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《鸟嘌呤核苷酸转化因子交换蛋白1对大鼠糖尿病机械性痛的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
分类号Ｒ５８７．１１６单位代码：１００学号：２０１５２０１１５叫瞢科太ｆ硕士学位论文题目：鸟嘌呤核苷酸转化因子交换蛋白１对大鼠糖尿病机械性痛的影响Ｅｆｆｅｃｔｏｆｅｘｃｈａｎｅｐｒｏｔｅｉｎｄｉｒｅｃｔｌａｃｔｉｇｙｖａｔｅｄｂｃｃｌｉｃａｄｅｎｏｓｉｎｅｍｏｎｏｐｈｏｓｐｙｙｈａｔｅ１ｏｎｍｅｃｈａｎｉｃａｌａｉｎｏｆｄｉａｂｅｔｉｃｐｒａｔｓ研究生：袁欢欢导师：李全民学科专业：内科学２０一１６论文课题起止时间：年２月２０１７年１０—论文完成时间：２０１８年３月 锦州医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含我一１为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与同工的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并ｆ表示谢意。一申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担切相关责任。．论文作者签名：ｔ欢■欢日期：叫锦州医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解锦州医科大学有关保护知识产权的规定？，即．研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属锦州医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为锦州医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为锦州医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容（保密内容除外），以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：表次水指导教师签名： 目录一、摘要中文论著摘要...........................................................................................................1英文论著摘要...........................................................................................................3二、英文缩略词..............................................................................................................6三、论文前言.........................................................................................................................8实验材料与方法.....................................................................................................9实验结果...............................................................................................................19讨论.......................................................................................................................30结论.......................................................................................................................32四、本研究创新性的自我评价....................................................................................33五、参考文献................................................................................................................34六、附录文献综述.................................................................................................................38在学期间科研成绩.................................................................................................47致谢.........................................................................................................................48个人简历.................................................................................................................49 ·中文论著摘要·鸟嘌呤核苷酸转化因子交换蛋白1对大鼠糖尿病机械性痛的影响目的鸟嘌呤核苷酸转化因子交换蛋白1(exchangeproteindirectlyactivatedbycyclicadenosinemonophosphate,Epac1)是疼痛的重要启动因子之一，但Epac1是否参与糖尿病机械性痛（diabeticmechanicalallodynia，DMA）的发病机制尚不清楚。本研究应用慢病毒介导shRNA抑制Epac1的表达，观察DMA模型大鼠后爪回缩阈值和背根神经节部位Epac1的表达，探讨Epac1在DMA发病机制中的作用。方法32只雄性SD大鼠（体重180-220g）饲养于无特定病原体级动物房中，自由进食、水，适应环境1周，于实验前测定所有大鼠的体重、空腹血糖和后爪回缩阈值。实验步骤如下：（1）制备糖尿病大鼠模型随机选取20只大鼠单次腹腔注射链脲佐菌素制作糖尿病模型，链脲佐菌素以20mg/ml的浓度溶于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，大鼠称重按65mg/kg的剂量腹腔注射链脲佐菌素溶液。其余12只作为正常对照，腹腔注射等体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。3天后测量全部大鼠尾静脉血糖值验证糖尿病造模情况，空腹血葡萄糖水平≥13.9mmol/L为糖尿病造模成功。（2）制备DMA大鼠模型在腹腔注射前（0d）、后3d、7d和14d检测大鼠后爪回缩阈值，若糖尿病模型大鼠14d的后爪回缩阈值与0d相比显著下降且有统计学差异者，即为制备成功的DMA模型大鼠。根据上述方法，共有11只大鼠成功制备为DMA模型。（3）分组12只正常对照大鼠随机分为2组，1组：正常大鼠鞘内注射对照组(n=6)，鞘内注射无效shRNA慢病毒，无效shRNA慢病毒不会导致任何细胞的mRNA降解，作为Epac1shRNA慢病毒的阴性对照；2组：正常大鼠鞘内注射组(n=6)，鞘内注射Epac1shRNA慢病毒。制备1 成功11只DMA模型大鼠随机分为2组，3组：DMA鞘内注射对照组(n=5)，鞘内注射无效shRNA慢病毒；4组：DMA鞘内注射组(n=6)，鞘内注射Epac1shRNA慢病毒。(4)检测后爪回缩阈值变化及mRNA、蛋白表达变化检测大鼠鞘内注射前（0d）、后1d、3d、6d、9d、12d、14d后爪回缩阈值的变化。鞘内注射14天后，1％戊巴比妥钠（65mg/kg）腹腔注射麻醉后取大鼠L4-L6段背根神经节，采用RealTime-PCR、Western-Blot检测4组大鼠背根神经节部位Epac1的mRNA和蛋白表达的情况。结果（1）与正常对照组大鼠（1组，2组）相比，DMA组大鼠（3组，4组）的后爪回缩阈值明显下降，腹腔注射后7d，14d差异有统计学意义（P=0.020，P=0.000）。同时DMA组（3组、4组）与正常对照组（1组、2组）相比Epac1mRNA和蛋白的表达上调（P=0.000，P=0.000）。（2）鞘内注射后14d，DMA鞘内注射组（4组）大鼠后爪回缩阈值上升，显著高于DMA鞘内注射对照组（3组）大鼠，差异有统计学意义(P=0.000)，说明Epac1shRNA慢病毒可上调大鼠机械性痛阈值，缓解大鼠糖尿病机械性痛；经析因设计方差分析统计显示，鞘内注射慢病毒组与鞘内注射无效慢病毒组比较，Epac1mRNA和蛋白的表达降低（P=0.000，P=0.020）。结论Epac1在DMA大鼠中表达升高，应用慢病毒介导shRNA抑制Epac1的表达可上调大鼠机械痛阈值，缓解大鼠糖尿病机械性痛。关键词鸟嘌呤核苷酸转化因子交换蛋白；糖尿病机械性痛；背根神经节2 ·英文论著摘要·Effectofexchangeproteindirectlyactivatedbycyclicadenosinemonophosphate1onmechanicalpainofdiabeticratsObjectiveTheanamorphismofguaninenucleotidetransformingfactorexchangeprotein1(Epac1)isoneoftheimportantinitiationfactorsofpain,butwhetherEpac1isinvolvedinthepathogenesisofdiabeticmechanicalallodynia(DMA)Notsure.Inthisstudy,Lentivirus-mediatedshRNAwasusedtoinhibittheexpressionofEpac1.ThehindpawwithdrawalthresholdandtheexpressionofEpac1indorsalrootganglionwereobservedinDMAmodelratstoinvestigatetheroleofEpac1inthepathogenesisofDMA.Methods32maleSDrats(180-220gbodyweight)werehousedinanimalhousewithoutspecificpathogens,andwerefreetoeatandwater.Theywereaccustomedtotheenvironmentfor1week.Thebodyweight,fastingbloodglucoseandhindpawwithdrawalthresholdweremeasuredbeforetheexperimentinallrats.Theexperimentalstepsareasfollows:(1)PreparationofDiabeticRatModelArandomizedselectionof20ratsforintraperitonealinjectionofstreptozotocinwasusedtomakeadiabeticmodel.Streptozotocinwasdissolvedincitricacid-sodiumcitrateataconcentrationof20mg/ml.Inthebuffer,theratswereweighedandstreptozotocinwasinjectedintraperitoneallyatadoseof65mg/kg.Theremaining12servedasnormalcontrolsandwereinjectedintraperitoneallywithanequalvolumeofcitricacid-sodiumcitratebuffer.After3days,allrats'tailveinbloodglucoselevelsweremeasuredtoverifythediabeticmodel.Fastingbloodglucoselevel≥13.9mmol/Lwasasuccessfulmodelfordiabetes.(2)PrepareD3 MAratmodeltodetectthewithdrawalthresholdofrathindpawbefore(0d),3d,7dand14dafterintraperitonealinjection.Thesignificantdecreaseintheratiowasstatisticallysignificant,thatis,asuccessfulDMAmodelrat.Accordingtotheabovemethod,atotalof11ratsweresuccessfullypreparedasaDMAmodel.(3)Grouping12normalcontrolratswererandomlydividedinto2groups:Group1:normalratswereintrathecalinjectedwithcontrolgroup(n=6),intrathecalinjectionofshRNAlentiviruswasineffective,andshRNAlentivirusdidnotresultinanycellsThemRNAwasdegradedasanegativecontrolofEpac1shRNAlentivirus;2groups:normalratsintrathecalinjectiongroup(n=6)andintrathecalEpac1shRNAlentivirus.11DMAmodelratswererandomlydividedinto2groups,3groups:DMAintrathecalinjectioncontrolgroup(n=5),intrathecalinjectionshRNAlentivirus;4group:DMAintrathecalinjectiongroup(n=6)IntrathecalEpac1shRNAlentivirus.(4)DetectionofchangesinhindpawwithdrawalthresholdandchangesinmRNAandproteinexpressionChangesinpawwithdrawalthresholdsbeforeandafterintrathecalinjection(0d),1d,3d,6d,9d,12d,and14dweredetected.14daysafterintrathecalinjection,1%sodiumpentobarbital(65mg/kg)wasinjectedintraperitoneallytoratstotakeL4-L6dorsalrootganglion.Realtime-PCRandWestern-Blotwereusedtodetectthedorsalrootoftheratsinthe4groups.MitochondrialsiteEpac1mRNAandproteinexpression.Results(1)Comparedwiththenormalcontrolgroup(group1,group2),thehindpawwithdrawalthresholdintheDMAgroup(group3,group4)wassignificantlydecreased,andtherewasastatisticallysignificantdifferencebetweenthe7thand14thdaysafterintraperitonealinjection.(P=0.020,P=0.000).Atthesametime,theexpressionofEpac1mRNAandproteinwasup-regulatedintheDMAgroup(group3,group4)comparedwiththenormalcontrolgroup(group1andgroup2)(P=0.000,P=0.000).(2)Onthe14thdayafterintrathecalinjection,thehindpawwithdrawalthresholdintheDMAintrathecalinjectiongroup(4groups)increasedsignificantly,whichwassignificantlyhigherthanthatintheDMAintrathecalg4 roup(group3)rats.Thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05).=0.000),indicatingthatEpac1shRNAlentiviruscanupregulatemechanicalpainthresholdinratsandrelievemechanicalpaininratswithdiabetesmellitus;analysisofvarianceanalysisandstatisticsoffactorialdesignshowedthatintrathecalinjectionoflentivirusgroupwascomparedwithintrathecalinjectionofineffectivelentivirusgroup.Epac1mRNAandproteinexpressiondecreased(P=0.000,P=0.020).ConclusionsTheexpressionofEpac1inDMAratswasincreased.TheinhibitionofEpac1expressionbylentivirus-mediatedshRNAupregulatestheratmechanicalpainthresholdandrelievesmechanicalpainindiabeticrats.Keywordsexchangeproteindirectlyactivatedbycyclicadenosinemonophosphate1,diabeticmechanicalallodynia,dorsalrootganglion.5 ·英文缩略语表·英文缩写英文全称中文译名DMDiabetesmellitus糖尿病DNDiabeticneuropathy糖尿病神经病变DNPDiabeticneuropathicpain糖尿病神经病理性疼痛DMADiabeticmechanicalallodynia糖尿病机械性痛Exchangeproteindirectlyactivatedbycyclic鸟嘌呤核苷酸转化因子交换Epacadenosinemonophosphate蛋白GEFGuaninenucleotide-exchangefactor鸟嘌呤核苷酸交换因子PKCεProteinkinaseCepsilontype蛋白激酶CεSTZStreptozotocin链脲佐菌素PWTPawwithdrawalthreshold后爪回缩阈值hhour小时minminute分钟dday天PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应mRNAMessengerribonucleicacid信使核糖核酸cDNAComplementaryDNA互补脱氧核糖核酸PVDFPolyvinylidenefluoride聚偏二氟乙烯膜GAPDHGlyceraldehyde-phosphatedehydrogenase磷酸甘油醛脱氢酶TBSTTrisbuffersalineplustween20含吐温20的tris缓冲液TEMEDN,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine四甲基乙二胺PMSFPhenylmethanesulfonylfluoride苯甲基磺酰氟BCABicinchoninicacid二喹啉甲酸ERKExtracellμlarsignal-regμlatedkinase细胞外信号调节激酶MAPKMitogen-activatedproteinkinase丝裂原活化蛋白激酶VEGFVascμlarendothelialgrowthfactor血管内皮生长因子shRNAShorthairpinRNA短发夹RNADMSODimethylsμlfoxide二甲基亚砜6 PLCεPhospholipaseCepsilon磷脂酶CεPhosphorylatedextracellμlarsignalpERK磷酸化胞外信号调节激酶regμlatedkinaseAktProteinkinaseB蛋白激酶Bp-AktPhosphorylatedAkt磷酸化AktSDSSodiumdodecylsuLfate十二烷基磺酸钠SDS-PAGESdspolyacrylamidegelelectrophoresisSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳TrisTrihydroxymethylaminomethane三羟甲基氨基甲烷DdH2ODidistilledwater重蒸水Llumbar腰椎Tthoracic胸椎Ssacral骶椎DRGDorsalrootganglion背根神经节7 ·论文·鸟嘌呤核苷酸转化因子交换蛋白1对大鼠糖尿病机械性痛的影响前言糖尿病（diabetesmellitus，DM）是威胁人类健康的慢性疾病之一，根据国际糖尿病联盟2015年12月发布的数据统计，全球约有4.15亿糖尿病患者，预计到2040年将有6.42亿人罹患糖尿病。糖尿病是以高血糖为主要特征的疾病，长期高血糖可导致微血管并发症和大血管并发症，不仅给患者带来肉体上和精神上的伤害，还使个人、国家的经济负担加重。糖尿病神经病变（diabeticneuropathy，DN）是最常见的，也是最容易被忽视和最难治疗的糖尿病并发症，病变可累及中枢神经及周围神经[1]。长期高血糖导致周围神经发生病理性改变，糖尿病病程10年以上常出现临床糖尿病神经病变症状，约有30%-50%糖尿病患者会出现糖尿病外周神经病变的并发症，又有约20%的外周神经病变患者发展为糖尿病神经病理性疼痛（diabeticneuropathicpain，DNP）[2]。对机械性刺激敏感性增高的DNP称为糖尿病机械性痛。DNP通常表现为远端肢体对称性、自发性的疼痛，痛觉过敏和感觉异常，经常伴有夜间加重。它严重影响糖尿病患者的生活质量，并且与抑郁、自杀倾向和截肢密切相关[3]。国际疼痛研究协会对神经病理性痛的定义是中枢或外周躯体感觉系统的损伤或疾病直接导致的疼痛[4]，糖尿病神经病理性痛属于外周性神经病理性痛。尽管许多研究已经证实高血糖可诱导神经损伤，但引起神经病变的确切机制尚未明确阐明，其主要原因在于机械性痛的发生及发展的分子机制不清楚。神经病理性疼痛的发生在背根神经节(dorsalrootganglion,DRG)水平涉及许多离子通道的表达，而在脊髓水平又涉及丘脑和许多皮层感觉区往返联系的改变。因此，目前仍缺乏治疗糖尿病神经病理性痛的特异性治疗药物[5]。经典的镇痛药，如阿片类镇痛药和非甾体抗炎药对DNP效果差，目前其一线治疗药物为度洛西汀、普8 瑞巴林和加巴喷丁等三环类抗抑郁药，但副作用较大[6]。主要表现为体位性低血压、心动过速、传导阻滞、心律失常及心跳骤停等心血管毒性反应，口干、便秘、体重增加等抗胆碱能反应，注意力不能集中、情绪低落、社会行为异常、运动失调、思维障碍等中枢神经系统毒性反应。Epac也叫cAMP直接激活的交换蛋白，是一种新型的cAMP靶蛋白，有Epac1和Epac2两种亚型，由两种不同的基因编码。Epac1在许多组织中广泛地表达，Epac2主要在脑、肝、胰腺和肾上腺中表达[7,8]。Epac的失调与各种疾病的发生与发展有关，如心肌肥大、心肌梗死、阿尔茨海默病、慢性阻塞性肺疾病、炎症、糖尿病、肥胖、癌症和疼痛等[9]。在神经系统中，Epac1参与轴突导向的调节和突起生长[10]，激活后促进神经性疼痛引起的异常性疼痛的进展。在DRG神经元中，Epac1介导cAMP信号传递到蛋白激酶Cε(proteinkinaseCepsilontype,PKCε)，对PKCε的激活起重要作用[11]，是疼痛的重要启动因子之一。足底注射Epac激动剂8-pCPT可产生持久的机械痛觉过敏[11]，Epac1−/−小鼠可对抗慢性神经病理性疼痛的发展[12]。但Epac1是否参与糖尿病机械性痛的发病机制是未知的，能否成为治其疗新靶标也是未知的。链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱导的糖尿病模型大鼠的神经病理性疼痛症状与糖尿病患者的临床症状相似，也有明显的机械痛觉过敏[13,14]。我们的研究通过一次性腹腔注射STZ破坏胰岛β细胞引起高血糖诱导糖尿病模型，通过测量后爪回缩阈值（pawwithdrawalthreshold，PWT）筛选出糖尿病机械性痛大鼠模型，单次鞘内注射Epac1shRNA慢病毒抑制大鼠Epac1的表达，进一步了解DMA的分子发病机制，为DMA治疗提供新的理论依据和实验依据。实验材料与方法一、实验材料（一）实验动物本研究由火箭军总医院伦理委员会批准，按照动物实验的道德准则进行研究，尽量减少动物的使用数量和减轻动物痛苦。32只雄性Sprague-Dawley大鼠（SPF9 级）购于军事医学科学院实验动物中心，体重180-220g。饲养于SPF级动物房，恒温22±1℃，相对湿度55％，保持12h光照/12h黑暗循环，定时更换垫料、笼具，大鼠可自由获取食物与灭菌水。在进行实验操作前，所有大鼠适应环境1周。（二）主要试剂和仪器1、主要仪器（1）Von-Frey纤维丝测痛仪：美国NorthCoast公司（2）血糖分析仪及试纸：瑞士Roche公司（3）微量注射器：美国HAMILTON公司（4）制冰机（SIM-F140）：日本三洋公司（5）摩尔基因型超纯水机（Molgenc1815c）：上海摩勒科学仪器有限公司（6）单人单面垂直净化工作台（SW-CJ-1FD）苏州智净净化设备有限公司（7）高压蒸汽灭菌锅（MLS-3781L-PC）：日本松下公司（8）-80℃冰箱：美国ThermoScientifics公司（9）低温冰箱：中国海尔公司（10）高通量动植物组织研磨机（2010）：美国SPEXSamplePrep公司（11）高速冷冻离心机（centrifuge5417R）：德国Eppendorf公司（12）5418小型高速离心机：德国Eppendorf公司（13）精密pH计(PB-10)：德国Sartorius公司（14）电子计时器：北京康润诚业生物科技有限公司（15）电子天平（BS224S）：德国Sartorius公司（16）微型磁力搅拌器：金坛市科析仪器有限公司（17）干式恒温器（K30D）：杭州奥盛仪器有限公司（18）移液器：美国ThermoScientifics公司（19）全波长酶标仪(TECANInfiniteF200)：美国MolecularDevices公司（20）MiniPROTEAN®Tetra小型电泳槽：美国Bio-Rad公司（21）MiniTrans-Blot小型转印槽：美国Bio-Rad公司（22）Basic基础电泳仪：美国Bio-Rad公司（23）电热恒温培养箱（DNP-9052型）：上海精宏实验设备有限公司10 （24）脱色摇床（TS-2000A）：海门市其林贝尔仪器设备制造有限公司（25）全自动荧光/化学发光成像分析系统（Tanon-5200Multi）：北京原平皓生物技术有限公司（26）基因扩增仪（ETC811）：北京东胜创新生物科技有限公司（27）超微量紫外/可见分光光度计(NanoDrop2000)：美国ThermoScientifics公司（28）ABI7500实时定量PCR系统：美国LifeTech(appliedbiosystems)公司2、主要试剂（1）制备DM大鼠模型的试剂①STZ：美国sigma公司；柠檬酸：德州润昕公司；柠檬酸三钠：德州润昕公司。②柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液：柠檬酸2.1g加入100ml的双蒸水中配置为A液，柠檬酸三钠2.94g加入100ml的双蒸水中配置为B液；按照1：1的体积比例将A液与B液进行混合，配置柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，精密pH计测定溶液的pH值使其pH值在4.2-4.5，现用现配。（2）行为药理学的试剂①Epac1shRNA慢病毒：美国santa公司；无效shRNA慢病毒：美国santa公司。②巴比妥钠：美国sigma公司。（3）RealTime-PCR①Trizol溶液：美国ThermoScientifics公司。②异丙醇：北京化工厂③反转录试剂盒（TransScriptFirst-StrandcDNASynthesisSuperMix）：北京全式金生物技术有限公司。④PCR引物：北京睿博兴科生物科技有限公司合成，灭菌去离子稀释至工作浓度。⑤TopGreenqPCRSuperMix：北京全式金生物技术有限公司。11 （4）Western-Blot试剂①蛋白裂解液：上海碧云天生物技术有限公司；PMSF：美国sigma公司。②BCA蛋白质定量试剂盒（E162-01）：北京康润诚业生物科技有限公司。③SDS-PAGE凝胶配制试剂：Tris(V900483-500G)、SDS(L3771-500G)、过硫酸铵（AP）、TMED(9281-25ML)T均购于美国sigma公司，30%丙烯酰胺购于北京康润诚业生物科技有限公司；④蛋白marker：美国ThermoScientifics公司，组成为11、17、25、35、48、63、75、100、135、180kDa。⑤6×SDS蛋白样品缓冲液（10ml）：3.0ml1MTris-HCL(pH6.8),1.2gSDS,6.0ml甘油，0.6mlβ-巯基乙醇，0.06g溴酚蓝，最后用水补到10ml。⑥1×电泳缓冲液（1L）：3.03gTris,14.4gGlycine,1gSDS,加水溶解后定容到1L。⑦1×转膜buffer（1L）：3.03gTris,14.4gGlycine,加水定容至900ml,再加入100ml无水甲醇。⑧1×TBST：8.0gNaCl,2.42gTris,0.2gKCl,1.5ml浓HCl（12M）调至pH10.4至7.5，定容至1L，加入1mlTween-20。⑨PVDF膜（IPVH00010）：美国Millpore公司。⑩封闭液：5%脱脂牛奶，用TBST溶液现用现配。○11抗体：Anti-Epac1抗体（ab109415）：英国Abcam公司；抗β-actin鼠单克隆抗体（HC201-01）：北京全式金生物技术有限公司；HRP结合的山羊抗兔IgG(7074s)：美国CST公司。○12显色试剂盒(P90719)：美国Millpore公司。12 二、实验方法（一）实验流程图图1实验流程图13 （二）诱导DM和DMA模型大鼠适应性喂养1周，造模前14h禁食、禁水。STZ以20mg/ml的浓度溶于新鲜配置的柠檬酸钠缓冲液中，随机选取20只大鼠单次腹腔内注射STZ（65mg/kg），其余12只作为正常对照，注射相同体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。STZ注射3天后，通过便携式血糖仪测量尾静脉血糖值验证造模情况，剔除空腹血葡萄糖水平＜13.9mmol/L的大鼠。在STZ注射前（0d）、后(3d、7d和14d)检测STZ注射组大鼠的PWT，若14d与0d相比显著下降，且有统计学差异者，即为制备成功的DMA模型大鼠。（三）PWT检测将大鼠置于金属网架子上，该架子带有透明塑料笼，每笼放置一只大鼠，适应环境30min后，用不同刺激强度的Von-Frey细丝（0.6g、1.0g、1.4g、2.0g、4.0g、6.0g、8.0g、10.0g、15.0g）垂直刺激大鼠后爪的足底表面，阳性反应为大鼠出现明显的缩足、舔足或抬足行为。刺激强度从小开始并逐渐增加，同一强度的刺激每次连续测试5-10次，且单次测试的时间持续在4-5s，同只后爪每两次测试的时间间隔在5min以上，若10次中有6次以上阳性反应或5次中有3次以上阳性反应，该最小刺激强度则为大鼠的PWT，即机械性刺激痛阈值。若所需刺激强度>15g，该阈值直接记为15g。为检测不同病毒对DMA模型大鼠及正常对照组大鼠疼痛行为的影响，分别在鞘内注射前0d（STZ注射后14d）和注射后1d,3d,6d,9d,12d,14d检测大鼠PWT值，每天检测1次。（四）体重检测每次进行腹腔注射前均需测量大鼠的体重，并以大鼠的体重为依据来计算药物的注射剂量。同时监测大鼠腹腔注射前0d、腹腔注射后3d、7d、14d及鞘内注射前0d(腹腔注射后14d)、后7d、14d体重变化，体重精确到1g。（五）血糖检测通过便携式血糖仪每周测量尾静脉血糖值验证造模情况，空腹血葡萄糖水平≥13.9mmol/L的大鼠纳入本研究中。监测大鼠腹腔注射前0d、腹腔Z注射后3d、7d、14d及鞘内注射前0d(腹腔注射后14d)、后7d、14d的空腹血糖的变化。14 （六）实验分组12只正常对照大鼠随机分为2组，1组：正常大鼠鞘内注射对照组(n=6)，鞘内注射无效shRNA慢病毒，无效shRNA慢病毒不会导致任何细胞的mRNA降解，作为Epac1shRNA慢病毒的阴性对照；2组：正常大鼠鞘内注射组(n=6)，鞘内注射Epac1shRNA慢病毒。制备成功11只DMA模型大鼠随机分为2组，3组：DMA鞘内注射对照组(n=5)，鞘内注射无效shRNA慢病毒；4组：DMA鞘内注射组(n=6)，鞘内注射Epac1shRNA慢病毒。（七）鞘内注射及给药200μlEpacshRNA慢病毒冻存液含1.0×106个病毒感染单位,用于抑制大鼠Epac1的表达。200μl无效shRNA慢病毒冻存液含有1.0×106感染单位病毒，不会导致任何细胞的mRNA降解，作为阴性对照。使用前一周将病毒液从-80℃冰箱转移至4℃冰箱解冻。1％戊巴比妥钠（35mg/kg）腹腔注射浅麻醉大鼠，大鼠取伏坐位，使用连接29号针头的微量注射器以L5-L6棘突间隙为穿刺点。右手持注射器，左手拇指和中指放于大鼠的第L5-L6棘突间隙的两侧，向外测绷紧大鼠的皮肤。右手的食指定位，从L5-L6棘突间隙垂直缓慢进针，当出现阻力消失感时倾斜针头至45度左右并向前推进，当大鼠出现甩尾动作表则明注射成功。（八）组织准备鞘内注射14天后，1％戊巴比妥钠（65mg/kg）腹腔注射深麻醉大鼠，大鼠取俯卧位，备皮后切开背部正中皮肤、筋膜，分离椎旁肌肉，于T12和S1处横断脊柱，迅速于冰上分离L4-L6段DRG周围的骨质及组织，充分暴露DRG后小心取出，立即置入2ml平底冻存管中，侵入液氮中转运至-80℃冰箱保存。实验过程中所用液体、器械和器皿均经高压蒸汽灭菌锅灭菌后使用。（九）RealTime-PCR检测基因表达水平（1）组织准备高压处理所用液体、枪头和离心管，所用的器皿和器械经121℃高温干烤20min。将从-80℃冰箱中取出L4-L5DRG迅速放入无RNA酶的2ml离心管中。（2）总RNA的提取①每管中加入1mlTrizol，样品的总体积不超过所用Trizol液体积的10%，15 并迅速混匀，用高通量动植物组织研磨机在液氮环境下研磨至看不到组织块，冰上静置5min。13000r/min离心10min。②取新管每管加入200μl氯仿，在其中加入上一步离心所得上清液，注意不要吸到下层沉淀，颠倒混匀后，冰上静置5min。③4℃，12000r/min离心10min。④取上层的水相500μl至新的离心管中，并在每管中并加入500μl的异丙醇颠倒混匀，移至-20℃冰箱内静置30min。⑤4℃，12000r/min离心10min，所得沉淀即为细胞RNA。⑥弃上清液，并加入等体积的75%乙醇颠倒混匀。4℃，12000r/min离心5min。重复此操作一次。⑦弃上清，放置于超净台中进行风干，待管壁无可见水滴后，加入30μl无RNA酶的去离子水进行溶解；取1μl测定RNA的浓度，其余保存至-80℃冰箱中。⑧超微量紫外分光光度计测定RNA的浓度，测试完毕先用擦镜纸擦干净，再用超纯水清洗两到三次，擦干。（3）RNA反转录合成cDNA反转录按全式金公司“TransScriptFirst-StrandcDNASynthesisSuperMix”试剂盒使用说明进行操作，将TotalRNA、Oligo(dT)与RNase-freeWater加入PCR管混匀，65℃孵育5min后，冰浴2min，然后向上述管中加入其它反应组分共10μl（表1）混匀，离心机离心后置入PCR仪中进行反转录反应，条件设定为25℃10min→42℃60min→70℃10min,反转录的cDNA于-20℃保存备用。表1反转录体系成分含量TotalRNA2500ngOligo(dT)1μl2×TSReactionMix5μlEnzymeMix0.5μlRNase-freeWaterupto10μl（4）实时定量PCR①采用ABI7500定量PCR仪，将反转录产物稀释5倍作为反应模板。检16 测基因引物：Epac1上游引物5'－GAGCAGAGATACCCGACTTA－3'，下游引物5'－CCTTGGTCTGAGGAGATACA－3'，GAPDH上游引物5'－TCAACAGCAACTCCCATTC－3'，下游引物5'－CCTGTTGCTGTAGCCATATT－3'。试剂采用TopGreenqPCRSuperMix，取96孔板依次加入20μl体系，离心机离心混匀。每个样品做3个重复。表220μl反应体系成分含量2×qPCRSuperMix10μlcDNA模板1μl上游引物0.4μl下游引物0.4μlddH2O8.2μl总体积20μl②反应条件设置为:95℃预变性15s，95℃变性5s，60℃退火,延伸30s，共45个循环。③PCR结束后，以GAPDH作为内参,用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。（十）Western-Blot检测蛋白表达水平（1）提取总蛋白①从-80℃冰箱中取出L4-L5DRG放入2ml离心管中，每管加入200μl含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，裂解液在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM,使用高通量动植物组织研磨机在液氮环境中将组织磨成匀浆。②蛋白匀浆4℃，12000r/min离心10min，将上清液移至新的离心管中。③用BCA试剂盒测定蛋白质浓度，将各样品蛋白浓度调至一致。按5：1将6×SDS上样缓冲液加入到蛋白样品中，100℃加热3min使蛋白质变性，置于-20℃冰箱保存备用。（2）蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳①将制胶专用玻璃板清洁干净并风干，与配套装置组合。17 ②配置10%分离胶：水4.0ml，30%丙烯酰胺3.3ml，1.5MTris(pH8.8)2.5ml，10%SDS0.1ml，10%过硫酸铵0.1ml，TMED0.004ml，共10ml，充分混匀。③将新鲜配置的液态分离胶加入两块玻璃板的夹层之间，为保证压缩胶的长度，分离胶上缘与低玻璃板上缘的距离约是梳齿长度的基础上加1cm，分离胶灌注后立刻轻轻地在分离胶溶液上加入一层水，置于室温下至少30min。④配制5%的浓缩胶：水3.4ml，30%丙烯酰胺0.83ml，1.5MTris(pH6.8)0.63ml，10%SDS0.05ml，10%过硫酸胺0.05ml，TEMED5μl，共5ml,充分混匀。待分离胶完全凝固后，倒掉其上层的水沿玻璃板夹层将浓缩胶加到分离胶上层，立刻插入配套的梳子，室温下静置至凝固。用保鲜膜包裹凝固的凝胶，水平放入4℃冰箱过夜，使之充分聚合，凝固均匀。⑤使用凝胶前小心拔出配套梳子，超纯水冲洗加样孔，并冲洗掉玻璃板上残余的胶块。⑥将凝胶玻璃板固定在电泳仪中，电泳槽内加入500ml电泳缓冲液。⑦按顺序依次加入不同组的样本和标准蛋白marker。⑧接通电源，浓缩胶选择80V恒压下电泳，分离胶选择120V恒压电泳。电泳时间根据目的蛋白分子量的大小确定。⑨电泳结束关闭电源，取下玻璃板并小心撬开取出凝胶，切掉浓缩胶。(3)湿法转移蛋白质①根据蛋白marker指示小心切下目的蛋白所在区域的凝胶，测量其长和宽。根据凝胶的尺寸裁剪出所需的1张PVDF膜和2张3层滤纸。PVDF膜使用前须在甲醇中激活10s。②组装转膜装置，依次为黑色夹板、海绵垫、3层滤纸、分离胶、PVDF膜、3层滤纸、海绵垫，白色夹板。卡紧转膜板、电转液倒入电转槽。接通电源后在200mA恒流下电转转1h。③转膜结束后将膜取出，在右上角剪下一角做为标记，用以区分膜的正反面。（4）免疫印迹检测①在37℃下，用TBST溶液配置的5%脱脂奶粉封闭膜1h。18 ②一抗孵育：将Epac1抗体（TBST溶液1:2000稀释）和β-actin抗体（TBST溶液1:10000稀释）分别加入容器中使其覆盖在PVDF膜表面，在摇床上室温孵育2h，取出膜后用TBST溶液漂洗3次，每次10min。③加入二抗：将偶联HRP山羊抗兔IgG（TBST溶液1：5000稀释），加入容器中使其覆盖在PVDF膜表面，在摇床上室温孵育40min后取出膜，用TBST漂洗3次，每次10min。④用显色试剂盒，检测试剂1和2按1：1体积比混合后滴加至膜上，在全自动荧光/化学发光成像分析系统下显示蛋白质条带，并保存图片。⑤ImageJ软件进行灰度分析,蛋白表达水平通过目的蛋白条带与内参蛋白β-actin条带灰度值的比值反映。（十一）数据分析实验数据录入SPSS22.0统计软件，正态分布计量资料采用x±s表示，统计方法采用重复测量的方差分析，析因设计的方差分析。P＜0.05时差异有统计学意义。结果（一）大鼠血糖和体重的变化（1）血糖①从腹腔注射后3d至14d，DMA组（3组、4组）大鼠空腹血糖显著大于13.9mmol/L，提示DM大鼠模型制备成功，成模率约92%；而正常对照组（1组、2组）大鼠空腹血糖无显著变化。采用两因素重复测量方差分析统计方法比较正常对照组（1组、2组）与DMA组两组（3组、4组）大鼠的空腹血糖，在腹腔注射前差异无统计学意义（P=0.084），腹腔注射后3d、7d、14d差异有统计学意义（P=0.000，P=0.000，P=0.000）（表3，图2）。19 表3腹腔注射前后各时间点大鼠的空腹血糖的变化情况(mmol/L,x±s)组别0d3d7d14d正常对照组4.790.215.200.575.180.565.050.75DMA组5.330.2022.910.54**26.250.54**27.190.72**注：DMA组与正常对照组比较，**表示P＜0.01图2腹腔注射前后各时间点大鼠的空腹血糖的变化注：DMA组与ＣＯＮ组比较，**表示P＜0.01，CON表示正常对照组②鞘内注射后采用重复测量的方差分析统计方法比较大鼠的空腹血糖，因方差不齐采用Games-Howell法，比较结果显示1组与2组差异无统计学意义（P=0.102），1组与3组、4组大鼠差异有统计学意义（P=0.000，P=0.000）。2组与3组、4组大鼠差异有统计学意义（P=0.000，P=0.000）。3组4组大鼠差异无统计学意义（P=0.994）。说明Epac1shRNA慢病毒与无效慢病毒对血糖均无无影响（表4，图3）。20 表4鞘内注射前后各时间点大鼠的空腹血糖的变化情况(mmol/L,x±s)组别0d7d14d1组5.231.26##5.231.28##5.331.12##2组4.931.03##5.031.05##5.000.92##3组27.321.13**25.841.15**24.601.00**4组27.081.03**25.451.05**24.100.92**注：**表示与同时间点的1组相比P＜0.01，##表示与同时间点的3组相比P＜0.01。1组，正常大鼠鞘内注射对照组；2组，正常大鼠鞘内注射组3组，DMA大鼠鞘内注射对照组；4组，DMA大鼠鞘内注射组。图3鞘内注射前后各时间点大鼠的空腹血糖变化注：**表示与同时间点的1组相比P<0.01，##表示与同时间点的3组相比P<0.01。1表示1组，正常大鼠鞘内注射对照组；2表示2组，正常大鼠鞘内注射组；3表示3组，DMA大鼠鞘内注射对照组；4表示4组，DMA大鼠鞘内注射组。21 （2）体重①体重是评定糖尿病模型的辅助参考指标，与正常对照组（1组、2组）相比，DMA组（3组、4组）大鼠的体重增长明显缓慢。采用两因素重复测量方差分析统计方法比较正常对照组（1组、2组）与DMA组（3组、4组）两组大鼠的体重，在腹腔注射前两组体重的差异无统计学意义（P=0.819）。腹腔注射后3d、7d、14d差异有统计学意义(P=0.000，P=0.000，P=0.000)（表5，图4）。表5腹腔注射前后不同时间点大鼠体重的变化情况(g,x±s)组别0d3d7d14d正常对照组220.7013.25255.5717.67293.6017.73325.0420.39DMA组222.0310.64221.4911.93**237.1816.30**243.0224.43**注：DMA组与正常对照组比较，**表示P＜0.01图4腹腔注射前后各时间点大鼠体重的变化注：DMA组与正常对照组比较，**表示P＜0.01，CON表示正常对照组②鞘内注射后采用重复测量的方差分析统计方法比较大鼠的体重，因方差齐，采用LSD法，比较结果显示1组与2组差异无统计学意义（P=0.066），1组与3组、4组大鼠差异有统计学意义（P=0.000，P=0.000），2组与3组、4组大22 鼠差异有统计学意义（P=0.000，P=0.000），3组与4组大鼠差异无统计学意义（P=0.083）。说明Epac1shRNA慢病毒与无效慢病毒对体重无影响（表6，图5）。表6鞘内注射前后各时间点大鼠体重的变化情况(g,x±s)组别0d7d14d1组308.539.086#342.1814.42#385.188.62##2组336.0518.30*##373.4222.86##408.8314.15##3组253.9425.21*285.5039.09306.3434.38**4组234.3318.89**253.9221.60**285.1317.50**注：*表示与同时间点的1组相比P＜0.05，**表示P＜0.01；#表示与同时间点的3组相比P＜0.05，##表示P＜0.01。1组，正常大鼠鞘内注射对照组；2组，正常大鼠鞘内注射组3组，DMA大鼠鞘内注射对照组；4组，DMA大鼠鞘内注射组。图5鞘内注射前后各时间点大鼠的体重变化注：*表示与同时间点的1组相比P＜0.05，**表示P＜0.01；#表示与同时间点的3组23 相比P＜0.05，##表示P＜0.01。1表示1组，正常大鼠鞘内注射对照组；2表示2组，正常大鼠鞘内注射组；3表示3组，DMA大鼠鞘内注射对照组；4表示4组，DMA大鼠鞘内注射组。（二）大鼠PWT的比较（1）腹腔注射前后采用两因素重复测量方差分析统计方法比较正常对照组（1组、2组）与DMA组（3组、4组）两组大鼠的PWT，在腹腔注射前0d、腹腔注射后3d两组PWT差异均无统计学意义(P=0.401，P=0.173)。腹腔注射后7d、14d差异均有统计学意义（P=0.020，P=0.000）（表7，图6）。表7腹腔注射前后各时间点大鼠PWT的变化情况(g,x±s)组别0d3d7d14d正常对照组12.833.2414.002.3713.752.2613.752.26DMA组14.092.0215.000.0010.814.35*4.181.66**注;DMA组与正常对照组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01。图6腹腔注射前后各时间点大鼠PWT的变化注：DMA组与正常对照组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01。CON表示正常对照组(2)鞘内注射前后24 鞘内注射后第6天Epac1shRNA慢病毒注射组（2组、4组）大鼠的PWT值开始上升并持续到第14天。采用重复测量的方差分析统计方法比较大鼠的PWT，因方差齐，采用LSD法，比较结果显示1与2组两组间相比，差异无统计学意义（P=0.112）；1组与3组两组间相比,差异有统计学意义（P=0.000）；1组与4组两组间相比，差异有统计学意义（P=0.000）；2组与3组两组间相比，差异有统计学意义（P=0.000）；2组与4组两组间相比，差异有统计学意义（P=0.000）；3组与4组两组间相比，差异有统计学意义（P=0.000）(表8，图7)。Epac1shRNA慢病毒可上调大鼠PWT，无效慢病毒对PWT无影响。表8鞘内注射前后各时间点大鼠PWT的变化情况(g,x±s)组别0d1d3d6d9d12d14d13.332.513.332.513.003.113.333.112.173.111.672.511.672.51组8##8##6##6##9##8##8##14.172.013.332.513.003.114.172.014.172.013.332.514.172.02组4##8##6##4##4##8##4*##4.801.104.001.412.801.103.881.633.361.972.681.232.281.003组**************3.671.973.671.513.001.104.331.517.002.758.173.929.331.034组*********#*#*##注：*表示与同时间点的CONshRNA组相比P＜0.05，**表示P＜0.01；#表示与同时间点的DMAshRNA组相比P＜0.05，##表示P＜0.01。1组，正常大鼠鞘内注射对照组；2组，正常大鼠鞘内注射组3组，DMA大鼠鞘内注射对照组；4组，DMA大鼠鞘内注射组。25 图7鞘内注射前后各时间点大鼠PWT的变化注：*表示与同时间点的1组相比P＜0.05，**表示P＜0.01；#表示与同时间点的3组相比P＜0.05，##表示P＜0.01。1表示1组，正常大鼠鞘内注射对照组；2表示2组，正常大鼠鞘内注射组；3表示3组，DMA大鼠鞘内注射对照组；4表示4组，DMA大鼠鞘内注射组。（三）大鼠DRG的Epac1mRNA和蛋白表达的比较（1）大鼠DRG的Epac1mRNA的表达①RNA提取完成后，应用超微量紫外分光光度计测定RNA浓度（表10），并测量A260/280评价RNA纯度，所得值在1.8-2.2之间，提示纯度较好。26 表9大鼠RNA浓度（ng/μl）组别序号RNA浓度1组1919.121018.83943.24996.22组11541.621570.931542.341531.63组11242.921329.031315.641002.84组11200.621235.431082.341124.251226.1注：1组，正常大鼠鞘内注射对照组；2组，正常大鼠鞘内注射组3组，DMA大鼠鞘内注射对照组；4组，DMA大鼠鞘内注射组。②运用RealTime-PCR我们检测了Epac1在大鼠DRG部位的mRNA表达情况。析因设计的方差分析显示DMA组（3组、4组）与正常对照组（1组、2组）相比Epac1mRNA表达上调，差异有统计学意义（P=0.000）；鞘内注射Epac1shRN慢病毒组（2组、4组）与无效慢病毒组（1组、3组）相比Epac1mR27 NA表达下调，差异有统计学意义（P=0.000）（表10，图8）。表10大鼠Epac1/GAPDHmRNA相对表达的变化(x±s)组别mRNA1组2.021.11**2组0.740.193组38.9713.74##4组21.857.80注：**表示DMA组与正常对照组相比，P＜0.01；##表示Epac1shRNA慢病毒组(2组、4组)与对照慢病毒组（1组、3组）相比，P＜0.01。1组，正常大鼠鞘内注射对照组；2组，正常大鼠鞘内注射组3组，DMA大鼠鞘内注射对照组；4组，DMA大鼠鞘内注射组。图8大鼠Epac1mRNA表达的变化注：**表示DMA组与CON组相比，P＜0.01；##表示Epac1shRNA慢病毒组(2组、4组)与无效慢病毒组（1组与3组）相比，P＜0.01。1组，正常大鼠鞘内注射对照组；2组，正常大鼠鞘内注射组3组，DMA大鼠鞘内注射对照组；4组，DMA大鼠鞘内注射组。（2）大鼠DRG的Epac1蛋白的表达Western-Blot检测结果显示DMA组（3组、4组）与正常对照组（1组、2组）相比Epac1表达上调，差异有统计学意义（P=0.000）；鞘内注射Epac1shRN慢病毒组（2组、4组）与无效慢病毒组（1组、3组）相比Epac1蛋白表达28 下调，差异有统计学意义（P=0.020）（图9ab）。ab图9大鼠Epac1蛋白表达的变化注：**表示DMA组与CON组相比，P＜0.01；#表示Epac1sh慢病毒组与对照慢病毒组相比，P＜0.05。1表示1组，正常大鼠鞘内注射对照组；2表示2组，正常大鼠鞘内注射组；3表示3组，DMA大鼠鞘内注射对照组；4表示4组，DMA大鼠鞘内注射组。29 讨论本研究采用单次腹腔注射STZ诱导DM模型，通过PWT筛选出DMA模型，鞘内注射Epac1shRNA慢病毒并观察给药后大鼠PWT的变化，检测DRG部位Epac1mRNA和蛋白的表达。结论如下：①STZ诱导的DM模型大鼠出现了显著的机械性痛，DMA模型大鼠约占STZ注射大鼠的55%；②DMA状态下，DRG部位Epac1mRNA和蛋白表达增多；③鞘内注射Epac1shRNA慢病毒，能下调Epac1mRNA和蛋白的表达，并能有效缓解DMA模型大鼠的疼痛行为。常用的DM动物模型有手术切除胰腺，化学药物诱导，饮食/营养诱导的模型、化学药物和营养联合诱导的模型、自发性糖尿病模型以及转基因动物模型[15]。DM模型大鼠或小鼠糖尿病周围神经病变后机械性异常痛觉过敏增加，常用来研究DNP的发病机制及开发新的有效的镇痛药物。腹腔注射大剂量STZ破坏胰腺β细胞诱导高血糖症建立大鼠DM模型具有快速可靠、重复性高的优点，而且胰岛素治疗可以阻止其高血糖进展[16,17]。我们的研究选用一次性腹腔注射STZ破坏大鼠胰岛β细胞导致大鼠血糖升高，约有90%的大鼠在注射后3天血糖开始升高，且高血糖状态持续至实验结束，同时伴有体重增长缓慢，饮水量、进食量及尿量明显增加。余10%血糖未达糖尿病标准，本研究于STZ腹腔注射3天后继续监测其血糖，发现其血糖始终未达糖尿病标准，但平均水平显著高于正常对照组血糖。DMA组与正常对照组的PWT基线水平在STZ注射前无显著性差异，在STZ注射后的第3天，DMA组PWT开始下降，在第7天显著低于正常对照组水平（P＜0.05），且在实验过程中持续逐渐下降，并保持显著低于正常对照组水平。随着DM病程发展，在STZ注射大鼠中有55%出现PWT明显下降，即DMA模型大鼠。既往有研究报道[18]STZ注射模型大鼠仅有57%出现中、重度机械性诱发痛，我们的结果与之基本一致。大多数研究认为高血糖是糖尿病神经病理性疼痛发生的最主要病理因素，但至少有30％的糖尿病患者血糖控制满意仍然发展为神经病变[19]。同时有糖尿病前期的病人也会有疼痛主诉，而且这往往是他们的唯一主诉。因此，糖尿病神经病理性疼痛也许不是高血糖单一因素导致的。已有研究发现STZ注射后血糖正常的大鼠也会出现显著的机械痛敏[20,21]，我们的研究中，未发现未成DM模型的大鼠有明显的机械痛敏症状，与正常对照组无显著性差异，30 这与其研究结果不一致，可能与大鼠各体差异有关。Epac是多结构域蛋白，有N端调节区和C端的催化区[22]。在没有cAMP的情况下，Epac蛋白具有自我抑制构象，其中催化位点被调节结构域所覆盖。与cAMP结合后,Epac的自我抑制构象被破坏,催化区被暴露,呈现出激活状态[23]。透膜的cAMP类似物8-pCPT可以激活Epac，足底注射8-pCPT可以产生异常性疼痛[24]。Epac1参与葡萄糖稳态和能量平衡[25]，促进轴突生长和再生。细胞外信号调节激酶（extracellularsignal-regulatedkinase，ERK）是丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase，MAPK）家族的成员，ERK通过其上游激酶磷酸化而被激活，磷酸化胞外信号调节激酶(phosphorylatedextracellularsignalregulatedkinase，pERK)信号通路调节细胞增殖和凋亡，参与炎性、神经病理性疼痛以及糖尿病神经病理性痛的进展[26-28]。血管内皮生长因子(vascμlarendothelialgrowthfactor，VEGF)可刺激内皮细胞生长，抑制细胞凋亡，增加血管通透性并促进血管生成，炎症可增加VEGF的表达[29]，并且在疼痛中起重要的作用[30]。Epac1/VEGF和Epac1/pERK信号可能通过蛋白激酶C（proteinkinaseC，PKC）的串扰，导致细胞内葡萄糖水平的升高[31]，并调节能量代谢[32]和保护神经[33]。在急性手术术后疼痛模型大鼠中证实，Epac1通过激活VEGF和pERK引起术后疼痛，且在急性手术术后疼痛模型大鼠足底注射Epac1激活剂导致异常性疼痛时间延长，且pERK和VEGF蛋白表达较对照组增高[24]。已有研究证实，高葡萄糖环境可以直接通过cAMP刺激鸟苷酸交换因子，上调Epac1及其下游效应蛋白[34-36]，Epac1的转录和翻译增加导致蛋白激酶B（proteinkinaseB，Akt）磷酸化[37]。磷酸化Akt对神经病理性疼痛的形成和维持发挥重要的作用[38]。我们的研究显示与正常对照组大鼠相比，DMA组大鼠Epac1mRNA和蛋白表达上调，与以往疼痛模型的研究结果一致，可能与高糖激活并上调Epac1，引起效应蛋白（如VEGF和pERK等）的激活有关。RNA干扰技术可特异性抑制特定基因的表达，慢病毒介导的shRNA在体内组织中的转染率高,作用时间持久，不易诱发宿主免疫反应。鞘内应用shRNA是研究药物、受体或其他蛋白质的常用方法[39]。我们的研究单次鞘内注射给药，给药体积10μl，小于大鼠脑脊液总量（250μl）的10%，未引起并发症。注射Epa31 c1shRNA慢病毒下调了Epac1蛋白和mRNA的表达。在注射后1d、3d检测大鼠PWT与对照组相比无显著变化,这可能是由于慢病毒本身作用慢，一般在四天左右。在注射后6d时DMA大鼠的PWT值开始上调，在9d、12d、14d时与注射无效慢病毒DMA大鼠相比差异均有统计学意义，产生了明显的抗伤害效应。Epac1信号引起PKC移位至细胞膜，激活磷脂酶Cε(phospholipaseCepsilon,PLCε)，引起细胞内钙升高[40]，影响神经元功能。Epac1特异性抑制剂ESI-09、PKC抑制剂Go6976，能够阻断大鼠的痛觉过敏[9,41]。因此，我们推测Epac1shRNA可能通过抑制PKC激活及钙离子内流等机制缓解DMA大鼠的痛觉异常。结论Epac1在STZ诱导的糖尿病机械性痛大鼠中表达升高，参与糖尿病糖尿病机械性痛的进展。应用慢病毒介导shRNA抑制Epac1的表达可上调大鼠机械性痛阈值，缓解大鼠糖尿病机械性痛。Epac1可能成为治疗糖尿病痛性神经病变的潜在靶点。32 ·本研究创新性的自我评价·本研究依据Epac1在疼痛中发挥的作用，单次腹腔注射STZ诱导糖尿病机械性疼痛大鼠模型，鞘内注射Epac1shRNA慢病毒，并检测其mRNA和蛋白的表达。首次提出Epac1参与DMA模型大鼠机械性疼痛行为维持的观点，对DPN的发病机制有一定补充，为临床治疗DMA提供了新思路。33 ·参考文献·[1]deAlmeidaLimaKC,daSilvaBorgesL,HatanakaE,etal.Gripforcecontrolandhanddexterityareimpairedinindividualswithdiabeticperipheralneuropathy[J].Neuroscienceletters,2017,659:54-59.[2]BarrettAM,LuceroMA,LeT,etal.Epidemiology,publichealthburden,andtreatmentofdiabeticperipheralneuropathicpain:areview[J].Painmedicine,2007,8(s2).[3]YangC,GaoJ,WuB,etal.MinocyclineattenuatesthedevelopmentofdiabeticneuropathybyinhibitingspinalcordNotchsignalinginrat[J].Biomedicine&Pharmacotherapy,2017,94:380-385.[4]FinnerupNB,HaroutounianS,KamermanP,etal.Neuropathicpain:anupdatedgradingsystemforresearchandclinicalpractice[J].Pain,2016,157(8):1599.[5]SCHREIBERAK,NONESCF,REISRC,etal.Diabeticneuropathicpain:Physiopathologyandtreatment[J].Worldjournalofdiabetes,2015,6(3):432-44.[6]NiuL,DaiGH,HeGL,etal.Decreasedspinalendomorphin-2contributestomechanicalallodyniainstreptozotocin-induceddiabeticrats[J].Neurochemistryinternational,2017,108:372-380.[7]KawasakiH,SpringettGM,MochizukiN,etal.AfamilyofcAMP-bindingproteinsthatdirectlyactivateRap1[J].Science,1998,282(5397):2275-2279.[8]DeRooijJ,ZwartkruisFJT,VerheijenMHG,etal.EpacisaRap1guanine-nucleotide-exchangefactordirectlyactivatedbycyclicAMP[J].Nature,1998,396(6710):474.[9]MatsudaM,Oh-HashiK,YokotaI,etal.Acquiredexchangeproteindirectlyactivatedbycyclicadenosinemonophosphateactivityinducedbyp38mitogen-activatedproteinkinaseinprimaryafferentneuronscontributestosustainingpostincisionalnociception[J].Anesthesiology:TheJournaloftheAmericanSocietyofAnesthesiologists,2017,126(1):150-162.[10]BaameurF,SinghmarP,ZhouY,etal.Epac1interactswithimportinβ1andcontrolsneuriteoutgrowthindependentlyofcAMPandRap1[J].Scientificreports,2016,6:36370.[11]WangH,HeijnenCJ,vanVelthovenCTJ,etal.BalancingGRK2andEPAC1levelspreventsandrelieveschronicpain[J].TheJournalofclinicalinvestigation,2013,123(12):5023-5034.[12]EijkelkampN,LinleyJE,TorresJM,etal.AroleforPiezo2inEPAC1-dependentmechanicalallodynia[J].Naturecommunications,2013,4:1682.[13]YaoL,WuYT,TianGX,etal.Acroleinscavengerhydralazinepreventsstreptozotocin‐inducedpainfuldiabeticneuropathyandspinalneuroinflammationinr34 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·附录·一、文献综述Epac1与神经性疼痛的研究进展国际疼痛研究协会关于神经性疼痛的定义是神经系统原发性损伤或功能障碍所引起的疼痛[1]。神经性疼痛是慢性疼痛的一种类型，其特征为痛觉过敏，对伤害性刺激引起的疼痛反应强烈。通常以烧灼痛为主，这种灼痛可以是自发性、间歇性的，也可以是持续性的。神经性疼痛通常与抑郁密切相关，给患者带来巨大的痛苦，并且大大降低了患者的生活质量。然而神经性疼痛是一种难治性疾病，其发病机制尚不明确，发病原因也非常复杂,仍是困扰医学界的一大难题。鸟嘌呤核苷酸转化因子交换蛋白1，也叫cAMP直接激活的交换蛋白1，在慢性炎性疼痛、神经性疼痛和炎症时表达增加，促进机械性痛觉过敏和炎症，可能成为治疗神经性疼痛的潜在靶点。现主要介绍Epac1蛋白的结构、功能及其在神经性疼痛方面的研究进展。1Epac蛋白1.1Epac蛋白的概述细胞外信号分子与细胞膜上的G蛋白偶联受体结合后，细胞内的腺苷酸环化酶被激活，腺苷酸环化酶催化腺苷三磷酸脱掉两个磷酸缩合成cAMP，导致细胞内cAMP升高，它是细胞内第一个被发现的第二信使。cAMP调控多种细胞生理学过程,如Ca2+代谢的调控、肌肉的收缩、离子通道的传递、学习与记忆、细胞的生长和分化、凋亡和炎症等。cAMP的生理效应由蛋白激酶A（proteinkinaseA，PKA）、环核苷酸门控离子通道和Epac三种效应分子介导。Epac是一种鸟苷酸交换因子,作用于蛋白，包括大鼠肉瘤蛋白蛋白，包括Ras相关蛋白Rap1[2-3]和Rap2[4]。Epac可单独或与PKA协同参与cAMP调控多种生物学过程,Epac的发现改变了人们对cAMP信号通路的认识，不再认为PKA是cAMP唯一的靶分子。在哺乳动物中，Epac存在Epac1和Epac2两种亚型。Epac1mRNA广泛表达，38 而Epac2mRNA主要在脑和胰腺、肾上腺等内分泌组织中表达[2-3]。由于组织分布及形成信号体的能力不同，它们的细胞功能也不同[5]。Epac1促进多种疾病的发展，如心肌肥大、心肌梗死、阿尔茨海默病、慢性阻塞性肺疾病、炎症、糖尿病、肥胖、癌症和疼痛等[6]。Epac2β细胞胰岛素的释放。1.2Epac蛋白的结Epac1和Epac2是多结构域蛋白，有N端调节区和C端的催化区（图1）。N端调节区有与细胞膜定位相关的Dishevelled,Egl-10,Pleckstrindomain（DEP）结构域和与cAMP结合的cAMP-B结构域。大鼠肉瘤蛋白（ratsarcoma,Ras）交换基序结构域是调节区和催化区之间的分子内桥，以稳定鸟苷酸交换因子（guaninenucleotide-exchangefactor,GEF）结构域。Epac蛋白还有Ras相关结构域，其存在几种与Ras相互作用的蛋白。C端催化区有CDC25同源结构域，具有GEF活性。Epac2还有与cAMP结合的亲和力很低的cAMP-A结构域，其生物学功能尚不确定。在没有cAMP的情况下，Epac蛋白具有自我抑制构象，其中催化位点被调节结构域所覆盖[4]。与cAMP结合后,Epac的自我抑制构象被破坏,催化区被暴露,呈现出激活状态。透膜的cAMP类似物，如8-pCPT-2′-O-Me-cAMP（8-pCPT）可以激活Epac。ESI-09是一种非环状核苷酸小分子，特异性抑制Epac1和Epac2，结构上不同于cAMP，选择性地结合Epac1和Epac2的cAMP结合位点[7]。图1Epac蛋白的结构注：Epca:鸟嘌呤核苷酸转化因子交换蛋白；DEP:DEP结构域；cAMP-B:cAMP结合区域B；REM:REM区域；RA:RA区域；CDC25HD:CDC25同源结构域；cAMP-A：cAMP结合区域A1.3Epac效应蛋白Epac蛋白对多种受体蛋白发挥信号转导功能：①具有鸟苷酸交换活性，激活39 Ras蛋白[8]。在非激活状态下，Ras蛋白以结合二磷酸鸟苷(guanosinediphosphate,GDP)的无活性形式存在于细胞膜内侧。生长因子受体结合蛋白与具有鸟苷酸交换因子活性的胞质蛋白可与Ras结合导致Ras的构象改变,使Ras-GDP释放GDP与三磷酸鸟苷(guanosinetriphosphate,GTP)结合，转变为Ras-GTP的活化状态，激活信号途径的下游蛋白。a.Epac1直接结合并激活重组人相关RAS病毒（recombinanthumanrelatedRASviral,R-Ras），R-Ras属于小分子G蛋白Ras超家族,R-Ras在调节细胞生长和黏附中发挥重要作用[9]，并通过激活人磷酯酶Cε改变细胞Ca2+含量[10]。b.Epac能够在cAMP激活的情况下催化Rap1上的GDP转变为GTP[11]。细胞cAMP的增加促进Epac1向质膜移位，从而允许局部Rap1激活。Epac-Rap1信号不仅可以控制细胞间相互接触[12]，还可以调控细胞分化[13]和炎症过程[14]。c.G蛋白偶联受体刺激腺苷酸环化酶，导致cAMP水平升高和Epac1活化，Epac1催化Rap2B上的GTP加载,引起PLC-ε激活产生三磷酸肌醇，导致细胞内Ca2+增加[15]。②激活丝裂原活化蛋白激酶通路[16]。Ras蛋白被活化后在胞内与Raf（又称MAPKKK，即MAPK激酶激酶）结合并使其激活。Raf活化后可使MAPK激酶的丝/苏氨酸残基磷酸化,从而活化MAPK,双特异性磷酸化激酶，可磷酸化MAPK使其活化，活化的MAPK进入细胞核，可调节细胞周期和细胞分化的特异性蛋白表达转录因子。Rap1调节MAPK反应，特别是细胞外信号调节激酶1/2(extracellularregulatedkinase1/2,ERK1/2)。Epac激活的MAPK不仅涉及调节细胞增殖和细胞周期调控，而且还涉及离子通道的调节[17]和基因表达调控[18]。③活化的Ras能直接与磷脂酰肌醇3-激酶的催化亚基结合并将其激活,磷脂酰肌醇3-激酶活化后生成磷脂酰肌醇3-磷酸，磷脂酰肌醇3-磷酸作为第二信使,调控细胞骨架构和骨架分布,影响细胞的运动能力,介导细胞转移。④Epac1信号通过使蛋白激酶C移位至细胞膜激活PLC-ε，活化的PLC-ε可将位于细胞膜内层脂质中的二磷酸磷脂酰肌醇水解为1、4、5-三磷酸肌醇和二酰甘油。1、4、5－三磷酸肌醇与内质网膜上的特异性受体结合，膜上的Ca2+闸门通道开放，内质网腔中的Ca2+释放入细胞质中，引起细胞内Ca2+升高[19]。在神经细胞中,激活Epac信号通路后神经元的调亡数目增加，有助于疼痛信号的产生，而在心肌细胞的反应则相反,在心肌细胞中激活Epac通路促进细40 胞存活，抑制心肌细胞凋亡[20]。2神经病理性疼痛的发病机制和Epac1的相关作用机制2.1神经病理性疼痛的发病机制2.1.1外周敏化与中枢敏化感觉神经末梢检测到的刺激通过分布在皮肤、肌肉、关节以及内脏器官的伤害性感受器转变为电信号，沿主要传入神经纤维传到背根神经节神经元，然后通过轴突到达脊髓后角。脊髓后角是感知信息的处理中心，脊髓后角胶状质中的神经细胞具有闸门作用，将外周感觉信息传到脑，并通过上行传导通路传导至较高的中枢神经系统进行进一步处理。然后将大脑下达的信号发送到脊髓，通过下行途径调节感觉和运动神经元电路活动。机体受到伤害性刺激可引起痛觉，生理条件下痛觉主要作为身体的一种保护机制，但剧烈疼痛可导致生理功能紊乱。在背根神经节和三叉神经节中的伤害感受器可被致痛物质激活，致痛物质可来源于：①直接从损伤细胞中释放的，如K+、乙酰胆碱、5-羟色胺等；②损伤细胞酶促合成的物质，或通过血浆蛋白及白细胞游走带入到损伤区的物质，缓激肽和花生四烯酸的代谢产物，如前列腺素和白三烯；③伤害感受器本身所释放的物质，如P物质；④神经细胞和免疫细胞释放的细胞因子，如肿瘤坏死因子。感觉神经元化学信号的传递机制包括离子通道受体，G蛋白偶联受体，酪氨酸-激酶受体和细胞内甾体型受体。外周伤害性感受器夸大对伤害性刺激的反应、异常神经冲动、寂静伤害性感受器的激活会导致外周伤害感受器的敏感化。外周异常传入引起脊髓和中枢痛敏神经元反应性的增强和抑制性神经元活动的阻抑，即中枢敏化。外周敏化和中枢敏化引起痛觉过敏，使机体对伤害性刺激的敏感性增强。这种异常感引起痛苦的现象，包括“异常性疼痛”（即对无害刺激感到痛苦的感觉）和“痛觉过敏”（加剧了对轻度刺激的痛觉），统称为痛苦状态。2.1.2离子通道的异常改变从细胞/分子方面来看，不同类型的感觉神经元中的受体和离子通道参与促进/持续的异位放电。离子通道是细胞膜或内质网膜上的有亲水性孔道的穿膜蛋白质，贯穿脂质双层膜的中央带，广泛分布于各类可兴奋细胞的细胞膜上。①电压门控Na通道在伤害感受器（疼痛感觉神经元）的兴奋性中起关键作用[21]。不同41 亚型的钠通道（Nav1.1～1.9），参与不同类型神经性疼痛的调控[22]。Nav1.7在伤害感受器中高度表达，并且在遗传性疼痛神经病变中起关键作用。在急性疼痛和炎性疼痛的动物模型中，敲除Nav1.7基因可下调机械性疼痛的阈值。Nav1.3在慢性炎症和神经损伤后被上调,Nav1.8和Nav1.9在家族性发作性疼痛中的表达增加[23-24]，其疼痛的特征是主要在上肢关节，偶尔在上半身，晚上出现腹泻，口腔消炎镇痛药能缓解疼痛。②瞬时受体电位（transientreceptorpotential,TRP）通道是主要的感官检测/转导通道，被激活时通常需要Nav通道引发的动作电位触发[25]。动物实验研究证实，TRP通道是参与神经性疼痛的关键因子[26]。神经损伤和炎症上调TRP通道的表达，导致神经纤维过度兴奋的程度和持续时间的增加。＋③电压门控K通道激活导致膜复极化，从而抑制放电。在动物神经性疼痛模型中＋减少电压门控K通道亚型Kv1.1，Kv1.2，K1.4，Kv2.1，Kv2.2，Kv4.3，Kv7.2，Kv7.3和Kv9.1的蛋白表达导致K+电流减少，引起感觉神经的兴奋[27]。K+通道的激动剂瑞替加滨在神经病理性疼痛、炎症性疼痛和内脏疼痛中都能起到明显的镇痛作用。④电压门控Ca2+通道在调节神经性疼痛中发挥关键作用，包括调节兴奋性神经递质释放、Ca2+依赖性酶激活以及对基因表达的影响。此外，损伤诱导的电压门控Ca2+通道及其亚基的失调，也可以通过调节其他神经可塑性导致疼痛信号转导[28]，使用Ca2+通道阻滞剂加巴喷丁同样可以起镇痛作用。2.1.3异位放电自发性疼痛是神经性疼痛的一个重要特征，是由于异位放电产生的。神经元受损后在非刺激诱导下外周和中枢都会产生异位放电，不是来源于末梢感受器，而是来自神经元胞体和轴突。异位放电的传入活动引起脊髓的敏感化，受损和正常的神经元都会出现异位放电。神经损伤后促炎细胞因子和趋化因子在背根神经节的表达上调，作用于它们各自的受体，并通过TRP通道和钠通道产生异常放电，增强传入脊髓背角的信号，导致外周细胞超兴奋和持续放电[29]。背根神经节的自发性放电也可能是一种功能代偿和自身修复的表现，在背根神经节用阻断剂能减少异位放电。2.2Epac1在神经病理性疼痛的作用机制cAMP促进Epac1向质膜的移位，堆积在质膜的Epac1抑制神经突的生长和42 修复[30]，Epac1激活有助于神经性疼痛引起的异常性疼痛的进展。①激活PKC。PKC是Epac的下游，Epac1介导cAMP的信号传递到PKC，对PKC的激活起重要作用，并可能有助于伤害性感受器的启动[31]。PKC激活剂可加快糖尿病小鼠的痛觉传导速度，外周组织注射PKC抑制剂后痛觉过敏现象减轻。在完全弗氏佐剂诱导的炎症中，背根神经节中Epac1和Epac2的表达以及cAMP的水平显著增高，磷酸化PKC的表达也被上调。P2X3嘌呤受体在疼痛信号的传导中起重要作用。完全弗氏佐剂诱导的P2X3嘌呤受体介导的痛觉过敏不仅可被Epac拮抗剂阻断，还可被经典的PKC亚型抑制剂Go6976和PKC-siRNA阻断[32]。Epac1信号引起PKC移位至细胞膜，增强电流以激活PLC-ε，引起细胞内Ca2+升高[33]。足底注射Epac激动剂8-pCPT已被证明通过PKC依赖性途径引起大鼠机械伤害阈值降低，其诱导的异常性疼痛在缺乏电压门控钠通道Nav1.7，Nav1.8或Nav1.9的小鼠背根神经节中表达不受影响[34]。Hucho等[19]的研究表明，PKC-ε特异性抑制剂可阻断由Epac激活剂8-pCPT诱导的机械性痛觉过敏，类似于肾上腺素诱导的PKC依赖性痛觉过敏中观察到的痛觉过敏。②激活MAPK。MAPK是调节神经元炎症的重要信号通路主要包括ERK、c-JunN端激酶/应激激活的蛋白激酶、p38MAPK。MAPK通路在各种因素刺激的作用下被激活，并通过影响下游多种细胞因子的表达参与炎症反应和免疫应答的调控，在转录和非转录水平调节诱导和维持痛觉过敏反应。在细胞分化、生长发育、神经元可塑性及多种生理病理过程中,ERK介导的胞内信号转导发挥重要作用。ERK活化后形成的磷酸化ERK是慢性疼痛形成和维持的关键因素。在大鼠炎性疼痛和神经病理性疼痛模型中，ERK参与痛觉敏化的形成和维持，ERK抑制剂可缓解大鼠的痛觉过敏。研究证实,Epac1对慢性术后疼痛有潜在作用，Epac1通过激活磷酸化ERK引起术后疼痛信号[35]。在应激反应和各种炎性因子的作用下，p38MAPK的酪氨酸和苏氨酸双磷酸化后被激活，它是疼痛的产生和维持的重要因子[36]。神经损伤后，p38MAPK磷酸化水平明显增加，参与炎性痛觉过敏的形成[37]。Epac1增高激活p38MAPK,Epac1特异性抑制剂ESI-09和p38MAPK特异性抑制剂FR167653能阻止伤害性感受器的启动，缓解持续的痛觉过敏，提高大鼠的痛阈[6]。43 3结语自从1998年开始对Epac蛋白进行探索以来，关于其生理效应和生物学功能的了解取得了初步进展。但是尚有很多的不足，如关于其转录、翻译和翻译后的调控方面的知识仍然匮乏。Epac1的研究仅限于动物实验和体外(细胞培养模型)，关于Epac1基因敲除小鼠研究的文献存在自相矛盾，可能需要组织特异性、条件性基因敲除动物模型以及功能特异性药理学探针来进一步研究。相信关于Epac1蛋白的研究进展会有重大突破，使其成为治疗神经性疼痛的新颖干预措施。参考文献[1]FinnerupNB,HaroutounianS,KamermanP,etal.Neuropathicpain:Anupdatedgradingsystemforresearchandclinicalpractice[J].Pain,2016,157(8):1599.[2]KawasakiH,SpringettGM,MochizukiN,etal.AfamilyofcAMP-bindingproteinsthatdirectlyactivateRap1[J].Science,1998,82(5397):2275-2279.[3]DeRooijJ,ZwartkruisFJ,VerheijenMH,etal.EpacisaRap1guanine-nucleotide-exchangefactordirectlyactivatedbycyclicAMP[J].Nature,1998,396(6710):474-477.[4]DeRooijJ,RehmannH,vanTriestM,etal.MechanismofregulationoftheEpacfamilyofcAMP-dependentRapGEFs[J].JBiolChem,2000,275(27):20829-20836.[5]SchmidtM,DekkerFJ,MaarsinghH.ExchangeproteindirectlyactivatedbycAMP(epac):AmultidomaincAMPmediatorintheregulationofdiversebiologicalfunctions[J].PharmacolRev，2013,65(2):670-709.[6]MatsudaM,Oh-HashiK,YokotaI,etal.Acquiredexchangeproteindirectlyactivatedbycyclicadenosinemonophosphateactivityinducedbyp38mitogen-activatedproteinkinaseinprimaryafferentneuronscontributestosustainingpostincisionalnociception[J].JAmChemSoc,2017,126(1):150-162.[7]McPheeI,GibsonLC,KewneyJ,etal.Cyclicnucleotidesignalling:AmolecularapproachtodrugdiscoveryforAlzheimer＇sdisease[J].BiochemSocT,2005,33(6):1330-1332.[8]ShariatiB,ThompsonL,NicolGD,etal.EpacactivationsensitizesratsensoryneuronsthroughactivationofRas[J].MolCellNeurosci,2016,70:54-67.[9]SelfAJ,CaronE,PatersonHF,etal.AnalysisofR-Rassignallingpathways[J].JCellSci,2001,114(7):1357-1366.[10]Ada-NguemaAS,XeniasH,SheetzMP,etal.ThesmallGTPaseR-RasregulatesorganizationofactinanddrivesmembraneprotrusionsthroughtheactivityofPLCepsilon[J].JCellSci,2006,119(7):1307-1319.[11]Lezoualc＇hF,FazalL,LaudetteM,etal.CyclicAMPsensorEPACproteinsandtheirroleincardiovascularfunctionanddisease[J].CircRes,2016,118(5):881-897.44 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二、在学期间科研成绩1、发表文章情况：（1）袁欢欢,李琳,徐凤霞,等.鸟嘌呤核苷酸转化因子交换蛋白1对大鼠糖尿病机械性疼痛的影响[J].中华内分泌代谢杂志,2018,(2):149-153.（2）袁欢欢,李琳,李全民.Epac1与神经性疼痛的研究进展[J].医学综述,2018(5).2、获奖情况：论文“鸟嘌呤核苷酸转化因子交换蛋白1对大鼠糖尿病机械性疼痛的影响”在2017年中华内分泌和糖尿病学分会学术年会暨2017“一带一路”内分泌和糖尿病学术论坛暨第三届京津冀内分泌和糖尿病学术论坛中进行大会交流，并评为二等奖。47 三、致谢我的硕士生涯已至谢幕时刻，回顾过去3年的学生生活，百感交集，苦辣酸甜集结于心头，但心中充盈最多的仍是感激。首先感谢我的恩师李全民教授，学位论文是在其殷切关怀和耐心指导下进行并完成的，衷心感谢我的恩师对我的淳淳教诲和悉心关怀。从课题的选择、项目的实施，直至论文的最终完成，李教授都始终给予我耐心的指导和支持，我取得的每一点成绩都凝聚着恩师的汗水和心血。恩师开阔的视野、严谨的治学态度、精益求精的工作作风，深深地感染和激励着我，在此谨向李教授致以衷心的感谢和崇高的敬意。感谢母校锦州医科大学对我的培养，严谨的学风、优美的校园环境使我的第一学期过的很充实和愉快。虽然只有短短的半年时光，但我确实学到了很多有用的知识，尤其是科研思想和方法。感谢实习基地火箭军总医院给了我一个宽阔的学习平台，让我不断吸取新知，充实自己。感谢北京师范大学动物房戴中心老师在动物饲养过程中给予的帮助与指导。感谢北师大韩生成教授课题组全体成员对实验技术的指导，特别在李逸豪博士孜孜不倦的教导下，我的科研水平有了很大的提高，受益颇多。感谢火箭军总医院内分泌科全体医护老师在实验过程中给予的帮助和支持。感谢各位老师在临床实习期间对我的谆谆教导，为我今后的临床工作奠定了基础。尤其感谢李琳老师在这篇论文构思和写作过程中提供的帮助，李老师对我的论文进行细心的修改，使得我的论文结构一步一步的完善，内容日趋丰满。特别感谢薛佩东老师对实验用品购买、样品储存方面给予的无私帮助。感谢3年以来与我朝夕相处、关心和帮助我的同学们，因为有他们的陪伴和支持，我的研究生生涯才能完满的结束。感谢家人对我常年的支持与鼓励，他们的默默奉献是我勇往直前的动力。衷心感谢所有曾经关心和鼓励过我的人，愿你们永远健康快乐。48 四、个人简历袁欢欢，河南平顶山人，1989年12月出生教育经历：2008.09-2011.06漯河医学高等专科学校大专2011.09-2014.06河南科技大学本科2015.09-2018.06锦州医科大学硕士实习经历：2013.07-2014.05洛阳市第三人民医院本科实习2016.02-2018.06火箭军总医院硕士实习工作经历：2014.07-2015.03平顶山市第五人民医院49 厚德修身精术济世
