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100例弥漫大B细胞淋巴瘤临床病理、分子遗传学改变及与预后相关性研究研究生王烨指导教师张巍教授学科专业名称病理学与病理生理学研究方向肿瘤病理2014年10月 CorrelationofmoleculargeneticalterationwithclinicalpathologyandprognosisofdiffuselargeBcelllymphomaof100casesＡDissertationSubmittedtoXinjiangMedicalUniversityInPartialFullfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofMedicineByWANGYePathologyandPathophysiologyDissertationSupervisor:ZHANGWeiProfessorOct,2014 中英文缩略词对照表英文缩写英文全名中文译名AnaplasticlargecellALCL间变性大细胞淋巴瘤lymphomaDAB3,3-diaminobenzidine3,3-二氨基联苯胺DEPCDiethylpyrocarboncate焦碳酸二乙酯DLBCLDiffuselargeBcell弥漫大B细胞淋巴瘤lymphomaEBEREpstein-BarrvirusEB病毒编码的RNAencodeRNAEBVEpstein-BarrvirusEB病毒FISHFluorescentinsitu荧光原位杂交hybridizationGCBGerminalcentreB生发中心B细胞样cell-likeIHCImmunohistochemistry免疫组织化学NHLNon-Hodgkinlymphoma非霍奇金淋巴瘤non-GCBnon-GerminalcentreB非生发中心B细胞样cell-like 目录摘要…………………………………………………………………………………1-2ABSTRACT………………………………………………………………………3-4前言…………………………………………………………………………………5-7内容与方法…………………………………………………………………………81.研究对象…………………………………………………………………82.研究内容及方法………………………………………………………92.1免疫组化实验………………………………………………………9-122.2EB病毒原位杂交…………………………………………………13-142.3荧光原位杂交…………………………………………………………15-172.4随访及统计学分析…………………………………………………182.4技术路线图…………………………………………………………19结果…………………………………………………………………………………20-31讨论…………………………………………………………………………………31-40小结…………………………………………………………………………………41致谢…………………………………………………………………………………42参考文献……………………………………………………………………………43-45附录…………………………………………………………………………………46-50综述…………………………………………………………………………………51-57攻读硕士学位期间发表的学位论文………………………………………………58个人简历……………………………………………………………………………59导师评阅表…………………………………………………………………………60 新疆医科大学硕士学位论文100例弥漫大B细胞淋巴瘤临床病理、分子遗传学改变及与预后相关性研究研究生：王烨导师：张巍教授/主任医师摘要目的：探讨100例弥漫大B细胞淋巴瘤临床病理改变及分子遗传学特征及其对预后的影响。以促进对DLBCL病理特征及分子遗传学改变的进一步认识，进而从分子水平了解DLBCL的发生、发展以及转归。方法：收集2007～2014年间由新疆医科大学第一附属医院收治经手术切除并由病理确诊的100例DLBCL病例。整理临床资料，参照2008版WHO造血与淋巴组织肿瘤分类诊断标准复查阅片。应用免疫组化（Envision二步法）观察CD3、CD5、CD10、CD20、CD23、CD34、CD43、Bcl-2、Bcl-6、MUM-1、CyclinD1、Ki-67的表达情况；应用原位杂交技术检测EBER；应用荧光原位杂交（FISH）技术检测100例DLBCL中BCL-2、BCL-6、C-myc基因的改变；结合临床病理资料进行统计分析，筛选影响100例DLBCL患者预后的危险因素。结果：本研究中DLBCL发病的高峰年龄为31～50岁，男性发病率略高于女性（男/女=1.27：1）；原发于淋巴结内患者59例。原发于结外器官的患者41例，其中以原发性中枢神经系统弥漫大B细胞淋巴瘤最为多见，为30例。临床分期中I-II期患者共49例，血清LDH水平升高27例，血清LDH水平（186.11±58.67）U/L；III-IV期患者共51例，血清LDH水平升高25例，血清LDH水平（287.19±177.63）U/L，III-IV期患者血清LDH水平显著高于I-II期患者（P＜0.05）。B症状患者血清LDH水平(311.43±213.83)U/L，A症状患者血清LDH水平(231.79±119.33)U/L，B症状患者血清LDH水平显著高于A症状患者，P=0.02。I-II期患者中血清β2-MG水平增高34例，β2-MG水平(1705.35±505.66)ug/L，III-IV期患者中血清β2-MG水平增高44例，β2-MG水平(3207.53±1067.33)ug/L，III-IV期β2-MG水平显著高于I-II期，P<0.05。B症状患者β2-MG水平(3133.52±1013.23)ug/L，A症状患者血清β2-MG(2055.31±955.67)ug/L，B症状患者β2-MG水平显著高于A症状患者，P<0.05。形态学以中心母细胞型为主（92/100）。100例患者中CD3阳性7例（7.00%）、CD10阳性11例（11.00%）、CD20阳性94例（94.00%）、CD34阳性79例（79.00%）、Bcl-2阳性55例（55.00%）、Bcl-6阳性89例（89.00%）、MUM-1阳性75例（75.00%）。CD10蛋白表达与ECOG评分相关（P=0.003）。免疫表型：生发中心起源19例，非1 新疆医科大学硕士学位论文生发中心起源81例。5例EBER阳性，其中1例为GCB，4例为non-GCB。仅ESR与免疫学表型之间差异具有统计学意义（P=0.017）。5例EBER阳性均为中心母细胞型。FISH检测：Bcl-2/IgH基因融合1例，BCL-2基因扩增7例。BCL-6基因重排8例。C-myc基因重排2例。单因素生存分析显示：血清LDH水平、原发肿瘤大小、IPI评分及治疗效果等因素的生存时间差异具有统计学意义（P＜0.05），多因素Cox分析结果显示：血清LDH水平、原发肿瘤大小及治疗效果是影响DLBCL患者预后的独立因素。结论：本研究显示DLBCL发病以男性多见，结内起病多见；血清LDH增高的患者预后较差。且血清LDH升高与AnnArbor临床分期相关；血清β2-MG水平与AnnArbor临床分期相关，但与预后无关；DLBCL的组织学亚型以中心母细胞型最常见；单因素生存分析显示：血清LDH水平、原发肿瘤大小、IPI评分及治疗效果等因素对预后的影响差异具有统计学意义（P＜0.05）。患者发病年龄、性别、民族、是否存在B症状、临床分期、ECOG评分、治疗方式、Bcl-2蛋白表达、Bcl-6蛋白表达及基因突变等因素的生存时间差异无统计学意义（P＞0.05）；Cox多因素分析显示：血清LDH水平、原发肿瘤大小及治疗效果是影响DLBCL患者预后的独立因素。关键词：弥漫大B细胞淋巴瘤，免疫表型，BCL-2基因，BCL-6基因，C-MYC基因，预后2 新疆医科大学硕士学位论文CorrelationofmoleculargeneticalterationwithclinicalpathologyandprognosisofdiffuselargeBcelllymphomaof100casesPostgraduate:WangYeSupervisor:Prof.ZhangWeiAbstractObjective:Tostudythehistopathologicalfeatures,diagnosisanddifferentialdiagnosesofDLBCLandtocorrelateclinicalprognosiswithpathologicparametersandimmunophenotypeswithanemphasisonBCL-2,BCL-6andC-MYCgeneabnormalitiesandtheirvaluesinpredictingthestatusofgenetranslocation.Methods:100caseswithpathologicallyconfirmeddiffuselargeBcelllymphomawereenrolledinthefirstAffiliatedHospitalofXinJiangMedicalUniversityfrom2007to2014.Pathologicaldiagnosisanddifferentialdiagnosiswasaccordingtothe2008WHOclassificationoftumorsofhaematopieticandlymphoidtissues.EnvisiontwomethodswasinvitedtodetecttheexpressionofCD3,CD5,CD10,CD20,CD23,CD34,CD43,Bcl-2,Bcl-6,MUM-1,CyclinD1andKi-67in100casesofDLBCL.InsituhybridizationwereusedfordetectionofEBERinallcases.Specimensfrom100DLBCLwerealsoanalyzedforBCL-6,BCL-2andC-mycgenerearrangementusinginterphasefluorescentinsituhybridization(FISH).StatisticalanalysiswasperformedusingtheSPSS17.0softwareanddifferenceswereconsideredsignificantwhenp<0.05.Results:DLBCLoccurredin31-50yearsold，andtheincidencerateismoreformenthanwomen．Thereare49patientsinI+IIstages，and51patientsinIII+IVstage.TheLDHlevelsandβ2-MGlevelsinIII+IVstagewereobviouslyhigherthanthatinI+IIstage，andtherewassignificantdifference(P<0.05).CD3,CD10,CD20,CD34,Bcl-2,Bcl-6andMUM-1werepositivein7.00%(7/100),11.00%(11/100),94.00%(94/100),79.00%(79/100),55.00%(55/100),89.00%(89/100),75.00%(75/100).AccordingtoHansalgorithmthereare19casesofGCBand81casesof3 新疆医科大学硕士学位论文non-GCB.ThedetectionofEBV:therewerefivecaseswerepositive,includingonecaseofGCB,fourcasesofnon-GCB.ThegeneticchangesofBCL-2,BCL-6andC-mycgeneswereexecutivedbyFISHincasesof100DLBCL.1caseofDLBCLexistthet(14;18).7casesexisttheBCL-2geneamplification.8casesexisttheBCL-6generearrangement.2casesexisttheC-mycgenerearrangement.Kaplan-Meieranalysisshowedthattherewasstatisticallysignificantdifferenceaccordingtothedifferentfactors,suchasLDHlevel,primarytumorsize,IPIscore(P＜0.05).CoxregressionanalysisshowedthatLDHlevel,IPIscorewereriskindicatorswhichcouldpredicttheprognosisofDLBCL.Conclusion:ThisstudyshowsthattheincidenceofDLBCLishigherinmalethanthatinfemale．nodalDLBCLismorefrequentthanExtra-nodalDLBCL.Themostcommonpathologicalsubtypeiscentroblastic.TheelevatedofserumLDHlevelcouldbeapoorprognosticfactorandassociatedwithclinicalstagesandtheβ2-MGlevelsmightbealsoassociatedwithclinicstage.Kaplan-Meieranalysisshowedthattherewasstatisticallysignificantdifferenceaccordingtothedifferentfactors,suchasLDHlevel,primarytumorsize,IPIscore(P＜0.05).CoxregressionanalysisshowedthatLDHlevel,IPIscorewereriskindicatorswhichcouldpredicttheprognosisofDLBCL.KeyWords:diffuselargeBcelllymphoma;immunophenotypes;EBER;BCL-2gene;BCL-6gene;C-mycgene;prognosis4 新疆医科大学硕士学位论文前言弥漫大B细胞淋巴瘤(DiffuselargeBcelllymphoma，DLBCL)是我国最常见的一种非霍奇金淋巴瘤，约占成人非霍奇金淋巴瘤发生率的30%-40%。DLBCL具有高度侵袭性、生长迅速并在临床表现、形态学特点、免疫学表型和分子遗传学特征等方面存在明显异质性。目前研究发现最具有可重复性和临床意义的患者生存预后评价指标是国际预后指数评分（InternationalPrognosticIndex,IPI），但IPI评分相同的患者预后仍存在较大差异性。随着分子生物学检测技术的快速发展和广泛运用,根据DLBCL全基因表达谱分析(GEP)的差异，将DLBCL分为生发中心B细胞样亚型（GCB），和与外周血活化B细胞亚型(ABC),以及第3型(type3，基因表达谱特点尚无法界定)；单因素生存分析显示：GCB亚型预后较好,而ABC亚型和type3型预后相似且明显低于GCB亚型,故将二者归为一类统称为非生发中心亚型(non-GCB)，二者五年生存率分别为76%和16%，生存分析显示患者的生存预后存在显著统计学差异，这种差异在不同IPI评分组间依然存在。全基因表达谱分析技术复杂、费用昂贵，从而限制了其在临床工作中的推广及应用。目前主要应用免疫组化法将DLBCL分成为GCB和non-GCB两种免疫表型。2004年Hans等用免疫组化法利用CD10、Bcl-6和MUM-1三种蛋白为标记物将DLBCL分成为GCB和non-GCB两种不同免疫学表型。其结果与GEP分型结果具有高度一致性，且操作简便易行，因此在临床工作中被广泛推广应用，但免疫学分型仍不能完全解释部分DLBCL患者在生存预后上的差异。在GCB亚型中约有30%的患者生存时间不足2年，在non-GCB亚型中约有20%的患者可获得长期带瘤生存。在预后相对较好的GCB亚型中仍有部分患者预后极差。这种异质性可能与肿瘤的生物学行为及分子遗传学改变密切相关。由于分子生物学和分子遗传学检测手段的日益更新，越来越多的淋巴造血系统肿瘤发现了其特定的分子生物学和分子遗传学改变，这些特征性的染色体改变解释了部分淋巴造血系统肿瘤的分子发生机制，甚至在部分实验室将其直接用于淋巴造血系统肿瘤的诊断、鉴别诊断、预后分析及分子靶向治疗。约50%的DLBCL患者中可检测到染色体异常。染色体异常中最常见的是t（3；14）（q27；q32），t（14；18）（q32；q21）和t（8；14）（q24；q32），分别涉及到BCL-6、BCL-2和C-myc基因。部分患者也可能同时存在有免疫球蛋白重链（H链）、轻链（L链）基因重排和（或）可变区（V区）的基因突变。这些染色体的易位多数可引起基因融合和（或）基因断裂重排。染色体易位所涉及的绝大多数基因可表达细胞内凋亡途径和（或）肿瘤增殖信号途径中的关键信号分子，其表达异常可能与DLBCL的分子发生机制密切相关。5 新疆医科大学硕士学位论文对DLBCL患者进行染色体改变的检测，极大的提高了对这种疾病的认识，对探究DLBCL的分子发生机制、病因、分类、诊断、鉴别诊断、和预后判断均有重要现实意义。BCL-2基因异常主要是由于染色体发生易位从而导致位于第18号染色体长臂上的BCL-2基因从第18号染色体上断裂后插入到第14号染色体长臂的IgH基因位点，从而使BCL-2基因转录活性增强，Bcl-2蛋白异常表达。其与DLBCL的发生及演变有密切关系。t（14；18）（q32；q21）染色体异常在滤泡细胞性淋巴瘤（FL）中研究较多。但这并不是滤泡细胞性淋巴瘤所特有的染色体异常，约20%-30%的DLBCL中也存在t（14；18）（q32；q21）染色体断裂重排。目前，国内检测BCL-2/IgH基因融合及BCL-2基因扩增多采用PCR法，但此方法仅适用于断裂点位于染色体特定位置的基因重排检测，因此常存在有漏诊现象。虽然PCR法灵敏度较高，但易受到环境中各种因素的影响从而产生假阳性和（或）假阴性实验结果。导致其在临床应用受限。荧光原位杂交（FISH）技术操作简便易行、灵敏度和特异性均高于PCR技术。因此，被视为诊断的“金标准”。关于t（14；18）（q32；q21）染色体易位及BCL-2基因扩增对患者生存预后的影响尚存在争议，YuKo等研究认为t（14；18）（q32；q21）染色体易位及BCL-2基因扩增与否与患者的总生存率、无病生存率均无关。而Yoon等认为t（14；18）（q32；q21）染色体易位及BCL-2基因扩增患者对常规化疗治疗反应性差，患者易产生原发耐药，与患者的生存预后密切相关。t（14；18）（q32；q21）染色体易位已经广泛用于滤泡细胞性淋巴瘤的诊断、鉴别诊断及临床治疗中。但（t14；18）（q32；q21）染色体易位及BCL-2基因扩增在DLBCL的分类、诊断、鉴别诊断、临床治疗及预后判断等方面仍存在争议。1993年YeBH，RaoPH等在研究NHL时克隆得到了一抑制性原癌基因，其基因位于染色体的3q27。将克隆得到的3q27断裂点附近的基因序列与t（14；18）（q27；q32）断裂点附近的基因序列比对后发现二者具有同源性，并将这种抑制性原癌基因命名为BCL-6。在DLBCL中可存在30%-40%的BCL-6基因断裂重排，从而引起人们关注BCL-6基因在DLBCL中的致病作用。引发BCL-6基因断裂重排的原因以及其在不同DLBCL亚型中的分布、临床意义及对患者预后的影响有待于进一步研究，能否能将BCL-6基因断裂重排作为影响DLBCL患者生存预后的判断指标仍存在争议。C-myc基因断裂重排是Burkitt淋巴瘤标志性的分子遗传学改变，约80％-90％的Burkitt淋巴瘤病例中存在t(8；14)染色体易位，但这并不是Burkitt淋巴瘤所特有分子遗传学改变，约10％左右DLBCL病例中也存在C-myc基因断裂重排。国外相关研究报道生发中心与非生发中心起源的DLBCL均可有C-myc基因易位但生发中心来源者发生率更高，病人的生存预后与未发生C-myc基因易位者相比通常较差。t(8；14)易位的DLBCL患者中更易出现于有结外器官侵犯和临床高侵袭性的肿瘤生物学行为。6 新疆医科大学硕士学位论文C-myc基因断裂重排在DLBCL病例中发生率较低，是否能用其他相关临床指标和免疫组化抗体进行标记，选择性进行C-myc基因断裂重排检测即可节省患者的住院费用又可指导临床治疗和预后判断而这些仍需要大量深入研究。本研究中以我院DLBCL患者病理存档蜡块为研究基础，进行临床资料分析、免疫组化染色、EB原位杂交、FISH检测BCL-2、BCL-6、C-myc基因改变。以期望通过上述研究寻找适合新疆地区DLBCL患者有效的预后及疗效评价指标，为指导临床开展分子靶向治疗和预后判断提供理论依据。7 新疆医科大学硕士学位论文研究内容与方法1研究对象收集2007年3月至2014年7月间由新疆医科大学第一附属医院手术切除并经病理确诊的具有完整临床及病理资料的100例弥漫大B细胞淋巴瘤患者的相关资料。获取每位患者的发病年龄、性别、族别、行为状态评分（PS评分）、AnnArbor临床分期、病理确诊时间、肿瘤原发部位、原发肿瘤大小、是否存在B症状（无感染原因但持续性发热且体温＞38℃、并持续3天以上；6个月以内体重减轻10%以上；盗汗）、血清乳酸脱氢酶（LDH）含量、血清β2微球蛋白含量、红细胞沉降速率（ESR）、国际预后指数评分（IPI评分）、骨髓穿刺涂片结果、颈胸腹盆腔CT和（或）MRI检查结果、结外受累部位、治疗方式、复发及转移等相关临床资料。建立数据库，并收集相应患者的存档病理蜡块。1.1纳入及排除标准1、2007年3月-2014年7月间由新疆医科大学第一附属医院收治并经手术切除，经病理学明确诊断的弥漫大B细胞淋巴瘤患者；2、具有完整的可系统性追溯的临床及病理学资料；3、原发性中枢神经系统弥漫大B细胞淋巴瘤患者均以中枢神经系统受累为首发症状，病变均局限于中枢神经系统，外周血常规检查及骨髓穿刺活检均未发现白血病征象，影像学检查排除其它部位（纵隔、后腹膜等部位）淋巴瘤转移至中枢神经系统。患者人类免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus,HIV）抗体均为阴性且既往无其他恶性肿瘤病史、自身免疫性疾病及器官移植病史，病理形态学及免疫组化染色确诊为原发性中枢神经系统弥漫大B细胞淋巴瘤。4、排除由其他低度恶性淋巴瘤/白血病转变成的DLBCL，如：滤泡性淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、慢性B淋巴细胞白血病及某些霍奇金淋巴瘤等。2研究方法2.1石蜡切片的制作及切片复习新鲜组织经10%中性福尔马林溶液充分固定（必要时切开固定），自动脱水机脱水，常规石蜡包埋，4μm厚连续切片，行HE染色。由2位高年资病理诊断医师复查阅片，部分疑难病例行免疫组织化学染色，依据2008版WHO《淋巴造血系统肿瘤病理学和遗传学》诊断标准进行病理诊断及组织学分型。并挑选典型切片所对应蜡块，重新切片并裱褙于防脱胶片上于4℃冰箱中保存备用。2.2免疫组织化学染色（IHC）2.2.1免疫组化原理免疫组织化学染色是应用免疫学中抗原与抗体特异性结合的原理，并通过化学8 新疆医科大学硕士学位论文反应使预先标记抗体的显色剂（如：酶、荧光素、金属离子、放射性同位素等）显色，并借助相应成像设备（如：普通光学显微镜、荧光显微镜、电子显微镜）的成像及放大作用，从而确定待检测细胞或组织中相应抗原（如：多肽、蛋白质、激素、糖类），并对其进行定性、定位及定量分析的一种研究方法。2.2.2免疫组化检测所用试剂1、抗体:本研究中免疫组织化学实验所用抗体的详细信息见表2.1。表2.1免疫组化所用抗体来源及工作浓度Table2.1Primaryantibodiesandconditionsofuseinthisexperiment抗体类型来源克隆号表达部位购买公司稀释度上海长岛生物技CD3单克隆鼠抗人UCHT1细胞膜1：50术有限公司CD5单克隆兔抗人SP19细胞膜北京中杉金桥生1：100物技术有限公司CD10单克隆鼠抗人56C6细胞膜基因科技（上海）1：50有限公司CD20单克隆鼠抗人L26细胞膜Dako公司1：150CD23单克隆鼠抗人1B12细胞膜上海长岛生物技1：50术有限公司CD34单克隆鼠抗人QBEnd/10细胞膜和细胞浆福州迈新生物技工作液术开发有限公司CD43单克隆鼠抗人DF-T1细胞膜或细胞浆北京中杉金桥生1：200物技术有限公司Bcl-2单克隆鼠抗人100/D5细胞膜上海长岛生物技1：100术有限公司Bcl-6单克隆GI191E/A北京中杉金桥生鼠抗人细胞核1：808物技术有限公司福州迈新生物技MUM-1单克隆鼠抗人MUM1p细胞核工作液术开发有限公司基因科技（上海）CyclinD1单克隆兔抗人SP4细胞核1：100有限公司基因科技（上海）Ki-67单克隆鼠抗人MIB-1细胞核1：150有限公司9 新疆医科大学硕士学位论文2、主要试剂及配置方法(1)Envision试剂(二抗及显色剂)：购自上海基因科技有限公司。(2)PBS缓冲液：将PBS磷酸盐缓冲液(粉剂)充分溶解于5000ml蒸馏水，定容后并配置成0.01mol/l的PBS缓冲溶液，并调节PH值为7.4。(3)0.01mol/l枸橼酸盐缓冲液（PH6.0）：将0.1mol/l枸橼酸溶液18ml，0.1mol/l枸橼酸钠溶液82ml及900ml蒸馏水充分混匀，并调节PH值为6.0。(4)0.001mol/lEDTA缓冲液（PH9.0）：将6.06gTris和0.30gEDTA充分溶解于蒸馏水中定容至1000ml，并调节PH值为9.0。(5)DAB显色液：20ulDAB浓缩液加入1000ulDAB稀释液（使用前新鲜配置，注意避光）。(6)3%过氧化氢溶液：450ml无水乙醇中加入50mlH2O2（使用前新鲜配置）。(7)苏木素染色液：上海生化试剂厂。(8)盐酸酒精溶液：上海生化试剂厂。2.2.3免疫组化检测所需主要仪器BX51普通光学显微镜（日本OLYMPUS）TPJ-438组织切片摊片机（德国徕卡Leica）KPJ-436组织切片烤片机（德国徕卡Leica）RM2235石蜡轮转切片机（德国徕卡Leica）PTX-DHA-35X40恒温电烤箱（上海跃进）TG-TY45A电饭煲（每时乐）ME-403E电子天平（赛多利斯）Milli-QIntegral-15超纯水制备系统（美国密立博）Eppendorf单道微量移液器免疫组化染色孵育盒、量筒、镊子、量杯、立式染色缸、耐高温塑料切片架2.2.4免疫组化检测所需主要耗材一次性刀片（德国徕卡Leica）载玻片盖玻片移液器吸头2.2.5Envision二步法免疫组化染色实验步骤防脱胶片的制备：将清洁载玻片放入用蒸馏水按1:20比例稀释的Poly-L-Lysine溶液中浸泡20分钟，取出后于37℃恒温电烤箱中烘烤过夜，装盒备用。应用免疫组织化学EnVison二步法检测上述各项指标，具体操作步骤如下：(1)10%中性福尔马林溶液充分固定组织、常规石蜡包埋、4μm厚连续切片，将10 新疆医科大学硕士学位论文蜡膜置于50℃的水中漂浮展开后裱褙于涂有Poly-L-Lysine的载玻片上，于37℃恒温电烤箱中烘烤过夜。(2)新鲜二甲苯脱蜡（三缸二甲苯各15分钟）→无水乙醇1分钟→于室温下3%过氧化氢溶液阻断内源性过氧化物酶15分钟→梯度乙醇水化（100%乙醇→95%乙醇→80%乙醇→75%乙醇各1分钟）→自来水冲洗，蒸馏水冲洗。(3)抗原修复:CD3、CD20、CD34采用0.01mol/l枸橼酸缓冲液（PH6.0）水浴加热修复，其余抗体采用EDTA缓冲液（PH9.0）水浴加热修复。为了使抗原位点得以充分暴露，将切片分别置于盛有相应缓冲液的抗原修复盒中煮沸30分钟，取出后自然冷却至室温，用蒸馏水冲洗3次，PBS缓冲液冲洗3次，每次3分钟，每次间隔2分钟。(4)按相应比例稀释抗体，配制一抗。用无绒纸巾吸干切片周围多余液体，用免疫组化画圈笔沿组织周围画圈标记，放入免疫组化染色孵育盒内，根据组织大小，将配制好的一抗（50-100ul）滴加于组织上（充分覆盖组织），于37℃恒温电烤箱中孵育60分钟。(5)取出切片，PBS缓冲液漂洗3次，每次3分钟。(6)甩干切片，放入孵育盒，滴加二抗，每张切片50-100ul，于37℃恒温电烤箱中孵育30分钟。(7)取出切片，PBS缓冲液漂洗3次，每次3分钟。(8)甩干切片，放入孵育盒内。DAB显色，暗处孵育，镜下控制显色程度，将显色后的切片立即放入自来水冲洗以终止显色。(9)复染：将切片浸泡于苏木素染液中染色2-3分钟，自来水冲洗以终止染色，然后将切片浸泡于1%盐酸酒精溶液中分化半分钟，自来水冲洗，随后将切片浸泡于热水或0.1%氨水中返蓝1分钟。(10)梯度酒精脱水（75%酒精→80%酒精→95%酒精→100%酒精→100%酒精各3分钟），二甲苯透明，中性树胶封片，镜检。2.2.6结果判读以已知相应抗体阳性的淋巴瘤组织作为阳性对照，以0.01mol/l（PH7.4）的PBS缓冲溶液代替一抗作阴性对照。CD3、CD5、CD10、CD20、CD23、Bcl-2阳性定位于细胞膜，Bcl-6、MUM-1、CyclinD1、Ki-67阳性定位于细胞核，CD34阳性定位于细胞膜和细胞浆，CD43定位于细胞膜或细胞浆。在光学显微镜下，随机选取10个高倍镜视野（HPFs×400），计数500个肿瘤细胞（肿瘤组织出血坏死区及与正常组织交界区不作为计数视野）。参照免疫组化反应评分（Immunoreactivescore，IRS）【12】推荐标准，阳性细胞染色强度分为四级：阴性（无着色）记为0分，弱阳性（着色弱）记为1分，中度阳性（着色适中）记为2分，强阳性（着色强）记为3分。11 新疆医科大学硕士学位论文阳性细胞占观察视野细胞总数百分比分为四级：阳性细胞≤10%记为0分，11%-25%记为1分，26%-50%记为2分，≥51%记为3分。以二者的乘积判断阳性程度，依次分为四个等级：0分记为（﹣），1-3分记为（+），4-6分记为（++），7-9分记为（+++）。2.2.7免疫学分型依据CD10、Bcl-6和MUM-1三种蛋白在肿瘤组织中的表达及分布情况将DLBCL【12】分成GCB和non-GCB两种免疫学表型，采用Hans等推荐的分型标准（图2.1），CD10及Bcl-6蛋白为生发中心起源B细胞的标记物。若肿瘤组织中CD10阳性则判断为GCB型。若肿瘤组织中CD10和Bcl-6蛋白均为阴性则判断为non-GCB型。MUM-1表达于B淋巴细胞发育分化的终末期及浆细胞发育分化的早期阶段，作为后生发中心细胞（即活化细胞）起源的重要标记物。若肿瘤组织中CD10阴性而Bcl-6阳性，则依靠MUM-1蛋白决定免疫学分型：若MUM-1阳性则为non-GCB型，MUM-1阴性则为GCB型。图2.1DLBCL免疫表型分类Fig2.1TheimmunophenotypeofDLBCL2.3原位杂交检测EBER2.3.1原位杂交原理EBERs（Epstein-BarrencodedRNAs)为Epstein-Barr病毒编码的小mRNA，是EB病毒在宿主细胞核内复制和表达的终末产物，在病毒感染的细胞核中以高拷贝数存在，根据EBERs特有的碱基序列设计的EBER单链RNA探针能特异性的与EBER靶序列互补杂交。从而能检测EB病毒是否感染。此方法适用范围广泛。操作间变且具有较高的特异性和灵敏度。是目前检测EBER最好的方法。12 新疆医科大学硕士学位论文2.3.2原位杂交实验所需实验仪器及试剂1、实验仪器OLYMPUS-BX51普通光学显微镜（日本OLYMPUS）S2451型原位杂交仪（DAKO公司）UB-7型电子PH计（美国丹佛）TPJ-438组织切片摊片机（德国徕卡Leica）KPJ-436组织切片烤片机（德国徕卡Leica）RM2235石蜡轮转切片机（德国徕卡Leica）PTX-DHA-35X40恒温电烤箱（上海跃进）Eppendorf单道微量移液器2、实验试剂胃酶1g北京中杉金桥胃酶稀释液（1NHcl溶液）15ml北京中杉金桥地高辛标记的EBER探针0.8ml北京中杉金桥HRP标记地高辛抗体15ml北京中杉金桥DAB稀释液20ml北京中杉金桥DAB浓缩液(20×)1ml北京中杉金桥PBS缓冲液100ml×5袋北京中杉金桥Tween-202ml北京中杉金桥3、原位杂交所需溶液的配制：胃酶浓缩液：将1g胃酶中加入4毫升的去离子水，于脱色摇床上充分振荡溶解后根据使用量进行分装，于-20℃低温冻存。胃酶稀释液：将1NHcl用去离子水10倍稀释，即配制成0.1NHcl溶液。PBS缓冲液：将一袋PBS粉剂充分溶解于1000毫升去离子水中，待其彻底溶解后加入少量的Tween-20溶液。混匀后备用。DAB工作液的配制：在1毫升DAB稀释液中加入20微升DAB浓缩液，现用现配。胃酶消化工作液的配制：将上述已经分装好的胃酶浓缩液用已稀释至0.1NHcl溶液100倍稀释，混匀后备用。2.3.3原位杂交实验步骤1、样品的收集及预处理实验操作前，准备好必备的实验试剂及仪器。实验所用物品都需经0.1%DEPC溶液灭活RNA酶。（1）10%中性福尔马林溶液充分固定组织12小时（必要时切开固定），常规石13 新疆医科大学硕士学位论文蜡包埋，4µm厚连续切片。（2）将蜡膜置于50℃的水中漂浮展开，并将其裱褙于涂有Poly-L-Lysine的载玻片上。置于72℃烤片机上烤片2小时，备用。（3）将切片完全浸泡于新鲜配置的二甲苯溶液中于室温下脱蜡3次，每次15分钟，期间提洗数次。（4）脱蜡后的切片在新鲜无水乙醇溶液中放置10分钟，取出后，放于空气中自然干燥3-5分钟。2、酶处理（1）3%过氧化氢溶液于室温下孵育15-30分钟，以充分阻断组织中的内源性过氧化物酶，从而降低非特异性背景着色。（2）将实验组和对照组的切片置于37℃DAKO杂交仪中，于每张切片上滴加300-400µl新鲜配制的胃酶工作液并孵育30分钟。（3）弃去胃酶工作液，梯度酒精脱水，室温下彻底干燥。3、杂交程序（1）充分混匀探针溶液，于每张切片上滴加15-20µl地高辛标记的EBER-RNA探针，并加盖硅化盖玻片，橡胶水泥封片，于DAKO杂交仪中37℃杂交16-18小时。（2）漂洗：撕去硅化盖玻片四周的橡胶水泥后将切片完全浸泡在PBS缓冲液中，直至盖玻片自然脱落，并用PBS缓冲液冲洗切片3分钟，重复操作3次。并用无绒纸巾将切片周边多余液体吸干。4、显色与检测程序（1）于每张切片上滴加20-30µl辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗地高辛抗体，于DAKO杂交仪中37℃孵育30分钟，PBS缓冲液冲洗3分钟×3次。用去离子水冲洗切片3分钟×3次。（2）用清洁无绒纸巾吸干切片周边多余液体，于每张切片上滴加20-30µl新配置的DAB显色液。显色5-10分钟。暗处孵育，镜下控制显色，一旦显色，立即用去离子水冲洗切片，以便终止显色。5、复染苏木精复染，自来水冲洗终止染色，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片、镜检。2.3.4结果判读以已知EBER阳性的NK/T细胞淋巴瘤组织为阳性对照，以0.01mol/l（PH7.4）的PBS缓冲溶液代替地高辛标记的EBER-RNA探针为空白对照。实验组切片中，首先在低倍镜下找到阳性部位，观察阳性部位是否定位于被病毒感染的细胞核内并染成棕黄色。14 新疆医科大学硕士学位论文2.4荧光原位杂交检测（FISH）2.4.1荧光原位杂交原理荧光原位杂交的基本原理是基于DNA分子双链结构中的碱基互补配对原理。设计一个与靶DNA分子同源并存在碱基互补序列的特异性核酸探针，二者在适宜条件下经过热变性-退火-复性形成杂化双链的过程，即可形成靶DNA分子与特异性核酸探针的杂化双链复合物。在特异性核酸探针上标记有某些信号分子如地高辛、生物素等。其能与荧光素标记的特异性亲和素发生化学反应并牢固结合，使用带有相应滤光片的荧光显微镜便能直接观察特异性探针和细胞内靶DNA分子的杂交情况，并可对其进行定性、定量和定位分析。2.4.2荧光原位杂交检测所用试剂FISH检测所用探针：LSIMYC双色断裂分离探针（探针编号：30-191096）LSIBcl-6双色断裂重排探针（探针编号：30-231050）LSIBcl-2/IgH双色双融合易位探针（探针编号：30-191018）所用探针均购自AbbottMolecularLnc。FISH检测辅助试剂：ParaffinPretreatmentkitII试剂盒（内含预处理液、胃蛋白酶、胃蛋白酶缓冲液）购自AbbottMolecularLncNP-40购自AbbottMolecularLnc20×SSC购自AbbottMolecularLnc4，6-二联脒-2-吲哚苯（DAPI）购自AbbottMolecularLnc橡胶水泥购自AbbottMolecularLnc2.4.3荧光原位杂交检测所用主要仪器OLYMPUS-BX51普通光学显微镜（日本奥林巴斯）DK-8D型电热恒温水槽（上海一恒科技有限公司）S2451型原位杂交仪（DAKO公司）Leica烤片机（德国徕卡）UB-7型电子PH计（美国丹佛）图像采集分析系统FISH2.0（俄罗斯Vido-Test）Milli-QIntegral-15超纯水制备系统（美国密立博）量筒、烧杯、镊子、立式染色缸2.4.4荧光原位杂交实验步骤样本玻片的制备15 新疆医科大学硕士学位论文（1）10%中性福尔马林溶液充分固定组织（必要时切开固定），常规石蜡包埋，3µm厚连续切片。（2）将蜡膜置于50℃的水中漂浮展开，将其裱褙于涂有Poly-L-Lysine的载玻片上。将切片置于56℃恒温电烤箱中烘烤过夜，老化玻片。切片脱蜡（1）将组织切片完全浸泡于新鲜二甲苯溶液中于室温下脱蜡3次，每次20分钟，期间提洗数次以便充分脱蜡。（2）将脱蜡后的切片于梯度乙醇溶液（70%乙醇→85%乙醇→100%乙醇溶液）中放置10分钟，取出后，置于空气中于室温下自然干燥。切片预处理（1）将组织切片浸泡在80℃预处理液中水浴处理20分钟。（2）取出切片并置于蒸馏水中漂洗3分钟。（3）配制胃蛋白酶消化液，将分装好的胃蛋白酶溶解于胃蛋白酶缓冲液中并放置于脱色摇床上充分振荡混匀。（4）用清洁无绒纸巾吸干切片周围多余的液体（避免损伤组织），将组织切片完全浸泡于胃蛋白酶消化液中于37℃水浴中消化15-20分钟（镜下控制消化程度）。（5）取出切片并将其置于蒸馏水中漂洗3分钟。取出切片后于室温下自然干燥。杂交过程（1）探针混合液的配制：将探针原液，相应探针缓冲液及去离子水按照1：7：2的比例于暗室中配制后于涡旋仪上涡旋混匀，于Mini离心机上短暂离心后备用。（2）根据HE切片中肿瘤组织的分布情况，在载玻片上用钻石笔画出杂交区域，并滴加5-10µl探针混合液，立即加盖硅化盖玻片（避免产生气泡），橡胶水泥封片，置于DakoHydridizer原位杂交仪中于75℃变性5min，37℃杂交≥18小时。杂交后洗涤（1）从杂交仪中取出切片后，用镊子撕去盖玻片四周的橡胶水泥。（2）将切片置于盛放有杂交后洗涤液（2×SSC/0.3%NP-40溶液）的立式染色缸中于室温下充分浸泡，直至盖玻片自然脱落。（3）在立式染色缸内加入杂交后洗涤液（2×SSC/0.3%NP-40溶液），放入恒温水浴锅内水浴加热至缸内洗液温度达到72±1℃。（4）将载玻片完全浸泡在72±1℃杂交后洗涤液内水浴洗涤2分钟。（5）取出载玻片后于暗室内自然晾干。（6）在每张切片的杂交区域内滴加5-10µlDAPI复染液，加盖盖玻片后于-20℃冰箱中冻存30分钟以上后可在安装有相应滤光片的荧光显微镜下观察实验结果。2.4.5结果判读16 新疆医科大学硕士学位论文BCL-6基因断裂重排实验结果判读LSIBCL-6双色断裂重排探针是在BCL-6基因（BCL-6基因定位于3q27）的5’端方向349kb用SpectrumOrange标以橙色荧光，3’端方向600kb用SpectrumGreen标以绿色荧光；正常有丝分裂分裂间期细胞核中显示为2个融合信号（橙色和绿色荧光信号叠加形成黄色荧光信号或橙色和绿色荧光信号紧密相连，其间距小于1个荧光信号点）其分别代表一对等位基因，当发生3q27染色体断裂重排时，BCL-6基因中1对等位基因的5’和3’端分离，橙色和绿色荧光信号分开，另外一对等位基因未分离。即表现为一个橙色荧光信号、一个绿色荧光信号和一个融合信号。当2对等位基因均发生断裂重排时，则表现为2个橙色荧光信号和2个绿色荧光信号。计数200个肿瘤细胞，当有超过20%的肿瘤细胞核出现上述信号改变时，即判读为【18-21】BCL-6基因断裂重排。BCL-2/IgH基因易位融合及扩增实验结果判读LSIBcl-2/IgH双色双融合易位探针是由两部分组成，一部分为BCL-2基因位点特异性荧光探针，BCL-2基因位于18q31，长度为750kb用SpectrumOrange标记为橙色荧光；IgH基因位于14q32，其5’端方向长度为1.5Mb基因位点特异性荧光探针用SpectrumGreen标记为绿色荧光。正常有丝分裂分裂间期细胞核信号表现为2个分离的橙色及2个分离的绿色荧光信号；当发生t（14；18）时，分裂间期细胞核FISH信号表现一个橙色信号，一个绿色信号及两个融合信号（橙色和绿色荧光信号叠加形成黄色荧光信号或橙色和绿色荧光信号紧密相连，其间距小于1个荧光信号点）。当分裂间期细胞核内出现≥3个橙色荧光信号时则判断为BCL-2基因所在的染色体区段发生扩增。计数200个肿瘤细胞，当有超过20%的肿瘤细胞核出现上述信号改变时，即判读为BCL-2/IgH基因易位融合及BCL-2基因所在染色体区段发生基【18-21】因扩增。C-MYC基因断裂重排实验结果判读LSIMYC双色断裂分离探针是由两部分组成，一部分结合在8号染色体MYC基因5’端方向的260kb用SpectrumOrange标记为橙色荧光；另一部分结合在MYC基因3’端方向的400kb用SpectrumGreen标记为绿色荧光。正常有丝分裂分裂间期细胞核内表现为2个融合信号（橙色和绿色荧光信号叠加形成黄色荧光信号或橙色和绿色荧光信号紧密相连，其间距小于1个荧光信号点）。当存在C-MYC基因断裂重排时，分裂间期细胞核内FISH信号表现为2个橙色信号和2个绿色信号或一个橙色信号，一个绿色信号及一个融合信号。计数200个肿瘤细胞，当有超过20%的肿【18-21】瘤细胞核出现上述信号改变时，即判读为C-MYC基因断裂重排。2.5随访100例弥漫大B细胞淋巴瘤患者，对于有条件的患者根据其住院复查情况了解17 新疆医科大学硕士学位论文患者预后，其余患者采用电话、门诊或书信随访。随访内容包括：了解患者治疗后病情是否稳定、有无肿瘤的复发及转移、患者体能状态评分（PS评分）、血清LDH水平、CT/MRI检查结果及骨髓穿刺活检结果等。总生存期（OverallSurvival）定义为自患者病理确诊之日起到患者死亡或随访终止的时间（以月计算）。与本病无关的死亡算为截尾。随访终止于2014年8月31日。对于确诊后更换电话号码或住址的患者及在不同时段内电话随访三次均无应答者视为失访。2.6统计学分析应用SPSS17.0统计学软件进行统计学分析。组间率的比较采用卡方检验或Fisher精确概率法（当n＜40时，采用Fisher精确概率法），检验水准α=0.05；影响患者预后的单因素生存分析采用Kaplan-Meier法并描绘生存曲线、计算生存时间及生存率，应用Log-Rank检验进行组间差异显著性检验。对单因素分析结果中生存率差异具有统计学意义的预后影响因素纳入多因素Cox分险比例回归模型，筛选影响预后的独立危险因素。建立Cox回归方程。P＜0.05为差异具有统计学意义。18 新疆医科大学硕士学位论文技术路线图收集具有完整临床资料的弥漫大B细胞淋巴瘤100例免疫分型组织学分型GCB型ABC型免疫组化技术检测CD3,原位杂交技术检测不同FISH技术检测CD10,CD20,Bcl-2,分型DLBCL中EBER表BCL2/BCL6/C-MYBcl-6,MUM-1,Ki-67达C基因突变情况年龄功能状态不同免疫分型和组织学亚血清乳酸脱氢酶水平型之间的关系累及淋巴结外部位的数量肿瘤临床分期统计学分析19 新疆医科大学硕士学位论文结果1临床病理资料1.1发病年龄、性别及民族100例DLBCL患者中男性56例（56.00%），女性44例（44.00%），男/女=1.27：1。年龄分布为5-83岁，平均年龄52.40±12.90岁，中位年龄53.50岁。发病集中分布在31-50岁之间（38例，38.00%）(见图3.1)。汉族62例（62.00%），维吾尔族27例（27.00%），其他少数民族11例（11.00%，其中回族6例、哈萨克族2例、东乡族、满族、塔塔尔族各1例）。图3.1患者的年龄分布图Fig.3.1Theagegroupsof100casesofDLBCL1.2发病部位及首发症状100例DLBCL患者中，59例（59.00%）患者原发于淋巴结，41例（41.00%）患者原发淋巴结以外，二者之比为1.44：1。（见表3.1）。结内病变以颈部淋巴结受累（34/100）最为常见，其次是腹股沟淋巴结受累（18/100）。原发结外DLBCL以原发性中枢神经系统弥漫大B细胞淋巴瘤（30/100）最为常见，其次是原发胃肠道DLBCL（见表3.1）。30例原发性中枢神经系统弥漫大B细胞淋巴瘤中肿瘤位于幕上23例（76.67%），肿瘤位于幕下5例（16.67%），颅内多发病灶2例（6.67%）。其中幕上肿瘤主要位于颞叶区6例（26.10%），幕下肿瘤主要位于小脑半球4例（80.00%）。进展期DLBCL患者中有≥2处结外器官受累者6例（6.00%），其中3例患者肿瘤累及肺，2例患者肿瘤累及脾脏，1例患者肿瘤累及肋骨和睾丸。患者的首发症状因DLBCL的发病部位不同而异。59例结内DLBCL患者的首发症状详见表3.2。41例结外DLBCL患者的首发症状详见表3.3。以全身表现为首发20 新疆医科大学硕士学位论文症状46例，表现为发热21例（45.65%），盗汗7例（15.21%），消瘦18例（39.13%）。表3.1100例DLBCL肿瘤原发部位及例数Table3.1Theprimarylocationof100casesofDLBCL原发部位例数（个）原发部位例数（个）颈部淋巴结34扁桃体1腹股沟淋巴结18肾脏1颌下淋巴结2睾丸1腋窝淋巴结3纵隔1腹腔淋巴结2骨1胃肠道3中枢神经系统胰腺1幕上23腮腺1幕下51鼻咽部颅内多发2表3.259例结内DLBCL患者的首发症状Table3.2Theprimarysymptomof59casesofDLBCL肿瘤原发部位首发症状例数浅表淋巴结淋巴结肿大50（87.71%）（57例）乏力、体重下降4（8.00%)皮肤瘙痒3(6.00%)腹腔淋巴结腹部包块1(50.00%)（2例）腹痛、腹胀1(50.00%)21 新疆医科大学硕士学位论文表3.341例结外DLBCL患者的首发症状Table3.3Theprimarysymptomof41casesofDLBCL肿瘤原发部位首发症状例数中枢神经系统头痛、头晕、恶24（80.00%）（30例）心、呕吐口角歪斜、言语2（6.67%）不清行为异常1(3.34%)单侧肢体运动障1(3.34%)碍视力下降2（6.67%）鼻腔、Walderyer咽痛、吞咽困难1(50.00%)环（2例）鼻塞、肿块1(50.00%)纵隔（1例）胸闷、气短1(100.00%)腮腺（1例）腮腺区包块1(100.00%)消化系统（4例）腹胀、早饱感3（75.00%）纳差、乏力1（25.00%）泌尿系统（1例）肾脏包块1(100.00%)生殖系统（1例）睾丸进行性肿大1(100.00%)骨骼及软组织（1关节区疼痛1(100.00%)例）1.3AnnArbor临床分期根据AnnArbor临床分期，100例DLBCL患者中，I期29例，II期17例，III期17例，IV期34例。A症状51例，B症状46例（表3.4）。22 新疆医科大学硕士学位论文3.4100例DLBCL临床分期及全身症状Table3.4Theclinicalstagesof100casesofDLBCLI期II期III期IV期A症状B症状男性18139192927女性1178152219合计2920173451461.4血清乳酸脱氢酶水平(1acticdehydrogenate，LDH)I-II期患者共49例，血清LDH水平升高27例，占58.69%，血清LDH水平（186.11±58.67）U/L，中位值181U/L；III-IV期患者共51例，血清LDH水平升高25例，占49.01%，血清LDH水平（287.19±177.63）U/L，中位值237U/L；III-IV期患者血清LDH水平显著高于I-II期患者（P＜0.05）。B症状患者血清LDH水平(311.43±213.83)U/L，中位值256U/L，A症状患者血清LDH水平(231.79±119.33)U/L，中位值197U/L，B症状患者血清LDH水平显著高于A症状患者，P=0.02。1.5β2-微球蛋白(β2-microglobulin，β2-MG)水平I-II期患者共49例，患者血清β2-MG水平增高34例，占73.91％，β2-MG水平(1705.35±505.66)ug/L，中位值1616ug/L。III-IV期共51例，患者血清β2-MG水平增高44例，占86.27％，β2-MG水平(3207.53±1067.33)ug/L，中位3302ug/L，III-IV期β2-MG水平显著高于I-II期，P<0.05。B症状患者β2-MG水平(3133.52±1013.23)ug/L，中位值2764.89ug/L，A症状患者血清β2-MG(2055.31±955.67)ug/L，中位值1755.06ug/L，B症状患者β2-MG水平显著高于A症状患者，P<0.05。1.6体能状态评分（PS评分）依据美国东部肿瘤协作组（EasternCooperativeOncologyGroup,ECOG）标准：0-1分82例（82.00%），≥2分18例（18.00%）。1.7国际预后指数（IPI，InternationalPrognosticIndex)100例DLBCL患者中，IPI低危组（0-1分）48例，占48.00%。IPI低中危组（2分）17例，占17.00%。IPI中高危组（3分）27例，占27.00%。IPI高危组（4-5分）8例，占8.00%。1.8淋巴瘤骨髓侵犯（lymphomawithbonemarrowinvolvement）100例DLBCL患者中，53例行骨髓穿刺活检。其中骨髓累计5例，骨髓未侵犯47例。23 新疆医科大学硕士学位论文1.9原发肿瘤灶大小100例DLBCL巨检标本中原发肿瘤最大直径≤2cm者46例（46.00%），2cm＜原发肿瘤最大直径≤5cm者48例（48.00%），原发肿瘤最大直径＞5cm者6例（6.00%）。2.0治疗方式、疗效评价及预后30例原发性中枢神经系统弥漫大B细胞淋巴瘤患者中单纯手术切除者15例（50.00%），手术切除后加用局部病灶放疗者4例（13.30%），手术切除后采用大剂量氨甲蝶呤或阿糖胞苷化疗者5例（16.70%），手术切除联合术后放化疗者6例（20.00%）。其余70例患者中，40例患者采用CHOP方案化疗（57.14%），26例患者采用R-CHOP方案化疗（37.14%），3例患者行单纯手术切除（4.28%），1例患者放弃治疗（1.42%）。患者治疗后疗效评价参照国际淋巴瘤工作组标准（InternationalWorkshoptoStandardizeResponseCriteria,IWC）即Cheson标准。通过对患者进行定期体格检查、CT/MRI扫描、骨髓穿刺活检等对患者治疗效果进行综合评价，每2个化疗周期进行一次疗效评价。完全缓解（CR）：所有可评价的临床及影像学异常指标完全消失，且至少维持≥4周。部分缓解（PR）：所有可评价的临床及影像学异常至少缩小50%并至少维持4周，且无新发病灶的出现。稳定（SD）：可进行疗效评价的肿瘤病灶缩小＜50%或不可测量的肿瘤病灶无明显改变，无新发病灶出现。疾病进展（PD）：淋巴节体积增大＞25%或治疗中或治疗后出现任何新发病灶。本组100例DLBCL患者治疗反应评价为病情稳定（包括完全缓解、部分缓解和稳定状态）共80例，包括13例完全缓解（4例为原发中枢DLBCL，其余9例均接受CHOP方案化疗），30例部分缓解（4例为原发中枢DLBCL，其余26例中接受R-CHOP方案化疗者14例，接受CHOP方案化疗者12例），37例稳定状态（6例为原发中枢DLBCL，其余31例中接受R-CHOP方案化疗者11例，接受CHOP方案化疗者18例，单纯手术治疗1例，放弃治疗1例），20例疾病进展（14例为原发中枢DLBCL，其余6例中接受R-CHOP方案化疗者1例，接受CHOP方案化疗者3例，单纯手术治疗2例）。100例患者在明确诊断前未进行任何治疗。对本研究中100例DLBCL患者采用电话、门诊或书信等形式进行随访，先后失访13例；共有完整可系统性随访病例87例，死亡24例，死亡率为27.58%；其中16例于确诊1年后死亡，占18.39%。2组织病理学特征2.1大体形态肿瘤组织均为实质性，肿瘤外形多不规则，与周边正常组织界限不清。肿瘤组24 新疆医科大学硕士学位论文织无包膜，切片呈灰白色或灰红色，质地细腻柔软，切面均匀一致，呈凝胶状或鱼肉状。2.2组织学改变镜下，典型DLBCL常表现为受累淋巴结或结外组织器官正常结构遭受破坏。肿瘤组织多呈弥漫浸润性生长，部分肿瘤组织呈结节性生长（附录-图1，2）。凝固性坏死及血管浸润多见（附录-图3）。肿瘤细胞形态多样，瘤细胞体积较大其细胞核为正常淋巴细胞胞核的2倍。依据2008版WHO《淋巴造血系统肿瘤病理学和遗传学》诊断标准进行组织学分型。在本研究中可以见到DLBCL三种不同组织学亚型：（1）中心母细胞型（Centroblastic,CB）：92例（92.00%）。肿瘤细胞形态似中心母细胞，瘤细胞呈圆形、椭圆形或不规则形。细胞核呈空泡状，核内染色质疏松，可见2-4个核仁紧贴核膜下，病理性核分叶多见（附录-图4）。瘤细胞胞浆稀少，呈嗜双色性或弱嗜碱性。高尔基复合体区淡染，肿瘤细胞间缺乏黏附性。部分区域可见肿瘤细胞包绕血管，呈“袖套样”改变。部分肿瘤细胞胞浆中可见免疫球蛋白沉积。背景中常可见嗜酸性粒细胞浸润（附录-图5）。（2）免疫母细胞型（Immunoblastic,IC）：5例（5.00%）。肿瘤细胞形态似免疫母细胞，且数量超过肿瘤细胞总数的90%。光镜下可见单一中位核仁，细胞体积较大，胞浆丰富呈嗜碱性（附录-图6）。（3）间变细胞型（Anaplasticlargecell,ALC）：3例（3.00%）。肿瘤细胞体积较大呈圆形、多角形或不规则形，肿瘤细胞常成簇分布，细胞核异形性明显，有的形态类似R-S细胞。窦性浸润性生长易见（附录-图7）。3免疫学表型100例患者中CD3阳性7例（7.00%）、CD10阳性11例（11.00%）（附录-图9）、CD20阳性94例（94.00%）、CD34阳性79例（79.00%）、Bcl-2阳性55例（55.00%）（附录-图8）、Bcl-6阳性89例（89.00%）（附录-图10）、MUM-1阳性75例（75.00%）。根据Hans分类法，100例患者中GCB型19例（19.00%），non-GCB型81例（81.00%）。由表3.5可见，仅CD10蛋白表达与ECOG评分相关（P=0.003）。由图3.6可见，仅有ESR和不同免疫学表型之间差异存在统计学意义（P=0.017）。生存分析显示：CD10、Bcl-2、Bcl-6及MUM-1蛋白表达阳性组与阴性组间与患者预后差异无统计学意义（P＞0.05）。25 新疆医科大学硕士学位论文表3.5100例DLBCL组织中相关蛋白表达与患者临床特征之间的关系Table3.5Thestatisticaldifferenceofexpressionofproteinsandclinicalcharacteristicsof100casesofDLBCLCD10bcl-2bcl-6MUM-1例临床特征阳阴阳阴阳阴阳阴数P值P值P值P值性性性性性性性性临床I+II49841292044539100.1180.4291.0000.359分期III+IV5134826254563615B症有49445282142739100.5260.6930.3520.359状无5174427244743615ECOG0-1分821171463973960220.0030.7991.0000.549评分≥2分1801899162153≥245U/L5264627254844111LDH1.0000.5520.3450.355＜245U/L4854328204173414IPI≤2分65956333256947180.3200.2950.320.863评分＞3分352332213332287治疗病情稳定781167443472658200.1161.0000.0610.780效果病情进展220221111175175表3.6100例DLBCL组织中免疫表型与患者临床特征之间的关系Table3.6Theimmunophenotypeandclinicalcharacteristicsof100casesofDLBCL临床特征例数GCBABCP值年龄≤60岁6913560.797＞60岁31625性别男5613430.226女4463826 新疆医科大学硕士学位论文原发部位结内598510.096结外411130LDH水平≥245U/L5211410.618＜245U/L48840β2-MG含量≥2.2mg/L7812660.083＜2.2mg/L22715ESR≥15mm/h709610.017＜15mm/h301020临床分期I+II期4912370.207III+IV期51744B症状有496430.126无511338IPI评分≤2分6514510.435＞3分35530ECOG评分0-1分8217650.512≥2分182164EB病毒原位杂交检测EBER对100例DLBCL患者行EBER原位杂交。共有5例EBER阳性（附录-图18），其中1例为GCB，4例为non-GCB。5例EBER阳性均为中心母细胞型。5FISH检测Bcl-2/IgH、BCL-6及C-MYC基因100例DLBCL患者中Bcl-2/IgH基因融合1例（附录-图11，12），BCL-2基因扩增7例（附录-图17）。BCL-6基因重排阳性8例（附录-图13，14）。C-myc基因重排阳性2例（附录-图15，16）。基因突变与患者的临床特征及免疫学表型之间差异无统计学意义（P＞0.05）。27 新疆医科大学硕士学位论文表3.7100例DLBCL组织中分子遗传学改变与患者临床特征之间的关系Table3.7Themoleculargeneticalterationandclinicalcharacteristicsof100casesofDLBCLBCL-2/IgH基因BCL-2基因扩BCL-6基因重排C-myc基因重排例融合增临床特征数阳阴阳阴阳阴阳阴P值P值P值P值性性性性性性性性≤60岁69168663663168年龄1.0000.4311.0001.000＞60岁31031130229130女42042339438141性别1.0001.0000.7171.000男58157454454157≥245U/L52052253448151LDH0.4800.2561.0001.000＜245U/L48147543444148β≥2.2mg/l781775736721771.0001.0001.0000.3932-MG＜2.2mg/l22022220220121≥15mm/h70169565565268ESR1.0001.0000.6940.576＜15mm/h30030228327030临床I+II491483465441480.4901.0000.4831.000分期III+IV51051447348150有49051546348150B症状0.4900.4370.4831.000无51148247544148ECOG0-1分821817757752801.0000.3451.0001.000评分≥2分18018018117018IPI评≤2分651644615601641.0000.6931.0001.000分＞3分3503533233213428 新疆医科大学硕士学位论文治疗病情稳定781777716722761.0000.2051.0001.000效果病情进展22022022220022Bcl-2阳性550552536492530.4500.2380.2890.500蛋白阴性45144540243045Bcl-6阳性891887827822871.0000.6011.0001.000蛋白阴性11011011110011免疫GCB191183161180190.1900.1240.7021.000表型ABC810814777742796生存分析采用Kaplan-Meier单因素生存分析法对100例DLBCL患者进行单因素生存分析，结果显示患者血清LDH水平、原发肿瘤大小、IPI评分及治疗效果等因素的生存时间差异具有统计学意义（P＜0.05），此四种因素的累计生存率及生存曲线（见图1-图4），单因素生存分析显示：（1）血清LDH水平正常组患者预后优于血清LDH水平升高组（P=0.017）（2）原发肿瘤越大患者预后越差，中位生存时间越短（P=0.011）（3）IPI评分越高患者预后越差（P=0.015）（4）不同治疗效果患者预后不同，完全缓解的患者预后最好，部分缓解和稳定状态患者预后较差，病情进展的患者预后最差（P=0.008）。患者发病年龄、性别、民族、是否存在B症状、临床分期、ECOG评分、治疗方式、Bcl-2蛋白表达、Bcl-6蛋白表达等因素的生存时间差异无统计学意义（P＞0.05）图1LDH水平与预后之间的关系图2肿瘤原发大小与预后之间的关系Fig1.ThesurvivalcurvesofLDHlevelFig2.Thesurvivalcurvesofprimarytumorsize29 新疆医科大学硕士学位论文图3IPI评分与患者预后之间的关系图4疗效与预后之间的关系Fig3.ThesurvivalcurvesofIPIscoreFig4.Thesurvivalcurvesoftherapy对单因素生存分析中生存差异具有统计学意义的预后指标（患者血清LDH水平、原发肿瘤大小、IPI评分、治疗效果）纳入多因素Cox分险比例回归模型，分析结果显示，血清LDH水平、原发肿瘤大小及治疗效果是影响DLBCL患者预后的独立因素（表3.8）。累计生存函数见图5。表3.8100例DLBCL多因素生存分析Table3.8TheCoxregressionmulti-factoranalysisresultsof100casesofDLBCLBSEWalddfSigExp(B)95.0%CI用于Exp(B)下部上部血清LDH水平.690.2616.9851.0081.9931.1953.323原发肿瘤大小.602.2207.5251.0061.8261.1882.808IPI评分.177.1341.7301.1881.193.9171.553治疗效果-.604.14916.5261.000.547.408.73130 新疆医科大学硕士学位论文图5100例DLBCL患者的生存曲线Fig5Thesurvivalcurvesof100casesofDLBCL31 新疆医科大学硕士学位论文讨论弥漫大B细胞淋巴瘤(DiffuselargeBcelllymphoma，DLBCL)是我国最常见的【1】一种非霍奇金淋巴瘤，约占成人非霍奇金淋巴瘤发生率的30%-40%。肿瘤组织呈高度侵袭性生长、该肿瘤在临床表现、形态学特点、免疫学表型和分子遗传学特征等方面存在明显异质性。DLBCL可发生于任何年龄阶段，随年龄的增长其发病率呈上升趋势，男性发病率略高于女性。DLBCL临床表现复杂多样，常以无痛性渐进性全身浅表淋巴结肿大为患者的首发症状。DLBCL可以原发于淋巴结内或原发于结外器官，也可以由其他类型的低度恶性的淋巴造血系统肿瘤转变而来（如滤泡细胞性【2】淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、滤泡边缘区淋巴瘤等），这种转变常常伴有分子遗传学改变和（或）肿瘤细胞凋亡抑制。到目前为止，DLBCL的发病原因及致病机制尚不清楚，可能与环境污染、电离辐射、免疫功能缺陷、分子遗传学改变及病【26】毒感染相关。其中病毒感染和分子遗传学改变是近年来研究的热点。DLBCL被认为是一种具有高度异质性的淋巴造血系统肿瘤，它包含不同的组织学及免疫学亚型，不同的亚型具有不同的临床表现及临床结局，这些不同之处大多是源于DLBCL分子水平上的异质性。因此，对DLBCL的分子水平的研究将有助于从分子水平了解DLBCL的发病原因及发病机制，从而为DLBCL患者制定有效的治疗方案奠定基础。1临床病理资料DLBCL是一种起源于淋巴造血系统的恶性增殖性肿瘤，在形态学、免疫学表型、分子遗传学、临床表现及治疗效果等方面均具有明显的异质性。2008版WHO淋巴造血系统肿瘤诊断标准中将DLBCL定义为B淋巴细胞源性的、有大的肿瘤细胞、【2】具有侵袭性生长的需要高强度化疗药物治疗的恶性非霍奇金淋巴瘤。目前，DLBCL的发病原因及发病机制尚不明确，其发病率呈逐年升高并呈年轻化趋势，临床上主要以中老年患者发病多见，国外研究报道DLBCL的中位发病年龄为70岁，国内研究报道其发病年龄有年轻化的趋势，平均发病年龄在43-65岁之间。各年龄阶段均可发病，且男性的发病率略高于女性。本组100例研究中男性56例（56.00%），女性44例（44.00%），男/女=1.27：1。年龄分布为5-83岁，平均年龄52.40±12.90岁，中位年龄53.50岁。发病年龄集中分布在31-50岁之间（38例，38.00%）。与国内报道相似。DLBCL最常累及淋巴结，结外受累也很常见，最常见结外受累部位是胃肠道（胃和回盲部），此外也可累及骨、皮肤、肝脏、脾脏、中枢神经系统等。本研究中100例DLBCL患者，59例（59.00%）患者原发于淋巴结内，41例（41.00%）患者原发于结外组织和（或）器官，二者之比为1.44：1。结内病变以颈部淋巴结受累（34/100）最为常见，其次是腹股沟淋巴结受累（18/100）。原发于结外DLBCL以原发性中枢神经系统弥漫大B细胞淋巴瘤（30/100）最为常见，其次是原发胃肠道32 新疆医科大学硕士学位论文DLBCL。30例原发性中枢神经系统弥漫大B细胞淋巴瘤患者中肿瘤位于幕上23例（76.67%），肿瘤位于幕下5例（16.67%），颅内多发病灶2例（6.67%）。其中幕上肿瘤主要位于颞叶区6例（26.10%），幕下肿瘤主要位于小脑半球4例（80.00%）。进展期DLBCL患者中出现≥2处结外器官累及者6例（6.00%），其中3例患者肿瘤累及肺，2例患者肿瘤累及脾脏，1例患者肿瘤同时累及肋骨和睾丸。DLBCL的临床表现复杂多样，大多数以无痛性渐进性浅表淋巴结肿大为患者的首发症状，由于肿瘤累及部位、浸润深度和病变范围不同，患者的临床表现复杂多样。本研究中原发于结内的DLBCL以无痛性渐进性浅表淋巴结肿大为首发症状。结外DLBCL中以【5】颅内压增高和颅神经受损的临床表现最为常见。1993年Shipp等综合分析了欧美国家2031例成人高侵袭性非霍奇金淋巴瘤患者的治疗效果及影响预后相关危险因素，所有患者均在治疗中均接受了以阿霉素为代表的大剂量联合化疗方案，采用多因素回归分析显示患者的发病年龄（≤60岁与＞60岁）、AnnArbor临床分期、体能状态评分（PS评分）、血清LDH水平及结外累计数目是其预后不佳的影响因素，综合分析这些临床相关因素，提出了非霍奇金淋巴瘤的国际预后指数（IPI），根据IPI指数将非霍奇金淋巴瘤患者按照生存预后分为4组即：低危组（IPI指数0-1分）、低中危组（IPI指数2分）、高中危组（IPI指数3分）和高危组（IPI指数4分或5分）。IPI指数与非霍奇金淋巴瘤患者治疗后的总生存率、无病生存率等密切相关，IPI指数适用于各种类型的非霍奇金淋巴瘤治疗后疗效的评估。国外相关研究表明在应用免疫化疗后，IPI指数仍然对患者的预后有较高的预测作用。本组100例DLBCL患者中，单因素分析显示，患者血清LDH水平、IPI指数与DLBCL患者的生存预后密切相关，差异具有统计学意义（P＜0.05）。而患者的发病年龄、性别、族别、AnnArbor临床分期、B症状、PS评分等对患者生存预后影响差异无统计学意义（P＞0.05）。Cox风险比例回归模型分析显示，IPI评分对患者的预后影响差异无统计学意义（P=0.188），提示在本组研究中IPI指数易受其它相关预后影响因素的影响，不是影响DLBCL患者生存预后的独立危险因素。血清乳酸脱氢酶（LDH）是糖无氧分解代谢过程中催化乳酸氧化形成丙酮酸的一重要的催化酶。该酶在机体内广泛分布，其中以心脏、肾脏及骨骼肌中含量最为【33】丰富。在肿瘤细胞增殖过程中由于机体对肿瘤组织基因调控失调，造成LDH合成增加大于分解，同时由于肿瘤细胞快速大量增殖，造成肿瘤组织内处于相对无氧环境，从而使LDH在肿瘤组织中大量积聚，当肿瘤组织发生缺血坏死及浸润到周边【3】正常组织中时，从而引起LDH大量释放入血，从而使血清中LDH升高。本组100例DLBCL患者中，I-II期患者共49例，血清LDH水平升高27例，占55.10%，血清LDH水平（186.11±58.67）U/L，LDH中位值181U/L；III-IV期患者共51例，血清LDH水平升高25例，占49.01%，血清LDH水平（287.19±177.63）U/L，LDH33 新疆医科大学硕士学位论文中位值237U/L；III-IV期患者血清LDH水平显著高于I-II期患者，P＜0.05。提升AnnArbor临床分期越晚、患者的肿瘤负荷越大、血清LDH水平越高。B症状患者血清LDH水平(311.43±213.83)U/L，中位值256U/L，A症状患者血清LDH水平(231.79±119.33)U/L，中位值197U/L，B症状患者血清LDH水平显著高于A症状患者，P=0.02。提示存在B症状的患者血清LDH水平更高。目前认为，血清LDH水平能反映肿瘤细胞的增殖活性，此酶水平升高，可能提示淋巴瘤患者的肿瘤负荷大小。AnnArbor临床分期越晚、肿瘤组织浸润越广泛、受累组织越多、LDH水平越高。LDH水平可从患者血清学水平动态反映肿瘤组织的增殖情况，故LDH水平变化是动【29】态监测疗效的一重要血清学指标。本组100例DLBCL患者中，单因素分析显示，血清LDH水平、IPI指数、肿瘤原发灶大小与DLBCL患者生存预后密切相关（P＜0.05），Cox风险比例回归模型分析显示，血清LDH水平对患者的生存预后影响差异具有统计学意义（P=0.008）。提示血清LDH水平变化受其它预后影响因素影响较小，是影响本组DLBCL患者生存预后的独立危险因素。【4-6】β2-微球蛋白(β2-microglobulin，β2-MG)于1968年由Beggand等首先在肾小管病变患者尿液中分离得到。β2-MG属于人类白细胞分化抗原(HLA)的轻链（L链）的组成部分，相对分子量为11600-11815Da之间，是一组分子量相对较小的蛋白质，主要由T淋巴细胞合成并分泌，起源于人体未分化间充质细胞、淋巴造血系统的正常组织细胞和部分恶性肿瘤细胞均能合成并分泌β2-MG。正常人体内的β2-MG含量相对稳定，而在许多恶性肿瘤中β2-MG含量明显升高，其具有作为肿瘤标志物的临床【32】参考价值。淋巴瘤患者β2-MG的增高主要是由于肿瘤细胞可自主性分泌产生β2-MG，病变广泛的患者血清β2-MG高于病灶局限性患者。当肿瘤发生骨髓浸润时，肿瘤细胞自身合成β2-MG的周期明显缩短，细胞代谢旺盛，肿瘤性破坏增加从而导致大量β2-MG释放入血。多数学者认为，β2-MG持续增高提示肿瘤的恶性度增加，【31-34】患者预后较差。β2-MG在白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤中的预后意义已得到【7】国内外许多文献的证实。相关研究还发现β2-MG水平与患者的发病年龄、临床分期、结外病变数、血清LDH水平、IPI指数等均有相关性(P<0.05)。说明β2-MG与病情、临床分期及体内肿瘤负荷有关。也有报道提示β2-MG水平的动态变化有助于临床疗效和预后的判断。本组研究中，I-II期患者共49例，患者血清β2-MG水平增高34例，占69.38％，β2-MG水平(1705.35±505.66)ug/L，中位值1616ug/L。III-IV期共51例，患者血清β2-MG水平增高44例，占86.27％，β2-MG水平(3207.53±1067.33)ug/L，中位3302ug/L，III-IV期β2-MG水平显著高于I-II期，P<0.05。B症状患者β2-MG水平(3133.52±1013.23)ug/L，中位值2764.89ug/L，A症状患者血清β2-MG(2055.31±955.67)ug/L，中位值1755.06ug/L，B症状患者β2-MG水平显著高于A症状患者，P<0.05。单因素生存分析显示血清β2-MG水平与生存预后之间差异无统计学意义。34 新疆医科大学硕士学位论文2组织学特点巨检，活检标本均表现为明显的肿物形成。肿瘤组织均为实质性，肿瘤形态多不规则，与周边正常组织界限不清。肿瘤组织无包膜，呈灰白色或灰红色，质地细腻柔软，切面均匀一致，呈凝胶状或鱼肉状。镜下，典型DLBCL常表现为受累淋巴结或结外组织和（或）器官正常结构被破坏。肿瘤组织多呈弥漫浸润性生长，部分肿瘤组织呈结节性生长。凝固性坏死及肿瘤血管浸润多见。肿瘤细胞形态多样，瘤细胞体积较大其细胞核常为正常淋巴细胞胞核体积的2倍。依据2008版WHO《淋【8】巴造血系统肿瘤病理学和遗传学》诊断标准进行组织学分型。在组100例中可见到DLBCL三种不同组织学亚型：中心母细胞型（Centroblastic,CB）：92例（92.00%）。肿瘤细胞形态中心母细胞类似，肿瘤细胞呈圆形、椭圆形或不规则形。细胞核呈空泡状，核内染色质疏松，可见2-4个核仁紧贴核膜下，病理性核分叶多见。瘤细胞胞浆稀少，呈嗜双色性或弱嗜碱性。高尔基复合体区淡染，肿瘤细胞之间缺乏黏附性。多数情况下由生发中心母细胞与免疫母细胞混合组成。某些肿瘤区域内可见肿瘤细胞包绕血管生长，呈“袖套样”改变。部分肿瘤细胞胞浆中可见蓄积的免疫球蛋白。背景中常可见嗜酸性粒细胞弥漫浸润性分布。免疫母细胞型（Immunoblastic,IC）：5例（5.00%）。肿瘤细胞形态与免疫母细胞相似，且数量超过肿瘤细胞总数的90%。光镜下可见单一中位分布的核仁，细胞体积较大，肿瘤细胞胞浆丰富呈嗜碱性。瘤细胞可出现浆样分化。间变细胞型（Anaplasticlargecell,ALC）：3例（3.00%）。肿瘤细胞体积较大，呈圆形、多角形或不规则形，肿瘤细胞形态和R-S细胞相似或与间变大细胞淋巴瘤细胞相似。肿瘤细胞多成簇分布，细胞核异形性明显，常呈窦性浸润性生长，与未分化癌组织学形态极为相似。组织学亚型与患者预后之间差异均无统计学意义（P＞0.05）。3免疫表型肿瘤细胞可表达全部B细胞系标记物，如CD19、CD20、CD22、CD79α、PAX-5。肿瘤细胞不表达T细胞系和组织细胞系标记物，如CD3和CD68。本研究中100例患者CD3阳性7例（7.00%）、CD10阳性11例（11.00%）、CD20阳性94例（94.00%）、CD34阳性79例（79.00%）、Bcl-2阳性55例（55.00%）、Bcl-6阳性89例（89.00%）、MUM-1阳性75例（75.00%）。CD10，为急性淋巴母细胞性白血病共同抗原。在人体各种组织器官中均可表达，CD10为一种膜相关性肽链内切酶。在淋巴细胞的发育、分化及归巢中发挥重要生物学作用，CD10主要表达于前B淋巴细胞和生发中心起源的B淋巴细胞。因此将CD10【11】作为生发中心起源B细胞的重要标记物。体内外实验研究均表明，CD10分子的【12】表达和B细胞淋巴瘤的凋亡之间呈正相关。本组研究中，CD10阳性率为11.00%，35 新疆医科大学硕士学位论文【12】略低于国内外文献报道的20%-43%的阳性率。推测可能与标本前期固定处理中膜抗原遭受破坏或丢失有一定关系。关于CD10分子表达与预后之间的关系尚存在有争议，不同的研究方法获得的研究结果各不相同。大多数研究表明，CD10阳性的患者预后较好，少数研究表明CD10分子的表达对患者的生存预后无任何影响，个别研【12】究报道CD10阳性患者的生存预后更差。本研究中CD10阳性组患者3年生存率为57.35%，CD10阴性组患者3年生存率为41.72%。CD10阳性组患者的总生存率高于CD10阴性组，但差异无统计学意义。提示单独依靠CD10分子的表达与否不足以作为预测DLBCL患者生存预后的指标。MUM-1又称为白细胞介素调节因子4（IRF-4），是一种骨髓瘤相关癌基因，是干【9】扰素调节因子超家族中一重要成员。该抗原表达于生发中心（GC）形成的终末期，并持续存在于B细胞发育分化的晚期及浆细胞分化形成的早期阶段。因此MUM-1蛋白的表达说明肿瘤细胞来源于生发中心（GC）形成的终末期或浆细胞形成早期阶段。MUM-1的异常表达主要是存在t（6；14）（p25；q32），即MUM-1基因从第6号染色体短臂上断裂后易位到了第14号染色体长臂上IgH基因增强子所在的基因位点，从而导致MUM-1蛋白的过度表达，MUM-1蛋白过表达提示NF-κB细胞信号转导途【21】径被激活，肿瘤细胞凋亡受到抑制，从而造成肿瘤细胞大量持续性增殖。文献【23】报道在DLBCL中MUM-1的表达率在47%-68%，其对患者生存预后的影响仍存在争议，部分研究表明MUM-1蛋白表达的患者预后更差，部分研究表明MUM-1蛋白表达对患者的预后无明显影响。本组研究中MUM-1阳性率为75.00%，略高于文献报道。单因素生存分析显示，MUM-1蛋白表达与否对患者的生存预后影响差异无统计学意义（P＞0.05）。提示在本研究中MUM-1蛋白表达与否不能作为预测DLBCL患者生存预后的危险因素。Bcl-6蛋白是由位于3q27上的BCL-6基因编码的具有锌指结构的一核内转录抑制【30】因子。正常情况下，Bcl-6蛋白表达于生发中心（GC）起源的B淋巴细胞和少数CD4阳性的T淋巴细胞，通过控制和调节Th2淋巴细胞分泌细胞因子从而在生发中心的形成、淋巴细胞的分选和调节等方面发挥重要生物学作用。大量研究表明，在DLBCL中Bcl-6蛋白的表达可以抑制NF-κB细胞信号转导途径，从而抑制NF-κB细胞信号转导途径的抗凋亡作用，故认为Bcl-6蛋白表达是患者具有良好生存预后的标志。文献【29】报道，在DLBCL中Bcl-6蛋白表达的阳性率在48%-77%，本组研究中Bcl-6蛋白的阳性率为89.00%，高于相关文献报道。Bcl-6蛋白表达阳性组3年生存率为49.05%，Bcl-6蛋白表达阴性组3年生存率为32.30%。Bcl-6蛋白表达阳性者的总生存率高于Bcl-6蛋白表达阴性组。单因素生存分析显示，Bcl-6蛋白表达对患者预后影响差异无统计学意义（P＞0.05）。可能与本研究中标本前期固定处理时抗原信息丢失有关，仍需要大样本量的前瞻性研究进一步验证。36 新疆医科大学硕士学位论文Bcl-2蛋白属于一种抗凋亡蛋白，在B淋巴细胞的发育、分化中起重要作用。约【27】50%-70%的DLBCL病例中可表达Bcl-2蛋白。大量研究表明，Bcl-2蛋白阳性表达患者预后较差，患者对常规化疗药物不敏感，易产生化疗耐受。部分研究表明，Bcl-2蛋白的表达对患者的生存预后无明显影响。本组研究中，Bcl-2蛋白阳性表达率为55.00%，与文献报道一致。Bcl-2蛋白阳性表达患者3年生存率为33.17%，Bcl-2蛋白阴性表达患者3年生存率为52.19%。Bcl-2蛋白表达阴性者的总生存率高于Bcl-2蛋白表达阳性组。单因素生存分析显示，Bcl-2蛋白阴性组生存曲线位于阳性组曲线上方，提示Bcl-2蛋白阴性组患者的生存状况明显优于阳性组，但组间差异无统计学意义（P＞0.05）。近年来，为了阐明DLBCL的分子生物学发生机制，利用基因芯片技术对DLBCL进行了全基因表达谱（geneexpressionprofiling,GEP）的分析研究。2000年Alzaideh【32】等根据全基因表达谱系将42例DLBCL患者分成为两组：生发中心B细胞样（GCB）组和活化B细胞样（ABC）组。生存分析显示GCB组患者的生存预后明显优于ABC【24】组。Rosenwald等在Alzaideh之后进行了大样本（n=240）比对研究后证实了上述结论并在此基础上提出第三型（type3）。type3型肿瘤组织的生物学行为及预后和ABC型极为类似。故将二者统称为非生发中心样（non-GCB）组。全基因表达谱分析技术复杂、费用昂贵，从而限制了其在临床工作中的推广及应用。目前在临床工作中主要应用免疫组化法标记将DLBCL分成为GCB和non-GCB两种免疫表型。2004【28-31】年Hans等采用免疫组化法利用CD10、Bcl-6和MUM-1三种蛋白为标记物将DLBCL分成为GCB和non-GCB两种不同免疫学表型。其结果与GEP分型结果具有高度一致性，由于免疫组化技术操作简便，技术相对成熟。因此在临床工作中被广泛应用，本研究中根据Hans分类模型将100例DLBCL分成GCB和non-GCB两组，其中GCB型19例，non-GCB型81例，二者之比为1：0.23。其中GCB组所占比例为19.00%，低于国外Alzaideh（50.00%）和Rosenwald（48.00%）基因表达谱中的研究报告。低于国外Hans（42.00%）免疫组化法分型的实验结果。GCB组患者随访时间为1-45个月，中位生存时间为21个月，3年生存率为45.92%。non-GCB组患者随访时间为1-42个月，中位生存时间为15个月，3年生存率为39.18%。单因素生存分析显示GCB组患者的生存状况优于non-GCB组患者，但Log-Rank检验P值=0.1392，差异不具有统计学意义。4EB病毒感染与DLBCLEB病毒是由Epstein和Barr两位病毒学家于1964年最先从非洲儿童的Burkitt淋巴瘤组织中发现并分离得到的一种病毒，EB病毒在病毒分类学上属于γ亚科嗜淋巴细【35】胞性DNA-疱疹病毒，该病毒呈全球性分布，据报道，世界上有超过90%的成人曾经感染过EB病毒。大多数人群在幼年时期感染过EBV，表现为无症状和（或）一37 新疆医科大学硕士学位论文些轻度非特异性的流感样症状，此后病毒长期潜伏在患者外周血淋巴细胞中。处于潜伏状态的EBV通常不会导致任何疾病，一旦在内外环境中各种刺激因素的诱发作用下处于潜伏状态的EBV开始活化并大量增殖，其可能会导致一系列恶性肿瘤的发生。已经证实EB病毒感染和鼻咽癌（NPC）、NK/T细胞淋巴瘤、移植后淋巴瘤、Burkitt【27】淋巴瘤等的发生、发展和预后密切相关。EB病毒全基因组中共有84个开放阅读框架（ORF），可以编码产生80余种与致病相关的蛋白质，但在整个基因组中仅有少数几个基因是在EBV发挥转化和永生化过程中所必备的，这些基因包括有编码EBV核抗原1（EBNA1）、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B、EBNA3C、EBNA-LP基因及编码潜伏膜蛋白1（LMP-1）基因和LMP-2基因。其中LMP-1是唯一一个确定具有致淋【4】【29】巴瘤作用的基因。LMP-1的致瘤机制是近几年的研究热点。1996年Kieff首先提出LMP-1的作用可能类似于肿瘤坏死因子超家族中CD40的生物学功能，其通过第二信使的介导，引发肿瘤细胞过度增殖和凋亡抑制，从而参与肿瘤的发生及发展。但今年来的分子生物学研究证实LMP-1致瘤作用和NF-κB信号转导通路、SEK-JNK1【33】信号转导通路及JAK-STATs信号转导通路密切相关。此外EBV感染后可使淋巴细胞染色体发生易位和（或）突变，从而导致C-myc原癌基因的激活和过度表达，导致恶性肿瘤的发生。EBV的感染还可使淋巴细胞系中由Fas-FasL介导细胞凋亡途径受到抑制，以及BCL-2基因的异常表达，使肿瘤细胞凋亡受阻从而造成肿瘤细胞持续增值进而发生淋巴瘤。在存在免疫系统功能缺陷的DLBCL人群中EBV感染率远远高于散发型DLBCL。在无严重免疫功能缺陷的人群中EBV感染率仅为10%。国内各项研究报道DLBCL中EBV阳性总检出率各不相同，本研究中100例DLBCL患者中EBER阳性率较低，但仍有为5.00%的阳性病例，且5例EBER阳性中1例为GCB，4例为non-GCB。5例EBER阳性中其组织学亚型均为中心母细胞型。EBER阳性与免疫表型及患者临床特征之间差异均无统计学意义（P＞0.05）。EBV感染在本组DLBCL发生中有一定作用，推测EBV感染可能是DLBCL发生、发展中的伴随现象或是一种诱发因素。5DLBCL与分子遗传学改变近年来，由于分子生物学和分子遗传学检测手段的日益更新，越来越多的淋巴造血系统肿瘤发现了其特定的分子生物学和分子遗传学改变，这些特征性的染色体改变解释了部分淋巴造血系统肿瘤的病因及发病机制，甚至在部分实验室直接用于淋巴造血系统肿瘤的分类、诊断与鉴别诊断、分子靶向治疗。大约有50%的DLBCL【34】病例中可检测到染色体异常。染色体异常中最常见的是t（3；14）（q27;q32），t（14；18）（q32;q21）和t（8；14）（q24;q32），分别涉及到BCL-6、BCL-2和C-myc基因。部分患者也可能同时存在有免疫球蛋白重链（H链）、轻链（L链）基因重排和（或）可变区（V区）的基因突变。以往检测和研究基因断裂重排常使用PCR法，但38 新疆医科大学硕士学位论文由于多种干扰因素常常造成实验结果中存在假阳性和（或）假阴性。今年来，荧光原位杂交（FISH）检测染色体断裂重排技术日趋成熟，且成本低、灵敏度及特异性【34】高。被视为检测染色体基因断裂、重排及扩增的“金标准”。本研究中应用间期荧光原位杂交技术检测100例DLBCL患者分裂间期的肿瘤细胞核中BCL-6基因断裂重排8例、BCL-2/IgH基因融合1例、BCL-2基因扩增7及C-myc基因断裂重排2例。BCL-6基因除了和IgH基因发生断裂重排以外，还和至少约30余种基因发生断裂重排。因此BCL-6基因被视为重排杂乱的基因之一。本研究在检测中应用位点特异性探针（LSI），虽然无法检测具体是哪种基因与BCL-6基因发生了断裂重排，但是可以检测出全部发生BCL-6断裂重排的基因。本研究中BCL-6基因断裂重排发生率为【33】8.00%，低于文献报道的在DLBCL中发生可存在30%-40%的BCL-6基因断裂重排。其可能于标本前期处理中固定不足有关、此外新疆地区DLBCL患者与其他地区DLBCL患者相比，除了社会文化、生活习俗上存在差异，其种族方面也存在特有的遗传学背景。而这些因素可能都与BCL-6基因断裂重排率过低有关。8例BCL-6基因重排中GCB组1例，non-GCB组7例。两组间差异无统计学意义。结内结外组比较BCL-6基因断裂重排差异无统计学意义，但结外病变组BCL-6基因断裂重排发生率为75.00%（6/8），且6例结外病变中5例为原发性中枢神经系统弥漫大B细胞淋巴瘤。结内组BCL-6基因断裂重排发生率为25.00%（2/8）。提示，结外组BCL-6基因断裂重排发生率高于结内组。预后相对较差的non-GCB组中BCL-6基因断裂重排发生率高于GCB组。由于民族、地域、生活习俗等因素导致DLBCL的发病原因各不相同，BCL-6基因断裂重排在DLBCL中致病地位也不相同。本组中BCL-6基因断裂重排多发生于结外non-GCB组且有6例患者的发病年龄≤60岁，不能否认BCL-6基因断裂重排是否在中年人群DLBCL的发生及发展过程中起到一定作用。BCL-2基因异常主要是由于染色体发生易位从而导致位于第18号染色体上的BCL-2基因从第18号染色体长臂上断裂后插入到第14号染色体长臂上的IgH增强子基【15】因所在位点，从而使BCL-2基因转录活性增强，Bcl-2蛋白异常表达。Kobayash等应用流式细胞仪法对淋巴瘤中BCL-2的表达进行分析研究，并同时应用荧光原位杂交（FISH）及RT-PCR法对标本进行细胞遗传学分析，结果发现91%的滤泡细胞性淋巴瘤（FL）中可检测到t（14；18）（q32；q21）染色体异常。实验组中凡是存在t（14；18）（q32；q21）染色体异常者都异常表达Bcl-2蛋白。因此推测FL的发生不仅和Bcl-2蛋白异常高表达有关外还和t（14；18）（q32；q21）染色体易位密切相关。因此Bcl-2蛋白高表达和t（14；18）（q32；q21）染色体异常成为诊断FL的重要分子遗传学依【17】据。大部分FL最终可转化为侵袭性淋巴瘤，其中Bcl-2蛋白过表达的FL常转变成DLBCL，因此在大约20%-30%的DLBCL病例中存在t（14；18）（q32；q21）染色体异常。本组研究中BCL-2/IgH基因融合检出阳性率为1.00%，低于文献报道。BCL-239 新疆医科大学硕士学位论文基因转录增强可使Bcl-2蛋白异常表达，Bcl-2在滤泡中心处活化后可阻止多种细胞毒性化疗药物所诱发的肿瘤细胞凋亡途径，从而使得肿瘤细胞凋亡受到抑制进而大【18】量增殖，出现原发耐药。Bairey等用免疫组化法回顾性研究不同生存期的DLBCL患者，发现Bcl-2蛋白高表达和化疗耐药有关，Bcl-2蛋白阳性者生存期较短。本研究中7例BCL-2基因扩增中3例为GCB，4例为non-GCB，组间差异无统计学意义。我国非霍奇金淋巴瘤各病理亚型的发生率与欧美国家存在一定的差异，欧美国家的FL发生率明显高于我国。由于BCL-2/IgH基因融合是FL特征性分子遗传学改变，而FL又可转变为DLBCL，因此国外报道的DLBCL中BCL-2/IgH基因融合发生率均较高，约在15.00%以上。本研究中BCL-2/IgH基因融合发生率仅为1.00%，可能与我国FL发生率较低有关，也可能是新疆地区DLBCL发生的特殊之处，这还需要大样本随机对照研究进一步验证。C-myc基因断裂重排是Burkitt淋巴瘤标志性的分子遗传学改变，约80％-90％的Burkitt淋巴瘤病例中存在t(8；14)染色体易位，但这并不是Burkitt淋巴瘤所特有分子【26】遗传学改变，约10％左右DLBCL病例中也存在此种分子遗传学改变。本研究中C-myc基因重排阳性发生率为2.00%，低于文献报道。2例重排阳性患者均为non-GCB型，一例肿瘤原发于淋巴结，一例为原发性中枢神经系统DLBCL。研究表明C-myc基因重排常与CD10分子的表达密切相关，且主要发生在GCB亚型中。本组中2例C-myc基因断裂重排阳性患者均为non-GCB型且与CD10分子表达无关。这种差异很可能和地域因素有关，亚洲人群中GCB型DLBCL相对少见，这可能与本组GCB型DLBCL较少有关，从而进一步导致C-myc基因断裂重排均发生在non-GCB型。因此可能是新疆地区DLBCL发生的特殊之处，这还需要进一大样本研究验证。研究DLBCL的免疫表型及分子遗传学改变能从分子生物学水平反应肿瘤的生物学行为，并帮助判断预后及选择合适治疗方式。相信随着对DLBCL的分子遗传学研究不断深入，将会使DLBCL的诊断及治疗更加个体化。40 新疆医科大学硕士学位论文小结1弥漫大B细胞淋巴瘤(DiffuselargeBcelllymphoma，DLBCL)是我国最常见的一种非霍奇金淋巴瘤，该肿瘤组织呈高度侵袭性生长、该肿瘤在临床表现、形态学特点、免疫学表型和分子遗传学特征等方面存在明显异质性。2本研究显示DLBCL发病以男性多见，结内起病多见；血清LDH增高的患者预后较差。且血清LDH升高与AnnArbor临床分期相关；血清β2-MG水平与AnnArbor临床分期相关，但与预后无关。3.DLBCL的组织学亚型以中心母细胞型最常见。4.单因素生存分析显示：血清LDH水平、原发肿瘤大小、IPI评分及治疗效果等因素对预后的影响差异具有统计学意义（P＜0.05）。患者发病年龄、性别、民族、是否存在B症状、临床分期、ECOG评分、治疗方式、Bcl-2蛋白表达、Bcl-6蛋白表达及基因突变等因素的生存时间差异无统计学意义（P＞0.05）；Cox多因素分析显示：血清LDH水平、原发肿瘤大小及治疗效果是影响DLBCL患者预后的独立因素。5.结外组BCL-6基因断裂重排发生率高于结内组。预后相对较差的non-GCB组中BCL-6基因断裂重排发生率高于GCB组。7例BCL-2基因扩增中3例为GCB，4例为non-GCB，组间差异无统计学意义。我国非霍奇金淋巴瘤各病理亚型的发生率与欧美国家存在一定的差异，欧美国家的FL发生率明显高于我国。由于BCL-2/IgH基因融合是FL特征性分子遗传学改变，而FL又可转变为DLBCL，因此国外报道的DLBCL中BCL-2/IgH基因融合发生率均较高，约在15.00%以上。本研究中BCL-2/IgH基因融合发生率仅为1.00%，可能与我国FL发生率较低有关，也可能是新疆地区DLBCL发生的特殊之处。2例C-myc基因重排阳性患者均为non-GCB型，一例肿瘤原发于淋巴结，一例为原发性中枢神经系统DLBCL。2例C-myc基因断裂重排阳性患者均为non-GCB型且与CD10分子表达无关。41 新疆医科大学硕士学位论文致谢首先，衷心的感谢我的导师张巍教授对我的精心培养和指导，在导师的指导和帮助下，我得以顺利完成课题。从本课题的选题、实验设计等方面处处浸透着导师无微不至的关怀。导师严谨的工作态度，广博的学识和医学科研工作孜孜不倦的追求精神，深深的感染着我，使我受益终生。在此，对我尊敬的导师表示衷心的感谢和深深的敬意。特别感谢新疆医科大学第一附属医院病理科李新霞老师在我实验过程中及论文撰写阶段给予我极大的帮助和鼓励，李新霞老师知识广博，工作态度严谨，这种严谨的工作态度一直影响着我，使我受益终生。。感谢新疆医科大学第一附属医院病理科诊断室以及技术室各位老师在生活上以及实验阶段的帮助和支持。感谢新疆医科大学基础医学院病理解剖学教研室的全体老师给予我的帮助和指导。感谢新疆医科大学研究生学院张丽、李玉华、王茜等老师在我三年的研究生学习期间的关心和帮助。感谢我的家人，他们三年来对我始终如一的支持和无微不至的关爱，是我顺利完成学业的最大精神支持和力量源泉。感谢所有曾经关心、帮助过我的人，你们的关心和帮助使我做得更好。衷心感谢大家！42 新疆医科大学硕士学位论文参考文献[1].GaiterKC，WamkeRA．DiffuselargeB-celllymphoma.JaffeES，HarrisNL，SteinH，eta1．Worldhealthorganizationclassificationofturnouts：pathologyandgeneticsoftumoursofhaematopoietieandlymphoidtissues．Lyon：IARCPress，2001．[2].VenturaRA，Martin-SuberoJ，JonesM，eta1．FISHanalysisforthedetectionoflymphoma—associatedchromosomalabnomuditiesinroutineparaffin-embeddedtissue．JMolDiagn.2006.8.141-151．[3].YonetaniN，UedaC，AkasakaT，eta1．Heterogeneousbreakpointsontheimmunoglobulingenesareinvolvedinfusionwiththe5’regionofBcl-2inB-celltumor.JapJCancerRes,2001,92:933-940．[4].LiuYH，xuFP，ZhuangHG，eta1．ClinieopathologicsignificanceofimmunophenotypicprofilesrelatedtogerminalcenterandactivationB．ceUdifferentiationindiffuselargeB．celllymphomafromChinesepatients．HumPathol，2008，39：875-884．[5].赵兵，杨顺娥．非霍奇金淋巴瘤中C-myc与NntcB的表达．肿瘤防治研究，2010，37：1091-1093．[6].HansCP，WeisenburgerDD，GreinerTC。eta1．ConfirmationofthemolecularclassificationofdiffuselargeB．celllymphomabyimmunohistochemistryusingatissuemicmarray．Blood，2004，103：275-282．[7].SukjoongOh,DongHoeKoo,CheolwonSuh,etal.PrognosticValueofImmunohistochemicalBiomarkersatDifferentCut-offValuesinPatientswithDiffuseLargeB-cellLymphomaTreatedwithCHOPChemotherapy.JKoreanMedSci.2011;26(12):1556–1562..[8].LohrJG,StojanovP,LawrenceMS,etal.DiscoveryandprioritizationofsomaticmutationsindiffuselargeB-celllymphoma(DLBCL)bywhole-exomesequencing.ProcNatlAcadSciUSA.2012:6;109(10):3879–3884[9].AlizadehAA，EisenMB，DavisRE，etal.DistincttypesofdiffuselargeB-celllymphomaidentifiedbygeneexpressionProfiling.Nature.2000;403:503一511.[10].SilviaBea,AndreasZettl,GeorgeWright,etal.DiffuselargeB-celllymphomasubgroupshavedistinctgeneticprofilesthatinfluencetumorbiologyandimprovegene-expression-basedsurvivalprediction.Blood.2005,106(9):3183–3190.[11].AlizadehAA,GentlesAJ,AlencarAJ,etal.Predictionofsurvivalindiffuselarge43 新疆医科大学硕士学位论文B-celllymphomabasedontheexpressionof2genesreflectingtumorandmicroenvironment.Blood.2011,4;118(5):1350–1358.[12].KathyH.Y.Shair,NancyRaab-Traub.TranscriptomeChangesInducedbyEpstein-BarrVirusLMP1andLMP2AinTransgenicLymphocytesandLymphoma.mBio.2012Sep-Oct;3(5):e00288-12.[13].ZacharyL.Pratt,JingzhuZhang,BillSugden,etal.TheLatentMembraneProtein1(LMP1)OncogeneofEpstein-BarrVirusCanSimultaneouslyInduceandInhibitApoptosisinBCells.JVirol.2012;86(8):4380–4393.[14].EmilieZuercher,ChristopheButticaz,JosianeWyniger,etal.GeneticDiversityofEBV-EncodedLMP1intheSwissHIVCohortStudyandImplicationforNF-KbActivation.PLoSOne.2012;7(2):e32168.[15].桂瑞瑞，周健，张艳莉等。EB病毒感染与恶性血液病相关性研究。中华实验和临床感染病杂志，2012，6(3)：195-197.[16].刘俊茹,林曲,吴祥元.EB病毒潜伏膜蛋白LMP1基因C末端30bp缺失与非霍奇金淋巴瘤的关系.癌症,2005,(24)2:145-148.[17].KaterinaVrzalikova,MartinaVockerodt,SarahLeonard，etal.Down-regulationofBLIMP1αbytheEBVoncogene,LMP-1,disruptstheplasmacelldifferentiationprogramandpreventsviralreplicationinBcells:implicationsforthepathogenesisofEBV-associatedB-celllymphomas.Blood.2011June2;117(22):5907–5917.[18].KuiNie,TaotaoZhang,HatimAllawi,etal.EpigeneticDown-RegulationoftheTumorSuppressorGenePRDM1/Blimp-1inDiffuseLargeBCellLymphomasAPotentialRoleoftheMicroRNALet-7.AmJPathol2010,177:1470–1479;[19].MandelbaumJ,BhagatG,TangH,etal.BLIMP1isatumorsuppressorgenefrequentlydisruptedinactivatedBcelllikediffuselargeBcelllymphoma.CancerCell.2010December14;18(6):568–579[20].JonathanMandelbaum,GovindBhagat,HongyanTang,etal.BLIMP1isatumorsuppressorgenefrequentlydisruptedinactivatedBcelllikediffuselargeBcelllymphoma.CancerCell.2010,14;18(6):568–579.[21].LauraPasqualucci,VladimirTrifonov,GiuliaFabbri,etal.AnalysisoftheCodingGenomeofDiffuseLargeB-CellLymphoma.NatGenet.2011,31;43(9):830–837.[22].MANDELBAUMJ,BHAGATG,TANGH,etal.BLIMP1isatumorsuppressorgenefrequentlydisruptedinactivatedBcell-likediffuselargeBcelllymphoma.CancerCell,2010,18(6):568-579.44 新疆医科大学硕士学位论文[23].LIUYY,LEBOEUFC,SHIJY,etal.RituximabplusCHOP(R-CHOP)overcomesPRDM1-associatedresistancetochemotherapyinpatientswithdiffuselargeB-celllymphoma.Blood,2007,110(1):339-344.[24].闵大六,周晓燕,陆洪芬,等.B细胞性非霍奇金淋巴瘤中Bcl-6、CD10和Bcl-2的蛋白表达及其临床病理意义.中国癌症杂志,2006,16:169-173.[25].张斌，毛庆，栗洁，等．中枢神经系统原发性淋巴瘤32例临床分析．中国实用神经疾病杂志2007；10(1)：42-43．[26].王欣，顾霞，王敏等。新疆314例恶性淋巴瘤的临床及病理资料分析。中国现代药物应用，2010年（4）22：111-112.[27].应香岚，杨幼萍，瞿海江，等。不同部位和不同类型恶性淋巴瘤患者EBV感染情况分析。万方数据.[28].陈波，王莉。新疆维吾尔族非霍奇金淋巴瘤的临床病理特点。新疆医科大学学报，2007，30（12）：1372-1375.[29].藏素红,王莉,陈波,等。新疆维吾尔族霍奇金淋巴瘤与EB病毒感染的关系。临床与实验病理学杂志，2008,24（1）：80-82.[30].李新霞，古丽娜尔.阿布拉江，李俊芝，等。新疆多民族鼻型结外NK/T细胞淋巴瘤临床病理特征研究。中国癌症杂志，2012,10.[31].路素丽，甘润良。EB病毒基因甲基化与肿瘤的关系。医学综述，2011（17）6：838-841。[32].易基群，林桐榆，何友兼．32例原发性中枢神经系统恶性淋巴瘤临床分析及文献复习．癌症，2006，25(4)：470-480[33].RajeshRamakrishnan,HartDonahue,DavidGarcia,etal.Epstein-BarrVirusBART9miRNAModulatesLMP1LevelsandAffectsGrowthRateofNasalNKTCellLymphomas.PLoSOne.2011;6(11):e27271.Publishedonline2011November10.doi:10.1371/journal.pone.0027271.[34].MariaTakacs,JuditSegesdi,FerencBanati,etal.TheImportanceOfEpigeneticAlterationsInTheDevelopmentOfEpstein-BarrVirus-RelatedLymphomas.MediterrJHematolInfectDis.2009;1(2):e2009012.[35].AdeleHannigan,JoannaBWilson，etal.EvaluationofLMP1ofEpstein-Barrvirusasatherapeutictargetbyitsinhibition.MolCancer.2010;9:18445 新疆医科大学硕士学位论文附录图1肿瘤成结节状生长（10×40）图2膨胀性生长（10×40）Fig1ThegrowthpatternoftumorcellsFig2Thegrowthpatternoftumorcells图3肿瘤性坏死（10×40）图4病理性核分叶（10×40）Fig3ThecoagulativenecrosisofthetumorFig4Thepathologicalkaryokinesisofthetumor46 新疆医科大学硕士学位论文图5中心母细胞型（10×40）图6免疫母细胞型（10×40）Fig5ThecentroblasticofDLBCLFig6TheimmunoblasticofDLBCL图7间变细胞型（10×40）图8Bcl-2蛋白在DLBCL中的表达（10×40）Fig7TheanaplasticlargecellofDLBCLFig8TheBcl-2positiveexpressioninDLBCL47 新疆医科大学硕士学位论文图9CD10在DLBCL中的表达（10×40）图10Bcl-6蛋白在DLBCL中的表达（10×40）Fig9TheCD10positiveexpressioninDLBCLFig10TheBcl-6positiveexpressioninDLBCL图11正常BCL-2/IgH基因（10×100）图12BCL-2/IgH基因融合（10×100）Fig11ThenormalBCL-2/IgHgeneFig12ThefusionofBCL-2/IgHgene48 新疆医科大学硕士学位论文图13正常BCL-6基因（10×100）图14BCL-6基因断裂重排（10×100）Fig13ThenormalBCL-6geneFig14TherearrangementofBCL-6gene图15正常C-MYC基因（10×100）图16C-MYC基因断裂重排（10×100）Fig15ThenormalC-MYCgeneFig16TherearrangementofC-MYCgene49 新疆医科大学硕士学位论文图17BCL-2基因扩增（10×100）图18EBER阳性（10×40）Fig17TheamplificationofBCL-2geneFig18ThepositiveexpressionofEBERinDLBCL50 新疆医科大学硕士学位论文综述弥漫大B细胞淋巴瘤研究进展王烨综述张巍审校弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuselargeBcelllymphoma）是最常见的一种非霍奇金【1】淋巴瘤（NHL），约占NHL的30%-40%。1994年REAL分类中首次提出了弥漫大B细胞瘤这一病理学名称，2001年版WHO淋巴造血系统肿瘤病理学和遗传学诊断标准首次承认和采纳了该病理学名称，并补充了新的“变型”(variants)。DLBCL在形态学、免疫表型、分子遗传学、治疗和预后等方面都表现出了很强的异质性。本文从病因、流行病学、形态学、免疫表型及分子遗传学改变等方面进行综述。1病因学及流行病学DLBCL的发病原因尚不清楚，DLBCL通常是原发性肿瘤，但部分DLBCL可由其他类型的低度恶性淋巴瘤/白血病转变而来。这种转变常常伴有分子遗传学改变和（或）细胞凋亡异常。可转变为DLBCL的淋巴瘤包括有滤泡性淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、慢性B淋巴细胞白血病及某些霍奇金淋巴瘤。DLBCL的发生可能和免疫系统功能缺陷、自身免疫抗体的产生以及某些病毒的【2】感染密切相关。免疫功能缺陷患者罹患淋巴瘤较正常人高出60-100倍。自身免疫性疾病患者，由于长期不断的自身免疫性刺激、体内细胞因子和淋巴因子比例失调、NK细胞生成大量减少等原因导致淋巴瘤的发生几率大为增加。一些病毒的感染和DLBCL的发生密切相关，包括Epstein-Barr病毒、人类免疫缺陷病毒（HIV病毒）、人类疱疹病毒8型（HHV-8病毒）。其中EB病毒的感染和DLBCL的发生、发展和预后密切相关。Epstein-Barr病毒是由Epstein和Barr两位病毒学家于1964年最先从非洲人群的【3】，EB病毒在病毒分类学上属于γ亚恶性淋巴瘤组织中发现并分离得到的一种病毒科嗜淋巴细胞性DNA-疱疹病毒，该病毒呈全球性分布，已经证实其和传染性单核细胞增多症、鼻咽癌（NPC）、NK/T细胞淋巴瘤、移植后淋巴瘤的发生、发展和预后密切相关。EB病毒全基因组中约有84个开放阅读框架（ORF），其可编码产生80余种蛋白质，在整个基因组中少数几个基因是在EBV发挥转化和永生化过程中所必备的，这些基因包括有编码EBV核抗原1（EBNA1）、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B、EBNA3C、EBNA-LP基因及编码潜伏膜蛋白1（LMP-1）基因和LMP-2基因。其中LMP-1是唯一一个确定具有致淋巴瘤作用的基因【4】。LMP-1的致瘤机制是近几年的研究热点。1996年Kieff【5】首先提出LMP-1的作用可能类似于肿瘤坏死因子超家族中CD40的生物学功能，其通过细胞内信号转导，引发肿瘤细胞过度增殖和凋亡抑制，从而参与肿瘤的发生及发展。但今年来的分子生物学研究证实LMP-1致瘤作用51 新疆医科大学硕士学位论文和NF-κB信号转导通路、SEK-JNK1信号转导通路及JAK-STATs信号转导通路密切相关。在存在免疫系统功能缺陷的DLBCL人群中EBV感染率远远高于散发的DLBCL。在无严重免疫功能缺陷的人群中EBV感染率仅为10%。某些环境因素也是诱发DLBCL的重要原因。包括日常接触的化学品如染发剂、装修后苯的残余、农药和杀虫剂，以及电离辐射等。2011年5月第十二届全国淋巴瘤学术大会肯定了我国近年来淋巴瘤的发生呈逐年上身趋势与环境污染和食品添加【8】剂的广泛使用密切相关。在欧美人群中DLBCL占NHL的25—30%，在发展中国家约占40%。其中以老年人患病居多，国外研究报道DLBCL发病中位年龄在70岁，国内大量文献报道DLBCL的发生呈年轻化趋势，其中位发病年龄在43-65岁。国内外研究报道均显示男性发病率高于女性【6-7】。2临床表现及组织病理学改变DLBCL的临床表现多种多样，常以无痛性渐进性肿大的淋巴结为首发临床表现。肿瘤主要发生于淋巴结，约30%-40%的患者发生于结外，常见部位为胃肠道（主要见于胃和回盲部），也可以发生于皮肤、纵隔、肾脏、肝脏、肺、骨、中枢神经系统、脾脏、生殖系统、咽淋巴环等部位。一般表现为局限性病灶，累计骨髓及外周血的情况相对少见。2008年版淋巴造血系统肿瘤病理学和遗传学诊断标准中将DLBCL分成为非特指型、T细胞/组织细胞丰富型DLBCL、原发性中枢神经DLBCL、原发于皮肤DLBCL（腿型）、老年人EBV阳性DLBCL及其它类型DLBCL。DLBCL的组织病理学表现相对单一，主要表现为形态较为一致的肿瘤细胞弥漫性浸润性破坏淋巴结或结外组织或器官的正常结构。瘤细胞形态具有异质性可表现为中心母细胞型、免疫母细胞型及间变大细胞型，或伴有浆样分化，肿瘤组织可以以一种形态的瘤细胞为主或多种形态瘤细胞混杂。淋巴结受累可表现为完全性、部分性、窦性浸润或几种形式的混合。结外受累主要表现为血管及软组织浸润，出血及肿瘤性坏死较为常见。并可见大量增生的条带状分布的纤维组织。背景中常可发现浆细胞及嗜酸性粒细胞弥漫性浸润。3免疫学表型DLBCL中肿瘤细胞可表达全B细胞系标记物，如CD19、CD20、CD22、CD79α、PAX-5。肿瘤细胞不表达T细胞系和组织细胞系标记物，如CD3和CD68。Bcl-2蛋白在DLBCL中的阳性率为30%-50%。Ki-67指数常大于40%，少数病例可以达到80%-90%，但由其他低度恶性B细胞淋巴瘤转化形成的DLBCL其Ki-67指数通常较低。部分肿瘤细胞可以表达CD30，主要见于间变型DLBCL亚型。约5%-10%的病例中肿瘤细胞可以表达CD5，通常只发生在少数原发DLBCL中及部分由CLL/SLL52 新疆医科大学硕士学位论文转变而来的DLBCL。肿瘤细胞通常不表达CyclinD1，借此可以和FL鉴别。在DLBCL中20%-43%的病例可表达CD10，48%-77%的病例可表达Bcl-6蛋白，47%-68%病例可表达MUM-1。正常淋巴组织生发中心来源B细胞可表达CD10和Bcl-6两种蛋白。因此CD10和Bcl-6时生发中心（GC）相关抗原，MUM-1又称为白细胞介素调节因子4（IRF-4），该抗原表达在生发中心形成的终末期，并持续存在于B细胞发生分化的终末期及浆细胞分化形成阶段。因此MUM-1蛋白的表达说明肿瘤细胞来源于GC形成的终末期或浆细胞形成早期。近年来，为了阐明DLBCL发生的分子生物学机制，利用基因芯片技术对DLBCL全基因表达谱（geneexpression【9-11】profiling,GEP）进行分析研究。2000年Alzaideh等根据基因表达谱系将42例DLBCL分成两组：生发中心B细胞样（GCB）组和活化B细胞样（ABC）组。生存分析显示GCB组的预后明显优于ABC组。Rosenwald等在Alzaideh之后进行了大样本（n=240）比对研究后证实了上述结论并提出第三型（type3）。type3肿瘤组织的生物学行为及预后和ABC型类似。故将二者统称为非生发中心样（non-GCB）组。国内刘艳辉【12】等所做的基因表达谱系研究将DLBCL分成A、B、C3组。对比Rosenwald的研究发现A组与GCB相似，C组与ABC相似，而B组的基因表达情况和A、C组差异较大，但结果更接近于A组，但具有A组和C组共同的免疫学表型。因此成为独立一组，并推测该组可能存在和肿瘤细胞起源以外的异质性因素，这种因素可能和DLBCL的发病机制密切相关。4.分子遗传学改变约50%的DLBCL病例中可检测到染色体异常【13】。染色体异常中最常见的是t（3；14）（q27;q32），t（14；18）（q32;q21）和t（8；14）（q24;q32），分别涉及到BCL-6、BCL-2/IgH和C-myc基因。部分患者也存在有免疫球蛋白重链、轻链基因重排和（或）可变区的基因突变。BCL-2基因异常主要是由于染色体发生易位从而导致位于第18号染色体上的BCL-2基因从第18号染色体上断裂后插入到第14号染色体上的IgH基因位点，从而使BCL-2基因转录增强，Bcl-2蛋白异常表达。Kobayash【15】等应用流式细胞仪法对淋巴瘤中BCL-2的表达进行分析研究，并同时应用荧光原位杂交（FISH）及RT-PCR法对标本进行细胞遗传学分析，结果发现91%的滤泡性淋巴瘤中可检测到t（14；18）（q32;q21）染色体异常。且在实验组中凡是存在t（14；18）（q32;q21）染色体异常都表达Bcl-2蛋白。因此推测FL的发生不仅和Bcl-2蛋白高表达有关还和t（14；18）（q32;q21）染色体异常密切相关。因此Bcl-2蛋白高表达和t（14；18）（q32;q21）染色体异常成为诊断FL的重要分子遗传学依据。大部分FL最终可转化为侵袭性淋巴瘤，其中Bcl-2蛋白过表达的FL常转变成DLBCL，因此在20%-30%的DLBCL中存在t（14；18）（q32;q21）染色体异常。BCL-2基因转录增强可使Bcl-2蛋白异53 新疆医科大学硕士学位论文常表达，Bcl-2在滤泡中心处活化后可阻止多种细胞毒性化疗药物所诱发的细胞凋【14】亡途径，从而使得肿瘤细胞凋亡受到抑制进而大量增殖，出现原发耐药。Bairey等用免疫组化法回顾性分析研究不同生存期的DLBCL患者，发现Bcl-2蛋白高表达和化疗耐药有关，Bcl-2蛋白阳性者生存期较短。BCL-6基因由于在弥漫大B细胞淋巴瘤中涉及到染色体3q27易位而得以克隆，也称LAZ-3或BCL-5基因，编码一个具有结构的POZ蛋白，其本质上属于一种转录抑制因子【23】。在正常淋巴组织中Bcl-6蛋白主要表达于生发中心B细胞和CD4阳性T淋巴细胞，促进淋巴细胞分化、增殖、控制生发中心的形成以及T淋巴细胞依赖的抗原反应。在生发中心形成后BCL-6基因表达发生下调，因此BCL-6基因不表达于记忆性B淋巴细胞、浆细胞、骨髓前体B淋巴细胞、边缘区及套区，故被认为是GC来源的B淋巴细胞的重要分子标志之一，也可以表达于GC来源的B细胞起源的淋巴瘤中。约【16】有30%-40%的DLBCL存在BCL-6基因易位重排。目前大量研究表明，BCL-6基因在NHL中呈好表达，且提示预后较好。美国一项III临床实验比较分析了BCL-6基因表达在199例DLBCL患者中生存预后【17-19】。在Bcl-6阴性组，R-CHOP方案治疗组与CHOP方案治疗组相比较，无病生存期（PFS）和总生存期（OS）明显延长（患者2年PFS为76%vs9%，患者2年OS为79%vs17%,P=0.0003）。在Bcl-6阳性组，患者分别使用R-CHOP方案和CHOP方案治疗，患者2年PFS和OS差异均无统计学意义。提示Bcl-6阳性患者未必能从利妥希单抗（美罗华）治疗中获益。C-myc基因是myc基因家族中一重要成员，其由三个外显子组成，其中第一个外显子是启动子，其不具有编码任何蛋白质的功能。全基因编码区位于第二、第三外显子上。蛋白质合成的起始信号位于第二外显子的起始端，c—myc基因含有两个启动子，相隔约160个bp，均位于非编码区【20】。C-myc基因位于8q24，其重排涉及三种染色体易位，其中最常见的为t(8；14)(q24；q32)，即C-myc基因从第8号染色体上断裂后易位到第14号染色体上，这种易位分离了位于第14号染色体上的IgH基因，使一些远端区域基因被移到8号染色体上。C-myc基因的断裂点一般位于第一编码区上游100Kb以上处，14号染色体断裂点在IgH基因的连接片上。染色体易位重排后的C-myc基因与IgH基因以5’端和5’端相接，即C-myc基因总是与免疫球蛋白恒定区相接。另外两种染色体改变相对少见，涉及t(2；8)(p12；q24)和t(8；22)(q24；qI1)易位。C-myc基因仍然在第8号染色体上，而免疫球蛋白轻链(Igκ、Ig入)的恒定区片段易位到这条染色体上，C-myc基因位置分别紧靠着κ链或入链和增强子元件区。C-myc基因重排后，导致C-myc基因过度表达，产物myc蛋白是一种具有α螺旋一环一α螺旋亮氨酸拉链结构的转录(bHLH-LZIP)因子，其可影响一些涉及细胞周期调控、凋亡、细胞生长和分化、细胞代谢和细胞黏附过程的转录，促使细胞增生及涉及细胞生长的一些基因的异常表达。C-myc基因重排是Burkitt淋巴瘤标志性的分子遗传学改变，54 新疆医科大学硕士学位论文约80％-90％的Burkitt淋巴瘤病例中存在t(8；14)染色体易位，但这并不是其所特有分子遗传学改变，约10％左右DLBCL病例中也存在这种分子遗传学改变，C-myc基因重排与DLBCL临床生物学特征之间的相关性尚存在争议，但大多数学者认为C-myc基因重排与不良预后有关。Akasaka【22】等通过RT-PCR法检测了203例DLBCL患者中C-myc基因表达后报道，C-myc基因阳性与阴性者2年总体生存率分别为37.2％与62.6％，二者差异具有统计学意义，但两者5年总体生存率（OS）差异无统计学意义。Offit【22】等认为t(8；14)易位者与具有其他核型异常者在生存期上无明显差异，另一方面，Au【21】等对9例8q24染色体易位者与61例具有其他染色体异常者比较后认为，存【21】在8q24染色体易位者预后更差。Ako等例研究发生t(8；14)易位的DLBCL病例后认为，生发中心来源与非生发中心来源者均可发生t(8；14)易位，但生发中心来源者发生率更高，两组患者的预后都比未发生易位者差。5问题与展望随着对DLBCL分类的不断完善，以及新技术的广泛应用，对DLBCL的诊断和治疗都进入了分子诊断和分子靶向药物治疗阶段。迄今已经发现并证实了一些具有临床意义的DLBCL分子遗传学改变，在DLBCL的诊断、鉴别诊断、治疗和预后判断上都发挥了重要作用。这些都将大大提高DLBCL的早期诊断率和病人的生命质量。但由于我国分子遗传学诊断技术尚未完全普及，以上大部分国外得出的分子遗传学诊断及预后判断标准，是否和我国DLBCL患者的实际情况一致，目前尚无定论。但是我们相信随着研究的不断深入，越来越多的分子遗传学改变及与预后的关系将会不断被发现，这将会极大的推动DLBCL的诊断和治疗水平，给DLBCL患者带来福音。55 新疆医科大学硕士学位论文参考文献[1].GaiterKC，WamkeRA．DiffuselargeB-celllymphoma.JaffeES，HarrisNL，SteinH，eta1．Worldhealthorganizationclassificationofturnouts：pathologyandgeneticsoftumoursofhaematopoietieandlymphoidtissues．Lyon：IARCPress，2001．[2].VenturaRA，Martin-SuberoJ，JonesM，eta1．FISHanalysisforthedetectionoflymphoma—associatedchromosomalabnomuditiesinroutineparaffin-embeddedtissue．JMolDiagn.2006.8.141-151．[3].YonetaniN，UedaC，AkasakaT，eta1．Heterogeneousbreakpointsontheimmunoglobulingenesareinvolvedinfusionwiththe5’regionofBcl-2inB-celltumor.JapJCancerRes,2001,92:933-940．[4].LiuYH，xuFP，ZhuangHG，eta1．ClinieopathologicsignificanceofimmunophenotypicprofilesrelatedtogerminalcenterandactivationB．ceUdifferentiationindiffuselargeB．celllymphomafromChinesepatients．HumPathol，2008，39：875-884．[5].赵兵，杨顺娥．非霍奇金淋巴瘤中C-myc与NntcB的表达．肿瘤防治研究，2010，37：1091-1093．[6].HansCP，WeisenburgerDD，GreinerTC。eta1．ConfirmationofthemolecularclassificationofdiffuselargeB．celllymphomabyimmunohistochemistryusingatissuemicmarray．Blood，2004，103：275-282．[7].SukjoongOh,DongHoeKoo,CheolwonSuh,etal.PrognosticValueofImmunohistochemicalBiomarkersatDifferentCut-offValuesinPatientswithDiffuseLargeB-cellLymphomaTreatedwithCHOPChemotherapy.JKoreanMedSci.2011;26(12):1556–1562..[8].LohrJG,StojanovP,LawrenceMS,etal.DiscoveryandprioritizationofsomaticmutationsindiffuselargeB-celllymphoma(DLBCL)bywhole-exomesequencing.ProcNatlAcadSciUSA.2012:6;109(10):3879–3884[9].AlizadehAA，EisenMB，DavisRE，etal.DistincttypesofdiffuselargeB-celllymphomaidentifiedbygeneexpressionProfiling.Nature.2000;403:503一511.[10].SilviaBea,AndreasZettl,GeorgeWright,etal.DiffuselargeB-celllymphomasubgroupshavedistinctgeneticprofilesthatinfluencetumorbiologyandimprovegene-expression-basedsurvivalprediction.Blood.2005,106(9):3183–3190.[11].AlizadehAA,GentlesAJ,AlencarAJ,etal.PredictionofsurvivalindiffuselargeB-celllymphomabasedontheexpressionof2genesreflectingtumorand56 新疆医科大学硕士学位论文microenvironment.Blood.2011,4;118(5):1350–1358.[12].KathyH.Y.Shair,NancyRaab-Traub.TranscriptomeChangesInducedbyEpstein-BarrVirusLMP1andLMP2AinTransgenicLymphocytesandLymphoma.mBio.2012Sep-Oct;3(5):e00288-12.[13].ZacharyL.Pratt,JingzhuZhang,BillSugden,etal.TheLatentMembraneProtein1(LMP1)OncogeneofEpstein-BarrVirusCanSimultaneouslyInduceandInhibitApoptosisinBCells.JVirol.2012;86(8):4380–4393.[14].EmilieZuercher,ChristopheButticaz,JosianeWyniger,etal.GeneticDiversityofEBV-EncodedLMP1intheSwissHIVCohortStudyandImplicationforNF-KbActivation.PLoSOne.2012;7(2):e32168.[15].桂瑞瑞，周健，张艳莉等。EB病毒感染与恶性血液病相关性研究。中华实验和临床感染病杂志，2012，6(3)：195-197.[16].刘俊茹,林曲,吴祥元.EB病毒潜伏膜蛋白LMP1基因C末端30bp缺失与非霍奇金淋巴瘤的关系.癌症,2005,(24)2:145-148.[17].KaterinaVrzalikova,MartinaVockerodt,SarahLeonard，etal.Down-regulationofBLIMP1αbytheEBVoncogene,LMP-1,disruptstheplasmacelldifferentiationprogramandpreventsviralreplicationinBcells:implicationsforthepathogenesisofEBV-associatedB-celllymphomas.Blood.2011June2;117(22):5907–5917.[18].KuiNie,TaotaoZhang,HatimAllawi,etal.EpigeneticDown-RegulationoftheTumorSuppressorGenePRDM1/Blimp-1inDiffuseLargeBCellLymphomasAPotentialRoleoftheMicroRNALet-7.AmJPathol2010,177:1470–1479;[19].MandelbaumJ,BhagatG,TangH,etal.BLIMP1isatumorsuppressorgenefrequentlydisruptedinactivatedBcelllikediffuselargeBcelllymphoma.CancerCell.2010December14;18(6):568–579[20].JonathanMandelbaum,GovindBhagat,HongyanTang,etal.BLIMP1isatumorsuppressorgenefrequentlydisruptedinactivatedBcelllikediffuselargeBcelllymphoma.CancerCell.2010,14;18(6):568–579.[21].LauraPasqualucci,VladimirTrifonov,GiuliaFabbri,etal.AnalysisoftheCodingGenomeofDiffuseLargeB-CellLymphoma.NatGenet.2011,31;43(9):830–837.[22].MANDELBAUMJ,BHAGATG,TANGH,etal.BLIMP1isatumorsuppressorgenefrequentlydisruptedinactivatedBcell-likediffuselargeBcelllymphoma.CancerCell,2010,18(6):568-579.57 新疆医科大学硕士学位论文攻读硕士学位期间发表的学术论文[1]王烨,陈熔,李新霞等.原发中枢神经系统弥漫大B细胞淋巴瘤临床病理、分子遗传学改变及与预后相关性研究[J].中华病理学杂志,2014,11(2):12-15.(待发表)58 新疆医科大学硕士学位论文个人简历王烨，男，30岁，汉族，于2003年9月至2008年7月就读于新疆医科大学口腔医学专业，取得口腔医学学士学位。于2008年9月至2014年5月就职于新疆医科大学厚博学院教学实验中心，病理学实验师。59
