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浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究摘要家蚕杆状病毒（BmNPV）中的lef-9与lef-4，lef-8和p47共同编码的蛋白联合体的亚基可以在体外启动polh启动子转录。但是，其在基因转录中的调控作用和病毒复制繁殖中所起的作用还未见报道。在本研究中，我们借助Red重组技术成功构建了lef-9基因缺失型病毒lef-9-KO-Bacmid，并利用Bac-to-Bac系统构建了lef-9基因补回型病毒lef-9-Re-Bacmid。将构建好的病毒基因组DNA转染BmN细胞。研究发现，lef-9缺失型病毒不能生成有感染活性的病毒粒子，而补回型病毒能够恢复病毒的感染活性，表明lef-9基因是病毒感染形成有感染活性BV（Buddedvirus）的必需基因。为进一步了解lef-9缺失对BmNPV基因组复制及基因转录表达的影响，我们以具有代表性的早晚期基因和极晚期基因为研究对象，利用实时荧光定量PCR（qPCR）技术研究了lef-9对病毒复制和基因转录调控的作用机制。qPCR研究结果表明，lef-9缺失后，病毒基因组的复制未受到明显影响（P>0.05）；而病毒早期基因ie-1和lef-3，晚期基因vp39和极晚期基因p10的转录水平相比较修复型与野生型病毒而言均有显著降低（P<0.05）；Westernblotting结果也显示lef-9基因缺失型病毒基本不表达蛋白LEF-3、VP39和P10（P<0.05）。同时，我们利用透射电镜技术对lef-9-KO-Bacmid、lef-9-Re-Bacmid和wtBacmid感染的家蚕BmN细胞进行观察，结果发现lef-9-KO-Bacmid感染的细胞并没有发现形成成熟的病毒粒子；而lef-9-Re-Bacmid和wtBacmid感染的细胞中均出现了明显的感染症状，装配形成了大量的病毒粒子。以上研究结果表明lef-9不是BmNPV病毒基因组复制的必需基因，但对病毒各个时期的基因转录及表达均有显著影响。电镜分析结果也进一步证实了上述结果。关键词：家蚕核型多角体病毒（BmNPV）；lef-9基因；Red重组；BactoBac系统；基因表达调控；电镜观察I 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究AbstractTheBmNPVlef-9andlef-4,lef-8andp47encodedproteinsubunitsofacomplexescanstartpolhpromotertranscriptioninvitro.Buttheroleoflef-9inviralreplication,assembleandgenetranscriptionarestillnotclear.Inordertostudythebiologicalfunctionoflef-9,weconstructedlef-9deficientvirus（lef-9-KO-Bacmid）usingtheRedrecombinationsystem,andlef-9repairedvirus（lef-9-Re-Bacmid）usingtheBac-to-Bacsystem.AftertransfectingBmNcellswithwtBacmid,lef-9-KO-Bacmidandlef-9-Re-BacmidDNA,wefoundthatthelef-9deletionvirusdoesnotgenerateinfectiousvirusparticles,whilerepairedviruscanrestoreinfectivity,indicatingthatlef-9iscriticalfortheformationofinfectiousbuddedvirus.Inordertofurtherstudytheeffectoflef-9deletiononBmNPVgenereplicationandtranscription,4geneswereselectedtoinvestigatetheroleoflef-9inviralreplicationandtranscription.Deletionoflef-9didnotreducedthereplicationleveloftheviralgenome（P>0.05）andlef-9deletionsignificantlyreducedthetranscriptionallevelofearlygenesie-1andlef-3,detectedbyqPCR（P<0.05）,moreover,thetranscriptionleveloflategenevp39andverylategenep10werereducedalso（P<0.05）.Furthermore,theexpressionlevelofearlygene,lategeneandverylategeneintheabsenceoflef-9werealsoexamined.WesternblottingresultsalsoshowedthattheexpressionlevelofLEF-3,VP39andP10weresignificantlylowerthanthewildtypeandrepairedrecombinantvirus（P<0.05）.ElectronmicroscopywasusedtoobservetheBmNcellsinfectedbylef-9-KO-Bacmid,lef-9-Re-BacmidandwtBacmid.TheresultsshowedthattherewerenoBVparticlesinlef-9-KO-Bacmidinfectedcells;however,therewerealargenumberofmaturevirusparticlesinlef-9-Re-BacmidandwtBacmidinfectedcells,indicating.TheseresultsindicatedthatBmNPVlef-9isnotessentialforvirusDNAreplication,butitisveryimportanttothevirusgenetranscriptionandexpression.Electronmicroscopyresultsalsoconfirmedtheaboveresults.Keywords:BmNPV;lef-9;Redrecombination;BactoBacsystem;Regulationofgeneexpression;ElectronmicroscopeobservationII 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究目录摘要...............................................................................................................................................................................IABSTRACT...............................................................................................................................................................II目录.........................................................................................................................................................................III第一章引言...............................................................................................................................................................11杆状病毒简述.....................................................................................................................................................11.1杆状病毒分类.............................................................................................................................................11.2杆状病毒的生活周期................................................................................................................................12杆状病毒的研究进展........................................................................................................................................12.1杆状病毒的序列........................................................................................................................................12.2杆状病毒基因表达调控............................................................................................................................23杆状病毒晚期基因表达因子LEFS研究进展.................................................................................................23.1杆状病毒晚期基因表达因子LEFs研究概况........................................................................................23.2杆状病毒LEFs基因的功能.....................................................................................................................33.3参与病毒DNA复制的lef基因............................................................................................................33.4其他lef基因的功能.................................................................................................................................44家蚕生物反应器概述........................................................................................................................................45RED重组技术的研究进展.................................................................................................................................56实验方案设计......................................................................................................................................................56.1研究的目的和意义....................................................................................................................................56.2研究内容.....................................................................................................................................................56.3实验流程.....................................................................................................................................................7第二章LEF-9的生物信息学分析..........................................................................................................................81.生物信息学简介.................................................................................................................................................82生物信息学工具.................................................................................................................................................83结果......................................................................................................................................................................83.1lef-9基因序列分析.....................................................................................................................................83.2LEF-9蛋白的疏水性分析.........................................................................................................................93.3LEF-9蛋白的信号肽分析.......................................................................................................................103.4LEF-9蛋白的跨膜区分析.......................................................................................................................113.5LEF-9蛋白的二级结构分析...................................................................................................................123讨论....................................................................................................................................................................12第三章家蚕核型多角体病毒lef-9缺失型和补回型病毒的构建....................................................................131材料与试剂........................................................................................................................................................131.1材料............................................................................................................................................................131.2试剂............................................................................................................................................................131.3试剂配制....................................................................................................................................................132方法....................................................................................................................................................................152.1含有pKD46质粒的DH10Bac菌的感受态制备................................................................................152.2lef-9基因打靶线性片段的制备..............................................................................................................152.3lef-9基因缺失型Bacmid的获得与PCR鉴定.....................................................................................16III 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究2.3.1通过同源重组获得lef-9缺失型Bacmid......................................................................................162.3.2lef-9缺失型Bacmid的获得.........................................................................................................162.3.3重组Bacmid的PCR鉴定.............................................................................................................162.4转移载体pFastBacHTB-lef-9的构建...................................................................................................172.4.1lef-9基因的PCR扩增..................................................................................................................172.4.2碱法提取pFastBacHTB质粒.........................................................................................................172.4.3目的片段与载体的双酶切...............................................................................................................182.4.4双酶切产物的连接反应..................................................................................................................182.5lef-9补回型Bacmid的构建....................................................................................................................182.5.1缺失型Bacmid感受态细胞的制备...............................................................................................192.5.2质粒pFastBacHTB-lef-9转化lef-9缺失型Bacmid感受态细胞..............................................192.6lef-9基因补回型Bacmid的PCR鉴定..................................................................................................193结果....................................................................................................................................................................193.1lef-9基因打靶线性化片段的PCR鉴定................................................................................................193.2lef-9基因缺失型病毒lef-9-KO-Bacmid的鉴定...................................................................................203.3重组转移载体pFastBacHTB-lef-9的PCR和双酶切鉴定.................................................................213.4lef-9基因补回型病毒lef-9-Re-Bacmid的鉴定....................................................................................224讨论....................................................................................................................................................................23第四章lef-9缺失对BmNPV复制及各时期基因转录的影响.........................................................................241材料与试剂........................................................................................................................................................241.1材料...........................................................................................................................................................241.2试剂...........................................................................................................................................................242方法....................................................................................................................................................................242.1家蚕细胞BmN的培养...........................................................................................................................242.1.1细胞冻存............................................................................................................................................242.1.2细胞复苏............................................................................................................................................252.1.3家蚕BmN细胞的传代培养...........................................................................................................252.2病毒DNA的提取.....................................................................................................................................252.3脂质体介导病毒DNA转染家蚕BmN细胞.......................................................................................252.4病毒滴度测定...........................................................................................................................................252.5病毒基因组的提取和消化......................................................................................................................262.5.1病毒基因组的提取..........................................................................................................................262.5.2DpnⅠ消化.........................................................................................................................................262.6qPCR分析.................................................................................................................................................262.6.1引物设计............................................................................................................................................262.6.2标准曲线的绘制................................................................................................................................272.6.3荧光定量PCR..................................................................................................................................272.7胞内总RNA的提取................................................................................................................................272.8DNaseI处理RNA...................................................................................................................................282.9cDNA第一链的合成................................................................................................................................282.10荧光定量PCR引物的设计..................................................................................................................292.11荧光定量PCR........................................................................................................................................292.12荧光定量PCR数据分析......................................................................................................................303结果....................................................................................................................................................................30IV 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究3.1病毒滴度测定...........................................................................................................................................303.2lef-9基因缺失对病毒DNA复制的qPCR分析...................................................................................313.2.1标准曲线的测定................................................................................................................................313.2.2lef-9-KO-Bacmid、lef-9-Re-Bacmid和wtBacmid基因组复制的qPCR分析.........................323.3病毒早期基因lef-3转录的qRT-PCR分析.........................................................................................343.4病毒早期基因ie-1转录的qRT-PCR分析..........................................................................................363.5病毒晚期基因vp39转录的qRT-PCR分析.........................................................................................383.6病毒极晚期基因p10转录的qRT-PCR分析......................................................................................404讨论....................................................................................................................................................................42第五章lef-9缺失对BmNPV基因表达的影响..................................................................................................441材料与试剂.......................................................................................................................................................441.1材料...........................................................................................................................................................441.2主要试剂的配制......................................................................................................................................442方法....................................................................................................................................................................442.1LEF-9蛋白在BmN细胞中SDS-PAGE................................................................................................442.2Westernblot检测蛋白的表达.................................................................................................................453.1Westernblot鉴定LEF-9蛋白.................................................................................................................453.2Westrenblot检测蛋白的表达情况........................................................................................................453.2.1Westrenblot检测LEF-3、P10、VP39蛋白的表达...................................................................454讨论....................................................................................................................................................................46第六章电子显微镜观察......................................................................................................................................471材料与试剂.......................................................................................................................................................471.1材料.............................................................................................................................................................471.2主要试剂的配制........................................................................................................................................472电子显微镜分析...............................................................................................................................................482.1病毒感染的BmN细胞的收集................................................................................................................482.2制样............................................................................................................................................................483结果....................................................................................................................................................................494讨论....................................................................................................................................................................50结论..........................................................................................................................................................................52参考文献....................................................................................................................................................................53致谢………………………………………………………………………………………………………….….58V 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究第一章引言1杆状病毒简述1.1杆状病毒分类杆状病毒（Baculovirus）是已知的昆虫病毒类中的最大类群，可以编码90-180种蛋白[1]质，基因组大小在80-180kb之间。根据杆状病毒亲缘关系，又可将杆状病毒分为：Betabaculovirus（lepidopterangranuloviruses，GVs）、Alphabaculoviru（lepidopterannucleo-polyhedroviruses，NPVs）、Deltabaculovirus（dipteranNPVs）和Gammabaculovirus[2]（hymenopteranNPVs）。Alphabaculovirus和Betabaculovirus属于鳞翅目杆状病毒，Deltabaculovirus为双翅目核多角体病毒，Gammabaculovirus为膜翅目核多角体病毒。NCBI目前公布的54株全基因组测序的杆状病毒中，有13株是鳞翅目颗粒体病毒，37株为鳞翅目核多角体病毒，3株为膜翅目核多角体病毒，1株为双翅目核多角体病毒。在这些杆状病毒[3]中，已经发现33个杆状病毒共有的基因，它们被称为核心基因。1.2杆状病毒的生活周期杆状病毒的生活周期具有两相性。即在一个生活周期内能够产生两种表型不同而基因型相同的病毒粒子：包埋型病毒（ODV）和芽生型病毒（BV）。ODV和BV的差别主要在囊膜组分上。ODV囊膜的组分主要是磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine）和磷脂酰乙醇胺[4-6]（phosphatidylethanolamine），膜上分布有与口服感染有关的蛋白，如PIF-1，PIF-2等。BV囊膜的主要组分是磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine），膜上分布有BV特有的膜融合蛋白GP64。在病毒感染早期，核衣壳在细胞核内被装配成熟，并在质膜处出芽，形成BV，BV负责细胞与细胞之间的传播。在病毒感染晚期，一些留在细胞核中的核衣壳被包装成ODV。当极晚期基因p10和多角体蛋白（polh）超量表达，ODVs被包埋进包涵体（occlusionbody，OB），OBs主要负责虫体间的传播。2杆状病毒的研究进展2.1杆状病毒的序列苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒（Autographacalifornicamulticapsid1 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究[7]nucleopolyhedrovirus,AcMNPV）是第一个被完全测序的昆虫杆状病毒。该病毒基因组DNA含有133894个碱基，其平均A+T含量为59%，可以编码150个核苷酸以上的开放式阅读框（OpenReadingFrame，ORF）有154个。截至2009年，已经有47种杆状病毒的基因组被测序完成。家蚕核多角体病毒（Bombyxmorinuclearpolyhedrosisvirus，BmNPV）是昆虫杆状病毒的模型病毒之一，BmNPV（T3株）基因组最早是被Gomi等在1999年测[8]序完成的。与AcMNPV基因组结构十分相似，为双链环状DNA分子，同源性可达到[9]90%以上。BmNPV基因组DNA总长128413bp，编码136个ORFs，GC含量约为40%。由于AcMNPV被公认为模式杆状病毒，因而BmNPV多数的信息可由它推测而来。BmNPV大部分的ORFs与AcMNPV基因组DNA在类似位置上。2.2杆状病毒基因表达调控目前，作为感染鳞翅目昆虫的杆状病毒代表种AcMNPV是研究最多的杆状病毒，其[10,11]基因的表达具有高度时序性，且主要是在转录水平上进行调控。早期基因转录开始于感染后6h之内，晚期基因的转录开始于病毒DNA开始复制之后，极晚期基因的转录开始于感染后8-24h。早期基因的功能主要表现在感染的前期，其对于加速病毒复制及使得宿主细胞接纳病毒的扩增是必需的。而晚期基因的表达主要发生在病毒DNA复制之后。3杆状病毒晚期基因表达因子LEFs研究进展3.1杆状病毒晚期基因表达因子LEFs研究概况通过瞬时表达实验，已发现19个与病毒晚期基因表达相关的病毒基因，这类蛋白被称[12,13]为晚期表达因子（lateexpressionfactors,LEFs）。在这些基因中，p143、ie-2、dnapol、[14,15]p35、lef-2、ie-1、lef-1、lef-3和lef-7等9个基因均可影响病毒DNA复制。此外，其他几[16]种基因也被认为与病毒晚期基因的转录有关。lef-4、lef-8、lef-9和p47分别编码病毒RNA[17][16]聚合酶的4个亚基；lef-5、lef-6、lef-10、lef-12和pp31直接参与晚期基因的转录调控。晚期基因的表达发生在病毒DNA复制之后，由病毒自身编码的RNA聚合酶调控，主要是编码病毒的结构蛋白。晚期基因有两个，p10与polyhedrin（polh），在病毒感染的极晚期超[18-20]量表达，而且与多角体的形成有关。2 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究3.2杆状病毒LEFs基因的功能lef基因家族中一部分是在转录水平上行使功能；另一部分在DNA复制水平上。Ie-1基因是目前研究得最多的调节基因，由Guarino等在1986年发现。蛋白IE-1含有582个氨基[21]酸，分子量为67kD。包括ie-1本身在内的所有早期基因启动子由蛋白IE-1调控。IE-1在[22,23]晚期基因的表达过程中起着直接或间接的作用。Ie-2又被称为ien基因，是一个极早期基因，其转录受IE-1负调控。其他早期基因、晚期基因和极晚期基因可以通过IE-2蛋白刺激ie-1的表达来间接促进。Miller等报道，细[24]胞的循环周期能被IE-2蛋白的表达所阻断，但是DNA的复制不会停止。[25]p35基因是杆状病毒的凋亡抑制基因。Kool等认为，P35是DNA复制的刺激因[26]子，而Miller等认为P35是DNA复制的必需因子。AcMNPVP35定位在受染细胞的胞浆中，含有299个氨基酸，其分子量为35kD。P35蛋白可以抑制昆虫细胞、哺乳动物细[27-29]胞的凋亡。AcMNPV在缺失p35后仍然能够感染粉纹夜蛾细胞，但不能感染Sf9和Sf21细胞。3.3参与病毒DNA复制的lef基因目前，已经证明AcMNPV中有19种lef基因。与病毒DNA复制有关的基因有9种。它们是lef-1、lef-2、lef-3、lef-7、hel、dnapol、ie-1、ie-2和p35。其中lef-1、lef-2、lef-3、hel、dnapol和ie-1是DNA复制的必需基因；ie-2、lef-7和p35是促进DNA复制基因。lef-1是DNA复制的必需基因，同时对晚期基因表达也有重要作用的基因。LEF-1蛋白的C端有一个NTP结合保守序列（G-X-G-X2-G-X15-20-K）。其富含Ser、Thr和Pro，和[30]蛋白激酶的NTP结合区非常相似。lef-2在病毒转录复制中起着与lef-1类似的功能，是病毒复制的一个必需基因，同时对晚期基因表达起着重要的调控作用。lef-2基因具有调控[31]DNA复制以及极晚期基因的表达这两方面独立的功能。lef-3基因能编码一种DNA单[32,33]链结合蛋白，具有调控晚期基因表达的能力。LEF-3蛋白是DNA复制的必需基因，能够自身相互作用，且进一步证明了LEF3作为ssDNA结合蛋白能和解旋酶P143相互作[34,35][36]用。P143是一种解旋酶，因此，只有定位核内才能发挥作用。lef-7是一个晚期基[37]因，是DNA复制辅助刺激因子，不是晚期和极晚期基因表达的必需因子。hel基因能够编码一个1221个氨基酸残基，分子量为143kD的多肽，因此又命名为p143基因。[38]Maeda等证明hel基因参与决定了病毒的宿主范围。杆状病毒DNA聚合酶基因dnapol3 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究能编码DNA聚合酶类蛋白，对aphidicolin敏感。其中，AcMNPV、BmNPV、CfMNPV、[39-42]LdMNPV、HzMNPV和OpMNPV都被鉴定出含有DNA聚合酶基因。3.4其他lef基因的功能其他参与晚期基因表达调控的基因包括lef-4、lef-5、lef-6、lef-8、lef-9、lef-10、lef-11、[43]lef-12、p47及39k。它们对晚期基因的表达具有重要作用。研究表明：LEF4是RNA聚[44]合酶的亚基之一，具有多种功能。RNA帽子结构的形成离不开LEF4蛋白，此外，LEF4[45]蛋白还具有鸟苷转移酶功能。PP31蛋白可以被细胞编码的和病毒编码的（或诱导的）激[46]酶磷酸化。lef-6基因在早晚期都能表达，可编码19kD蛋白。lef-8基因编码102kD的蛋[47]白，其C端含有一个基序，由13个氨基酸残基组成，认为该基序是酶的催化位点。lef-11[12]基因编码的多肽，可以调节晚期基因表达。lef-12是被鉴定的第19个晚期表达因子基因，可调节晚期基因的表达，但是不影响杆状病毒早期基因的表达。此外，Mclachilin和Miller[48]鉴定出了一个调节极晚期基因表达（verylategeneexpression）的基因vlf-1。vlf-1基因[49]突变对p10转录的影响非常小，但是polh转录水平却陡降。4家蚕生物反应器概述家蚕生物反应器是指将目的基因通过分子克隆技术插入到一个转移载体上，然后将这段基因转座到杆状病毒上，植入家蚕体内进行培养。通过家蚕对目的基因的转录翻译，生产出对人类有用的具有生物活性的物质。这种生物反应器具有以下几种有点：（1）取材便利，来源广泛：我国自古是是养蚕大国，具有资源优势，家蚕养殖已形成规模化和产业化发展；（2）成本低廉：家蚕易饲养，生活周期短，仅在幼虫期摄食，以桑叶为主，不需要特殊饲料；（3）安全性好：杆状病毒仅感染昆虫和节肢动物，并不感染人体，所以对人和动物无害，将携带外源基因的重组杆状病毒感染家蚕，即可在家蚕中表达目的蛋白；（4）表达效率高：家蚕杆状病毒可以通过接种幼虫及蚕蛹进行扩增，且具有多角体及P10[50]强启动子，对外源蛋白的高效表达具有重要作用；（5）较完善的翻译后加工：家蚕作为真核表达系统，含有蛋白翻译后加工所需的元件，外源蛋白可完成信号肽的切割及糖基[51]化、磷酸化等修饰，分子构象及生物学活性与天然蛋白十分相似；（6）可食：蚕蛹具有特殊的药用价值，可以食用，在蚕蛹中表达功能蛋白后可直接利用其冻干粉进行口服药物的研究，不用纯化，节省时间。（7）表达产物稳定：蚕体中含多种蛋白保护剂，可以有效表达外源蛋白。（8）容易产业化生产：中国自古以来都是蚕桑大国，而家蚕是目前4 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究唯一可以大规模养殖的无菌昆虫，可以大量养殖。5Red重组技术的研究进展[52]Red重组技术是一种新型DNA工程技术。在没有限制性内切酶和DNA连接酶的情[53]况下依然能够实现DNA的修饰。其原理就是通过构建一个两端含有50bp目的基因的打靶片段，通过同源重组替换目的基因，达到基因敲除的目的。目前，Red重组技术在AcMNPV及BmNPV的基因功能解析中已经应用得非常广泛，如通过Red重组技术敲除基因Ac146[54,55]和lef-12等。随着基因工程技术的不断发展，Red重组作为一种高效率的打靶技术，[56]其应用价值和应用范围一定会得到进一步的提升与完善。6实验方案设计6.1研究的目的和意义BmNPV高效表达系统于1984年由Maeda建立并超高效表达了人α-干扰素。因为家蚕（Bombyxmori）是目前唯一能够大规模人工饲养的经济昆虫，因而是目前非常有应用前景的表达系统。昆虫杆状病毒表达系统作为基因工程四大表达系统之一，有其自己的优势，[57]如对外源基因克隆容量大；具有很完备的翻译后修饰加工能；高效表达外源基因等能力。近年来，家蚕杆状病毒表达系统发展越来快，越来越受到广泛的关注。目前，一些代表性的杆状病毒基因及功能已经被揭示。但是目前该表达系统高效启动外源基因转录、表达的作用机制还不清楚，因此，本课题就家蚕杆状病毒的一个晚期基因表达因子LEF-9的功能进行研究。本课题中，我们应用了Red重组技术和Bac-to-Bac系统分别构建了lef-9基因缺失型的Bacmid和lef-9基因（带自身启动子）补回型的Bacmid，用来研究lef-9基因缺失后对病毒的影响。将重组病毒转染家蚕BmN细胞，借助于qPCR、电子显微镜等技术来研究lef-9基因对病毒复制、转录、表达及装配的作用。相信能够系统地阐述lef-9基因的生物学功能，为进一步深入研究杆状病毒表达系统提供一定的理论基础。6.2研究内容·生物信息学预测LEF-9蛋白各方面的性质；5 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究·设计打靶片段引物，扩增打靶片段，构建lef-9基因缺失型DH10Bac株；·构建重组转移载体pFastBacHTB-lef-9，通过Bac-to-Bac系统构建lef-9基因补回型病毒，即lef-9-Re-Bacmid；·分别将三种Bacmid转染家蚕BmN细胞，观察细胞生长状态；5·分别将三种Bacmid各1μg转染1×10个BmN细胞（35mm培养皿），分不同时段收集病毒，用二代病毒感染BmN细胞，利用TCID50法测定子代病毒滴度；5·分别将三种Bacmid各1μg转染1×10个BmN细胞（35mm培养皿），分时段收集细胞，并提取胞内总的基因组DNA，分析病毒DNA的复制情况；5·分别将三种Bacmid转染1×10个BmN细胞（35mm培养皿），分时段收集细胞，Trizol法提取胞总RNA，反转录成cDNA，分析病毒基因的转录情况；·将三种病毒基因组DNA各1μg转染BmN细胞，收集转染72h的细胞，裂解细胞收集蛋白，WseternBlot检测病毒早晚期基因和极晚期基因蛋白的表达情况；·将三种病毒基因组DNA各1μg转染BmN细胞，收集转染96h的细胞，固定、切片，透射电镜分析三种病毒感染细胞后的差异。6 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究6.3实验流程PCR得到目的基因lef-9lef-9生物信息学分析构建重组转移载体打靶片段lef-9-c构建pFastBacHTB-lef-9利用Red重组技术敲除野生型利用Bac-to-Bac系统构建lef-9病毒wtBacmid中的lef-9基因补回型Bacmid三种病毒wtBacmid、lef-9-KO-Bacmid、lef-9-Re-Bacmid分别转染BmN细胞分分分分病析析析析毒病病病病的毒毒毒毒透基的的的射因增基基电组殖因因镜的曲转表分复线录达析制7 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究第二章LEF-9的生物信息学分析1生物信息学简介生物信息学分析主要是对基因组研究相关生物信息的获取、加工、分析以及解释的过[55]程。通过生物信息学分析可以研究新基因的蛋白质结构、核酸信息和功能性预测等。根据NCBI提供的家蚕核型多角体病毒（BmNPV）T3株基因组序列lef-9序列，对该基因进行了生物信息学分析，为进一步研究lef-9功能提供理论依据。2生物信息学工具·研究疏水性，应用的软件为：ProtScaletool；·研究蛋白质的跨膜区，所应用的工具为：TMHMMServer；·研究蛋白质是否存在信号肽，运用的软件为：SignalP3.0Server；·对相关生物信息序列进行比对从而分析相似性，所用工具为BLAST；·研究蛋白质的二级机构，运用NPS@服务器上的GOR4程序；·单机版生物信息学分析软件为DNAstar等。3结果3.1lef-9基因序列分析NCBI序列分析，lef-9基因位于基因组的44402-45874nt，其全长1473bp，编码491个氨基酸，预测分子量54kDa（如图2.1）。通过NCBIBlast比对显示该蛋白有一个完整的保守结构域（如图2.2）。8 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究3.2LEF-9蛋白的疏水性分析氨基酸有着亲水性和疏水性的分类，此性质是氨基酸固有属性，也是蛋白质折叠成三维空间构象的重要影响因素之一。LEF-9蛋白的疏水性由ExPASy的ProtScaletool预测。结果显示，大部分区域的氨基酸疏水性大于零，即该蛋白偏向疏水性，推测为疏水性蛋白（图2.3）。9 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究3.3LEF-9蛋白的信号肽分析信号肽(Signalpeptide)的定义是N末端起始密码子之后的一组密码子的肽产物，其功能是在蛋白质分泌时牵引其到质膜，带有信号肽的蛋白质一般情况下能够被分泌到细胞外。信号肽位于蛋白质的N端，在蛋白质合成后指引其到达特定部位发挥作用，之后被切除。我们通过对LEF-9蛋白信号肽分析，结果表明（图2.4），sq为“无”，说明没有信号肽。10 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究3.4LEF-9蛋白的跨膜区分析存在跨膜区是膜蛋白的一个特征，通过跨膜区域分析软件和TMHMM服务器对LEF-9蛋白氨基酸序列进行跨膜分析，结果显示器全部位于outside，如图2.5，表明LEF-9蛋白氨基酸不存在跨膜区。11 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究3.5LEF-9蛋白的二级结构分析运用NPS@服务器上的GOR4程序对氨基酸序列进行二级结构的预测，多数蛋白质由三种二级结构组成：延伸主链（Extendedstrand）、α螺旋结构（α-Helix）、无规卷曲（Randomcoil）。如图所示，α螺旋记为蓝色，延伸区为红色，无规则卷曲为粉红色。我们通过相应的软件对LEF-9蛋白的二级结构进行预测，结果显示（图2.6），该蛋白存在二级结构分别为：α-Helix占28.57%、Extendedstrand占19.80%和Randomcoil占51.63%。图2.6LEF-9蛋白的二级结构预测2.6ThesecondarystructurepredictionofLEF-94讨论生物信息学在近年来得到越来越广泛的应用，它具有节约资源、节省时间、预测结果精确且形象具体等特点。生物信息学通过信息技术来分析研究分子生物学。随着生物信息学技术的不断发展，我们可以利用生物信息学资源提供的基因规律，根据需要去预测目标基因的多种生物信息，为研究的进一步进行提供预示和启发，利用已知的生物学内容去更好地为未知的研究提供模板。由此，人们也倾向于使用生物信息学软件对自己设计的实验进行预先分析与处理。通过生物信息学分析lef-9基因及编码蛋白的一些特性，我们得知lef-9基因全长1473bp，编码491个氨基酸，预测分子量54kDa，并且该蛋白序列含有一个保守结构域。通过对LEF-9蛋白的疏水性、信号肽、跨膜区预测发现，该蛋白可能为疏水性蛋白，不存在信号肽和跨膜区。以上分析结果为我们接下去研究该蛋白的性质和功能提供了方向。12 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究第三章家蚕核型多角体病毒lef-9缺失型和补回型病毒的构建1材料与试剂1.1材料Nikon倒置显微镜、EPS300电泳仪购自于上海天能科技有限公司；EPS300电泳仪购自于上海天能科技有限公司；E.coliTG1、DH10Bac（含help、pKD46质粒和Bacmid）、质粒pFastBacHTB和质粒pKD3（含有氯霉素抗性基因cat）均为本实验室保存。1.2试剂L-阿拉伯糖、SOC液体培养基购自上海博彩生物有限公司；1KbDNAladdermarker、DL2000DNAladdermarker、T4Ligation、PMD18-Tvector、Taq酶、限制性内切酶等为TaKaRa产品；基因组DNA小量抽提试剂盒购自碧云天生物科技有限公司（中国）。1.3试剂配制分子克隆的相关试剂（如LB液体和固体培养基、碱裂解法提取质粒DNA的溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、各种抗生素以及TAE溶液等均按《分子克隆指南》（第三版）•1%琼脂糖凝胶Agarose0.2g，溶于20mL1×TAE缓冲液中，加热使其溶解，待温度降至50℃左右，加3μLEB，摇匀。SDS-PAGE蛋白电泳溶液•30%丙烯酰胺溶液·29g丙烯酰胺，1gN-N’亚甲基双丙烯酰胺，溶于60mL的ddH2O中；·37℃水浴助溶（时间不可太长），定容至100mL；·0.22μm滤膜过滤，置于棕色瓶中，4℃保存。•1.5MTris·Cl（pH8.8）181.7gTris溶于800mLddH2O中，浓HCl调pH为8.8，定容至1L，高压灭菌，4℃保存。•1MTris·Cl（pH6.8）121.1gTris溶于800mLddH2O中，浓HCl调pH为6.8，定容至1L，高压灭菌，4℃保存。13 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究•10%（w/v）过硫酸铵（AP）0.1gAP溶于1mLddH2O中，现配现用。•10%（w/v）十二烷基硫酸钠（SDS）10gSDS溶于80mLddH2O中，浓HCl调pH为6.8，定容至100mL，4℃保存。•10×Tris-SDS电泳缓冲液Tris30g，甘氨酸188g，SDS10g，用900mLddH2O溶解，定容至1L。•5×LoadingBuffer（10mL）•考马斯亮蓝染色液（1L）•脱色液（1L）WesternBlotting溶液•1×转膜Buffer·甘氨酸14.4g·Tris3.0g·甲醇200mL·加ddH2O定容至1L•1×TBS·Tris2.4g·NaCl8.8g14 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究·溶于800mLddH2O中，HCl调pH至7.4，定溶至1L，0.45μm滤膜抽滤备用。•封闭液BSA或脱脂奶粉溶于1×TBS中至终浓度5%。•DAB显色液5mgDAB溶于10mLTBS中，加10μL30%H2O2，现配现用。LB液体培养基蛋白胨10g，NaCl10g，酵母提取物5g，溶于800mLddH2O中，定容1L，高压蒸气灭菌121℃，20min，室温保存。LB固体培养基蛋白胨10g，NaCl10g，酵母提取物5g，溶于800mLddH2O中，定容1L，高压蒸气灭菌121℃，冷却至室温，加入抗生素，轻轻摇动混匀，最后将培养基倒入平板中，每块平板约20mL。用封口膜包好，4℃保存备用。2方法2.1含有pKD46质粒的DH10Bac菌的感受态制备具体方法参照《分子克隆指南》（第三版）2.2lef-9基因打靶线性片段的制备为了获得lef-9基因缺失型的Bacmid，构建了一个用于lef-9基因打靶线性化片段。设计引物lef-9-CF、lef-9-CR。序列如下：上游引物lef-9-CF：5'-TGTTTTCTTTTTTGGATAAAACTCCTACTGAGTTTGACCTCATATTAGACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'下游引物lef-9-CR：5'-TGATAAAATTTTTTAAAATCACTTTAAATTCTTCATTGGTAAAAAATGCCATGGGAATTAGCCATGGTCC-3'PCR反应体系如下：高保真DNA聚合酶0.5μL，引物Lef-9-CF和lef-9-CR均加1μL，KODplus10×buffer5μL，PKD3质粒模板（含基因cat）1μL，MgSO45μL，ddH2O31μL，dNTPs4μL，总体系为50μL。PCR程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，60℃变性30s，72℃延伸1min，72℃最后一步延伸10min。所有PCR反应步骤完成15 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究后产物置于4℃保存备用。PCR扩增获得1100bp左右的打靶片段，将其命名为lef-9-C。2.3lef-9基因缺失型Bacmid的获得与PCR鉴定将PCR得到的打靶片段lef-9-C转化到含有质粒pKD46的DH10Bac感受态细胞中，用L-阿拉伯糖诱导表达同源重组所需的酶，在λRed重组酶作用下，线性化片段lef-9-C与病毒基因组中的lef-9基因发生同源重组。最后，利用含有氯霉素和卡那霉素的双抗板筛选。2.3.1通过同源重组获得lef-9缺失型Bacmid具体操作步骤详见《分子克隆指南》（第三版）2.3.2lef-9缺失型Bacmid的获得随机挑取Cm、Kan双抗板上的单菌落，接种于Cm、Kan液体培养基培养；分别取菌液入1.5mLEP管中，12000rpm离心30s；分别弃去上清，加入100L溶液I，混匀；加入100μL0.4MNaOH和100μL1%SDS，上下颠倒数次，使溶液变澄清；加入100L溶液Ⅲ，颠倒数次混匀，12000rpm离心10min；吸取上清至新的EP管中，加入800μL异丙醇，上下颠倒混匀，4℃，12000rpm离心10min；弃上清，加入0.5mL预冷的70%乙醇，4℃，13000rpm，离心10min；弃上清，沉淀溶于50L含RNaseA的无菌水中，37℃水浴30min，-20℃保存备用。2.3.3重组Bacmid的PCR鉴定我们设计了两对引物来鉴定lef-9基因是否已敲除，引物序列如下：lef-9F5'-CACGTTTTCGTCGATTTG-3'lef-9R5'-CGGCAAATCCGTGACTAT-3'catF5'-CACGTTTAAATCAAAACTGGTG-3'catR5'-CAATATGGACAACTTCTTCG-3'以lef-9F和catR，lef-9R和catF，lef-9F和lef-9R为上下游引物进行PCR扩增，产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。16 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究lef-9基因缺失型病毒的构建策略如图3.1。2.4转移载体pFastBacHTB-lef-9的构建2.4.1lef-9基因的PCR扩增用DNAstar设计引物，设计的上游引物包括完整阅读框上游的150bp，并在上下游引入酶切位点。序列如下：pFblef-9F：5'-CGGGATCCTCAGCCTGTTGTCGTGAATACC-3'pFblef-9R：5'-CGGAATTCCGTATTGAGATTTTCCGCAGTT-3'以野生型Bacmid为PCR模板，以pFblef-9F和pFblef-9R为上下游引物PCR扩增。PCR反应体系：Taq酶1μL，引物pFblef-9F和pFblef-9R均加1μL，10×buffer5μL，质粒模板1μL，MgSO45μL，ddH2O31μL，dNTPs5μL，总体系为50μL。PCR程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，65℃变性30s，72℃延伸1min，72℃最后一步延伸10min。所有PCR反应步骤完成后产物置于4℃保存备用。2.4.2碱法提取pFastBacHTB质粒具体方法参见本章2.3.217 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究2.4.3目的片段与载体的双酶切碱法提取pFastBacHTB质粒，用BamHⅠ、EcoRⅠ进行PCR和双酶切反应；以野生型Bacmid为模板，以pFblef-9F/R为上下游引物，PCR扩增得到含自身启动子的目的片段，纯化后用BamHⅠ、EcoRⅠ进行双酶切反应。双酶切反应体系如下：PCR产物或载体20μL，10×buffer5μL，ddH2O23μL，BamHⅠ和EcoRⅠ各1μL，总体系50μL。混匀，37℃水浴4h。2.4.4双酶切产物的连接反应连接体系如下：pFastBacHTB载体片段3μLPCR产物5μLT4DNALigase1μL10×T4LigaseBuffer1μLTotal10μL混匀，16℃反应过夜。2.5lef-9补回型Bacmid的构建重组转移载体pFastBacHTB-lef-9转化至含lef-9缺失型Bacmid的大肠杆菌感受态细胞，通过Bac-to-Bac系统构建修复型的lef-9-Re-Bacmid。其构建策略如3.2所示。图3.2lef-9基因补回型Bacmid的构建图谱Fig3.2Mapofconsturctionoflef-9-Re-Bacmid18 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究2.5.1缺失型Bacmid感受态细胞的制备制备方法参见《分子克隆指南》第三版2.5.2质粒pFastBacHTB-lef-9转化lef-9缺失型Bacmid感受态细胞制备方法参见《分子克隆指南》第三版2.6lef-9基因补回型Bacmid的PCR鉴定以碱法提的重组病毒基因组为模板，分别以M13F和M13R、M13F和pFblef-9F、M13R和pFblef-9R、pFblef-9F/R为上下游引物，进行PCR扩增鉴定来判定外源基因是否正确插入。PCR反应体系为：Taq酶1μL，上下游引物均加1μL，10×buffer5μL，质粒模板1μL，MgSO45μL，ddH2O31μL，dNTPs5μL，总体系为50μL。PCR程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，60℃变性30s，72℃延伸1min，72℃最后一步延伸10min。所有PCR反应步骤完成后产物置于4℃保存备用。PCR的反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，60℃变性30s，72℃延伸1min，72℃最后一步延伸10min。所有PCR反应步骤完成后产物置于4℃保存备用。3结果3.1lef-9基因打靶线性化片段的PCR鉴定以pKD3质粒为模板，PCR扩增获得1100bp左右的打靶片段（图3.3），命名为lef-9-C。19 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究3.2lef-9基因缺失型病毒lef-9-KO-Bacmid的鉴定碱法提取Bacmid基因组DNA，分别以lef-9F和catR；lef-9F和lef-9R为上下游引物进行PCR，产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3.4显示，lef-9F和catR作为引物扩增出的PCR产物条带约为500bp左右；lef-9F和lef-9R作为引物扩增出的PCR产物大小约为1500bp左右；各条带大小均与理论值相符，说明成功构建lef-9-KO-Bacmid。20 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究3.3重组转移载体pFastBacHTB-lef-9的PCR和双酶切鉴定碱法提取质粒DNA，进行PCR鉴定和双酶切鉴定。PCR鉴定有目的条带，且与预期大小一致；BamHI/EcoRⅠ双酶切也有目的条带和载体条带，都与预期结果一致（如图3.5），表明重组转移载体pFastBacHTB-lef-9构建成功。21 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究3.4lef-9基因补回型病毒lef-9-Re-Bacmid的鉴定碱法提取重组Bacmid基因组DNA，以M13F和M13R；M13F和pFblef-9R及pFblef-9F和M13R为上下游引物PCR，以M13F和M13R为引物的PCR产物大小应该为4430bp；以M13F和pFblef-9R为引物的PCR产物大小应该为3830bp；以M13R和pFblef-9F为引物的PCR产物大小应该为2690bp；产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，大小均与理论值一致，如图3.6所示。22 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究4讨论本章中我们利用Red重组技术构建了lef-9基因缺失型病毒lef-9-KO-Bacmid，进而利用Bac-to-Bac系统将含自身启动子序列在内的lef-9基因异位补回到缺失型病毒的多角体启动子下，成功构建了lef-9-Re-Bacmid。Red重组技术是近十几年发展起来的基于Red重组酶的新型体内重组系统，为基因敲[58]除实验提供了方便精确的方法。Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是一种高效的表达系统，[59]其优点在于大大节省了构建重组病毒所需的时间。本章中我们通过Red同源重组敲除了BmNPV的lef-9基因；同时，又利用Bac-to-Bac系统获得了lef-9补回型病毒。为后续研究lef-9基因在病毒复制、转录和表达等生物学功能方面奠定了基础。23 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究第四章lef-9缺失对BmNPV复制及各时期基因转录的影响1材料与试剂1.1材料DH10Bac菌种、家蚕细胞BmN为本实验室保存；CO2培养箱购自RSBiotech公司；Nikon倒置显微镜、PCR基因扩增仪购自于杭州博日科技有限公司；细胞培养瓶、培养皿等购自美国Coring公司，荧光定量仪购自ABI公司（美国）。1.2试剂LightCycler®480SYBRGreenIMaster试剂盒、荧光定量PCR反应96孔板均购自于Roche公司；ReverseTranscriptaseM-MLV（RNaseH-）、RNA酶抑制剂购自美国Promega公司、sf-900ⅡSFM（1×）无血清培养基购自GIBCO公司，胎牛血清（FBS）购自奥地利PAA公司。2方法2.1家蚕细胞BmN的培养2.1.1细胞冻存1)在超净工作台内，配制细胞冻存液（胎牛血清、细胞培养基、DMSO按7：2：1的比例配制）；2)用弯头吹管将培养瓶中的细胞轻轻吹下，成单细胞悬浮液；3)将细胞悬浮液转移到15mL离心管中，500rpm，离心5min，弃上清；4)离心管中加入适量的细胞冻存液，轻轻吹打使细胞重新悬浮；5)取出冻存管，吸取适量的细胞悬液移到细胞冻存管，每管约2mL，拧紧盖子，用封口膜包好，在管壁上写上细胞名字和日期；6)将冻存管置于梯度降温盒中，于-80℃冰箱6~8h，然后转入到液氮中保存。24 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究2.1.2细胞复苏1)取出冻存管，放入37℃水浴锅，解冻细胞；2)取出冻存管，用酒精棉消毒，移入超净工作台；3)将冻存管中的细胞小心移入15mL离心管中，1000rpm，离心10min；4)弃上清，加入10mL含10%血清的sf-900ⅡSFM（1×）培养液，轻轻吹打悬浮细胞；25)取25cm细胞培养瓶，将细胞悬液转入瓶中，拧紧瓶盖，以倒“8”字轻轻平晃培养瓶，使细胞均匀分布于培养瓶底部；6)27℃昆虫培养箱培养，每周换新鲜培养基2次。2.1.3家蚕BmN细胞的传代培养1)显微镜下观察细胞状态，取出细胞状态良好，密度80%左右的细胞培养瓶；2)用移液管吸取10mL新鲜的sf-900ⅡSFM（1×）培养基（含10%胎牛血清）加入到培养瓶中，用弯头吹管吸取瓶内培养基，轻轻吹打贴壁的细胞；23)用移液管吸取5mL细胞悬液分装于另一干净的25cm培养瓶中，拧紧盖子，以倒“8”字轻轻平晃培养瓶，使细胞均匀分布于培养瓶底部，最后放入27℃培养箱中培养；4)培养3~5天，在显微镜下观察细胞生长状况，待细胞密度达80%左右时再按上述步骤传代培养。2.2病毒DNA的提取方法参见碧云天基因组DNA小量提取试剂盒说明书。2.3脂质体介导病毒DNA转染家蚕BmN细胞方法详见《分子克隆指南》（第三版）2.4病毒滴度测定3取处于对数生长期的BmN细胞铺96孔板（10个细胞/孔）；-1-9将各个时段收集到的病毒上清按10倍梯度稀释，稀释范围为10-10；每孔接10μL病毒上清，每个稀释度接8孔。以未接病毒的BmN细胞作阴性对照；在细胞培养箱中培养5天，记录各稀释度的发病情况；25 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究·最后用Reed&Muench法计算50%保护终点（TCID50）。2.5病毒基因组的提取和消化2.5.1病毒基因组的提取病毒基因组的提取详见基因组DNA小量抽提试剂盒（碧云天）说明书。2.5.2DpnⅠ消化5分别用wtBacmid、lef-9-KO-Bacmid和lef-9-Re-BacmidDNA各1μg转染1×10个BmN细胞（35mm培养皿），分别在转染后的6h、12h、18h、24h、48h收集细胞，提取细胞内总DNA，并用DpnⅠ酶消化（DpnⅠ酶只能识别甲基化的位点，可以利用DpnⅠ酶消化外[60]源BacmidDNA，而在家蚕细胞内复制的子代病毒DNA不会被酶解）。因此，将不同时段提取的总DNA利用DpnⅠ酶消化5h后进行qPCR分析。所用引物为扩增gp41基因引物（gp41是ODV的囊膜蛋白，gp41基因突变感染昆虫细胞后呈现单细胞感染表型，即[60]不能产生二代病毒）。反应体系如下：混匀，37℃反应5h。2.6qPCR分析2.6.1引物设计26 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究2.6.2标准曲线的绘制19将纯化得到的wtBacmid进行10倍梯度稀释，取10~10倍稀释的Bacmid质粒作为模板，以gp41F和gp41R为上下游引物，采用SYBRGreen染料法进行实时荧光定量PCR扩增，每个浓度分别作三个重复。2.6.3荧光定量PCR反应体系如下，每个样品做三个重复：设置反应程序如下：95℃2min95℃30sec40cycles60℃30sec95℃15sec65℃30secMeltingcurve95℃15sec反应结束，编辑标准曲线。2.7胞内总RNA的提取具体步骤见《分子克隆指南》第三版27 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究2.8DNaseI处理RNA提取的胞内总RNA含有DNA，会污染逆转录模板，所以要用DNaseI消化基因组DNA，得到纯净的总RNA。反应体系如下：总RNA30μL10×DNaseIBuffer5μLDNaseI2μLRNaseInhibitor0.5μLDEPC水12.5μLTotal50μL37℃反应30min。热处理使DNaseI失活。加4μL0.5MEDTA，混匀，80℃加热处理2min，然后用DEPC水定容至100μL；加入250μL冷乙醇和10μL3M醋酸钠，-80℃冰箱放置20min；4℃，12000rpm，离心10min，弃上清；用70%乙醇洗一次，4℃，12000rpm，离心10min，弃上清，沉淀干燥，再用30μLDEPC水溶解，-20℃保存备用。2.9cDNA第一链的合成用上述提取出的总RNA逆转录成cDNA第一条链。具体操作方法如下：模板RNA1.5μLOligo（dT）18Primer1.0μLDNTPs1.5μLDEPC水6.0μLTotal10μL65℃金属浴5min，立即冰浴2min，瞬时离心。上述变性液10μL5×MLVBuffer4.0μL28 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究RNaseInhibitor0.5μLMLV逆转录酶1.0μLDEPC水4.5μLTotal20μL逆转录反应程序：42℃45min70℃15min逆转录产物-20℃保存备用。2.10荧光定量PCR引物的设计ie-1、lef-3、vp39、p10引物为本实验室保存，引物序列如表4.1。表4.1荧光定量引物序列Table4.1Primersequencesforquantitativereal-timePCR(qRT-PCR)2.11荧光定量PCR反应体系如下，每个样品做三个重复：消化后的DNA4μLgp41F1μL29 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究gp41R1μL2×MasterMix50μLddH2O34μLTotal50μL设置反应程序如下：95℃5min95℃30sec40cycles60℃30sec95℃15sec65℃30secMeltingcurve95℃15sec反应结束，编辑样品并分析结果。2.12荧光定量PCR数据分析-△△CT得到的Ct值通过EXCLE编辑，并利用2方法分析基因转录的差异。3结果3.1病毒滴度测定病毒滴度指的是病毒的毒力强弱，是衡量病毒感染力的指标。目前常用的测定病毒滴[61]度的方法为终点稀释法（TCID50法），即能引起半数细胞病变的病毒量，得到的是具有感染力的病毒滴度。图如4.1显示，lef-9-KO-Bacmid在所有时间点上其TCID50均为0；补回型的病毒在24h前所测的滴度略低于野生型的病毒；48h后，其滴度还略高于野生型病毒。30 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究图4.1lef-9-KO-Bacmid、wtBacmid和lef-9-Re-Bacmid转染BmN细胞的病毒增长曲线Fig4.1ThevirusgrowthcurveinBmNcellstransfectedwithlef-9-KO-Bacmid,wtBacmidandlef-9-Re-Bacmid3.2lef-9基因缺失对病毒DNA复制的qPCR分析3.2.1标准曲线的测定19取10~10倍稀释的Bacmid质粒作为模板，以gp41F和gp41R为上下游引物，采用SYBRGreen染料法进行实时荧光定量PCR扩增，得到标准品实时荧光定量PCR扩增动力学曲线（4.2左）和溶解曲线（4.2右）。由图4.2左可知，相同样品间重复性好，且相邻稀释梯度样品之间有良好的相关性；如图4.2右所示，溶解曲线为单一峰值，没有出现杂峰，说明实验中没有出现污染、引物二聚体或非特异性扩增，表明该荧光定量PCR引物2的特异性良好。由图4.3可知，标准曲线线性关系良好，R达到0.993，所得标准曲线方程为：Y=-2.99X+32.97，横坐标为DNA拷贝数指数，纵坐标为PCR扩增产物达到一定的荧光信号（阈值）时所经历的扩增循环次数，即Ct值。31 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究3.2.2lef-9-KO-Bacmid、lef-9-Re-Bacmid和wtBacmid基因组复制的qPCR分析6分别用Bm67-KO-Bacmid、wtBacmid和Bm67-Re-Bacmid各1μg转染1×10个细胞，分别在转染后6h、12h、18h、24h、48h收集细胞，提取胞内总DNA，并用DpnⅠ酶消化。如图4.4，PCR引物的特异性良好，结果可信。结果如表4.2。将Ct值通过标准曲线换算成绝对拷贝数，从图4.5可以看出，在lef-9-KO-Bacmid、wtBacmid和lef-9-Re-Bacmid转染家蚕BmN的各个时段，3种病毒的DNA拷贝数都没有明显的差别（P>0.05）。32 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究图4.4lef-9-KO-Bacmid、lef-9-Re-Bacmid和wtBacmid基因组DNA转染BmN细胞后病毒拷贝数的扩增曲线（左）与溶解曲线（右）Fig4.4Theamplificationplot(left)andmeltingcurve(right)ofviralDNArecplicationinBmNcellstransfectedwithlef-9-KO-Bacmid,lef-9-Re-BacmidandwtBacmid33 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究图4.5lef-9-KO-Bacmid、lef-9-Re-Bacmid和wtBacmid感染BmN细胞病毒拷贝数随时间变化的qPCR分析Fig4.5qPCRanalysisofviralDNArecplicationinBmNcellsinefctedwithlef-9-KO-Bacmid,lef-9-Re-BacmidandwtBacmid3.3病毒早期基因lef-3转录的qRT-PCR分析5分别用wtBacmid、lef-9-KO-Bacmid和lef-9-Re-BacmidDNA各1μg转染1×10个BmN细胞（35mm培养皿），分别在转染后的12h、24h、48h、72h收集细胞，提取胞内总RNA，逆转录成cDNA，同时以β-Actin为内参，qPCR分析。结果如表4.3，扩增曲线和溶解曲线如图4.6。结果如图4.7，从图中看出在lef-9-KO-Bacmid转染BmN细胞12h后，lef-3的转录水平与wtBacmid和lef-9-Re-Bacmid相比差异不大；但是，24h后lef-3的转录水平下降明显，与wtBacmid和lef-9-Re-Bacmid相比差异明显（P<0.05）。在48h，lef-9-Re-Bacmid的转录水平略高于wtBacmid（P>0.05）。34 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究图4.6lef-3的扩增曲线（左）与溶解曲线（右）Fig4.6Theamplificationplot(left)andmeltingcurve(right)oflef-335 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究图4.7lef-9-KO-Bacmid，lef-9-Re-Bacmid和wtBacmid早期基因lef-3转录水平的qRT-PCR分析Fig4.7qRT-PCRanalysisofthetranscriptionlevelofearlygenelef-3inlef-9-KO-Bacmid,lef-9-Re-BacmidandwtBacmid3.4病毒早期基因ie-1转录的qRT-PCR分析5分别用wtBacmid、lef-9-KO-Bacmid和lef-9-Re-BacmidDNA各1μg转染1×10个BmN细胞（35mm培养皿），分别在转染后的12h、24h、48h、72h收集细胞，提取胞内总RNA，逆转录成cDNA，同时以β-Actin为内参，qPCR分析。结果如表4.4，扩增曲线和溶解曲线如图4.8。结果如图4.9，从图中看出在lef-9-KO-Bacmid转染BmN细胞后的12h，ie-1的转录水平与wtBacmid和lef-9-Re-Bacmid相比差异不大；但是，在24h后ie-1的转录水平下降明显，与wtBacmid和lef-9-Re-Bacmid相比差异明显（P<0.05）。36 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究图4.8ie-1的扩增曲线（左）与溶解曲线（右）Fig4.8Theamplificationplot(left)andmeltingcurve(right)ofie-137 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究图4.9lef-9-KO-Bacmid，lef-9-Re-Bacmid和wtBacmid早期基因ie-1转录水平的qRT-PCR分析Fig4.9qRT-PCRanalysisofthetranscriptionlevelofearlygeneie-1inlef-9-KO-Bacmid,lef-9-Re-BacmidandwtBacmid3.5病毒晚期基因vp39转录的qRT-PCR分析5分别用wtBacmid、lef-9-KO-Bacmid和lef-9-Re-BacmidDNA各1μg转染1×10个BmN细胞（35mm培养皿），分别在转染后的12h、124h、48h、72h收集细胞，提取胞内总RNA，逆转录成cDNA，同时以β-Actin为内参，qPCR分析。结果如表4.5，扩增曲线和溶解曲线如图4.10。结果如图4.11，从图中看出在lef-9-KO-Bacmid转染BmN细胞后的12h，vp39的转录水平与wtBacmid和lef-9-Re-Bacmid相比差异不大；但是，在24h后vp39的转录水平下降明显，与wtBacmid和lef-9-Re-Bacmid相比差异明显（P<0.05）。在48h，lef-9-Re-Bacmid的转录水平略高于wtBacmid（P>0.05）。38 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究图4.10vp39的扩增曲线（左）与溶解曲线（右）Fig4.10Theamplificationplot(left)andmeltingcurve(right)ofvp3939 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究图4.11lef-9-KO-Bacmid，lef-9-Re-Bacmid和wtBacmid早期基因vp39转录水平的qRT-PCR分析Fig4.11qRT-PCRanalysisofthetranscriptionlevelofearlygenevp39inlef-9-KO-Bacmid,lef-9-Re-BacmidandwtBacmid3.6病毒极晚期基因p10转录的qRT-PCR分析5分别用wtBacmid、lef-9-KO-Bacmid和lef-9-Re-BacmidDNA各1μg转染1×10个BmN细胞（35mm培养皿），分别在转染后的12h、124h、48h、72h收集细胞，提取胞内总RNA，逆转录成cDNA，同时以β-Actin为内参，qPCR分析。结果如表4.6，扩增曲线和溶解曲线如图4.12。结果如图4.13，从图中看出在lef-9-KO-Bacmid转染BmN细胞12h前，p10的转录水平与wtBacmid和lef-9-Re-Bacmid相比差异不大；但是，在24h后p10的转录水平下降明显，与wtBacmid和lef-9-Re-Bacmid相比差异明显（P<0.05）。40 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究图4.12p10的扩增曲线（左）与溶解曲线（右）Fig4.12Theamplificationplot(left)andmeltingcurve(right)ofp1041 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究图4.13lef-9-KO-Bacmid，lef-9-Re-Bacmid和wtBacmid早期基因p10转录水平的qRT-PCR分析Fig4.13qRT-PCRanalysisofthetranscriptionlevelofearlygenep10inlef-9-KO-Bacmid,lef-9-Re-BacmidandwtBacmid4讨论为了分析lef-9基因对病毒DNA复制的影响，我们通过定量实时PCR（qPCR），对病毒基因组DNA在转染后不同时间的累积情况进行了分析。为了消除上样量的影响，引入内参β-Actin。结果显示在转染后的各个时段，3种病毒的DNA拷贝数指数没有显著性差异（P>0.05），说明lef-9基因不是病毒复制的必需基因。病毒滴度指的是病毒的毒力强弱，是衡量病毒感染力的指标。目前常用的测定病毒滴[61]度的方法为终点稀释法（TCID50法），即能引起半数细胞病变的病毒量，得到的是具有感染力的病毒滴度。结果显示，lef-9-KO-Bacmid在所有时间点上其TCID50均为0；相对而言，补回型的病毒在24h前所测的滴度略低于野生型的病毒；但是，在48h后其滴度还略高于野生型病毒，这可能是多角体启动子晚期大量启动外源基因表达的结果。综上所知，lef-9缺失型病毒不能产生有感染性的子代病毒，而lef-9补回型病毒很好地恢复了这一能力。qPCR分析wtBacmid、lef-9-KO-Bacmid和lef-9-Re-Bacmid基因转录情况果表明，lef-9缺失型病毒各个时期的基因转录水平与wtBacmid和lef-9-Re-Bacmid均有很大差异。早期42 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究基因lef-3的转录水平：在lef-9-KO-Bacmid转染BmN细胞12h后，lef-3的转录水平与wtBacmid和lef-9-Re-Bacmid相比差异不大；但是，24h后lef-3的转录水平下降明显，与wtBacmid和lef-9-Re-Bacmid相比差异明显（P<0.05）。在48h，lef-9-Re-Bacmid的转录水平略高于wtBacmid；早期基因ie-1的转录水平：lef-9-KO-Bacmid转染BmN细胞后的12h，ie-1的转录水平与wtBacmid和lef-9-Re-Bacmid相比差异不大；但是，在24h后ie-1的转录水平下降明显，与wtBacmid和lef-9-Re-Bacmid相比差异明显（P<0.05）。晚期基因vp39和极晚期基因p10的转录在整个时期的检测中都处于较低水平，而其他两种病毒vp39和p10的转录水平都处于正常水平。以上研究结果表明：lef-9的缺失对于病毒各个时期的基因转录都有不同程度的影响。lef-9作为晚期表达因子，是晚期基因表达的必需因子。本文中用来研究的晚期基因vp39和极晚期基因p10的转录水平在lef-9基因缺失后受到了很大的影响；但是，值得注意的是早期基因lef-3和ie-1的转录水平也受到了不同程度的影响。说明lef-9基因对于病毒早期基因的转录也具有一定的作用。43 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究第五章lef-9缺失对BmNPV基因表达的影响1材料与试剂1.1材料家蚕核型多角体病毒LEF3、VP39以及P10的单克隆抗体由Abmart公司制备；微型转膜仪购自Bio-Rad公司；PVDF膜购自罗氏公司；脱脂奶粉购自上海生工生物有限公司；Tween-20、甘氨酸购自北京鼎国生物技术公司；电泳级SDS、Tris碱、丙烯酰胺购自Roche公司；6×His单克隆标签抗体（Anti-HisTagMonoclonalAntibody）购自北京泽溪源生物科技有限公司；Goatanti-RabbitIgG(H+L)-HRP购自天津三箭生物技术有限公司；细胞裂解液购自上海碧云天生物技术有限工司（中国）。1.2主要试剂的配制电泳和WesternBlotting所用溶液等均按《分子克隆指南》（第三版）和《蛋白质电泳实验技术》中相应的配方配置。2方法2.1LEF-9蛋白在BmN细胞中SDS-PAGE51)分别用wtBacmid、lef-9-KO-Bacmid和lef-9-Re-BacmidDNA各1μg转染1×10个BmN细胞（35mm培养皿），置于27℃培养箱中，连续培养72h；2)显微镜下观察细胞发病后，收集细胞悬液，4℃，1000rpm，离心5min，弃上清；3)细胞沉淀用pH7.2的PBS溶液洗涤两次，最后用50μL的PBS重悬，然后转移到干净的EP管中；4)将细胞悬液反复冻融3次，4℃，1200rpm，离心10min，留取上清作为检测样品；5)上述样品加入5×蛋白质上样缓冲液，100℃煮沸10min，取10μL进行10%的SDS-PAGE电泳检测，同一块PAGE胶分为左右两半，分别按顺序点样，电泳结束后一半用于考马斯亮蓝染色，另一半转膜后进行WesternBlotting检测。44 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究2.2Westernblot检测蛋白的表达WesternBlot步骤请参照《蛋白质电泳实验技术》中相应章节描述3.1Westernblot鉴定LEF-9蛋白5分别用wtBacmid、lef-9-KO-Bacmid和lef-9-Re-BacmidDNA各1μg转染1×10个BmN细胞（35mm培养皿），待细胞发病后于超净台内收集，1000rpm离心10min，沉淀用PBS洗一遍，加细胞裂解液裂解制样，进行SDS-PAGE和Westernblot鉴定。结果如图5.1所示，接种了lef-9缺失型病毒的细胞和野生型感染病毒的细胞裂解液Westernblot没有明显的杂交条带，而接种了lef-9修复型病毒的细胞在40kDa左右杂交出一条明显的条带，与预期大小一致。说明lef-9已成功敲除，且没有相应的蛋白表达。图5.1LEF-9表达的Wsetrenblot分析Fig5.1TheanalysisofLEF-9expressionbyWsetrenboltM：蛋白marker；1:接种野生型病毒的BmN细胞裂解液；2：接种lef-9缺失型病毒的BmN细胞裂解液；3：接种lef-9修复型病毒的BmN细胞裂解液M:Proteinmolecularweightmarker;1:BmNcellsinfectedwithwtBacmid;2:BmNcellsinfectedwithlef-9-KO-Bacmid;3:BmNcellsinfectedwithlef-9-Re-Bacmid3.2Westrenblot检测蛋白的表达情况3.2.1Westrenblot检测LEF-3、P10、VP39蛋白的表达5分别用wtBacmid、lef-9-KO-Bacmid和lef-9-Re-BacmidDNA各1μg转染1×10个BmN细胞（35mm培养皿），取72h收集细胞裂解液进行SDS-PAGE，利用LEF-3、VP39和P10单克隆抗体进行Westernblot鉴定，由图5.2知，接种lef-9-Re-Bacmid和wtBacmid的细胞分别杂交出明显的条带，且与预期大小一致；而接种了lef-9-KO-Bacmid的细胞Westernblot没有明显的杂交条带。以上结果表明lef-9基因的缺失将会显著影响病毒早期、晚期和极晚期基因的表达。45 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究图5.2LEF-3、P10和VP39的Wsetrenblot分析Fig5.2TheWsetrenboltanalysisofLEF-3、P10andVP394讨论根据Wsetrenblot结果显示，lef-9补回型病毒感染细胞72h后可以明显检测到lef-9基因的表达，而lef-9缺失型病毒和野生型病毒中并没有检测到带6×His标签的LEF-9蛋白，由此，我们可以确认构建的lef-9缺失型病毒是成功的。lef-9的缺失影响了早期基因lef-3、晚期基因vp39和极晚期基因p10的表达。在lef-9-KO-Bacmid感染病毒72h后，我们没有检测到有以上三种蛋白的表达，而补回型病毒和野生型病毒感染病毒72h后，均有检测到三种蛋白的表达。这与本论文中第四章中利用qPCR技术分析的基因转录水平变化情况完全一致，同时与病毒滴度测定结果也相符合。从中我们可以推测，lef-9基因的缺失影响了病毒早晚期基因的表达，说明lef-9基因对病毒基因表达是必需的。但是，影响病毒基因表达的因素有很多，我们将在下一章借用电子显微镜技术对缺失型病毒与野生型和补回型病毒作一个详细的比较，试图在病毒的形成、结构、装配等方面来分析lef-9缺失后对病毒造成的影响。46 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究第六章电子显微镜观察1材料与试剂1.1材料家蚕细胞BmN为本实验室保存；CO2培养箱购自RSBiotech公司；Nikon倒置显微镜；细胞培养瓶、培养皿等购自美国Coring公司；HitachiH-7650型透射镜。1.2主要试剂的配制磷酸盐缓冲液配制A液：0.2M磷酸氢二钠贮备液磷酸氢二钠Na2HPO4·2H2O35.61g或Na2HPO4·7H2O53.65g或Na2HPO4·12H2O71.64g加双蒸水至1000mLB液：0.2M磷酸二氢钠贮备液磷酸二氢钠NaH2PO4·H2O27.60gNaH2PO4·2H2O31.21g加双蒸水至1000mLC液：0.2M磷酸盐缓冲液pHA液B液7.236mL14mL7.440.5mL9.5mL磷缓戊二醛固定液配方C液（mL）50mL50mLpH25%戊二醛溶液10mL12mL7.2加蒸馏水至100mL100mL7.2戊二醛最终浓度2.5%3.0%7.2锇酸固定液配方2%锇酸贮备液：47 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究锇酸2g蒸馏水100mL醋酸铀染色液配方醋酸铀2g双蒸水100mL柠檬酸铅染液色硝酸铅1.33g柠檬酸钠1.76g1MNaOH溶液8mL双蒸水42mL2电子显微镜分析2.1病毒感染的BmN细胞的收集51)分别用wtBacmid、lef-9-KO-Bacmid和lef-9-Re-BacmidDNA各1μg转染1×10个BmN细胞（35mm培养皿）；2)在转染后24h，收集细胞，2000rpm，3min；3)用PBS洗细胞一次；4)细胞在2.5%的戊二醛溶液中4℃过夜。2.2制样1000rpm离心5min，弃固定液，0.1M的pH7.0磷酸缓冲液洗涤样品三次，每次洗15min；1%锇酸溶液固定样品2h；弃去固定液，用0.1M的pH7.0磷酸缓冲液洗涤样品三次，每次洗涤15min；用梯度浓度的乙醇对样品进行梯度脱水处理，每种浓度洗脱15min，再用100%的乙醇脱水处理20min；最后转到丙酮处理20min；包埋剂和丙酮以体积比1:1的混合液浸泡样品1h；48 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究包埋剂和丙酮以体积比3:1的混合液浸泡样品3h；纯包埋剂浸泡样品12h以上；包埋经过渗透处理的样品，70℃过夜加热，即得包埋好的样品；·样品用Reichertd超薄切片机进行切片，获得70-90nm的切片，将该切片用柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液分别染色15min，即可用HitachiH-7650型透射镜进行观察。3结果为了进一步分析lef-9的缺失对病毒粒子机构的影响，分别用wtBacmid、5lef-9-KO-Bacmid和lef-9-Re-BacmidDNA各1μg转染1×10个BmN细胞（35mm培养皿），收集感染24h的BmN细胞进行了透视电镜分析。结果表明，lef-9缺失型病毒感染的BmN细胞不能看到成束存在的杆状病毒（图6.1）；相反，感染了野生型病毒（图6.2）和lef-9补回型病毒（图6.3）的BmN细胞呈现出典型的多角体病毒侵染性状，图中能够清楚的看到杆状病毒，具有囊膜包围的病毒粒子，且以多粒包埋的形式存在。图6.1透视电镜观察lef-9-KO-Bacmid病毒感染的BmN细胞。（A）感染24h后的BmN细胞（5000×）；（B）感染24h后的BmN细胞（20000×）；（C）感染24h后的BmN细胞（50000×）。Fig6.1Electronmicroscopicanalysisofsectionsgeneratedfromlef-9-KO-BacmidVirusinfectedBmNcell.(A)24hpostinfectionofBmNcells(5000×);(B)24hpostinfectionofBmNcells(20000×);(C)24hpostinfectionofBmNcells(50000×)49 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究图6.2透视电镜分析wtBacmid病毒感染的BmN细胞。（A）感染24h后的BmN细胞（5000×）；（B）感染24h后的BmN细胞（20000×）；（C）感染24h后的BmN细胞（50000×）Fig6.2ElectronmicroscopicanalysisofsectionsgeneratedfromwtBacmidvirusinfectedBmNcells.(A)24hpostinfectionofBmNcells(5000×);(B)24hpostinfectionofBmNcells(20000×);(C)24hpostinfectionofBmNcells(50000×)图6.3透视电镜分析lef-9-Re-Bacmid病毒上清感染BmN细胞制备的超薄切片。（A）感染24h后的BmN细胞（5000×）；（B）感染24h后的BmN细胞（20000×）；（C）感染24h后的BmN细胞（50000×）50000×透视电镜图。Fig6.3Electronmicroscopicanalysisofsectionsgeneratedfromlef-9-KO-BacmidvirusinfectedBmNcell.(A)24hpostinfectionofBmNcells(5000×);(B)24hpostinfectionofBmNcells(20000×);(C)24hpostinfectionofBmNcells(50000×)4讨论我们利用透射电镜技术对wtBacmid、lef-9-KO-Bacmid、lef-9-Re-Bacmid感染的家蚕50 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究BmN细胞进行了观察。结果发现，lef-9缺失型病毒感染的细胞中并没有看到成熟的杆状病毒粒子，也没有形成具有囊膜包围的病毒粒子，这说明lef-9的缺失影响了病毒的装配能力，使其不能产生具有感染活性的病毒粒子；而lef-9补回型病毒和野生型病毒感染的BmN细胞出现了杆状病毒感染的典型症状，包括出现了电子密度很高的病毒发生基质；细胞核增大；大量核衣壳在发生基质中进行装配等。这与第四章中我们所测的病毒滴度TCID50=0的结果是吻合的；本论文第五章节中的Westrenblot结果也显示，lef-9-KO-Bacmid感染的BmN细胞的基本上检测不到LEF-3、VP39及P10蛋白的表达；基因转录的研究结果也证明了lef-9基因的缺失大大降低了早晚期及极晚期基因的转录水平。综上所知，lef-9对于在细胞中BV的产生是必需的；其缺失导致病毒不能完成正常装配，从而影响了病毒基因的转录与表达。51 浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究结论1.利用Red重组系统敲除Bacmid基因组中lef-9基因，成功构建了lef-9缺失型病毒lef-9-KO-Bacmid；2.利用Bac-to-Bac系统将lef-9基因（带自身启动子）补回到lef-9缺失型Bacmid中，构建了lef-9补回型病毒lef-9-Re-Bacmid；3.lef-9缺失型病毒不能产生有感染活性的BV；4.lef-9基因的缺失不影响病毒DNA复制，说明lef-9基因不是病毒DNA复制的必需基因；5.lef-9基因缺失后病毒各时期基因的转录与表达均受到明显影响；6.利用透射电镜观察lef-9基因缺失对于病毒粒子装配的影响，结果显示lef-9缺失影响了病毒的装配能力，无感染活性病毒粒子的产生。52 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浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒晚期表达因子LEF-9的功能研究致谢行文至此，我的这篇论文也接近尾声。岁月如梭，两年半的研究生生活也即将结束。回望过去的点滴生活，不由让人感慨万千。站在人生的又一个转折点，心中难免思绪万千。让我感到欣慰的是这两年半我没有虚度过日，在实验室的每个日夜，我都过得很充实，学到了许多受益无穷的知识。本课题实验是在解纯刚副教授、于威副教授的悉心指导下完成的。两位老师以其渊博的知识、严谨的治学态度和敏捷的思维给我留下深刻的印象。论文的选题、开题、中期答辩、实验设计等各方面无不注入了两位老师辛苦的汗水。于老师作为一名优秀的研究生导师，具有丰富的知识和实验经验，在整个论文实验和写作中，她对我进行了耐心地指导。她还不断引导我开拓思路，鼓励我大胆创新，使我在这段刻骨铭心的生活中开阔了视野、锻炼了心智，同时也培养了良好的实验习惯和探索科学的精神。在此，我向我的两位指导老师表示最诚挚的谢意！特别感谢张耀洲教授为我们提供了先进的科学研究平台，使我们的实验能够顺利进行。感谢吕正兵副教授、陈健副教授、聂作明副研究员、童富淡教授、盛清教授对我实验的建议和指导。还要感谢杜超逸、费伟强、刘云龙、周芳等师兄师姐对我实验的关心和帮助，感谢同窗梅文枫、张成、袁佳、张玉、王婵、王涛、毕臻乐等同学对我生活的关心和实验上的帮助。最后我还要感谢培养我长大含辛茹苦的父母，谢谢你们！最后，谨向参加本论文评阅和答辩委员会的全体专家致以最诚挚的谢意！石扬辉2012年12月20日58
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