质粒分别转化TransBL21(DE3)化学感受态细胞。2)挑取单个克隆到含有5mLLB培养基(100μg/mlAmp)的10ml试管里，37℃培养过夜3)将培养菌液转移到含有500mLLB(100μg/mlAmp)的1L锥形瓶中，37℃，225rpm培养至OD600≈0.6-0.8左右，加入1μM的IPTG，16℃，160rmp培养过夜。6000g、4℃离心15min，弃上清，收集菌体沉淀。4)沉淀中加入50mLPBS（含1%Triton-100），吹打混匀5)冰上超声破碎，开2s，停6s，总40min，至裂解液变的澄清。6)11000rpm、4℃离心15min，保留上清。7)4℃下，将上清与1mL琼脂珠GlutathioneSepharoseTM4B在蛋白纯化柱中，垂直摇床上孵育4h。8)4℃下，弃去液体，用20mLGSTBindingBuffer洗涤柱子3次，每次5min。9)4℃下，用3mLGSTElutionBuffer洗涤柱子2次，收集洗涤液即为纯化好的GST-NSP5和GST蛋白，-80℃保存。二、捕获与GST-NSP5相互作用的宿主细胞蛋白1)4℃下，在1.5mLEP管中，分别取1mL浓度为0.5μg/μL的GST-NSP5和GST蛋白，再分别与50μL琼脂珠GlutathioneSepharoseTM4B在垂直摇床上孵育4h。2500rmp离心5min，留沉淀备用。13 中国农业科学院硕士学位论文第二章A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株NSP5与β-tubulin互作的研究2)4℃下，收集2瓶长满单层的75cm2细胞瓶的MA104细胞，PBS洗2次，各用1mLIP裂解液裂解并收集细胞裂解液。3)4℃下，用GST蛋白孵育的琼脂珠GlutathioneSepharoseTM4B，与细胞裂解液孵育2h，2500rmp离心5min，再收集上清留用，以去除阴性反应。4)4℃下，将细胞上清与第一步中的琼脂珠，孵育6h。5)4℃下，2500rmp离心5min，收集琼脂珠。6)4℃下，PBS洗琼脂珠4次，每次2500rmp离心5min，收集琼脂珠。7)分别在GST-NSP5和GST蛋白样品的沉淀中加50μLPBS和12.5μL5×SDS蛋白上样缓冲液，沸水中煮10min。对样品进行SDS-PAGE分析；对可能发生相互作用的蛋白质谱分析后，使用β-tubulin商品化抗体MonoclonalAnti-β-Tubulinantibodyproducedinmouse对可疑蛋白进行WesternBlot分析。2.2.2蛋白质谱分析通过GSTpull-down试验，捕获可能与A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株NSP5相互作用的宿主细胞蛋白，并对可能蛋白送至上海厚基生物科技有限公司进行蛋白质谱分析。2.2.3免疫共沉淀(Co-IP)试验2.2.3.1外源表达NSP5与β-tubulin的Co-IP试验结果PCR扩增MA104细胞中的β-tubulin基因，连接到p3×flag-CMV-10载体上，构建能够表达Flag-β-tubulin重组蛋白的重组质粒p3×flag-β-tubulin；PCR扩增A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株的NSP5基因，连接到pCMV-Myc载体上，构建能够表达Myc-NSP5重组蛋白的重组质粒pCMV-Myc-NSP5，利用质粒大提试剂盒EndoFreePlasmidMaxiKit对重组质粒大提。用Lipofectamine2000Reagent转染试剂将p3×flag-β-tubulin与pCMV-Myc-NSP5重组质粒共转染于COS-7细胞，同时设立对照组p3×flag-β-tubulin与pCMV-Myc共转染于COS-7细胞，及p3×flag-CMV-10与pCMV-Myc-NSP5共转染于COS-7细胞。72h后进行Co-IP试验，具体如下：1)4℃下，用预冷的PBS洗涤细胞2次，并吸干PBS，用预冷的IP裂解液(1mL/107个细胞)充分裂解细胞，约5min。2)4℃下，把细胞裂解液转到1.5mLEP管中，垂直摇床摇30min。3)4℃下，12000g离心15min，立即将上清转移到新的离心管中。5)准备磁珠PierceProteinA/GMagneticbeads，PBS洗2遍珠子。6)4℃下，去除阴性反应，每1ml细胞裂解液加入50μL磁珠PierceProteinA/GMagneticbeads及1μL阴性IgG，摇晃2h，以去除非特异性结合的杂蛋白，降低背景。7)4℃下，用磁力架捕获磁珠，将上清转移到一个新的EP管中，去除磁珠。8)4℃下，加入捕获抗体：捕获Myc-NSP5用1μL兔抗Myc抗体Anti-c-Myc抗体[Y69](ab32072)，垂直摇床摇晃6h。9)4℃下，用磁力架捕获磁珠，弃掉上清，用PBS洗磁珠3次，每次5min。14 中国农业科学院硕士学位论文第二章A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株NSP5与β-tubulin互作的研究10)最后弃去上清，在磁珠沉淀中加入50μLPBS和12.5μL5×SDS蛋白上样缓冲液，沸水中煮样10min。注：以上是以Myc-NSP5为诱饵蛋白，捕获Flag-β-tubulin蛋白，反向验证为以Flag-β-tubulin蛋白为诱饵蛋白，捕获Myc-NSP5，方法同上，只是捕获抗体改为Anti-DDDDKtag抗体(ab1162)。最后对样品进行WesternBlot分析，为了避免在WesternBlot检测中捕获抗体的轻重链对目的条带的背景干扰，本实验中使用了不同宿主物种的捕获抗体和检测抗体，检测Flag-β-tubulin用小鼠源的MonoclonalANTI-FLAG®M2antibodyproducedinmouse抗体，检测Myc-NSP5用小鼠单抗Anti-Myctag抗体[9E10]-ChIPGrade(ab32)。2.2.3.2内源表达NSP5与β-tubulin的Co-IP试验MA104细胞长满单层后，感染0.1MOI的A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株(25代)，对照组不接毒，24hpi(hourpostinfection)收集细胞，用于Co-IP试验，方法同上，见本章2.2.3.1，但捕获抗体有所不同，以β-tubulin为诱饵蛋白时，捕获抗体为兔抗β-tubulin的商品化抗体，购自Abcam公司的抗体Anti-betaTubulin抗体-LoadingControl(ab6046)。最后对样品进行WesternBlot分析。为了避免在WesternBlot检测中捕获抗体的轻重链对目的条带的背景干扰，本实验中尽量使用不同宿主物种的捕获抗体和检测抗体，以β-tubulin为诱饵蛋白时，检测β-tubulin用小鼠源MonoclonalAnti-β-Tubulinantibodyproducedinmouse的抗体，检测NSP5用小鼠单抗5E11检测。2.2.4激光共聚焦试验2.2.4.1激光共聚焦扫描显微镜观察外源表达的NSP5与β-tubulinPCR扩增MA104细胞的β-tubulin基因，连接到pDsRED-N1质粒载体上构建能够表达Red-β-tubulin重组蛋白的重组质粒pDsRED-β-tubulin；PCR扩增A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株NSP5基因，连接到pEGFP-N1载体上，构建能够表达EGFP-NSP5重组蛋白的重组质粒pEGFP-NSP5，利用质粒大提试剂盒EndoFreePlasmidMaxiKit对重组质粒大提，并-20℃保存，以用于转染。用Lipofectamine2000Reagent转染试剂将pDsRED-β-tubulin与pEGFP-NSP5重组质粒共转染于COS-7细胞，同时设立对照组pEGFP-NSP5与pDsRED-N1共转染于COS-7细胞，及pDsRED-β-tubulin与pEGFP-N1共转染于COS-7细胞。转染36h后，4%多聚甲醛固定细胞，4℃固定30min，弃去固定液，PBS洗2遍；DAPI染核20min，PBS洗2遍，激光共聚焦扫描显微镜观察分析结果。2.2.4.2激光共聚焦扫描显微镜观察内源表达的NSP5与β-tubulinMA104细胞感染0.1MOI的A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株（25代），对照组不接毒，8hpi时甲醇固定细胞，4℃固定30min，弃去固定液，PBS洗2遍；用含0.25%TritonX-100的PBS透膜10min，PBS洗2遍；5%脱脂乳，37℃封闭2h，PBS洗2遍；一抗为β-tubulin的AlexaFluor®15 中国农业科学院硕士学位论文第二章A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株NSP5与β-tubulin互作的研究488指标抗体Anti-betaTubulin抗体[EPR16774](AlexaFluor®488)，1:100PBS稀释使用，小鼠单抗5E11腹水1:500稀释使用，一抗混合孵育37℃、2h，PBST洗3遍；二抗为Goatanti-MouseIgG(H+L)HighlyCross-AdsorbedSecondaryAntibody、AlexaFluor633，1:300PBS稀释使用，37℃孵育1h；PBST洗3遍；DAPI染核20min，PBS洗2遍，激光共聚焦扫描显微镜观察分析结果。2.3实验结果2.3.1GSTpull-down试验及蛋白质谱分析结果本探究通过GSTpull-down试验，以原核表达纯化的GST-NSP5为诱饵蛋白，捕获MA104的细胞蛋白，经SDS-PAGE试验分析,发现能特异性与A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株NSP5相互作用的宿主细胞蛋白，其大小为55kDa左右（如图2.1A），将其送至上海厚基生物科技有限公司进行质朴分析，结果显示该蛋白为β-tubulin，大小与预期相符（表2.4）。同时通过WesternBlot分析，证明通过GSTpull-down试验获得的能与NSP5相互作用的宿主细胞蛋白是β-tubulin（如图2.1B）。以上结果说明原核表达的NSP5与宿主细胞β-tubulin存在相互作用。2.3.2外源表达NSP5与β-tubulin的Co-IP试验结果为了进一步验证NSP5与宿主细胞β-tubulin相互作用，本研究将p3×flag-β-tubulin与pCMV-Myc-NSP5重组质粒共转染于COS-7细胞，使该细胞同时表达Flag-β-tubulin和Myc-NSP5两个重组蛋白。首先以Flag-β-tubulin蛋白为诱饵蛋白，经Co-IP试验和WesternBlot分析，证明Myc-NSP5能够与Flag-β-tubulin发生免疫共沉淀（如图2.2）；同时，以Myc-NSP5蛋白为诱饵蛋白，经Co-IP试验和WesternBlot分析，证明Flag-β-tubulin能够与Myc-NSP5发生免疫共沉淀（如图2.3）。说明真核表达的A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株NSP5与宿主细胞β-tubulin存在相互作用。2.3.3内源表达NSP5与β-tubulin的Co-IP试验结果为了进一步验证PoRV感染宿主细胞时NSP5与β-tubulin是否存在相互作用，本研究使用A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株感染的MA104细胞，以β-tubulin为诱饵蛋白，对感染PoRV的细胞进行进行Co-IP试验，发现NSP5能够与β-tubulin发生免疫共沉淀，说明A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株感染时其NSP5与MA104细胞β-tubulin存在相互作用（如图2.4）。表2.4GSTpull-down试验的蛋白质谱分析结果Table2.4TheresultsofGSTpull-downassaybyproteinmassspectrometry蛋白名称NCBI登录号最高得分质量大小β-tubulinqi|35959(人源)128Mass：49799（符合）16 中国农业科学院硕士学位论文第二章A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株NSP5与β-tubulin互作的研究图2.1GSTpull-down试验证明NSP5与β-tubulin的相互作用。A：SDS-PAGE分析GSTpull-down的试验结果。B：WesternBlot分析GSTpull-down的试验结果。Fig.2.1TheverificationofNSP5interacedwithβ-tubulinbySDS-PAGEandWesternBlot.(A)TheresultsofGSTpull-downbySDS-PAGEanalysis.(B)WesternBlotanalysisofGSTpull-downtestresults.图2.2Co-IP验证外源表达的NSP5与β-tubulin存在相互作用（Flag-β-tubulin为诱饵蛋白）。Fig.2.2TheverificationofNSP5interacedwithβ-tubulinbyCo-IP(Flag-β-tubulinwasbaitprotein).2.3.4激光共聚焦扫描显微镜观察外源表达的NSP5与β-tubulin的结果为了充分证明A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株NSP5与β-tubulin的相互作用，本研究通过17 中国农业科学院硕士学位论文第二章A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株NSP5与β-tubulin互作的研究在COS-7细胞中过表达的EGFP-NSP5和DsRED-β-tubulin融合蛋白，转染36h后利用激光共聚焦扫描显微镜观察，结果显示EGFP-NSP5和DsRED-β-tubulin蛋白共定位于COS-7细胞的细胞质中，而对照组的EGFP-NSP5和DsRED蛋白，以及另一对照组的EGFP蛋白和DsRED-β-tubulin蛋白都没有发生共定位（如图2.4），说明EGFP-NSP5和DsRED-β-tubulin蛋白的共定位与EGFP和DsRED标签无关，NSP5和β-tubulin共定位与细胞质中。图2.3Co-IP验证外源表达的NSP5与β-tubulin存在相互作用(Myc-NSP5为诱饵蛋白)。Fig.2.3TheverificationofNSP5interacedwithβ-tubulinbyCo-IP(Mcy-NSP5wasbaitprotein).图2.4内源表达NSP5与β-tubulin的Co-IP试验的WesternBlot结果（β-tubulin为诱饵蛋白）。Fig.2.4TheverificationofNSP5interacedwithβ-tubulinbyCo-IP(Flag-β-tubulinwasbaitprotein).2.3.5激光共聚焦扫描显微镜观察内源表达的NSP5与β-tubulin为了进一步观察在PoRV感染时，NSP5与β-tubulin的亚细胞定位情况，本研究利用A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株感染MA104细胞，病毒感染8h后固定细胞，通过激光共聚焦扫描显微镜观察，发现A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株的NSP5与MA104细胞β-tubulin共定位于细胞质中，并且NSP5仿佛依附于微管骨架之上（如图2.6）。18 中国农业科学院硕士学位论文第二章A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株NSP5与β-tubulin互作的研究MergeEGFPEGFP-NSP5DsRED-β-tubulinDAPIMergeEGFPDsRED-β-tubulinDAPIMergeEGFP-NSP5DsREDDAPI图2.5激光共聚焦扫描显微镜观察外源表达的NSP5与β-tubulin共定位与细胞质中。Fig.2.5ExogenouslyexpressedNSP5andβ-tubulinco-localizedincytoplasmbyLaserConfocalScanningMicroscope.PoRVMergeβ-tubulinNSP5DAPIMock图2.6激光共聚焦扫描显微镜观察内源表达的NSP5与β-tubulin共定位与细胞质中。Fig2.6EndogenouslyexpressedNSP5andβ-tubulinco-localizedincytoplasmbyLaserConfocalScanningMicroscope.19 中国农业科学院硕士学位论文第二章A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株NSP5与β-tubulin互作的研究2.4讨论本研究证明A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株的NSP5在体外转染和病毒感染过程中，都与宿主细胞β-tubulin存在相互作用。值得注意的是，NSP5在不同亚型RV之间的进化相对保守，提示NSP5与β-tubulin间存在的相互作用，可能在不同亚型RV中具有广谱性，而不仅限于A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株中。同时β-tubulin也是真核细胞中相对保守的蛋白，提示NSP5可能和更多种类的细胞β-tubulin存在相互作用，甚至可能在RV感染宿主时，与宿主细胞β-tubulin存在相互作用，这一发现有助于人们了解NSP5在RV感染时的生物学功能。有研究显示通过RNA干扰技术下调NSP5的表达，能够明显降低RVdsRNA的合成(Campagnaetal.,2005;Lopezetal.,2005)，并且NSP5能够招募VP1、VP2、VP3、NSP2和VP6蛋白组装成RV病毒质(viroplasm)(Cabral-RomeroandPadilla-Noriega,2006)，RV病毒质是RV复制的工厂(Continetal.,2010)，可见NSP5对RV复制的重要性。本研究证明NSP5与β-tubulin存在相互作用，提示RVNSP5与β-tubulin的相互作用可能影响RV复制，甚至影响RV病毒质的形成。本研究通过体外转染NSP5和宿主细胞β-tubulin，而后利用Co-IP试验证明，A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株NSP5与宿主细胞β-tublin存在相互作用。由于该试验中只转染了NSP5和β-tubulin，而没有其它RV蛋白的影响，因此可排除NSP5通过其它RV组分与β-tubulin发生间接相互作用的可能，即NSP5和β-tubulin的相互作用，与除NSP5以外的其它RV组分无关。此外，目前研究尚未发现β-tubulin结合RNA的报道，尽管有研究显示NSP5不仅能与ssRNA结合，还可与dsRNA结合，且不具有序列特异性(Vendeetal.,2002)。但没有β-tubulin与RNA结合，RNA将不能介导NSP5与β-tubulin的相互作用，因此NSP5与β-tubulin的相互作用与RNA无关。虽然本研究认为NSP5与β-tubulin的相互作用，不由其它RV蛋白或者RNA介导。但是我们不能排除NSP5与β-tubulin的相互作用受其它细胞蛋白的影响，如马达蛋白或者微管相关蛋白（MAPs）。事实上，有的病毒确实能够通过细胞自身蛋白与微管发生关联，如腺病毒就是在动力蛋白的介导下与微管结合(Kelkaretal.,2004)。所以我们需要进一步探究NSP5与β-tubulin的相互作用，是否某些细胞蛋白的影响。与本研究结果相似的是，Martin等人在轮状病毒RF株感染的MA104细胞中，也观察到病毒蛋白NSP2与α-tubulin颗粒共定位的现象。应当注意的是，有研究证明NSP2与NSP5存在直接相互作用(Criglaretal.,2014)，且α-tubulin与β-tubulin也存在直接相互作用，本研究证明NSP5与β-tubulin存在相互作用，且通过外源表到NSP5和β-tubulin的Co-IP试验证明这种相互作用其他病毒蛋白无关，因此本研究认为NSP2与α-tubulin颗粒共定位的现象可能是由于NSP5与β-tubulin的相互作用引起的间接相互作用，这种在细胞中相对复杂的四种蛋白的相互作用，可能具有重要的生物学意义。与本研究结果相似的是，报道显示多种病毒的蛋白都与微管蛋白存在相互作用，如已经通过Co-IP实验证实埃博拉病毒基质蛋白VP40与β-tubulin存在相互作用(Rutheletal.,2005)。并且这些病毒蛋白通过与β-tubulin发生相互作用，在病毒感染中发挥着复杂而重要功能。例如，仙台病毒M蛋白与β-tubulin存在相互作用，对仙台病毒的转录具有负调控作用(Oginoetal.,2003)；苜20 中国农业科学院硕士学位论文第二章A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株NSP5与β-tubulin互作的研究蓿银纹夜蛾核型多角体病毒AC141蛋白与β-tubulin存在相互作用，可能参与该病毒的出芽(Fangetal.,2009)；禽流感病毒H1N1NS1株蛋白与β-tubulin存在相互作用，能够诱导微管解聚。因此NSP5与β-tubulin的相互作用可能影响RV复制，因此本研究中下一章将探究NSP5与β-tubulin的相互作用对RV复制的影响。21 中国农业科学院硕士学位论文第三章β-tubulin对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制的影响第三章β-tubulin对A群PoRVG9P[23]型毒株复制的影响上一章的研究证明A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株NSP5与宿主细胞β-tubulin存在相互作用，为了进一步探究这种相互作用对RV病毒复制的影响，本章利用激光共聚焦扫描显微镜技术进一步探究了这种相互作用对细胞β-tubulin的影响，此外还探究了上调/下调表达β-tubulin以及微管抑制剂，对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制的影响。3.1实验材料3.1.1细胞、毒株和质粒本章研究对象和所用细胞与上一章相同，研究对象仍然是A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株，所用细胞仍然是恒河猴肾细胞(MA104细胞)和SV40转化的非洲绿猴肾细胞COS-7，具体参见2.1.1。PCR扩增A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株的VP6基因（序列参考：GenBankJF781162），将其连接到pMD18-T载体上，构建pMD18-T-VP6质粒。PCR扩增MA104细胞中的β-tubulin基因，连接到p3×flag-CMV-10载体上，构建能够真核表达Flag-β-tubulin蛋白的p3×flag-β-tubulin重组质粒，3.1.2主要仪器与设备本章使用的主要仪器设备见表3.1。表3.1主要仪器和设备Table3.1Theinstrumentsandfacilities仪器（设备）名称生产厂家DYY-6C型电泳仪六一仪器厂Centrifuge5424型小型高速离心机德国EppendorfThermoStatplus连接仪德国EppendorfGelDoc凝胶成像分析系统美国Bio-RadAvantiJ-26XPI大型离心机美国BeckmanBCN-1360B型生物洁净工作台东联哈尔仪器制造有限公司台式生物安全柜美国Thermo蛋白电泳系统美国Bio-RadTrans-SD通用型半干转印电泳槽美国Bio-RadELx800通用酶标仪美国BioTek荧光定量PCR仪AligentMx3005P美国AligentLicorODYSSEY近红外荧光扫描成像系统美国Li-Cor22 中国农业科学院硕士学位论文第三章β-tubulin对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制的影响3.1.3主要试剂NSP55E11单抗小鼠腹水由本实验室制备。VP61F4单抗小鼠腹水本实验室制备。本章使用的其它商品化试剂情况如表3.2。表3.2试剂Table3.2Thereagents试剂名称品牌optiDMEM美国GibcoRPMIMedium1640basic(1×)美国GibcoDMEMbasic(1×)美国Gibco胎牛血清美国Gibco0.25%胰酶美国GIbcoStealthRNAi™siRNANegativeControlLOGC美国ThermoLipofectamine2000Reagent转染试剂美国ThermoMonoclonalAnti-β-Tubulinantibodyproducedinmouse美国SigmaAnti-betaActin抗体[AC-15](ab6276)英国AbcamAnti-ac-β-tubulin美国SigmaBioRT实时荧光RT-PCR试剂盒博日科技siRNA-NC美国ThermoCellCountingKit-8(CCK-8)日本DojindoLipofectamineRNAiMAXReagent美国ThermoMonoclonalANTI-FLAG®M2antibodyproducedinmouse美国SigmaGoatanti-MouseIgG(H+L)HighlyCross-AdsorbedSecondaryAntibody,AlexaFluor633美国ThermoBamHI、XhoI、EcoRI、KpnI限制性内切酶美国NEBE.Z.N.A.™GelExtractionKit美国OmegaPierceProteinA/GMagneticbeads美国PierceEndoFreePlasmidMaxiKit德国QiagenHRP标记山羊抗小鼠IgG中杉金桥IRDye@800RDgoatanti-mouseIgG美国Li-CorTransBL21(DE3)化学感受态细胞北京全式金生物Trans5α化学感受态细胞北京全式金生物RIPA裂解液美国Thermo诺考达唑美国Sigma紫杉醇美国SelleckBFA碧云天ABT-751美国Selleck23 中国农业科学院硕士学位论文第三章β-tubulin对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制的影响3.1.4引物及siRNA序列本研究中根据MA104细胞β-tubulin的序列共设计了3条siRNA（如表3.3），并由Thermo公司合成，siRNA-NC为阴性对照，购自美国Thermo公司，货号为12935200。如表3.3MA104细胞β-tubulin的siRNA序列Table3.3ThesequenceofsiRNAofβ-tubulininMA104名称序列siRNA-15'GGCAACCAAAUUGGCGCCAAGUUCU'3siRNA-25'GAAGAGUACCCUGAUCGCAUCAUGA'3siRNA-35'AAAGCCAGGCAUAAAGAGAUGGAGG'3根据A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株VP6基因（GenBankJF781162），设计引物VP6-F和VP6-R和探针VP6probe，序列信息见表3.4，由Thermo公司合成，用于建立A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株Taqman荧光定量PCR检测方法。表3.4A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株VP6基因Taqman荧光定量PCR检测引物和探针序列Table3.3ThesequenceofprimersandprobeofTaqmanfluorescencequantitativePCRtestforgroupAPoRVVP6gene名称序列VP6probe5'TTGGAATTTACAAAACAGACGACAGCG'3VP6-F5'CCACAATCTGAAGCACTAAGGA'3VP6-R5'GCGCTGGCTGTGATCTATTC'33.2实验方法3.2.1A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株VP6基因的Taqman荧光定量PCR检测方法使用BioRT实时荧光RT-PCR试剂盒，以pMD18-T-VP6为标准品，建立A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株Taqman荧光定量PCR检测方法，使用荧光定量PCR仪AligentMx3005P，反应体系如表3.5，反应条件如表3.6。3.2.2激光共聚焦扫描显微镜试验0.1MOI的A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株感染MA104细胞6h、12h、18h和24h时固定细胞，对NSP5和β-tubulin进行免疫荧光染色，利用激光共聚焦扫描仪对样品分别进行单层扫描和逐层扫描，利用ZEN2.3软件进行图像分析拟合，具体接毒、固定及免疫荧光染色的方法实24 中国农业科学院硕士学位论文第三章β-tubulin对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制的影响验方法参照2.2.4.。同时，用2μM的诺考达唑处理MA104细胞2h后固定细胞（不接毒），并对β-tubulin进行免疫荧光染色，在利用激光共聚焦扫描显微镜观察，具体方法参考2.2.4。表3.5A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株VP6基因的Taqman荧光定量PCR检测反应体系Table3.5ThereactionsystemofTaqmanfluorescencequantitativePCRtestforgroupAPoRVVP6gene名称体积(μL)RT-PCR反应液15增强剂1.5稳定剂1.5VP6-F(20μM)0.5VP6-R(20μM)0.5VP6Probe0.25实验样品RNA5RnasefreeH2O5.75总体积30表3.6A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株VP6基因的Taqman荧光定量PCR检测反应条件Table3.6ThereactionconditionsofTaqmanfluorescencequantitativePCRtestforgroupAPoRVVP6gene反应温度反应时间循环数90℃30s1个61℃20min1个95℃1min1个95℃15s40个60℃1min3.2.3过表达β-tubulin对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制影响的探究铺MA104细胞于在6孔板中，利用Lipofectamine2000Reagent转染试剂转染p3×flag-β-tubulin于MA104细胞，对照组转染p3×flag-CMV-10空载体，转染48h后感染0.1MOI的A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株。分别在感染16h和24h后弃去细胞上清，用160μLRIPA裂解液裂解并收集细胞，加40μL5×SDS蛋白上样缓冲液，混匀后沸水煮10min，-20℃保存样品。用WesternBlot对样品中的flag-β-tubulin、NSP5、VP6和β-actin进行检测，用1:1000的NSP55E11小鼠单抗腹水检测NSP5，用1:1000的VP61F4小鼠单抗腹水检测VP6蛋白，用Anti-β-actin25 中国农业科学院硕士学位论文第三章β-tubulin对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制的影响抗体检测β-actin，用Anti-flag-tag抗体检测过表达的Flag-β-tubulin，其中β-actin为内参蛋白。同样的方法过表达后感染0.1MOI的A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株，分别在感染8h、16h和24h后收集细胞上清，用病毒RNA提取试剂盒QIAampViralRNAMiniKit，按说明书操作提取病毒RNA，对RNA样品进行A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株的Taqman荧光定量PCR检测，并用统计分析软件GraphPadPrism6.01对数据处理分析。3.2.4下调β-tubulin对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制影响的的研究细胞增殖-毒性检测：按说明书操作，利用CellCountingKit-8(CCK-8)试剂盒，将siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3转染MA104细胞72h后加入CCK-8试剂，在培养箱中孵育2h，用ELx800通用酶标仪测定450nm处的吸光度，用GraphPadPrism6.01分析处理数据。siRNA下调MA104细胞β-tubulin表达验证：在6孔板中，利用LipofectamineRNAiMAXReagent转染试剂分别转染siRNA-1和siRNA-3于MA104细胞中，转染72h后，用160μLRIPA裂解液裂解并收集细胞，加40μL5×SDS蛋白上样缓冲液，混匀后沸水煮10min，-20℃保存。对样品进行WesternBlot鉴定，用Anti-β-tubulin抗体检测β-tubulin蛋白，以及用Anti-β-actin抗体检测β-actin蛋白，以β-actin蛋白为内参。利用ImageJ图像分析软件分析WesternBlot结果的灰度值。下调β-tubulin对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株蛋白表达影响的探究：在6孔板中，利用LipofectamineRNAiMAXReagent转染试剂转染siRNA-1于MA104细胞中，对照组转染siRNA-NC，转染72h后感染0.1MOI的A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株，感染24h后，用160μLRIPA裂解液裂解并收集细胞，加40μL5×SDS蛋白上样缓冲液，混匀后沸水煮10min，-20℃保存。对样品进行WesternBlot鉴定，用1：1000稀释的NSP55E11小鼠单抗腹水检测NSP5，用1：1000稀释的VP61F4小鼠单抗腹水检测VP6蛋白，用Anti-β-tubulin抗体检测β-tubulin蛋白，用Anti-β-actin抗体检测β-actin蛋白，以β-actin蛋白为内参。下调β-tubulin对上清中A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株拷贝数影响的探究：在6孔板中，利用LipofectamineRNAiMAXReagent转染试剂转染siRNA-1于MA104细胞中，转染72h后感染0.1MOI的A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株，感染24h后，收集细胞上清，用病毒RNA提取试剂盒QIAampViralRNAMiniKit、按说明书操作提取病毒RNA，对RNA样品进行A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株Taqman荧光定量PCR检测，并用统计分析软件GraphPadPrism6.01对数据处理分析。下调β-tubulin对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株感染力影响的探究：在6孔板中，利用LipofectamineRNAiMAXReagent转染试剂转染siRNA-1于MA104细胞中，转染72h后感染0.1MOI的A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株，感染24h后，上清和细胞一起冻于-20℃，反复冻融2次，用MA104细胞按照常规操作测定样品的TCID50。3.2.5抑制剂对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制影响的探究铺MA104细胞于在12孔板中，长满单层后，感染0.1MOI的A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株，细胞培养箱中感作1h后，PBS洗3遍，分别加入预先用RPMIMedium1640basic(1×)培26 中国农业科学院硕士学位论文第三章β-tubulin对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制的影响养液稀释好的药物，其中诺考达唑工作浓度为1μM、10μM和50μM，ABT-751工作浓度为0.2μM、2μM和20μM，紫杉醇工作浓度为2μM、10μM和20μM，同时设立DMSO空白对照组。病毒感染24h后，收集细胞上清。用病毒RNA提取试剂盒QIAampViralRNAMiniKit、按说明书操作提取上清中病毒RNA，对RNA样品进行A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株VP6基因的Taqman荧光定量PCR检测方法，并用统计分析软件GraphPadPrism6.01对数据处理分析。取完上清后，将上清吸净弃掉多余上清，用80μLRIPA裂解液裂解并收集细胞，加20μL5×SDS蛋白上样缓冲液，混匀后沸水煮10min，-20℃保存。对样品进行WesternBlot鉴定，用1:1000稀释的NSP55E11小鼠单抗腹水检测NSP5，用1:1000稀释的VP61F4小鼠单抗腹水检测VP6蛋白，用Anti-β-tubulin商品化单克隆抗体检测β-tubulin蛋白，用Anti-β-actin商品化单克隆抗体抗体检测β-actin蛋白，以β-actin蛋白为内参。3.3实验结果3.3.1A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株感染对β-tubulin影响的探究通过激光共聚焦扫描显微镜观察发现，0.1MOI的A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株感染MA104细胞，感染和6h开始，至感染24h，细胞中β-tubulin从微管上解聚，微管骨架变得稀疏松散，且随着感染时间的延长，这种现象愈加明显（如图3.1A）；感染后6-18h，胞质中出现颗粒状β-tubulin，且β-tubulin颗粒随感染时间的延长而增大；在感染后18h观察到的颗粒状β-tubulin最多、最大（如图3.1A中箭头所指）。利用激光共聚焦扫描显微镜逐层扫描及ZEN2.3图像拟合软件分析发现，A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株感染18h后，许多颗粒状β-tubulin结合在NSP5聚集的地方与NSP5发生共定位现象（如图3.1B）。而诺考达唑处理的MA104细胞中，虽然β-tubulin能够从微管上解聚，但未观察到β-tubulin颗粒（如图3.1C）。3.3.2过表达β-tubulin对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制影响的探究WesternBlot分析发现，A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株感染24h后，转染p3×flag-β-tubulin质粒的过表达β-tubulin实验组中，能够检测到约55kDa的Flag-β-tubulin蛋白，而转染p3×flag-CMV-10的对照组中检不到Flag-β-tubulin，说明实验组中β-tubulin过表达成功；过表达β-tubulin后，感染0.1MOI的A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株，对感染24h后的细胞进行WesternBlot分析，发现过表达β-tubulin的实验组中NSP5和VP6蛋白含量均显著低于对照组（如图3.2A）。说明在MA104细胞中，β-tubulin过表达能够明显抑制A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株NSP5和VP6蛋白的合成与表达。过表达β-tubulin后，感染0.1MOI的A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株，对感染24h后的细胞上清进行A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株VP6基因的Taqman荧光定量PCR检测，结果表明，过表达β-tubulin的实验组上清中VP6基因拷贝数低于对照组10倍作用，具有极显著差异，P<0.01，如图3.2B。说明过表达β-tubulin能够抑制A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制。27 中国农业科学院硕士学位论文第三章β-tubulin对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制的影响Aβ-tubulinMergeNSP5DAPIMock6hpi12hpi18hpi24hpiBCβ-tubulinMergeDAPI图3.1A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株感染对β-tubulin的影响6hpi、12hpi、18hpi和24hpi。A：A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株感染诱导β-tubulin从微管上解聚，并形成与NSP5共定位的β-tubulin颗粒（单层扫描2D视图）。B：A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株感染后NSP5包裹在微管周围，且β-tubulin颗粒依附在NSP5周围18hpi（逐层扫描3D视图）。C:诺考达唑处理后微管解聚。Fig.3.1TheeffectofgroupAPoRV/NMTL/G9P[23]straininfectiononMTs6hpi,12hpi,18hpiand24hpi.(A)TheinfectionofgroupAPoRVG9P[23]NMTLstraininducesβ-tubulintodepolymerizefrommicrotubulesandformβ-tubulinparticlesco-localizedwithNSP5(single-layerscan2Dview).(B)NSP5wrapsaroundmicrotubulesinMA104cellsinfectedwithgroupAPoRVG9P[23]NMTLstrain.Theβ-tubulinparticlesadheredtotheperipheryofNSP5at18hpi(layer-by-layerscanning3Dview).(C)nocodazoleinducesmicrotubulestodepolymerization.28 中国农业科学院硕士学位论文第三章β-tubulin对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制的影响ABMock+β-tubulinFlag-β-tubulinVP6NSP5β-actin图3.2β-tubulin过表达抑制A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制。A：WesternBlot检测，过表达β-tubulin抑制细胞中NSP5和VP6蛋白的表达量。B：Taqman荧光定量检测，过表达β-tubulin对抑制上清VP6基因的拷贝数（“**”代表P<0.01）。Fig.3.2Theoverexpressionofβ-tubulininhibitsthereplicationofgroupAPoRV/NMTL/G9P[23]strain.(A)Over-expressionofβ-tubulininhibitedtheexpressionofNSP5andVP6proteinincellsbyWesternBlot.(B)Overexpressionofβ-tubulininhibitedthecopiesofVP6geneinthesupernatantbyTaqmanfluorescencequantitativePCR(“**”meansP<0.01).3.3.3下调β-tubulin对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制影响的探究细胞增殖-毒性检测：细胞增殖-毒性检测试验结果证明，siRNA-2对细胞活性有极显著影响，而siRNA-1和siRNA-3对细胞活性无显著影响（如图3.3A）。为了验证siRNA-1和siRNA-3对MA104细胞β-tubulin的下调效力，本研究分别转染siRNA-1和siRNA-3于MA104细胞中，同时转染siRNA-NC为阴性对照，转染72h后裂解并收集细胞，经WesternBlot分析发现，siRNA-1组β-tubulin的表达量明显比其它两组低，对WesternBlot结果进行灰度值分析发现，siRNA-1大约能下调70%的β-tubulin表达（如图3.3B），因此本研究选择siRNA-1进行下游研究。β-tubulin下调对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株感染的细胞中病毒蛋白表达影响的探究：本研究利用siRNA-1进一步探究β-tubulin下调对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制的影响。转染siRNA-1于MA104细胞72h后，感染0.1MOI的A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株，感染24h后，利用WesternBlot分析细胞中NSP5和VP6蛋白的表达量，发现NSP5和VP6蛋白表达量明显增多（如图3.3C）。探究下调β-tubulin对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株感染后的细胞上清中的VP6基因拷贝数的影响：转染siRNA-1于MA104细胞72h后，感染0.1MOI的A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株，感染24h后对细胞上清进行A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株VP6基因的Taqman荧光定量PCR检测发现，下调β-tubulin后细胞上清中VP6基因拷贝数明显升高，且具有极显著差异，29 中国农业科学院硕士学位论文第三章β-tubulin对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制的影响P<0.01（如图3.3D）。下调β-tubulin对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株感染力影响的探究：转染siRNA-1于MA104细胞72h后，感染0.1MOI的A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株，感染24h后，通过TCID50方法对细胞上清中病毒滴度进行测定试验，发现下调β-tubulin表达后A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株病毒滴度在105.6TCID50/mL作用，对照组为106.4TCID50/mL，实验组比对照组高出近10倍，说明下调β-tubulin表达后A群PoRVG9P[23]型NMTL感染力明显升高，且具有极显著差异，P<0.01（如图3.3E）。综上结果说明，下调β-tubulin表达促进A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制。图3.3下调β-tubulin促进A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制。A：CCK-8检测，siRNA-2对抑制细胞活性，siRNA-1和siRNA-3对细胞活性无影响。B：WesternBlot验证，siRNA-1能够有效下调β-tubulin的表达。C：WesternBlot检测，下调β-tubulin促进细胞中NSP5和VP6蛋白的表达量。D：Taqman荧光定量PCR检测，下调β-tubulin促进上清中VP6基因的拷贝数（P<0.01）。E：TCID50检测，下调β-tubulin对存进A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株的滴度（P<0.01）。Fig.3.3Theknockdownofβ-tubulinpromotesthereplicationofgroupAPoRV/NMTL/G9P[23]strain.(A)siRNA-2inhibitscellactivity,siRNA-1andsiRNA-3havenoeffectoncellviabilitybyCCK-8assay.(B)siRNA-1caneffectivelydown-regulateβ-tubulinexpressionbyWesternBlot.(C)Down-regulatedofβ-tubulinpromotestheexpressionofNSP5andVP6proteinincellsbyWesternBlot.(D)Down-regulatedofβ-tubulinpromotesthecopiesofVP6geneinthesupernatantbyTaqmanfluorescencequantitativePCR(P<0.01).(E)TheTCID50assaydown-regulatedthetiterofβ-tubulinagainstthegroupofPoRVG9P[23]NMTLstrains(“**”meansP<0.01,“***”meansP<0.001).30 中国农业科学院硕士学位论文第三章β-tubulin对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制的影响3.3.4诺考达唑对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制影响的探究WesternBlot试验结果表明，A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株感染24h后，1-50μM诺考达唑实验组中，细胞中NSP5和VP6蛋白含量高于空白对照组，并且随着诺考达唑工作浓度的增加，NSP5和VP6蛋白含量增加的更加显著，具有浓度依赖性，如图3.4A。说明1-50μM诺考达唑能够能够促进A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株NSP5和VP6蛋白的合成与表达，且在该浓度范围内具有浓度依赖性。对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株VP6基因的Taqman荧光定量PCR检测发现，1-50μM诺考达唑作用下，A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株感染24h后，上清中VP6基因拷贝数明显高于对照组，并且随着诺考达唑工作浓度的增加，VP6基因的拷贝数也随着升高，具有极显著差异，P<0.01，如图3.4B。说明1-50μM诺考达唑能够促进A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制，且具有浓度依赖性。AB0μM1μM10μM50μMVP6NSP5β-actin图3.4诺考达唑促进A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制。A：WesternBlot检测，1-50μM诺考达唑促进NSP5和VP6蛋白的表达量，且具有浓度依赖性。B：Taqman荧光定量PCR检测，1-50μM诺考达唑促进上清中VP6基因的拷贝数（“**”代表P<0.01，“***”代表P<0.001）。Fig.3.4NocodazolepromotesthereplicationofgroupAPoRV/NMTL/G9P[23]strain.(A)1-50μMNocodazolepromotestheexpressionofNSP5andVP6proteinsinaconcentration-dependentmannerbyWesternBlot.(B)1-50μMNocodazolepromotesthecopiesofVP6geneinsupernatantsbyTaqmanfluorescencequantitativePCR(“**”meansP<0.01,“***”meansP<0.001).3.3.5ABT-751促进A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制WesternBlot试验结果表明，A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株感染24h后，0.2-20μMABT-751实验组中NSP5和VP6蛋白含量高于空白对照组，并且在0.2-20μM浓度下随着ABT-751工作浓度的增加，NSP5和VP6蛋白含量也随之增加，如图3.5A。说明0.2-20μMABT-751能够促进A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株NSP5和VP6蛋白的合成与表达，且在该浓度下具有浓度依赖性。31 中国农业科学院硕士学位论文第三章β-tubulin对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制的影响对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株VP6基因的Taqman荧光定量PCR检测发现，0.2-20μMABT-751的作用下，A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株感染24h后，0.2-20μM的ABT-751实验组上清中VP6基因拷贝数明显高于对照组，并且随着诺考达唑工作浓度的增加，VP6基因拷贝数也随之升高，具有极显著差异，P<0.01，如图3.5B。说明0.2-20μMABT-751能够促进A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制，且在该浓度下具有浓度依赖性。A0μM0.2μM2μM20μMVP6NSP5β-actin图3.5ABT-751促进A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制。A：WesternBlot检测，1-20μMABT-751促进NSP5和VP6蛋白的表达量。B：Taqman荧光定量PCR检测，1-20μMABT-751促进上清中VP6基因的拷贝数（“**”代表P<0.01，“***”代表P<0.001）。Fig.3.5ABT-751promotesthereplicationofgroupAPoRV/NMTL/G9P[23].(A)1-20μMABT-751promotestheexpressionofNSP5andVP6proteinbyWesternBlot.(B)1-20μMABT-751promotsthecopiesofVP6geneinthesupernatantbyTaqmanfluorescencequantitativePCR(“**”meansP<0.01,“***”meansP<0.001).32 中国农业科学院硕士学位论文第三章β-tubulin对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制的影响3.3.6紫杉醇抑制A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制WesternBlot试验结果表明，A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株感染24h后，2-20μM紫杉醇实验组中NSP5和VP6蛋白含量低于空白对照组，并且在2-20μM下随着紫杉醇工作浓度的增加，NSP5和VP6蛋白含量随之减少，如图3.6A。说明在2-20μM浓度下紫杉醇能够抑制A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株NSP5和VP6蛋白的合成与表达，且在该浓度下具有浓度依赖性。对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株VP6基因的Taqman荧光定量PCR检测发现，0.2-20μM紫杉醇的作用下，A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株感染24h后，2-20μM紫杉醇实验组的上清中VP6基因拷贝数明显低于对照组，并且随着紫杉醇工作浓度的增加，VP6基因拷贝数逐渐降低，具有极显著差异，P<0.01，如图3.6B。说明2-20μM紫杉醇能够抑制A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株的复制，且在该浓度下具有浓度依赖性。A0μM2μM10μM20μMVP6NSP5β-actinB图3.6紫杉醇抑制A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制。A：WesternBlot检测，1-20μM紫杉醇抑制NSP5和VP6蛋白的表达量。B：Taqman荧光定量PCR检测，1-20μM紫杉醇抑制上清中VP6基因的拷贝数（“**”代表P<0.01，“***”代表P<0.001）。Fig.3.6PaclitaxelinhibitsthereplicationofgroupAPoRV/NMTL/G9P[23]strain.(A)1-20μMpaclitaxelinhibitstheexpressionofNSP5andVP6proteinbyWesternBlot.(B)1-20μMpaclitaxelinhibitsthecopiesofVP6geneinthesupernatantbyTaqmanfluorescencequantitativePCR(“**”meansP<0.01,“***”meansP<0.001).33 中国农业科学院硕士学位论文第三章β-tubulin对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制的影响3.4讨论本研究利用A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株感染的MA104细胞，通过激光共聚焦扫描显微镜和免疫荧光技术，观察发现病毒感染6-24h时，β-tubulin构成的微管网络变的稀疏松散，且随感染时间延长，这种现象愈加明显，说明A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株感染能够诱导β-tubulin从微管上解聚，进而导致微管解聚，这与Zambrano等人和Martin等人的研究结果一致(Zambranoetal.,2012；Martinetal.,2010)。Zambrano等研究人员发现轮状病毒DxRRV株能够诱导MA104细胞微管网络解聚，同时Martin等研究人员发现轮状病毒RF株的感染使MA104细胞的微管网络崩解并解聚，提示诱导微管解聚可能是RV不同毒株的共性。无独有偶，除RV外，其它病毒也具有类似性质，如流感病毒，Han等人的实验证明流感病毒A/Beijing/501/2009(H1N1)株感染A594细胞能够诱导宿主细胞微管解聚，并发生重排(Hanetal.,2012)，提示诱导微管解聚可能是一些病毒在复制过程中出现的普遍现象，并且可能具有重要的生物学意义。有趣的是，在观察A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株感染对β-tubulin的影响时发现，未感染病毒的细胞中β-tubulin主要以微管的形式存在，但在感染A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株的细胞中，网状的β-tubulin减少，同时出现颗粒状的β-tubulin。而诺考达唑处理的MA104细胞，虽然网状的β-tubulin减少甚至消失，但未观察到颗粒状的β-tubulin，说明A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株的某些成分在诱导β-tubulin从微管上解聚的同时，还能促使游离的β-tubulin聚集成颗粒状的β-tubulin。通过激光共聚焦的3D视图发现，许多β-tubulin颗粒依附于NSP5之中，且本研究证明NSP5能够与β-tubulin相互作用，推测NSP5可能就是促使游离的β-tubulin聚集成颗粒的病毒成分。但这一推断还需更多的直接证据，并且A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株这种行为的生物学意义，尚有不清楚。本研究证明过表达β-tubulin，能够抑制A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株的复制；下调β-tubulin，能够促进A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制；抑制β-tubulin在微管上的聚合，能够促进A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制；抑制β-tubulin从微管上解聚，能够抑制A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制。以上结果充分说明β-tubulin对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制具有负调控作用。但是β-tubulin具体影响A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制的哪个阶段，这一科学问题尚未解决。值得注意的是，虽然许多病毒蛋白都能与β-tubulin发生相互作用，且影响病毒的复制，但β-tubulin对于病毒复制的影响实际上是复杂的，并不是所有病毒都在微管解聚后都能增强其复制能力。相反的，例如冠状病毒在微管解聚后，其感染性病毒粒子的释放明显减少(Rudigeretal.,2016)。所以在本实验的基础上，仍有必要探究A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株NSP5与β-tubulin相互作用对病毒复制影响的分子机制，这将深入我们对RV乃至更多病毒复制机制的认知与理解。β-tubulin对PoRV病毒复制负调控的现象,与人流感病毒A/NWS/33的相关报道相似，研究证明稳定的微管限制人流感病毒A/NWS/33在LLC-MK2细胞上的感染(DeContoetal.,2012)。提示β-tubulin对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制的负调控作用的分子机制，可能与人流感病毒A/NWS/33的相似。且最近有研究发现，微管的交叉构型可以干扰流感病毒在活细胞中的运输行34 中国农业科学院硕士学位论文第三章β-tubulin对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制的影响为，导致流感病毒运输方向的变化和长期停滞；大多数流感病毒沿着微管，直接快速地从细胞周边向细胞底部附近的微管组织中心(MTOC)移动，并且流感病毒被限制在靠近细胞顶部的微管网格中和靠近细胞底部的MTOC处。β-tubulin对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株复制具有负调控作用的分子机制可能与流感病毒相似，受到了微管交叉构型的限制，本研究下一步将继续探究该科学问题。虽然本研究仅对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株在MA104细胞中进行了研究，但是NSP5与β-tubulin都是进化上非常保守的蛋白，提示β-tubulin对RV复制的负调控作用，可能在更多种类的细胞和不同亚型RV间具有类似现象。此外，本研究证明A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株感染能够诱导MA104细胞β-tubulin从微管是解聚，且通过抑制剂试验证明，β-tubulin从微管上的解聚能够促进A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株的复制，提示A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株可能正是利用β-tubulin从微管上的解聚，来促进其自身的复制。35 中国农业科学院硕士学位论文第四章全文结论第四章全文结论1.A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株NSP5与宿主细胞β-tubulin存在相互作用。且该病毒感染诱导宿主细胞β-tubulin从微管上解聚，并形成与NSP5共定位的颗粒状β-tubulin。2.β-tubulin对A群PoRVG9P[23]型NMTL毒株的复制呈现负调控作用。36 中国农业科学院硕士学位论文参考文献参考文献1.李学荣,余新炳.核酸疫苗及其免疫机制研究.中国人兽共患病杂志,2000,16(6):82-86.2.殷震,刘景华.动物病毒学[M].第二版,北京:科学出版社,1997,562-566.3.翟中和,王喜忠,丁明孝.细胞生物学[M].第4版,北京:高等教育出版社,2011,206-217.4.AfrikanovaI.,FabbrettiE.,MiozzoM.C.,etal.RotavirusNSP5phosphorylationisup-regulatedbyinteractionwithNSP2.JournalofGeneralVirology,1998,79(11):2679-2686.5.AkhmanovaA.,HammerJ.A.,3rd.Linkingmolecularmotorstomembranecargo.CurrentOpinioninBiotechnology,2010,22(4):479-487.6.ArnoldiF.,CampagnaM.,EichwaldC.,etal.InteractionofrotaviruspolymeraseVP1withnonstructuralproteinNSP5isstrongerthanthatwithNSP2.JournalofVirology,2007,81(5):2128-2137.7.AungT.S.,KobayashiN.,NagashimaS.,etal.DetectionofgroupBrotavirusinanadultwithacutegastroenteritisinYangon,Myanmar.JournalofMedicalVirology,2009,81(11):1968-1974.8.BallJ.M.,TianP.,ZengC.Q.,etal.Age-dependentdiarrheainducedbyarotaviralnonstructuralglycoprotein.Science,1996,272(5258):101-104.9.BanyaiK.,KemenesiG.,BudinskiI.,etal.CandidatenewrotavirusspeciesinSchreiber'sbats,Serbia.Infection,GeneticsandEvolution,2017,48:19-26.10.Bar-MagenT.,SpencerE.,PattonJ.T.,AnATPaseactivityassociatedwiththerotavirusphosphoproteinNSP5.Virology,2007,369(2):389-399.11.BishopR.F.,DavidsonG.P.,HolmesI.H.,etal.Virusparticlesinepithelialcellsofduodenalmucosafromchildrenwithacutenon-bacterialgastroenteritis.Lancet,1973,2(7841):1281-1283.12.BluttS.E.,ConnerM.E.,Rotavirus:tothegutandbeyond.CurrentOpinioninGastroenterology,2007,23(1):39-43.13.BrownA.,Axonaltransportofmembranousandnonmembranouscargoes:aunifiedperspective.JournalofCellBiology,2003,160(6):817-821.14.Cabral-RomeroC.,Padilla-NoriegaL.,AssociationofrotavirusviroplasmswithmicrotubulesthroughNSP2andNSP5.MemóriasDoInstitutoOswaldoCruz,2006,101(6):603-611.15.CampagnaM.,EichwaldC.,VascottoF.,etal.RNAinterferenceofrotavirussegment11mRNArevealstheessentialroleofNSP5inthevirusreplicativecycle.JournalofGeneralVirology,2005,86(5):1481-1487.16.CharpilienneA.,LepaultJ.,ReyF.,etal.IdentificationofrotavirusVP6residueslocatedattheinterfacewithVP2thatareessentialforcapsidassemblyandtranscriptaseactivity.JournalofVirology,2002,76(15):7822-7831.17.ChhabraP.,PayneD.C.,SzilagyiP.G.,etal.Etiologyofviralgastroenteritisinchildren<5yearsofageintheUnitedStates,2008-2009.JournalofInfectiousDiseases,2013,208(5):790-800.37 中国农业科学院硕士学位论文参考文献18.ChizhikovV.,PattonJ.T.,Afour-nucleotidetranslationenhancerinthe3'-terminalconsensussequenceofthenonpolyadenylatedmRNAsofrotavirus.RNA,2000,6(6):814-825.19.ChnaidermanJ.,BarroM.,SpencerE.,NSP5phosphorylationregulatesthefateofviralmRNAinrotavirusinfectedcells.ArchivesofVirology,2002,147(10):1899-1911.20.CriglarJ.M.,HuL.,CrawfordS.E.,etal.AnovelformofrotavirusNSP2andphosphorylation-dependentNSP2-NSP5interactionsareassociatedwithviroplasmassembly.JournalofVirology,2014,88(2):786-798.21.CrossR.A.,Thekineticmechanismofkinesin.TrendsinBiochemicalSciences,2004,29(6):301-309.22.DeBrabanderM.J.,VanDeVeireR.M.,AertsF.E.,etal.Theeffectsofmethyl(5-(2-thienylcarbonyl)-1H-benzimidazol-2-yl)carbamate,(R17934;NSC238159),anewsyntheticantitumoraldruginterferingwithmicrotubules,onmammaliancellsculturedinvitro.CancerResearch,1976,36(3):905-916.23.DeContoF.,DiLonardoE.,ArcangelettiM.C.,etal.HighlydynamicmicrotubulesimprovetheeffectivenessofearlystagesofhumaninfluenzaA/NWS/33virusinfectioninLLC-MK2cells.PLoSOne,2012,7(7):e41207.24.DoddingM.P.,WayM.,Couplingvirusestodyneinandkinesin-1.EMBOJournal,2011,30(17):3527-3539.25.DohnerK.,NagelC.H.,SodeikB.,Viralstop-and-goalongmicrotubules:takingaridewithdyneinandkinesins.TrendsinMicrobiology,2005,13(7):320-327.26.DunnS.J.,CrossT.L.,GreenbergH.B.,ComparisonoftherotavirusnonstructuralproteinNSP1(NS53)fromdifferentspeciesbysequenceanalysisandnorthernblothybridization.Virology,1994,203(1):178-183.27.EichwaldC.,JacobG.,MuszynskiB.,etal.UncouplingsubstrateandactivationfunctionsofrotavirusNSP5:phosphorylationofSer-67bycaseinkinase1isessentialforhyperphosphorylation.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2004,101(46):16304-16309.28.EstroziL.F.,SettembreE.C.,GoretG.,etal.LocationofthedsRNA-dependentpolymerase,VP1,inrotavirusparticles.JournalofMolecularBiology,2013,425(1):124-132.29.FabbrettiE.,AfrikanovaI.,VascottoF.,etal.Twonon-structuralrotavirusproteins,NSP2andNSP5,formviroplasm-likestructuresinvivo.JournalofGeneralVirology,1999,80(2):333-339.30.FangZ.Y.,YeQ.,HoM.S.,etal.InvestigationofanoutbreakofadultdiarrhearotavirusinChina.JournalofInfectiousDiseases,1989,160(6):948-953.31.FischerWalkerC.L.,PerinJ.,AryeeM.J.,etal.Diarrheaincidenceinlow-andmiddle-incomecountriesin1990and2010:asystematicreview.BMCPublicHealth,2012,12:220.32.FlewettT.H.,BrydenA.S.,DaviesH.,etal.Relationbetweenvirusesfromacutegastroenteritisofchildrenandnewborncalves.Lancet,1974,2(7872):61-63.38 中国农业科学院硕士学位论文参考文献33.GastanaduyP.A.,HallA.J.,CurnsA.T.,etal.Burdenofnorovirusgastroenteritisintheambulatorysetting--UnitedStates,2001-2009.JournalofInfectiousDiseases,2013,207(7):1058-1065.34.GennerichA.,ValeR.D.,Walkingthewalk:howkinesinanddyneincoordinatetheirsteps.CurrentOpinioninBiotechnology,2009,21(1):59-67.35.GoldsteinL.S.,YangZ.,Microtubule-basedtransportsystemsinneurons:therolesofkinesinsanddyneins.AnnualReviewofNeuroscience,2000,23:39-71.36.GonzalezS.A.,BurroneO.R.,RotavirusNS26ismodifiedbyadditionofsingleO-linkedresiduesofN-acetylglucosamine.Virology,1991,182(1):8-16.37.GreberU.F.,WayM.Asuperhighwaytovirusinfection.cell,2006,124(4):741-754.38.HagbomM.,IstrateC.,EngblomD.,etal.Rotavirusstimulatesreleaseofserotonin(5-HT)fromhumanenterochromaffincellsandactivatesbrainstructuresinvolvedinnauseaandvomiting.PLoSPathogens,2011,7(7):e1002115.39.HanX.,LiZ.,ChenH.,etal.InfluenzavirusA/Beijing/501/2009(H1N1)NS1interactswithbeta-tubulinandinducesdisruptionofthemicrotubulenetworkandapoptosisonA549cells.PLoSOne,2012,7(11):e48340.40.HirokawaN.,TakemuraR.,Molecularmotorsandmechanismsofdirectionaltransportinneurons.NatureReviewsNeuroscience,2005,6(3):201-214.41.HirokawaN.,Fromelectronmicroscopytomolecularcellbiology,moleculargeneticsandstructuralbiology:intracellulartransportandkinesinsuperfamilyproteins,KIFs:genes,structure,dynamicsandfunctions.JournalofElectronMicroscopy,2011,60Suppl1:S63-92.42.HirokawaN.,Kinesinanddyneinsuperfamilyproteinsandthemechanismoforganelletransport.Science,1998,279(5350):519-526.43.HsiehM.J.,WhiteP.J.,PoutonCW.Interactionofviruseswithhostcellmolecularmotors.CurrentOpinioninBiotechnology,2010,21(5):633-639.44.JainS.,VashisttJ.,ChangotraH.,Rotaviruses:istheirsurveillanceneeded?.Vaccine,2014,32(27):3367-3378.45.JayaramH.,EstesM.K.,PrasadB.V.,Emergingthemesinrotaviruscellentry,genomeorganization,transcriptionandreplication.VirusResearch,2004,101(1):67-81.46.JourdanN.,MauriceM.,DelautierD.,etal.RotavirusisreleasedfromtheapicalsurfaceofculturedhumanintestinalcellsthroughnonconventionalvesiculartransportthatbypassestheGolgiapparatus.JournalofVirology,1997,71(11):8268-8278.47.KellingJ.,SullivanK.,WilsonL.,etal.SuppressionofcentromeredynamicsbyTaxolinlivingosteosarcomacells.CancerResearch,2003,63(11):2794-2801.48.KhagayiS.,BurtonD.C.,OnkobaR.,etal.HighburdenofrotavirusgastroenteritisinyoungchildreninruralwesternKenya,2010-2011.PediatricInfectiousDiseaseJournal,2014,33Suppl1:S34-40.49.KulicI.M.,BrownA.E.,KimH.,etal.Theroleofmicrotubulemovementinbidirectional39 中国农业科学院硕士学位论文参考文献organelletransport.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2008,105(29):10011-10016.50.LiY.Z.,HuW.,ZhouL.,Naturalanti-tumorcompoundswithactivityofpromotingmicrotubuleassembly.YaoXueXueBao,2001,36(2):155-160.51.LiuL.,OzaS.,HoganD.,etal.Global,regional,andnationalcausesofchildmortalityin2000-13,withprojectionstoinformpost-2015priorities:anupdatedsystematicanalysis.Lancet,2015,385(9966):430-440.52.LiuS.L.,ZhangL.J.,WangZ.G.,etal.Globallyvisualizingthemicrotubule-dependenttransportbehaviorsofinfluenzavirusinlivecells.AnalyticalChemistry,2014,86(8):3902-3908.53.LopezT.,RojasM.,Ayala-BretonC.,etal.ReducedexpressionoftherotavirusNSP5genehasapleiotropiceffectonvirusreplication.JournalofGeneralVirology,2005,86(6):1609-1617.54.LuX.,McdonaldS.M.,TortoriciM.A.,etal.MechanismforcoordinatedRNApackagingandgenomereplicationbyrotaviruspolymeraseVP1.Structure,2008,16(11):1678-1688.55.LuY.,ChenJ.,XiaoM.,etal.Anoverviewoftubulininhibitorsthatinteractwiththecolchicinebindingsite.PharmaceuticalResearch,2012,29(11):2943-2971.56.LundgrenO.,PeregrinA.T.,PerssonK.,etal.Roleoftheentericnervoussysteminthefluidandelectrolytesecretionofrotavirusdiarrhea.Science,2000,287(5452):491-495.57.LundgrenO.,SvenssonL.,Pathogenesisofrotavirusdiarrhea.MicrobesandInfection,2001,3(13):1145-1156.58.MartinD.,CharpilienneA.,ParentA.,etal.TherotavirusnonstructuralproteinNSP5coordinatesa[2Fe-2S]iron-sulfurclusterthatmodulatesinteractiontoRNA.FASEBJOURNAL,2013,27(3):1074-1083.59.MartinD.,DuarteM.,LepaultJ.,etal.SequestrationoffreetubulinmoleculesbytheviralproteinNSP2inducesmicrotubuledepolymerizationduringrotavirusinfection.JournalofVirology,2010,84(5):2522-2532.60.MartinD.,OuldaliM.,MenetreyJ.,etal.StructuralorganisationoftherotavirusnonstructuralproteinNSP5.JournalofMolecularBiology,2011,413(1):209-221.61.MathieuM.,PetitpasI.,NavazaJ.,etal.Atomicstructureofthemajorcapsidproteinofrotavirus:implicationsforthearchitectureofthevirion.EMBOJournal,2001,20(7):1485-1497.62.MatthijnssensJ.,CiarletM.,HeimanE.,etal.Fullgenome-basedclassificationofrotavirusesrevealsacommonoriginbetweenhumanWa-LikeandporcinerotavirusstrainsandhumanDS-1-likeandbovinerotavirusstrains.JournalofVirology,2008,82(7):3204-3219.63.MatthijnssensJ.,OttoP.H.,CiarletM.,etal.VP6-sequence-basedcutoffvaluesasacriterionforrotavirusspeciesdemarcation.ArchivesofVirology,2012,157(6):1177-1182.64.McclainB.,SettembreE.,TempleB.R.,etal.X-raycrystalstructureoftherotavirusinnercapsidparticleat3.8Aresolution.JournalofMolecularBiology,2010,397(2):587-599.65.McdonaldD.,VodickaM.A.,LuceroG.,etal.VisualizationoftheintracellularbehaviorofHIVin40 中国农业科学院硕士学位论文参考文献livingcells.JournalofCellBiology,2002,159(3):441-452.66.McdonaldS.M.,PattonJ.T.,RotavirusVP2coreshellregionscriticalforviralpolymeraseactivation.JournalofVirology,2011,85(7):3095-3105.67.MeanyH.J.,SackettD.L.,MarisJ.M.,etal.ClinicaloutcomeinchildrenwithrecurrentneuroblastomatreatedwithABT-751andeffectofABT-751onproliferationofneuroblastomacelllinesandontubulinpolymerizationinvitro.PediatrBloodCancer,2010,54(1):47-54.68.NaghaviM.,WangH.,LozanoR.,Global,regional,andnationalage-sexspecificall-causeandcause-specificmortalityfor240causesofdeath,1990-2013:asystematicanalysisfortheGlobalBurdenofDiseaseStudy2013.Lancet,2015,385(9963):117-171.69.MuresanV.,Oneaxon,manykinesins:What'sthelogic?.JournalofNeurocytology,2000,29(11-12):799-818.70.OusingsawatJ.,MirzaM.,TianY.,etal.RotavirustoxinNSP4inducesdiarrheabyactivationofTMEM16AandinhibitionofNa+absorption.PflügersArchiv-EuropeanJournalofPhysiology,2011,461(5):579-589.71.PalmerK.J.,WatsonP.,StephensD.J.,TheroleofmicrotubulesintransportbetweentheendoplasmicreticulumandGolgiapparatusinmammaliancells.BiochemicalSocietySymposium,2005,(72):1-13.72.PattonJ.T.,Vasquez-DelCarpioR.,TortoriciM.A.,etal.Couplingofrotavirusgenomereplicationandcapsidassembly.AdvancesinVirusResearch,2007,69:167-201.73.PerizJ.,CelmaC.,JingB.,etal.RotavirusmRNASarereleasedbytranscript-specificchannelsinthedouble-layeredviralcapsid.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2013,110(29):12042-12047.74.PfisterK.K.,FisherE.M.,GibbonsI.R.,etal.Cytoplasmicdyneinnomenclature.JournalofCellBiology,2005,171(3):411-413.75.PoncetD.,LindenbaumP.,L'haridonR.,etal.InvivoandinvitrophosphorylationofrotavirusNSP5correlateswithitslocalizationinviroplasms.JournalofVirology,1997,71(1):34-41.76.PrasadB.V.,RothnagelR.,ZengC.Q.,etal.VisualizationoforderedgenomicRNAandlocalizationoftranscriptionalcomplexesinrotavirus.Nature,1996,382(6590):471-473.77.RadtkeK.,DohnerK.,SodeikB.,Viralinteractionswiththecytoskeleton:ahitchhiker'sguidetothecell.CellMicrobiol,2006,8(3):387-400.78.RahmanM.,MatthijnssensJ.,YangX.,etal.Evolutionaryhistoryandglobalspreadoftheemergingg12humanrotaviruses.JournalofVirology,2007,81(5):2382-2390.79.RietdorfJ.,PloubidouA.,ReckmannI.,etal.Kinesin-dependentmovementonmicrotubulesprecedesactin-basedmotilityofvacciniavirus.NatureCellBiology,2001,3(11):992-1000.80.RudigerA.T.,MayrhoferP.,Ma-LauerY.,etal.TubulinsinteractwithporcineandhumanSproteinsofthegenusAlphacoronavirusandsupportsuccessfulassemblyandreleaseofinfectiousviralparticles.Virology,2016,497:185-197.41 中国农业科学院硕士学位论文参考文献81.RuthelG.,DemminG.L.,KallstromG.,etal.AssociationofebolavirusmatrixproteinVP40withmicrotubules.JournalofVirology,2005,79(8):4709-4719.82.SaifLJ,BohlEH,TheilKW,etal.Rotavirus-like,calicivirus-like,and23-nmvirus-likeparticlesassociatedwithdiarrheainyoungpigs.JournalofClinicalMicrobiology,1980,12(1):105-111.83.ScottD.A.,DasU.,TangY.,etal.Mechanisticlogicunderlyingtheaxonaltransportofcytosolicproteins.Neuron,2011,70(3):441-454.84.SeisenbergerG.,RiedM.U.,EndressT.,etal.Real-timesingle-moleculeimagingoftheinfectionpathwayofanadeno-associatedvirus.Science,2001,294(5548):1929-1932.85.SenA.,SenN.,MackowE.R.,Theformationofviroplasm-likestructuresbytherotavirusNSP5proteiniscalciumregulatedanddirectedbyaC-terminalhelicaldomain.JournalofVirology,2007,81(21):11758-11767.86.SettembreE.C.,ChenJ.Z.,DormitzerPR,etal.Atomicmodelofaninfectiousrotavirusparticle.EMBOJournal,2011,30(2):408-416.87.SodeikB.,EbersoldM.W.,HeleniusA.,Microtubule-mediatedtransportofincomingherpessimplexvirus1capsidstothenucleus.JournalofCellBiology,1997,136(5):1007-1021.88.SuomalainenM.,NakanoM.Y.,KellerS.,etal.Microtubule-dependentplus-andminusend-directedmotilitiesarecompetingprocessesfornucleartargetingofadenovirus.JournalofCellBiology,1999,144(4):657-672.89.TaoY.,FarsettaD.L.,NibertML,etal.RNAsynthesisinacage--structuralstudiesofreoviruspolymeraselambda3.Cell,2002,111(5):733-745.90.TateJ.E.,BurtonA.H.,Boschi-PintoC.,etal.2008estimateofworldwiderotavirus-associatedmortalityinchildrenyoungerthan5yearsbeforetheintroductionofuniversalrotavirusvaccinationprogrammes:asystematicreviewandmeta-analysis.LancetInfectiousDiseases,2012,12(2):136-141.91.Torres-VegaM.A.,GonzalezR.A.,DuarteM.,etal.TheC-terminaldomainofrotavirusNSP5isessentialforitsmultimerization,hyperphosphorylationandinteractionwithNSP6.JournalofGeneralVirology,2000,81(3):821-830.92.TortoriciM.A.,BroeringT.J.,NibertM.L.,etal.Templaterecognitionandformationofinitiationcomplexesbythereplicaseofasegmenteddouble-strandedRNAvirus.JournalofBiologicalChemistry,2003,278(35):32673-32682.93.TortoriciM.A.,ShapiroB.A.,PattonJ.T.,Abase-specificrecognitionsignalinthe5'consensussequenceofrotavirusplus-strandRNAspromotesreplicationofthedouble-strandedRNAgenomesegments.RNA,2006,12(1):133-146.94.TraskS.D.,McdonaldS.M.,PattonJ.T.,Structuralinsightsintothecouplingofvirionassemblyandrotavirusreplication.NatureReviewsMicrobiology,2012,10(3):165-177.95.TrojnarE.,SachsenroderJ.,TwardziokS.,etal.IdentificationofanaviangroupArotaviruscontaininganovelVP4genewithacloserelationshiptothoseofmammalianrotaviruses.Journal42 中国农业科学院硕士学位论文参考文献ofGeneralVirology,2013,94(1):136-142.96.VendeP.,PironM.,CastagneN.,etal.EfficienttranslationofrotavirusmRNArequiressimultaneousinteractionofNSP3withtheeukaryotictranslationinitiationfactoreIF4GandthemRNA3'end.JournalofVirology,2000,74(15):7064-7071.97.VendeP.,TaraporewalaZ.F.,PattonJ.T.,RNA-bindingactivityoftherotavirusphosphoproteinNSP5includesaffinityfordouble-strandedRNA.JournalofVirology,2002,76(10):5291-5299.98.WakudaM.,IdeT.,SasakiJ.,etal.Porcinerotaviruscloselyrelatedtonovelgroupofhumanrotaviruses.EmergingInfectiousDiseases,2011,17(8):1491-1493.99.WaniM.C.,TaylorH.L.,WallM.E.,etal.Plantantitumoragents.VI.Theisolationandstructureoftaxol,anovelantileukemicandantitumoragentfromTaxusbrevifolia.JournaloftheAmericanChemicalSociety,1971,93(9):2325-2327.100.WardB.M.,Thetakingofthecytoskeletononetwothree:howvirusesutilizethecytoskeletonduringegress.Virology,2011,411(2):244-250.101.WelchS.K.,CrawfordS.E.,EstesM.K.,RotavirusSA11genomesegment11proteinisanonstructuralphosphoprotein.JournalofVirology,1989,63(9):3974-3982.102.WelteM.A.,GrossS.P.,PostnerM.,etal.DevelopmentalregulationofvesicletransportinDrosophilaembryos:forcesandkinetics.Cell,1998,92(4):547-557.103.WillardM.,Rapiddirectionaltranslocationsinvirusreplication.JournalofVirology,2002,76(10):5220-5232.104.YildizA.,SelvinP.R.,Kinesin:walking,crawlingorslidingalong?.TrendsinCellBiol,2005,15(2):112-120.105.ZambranoJ.L.,SorondoO.,AlcalaA.,etal.RotavirusinfectionofcellsincultureinducesactivationofRhoAandchangesintheactinandtubulincytoskeleton.PLoSOne,2012,7(10):e47612.43 中国农业科学院硕士学位论文附录附录MA104细胞的β-tubulin的基因序列：5'ATGCCTGCAGGTCGACGATTGAGAATTCAAGGGAAATCGTGCACATCCAGGCCGGGCAGTGCGGCAACCAAATTGGCGCCAAGTTCTGGGAGGTGATCAGCGATGAGCACGGCATCGACCCCACGGGCACCTACCACGGGGACAGCGACCTGCAGCTGGACCGCATCTCCGTGTACTACAATGAAGCCACAGGTGGCAAATATGTTCCTCGTGCCATCCTGGTGGATCTAGAACCTGGGACCATGGACTCTGTTCGCTCAGGTCCTTTTGGCCAGATCTTTAGACCAGACAACTTTGTATTTGGTCAGTCTGGGGCAGGTAACAACTGGGCCAAAGGCCACTACACAGAGGGGGCCGAGCTGGTTGATTCTGTCCTGGATGTGGTACGGAAGGAGGCAGAGAGCTGTGACTGCCTGCAGGGCTTCCAGCTGACCCACTCACTGGGCGGAGGCACAGGCTCTGGAATGGGCACTCTCCTTATCAGCAAGATCCGAGAAGAGTACCCTGATCGCATCATGAACACCTTCAGTGTGGTTCCTTCACCCAAAGTATCTGACACCGTGGTCGAGCCCTACAATGCCACCCTCTCCGTCCATCAGTTGGTAGAGAACACTGATGAGACCTATTGCATTGACAACGAGGCCCTCTATGATATCTGCTTCCGTACTCTGAAGCTGACCACACCAACCTACGGGGATCTGAACCACCTCGTCTCAGCCACCATGAGCGGTGTCACCACCTGCCTCCGCTTCCCTGGCCAGCTCAATGCTGACCTCCGCAAATTGGCAGTCAACATGGTCCCCTTCCCACGCCTCCATCTCTTTATGCCTGGCTTTGCCCCTCTCACCAGCCGTGGAAGCCAGCAATATCGAGCTCTTACAGTGCCAGAACTCACCCGGCAGGTCTTCGATGCCAAGAACATGATGGCTGCCTGTGACCCCCGCCACGGCCGATACCTCACCGTGGCTGCTGTCTTCCGTGGTCGGATGTCCATGAAGGAGGTTGATGAGCAGATGCTTAACGTGCAGAACAAAAACAGCAGCTACTTTGTGGAATGGATCCCCAACAACGTCAAGACAGCTGTCTGTGACATCCCACCTCGTGGCCTCAAGATGGCAGTCACCTTCATCGGCAACAGCACGGCCATCCAGGAGCTCTTCAAGCGCATCTCAGAGCAGTTCACTACCATGTTCCGCCGGAAGGCCTTCCTCCACTGGTACACAGGCGAGGGCATGGACGAGATGGAGTTCACTGAGGCTGAGAGCAACATGAACGACCTCGTCTCTGAGTATCAGCAGTACCAGGATGCCACCGCAGAAGAGGAGGAGGATTTCGGTGAGGAGGCCGAAGAGGAGGCCTAA'344 中国农业科学院硕士学位论文致谢致谢时光荏苒，岁月如梭，转眼间三年的硕士生涯即将画上句号。回首过往，感触良多，毋庸置疑的是，三年的学习与实验生活十分充实，从专业技能的提高到思维方式的养成，再到心智的成熟，都令我心怀感恩。饮水思源，我的成长离不开各位老师以及师兄师姐们的帮助，感谢之情溢于言表！感谢我的导师冯力研究员,对我实验中的指导和生活中的帮助。每当我试验遇到坎坷，冯老师总是我坚强的后盾，给予我信任，包容我的错误，开发我的潜力，指引我找到解决问题的方案，为我点燃希望的光芒。冯老师严谨的治学态度和实事求是的科研作风，为我树立良好的科研心态。谢谢您，我亲爱的导师，感谢您三年前的选择，愿我的努力没让您失望；感谢您三年里为我倾注的心血，愿我的成长没让您遗憾！感谢本实验室张鑫老师对我实验的指导，感谢本实验室的时洪艳老师为我实验提供的无私帮助与细心的指导，感谢本实验室的陈建飞老师、袁婧老师、石达博士、刘建波博士为我实验提供的支持以及与生活中提供帮助。感谢猪消化道传染病创新团队的刘长明老师、刘平黄老师为我课题提出的宝贵意见；感谢兽医学院的刘益民处长和高友兰老师给予我的生活上的关心；感谢公共仪器室的刘培欣老师、杨涛老师、宋海慧老师以及其他默默付出的人士！感谢朱向东师兄、韩斅师姐、张家林师兄、谷凤丽师姐、董慧师姐、王潇博师兄、季朝阳师兄和朱蕴暖师姐对我实验和生活的关心与帮助，感谢同级魏姗硕士、卢曼曼硕士、高冉硕士以及同门师妹，刘烨硕士、丛广义硕士、李明蔚硕士、刘秋歌硕士陪伴我实验室的青葱岁月。你们既是我科研工作中的战友，也是我生活中的益友！感谢哈兽研15级所有硕士同窗，与我一起分享科研与生活中的五味杂陈！感谢我父母对我学习和生活中的支持、关心与理解，这三年很少陪伴在你们身边，但你们从不抱怨，让我没有后顾之忧的投入到科研中，我会努力成长，回报父母的养育之恩。最后，感谢国家自然科学基金（受理编号3150130629）对本实验的支持，向所有关心与帮助过我的人们致以最真诚的感谢！景朝阳2018年春于哈尔滨45 中国农业科学院硕士学位论文作者简介作者简历景朝阳：女，1991年3月生，中共团员，汉族，黑龙江哈尔滨人。2010.9-2015.6东北农业大学动物医学学院学习，获得农学学士学位。2015.9月至今在中国农业科学院哈尔滨兽医研究所攻读农学硕士学位，导师为冯力研究员。硕士期间获得2017年度研究生国家奖学金。硕士期间发表的文章：JingZ.Y.,ZhangX.,ShiH.,etal.AG3P[13]porcinegroupArotavirusemerginginChinaisareassortantandanaturalrecombinantintheVP4gene.TransboundaryandEmergingDiseases,2018,65(2):e317-e328.46