运用CLARITY技术进行神经疾病模型鼠的研究

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分类号Q-334密级注1UDC学位论文运用CLARITY技术进行神经疾病模型鼠的研究(题名和副题名)吴清勤(作者姓名)指导教师冯娟副教授电子科技大学成都(姓名、职称、单位名称)申请学位级别硕士专业学位类别生物化学与分子生物学提交论文日期2017.04论文答辩日期2017.05学位授予单位和日期电子科技大学2017年6月答辩委员会主席评阅人注1：注明《国际十进分类法UDC》的类号。 ApplicationofCLARITYtostudytheneurologicaldiseaseinmicemodelAMasterThesisSubmittedtoUniversityofElectronicScienceandTechnologyofChinaMajor:BiochemistryandmolecularbiologyAuthor:WuQingqinAdvisor:AssosiateProfessorFengJuanSchool:Schooloflifescienceandtechnology 摘要摘要光的散射性一直是阻碍生物大组织深度成像的主要因素，尽管目前出现许多旨在降低组织光散射的组织透明技术，但是这些技术或多或少存在技术缺陷而需要进一步改进。2013年报道的CLARITY技术则是一种全新的组织透明技术，和传统技术存在本质区别。这项技术首次将大脑组织转变成水凝胶结构并去除脑内脂质而使脑组织变透明，去除脂质能够降低光散射从而提高脑成像深度，同时大分子抗体标记物也更容易进入组织内部。CLARITY技术自被报道以来就以其显著的优势吸引着世界各地课题组对它进行完善改进，另外，最近两年CLARITY技术已被成功应用于各类神经疾病的高精度成像研究。本文主要分为两部分进行。第一部分进行了CLARITY技术一系列的摸索及优化工作，包括CLARITY技术必须的电泳装置的构建、电泳条件如温度、水凝胶溶液配比以及光折射率匹配溶液的优化等，并通过紫外分光光度计及BCA法分别测量了不同的条件下所获得的透明脑的透明度以及蛋白损失率，通过相关数据分析得到最优的CLARITY技术条件，最后开展免疫染色及共聚焦成像研究得到了一些14-3-3zeta蛋白的三维结构信息。接下来将CLARITY技术其应用于颞叶癫痫的成像研究。通过构建癫痫鼠模型并采用Timm染色法验证成功获得了颞叶癫痫模型，之后采用CLARITY技术透明了包含完整海马约3mm厚的小鼠脑切片并开展免疫染色及共聚焦成像，获取了14-3-3zeta蛋白和S262位点磷酸化Tau蛋白在癫痫小鼠海马CA1、CA3区的空间共定位信息，上述这些研究工作为后续深入展开癫痫全脑成像研究奠定了基础。关键词：CLARITY技术，三维成像，颞叶癫痫，免疫染色I ABSTRACTABSTRACTLightscatteringisalwaysthemainobstacletoachievethedepthimagingofthethickbiologicaltissues.Althoughmanyopticalclearingagentshavebeendevelopedtoreducethelightscatteringduringimaging,theseexistedmoreorlesstechnicalshortcomingsneededforthefurtherimprovement.CLARITYisonenewstrategydiscoveredin2013tomakethebraintissuebecometransparent,whichallowstheconversionofthebiologicaltissueintohydrogelstructurefollwedbytheremovingofthelipidswithhighefficiency.Thepresenceoflesslipiddilayershelpstoreducethelightscatteringandachievethedeep-tissueimaging.Meanwhile,theantibodieshavemoreaccesstoenterthebraintissueandcombinethetargetproteinwiththepresenceoflesslipidsdilayersinbrain.Theseadvantageshaveattractedmoreandmoreresearcherscomingfromallovertheworld.Someworkhadbeendonetooptimizetheexperimentalconditions.Moreinterestingly,intherecenttwoyearsthisCLARITYmethodhadbeensuccessfullyappliedtostudysomebriandiseases.Inthispaper,weself-madeoneelectrophoresisapparatus,andthensomeexperimentalconditionswereoptimizedforCLARITY,includingtheelectrophoresistemperature,theratiooftwomonomersinthehydrogelsolution,aswellasthecomoarisonofrefractiveindexmatchingsolution.Transparencywasdetectedusinguv-visabsorptionspectrophotometer,andproteinlosswasmeasuredbasedonBCAmethod.Additionally,wealsocarriedouttheimmunostainingandconfocalimagingon1mm-thickclarifiedbrainslice,andthesome3Ddatahavebeenobtainedforthevisulizationof14-3-3zeta.Apartfromtheexperimentalcondition,inthepresenwealsoperformedsomestudiesonthetemporallobeepilepsyofmicebyusingCLARITYtechnology.WehaveestablishedthePilocarpine-inducedtemporallobeepilepsymousemodel,andTimmstainingmethodwasusedtoverifythemousesufferingfromtemporallobeepilepsy.Immunostainingresultsshowedthattherecoexisted14-3-3zetaandphosphorylatedTauprotein(p-S262)inCA1andCA3domainofhippocampustissue.Theco-localizationofbothproteinwasfurtherobservedonthe3mm-thickclarifiedbrainII ABSTRACTtissueusingCLARITYandconfocalimagingmethod.Theseresultsprovidedsomeusefulinformationforthefurtherwholebrainimagingofthetemporallobeepilepsy.Keyword:CLARITY，Three-dimensionalImaging，Epilepsy，ImmunostainingIII 目录目录第一章绪论.................................................................................................................11.1课题研究背景....................................................................................................11.1.1大组织高分辨率三维成像的挑战.........................................................11.1.2生物组织透明技术概述.........................................................................21.1.3CLARITY技术概述................................................................................41.1.3.1CLARITY技术原理.....................................................................41.1.3.2CLARITY技术的发展.................................................................61.1.3.3CLARITY技术的应用.................................................................61.2颞叶癫痫概述....................................................................................................71.3研究意义及目的................................................................................................91.4研究内容............................................................................................................9第二章CLARITY技术实验及条件优化.....................................................................102.1引言..................................................................................................................102.2实验材料..........................................................................................................102.2.1实验动物...............................................................................................102.2.2主要试剂...............................................................................................102.2.3实验仪器和设备...................................................................................112.2.4主要溶液配制.......................................................................................112.3实验方法..........................................................................................................142.3.1CLARITY技术及其实验条件的摸索与优化......................................142.3.1.1心脏灌注取脑及水凝胶成分摸索优化实验............................142.3.1.2电泳条件的摸索优化................................................................142.3.1.3光折射率匹配溶液的优化........................................................152.3.2透明度、膨胀率及BCA法测蛋白损失统计分析.............................152.3.2.1紫外分光光度计法检测组织透明度........................................152.3.2.2透明脑膨胀率的测定................................................................152.3.2.3BCA法测电泳过程蛋白损失率................................................162.3.2.4统计分析.....................................................................................172.3.3免疫组织化学染色及共聚焦三维成像...............................................172.3.3.1免疫组织化学染色....................................................................17IV 目录2.3.3.2双光子共聚焦三维成像............................................................172.4实验结果..........................................................................................................182.4.1CLARITY技术及其实验条件的摸索与优化......................................182.4.1.1电泳装置及水浴循环系统的构建............................................182.4.1.2电泳温度及水凝胶配比的优化................................................182.4.1.3光折射率匹配溶液的优化........................................................202.4.2BCA法测蛋白损失量测定...................................................................212.4.3免疫组织化学染色及共聚焦三维成像...............................................222.5讨论..................................................................................................................232.6本章小结..........................................................................................................25第三章CLARITY技术应用于颞叶癫痫模型鼠的初步研究.....................................263.1引言..................................................................................................................263.2实验材料..........................................................................................................263.2.1实验动物...............................................................................................263.2.2主要试剂...............................................................................................263.2.3实验仪器和设备...................................................................................273.2.4主要溶液配制.......................................................................................273.3实验方法..........................................................................................................283.3.1锂-匹鲁卡品癫痫造模..........................................................................283.3.2Timm染色实验......................................................................................293.3.3免疫染色及成像...................................................................................303.4实验结果..........................................................................................................303.4.1颞叶癫痫小鼠模型的构建及检测.......................................................303.4.1.1锂-匹鲁卡品颞叶癫痫小鼠行为检测.......................................303.4.1.2Timm染色观察颞叶癫痫海马齿状回苔藓出芽（MFS）.......303.4.2免疫染色及成像...................................................................................313.4.2.1普通切片免疫染色及成像........................................................313.4.2.2透明脑切片免疫染色及三维成像............................................333.5讨论..................................................................................................................343.6本章小结..........................................................................................................35第四章全文总结及展望...............................................................................................364.1总结..................................................................................................................364.2展望..................................................................................................................37V 目录4.2.1CLARITY技术应用于颞叶癫痫的全脑成像......................................374.2.2针对磷酸化Tau蛋白开展药物干预实验...........................................37致谢.............................................................................................................................39参考文献.........................................................................................................................40相关研究成果.................................................................................................................44VI 第一章绪论第一章绪论1.1课题研究背景1.1.1大组织高分辨率三维成像的挑战生物学家很早就意识到薄的切片组织要比厚的块状组织更容易进行显微观察。因此，切片机作为必不可少的传统工具广泛的应用于获取薄片组织以进行细胞水平的二维成像。然而，探索细胞和器官的三维立体结构的需求趋势促使生物学家需要挑战更大尺寸的组织而不再只是切片。最明显的例子就是神经系统的研究，普通切片无法获取单个神经细胞各个方向的延伸性以及鉴定他们的类别。另外，发育生物学中许多的研究涉及三维立体成像如探究器官甚至动物整体的形态发生等，因此如何有效地获取这些三维结构信息成为现代组织成像的重点难点。传统的应对方法是先将完整组织进行切片，然后按照顺序逐片成像后再由计算机处理重建出完整组织的三维结构信息。这种切片三维重构的方式极其繁琐，所需费用和精力较大，数据重建过程相当复杂，而最严重的缺陷是切片操作过程根本无法保证每张切片的完整性，切片的撕裂、折叠、压缩、拉伸等机械损伤势必会影响重建完成后的整体效果，因此机械切片三维重构目前仅限于小体积组织的成像，如射线断层摄影技术和串行块面扫描电子显微镜[1,2]。基于上述原因，探索不需要切片的完整组织三维成像技术势在必行。起初，人们发现普通光学显微镜并不能解决这样一个难题，即在厚组织成像中，来自不同层面的未对焦的模糊信号会严重干扰聚焦平面的信号。MarvinMinsky为了解决这一问题设计出世界上第一台共聚焦显微镜以过滤掉离焦信号[3]，由此开启了“光学切片”技术的新革命。一系列越来越先进复杂的显微技术应运而生，从激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）到双光子激光扫描共聚焦显微镜（TPEFM）再到光片照明（light-sheet）显微镜[4-6]，这些先进的显微技术能够在厚组织成像中通过降低组织其他层面的信号贡献而获取高精度的单一层面的信号，通俗来说就是可以在完整的大组织中任意截取一张薄切片的图像信息，然后再将一系列的切片数据通过电脑软件处理之后重建出令人满意的完整组织高分辨率三维构图。虽然显微技术的改进大大推进了组织成像的发展，但是厚组织的三维成像工作仍旧面临着严峻的挑战。一些组织中自身存在的色素以及自体荧光会干扰免疫染色的荧光标记[7,8]，而最主要的困难源于组织本身固有的不透明性和光散射性，这些特性阻碍了光线进入更深层的组织而制约了大组织的深度成像。目前标准的1 电子科技大学硕士学位论文激光扫描共聚焦显微镜穿透深度只能到达脑组织表面以下150μm左右。双光子激发荧光显微镜虽然改进了穿透深度，但它即使在理想的条件下也不能穿透超过大脑表面以下800μm。在这种背景下，旨在降低组织光散射，提高光线穿透深度的生物组织透明技术应运而生。1.1.2生物组织透明技术概述20世纪初，Spalteholz提出了一种基于有机溶剂的大组织（完整的器官和系统）透明技术[9]。虽然该技术操作繁琐，包括一系列脱水、组织漂白以及透明等步骤，但运用此法得到的透明组织在当时是前所未有的，有利的推进了解剖学领域的前进。20世纪末，上文提到的在数据采集及存储方面具有巨大优势的共聚焦、双光子荧光显微镜的出现使大组织成像成为可能，光学成像因此成为组织成像的主流手段。然而，组织各向异性产生的光散射仍然是阻碍这些显微技术获取厚组织高分辨率三维图像的主要因素[10]。这一瓶颈让人们更加关注由Spalteholz发展起来的生物组织光透明技术。迄今为止，所有的组织透明技术原理基本相同，皆专注于统一整个样本的光折射率以降低不均一性引起的光散射，如图1-1所示。图1-1光折射率均一组织（Noscatter）和散射组织（Scatter）中的入射光与荧光发射情况组织透明技术按照关键试剂成分可以分成两类：(1)与Spalteholz方法类似的基于有机溶剂的透明技术；(2)基于水溶性试剂的透明技术。（1）有机溶剂型透明技术2 第一章绪论这类技术通常分为两个步骤：(1)采用甲醇、己烷等溶剂进行脱水并脱去部分脂质；(2)将脱水后的组织孵育于与其光折射率匹配的有机溶剂进行进一步脱脂直至透明。比较经典的方法如2007年Hans-UlrichDodt等人提出的BABB[11]，该试剂通过乙醇和己烷将准备好的组织样品脱水之后再孵育于苯甲醇与苯甲酸苄酯等混合有机溶剂中，这些混合有机溶剂的光折射率与脱脂脱水后的组织非常接近，从而达到组织光折射率均一化，减少光散射提高成像分辨率的目的。他们将其应用于双光子荧光显微镜成像，获得了小鼠海马CA1区绿色荧光蛋白标记的神经元树突棘三维结构图像以及小鼠和果蝇胚胎的结构信息。然而大多数荧光蛋白的发色基团需要水环境来维持荧光发射，该技术必须的脱水步骤使得样品荧光很快就发生淬灭而使技术本身的应用受到限制。最近的两项研究进展在一定程度上解决了这个问题，能够在几天内维持处理后的样品荧光，即2012年AliErtürk等人提出的3DISCO以及随后的NicolasRenier等人提出的iDISCO[12,13]。3DISCO用四氢呋喃代替甲醇脱水使得绿色荧光蛋白的半衰期增至1-2天。而iDISCO则用包含磷酸盐缓冲液（PBS）、去垢剂、二甲亚砜（DMSO）的水溶液代替甲醇脱水这一步，这种结合了水溶液和有机溶剂的方式使绿色荧光蛋白的保存时间要比传统的BABB和3DISCO更长，能维持4天左右。有机溶剂型透明技术目前已经被报道用于处理过许多不同的组织类型。然而，此类技术用到的某些有机化学物质固有的毒性，能够损坏显微镜的物镜，并且脱水使得组织大幅收缩50%[14]，以及淬灭荧光等缺陷限制了他们的应用。（2）水溶性试剂型透明技术有机溶剂型透明技术因为无法保存荧光以及改变组织架构（主要是脱水导致组织收缩）等缺陷让许多的研究人员转而投入到水溶性试剂型透明技术研发中。目前已被报道的水溶性试剂型透明技术的原理主要分为两种：(1)将组织直接孵育于具有较高光折射率的溶液中，组织被动地逐渐呈现透明，称为简单浸透法；(2)将组织脱脂后通过组织水合作用降低剩下组分的光折射率，再孵育于较低的光折射率介质中，称为水合法。简单浸透法具有操作简便、经济以及良好兼容包括脂质染料等诸多荧光染料等优点。蔗糖、果糖、甘油、以及甲酰胺等具有高光折射率的物质都曾经被报道用来作为高折射率水溶液的溶质[15-18]。然而高浓度的蔗糖和甘油溶液由于其粘稠性、容易产生气泡的特性给实际操作带来困难。一些低粘性透明试剂的出现解决了上述问题，比如专利试剂FocusClear以及最近发表的RIMs[19,20]，它们分别采用泛影酸和Histodenz等低粘性、高光折射率物质作为试剂关键成分，但这些化学物质由于价格昂贵而影响了它们的应用。此外，2,2’-硫代双乙醇（TDE）是另3 电子科技大学硕士学位论文一种价格低廉、低粘性的水溶性物质，能够根据需要调成不同的光折射率溶液[21]。它首次被Staudt等证明能够作为超分辨率显微镜的封固剂[22]，并被Aoyagi等证明可以用来透明厚组织，然而TDE在浓度较高时会引起许多荧光分子亮度减弱。2013年Meng-TsenKe等人提出的SeeDB以饱和果糖以及α-硫代甘油为主要成分，能够迅速透明（3天左右）幼鼠脑组织，并可以保存样品1周而不会造成荧光猝灭[23]。但据报道如果不升高孵育温度，透明成年小鼠的整个大脑将变得相当困难，而升温将导致一些荧光信号丢失。总体来说，仅仅简单地将组织孵育于高折射率溶液中被动透明的方式其透明效果不及有机溶剂型透明技术，以及接下来要提到的另一类水溶性试剂型透明技术，而且被动透明所需时间长，因此主要被运用于显微镜成像时样品的封固剂以及小组织的透明处理。水合法则是利用去垢剂去除组织的脂质并在透明的过程中通过水合作用降低组织的光折射率。第一种采用这种原理的透明技术为2011年HiroshiHama等人研制出的以尿素、甘油以及TritonX-100为主要成分的水溶性试剂Sca/e[24]，它利用去垢剂TritonX-100去除脂质，结合尿素介导的水合作用以及匹配甘油的光折射率能够使生物组织转变成光学透明的结构，同时完全保留透明结构中被标记目标的荧光信号。他们通过实验证明Sca/e允许几毫米完整脑成像，获取了包括皮质、胼胝体以及海马等大组织的神经网络三维重构图。另外，名为CUBIC的透明技术采用和Sca/e类似的尿素水合机制，不同的是CUBIC可以选择高光折射率的蔗糖溶液作为透明溶液以加快组织透明进程[25]。总体来说，水合法利用去垢剂如TritonX-100代替疏水性的有机溶剂去除脂质虽然维持了荧光蛋白所需的水相环境，却大大延长了孵育时间，比如Sca/e透明完整小鼠大脑需要3-6周，而且需要多次更换溶液，透明后的组织样品变得非常脆弱，组织因为水合作用也会膨大很多。CUBIC同样利用高浓度的Triton(50%)尽可能去除脂质，但这种脂质去除过程会引起组织过多的蛋白损失(24%-41%)，导致抗原决定簇浓度减少从而影响免疫染色。1.1.3CLARITY技术概述1.1.3.1CLARITY技术原理上文提到的两大类生物组织透明技术虽然较完美的达到了统一样品光折射率降低光散射的目标，但其所有操作都建立在原来的组织结构基础上，因此衍生出许多无法消除的难题，如有机溶剂型透明技术将原本的组织脱水之后不利于荧光保存，而水溶剂透明技术虽然解决了荧光淬灭问题，但是要么只能局限于小组织处理（简单浸透法），要么透明时间过长，并且透明后组织由于失去相应的稳定4 第一章绪论架构而变得非常脆弱（水合法）。接下来要提到的CLARITY技术则首次主动将组织转变成透明的刚性水凝胶形态从而成功的解决了上述透明技术遗留的问题。CLARITY（ClearLipid-exchangedAcrylamide-hybridizedRigidImaging-compatibleTissue-hYdrogel）技术是2013年美国斯坦福科学家提出的与传统光透明技术有着本质区别的组织透明技术[26]。它首次向组织中引入多孔性水凝胶网状结构以代替原来组织的脂质架构，然后通过甲醛的共价连接作用把组织中的蛋白质、核酸以及小的神经传导物质按照它们之前所在的生理位置原位固定在水凝胶上，而脂质由于缺乏相应的结合基团无法被固定到水凝胶上。最后采用电泳的方式通过离子型去垢剂SDS将组织中的脂质包裹去除。全过程只需要大约一周时间，便能获得完整透明的成年小鼠大脑，大概流程如图1-2所示。透明过程中用到的化学试剂均不会造成荧光信号的丢失，而且由于水凝胶的刚性特征，组织能够维持稳定结构而允许进行多次免疫组化操作。图1-2CLARITY技术步骤整体示意图[26]5 电子科技大学硕士学位论文1.1.3.2CLARITY技术的发展CLARITY技术是一项较新的组织透明技术，和许多刚出现的技术类似，需要很多的技术改进，因此在技术的完善优化，以及技术创新等方面具有很大的研究空间，目前世界上很多课题组都在进行相关工作。首先在技术层面最具代表性的完善是2014年Tomer等人在natureprotocal上发表的文献[27]，该文献非常具体的介绍了CLARITY技术的各个步骤，弥补了前文[26]细节信息的不足，并进行相应的优化改进。针对CLARITY需要特殊的电泳装置这一问题提出被动扩散清除脂质这种方法，代替电泳改为恒温摇床操作，使去脂步骤更加简易，还能够降低因为电泳引起的蛋白变性以及损失率，但是相应的会延长透明所需时间。之后，Zheng等人适当的修善了CLARITY技术中水凝胶溶液的配置，并向其中添加了丙烯醛以提高脆弱组织（比如新生小鼠大脑）的结构稳定性，他们还进行了光折射率匹配所需介质以及共聚焦成像方面的简化工作，降低了实验成本[28]。另外，CLARITY技术虽然允许大体积完整组织的免疫染色操作，但是抗体通过被动扩散作用渗透到完整的水凝胶组织内部依旧非常困难，需要高浓度抗体以及较长的孵育时间（如完整小鼠大脑的免疫染色大约需要一个月）。上海交大的课题组针对这一问题对CLARITY免疫染色这部分做了改进，他们利用抗体本身自带净电荷的特点，将组织置于增设的恒定电场中，抗体主动沿着电场方向运动，大大缩短渗入整个小鼠大脑所需时间[29]。一些课题组则对CLARITY技术做了扩展工作，Lee等人将原本用于处理大脑组织的CLARITY技术运用到透明其他的器官如肝，肾，肺等并探究了透明这些器官最佳的电泳条件[30]。Palmer等人则通过方法上的创新向其中添加一种酶溶解细胞壁使其能够运用于透明植物器官并进行完整植物器官三维成像[31]。另外，目前由于缺乏有效的工具进行纳米粒子在整个器官的成像，因此对于纳米粒子在生物组织内部的运输、定位以及生物效应无法知晓。为了克服这一挑战，Sindhwani等人合成了一种表面能够吸附血清蛋白的纳米粒子，这样纳米粒子就可以通过血清蛋白本身与甲醛的共价连接固定到水凝胶上。他们设计了一套高通量电泳设备能够同时透明48个组织样本，允许超过1mm深的亚细胞水平的纳米颗粒成像，超出现有纳米成像技术25倍左右[32]。他们的技术创新可以普遍应用于观察完整组织甚至整只动物中的材料如纳米粒子、生物传感器的分布以及和组织的相互作用。1.1.3.3CLARITY技术的应用作为能够立体直观的显示神经网络连接的新型组织处理成像技术，CLARITY技术目前已经应用于研究神经疾病，例如2014年报道的Spence等人结合功能磁6 第一章绪论共振和CLARITY技术研究灰质萎缩和轴突损伤之间的关系[33]；Ando等运用CLARITY技术处理阿兹海默症患者的500μm前额叶脑切片，首次得到了相关病理特征Aβ、Tau以及神经丝的三维结构[34]。Liu等人将CLARITY技术应用于研究帕金森病患者的脑组织，形象地观察到基底核路易斯小体的三维结构，以及中脑黑纹状体纤维中的单胺能纤维和路易斯病理的空间关系[35]。JonathanPhillips等人则将临床上和遗传方面确定患有线粒体疾病的人小脑组织作为研究对象，通过免疫荧光标记神经元以及线粒体蛋白进一步理解线粒体疾病中发生的神经退行性病变的机制[36]。除了神经疾病，CLARITY技术在肿瘤领域也有很大研究进展。2015年Font-Burgada等人在cell杂志上报道了一种杂种门静脉肝细胞（HybHP），它存在于健康的肝脏内，能够进行广泛的增殖以补充因为慢性损伤导致的肝细胞数量减少，并且尤为重要的一点是不会因为增殖而引起肝细胞癌变（由肝细胞损失引起的细胞补偿增殖效应会促进肝细胞癌变）。他们将HybHP移植到患病的肝脏，发现其具有非常强大的肝功能修复能力，表明了HybHP的治疗潜力。在他们的研究中，CLARITY技术被用来精确定位转基因小鼠肝脏赫林管中的HybHP[37]。Cronan等人则证明CLARITY技术能够运用于研究由细菌感染引起的肿瘤病变。研究表明分枝杆菌感染会导致宿主内形成名为肉芽肿瘤的特征病变，作者将斑马鱼和小鼠作为实验对象，首先采用CLARITY技术透明了整只斑马鱼，然后结合免疫荧光观察斑马鱼肉芽肿瘤内的细菌定位，揭示肉芽肿瘤自身存在相当大的异质性，并揭示对于分枝杆菌发病机制极其重要的两个过程——细胞因子介导和肉芽肿瘤血管化。最后作者还研究了结核杆菌感染的小鼠肺部组织，获得了处于肺部深处的肉芽肿瘤的三维结构图[38]。1.2颞叶癫痫概述癫痫是一种慢性脑部神经障碍性疾病，其临床特征为脑部神经元高度同步持续异常放电所致反复癫痫样发作。目前，全世界患有癫痫的人群大约占世界总人口的1%，而在这其中存在约30%的患者不能够有效的控制病情[39]，归类为难治性癫痫，颞叶癫痫（Temporallobeepilepsy，TLE）是难治性癫痫较常见类型，约占70%。到目前为止，颞叶癫痫的发病机理尚不明确，但普遍被认同的观点是致痫因素引起海马神经发生改变导致神经元异常放电。海马的齿状回颗粒细胞轴突称为苔藓纤维，一般情况下苔藓纤维只会往海马CA3区投射并止于CA3区透明层。但是在人类颞叶癫痫以及各种动物模型中均发现这样一种现象，即苔藓纤维折回齿状回内分子与自身的树突或者其他的颗粒细胞树突发生神经连接或者越过CA3区和锥体细胞的顶树突发生异常神经联系，7 电子科技大学硕士学位论文这一现象被称为齿状回苔藓纤维出芽（Mossyfibersprouting，MFS）[40,41]。MFS的出现表明内分子层局部环路发生改变，可能是导致癫痫反复发作的重要病理。目前已经知道，微管（Microtubules，MTs）是神经细胞突起的重要组成结构，在神经元突起的发育过程中发挥着重要作用，而微管的结构和功能维持正常依赖于微管相关蛋白（Microtubleassociated，MAPs）。Tau蛋白是最主要的微管相关蛋白，正常情况下，Tau蛋白参与神经元骨架中微管的装配，促进微管稳定[42]。在某些病理状态Tau蛋白会发生异常磷酸化，导致失去促进微管组装的功能，引起一系列的神经病变包括轴突运输受损、神经丝缠结等，最终引起神经退行性病变。Tau蛋白异常过度磷酸化是阿兹海默症的一个非常典型的病理特征，而在颞叶癫痫的研究中亦发现tau蛋白过度磷酸化的现象，并且与MFS存在非常密切的关联。目前多种癫痫模型已证实癫痫发病过程Tau蛋白磷酸化水平增高，且与苔藓纤维出芽存在时间空间一致性，揭示磷酸化Tau蛋白过量表达可能是MFS最为重要的调节机制[43,44]，表明磷酸化Tau蛋白在癫痫反复发作中扮演着重要角色。14-3-3蛋白是另一类和神经疾病发病密切相关的蛋白。14-3-3蛋白分子量为28~33kD，是一组高度保守的可溶性酸性蛋白质，在动物体内广泛分布，尤其在大脑内。该蛋白能特异结合丝氨酸或苏氨酸位点磷酸化的蛋白，参与多种生物途径[45]。最近的一些研究表明14-3-zeta蛋白能结合Tau蛋白，导致Tau磷酸化和发生聚合[46,47]。Qureshi等人运用免疫组化和免疫共沉淀的方法研究14-3-zeta蛋白和Tau蛋白的之间相互作用，发现无论Tau磷酸化与否，14-3-3zeta蛋白都能导致Tau蛋白的聚合，随着处理时间的延长，Tau蛋白聚合体会从最初的无定形态转变为单链直长丝[48]。此外，Hamid报道14-3-3zeta蛋白通过激活PKA促进Tau蛋白262位丝氨酸磷酸化，导致大鼠海马初级神经元突触小泡蛋白水平下降[49]。这些研究表明14-3-3zeta在AD发病过程中可能扮演促进疾病发展的不利角色。然而关于癫痫的研究却发现14-3-3zeta蛋白对于癫痫发作后的细胞凋亡通路具有重要调控作用[50]，Murphy等人的体外实验表明消耗14-3-3zeta蛋白能够引起内质网应激以及海马颗粒细胞凋亡，并且会加剧红藻氨酸对于海马神经元的兴奋毒性，揭示14-3-3zeta蛋白可能具有神经保护作用[51]。总而言之，磷酸化Tau蛋白和14-3-3zeta蛋白是癫痫发作过程中重要的特征蛋白，而关于颞叶癫痫中两者之间的相互作用以及其在发病过程中的分布区域的研究鲜见报道，因此探讨磷酸化Tau蛋白与14-3-3zeta蛋白在癫痫的作用有利于揭示颞叶癫痫的病理机制。8 第一章绪论1.3研究意义及目的CLARITY技术作为一项新的组织透明技术，在大组织高精度三维成像以及免疫染色方面与传统生物组织透明技术相比具有很大优势，目前已被报道并证明能够运用于一系列神经疾病包括阿兹海默症、灰质萎缩、帕金森症等疾病的病理成像，取得了较大进展，但是目前关于癫痫的病理研究尚未见报道。颞叶癫痫是难治愈癫痫中最常见的一种类型，目前为止关于其发病机制尚不明确。前人研究表明：磷酸化Tau蛋白与颞叶癫痫密切相关，其通过介导MFS发生而在癫痫发病过程中扮演着重要角色。此外，14-3-3蛋白是另一类和神经疾病密切相关的蛋白，在癫痫发作过程中其mRNA水平呈上升趋势。在阿兹海默症的研究中发现14-3-3zeta能够促进Tau蛋白磷酸化，表明这两类蛋白之间存在相互作用。这种相互作用在颞叶癫痫中是否存在是本论文研究的主要内容，相关研究尚未见报道。1.4研究内容本课题主要分为两部分进行。首先我们将6-8周龄的正常的昆明小鼠作为实验对象，进行了CLARITY技术一系列的摸索及优化工作，包括CLARITY技术必须的电泳装置的构建、电泳条件如温度、水凝胶溶液配比以及光折射率匹配溶液的优化等，并通过紫外分光光度计及BCA法分别测量了不同的条件下所获得的透明脑的透明度以及蛋白损失率，通过相关数据分析得到最优的CLARITY技术条件，并在此基础上进行透明脑免疫组织化学染色及共聚焦三维成像实验。其次，我们尝试将CLARITY技术应用于颞叶癫痫的病理成像研究。首先通过构建癫痫鼠模型并进行相应的实验验证成功获得了颞叶癫痫模型，之后通过免疫染色及共聚焦成像获得了与癫痫发病密切相关的两类蛋白：14-3-3zeta与磷酸化Tau蛋白在海马CA1区的空间共定位信息，这些癫痫研究工作尚处于初级阶段，需要后续开展更深入的研究。9 电子科技大学硕士学位论文第二章CLARITY技术实验及条件优化2.1引言如前言所述，CLARITY技术作为最新的组织透明技术，和传统的组织透明技术相比，具有非常显著的优势，吸引着世界各地的课题组对其进行研究及应用。然而，CLARITY技术的步骤原理虽然非常统一，即主要分为灌注、水凝胶组织包埋、电泳去除脂质以及最后将透明组织孵育于光折射率匹配溶液中，但具体实施到实验中将因为各个课题组实验条件的不同，处理的组织不同等因素而使得实验的开展存在差异，尤其是电泳装置并没有统一的标准，电泳条件也是各个课题组自行设计的利于实验开展的策略。因此，建立起符合本实验室条件的CLARITY技术以便后续研究将是十分必要的。本章实验我们首先根据文献[26]提到的资料自行设计了符合要求的电泳去脂装置，在此基础上探索出一整套完备的电泳水浴循环系统。接下来开展CLARITY技术如电泳温度、水凝胶成分配比、选择光折射率匹配溶液等实验条件优化，并考察了所获得的透明小鼠脑组织的透明度以及蛋白损失率，最后开展了透明脑免疫组织化学染色及共聚焦三维成像研究工作。2.2实验材料2.2.1实验动物6-8周龄体重20-25g雄性昆明小鼠购自四川省医学科学院实验动物中心，饲养室温度23±1.5°C，湿度50%~60%，白昼开始于8:00a.m.，昼夜12h交替，给予标准饲料及自由饮水。动物处理遵守国家健康协会制定的实验动物护理和使用指南。2.2.2主要试剂水合氯醛成都市科龙化工试剂厂氯化钠成都市科龙化工试剂厂二水合磷酸二氢钠成都市科龙化工试剂厂一水合磷酸二氢钠成都市科龙化工试剂厂十二水合磷酸氢二钠成都市科龙化工试剂厂多聚甲醛成都市科龙化工试剂厂10 第二章CLARITY技术实验及条件优化丙烯酰胺Biosharp双丙烯酰胺BiosharpVA044SigmaBCA定量试剂盒康为世纪生物科技有限公司硼酸成都市科龙化工试剂厂甘油成都市科龙化工试剂厂山梨醇SigmaD-果糖成都市科龙化工试剂厂α-硫代甘油Mackin尿素成都市科龙化工试剂厂TritonX-100Biosharp羊抗人14-3-3zeta抗体RDAlexa488结合的驴抗羊IgGInvitrogenDAPI瑞士Roche公司驴封闭血清索莱宝生物公司2.2.3实验仪器和设备恒温磁力搅拌器中国金坛市科析仪器有限公司HJ-4A冰箱中国青岛海尔股份有限公司制冰机SCOTSMAN超纯水处理系统Millipore电子分析天平中国北京赛多利斯科学仪器有限公司恒温水浴锅中国金坛市科析仪器有限公司KW恒温摇床中国上海智城分析仪器制造有限公司移液枪EPPENDORFRESEARCHpH计中国上海精科PHS-3C型紫外分光光度计日本HitachU2910双光子荧光显微镜BX51，Olympus酶标仪美国Bio-Rad6802.2.4主要溶液配制（1）水凝胶灌注液（以多聚甲醛：丙烯酰胺：甲叉=4:4:0.05为例）多聚甲醛PFA20g11 电子科技大学硕士学位论文丙烯酰胺20g甲叉双丙烯酰胺0.25gVA0441.25g0.01MPBS500mL制备步骤：a、取出约300mLPBS，加入20g多聚甲醛，60°C磁力搅拌，滴1MNaOH直至清亮。b、待溶液冷却后加入PBS至大约450mL，然后加入20g丙烯酰胺，0.25g甲叉，用PBS定容至500mL。c、最后避光加入1.25gVA044，用浓HCl调pH至7.4，棕色瓶4°C保存。另外，配制多聚甲醛：丙烯酰胺：甲叉=4:4:0.025的水凝胶灌注液则将甲叉用量调为0.125g；配制多聚甲醛：丙烯酰胺：甲叉=3:3:0.05的水凝胶灌注液则将多聚甲醛、丙烯酰胺用量分别降为15g；配制多聚甲醛：丙烯酰胺：甲叉=3:3:0.025的水凝胶灌注液则则将多聚甲醛、丙烯酰胺以及甲叉用量分别降为15g、15g、0.125g，其他条件不变，步骤同上。（2）ClearingBuffer硼酸6.183g十二烷基磺酸钠SDS20g双蒸水500mL1M氢氧化钠若干先称取6.183g硼酸溶于适量的双蒸水中，再加入20gSDS，搅拌溶解后加双蒸水定容至500mL，最后用1M氢氧化钠调节pH值为8.5，常温保存。（3）PBS溶液（0.01M，pH=7.4）氯化钠8.5g十二水合磷酸氢二钠2.684g二水合磷酸二氢钠0.39g双蒸水1000mL分别称取上述试剂溶于1000mL的双蒸水中，磁力搅拌待其完全溶解后通过HCL或氢氧化钠调节pH值为7.4，于4°C保存。（4）0.1MPB母液（1L，pH=7.4）磷酸氢二钠10.9g一水合磷酸二氢钠3.1g12 第二章CLARITY技术实验及条件优化分别称取上述试剂溶于1000mL的双蒸水中，磁力搅拌待其完全溶解后通过HCL或氢氧化钠调节pH值为7.4，于4°C保存。（5）PBST溶液0.01MPBS500mLTritonX-1000.5mL用1000μL移液枪吸取500μLTritonX-100加入500mL0.01MPBS中，磁力搅拌使其充分混合后于4°C保存备用。（6）sRIMS溶液（100mL，pH=7.5）山梨醇70g叠氮钠0.01g0.02MPB100mL首先取出20mL事先配好的0.1MPB母液，加入适当的双蒸水，然后称取70g山梨醇、0.01g叠氮钠加入溶液中磁力搅拌溶解最后再加入双蒸水定容至100mL，得到含0.02MPB、70%山梨醇、0.01%叠氮钠总体积100mL的sRIMS溶液，最后用1M氢氧化钠调pH为7.5，常温保存。（7）85%甘油溶液甘油85mL双蒸水15mL用量筒取85mL甘油溶液、15mL双蒸水加入烧杯中，磁力搅拌充分混合后静止待气泡消失，获得85%的甘油溶液。（8）Sca/eA2溶液（100mL，pH=8.5）尿素24g甘油10mLTritonX-1000.1mL称取24g尿素加入适量双蒸水磁力搅拌溶解之后加入10mL甘油、0.1mLTritonX-100，将溶液定容至100mL，得到含4M尿素、10%甘油以及0.1%TritonX-100的Sca/eA2溶液。（9）SeeDB溶液（~20mL）D-果糖23gα-硫代甘油0.1mL称取23gD-果糖溶于适量双蒸水中并定容至约20mL获的饱和果糖溶液，之后用移液枪吸取0.1mLα-硫代甘油加入饱和果糖溶液中得到含0.5%α-硫代甘油的约20mL的SeeDB溶液。13 电子科技大学硕士学位论文2.3实验方法2.3.1CLARITY技术及其实验条件的摸索与优化2.3.1.1心脏灌注取脑及水凝胶成分摸索优化实验（1）电子天平称取1g水合氯醛加入盛有10mL生理盐水的50mL锥形管中，溶解完全后配成10%水合氯醛麻醉剂，置于4°C冰箱备用。（2）按照350mg/kg剂量腹腔注射水合氯醛麻醉小鼠，等待直至小鼠进入深度麻醉状态，可以通过用力掐小鼠尾部观察有无条件反射作为小鼠深度麻醉的依据。（3）待小鼠深度麻醉后，将其固定在解剖板上，然后捏起腹腔表皮以直头眼科剪剪开小鼠腹腔，注意不要误剪到内脏器官。接着用剪子剪破横膈膜并沿着两侧剪开肋骨，用弯头镊子夹住将胸腔上端卷起露出直观的心脏部分，注意千万不可剪到心脏。（4）将事先准备好的5mL磨平针头缓缓插入心尖直至主动脉，进针主动脉的过程会手感顺利没有阻碍，而且最后可以看见针头出现在透明的主动脉根部，然后用动脉夹加紧针头。（5）剪开右心耳作为出血口，先缓慢注射60mL预冷生理盐水直到肝脏发白以及出血口流出的液体再无血色，可以判断大脑内的血液已经冲洗完毕，然后再缓慢注射40mL预冷的水凝胶灌注液。水凝胶溶液中各组分的配比会影响之后形成的固态水凝胶的状态，尤其是丙烯酰胺和甲叉的比率，比例太高会使获得的固体水凝胶孔径过小而不易去除脂质，浓度太低则会影响水凝胶结构稳定性，蛋白容易损失。因此我们配制了4种成分浓度不同的水凝胶溶液以期获得最优的水凝胶成分配比。（6）将灌注完毕的小鼠用平头剪剪下头颅，快速剥离头皮并用剪子镊子等工具打开颅骨，开颅过程注意保持鼠脑的完整性，然后取出鼠脑并撕去脑膜。（7）将得到的脑组织浸泡在锡箔纸包裹的盛有20mL灌注液的50mL锥形管内，4°C冰箱保存三天以使灌注液能够充分的浸透到全脑内。2.3.1.2电泳条件的摸索优化（1）从4°C冰箱取出保存三天含有脑组织的50mL锥形管，通入氮气以替换瓶内氧气（氧气的存在会阻碍水凝胶交联反应的进行），将锥形管密封。（2）将处理好的锥形管置于37°C水浴锅中孵育三小时左右，水凝胶溶液中的丙烯酰胺、甲叉在热引发剂VA044的作用下交联形成固体凝胶状态。14 第二章CLARITY技术实验及条件优化（3）戴上手套在通风口处取出嵌在凝胶内的脑组织并尽可能除去脑组织外周附带的水凝胶。（4）将脑组织置于自制电泳装置中央，如图2-1(a)所示，向电泳水浴循环系统中加入500mLClearingBuffer然后启动系统，如图2-2(b)所示。我们依据文献[27]的建议将电泳中的基本条件电压设为20V，电流设为350mA，水流速为8L/min。这样的设置能够保证在电泳过程中不会损坏组织。然后我们将电泳的温度作为优化条件，以电泳3天为标准，分别测试了37°C、50°C下鼠脑的透明情况。（5）将得到的透明小鼠大脑放入PBST溶液中清洗两天，37°C轻微震荡，每一天更换一次新鲜的PBST溶液以彻底洗去脑组织内的ClearingBuffer。另外，组织可以在PBST溶液中保存数月。2.3.1.3光折射率匹配溶液的优化将组织孵育在光折射率匹配的介质中获得进一步的透明效果是组织成像之前的最后一步。去除了脂质的小鼠大脑在ClearingBuffer中会变得透明，这是因为这时候的小鼠大脑的光折射率和ClearingBuffer非常相近，因此能够使脑组织透明，但是ClearingBuffer中SDS的存在会影响后续的免疫组化及成像效果，因此需要去除干净，并改用适合的光折射率匹配的溶液作为成像的组织封固剂。在这部分实验中，我们测试了85%甘油、sRIMS、SeeDB、Sca/eA2作为光折射率匹配溶液时的透明效果。2.3.2透明度、膨胀率及BCA法测蛋白损失统计分析2.3.2.1紫外分光光度计法检测组织透明度我们采用紫外分光光度计测量透明脑的透明度。首先，打开紫外分光光度计，测量空载样品池作为基线调零。然后通过小鼠脑模具获得1mm厚的冠状中脑切片并将切片置于载玻片上，盖好盖玻片。最后将准备好的玻片置于紫外分光光度计的样品池内固定角度让检测光线能够垂直穿过脑片所在位置，检测600nm波长的透过率，保存光谱，每组重复检测三只小鼠。PBS处理的未透明的鼠脑作为对照组。2.3.2.2透明脑膨胀率的测定CLARITY技术中水凝胶多孔网状物质的主要成分为多聚甲醛（固定剂）、丙烯酰胺（水凝胶单体）以及双丙烯酰胺（交联剂）。其中丙烯酰胺和双丙烯酰胺的比率会直接影响生成的水凝胶的孔径大小以及刚性。孔径越大则越利于脂质15 电子科技大学硕士学位论文去除从而提高透明效率，但同时水凝胶的稳定性也会越差。CLARITY技术引入的水凝胶结构在经过电泳之后发生水合作用会变得比原来膨大，在一定程度上会改变组织的架构，因此水凝胶膨胀率可以作为组织架构受到不利影响的一个指标。我们通过测量脑组织的表面积膨胀率近似反映组织的改变率，大致步骤是将脑样品置于盛有clearingbuffer的12孔板内采集样品的俯视图片，然后采用ImageJ软件测量脑样品的轮廓面积，为了减少误差，每只鼠脑重复五次测量取平均值作为该脑组织的表面积，将灌注后未进行透明的鼠脑作为对照组。表面积膨胀率=(透明脑表面积－灌注后未透明脑表面积)/(灌注后未透明脑表面积)。2.3.2.3BCA法测电泳过程蛋白损失率本实验采用BCA试剂盒CW0014（组分：试剂A、试剂B、BSA标准品（2mg/ml））进行电泳后clearingbuffer蛋白浓度的测定。具体操作步骤如下：a、准备7个1.5mL离心管，将试剂盒自带的牛血清蛋白BSA标准品用clearingbuffer稀释成不同浓度梯度的BSA溶液，见表2-1：表2-1不同浓度梯度的BSA溶液配制管号稀释液用量（μL）BSA标准品用量（μL）BSA标准品最终浓度（μg/μL）A01002B2002001C200200（从B管中取）0.5D200200（从C管中取）0.25E200200（从D管中取）0.125F200200（从E管中取）0.0625G20000（空白）b、配制BCA工作液。首先计算BCA工作液总量，根据算式：BCA工作液总量=（BSA标准品样本个数+未知样本个数）×复孔数×每个样本BCA工作液体积，然后根据计算出的BCA工作液总量将试剂盒自带的的试剂A和试剂B按照50:1的体积比配置成BCA工作液，充分混匀。c、进行蛋白浓度定量检测。首先将稀释好的A-GBSA标准品和待测蛋白样品各25μL分别加入做好标记的96孔板微孔中，然后每孔再加入200μLBCA工作液，盖上96孔板盖，37°C孵育30分钟。冷却至室温后用酶标仪在540-590nm范围内，测定每个样品及BSA标准品吸光度值，绘制标准曲线，计算样品中蛋白浓度。16 第二章CLARITY技术实验及条件优化2.3.2.4统计分析所有的数据都采用Mean±SEM的形式，采用Origin9.0软件进行绘图，数据统计采用版本为Windows®v.17的SPSS分析软件（SPSSInc.，Chicago，USA），统计分析的显著性水平定为p＜0.05。2.3.3免疫组织化学染色及共聚焦三维成像2.3.3.1免疫组织化学染色组织在经过电泳去脂光学透明之后用新鲜配制的PBST清洗两天，每隔一天更换一次新鲜PBST用以去除组织内的SDS。之后行免疫组织化学染色，以1-2mm厚的透明组织切片为例，具体步骤操作如下：a、将组织置于24孔板中，加入含有1:200一抗、5%驴血清的PBST约500mL，4°C冰箱孵育3-5d。b、从4°C冰箱中取出组织，PBST轻微震荡清洗一天，中间更换4次PBST以去除多余的没有被结合的一抗。c、将清洗好的组织避光置于含有1:200二抗、5%驴血清的PBST约500mL，4°C冰箱避光孵育3d。d、将含有DAPI的PBST轻微震荡清洗组织一天，进行细胞核复染以及清洗多余的没有被结合的二抗。本部分实验采用小鼠脑模具获得1mm脑切片进行免疫组化染色，用到的一抗为羊抗人14-3-3zeta抗体(1:200；RD)、二抗为AlexaFluor488-共轭驴抗羊IgG(1:200；Invitrogen)。2.3.3.2双光子共聚焦三维成像1mm厚脑切片经过抗体孵育及清洗等免疫组织化学染色步骤之后，将切片置于共聚焦小皿内，并加入85%甘油作为光折射率匹配溶液，待切片达到最佳透明效果之后进行双光子共聚焦成像。双光子共聚焦荧光显微镜采用两个通道，其中一个激发波长设为800nm，以激发AlexaFluor516nm的绿色荧光发射，另外一个激发波长设为700nm以激发DAPI在455nm的蓝色荧光发射。采用Imarisv7.5.2图像软件进行3维图像分析。17 电子科技大学硕士学位论文2.4实验结果2.4.1CLARITY技术及其实验条件的摸索与优化2.4.1.1电泳装置及水浴循环系统的构建CLARITY技术的关键步骤是搭建符合要求的电泳体系以便有效去除脑组织内的脂质。本论文中我们通过文献[26]提供的资料选购了体积约30mL的容器、长50cm直径0.5mm的铂丝以及香蕉插头等材料自制成电泳装置（Electrophoretictissueclearing，ETC），如图2-1(a)所示。图2-1电泳装置（ETC）图(a)以及水浴循环系统原理图（b）在此基础上，我们根据本实验室现有条件，采用水浴锅作为液体温度调节器，将常规的琼脂糖凝胶电泳的电源作为自制电泳装置的供电源，配上流速为8L/min的无刷直流水泵以及相应的硅胶导管建立起一套完整的电泳水浴循环系统，具体原理如图2-1(b)所示。经测试，我们的电泳装置最大输入电压能够达到60V，完全能满足实验要求。2.4.1.2电泳温度及水凝胶配比的优化在构建好电泳水浴循环系统后，为了探究最为理想的电泳温度以及最佳水凝胶组分比率，我们按照温度37°C、50°C以及4种水凝胶配比将小鼠分成8组，每组3只进行实验，电泳输入电压控制为20V，电流为350mA，控制电泳时间为3天。18 第二章CLARITY技术实验及条件优化图2-2不同电泳温度（50°C、37°C）以及水凝胶溶液成分配比（丙烯酰胺：多聚甲醛：双丙烯酰胺）条件下的小鼠大脑图2-34种水凝胶溶液成分配比（丙烯酰胺：多聚甲醛：双丙烯酰胺）条件下的小鼠大脑透明度(a)以及组织膨胀率(b)。（Mean±SEM，n=3,图a中*表示VS37℃组；图b中*表示VS4:4:0.05组，#表示VS4:4:0.025组，*P<0.05,#P<0.05）19 电子科技大学硕士学位论文如图2-2所示，我们获得了共8组小鼠透明脑，采用紫外分光光度计对所获得的透明脑进行透明度分析，通过比较我们可以发现电泳温度控制在50°C普遍要比37°C透明效果好(P<0.05)。另外，我们检测了50°C电泳温度下4种水凝胶配比的组织膨胀率，配比为4:4:0.05和其他组相比具有显著性差异，其小鼠大脑膨胀率最小(P<0.05)，如图2-3所示。因此我们获得的最佳电泳温度为50°C，水凝胶配比为4:4:0.05。2.4.1.3光折射率匹配溶液的优化CLARITY技术成像之前的最后一步是将组织孵育于合适的光折射率匹配介质中进一步透明组织。在这里我们同样展开了相关工作，我们选择了和组织光折射率非常接近的85%甘油、sRIMS、SeeDB以及Sca/eA2这四种介质进行探究，然后借助紫外分光光度计分析组织处理之后的透明程度，如图2-4所示。图2-4不同光折射率匹配溶液的透明效果比较。a、b、c、d依次为85%甘油、SeeDB、sRIMS以及Sca/eA220 第二章CLARITY技术实验及条件优化图2-54种光折射率匹配溶液下小鼠大脑透明度(a)以及膨胀率(b)。（Mean±SEM，n=3,图a中*表示VSSeeDB组；图b中*表示VSSca/eA2组，#表示VSSeeDB组，*P<0.05,#P<0.05）在实验中我们发现将电泳去脂后的组织孵育于85%甘油、sRIMS以及SeeDB中组织会基本收缩回原来的尺寸大小，而采用Sca/eA2作为光折射率匹配溶液时组织还保留40%左右的膨胀(P<0.05)，如图2-5(b)所示。另外，我们采用紫外分光光度计检测组织透明度，通过比较不难发现当组织孵育于sRIMS以及Sca/eA2的透明效果最好(P<0.05)，限于之前提到的Sca/eA2会维持组织较大的膨大率，因此我们选择sRIMS作为光折射率匹配溶液。2.4.2BCA法测蛋白损失量测定在验证了使鼠脑达到最佳透明度的实验条件之后，为了进一步探究电泳过程蛋白的损失率，我们采用BCA法检测8组小鼠透明完毕之后clearingbuffer内的蛋白浓度。我们采用酶标仪检测了540nmBSA标准品吸光度值，每个样本重复测量三次并取平均值，绘制标准曲线，如图2-5所示。得到蛋白浓度X对吸光度值Y的线性回归方程Y=0.56863X+0.06999(R2=0.99072)。21 电子科技大学硕士学位论文图2-6BSA标准曲线(a)以及两种电泳温度下clearingbuffer的蛋白含量(b)获得了标准曲线之后，我们测量了37°C以及50°C电泳后clearingbuffer内的蛋白含量，每组重复三次。如图2-6所示，通过比较我们发现37°C和50°C的蛋白损失率并没有明显的显著性差异。基于上述所有数据分析电泳温度采用50°C、水凝胶组分多聚甲醛：丙烯酰胺：甲叉配比采用4:4:0.05，光折射率匹配溶液选定sRIMS作为CLARITY技术获取透明脑的最优条件。2.4.3免疫组织化学染色及共聚焦三维成像在获得透明脑切片之后我们开展免疫染色及成像实验。羊抗人14-3-3zeta抗体以及驴抗羊AlexaFluor488分别为一抗和二抗，DAPI核复染。切片经过抗体孵育及清洗步骤之后，将切片置于共聚焦小皿内，并加入sRIMS作为光折射率匹配溶液，待切片达到最佳透明效果之后进行双光子共聚焦成像。双光子共聚焦荧光显微镜采用两个通道，其中一个激发波长设为800nm，以激发AlexaFluor516nm的绿色荧光发射，另外一个激发波长设为700nm以激发DAPI在455nm的蓝色荧光发射，如图2-7所示。图中绿色显示的是14-3-3zeta蛋白，蓝色为细胞核，从图中我们可以观察到非常清晰的丝状结构的14-3-3zeta蛋白。22 第二章CLARITY技术实验及条件优化图2-7小鼠1mm厚透明冠状切片3D成像。绿色标记为14-3-3zeta蛋白三维构像；蓝色为DAPI标记的细胞核2.5讨论CLARITY技术作为一项较新的组织透明技术，其技术本身尚有较大改进完善空间。CLARITY技术最大的困难首先在于电泳体系的构建，包括自制电泳装置以及配备符合要求的恒温水循环系统。虽然后来的文献提出可以采用被动热扩散的方式代替电泳去除脂质，但是这种方法很大程度上延长了透明所需时间（透明完整小鼠大脑需要约一个月）[27]，因此电泳仍然是发挥CLARITY技术全部优势必须的步骤。另外，最初的CLARITY文献提到电泳条件并没有统一标准，可以采用不同的电压以及温度组合进行电泳。通常来说，电泳温度和电压越高，组织透明的进程也会更快，但是由此导致组织的损害也会增加。对于透明成年小鼠全脑，作者建议电压控制在10-60V之间，温度控制在37-55°C，在这样的范围限定下探索最优化的电泳条件对于CLARITY技术的有效开展是十分必要的[26]。本章实验我们首次制作出来的电泳装置并不能够有效的去除脂质，只获得了边缘透明的小鼠大脑（数据未显示），我们推测是由于电泳装置容积过大（约120mL）导致输入电压达不到要求（只达到6V），后来改用容积为30mL的容器做出的电泳装置最大输入电压能够达到60V，远远满足实验要求。接下来我们根据作者的建议，首先将电压控制为20V，保证电泳过程不会因为电压过高引起组织损坏，之后对最佳电泳温度进行了摸索工作，我们选择了37°C以及50°C进行实验，通过紫外分光光度计测量透明度以及BCA法测蛋白损失率我们发现50°C透明效果最好，并且这两个温度下电泳导致的蛋白损失率并没有显著性差异。23 电子科技大学硕士学位论文水凝胶溶液成分尤其是丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的比率会直接影响到之后形成的水凝胶固体结构的孔径大小以及稳定性，孔径越大越有利于脂质去除，但同时也增加蛋白损失的风险以及水凝胶的不稳定性。水凝胶因为透明过程发生水合作用导致体积膨胀是CLARITY技术可能的技术缺陷，因此体积膨胀率可以作为水凝胶稳定性的一个指标。我们选择了4种不同成分比率的水凝胶溶液进行实验，通过透明度、蛋白损失率以及膨胀体积等数据分析我们确定最终确定电泳温度为50°C、水凝胶配比（多聚甲醛：丙烯酰胺：甲叉）选择4:4:0.025作为最佳透明脑获取条件。CLARITY技术成像之前的最后一步是将透明组织孵育于合适的光折射率匹配封固溶液中，以获取进一步的透明效果。最初报道的CLARITY文献作者推荐使用FocusClear作为封固液，因为这种试剂非常匹配水凝胶结构的光折射率（~1.45），但这种商业化的专利试剂价格非常昂贵，许多有关CLARITY的文献都提到FocusClear是阻碍CLARITY技术普遍应用的一个关键因素。为此寻找价格合适并具有和FocusClear同等效用的封固剂是CLARITY技术完善的另一个关键点。目前价格合适，配制容易的85%甘油、RIMS、sRIMS、Sca/eA2、SeeDB以及47%、60%的TDB都曾被报道用作CLARITY透明组织的光折射率匹配溶液。但是这些试剂处理不同组织、其透明效果也存在差异，比如在LiuAK实验室里，他们就发现在荧光保存以及透明程度方面，RIMS处理转基因小鼠组织要比人组织效果更好，他们推断可能与光折射匹配溶液的渗透压有关[35]。因此在这一部分的研究中，我们选择了85%甘油、sRIMS、Sca/eA2以及SeeDB这4种溶液进行透明效果探究。实验中我们发现85%甘油、sRIMS及SeeDB在处理过程中组织会缩小为原来的尺寸，而Sca/eA2则基本维持组织的膨胀尺寸，如图2-5所示。另外，随着孵育时间的延长，这4种溶液只有85%甘油会使组织内部逐渐出现不透明的白色小斑点（数据未显示）。根据紫外分光光度计测量的透明度结果显示采用sRIMS以及Sca/eA2透明的效果最好，考虑到之前提到的CLARITY会导致原来的组织膨胀的缺陷，我们最终选择sRIMS作为光折射率匹配溶液。最后研究了通过条件优化后获得的透明脑的三维成像效果，首先采用小鼠脑模具将鼠脑进行1mm切片，然后通过免疫染色以及双光子共聚焦成像研究与神经疾病密切相关的14-3-3zeta蛋白，成功获得了高分辨率的14-3-3zeta蛋白的三维结构，从成像结果我们可以观察到十分明显的丝状结构的14-3-3zeta蛋白。这些前期的工作为后续将CLARITY技术应用于神经疾病的研究奠定了基础。24 第二章CLARITY技术实验及条件优化2.6本章小结（1）通过摸索成功制成有效的电泳装置并建立符合本实验室条件的电泳水浴循环系统。（2）进行CLARITY技术实验条件如电泳温度、水凝胶配比以及光折射率匹配溶液的选择等实验条件优化，电泳温度选择50°C、水凝胶配比选择4:4:0.05、光折射率匹配溶液选择sRIMS为最优的实验条件。（3）采用优化之后的CLARITY技术条件获取的透明脑开展免疫组织化学染色以及共聚焦三维成像，成功获得了高分辨率的14-3-3zeta蛋白的三维结构信息。25 电子科技大学硕士学位论文第三章CLARITY技术应用于颞叶癫痫模型鼠的初步研究3.1引言如前言所述，颞叶癫痫是一种较常见的神经疾病。前人研究发现：磷酸化Tau蛋白和14-3-3zeta在癫痫发作过程中均发挥了一定作用，但两者之间是否存在相互作用尚不清楚。鉴于上述考虑，在本章中我们首先构建颞叶癫痫鼠模型，然后通过普通切片免疫组织化学染色及成像观察到了14-3-3zeta蛋白与磷酸化Tau蛋白存在相互作用，并且发现颞叶癫痫海马区神经元的树突发育受到影响。最后采用CLARITY技术处理了含有完整海马的约3mm厚小鼠脑切片，并进行免疫荧光探讨了14-3-3zeta和磷酸化Tau蛋白的空间共定位，得到初步的三维成像结果。3.2实验材料3.2.1实验动物6-8周龄体重20-25g雄性昆明小鼠购自四川省医学科学院实验动物中心，饲养室温度23±1.5°C，湿度50%~60%，白昼开始于8:00a.m.，昼夜12h交替，给予标准饲料及自由饮水。动物处理遵守国家健康协会制定的实验动物护理和使用指南。3.2.2主要试剂氯化锂Sigma匹鲁卡品Sigma溴甲基东莨菪碱Sigma地西泮Sigma-Aldrich硫化钠成都市科龙化工试剂厂阿拉伯胶成都市科龙化工试剂厂一水合柠檬酸成都市科龙化工试剂厂二水合柠檬酸钠成都市科龙化工试剂厂对苯二酚成都市科龙化工试剂厂硝酸银成都市科龙化工试剂厂羊抗人14-3-3zeta抗体RD兔抗鼠p-262抗体Abcom26 第三章CLARITY技术应用于颞叶癫痫模型鼠的初步研究鼠抗鼠Map2抗体AbcomAlexa488结合的驴抗羊IgGInvitrogenAlexa488结合的驴抗鼠IgGInvitrogenAlexa569结合的驴抗兔IgGInvitrogenDAPI瑞士Roche公司驴封闭血清索莱宝生物公司3.2.3实验仪器和设备恒温磁力搅拌器中国金坛市科析仪器有限公司HJ-4A冰箱中国青岛海尔股份有限公司制冰机SCOTSMAN超纯水处理系统Millipore电子分析天平中国北京赛多利斯科学仪器有限公司恒温水浴锅中国金坛市科析仪器有限公司KW-1000DC移液枪EPPENDORFRESEARCHpH计中国上海精科PHS-3C型恒温摇床中国上海智城分析仪器制造有限公司冰冻切片机德国Leica正置荧光显微镜日本Olympus共聚焦荧光显微镜BX51，Olympus3.2.4主要溶液配制（1）Timm染色液配制（100mL）50%阿拉伯胶60mL2M柠檬酸缓冲液10mL5.6%对苯二酚30mL17%硝酸银0.5mL制备步骤：a、取阿拉伯胶30g，加入双蒸水60mL，搅拌，静置24h后以双层纱布过滤，获得50%阿拉伯胶溶液60mL。b、取一水合柠檬酸25.5g，二水合柠檬酸钠23.5g，双蒸水100mL，获得2M柠檬酸缓冲液100mL。c、取对苯二酚1.68g，加入30mL去离子水，获得5.6%对苯二酚溶液30mL。27 电子科技大学硕士学位论文染色前将60mL阿拉伯胶、10mL的2M柠檬酸缓冲液以及30mL5.6%对苯二酚在暗室内充分混合，最后加入0.5mL17%硝酸银。（2）0.37%硫化钠硫化钠1.85g0.01MPBS溶液500mL称取1.85g硫化钠固体溶于500mL的0.01MPBS溶液中，搅拌待其完全溶解后于4°C冰箱保存。（3）水凝胶灌注液、ClearingBuffer、PBS溶液、PBST溶液、sRIMS溶液配制步骤参照2.2.43.3实验方法3.3.1锂-匹鲁卡品癫痫造模30只成年雄性昆明小鼠随机分为两组，分别为对照组（n=10）和模型组（n=20）。按照文献[52]提供的信息以及我们自己的摸索建立锂-匹鲁卡品颞叶癫痫小鼠模型，过程如下：首先小鼠按照127mg/kg的剂量腹腔注射新鲜配制的氯化锂溶液。隔18-20小时之后，先按照1mg/kg的剂量腹腔注射溴甲基东莨菪碱，目的是为了减轻胆碱能外周反应。然后隔20min之后给予匹鲁卡品。匹鲁卡品初始剂量为230mg/kg，然后每隔20min继续注射一次减半剂量的匹鲁卡品直到诱发小鼠出现一系列持续不间断的惊厥症状，即癫痫持续状态（SE）。发作强度标准按Racine分级[53]，如表3-1所示。表3-1Racine标准Racine标准0级无任何惊厥反应I级动作固定、眨眼、面肌抽搐II级湿狗样动作（WDS）、节律性点头运动III级双侧前肢阵挛，或一侧前肢或后肢频繁性抽搐IV级双侧前肢阵挛，后肢站立V级四肢抽搐并跌倒、旋转待小鼠出现连续不间断的Ⅳ级及以上SE发作持续达90min后，立即按照10mg/kg的剂量给予镇静剂地西泮以终止SE发作。待小鼠平静下来之后皮下注射28 第三章CLARITY技术应用于颞叶癫痫模型鼠的初步研究葡萄糖溶液，补充小鼠体液及能量损失。在建模后3天内小鼠不能正常饮食，可以给予糊状鼠粮。在接下来的实验中，5只小鼠在72小时内死亡。3.3.2Timm染色实验造模组小鼠于造模后60天，以10%水合氯醛深度麻醉后，进行心脏灌注手术，方法同前文所述。先缓慢注射60ml生理盐水冲血，再注射0.37%硫化钠约40mL，最后灌注4%多聚甲醛固定液60mL，取脑后浸入4%多聚甲醛继续固定1天。将固定好的鼠脑先置于15%蔗糖溶液直至沉底后再置于30%蔗糖溶液至沉底进行组织脱水处理。将脱水后的鼠脑于冰冻切片机进行连续冠状切片，切片厚度40μm，将切片用毛笔轻轻扫入事先准备好的盛有0.01MPBS的24孔板中每孔装7张脑片，4°C冰箱保存。将保存的切片取出用新鲜的PBS漂洗之后贴附于表面经正电荷处理过的防脱载玻片上晾干进行Timm染色，具体步骤如下：a、暗室内将切片放入盛有Timm染色液的染色缸内，然后放入26°C恒温培养箱孵育1h。b、将孵育好的切片于暗室内用双蒸水清洗15min，移出暗室，再次用双蒸水清洗15min以清除附带的染色液。c、进行常规脱水、透明、封片操作：依次将切片浸入75%乙醇5min，85%乙醇5min，95%乙醇5min，100%乙醇5min进行脱水。将脱水后切片浸入二甲苯5min，更换新鲜二甲苯再次浸泡5min进行透明处理，最后用中性树胶封片。d、采用普通光学显微镜分别放大40倍和400倍观察海马齿状回颗粒细胞层上区Timm染色颗粒，每只小鼠随机选取4张片子进行统计，4张片子的平均值作为该只小鼠的Timm染色评分值，苔藓出芽评分标准如表3-2所示[54]。表3-2齿状回颗粒细胞上区苔藓纤维出芽评分标准评分标准0分颗粒细胞上区未见Timm颗粒1分颗粒细胞上区偶见散在的片状分布的Timm颗粒2分颗粒细胞上区有较多片状分布的Timm颗粒3分颗粒细胞上区Timm颗粒接近连续分布4分颗粒细胞上区浓密的Timm颗粒，连续接近连续分布5分颗粒细胞上区浓密、层带状Timm颗粒，连续分布29 电子科技大学硕士学位论文3.3.3免疫染色及成像造模组小鼠于造模后60天进行CLARITY技术处理获得透明小鼠大脑，然后进行透明脑组织免疫组织化学染色及共聚焦成像实验，操作步骤参照2.3.3。3.4实验结果3.4.1颞叶癫痫小鼠模型的构建及检测3.4.1.1锂-匹鲁卡品颞叶癫痫小鼠行为检测造模组一共20只小鼠进行腹腔注射匹鲁卡品，之后密切观察小鼠的行为活动。图3-1显示了小鼠不同的SE发作，对应不同的惊厥强度。待小鼠达到IV级及以上SE发作持续达90min后，立即按照10mg/kg的剂量给予镇静剂地西泮以终止SE发作。实验中匹鲁卡品给药组所有小鼠均达到IV级以上SE发作。图3-1a、b、c、d依次为节律性点头、前肢阵挛、后肢站立及跌倒发作，分别代表II、III、IV和V级发作将造模组小鼠单笼饲养60天，起初3天内小鼠不能正常饮食，给予糊状鼠粮。每天关注小鼠行为表现并统计小鼠存活率。5只小鼠在注射匹鲁卡品之后72小时内死亡，小鼠存活率达到75%。存活下来的小鼠在两个星期之后开始出现癫痫的反复自发发作，最初多为局部性发作如前肢阵挛或面部抽搐，很快发展至全身强直性惊厥发作，发作持续时间一般不超过1min，均可自行终止。对照组小鼠未见到任何癫痫样发作。3.4.1.2Timm染色观察颞叶癫痫海马齿状回苔藓出芽（MFS）造模组小鼠于造模后60天进行Timm染色实验以检测海马齿状回苔藓纤维出芽情况。通过对比我们可以观察到模型组小鼠海马的齿状回颗粒细胞上区呈现出较浓密的、层带状连续分布的Timm颗粒，正常组在相同的位置无明显的Timm颗粒，如图3-2所示。根据齿状回颗粒细胞上区苔藓纤维出芽评分标准评分为430 第三章CLARITY技术应用于颞叶癫痫模型鼠的初步研究分左右，显著高于正常组(P<0.05)，如图3-2(e)所示。说明我们的颞叶癫痫模型已经成功建立。图3-2正常组和匹鲁卡品组海马切片Timm染色以及苔藓出芽评分。a、b代表正常组的完整海马以及齿状回分子层；c、d代表匹鲁卡品诱发组完整海马以及齿状回分子层。MFS染色用箭头标示，左边图片放大40倍，右边图片是左图方框放大400倍效果图。e为正常组和癫痫组的苔藓纤维出芽评分统计。Mean±SEM，n=4,*表示和正常组相比，*P<0.053.4.2免疫染色及成像3.4.2.1普通切片免疫染色及成像为了验证颞叶癫痫鼠脑中14-3-3zeta蛋白与磷酸化Tau蛋白是否存在相互作用，以及海马神经元树突的形态是否发生变化，我们首先进行了普通切片进行二维水平观察。31 电子科技大学硕士学位论文图3-314-3-3zeta蛋白与磷酸化tau蛋白共染于海马CA1区。a、d分别表示正常组和癫痫组的14-3-3zeta(绿色)染色；b、e分别表示正常组和癫痫组的磷酸化tau蛋白(红色)相同区域的染色；重叠图片(c、f)显示14-3-3zeta共染p-tau(箭头所示)；蓝色为DAPI核复染我们首先观察了14-3-3zeta蛋白与磷酸化Tau蛋白的共定位，分别采用相应的抗体标记了14-3-3zeta蛋白和磷酸化Tau蛋白，如图3-3所示，绿色标记的是14-3-3zeta蛋白，红色标记的磷酸化Tau蛋白，通过比较正常组与癫痫组双染色，我们发现癫痫组14-3-3zeta与磷酸化Tau蛋白出现荧光标记信号，并且共定位于海马CA1区（f）。除了观察到两类蛋白的相互作用以及空间定位之外，我们还采用MAP2标记神经树突以研究癫痫发病对于树突的影响，如图3-4所示。通过的比较我们可以发现，与正常组相比，癫痫组海马神经元树突较为短小杂乱。32 第三章CLARITY技术应用于颞叶癫痫模型鼠的初步研究图3-4海马CA1区MAP2免疫染色。a、b分别表示正常组和癫痫组Map2(绿色)染色；蓝色为DAPI细胞核复染3.4.2.2透明脑切片免疫染色及三维成像为了验证CLARITY技术是否可以用于癫痫研究我们进行了透明透明脑切片免疫组化及三维成像实验。我们首先采用震动切片机完整的切下包含整个海马的约3毫米厚的脑切片，然后采用之前优化好的CLARITY技术实验条件进行脑切片透明，如图3-5所示。图3-5CLARITY处理前(a)以及处理后(b)的3mm厚小鼠脑冠状切片33 电子科技大学硕士学位论文我们将获得的透明脑切片进行免疫染色后采用共聚焦显微镜进行三维成像，结果如图3-6所示。从图中我们可以观察到14-3-3zeta蛋白与Tau蛋白的三维结构，以及它们的空间共定位。图3-614-3-3zeta和磷酸化Tau蛋白共定位于透明海马区的共聚焦三维成像。蓝色为DAPI细胞核复染3.5讨论成功获取可靠的癫痫动物模型是实验开展的基础。颞叶癫痫造模方法常见的有海人酸模型、戊四氮（CTZ）点燃模型以及匹鲁卡品模型，其中匹鲁卡品动物模型因为具有和人类颞叶癫痫相似的特征、致痫成功率高以及制作简单等优点而被公认为是理想的边缘系统癫痫模型[55]。因此本章实验选择匹鲁卡品小鼠癫痫模型进行研究。刚开始我们按照文献[52]的匹鲁卡品剂量进行一次性给药，发现只能诱发小鼠II级左右的轻度癫痫发作，之后我们将匹鲁卡品剂量增设到300mg/kg，结果小鼠阵挛并且几乎很快就死亡，经过摸索最后我们决定将匹鲁卡品的初始给药剂量调整为230mg/kg，然后每隔20min继续注射一次减半剂量的匹鲁卡品终于成功诱发小鼠出现VI到V级不间断的惊厥症状（SE），并且颞叶癫痫组模型鼠存活率达到75%左右，如图3-1所示。前文已经提到苔藓纤维出芽（MFS）是颞叶癫痫的一个独特的病理特征，而Timm染色法是经典的MFS标记法，因此我34 第三章CLARITY技术应用于颞叶癫痫模型鼠的初步研究们通过Timm染色法确定匹鲁卡品给药小鼠是否已经成功被诱发出慢性颞叶癫痫，如图3-2所示。颞叶癫痫发病过程中磷酸化Tau蛋白表达量会增加，而14-3-3zeta蛋白是一类会靶向结合丝氨酸或苏氨酸位点磷酸化的蛋白，为了验证在颞叶癫痫发病过程中这两类蛋白是否会存在相互作用，以及这两类蛋白的富集位置我们进行了探索实验。我们首先进行了普通薄切片免疫荧光实验，结果显示14-3-3zeta蛋白与Tau蛋白在颞叶癫痫小鼠海马CA1区出现荧光信号，而且荧光信号能够重叠在一起说明它们之间存在相互作用，正常组中并没有观察到相应的荧光信号，这是尚未见报道的结果。另外我们通过树突免疫染色发现癫痫小鼠和正常小鼠相比海马CA1区树突形态较为短小杂乱，说明癫痫的发病会影响到海马神经元发育，相关实验结果需要后续进一步验证。为了形象地观察到这两类蛋白的空间结构以及相互作用信息，我们首先采用CLARITY技术透明约3毫米带有完整海马的癫痫脑切片，如图3-5所示。并进行免疫染色及共聚焦三维成像，我们可以观察到条带状的14-3-3zeta蛋白与斑块状的磷酸化Tau蛋白的三维共定位信息，说明CLARITY技术完全能够应用于癫痫的病理成像研究，并为之后深入开展癫痫的三维成像研究奠定基础。3.6本章小结（1）通过摸索给药剂量获得了存活率达到75%的颞叶癫痫组模型鼠，并通过Timm染色检测到癫痫组小鼠齿状回苔藓纤维出芽（MFS），确定成功获得可靠的颞叶癫痫小鼠模型。（2）普通切片免疫组织化学染色结果证明颞叶癫痫海马区14-3-3zeta蛋白和磷酸化Tau蛋白表达增加并存在相互作用。另外，颞叶癫痫鼠海马CA1区的神经发生与正常组相比存在差异。（3）采用CLARITY技术获取了含有完整海马约3mm厚小鼠脑切片并进行免疫组织化学染色及共聚焦成像获取了14-3-3zeta蛋白与磷酸化Tau蛋白的三维空间共定位信息。35 电子科技大学硕士学位论文第四章全文总结及展望4.1总结本文第一章我们提到目前获取厚组织高分辨率三维成像的困难所在及相应的应对方式，包括机械切片三维重构法以及光折射率均一化法。前者由于过程繁琐，并造成组织的不连续等因素一般仅限于小组织精度成像；而光折射率均一化法在原理上降低了光散射从而允许完整组织成像，但是以此原理为基础的各类组织光透明技术皆不能够有效的解决经试剂处理之后，原有组织架构的改变而衍生出的问题。CLARITY技术作为一项较新的组织透明技术，首次引入透明的水凝胶代替原有组织架构，并且组织中主要的生物大分子物质如核酸，蛋白以及小分子神经递质能够保持原样附着在水凝胶上，而脂质作为阻碍光子以及大分子抗体标记物进入组织内部的“罪魁祸首”则通过电泳的方式去除。CLARITY技术总体上解决了以上提到的传统生物组织光透明技术遗留的问题。自从CLARITY技术2013年被报道以来，以其无法比拟的优势受到各地课题组的青睐，许多人对它进行了改进完善，并将其运用于疾病的成像研究，获得了许多重要成果。因此其技术本身便是本文研究的一个意义所在。本文第二章我们的主要工作是成功建立起本实验室的一套电泳水浴循环装置，测试并优化了CLARITY实验条件，最后我们进行了免疫组织化学染色以及共聚焦三维成像，为下一步的神经疾病研究奠定基础。CLARITY技术关键步骤是需要合适的电泳循环系统，其主要核心部件是自制的电泳装置、能够有效带走电泳装置热量的水泵以及保持系统温度恒定的仪器。制作出符合要求的电泳装置存在一定的困难，我们最初制作出来的电泳装置就因为输入电压达不到预期值而导致仅获得边缘透明的小鼠脑。另外，需要考虑配套合适流速的水泵，以便能够及时将电泳产生的热量带走不致损坏组织样品。我们最初采用了流速较慢的蠕动泵，最后得到的透明组织已经呈现焦黄状态，表明组织已经受到了严重损坏（数据未显示）。后来我们改进了电泳装置，采用常规凝胶电泳电源作为供电源，其输入电压最大能够达到60V，完全符合电泳需求，同时采用流速达到8L/min的无刷水泵作为水循环泵。我们将搭建好的装置放入实验室常用的恒温水浴锅内以保证整套系统处于恒定的温度中。通过一系列的测试证明我们的电泳水浴循环系统能够非常有效的获取高质量的透明脑组织，在此基础上我们进一步优化实验条件，包括电泳温度、水凝胶溶液配比以及光折射率匹配溶液的选择等，并测量了相应的电泳蛋白损失率，获得最佳的实验条件。之后我们进行了1mm厚小鼠脑36 第四章全文总结及展望切片共聚焦三维成像，获得了14-3-3zeta蛋白的高分辨率三维结构图，证明通过我们优化实验条件得到的透明脑能够完全应用于共聚焦三维成像。本文第三章内容主要为将掌握的CLARITY技术初步应用于颞叶癫痫模型小鼠的成像研究。CLARITY技术目前已经运用于多种神经疾病的成像研究，包括灰质萎缩以及阿兹海默症等[33,34]，而关于癫痫的研究尚未见报道，因此选择癫痫作为研究对象即本文研究的另一个意义所在。我们首先根据文献以及自己摸索给药剂量成功建立了颞叶癫痫模型，然后我们选择14-3-3zeta蛋白和磷酸化Tau这两类和癫痫发病密切相关的蛋白进行研究。通过普通切片免疫染色我们发现14-3-3zeta蛋白与磷酸化Tau蛋白共定位于颞叶癫痫鼠海马区，而对照组的正常小鼠则没有相关荧光信号产生，之后我们透明了约3mm厚包含完整海马的颞叶癫痫小鼠脑切片并进行共聚焦三维成像，获得了14-3-3zeta蛋白与Tau蛋白的空间共定位信息，相关研究需要进一步深入展开。4.2展望4.2.1CLARITY技术应用于颞叶癫痫的全脑成像CLARITY技术的最大优势是能够实现全脑成像。目前，该方法尚未运用于颞叶癫痫疾病的研究，我们后续拟采用免疫荧光接合共聚焦荧光显微镜的手段，研究各种与树突、轴突相关的蛋白、以及神经营养因子、神经细胞粘附因子等在全脑中的空间分布，以及在癫痫发作过程中的时间分布。4.2.2针对磷酸化Tau蛋白开展药物干预实验如前言所述，颞叶癫痫在发病过程中会伴随Tau蛋白磷酸化水平增加，并且出现具有代表性的苔藓纤维出芽（MFS）病理特征，目前已有证据表明Tau蛋白磷酸化水平增高与MFS的发生过程具有时间以及空间的同步性，提示Tau蛋白磷酸化是引起MFS进而导致反复癫痫样发作的关键。Tau蛋白的磷酸化水平由蛋白激酶以及磷酸酯酶所调控，目前已发现了几种对于Tau蛋白磷酸化非常重要的蛋白激酶，它们分别是cAMP依赖性蛋白激酶（cyclin-AMP-dependentproteinkinase，PKA）、周期素依赖性蛋白激酶5（cyclindependentkinase5，CDK5）以及糖原合成酶激酶3（glycogensynthasekinase3，GSK3）。PKA能催化Tau蛋白Ser214、Ser262以及Ser409这3个位点磷酸化，对于Tau蛋白早期的异常磷酸化作用具有重要贡献。另外，研究发现戊四氮（CTZ）点燃模型中的CDK5蛋白表达增加，Tau蛋白Ser202位点的磷酸化也相应升高，揭示CDK5可能通过磷酸化Tau蛋白37 电子科技大学硕士学位论文促进苔藓纤维出芽（mossyfibersprouting，MFS）。蛋白磷酸酯酶2A（PP2A）是催化Tau蛋白去磷酸化最重要的磷酸酯酶，已有研究表明其能够通过催化Tau蛋白去磷酸化降低癫痫发作频率。通过采用蛋白激酶的特异性抑制剂或者PP2A的激动剂等手段调控Tau蛋白的磷酸化水平以进一步探究颞叶癫痫中磷酸化Tau蛋白、MFS以及14-3-3zeta之间关系对于揭示颞叶癫痫的病理机制将是十分有意义的工作。38 致谢致谢时光荏苒，研究生三年的科研生活已经接近尾声，值此毕业论文完成之际，我衷心感谢从本科到研究生7年电子科大所有帮助过我的老师以及一起生活的朋友们。首先诚挚地感谢我的导师冯娟副教授，回想当初本科上课的时候，冯老师就以其热情洋溢的讲课才能感染了我，本科毕业之后有幸来到冯老师实验室继续读硕士。从本科毕设开始算起，您就开始指导我进行实验研究，在之后的研究生生涯里更是给予了我无微不至的照顾和帮助。科研上，您不厌其烦地锻炼我的学术报告能力，将我引入了透明脑成像领域，并给我机会让我到北京中医药大学进行脑成像实验，从此坚定了我硕士毕业之后继续从事神经科学研究的信念；生活中，您给出了许多对我有帮助的建议，教会我如何更好地面对感情以及生活中的挫折。另外我要感谢教育部重点实验室尧德中教授提供给我的透明脑课题，北京中医药大学李健老师给我机会到其实验室进行透明脑实验研究，游自立老师对我动物实验提供的帮助，以及杨足君老师提供的实验帮助。同时，一路走来，感谢我的家人多年来给予我的无限支持与鼓励，感谢女友对我科研及生活上的帮助。你们的爱是我坚实的后盾，是我前进的动力，是我一生的幸运。我要感谢陪伴了我7年之久的小伙伴们，感谢章登位、孙耿、周雨带领我多年来遨游在国服天梯3000分的鱼塘里。感谢课题组里的小白大师兄、韩婷师姐、张密青师兄、胡奇洲师弟、赵娇娇师妹以及蛋白质实验室的各位师弟师妹，实验室生活因为你们而丰富多彩。最后，再次向曾经帮助我、支持我、鼓励我的各位老师、同学们、朋友们致以最诚挚地祝福和感谢！39 电子科技大学硕士学位论文参考文献[1]MichevaKD,SmithSJ.Arraytomography:anewtoolforimagingthemoleculararchitectureandultrastructureofneuralcircuits[J].Neuron,2007,55:25-36.[2]DenkW,HorstmannH.Serialblock-facescanningelectronmicroscopytoreconstructthree-dimensionaltissuenanostructure[J].PLoSBiol,2004,2(11):e329.[3]MinskyM.Memoironinventingtheconfocalscanningmicroscope[J].Scanning,1988,10:128-138.[4]ConchelloJA,LichtmanJW.Opticalsectioningmicroscopy[J].NatMethods,2005,2:920-931.[5]Mertz,J.Opticalsectioningmicroscopywithplanarorstructuredillumination[J].NatMethods,2011,8:811-819.[6]ReynaudEG,KrzicU,GregerK,etal.Lightsheetbasedfluorescencemicroscopy:moredimensions,morephotons,andlessphotodamage[J].HFSPJ,2008,2:266-275.[7]TainakaK,KubotaSI,SuyamaTQ,etal.Whole-bodyimagingwithsinglecellresolutionbytissuedecolorization[J].Cell,2014,159:911-924.[8]DuongH,HanM.AmultispectralLEDarrayforthereductionofbackgroundautofluorescenceinbraintissue[J].JNeurosciMethods,2013,220:46-54.[9]SpalteholzW.UberdasDurchsichtigmachenvonmenschlichenundtierischenPraparaten(S.Hierzel).1914.[10]TheerP,DenkW.Onthefundamentalimaging-depthlimitintwo-photonmicroscopy[J].JOptSocAmAOptImageSciVis,2006,23(12):3139-3149.[11]DodtHU,LeischnerU,SchierlohA,etal.Ultramicroscopy:three-dimensionalvisualizationofneuronalnetworksinthewholemousebrain[J].NatMethods,2007,4:331-336.[12]ErturkA,BeckerK,Jahrling,N,etal.Three-dimensionalimagingofsolvent-clearedorgansusing3DISCO[J].NatProtoc,2012,7:1983-1995.[13]RenierN,WuZ,SimonDJ.iDISCO:asimple,rapidmethodtoimmunolabellargetissuesamplesforvolumeimaging[J].Cell,2014,159:896-910.[14]BeckerK,JahrlingN,SaghafiS,etal.ChemicalclearinganddehydrationofGFPexpressingmousebrains[J].PLoSONE,2012,7:e33916.[15]TsaiPS,KaufholdJP,BlinderP,etal.Correlationsofneuronalandmicrovasculardensitiesinmurinecortexrevealedbydirectcountingandcolocalizationofnucleiandvessels[J].JNeurosci,2009,29:14553-14570.40 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