《额尔齐斯河鳅科鱼类寄生虫病原分类及流行病学特点分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
分类号：Ｓ８化７３学校巧码：１０７５８％密级：公开学号：１巧６０２的５１ｉｆ發务Ｉ乂＃硕击学位论文额尔齐斯河織科鱼类寄生虫病原分类及流行病学特点分析ＡｎａｌｙｚｅＣｌａｓｓ；巧ｃａｔｉｏ凸ａｎｄＥｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｏｆＰａｒａｓｉｔｅｓｏｎＣｏｂｉｔｉｄａｅｉｎＩｒｔ化Ｒｉｖｅｒｙ巧究生姓名王京京枚巧导师姓名义职称岳城教授学位口类级别农学硕去专业名称预巧兽医学研黎方向水生动物病害巧治所在学院动物區学学院，新疆？乌鲁木齐二〇—六年六月记，知．．谋’＇＾－知；；＿．．：．：单 本文是“国家自然科学基金”项目《额尔齐斯河鱼类复口吸虫种类组成及种群生物学研究》（NO：31360644）、科技支疆项目《新疆主要土著经济鱼类病害防治关键技术开发》（NO:201191136）的部分成果研究课题主持人：岳城教授（新疆农业大学） 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得新疆农业大学或其他教育单位的学位或证书而使用过的材料一。与我同工作的同志对本研巧所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。、、研究生签名：＾或某、时间：Ｗｂ年（月＞１？日关于学位论文使用授权的说明本人完全了解新疆农业大学有关保留、使用学位论文的规定，目Ｐ：新疆农业大学有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子文档，可Ｗ采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，允许论文被查阅巧借阅。本人授权新疆农业大学将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可Ｗ公布（包括刊登）论文的全部或部分内容。（保密的学位论文在解密后应遵守此协议）、、＾？ｊ．７／会＞〇研究生签名：时间：年《月日Ｗ导师签名：：、时间之年＾月日 额尔齐斯河鳅科鱼类寄生虫病原分类及流行病学特点分析摘要于2009-2015年期间，在中国境内额尔齐斯河进行了10次采样，调查鳅科鱼类寄生虫分类组成及感染情况，结果显示共发现寄生虫8种：分别是筒形杯体虫（Apiosomacylindriformis）、车轮虫（Trichodinasp.）、指环虫（Dactylogyrussp.）、默氏复口吸虫（Diplostomummergi）、舌状绦虫（Ligulasp.）、毛细线虫（Capillariasp.）、福海泡吻棘头虫（Pomphorhynchusfuhaiensis）、鲤锚头鳋（Lernaeacyprinacea）。它们分别寄生于鳅科鱼类的体表、鳃、眼球、腹腔、肠道等部位，隶属于5门、6纲、7目、8科、8属。新疆高原鳅（Triphophysastrauchii）的采集量最大，感染寄生虫种类也最多为8种，说明新疆高原鳅具有一定的易感性。其中默氏复口吸虫（Diplostomummergi）为该区系的优势种，同时感染3种鳅科鱼类，在这3种鱼类种群中呈现较高的聚集度。新疆高原鳅6-8cm体长组默氏复口吸虫感染率最低为6.54%，10-12cm体长组感染率相对最高为80.39%，呈现聚集分布。ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列测定与GenBank中默氏复口吸虫（Diplostomummergi）和舌状绦虫（Ligulasp.）序列进行比对，其同源性分别是99.68%（1265/1269）、99.25%（790/796），确定为同一虫种。默氏复口吸虫（Dipolostmummergi）在我国首次报道，系中国新纪录种。并对两种虫种进行了系统发育学研究分析，上传序列获得2个GenBank登录号（KU821408，KU821409）。综上所述，通过对中国境内额尔齐斯河鳅科鱼类寄生虫组成分类及感染情况进行调查，分析了鳅科鱼类寄生虫的流行病学特点，并且对两种形态学难以鉴定种的寄生虫进行分子生物学鉴定，为疑难寄生虫鉴定提供了更准确的鉴定方法，为鳅科鱼类疾病防控提供科学资料。关键词：鳅科鱼类；寄生虫分类；种群生态学；分子系统发育；额尔齐斯河I AnalyzeClassificationandEpidemiologicalCharacteristicofParasitesonCobitidaeinIrtyshRiverAbstractWehavesurveyedtheclassificationidentificationandinfectionofparasitesonCobitideatentimesfrom2009to2015yearinIrtyshRiver.Theresultshowedthateightspeciesofparasiteswerefound:includingApiosomacylindriformis,Trichodinasp.,Dactylogyrussp.,Diplostomummergi,Ligulasp.,Capillariasp.,Pomphorhynchusfuhaiensis,Lernaeacyprinacea.Theydistributedonsurface,gill,eye,abdomina,bowelofCobitidea,whichbelongedto3genera,5families,8orders,8classes,8phyla.Triphophysastrauchiicollectedthelargestamount,infectionofparasitespeciesisalsoupto8,descriptionTriphophysastrauchiihasacertainsusceptibility.Diplostomummergiwasthedominantspeciesintheparasitecommunity.Infection3speciesofCobitideaandshowedahighdegreeofaggregationinCobitideapopulations.Infectionrateof6-8cmbodylengthofDiplostomummergireachedthelowest6.54%,thehighest80.39%andaggregateddistribution.DipolostmummergiisfirstdiscoveredinChina,isaChinesenewrecordspecies.ITS1-5.8S-ITS2rDNAsequencingofDiplostomummergiandLigulasp.havecomparedwithGenBankasthe99.68%(1265/1269),99.25%(790/796)severally,andbeendeterminedthesameparasite.Westudyedphylogeneticrelationshipsofthesetwospeciesanalysis,andtwoGenBankaccessionnumbers(KU821408,KU821409)wereobtained.Insummary,throughinvestigatedparasitesclassificationandinfectiononCobitideainIrtyshRiver(China),analyzesepidemiologycharacteristicandbyadoptingmolecularbiologytechniqueidentifiedthemorphologicaldifficulttoidentifytwospeciesofparasites,providedamoreaccurateidentificationoftheparasitesisdifficulttoidentify,andprovidedscientificinformationforCobitideadiseases.Keywords：Cobitidae;Parasitesclassification;Ecologycharacteristics;Molecularphylogeny;IrtyshRiverII 目录摘要...................................................................................................................IAbstract...............................................................................................................II第1章绪论.......................................................................................................11.1鳅科鱼类分类学的国内外研究进展..............................................................................................21.2额尔齐斯河的自然概况及鱼类资源..............................................................................................41.3我国鱼类寄生虫的研究情况..........................................................................................................71.4鱼类寄生虫的研究方法..................................................................................................................81.5研究目的及意义............................................................................................................................10第2章额尔齐斯河鳅科鱼类寄生虫分类研究及流行特点分析..................122.1材料与方法....................................................................................................................................122.2结果与分析....................................................................................................................................152.3讨论................................................................................................................................................24第3章额尔齐斯河鳅科鱼类默氏复口吸虫（Diplostomummergi）种群生态学研究.................................................................................................................273.1材料与方法....................................................................................................................................283.2结果与分析....................................................................................................................................293.3讨论................................................................................................................................................32第4章额尔齐斯河鳅科鱼类默氏复口吸虫（Diplostomummergi）分子鉴定及系统发育研究.................................................................................................354.1材料与方法....................................................................................................................................364.2结果与分析....................................................................................................................................384.3讨论................................................................................................................................................41第5章额尔齐斯河鳅科鱼类舌状绦虫分子（Ligulasp.）分子鉴定及系统学研究.....................................................................................................................435.1材料与方法....................................................................................................................................435.2结果与分析....................................................................................................................................48III 5.3讨论................................................................................................................................................51第6章结论.......................................................................................................53参考文献.............................................................................................................55附录Ⅰ常用试剂的配制.................................................................................55附录Ⅱ部分鱼（虫）体标本................................................................................................66致谢.................................................................................................................68作者简历.............................................................................................................69IV 插图和附表清单表2-1额尔齐斯河鳅科鱼类寄生虫的检查结果.......................................................15表3-1新疆高原鳅默氏复口吸虫的感染情况...........................................................29表3-2小体高原鳅默氏复口吸虫的感染情况...........................................................29表3-3北方花鳅默氏复口吸虫的感染情况..............................................................29表3-4默氏复口吸虫在新疆高原鳅不同体长组的感染情况......................................30表4-1PCR引物....................................................................................................37表4-2PCR反应体系.............................................................................................37表4-3复口吸虫的种类及序列信息........................................................................38表4-4ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列区域的遗传距离..................................................40表5-1PCR引物....................................................................................................46表5-2PCR反应体系.............................................................................................47表5-3绦虫的种类及序列信息...............................................................................47表5-4ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列区域的遗传距离..................................................50图2-1筒形杯体虫Apiosomacylindriformis.............................................................16图2-2车轮虫未定种Trichodinasp.........................................................................18图2-3指环虫未定种Dactylogyrussp......................................................................19图2-4默氏复口吸虫Diplostomummergi.................................................................20图2-5舌状绦虫裂头蚴Ligulasp............................................................................21图2-6毛细线虫Capillariidaesp.............................................................................22图2-7福海泡吻棘头虫Pomphorhynchusfuhaisis.....................................................23图2-8鲤锚头鳋Lernaeacyprinacea.......................................................................24图3-1不同体长组新疆高原鳅体内默氏复口吸虫的感染率和感染强度.....................31图3-2不同季节新疆高原鳅默氏复口吸虫的感染率和感染强度...............................31图3-3不同季节新疆高原鳅默复口吸虫的聚集度变化.............................................32图4-1默氏复口吸虫ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列电泳结果.......................................38图4-2默氏复口吸虫ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列比对结果........................................39图4-3基于ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列系统发育树（NJ树).....................................41图5-1舌状绦虫ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列电泳结果...............................................48图5-2舌状绦虫ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列比对结果...............................................49图5-3基于ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列系统发育树（NJ树).....................................50V 英文缩略词表英文缩写英文全称中文全称℃Centidegree摄氏度hHour小时cmCentimeter厘米mmMillimetre毫米sSecond秒rRNARibosomeRibonucleicacid核糖体核糖核酸ITSIntertranscriptionspacer内转录间隔区rDNARibosomeDeoxyribonucleicacid核糖体脱氧核糖核酸NCBINationalCenterfor美国国立生物技术BiotechnologyInformation信息中心PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应bpBasepair碱基对NJNeighborjointing邻接法pHPowerofhydrogen酸碱度LBLuria-BertanimediumLB培养基AmpAmpicillin氨苄青霉素EBEthidiumbromide溴化乙锭VI 第1章绪论[1]鳅科鱼类（Cobitidae）是鲤形目（Cypriniformes）鱼类中的第二大类群。在亚欧大陆、非洲等地均有种类分布，鳅科鱼类分布广泛，具有明显的区域性特征。我国是鳅[2]科鱼类数量多且分布十分广泛的国家，有18个属约100个种和亚种，占全部鳅科种类的半数以上，是世界上鳅科种类最多的国家。鳅科鱼类是一群小型底栖性的淡水鱼类，大多数被发现在河流和湖泊中，少部分生活于沼泽水域或静止水域中。它们的身体细长呈筒状，上面布满有各种规则性的花纹图案，头小。口小、下位，马蹄形。眼小，无眼下刺。须5-7对。鳞极其细小，圆形，埋于皮下。体背部及两侧灰褐色，头部、身体及各鳍上布有不规则的黑色斑点，背鳍和尾鳍膜上的斑点呈规则排列，尾柄基部有一明显的黑斑，其他各鳍灰白色。产卵期在5-6月，粘性卵。鳅科鱼类是杂食性淡水鱼类，以水生昆虫、附着藻类和甲壳类底栖动物为食物，白天通常潜伏在水底砂石中，善逃逸；夜间出来觅食，夜行性。鳅对溶氧量低的水体环境适应性强，因为它们可以通过自身的肠壁呼吸能力能够在低溶氧的水体里确保长时间生存。鳅科鱼类具有一定的经济价值，鳅分布在我国各地的河川、湖泊、小溪、水田、沟渠、池塘、及水库等天然水域中，尤其是在长江流域和珠江中下游区域，分布广泛、产量较高，这些鳅被野外捞捕或供人工养殖，并且天然野生鳅种的采捕也是人工养殖的来源之一。供养殖的鳅主要品种有大鳞副泥鳅（黄板鳅）、中华花鳅、长薄鳅、泥鳅、巨龙泥鳅和美国香鳅等，其中以泥鳅最为广泛养殖。鳅类自身具备有清洁功能。当泥鳅与其他鱼类混杂养殖时，它们的活动范围一般在水体的底部，则可以清理并吞食其他鱼类的代谢物、残渣剩饵，甚至能将水体变得清澈，因此泥鳅还被称为“池塘中的清洁工”[3]。此外，鳅类还具有丰富的营养价值，它们肉质细嫩、味道鲜美以及具备药用价值，不仅成为了一种餐桌文化，而且对人体健康方面有保健功效。其中，泥鳅常被作为药膳用来入药治病；大鳞副泥鳅（黄板鳅）富含优质的蛋白质，含有多种人体所需的必需氨基酸，而且多数常规鱼类的必需氨基酸含量远不及其所含，并在治疗人体所患皮肤病、[4]肝炎等方面有着辅助功效。鳅除了食用价值以外，在水中作为小型鱼类还是其它鱼类的饵料，完成了鱼类捕食食物链的完整性，保持着生态平衡。因此，鳅的存在具有一定1 重要性。1.1鳅科鱼类分类学的国内外研究进展1.1.1国外鳅科种类分类学的研究国外有关于鳅科鱼类的形态分类和生长繁殖等生物学特性的报道较多。FüsunErkakan和JunNakajima对鳅科鱼类形态学分类做了研究，其中FüsunErkakan主要对分布在土耳其的河流和湖泊的十种不同鳅科鱼类进行研究，根据采集到的鳅类样品来描述[5]其形态以及地理分布的特点，对土耳其的鳅类物种分类学的价值作出了宝贵的贡献；[6]JunNakajima对日本九州岛地区的鳅科鱼类进行调查研究，并发现部分鳅类新种；而[7]VinyolesA对分布于欧洲不同地区的鳅科鱼类的繁殖能力情况做出了一些分析研究。目前国外对于鳅科鱼类的系统发育、不同种群间的区别、物种的进化史以及鳅科鱼类的形态分类都有相关的报道与研究。M.Rabova利用rDNA生物探针荧光原位杂交的技术，针对欧洲鳅科鱼类花鳅属物种之间的杂交多倍体核型多样性进行测量识别，分析结果显示花鳅属物种之间的遗传生物多样性关系密切，并且推断其物种的演化，通过使[8]用带技术揭示了rDNA生物探针荧光杂交方法并得到了证实。DaeminKim对韩国濒危鳅科鱼类小沙鳅的线粒体细胞色素b基因和核基因进行基因序列分析，得出该物种具有[9]保守外部形态的同时仍有较高的遗传多样性，并提出了相应的物种保护措施。VasiljevV.和NalbantT.T.对部分鳅科鱼类的分类进行了分析描述，由于鳅科鱼类的形态特征多[10-11]样，他们认为很难对其进行区分鉴别，因此还需更深入的鉴定研究。1.1.2我国鳅科种类及其分类学研究有关我国鳅科鱼类的分类学研究，早在十九世纪初，法国人Dabry于1872年著述的《中国养鱼学和捕捞学》中详细描述了我国鱼类一些新物种，其中最早出现的大斑鳅（C.macrostigma）产于我国的中部湖泊，就是最初对我国鳅科鱼类分类的相关记述。此后SauvageandDabry于1874年著述的《中国淡水鱼类索引》中发表了产于四川西部的中华鳅（C.sinensis）。Berg将它作为C.taenia的一个亚种，Fowler甚至认为它是[12-13]C.taenia的同物异名；而Kreyenberg和Pappenheim认为分布于长江流域的所有鳅[14]类都是大斑鳅。但是CliffordH.Pope对分布于洞庭湖的鳅类进行研究时认同这两个物2 种，即中华鳅和大斑鳅的存在，其主要依据是大斑鳅具有长的尾柄，鳞片小，背鳍起点位于吻端之尾柄中部距离的中点。美国学者Nichols在对美国历史博物馆（AmericanMuseumofNaturalHistory）收藏的我国淡水鱼类标本进行整理时，记述了产于我国福建的一个新物种－长吻鳅[15]（C.dolichorhynchus）；1925年他又在“中国两种鳅属鱼类（ThetwoChineseloachesofthegenusCobitis）”中记录了产于我国山西清徐的一个新物种－花斑鳅[16]（C.melanoleuca），在此文中他将中华鳅和花斑鳅都作为欧洲C.taenia的亚种；1943年在《中国的淡水鱼类》中，他依据鳅属鱼类具有眼下刺和体色斑纹等特征，将Lin（林[17]书颜）描记的沙花鳅（C.arenae）由泥鳅属（Misgurnus）改归置鳅属。因此，该书记载了我国鳅科鱼类5个物种，即大斑鳅、花斑鳅、中华鳅、沙花鳅和长吻鳅。但是他的记述都过于简单，并没有对物种的鉴别特征给予详细的描述。同时，也没有包含瑞典人Rendahl于1935年发表的产于黑龙江兴凯湖的黑龙江鳅（C.lutheri）和额尔齐斯河的北[18]方鳅（C.granoei）。鳅科鱼类（Cobitidae）在我国分布广泛、资源丰富，它们的个体较小，形态上多变且差异很小，往往被忽视形态特征，故鳅科鱼类的鉴别分类比较困难。国内也已经有很多学者对鳅科进行了分类研究，陈景星通过一些外部形态特征以及内部解剖的结构为鉴别依据，曾对我国鳅科鱼类进行了较全面的分类整理研究，共确定有三个亚科：条鳅亚[2]科（Noemaeheilinae）、沙鳅亚科（Botinae）和花鳅亚科（Cobitinae）。朱松泉对中国[19]条鳅亚科鱼类的整理中，发现了三个新种，并分别对其形态特征进行分类。张春光对[20]北京地区鱼类区系进行分类研究，确定该地区的鳅科鱼类有8属10种和1个亚种。[21]何德奎对青藏高原的高原鳅属鱼类进行了分子系统发育和生物地理学的研究。郭晓芸[22]在青海省首次发现高原鳅属鱼类的新物种，并对其新物种命名进行。肖海对中国高原[23]鳅属的多样性以及地理分布进行研究概述。但鳅科鱼类的分类学研究并没有进一步的进展，大部分研究仅局限于分布在各个地区的鳅科鱼类的形态上进行描述。陈咏霞对我国鳅科鱼类分类学进行了整理，并且利用分子系统学对其进行研究分析，首先在鳅科鱼类形态学特征方面做了比较研究，研究认为两性异形和第二特征、体色斑纹图案的性状、口唇的位置及结构、是否具有眼下刺以及眼下刺的形状、鳞片的分布区域以及形状都是3 区别鳅科鱼类的主要特征；然后再结合分子系统学研究，对鳅科鱼类进行基因序列研究，[24]并整理鳅科鱼类的演化过程以及分类状况的研究。所以将传统形态学性状研究与分子系统学研究结合起来，是对鳅科鱼类分类较为理想的研究方式。1.2额尔齐斯河的自然概况及鱼类资源额尔齐斯河（IrtyshRiver）发源于阿尔泰山南麓，流经蒙古国、中国、哈萨克斯坦、俄罗斯这几个国家，最终汇入到北冰洋，与喀拉海交汇。额尔齐斯河全长4284km，在[25-26]中国境内河长633km，我国境内的河流是全河上游的一部分，中下游流入到哈萨克斯坦、俄罗斯境内。额尔齐斯河（中国段）是鄂毕河最大的支流，它的形成和地理位置都具有特殊性，是一条独特的河流。额尔齐斯河拥有充足的水量和肥沃的土壤，流经区域沿途秀美，有莽莽的草原和繁茂的森林，牧区沿河岸的两边，通过地表径流提供了大[27]量有机肥料，使得水质富含丰富营养物质，形成了繁杂的水文条件和优良的生态环境，使得额尔齐斯河孕育了许多与我国其他河流水系不同的独特鱼类优质资源。国外学者对额尔齐斯河鱼类的区系组成的研究情况较早，我国是在新中国成立之后开始涉及额尔齐斯河鱼类区系领域，起步较晚。任慕莲等对中国境内的额尔齐斯河流域的生态环境和鱼类物种资源进行了研究分析，并比较了额尔齐斯河在哈萨克斯坦境内和我国境内的鱼类资源组成。1999年到2000年，任慕莲等捕捞中国境内的额尔齐斯河流域中的5000余尾鱼类，进行剖检鉴定种类研究，结论得出在中国境内的额尔齐斯河鱼类共有35（亚）种，隶属于6目12科31属，其中土著鱼类有23种，杂交鱼类有1种，[25-26]移植鱼类有11种。1.2.1我国额尔齐斯河鳅科鱼类的分类学研究我国境内的额尔齐斯河流域存在的鳅科鱼类有4种：北方须鳅（Barbatulabarbatulanuda）、新疆高原鳅（Triphophysastrauchii）、小体高原鳅（Triplophysaminuta）和北方花鳅（Cobitisgranoei）。北方须鳅是北半球亚寒带地区的鱼类，喜清澈冷水、低温高氧的水域环境，多数产卵于水底的砂砾间，归属于北方山麓鱼类复合体；新疆高原鳅和小体高原鳅起源于第三纪上新世，由于中亚地区因喜马拉雅山脉的升高，开始形成于其北方海拔较高、气候非常严酷干燥、水流湍急的水域环境中，最后归属于冰川期4 的中亚高山鱼类复合体。北方花鳅起源于亚寒带平原地区，位于北半球北部，耐寒性极强，能够在冰彻透骨的溪流中生存并繁衍后代，常产卵于水底植物基体或砂石上，[25-26]归属于平原鱼类复合体。这4种鳅科鱼类拥有共同的特点：起源于气候寒冷的地区，主要栖息于清澈冷冽、[28]溶氧量足的水域环境中；它们属于夜行性鱼类，白天时常隐藏于水底的砂砾间，夜间出来觅食，单独或少数几尾出游活动，不集群，因此不易被发现与捕捞；受到惊扰时，反应十分迅速，易逃逸；但当水中溶氧量不足时，鳅科鱼类与生俱来的“肠壁功能”，可以直接吞吸空气，能够帮助自身存活在低氧水域中的时间延长；它们多摄食底栖无脊椎动物、颤蚓和摇蚊幼虫、浮游植物中的藻类以及植物碎屑等。1.2.1.1北方须鳅的生物学特性北方须鳅（Barbatulabarbatulanuda），隶属于鲤形目（Cypriniformes）鳅科（Cobitidae）条鳅亚科（Nemacheilinae)须鳅属（Barbatula）。曾用名：北方条鳅，董氏条鳅，阿勒泰须鳅。属于我国额尔齐斯河河流中常见的小型底栖淡水鱼类。此外，北方须鳅还在我国东北地区、内蒙古东部、河北北部的水系以及新疆的乌伦古河河流中均有广泛分布。它的身体呈细筒状，眼小，头扁。唇略厚，在上唇的中部有“V”字形裂缺，下唇在中间处断裂。须有3对，细鳞。有完整平直的侧线。身体背部为灰褐色；腹部为白色。有不规则的小斑点均分布于各鳍。它们的卵为粘性，产于水体底部的砂砾上，产卵期一般为5月上旬至6月中下旬。1.2.1.2新疆高原鳅的生物学特性新疆高原鳅（Triphophysastrauchii），隶属于鲤形目（Cypriniformes）鳅科（Cobitidae）条鳅亚科（Nemacheilinae）高原鳅属（Triplophysa）高原鳅亚属（Tripolophysa）。曾用名：黑斑高原鳅，黑斑条鳅；地方名：狗鱼。新疆高原鳅数量大分布广，多见于我国额尔齐斯河河流中。此外，新疆高原鳅在我国境内的伊犁河水系：伊犁河—巴尔喀什湖、额尔齐斯河水系：哈巴河的下游支流、额敏河水系：额敏河、斋桑泊、阿拉湖以及准葛尔盆地水系等均有广泛分布。它们的身体延长，头部隆起，背廓成弧状，胸腹部平直，前躯圆粗，尾柄细。头呈锥状，头宽明显大于头高。吻钝，吻长与眼后头长相等或略长。口下位，口裂呈浅弧状。上唇唇缘布有小乳突，下唇中沟深长，达峡部，唇面也布有粒5 状小乳突。下颌匙状，不突出唇外。须3对，较长，端吻须后延口角或超越口角；侧吻须位于眼下缘的下方；颌须后延达或超越眼后缘的下方。眼位于头的中部，侧上位。背及两侧为灰褐色或黄褐色，布有不规则的小黑斑，腹部浅黄色或浅灰色。背鳍和尾鳍布有较整齐而呈行的小斑纹，具有浑斑。产卵期为5-6月，产卵在石砾和植物茎上。1.2.1.3小体高原鳅的生物学特性小体高原鳅（Triplophysaminuta），隶属于鲤形目（Cypriniformes）鳅科（Cobitidae）条鳅亚科（Nemacheilinae）高原鳅属（Triplophysa）赫氏鳅亚属（Hedinichthys）。体略长，胴部粗圆，后部侧扁状。头似三角形，平扁，头宽大于头高。吻长小于眼后头长，约与眼间距相等。两眼间平坦，眼圆形，侧上位。口下位，弧形，上唇狭、下唇中断，两侧呈“八”字状的乳突，上宽下窄。下颌匙状。须3对，前吻须后延超过口角，后吻须后延达眼后缘的下方；角须后延达主鳃盖骨的前缘，其长度基本与后吻须等长。无鳞，体表光滑。体为灰褐色，背及两侧上方各有一条小黑点组成的黑纹，腹部白色。背鳍和尾鳍上有小黑点组成的横纹；胸鳍和腹鳍色暗淡。产卵期为6月中下旬，在植物基体上。1966年李思忠教授首次在新疆的鄯善、博乐、精河、温泉、米泉、乌鲁木齐等水域中发现小体高原鳅，当时定名为小体条鳅（N.minutus）。后来朱松泉研究员在《中国条鳅志》中将小体高原鳅归为高原鳅属，即赫氏鳅亚属（T.Hedinichthyminutus），并记录了托克逊也有分布。李思忠教授将其定位特有种在新疆准格尔区。小体高原鳅的分布范围随着额尔齐斯河的出现，向北推进，成为准格尔区和额尔齐斯河区的共有种。小体高[25]原鳅是我国境内额尔齐斯河的新纪录。1.2.1.4北方花鳅的生物学特性北方花鳅（Cobitisgranoei），隶属于鲤形目（Cypriniformes）鳅科（Cobitidae）条鳅亚科（Nemacheilinae）花鳅属（Cobitis）。曾用名：西伯利亚花鳅。北方花鳅的分布较广，俄罗斯境内的鄂毕河、叶尼塞河、勒拿河，我国境内的黑龙江、额尔齐斯河、乌伦古河、黄河上游、滦河上游等水域均有分布。体细长较侧扁，体高为体厚近1.6倍。头小、侧扁，头的腹面较平，而上部自顶骨起即向前倾斜呈斜坡状。口小，下位。上唇游离，下唇中部左右分开，唇叶较肥大，呈穗状。眼小，侧上位，两眼间微隆起。须3对，较长，前吻须后延达下唇叶的后缘；后吻须与口角须位于眼前缘的下方。体被细鳞，6 侧线位于中部，微弱完整。体色：背及体侧为黄灰色；腹部为灰白色。尾柄基部上下方各有一条状黑斑。背鳍和尾鳍均有6-7条由黑褐色斑点组成的条纹，其他鳍为白色透明。产卵期为6月份，繁殖力较低，分两批产出。1.3我国鱼类寄生虫的研究情况1.3.1我国鱼类病害学研究进展我国养鱼的历史非常悠久，据考证早在公元前1200年前，就有对我国鱼类寄生虫的发现与寄生虫对鱼类危害的记载，很早就引起了人们对其的注意。宋代的苏轼在《物类相感志》中曾记载：“鱼生白点名虱，用枫杨树皮投掷于水中则愈”。文中所谓的“虱”并不一定就是现在的“鲺”。由于过于简单的记载，无法断定是什么鱼类寄生虫病，但可以确定人们在那时开始注意寄生虫对鱼类的危害。此后，有关的记载日益增多。明代的徐光启曾在《农致全书》中记载：“池瘦伤，令鱼生虱”“鱼虱如小豆大，似团鱼”。这里对鱼虱的描述，我们认为就是鲺。此记载比国外的研究提早了整整半个世纪。而由于当时我国的科技水平落后，技术不够发达等原因，直到解放前关于我国鱼类寄生虫的研究仍然停滞不前。解放后，我国逐渐开始对鱼类寄生虫病研究有了重视，寄生在草鱼鳃部的鳃隐鞭虫病是解放后最早开始研究的，倪达书发现了草鱼种死亡原因并且在短期[29]内找到了有效防治措施。此后发现了很多种类的原生动物都能引起鱼病。此外，倪达书等人也对小瓜虫也做了有关研究，发现小瓜虫不好控制和预防，并且第一次观察到幼[30]虫时期的小瓜虫具有尾毛结构。在此期间，陈启鎏、王耕南和尹文英对我国寄生鱼类[31-36]的原生动物及甲壳动物的分类做了大量的调查研究，取得了很大的研究进展。接下来，在各个省份开展了单殖吸虫的调查研究，郎所先后对太湖鱼类的蠕虫类的[37-39]复殖吸虫发现新种记录并做了相关研究。廖翔华等对九江头槽绦虫病做了最早的研[40-41]究，并对其病原的生活史、形态、病理及防治方法做了详细的研究。之后潘金培对[42][43][44]复口吸虫病做了调查研究，左文功对粘孢子虫病、唐仲璋对血居吸虫病等进行了研究。我国开展了鱼病病原区系普查，发现了许多单殖吸虫、粘孢子虫以及复殖吸虫的虫种新纪录。近些年来，汪溥钦发表了大量有关我国鱼类寄生虫的新资料，做出了很[45-49]大的贡献。7 1.3.2额尔齐斯河鱼类的病害研究现状鳅科鱼类不仅分布于我国额尔齐斯河流域，还分布于我国其他水系甚至为全世界性分布。随着我国养殖渔业的蓬勃发展，鳅的利用价值也逐渐提高，许多当地居民也开始鳅类的养殖，同时在自身病害方面也越来越受到重视。鳅作为额尔齐斯河流域的底栖鱼类，自身在繁殖发育存活的同时，也是其它鱼类的饵料，从而能够维持水体生态平衡。倘若鳅感染寄生虫后被其它鱼类所食，会造成病原传播的风险，这些食用鳅的鱼类就会感染寄生虫，进一步造成健康鱼类的危害。2009-2011年期间，岳城等人针对我国额尔齐斯河的不同鱼类寄生虫区系组成情况进行调查研究，赵江山：白斑狗鱼和高体雅罗鱼[50-51][52][53][54][55]；焦丽：东方欧鳊；郝翠兰：白斑狗鱼；汪博良：银鲫；张晓玲：鲤鱼；[56][57][58-59]苗晶晶：高体雅罗鱼；王新：湖拟鲤；贾舒安：河鲈等。然而，对于额尔齐斯河流域的鳅科鱼类寄生虫学方面的研究报道甚少，病害学方面更是无人关注。鳅科鱼类虽为小型鱼类，分布于额尔齐斯河的数量不多但作为新疆的特有土著鱼类，是其它鱼类的饵料也是生物多样性中的一员，从病害传播以及生态平衡角度的方面必须加以保护。随着科技水平的发展，很多检查技术和方法不断更新，推动了我国鱼类寄生虫及寄生虫病的研究进展，前人做了大量的区系研究奠定了鱼病寄生虫调查的基础，对鱼病流行病学具有很重要的影响意义，为鱼类流行病的控制提供了有益的科学参考。1.4鱼类寄生虫的研究方法通常鱼类寄生虫对宿主所造成的危害是缓慢持续、具有继发性的，而微生物对宿主造成的病害暴发迅猛，因此对鱼类寄生虫的研究不易被高度关注，然而当寄生虫严重感[60]染时，则将造成鱼类大量死亡的危害。因此，要首先了解并熟悉鱼类寄生虫的分类地位、生活史、虫体形态以及内部结构，早期对病原进行准确的诊断，从而可以提前制定和实施对鱼类疾病必要的防治方法与措施。目前针对鱼类寄生虫的主要研究有三个方面：初步肉眼观察、显微镜下观察以及分子生物学的研究，近年来，随着生物技术在科学发展中广泛的应用，分子生物学方法是兴起的研究手段。通过结合分子生物学技术对鱼病的诊断和寄生虫的鉴定方面，很好地推动了鱼类寄生虫研究的发展，有着很重要的意义。8 1.4.1肉眼观察法通过我们的肉眼，只能观察到一些鱼体表面、鳃部以及内脏表面上的体型较大可见虫体，在显微镜发明以前，主要研究集中这些可见虫体上。通过描述虫体的外观形态以及引起宿主的各类疾病特征，从而对宿主感染的不同虫体进行区别。肉眼观察是初步对鱼类寄生虫分类研究的一种非常重要的方法，借助肉眼观察的方法来区分很多虫体不同的种类。双身虫属于单殖吸虫纲，大多寄生于淡水鱼类的鳃部，剖检鱼类将鳃取出时，[61]用肉眼便可观察到鳃片上寄生的双身虫，虫体较大，呈X型。舌状绦虫属于绦虫纲，为鱼类常见的寄生虫，寄生于鱼类的腹腔，当剖检鱼腹时，肉眼可观察到活的虫体会从[62]腹腔中钻出，虫体为白色，呈面条状。通过肉眼观察对这些较大虫体的判断，为形态分类提供了依据。1.4.2显微镜观察法显微镜的发明将一个全新微观世界展现在人类的视野中，寄生虫研究在显微镜的技术下，虫种新纪录不断被发现，推动了寄生虫学的发展，同时也是实验寄生虫学研究与发展的基础。在寄生虫生活史方面的研究也不断深入，对其不同的发育时期在宿主体内[63]的发育状况有了更全面的认识，从而为寄生虫病的防治提供了更科学的依据。李明等剖检彭泽鲫后，对其鳃部病理组织进行的光镜及投射电镜观察中发现，杯体虫寄生了彭泽鲫鳃之后，发现鳃部红肿炎症，鳃丝分泌的黏液增多，造成了明显的机械性损伤，人们通过显微镜的应用对鱼类的研究，发展到了组织细胞领域水平，从而对寄生虫的致病[64]机理，有了更加全新深入的了解和认识。谢炎福总结了利用显微镜技术对鱼类外寄生虫病的快速诊断以及在预防治疗方面有很大的帮助，通过显微镜来鉴定寄生虫的种类，描述其主要形态特征，并且区分寄生虫与其他水体中的生物进行比较研究。1.4.3分子生物学方法防治寄生虫病的有效手段是对寄生虫病病原进行早期发现和诊断，随着分子生物学的不断发展，其在寄生虫病方面的研究与应用也不断深入，为水产养殖过程中鱼类寄生虫疾病的早期发现、诊断、预防免疫、治疗以及科学规模化养殖提供了重要依据，并且[65]发挥了重要的作用。1953年，DNA双螺旋体的发现意味着分子生物学诞生的时代来[66]临。分子生物学是从分子水平上探索研究生命物质现象基础的一门学科，主要研究生9 物碱基的排序以及蛋白质氨基酸的排序之间的关系，如何对四种碱基进行排列组合，编[67]码后使得基因表达。分子生物学的发展使许多古老生命学科获得新生，成为一个研究的新领域，推动了鱼类寄生虫疾病的研究以及寄生虫分类的发展。目前通用的分子检索指标为有转录活性以及中等重复的rDNA（核糖体DNA）基因，聚集在多数动物中染色体的核仁形成区，一般在20kb以上，其包括三个区域，分别具有不同进化速率，相邻的两个重复单位被NTS隔开，转录区（Transcribedspacer，TS）和非转录区（Nontranscribedspacer，NTS）构成了rDNA的重复单位，也称为基因间隔区（Intergenicspacer，IGS）构成。其中进化速率较慢的是18S、5.8S和大部分的28S[68]序列，而ITS1，ITS2，ETS和28S序列进化速率是较快的。由于保守区和高变区在rDNA基因中是交替分布的，因此在用于分析远近不同的亲缘关系的生物特征时，就具[69]有良好的优越性。近几年来，采用分子生物学方法来研究鱼类寄生虫的系统发育时，会选取ITS1和ITS2为靶基因。ITS1序列（核糖体内转录间隔区）在非编码区，它是在rDNA（核糖体DNA）18S和5.8S的中间，相对来讲其进化速度极快，具有很多丰富的核苷酸信息位点[70]和变异位点，适合物种及种群间水平方向的系统发育研究。利用ITS1和ITS2为靶基因序列为属内亲缘之间或种内群体之间的比较相互关系，提供了非常有效的分子标记技术方法，对于寄生中的分类和种类鉴别具有重要意义。选取目的基因后设计引物，利用PCR扩增DNA目的片段后进行测序，获得目标生物类群的DNA序列，确立同源分子之间位点的同源关系就是基因序列比对的过程，通过观测所分析的序列中的一个特定位点，两两比对分析是否由同一个祖先进化而来。目[71]前比对分析序列可通过DNAMAN、MEGA、BioEdit软件来完成。利用构建进化树来进行系统发育分析，采用的主要方法主要有最大简约法、距离法和最大似然法，通过利用MEGA软件来完成系统发育建树。1.5研究目的及意义近几年来，鱼类寄生虫的调查研究主要集中在我国的中部和东南部地区，相对北方的调查就较少，尤其是对新疆地区的鱼类寄生虫区系的调查研究只是刚开始进行。因此，10 对新疆地区的鱼类寄生虫进行调查研究意义重大。额尔齐斯河流域具有得天独厚的地理位置，并且孕育了其独特的鱼类区系，分布在额尔齐斯河流域内的土著鱼类为极具有开发价值，受到广泛的关注。目前，随着额尔齐斯河淡水鱼渔业经济的日益发展，鱼类的开发、大规模养殖已成为新疆水产业主要的发展方向。4种鳅科鱼类的养殖开发也逐渐成为额尔齐斯河水域经济发展不可或缺的一部分。它们主要分布于欧洲和亚洲的众多河流中，在中国境内的额尔齐斯河分布较广，偶见当地居民钩捕食用，部分鳅科鱼类的寄生虫种类也与欧洲及亚洲的其他水系较为相似，同时也会引起交叉感染。鳅科鱼类虽为小型鱼类，在中国境内的额尔齐斯河的数量不多但作为新疆的特有土著鱼类，具有一定的经济价值，也是生物多样性中的一员，必须加以保护。在额尔齐斯河鳅科鱼类的生物[25-26]学特性、分类学等已有过零散报道，但对其寄生虫的区系及感染情况未进行过详细研究。本文研究具有生态学和经济价值两个方面的重要意义，利用常规的鱼类寄生虫的调查及研究方法，对中国境内额尔齐斯河水域中的鳅科鱼类寄生虫种类的组成、感染情况以及种群动态分布特点进行调查研究，并且采取结合形态学特征描述和分子生物学方法对其寄生虫的种类进行虫种分类及鉴定，填补了中国境内额尔齐斯河的鳅科鱼类寄生虫研究方面的空白，对鳅科鱼类寄生虫疾病防治积累资料。11 第2章额尔齐斯河鳅科鱼类寄生虫分类研究及流行特点分析额尔齐斯河（IrtyshRiver）发源于我国阿尔泰山，流经哈萨克斯坦，在俄罗斯境内汇入鄂毕河，大支流，最终注入北冰洋，全长4284km。额尔齐斯河孕育了丰厚的鱼类资源，这与该河的特殊地理位置以及丰富的下游水域环境的关系密不可分。任慕莲等人对中国境内的额尔齐斯河鱼类资源进行调查，现有的鱼类共有35（亚）种，土著鱼类就[25]有23（亚）种，其中包括4种鳅科鱼类，分别为：北方须鳅（Barbatulabarbatulanuda）、新疆高原鳅（Triphophysastrauchii）、小体高原鳅（Triplophysaminuta）和北方花鳅（Cobitisgranoei）。鳅科是一种小型底栖淡水鱼类，种类十分丰富，共有三个亚科：沙鳅亚科（Botinae）、花鳅亚科（Cobitinae）和条鳅亚科（Noemaeheilinae），在我国有18个属，约100个种，种类丰富，超过全部鳅科种类的半数，我国是世界上拥有鳅科种类最多的[72]国家。它们肉质鲜美，具有极高营养价值的同时也具有药用价值，人们不仅食用鳅，而且还以其为药膳用来治病、强身健体，治疗效果佳。目前，随着额尔齐斯河淡水鱼渔业经济的日益发展，四种鳅科鱼类的养殖开发也逐渐成为额尔齐斯河流域经济发展的重要组成部分。它们主要分布于欧洲和亚洲的众多河流中，在我国额尔齐斯河分布较广，偶见当地居民钩捕食用，部分鳅科鱼类的寄生虫种类也与欧洲及亚洲的其他水系较为相似，同时鳅科鱼类为小型鱼类被其他大中型鱼类为食，造成寄生虫病的传播危害，也会引起交叉感染。在额尔齐斯河鳅科鱼类的生物学特[25-26]性、分类学等已有过零散报道，但对其寄生虫的区系及感染情况未见详细研究。综上所述，对额尔齐斯河鳅科鱼类寄生虫进行调查研究，阐明额尔齐斯河鳅科鱼类寄生虫种类组成及流行病学情况，不仅有利于额尔齐斯河流域生态的平衡以及水产养殖的健康发展，而且还为额尔齐斯河鳅科鱼类寄生虫疾病防治及鱼类寄生虫学研究积累资料。2.1材料与方法2.1.1实验材料2.1.1.1实验鱼12 根据额尔齐斯河的流域及季节特性，于2009年4月至2015年9月在额尔齐斯河（中国段）3个随机采样地点（北屯市、哈巴河县、185团场）进行采样调查。共采集剖检鳅科鱼类337尾，北方须鳅24尾，新疆高原鳅279尾，小体高原鳅3尾，北方花鳅31尾。2.1.1.2试剂、仪器及用具试剂：0.8%生理盐水、75%无水乙醇、苏木素、系列梯度无水乙醇、酸酒精、二甲苯、中性树胶。仪器：解剖镜、数码摄像显微镜、普通生物显微镜、数码相机。用具：玻璃板、解剖盘、挑虫针、解剖刀、手术剪、手术镊、放大镜、载玻片、盖玻片、培养皿、记录本、标签纸、标本瓶、离心管等。2.1.2方法捕获的鳅科鱼类需在新鲜时剖检并检查寄生虫，且不宜超过24小时。对鳅科鱼类[73]的鉴定以《中国鱼类系统检索》和《中国额额尔齐斯河鱼类资源及渔业》为主要依据。[74]寄生虫的采集、保存、分类及制作标本等工作均参照《鱼病调查手册（第二版）》，[75-81]寄生虫的形态学鉴定工作依据相关参考文献，在显微镜和解剖镜下完成。2.1.2.1测量编号将鳅科鱼类平放于解剖盘中，编号并拍照，然后用铁皮卷尺测量鱼体的体高和尾叉长，并记录数据。2.1.2.2寄生虫采集（1）体表首先肉眼观察鱼体表是否有可见虫体或病变异样的地方，后用解剖刀刮取体表、鳍条和鱼尾上的粘液，分别置于载玻片上镜下观察。若有可见虫体，用挑虫针将完整的寄生虫从寄生部位轻轻剥离取出，采集的虫体暂时放置于生理盐水中。此检查法依次分别检查鼻腔、口腔、鳃片。（2）眼球用小型手术剪和弯钩镊子摘取鱼体的左右眼球，完整取出置于玻璃板，用另一块玻璃板覆盖轻压，在解剖镜下检查眼球内的寄生虫，发现后用挑虫针剥离出寄生虫。13 （3）鳃先完整取出左右的鳃粑放置于平皿，观察鱼鳃的色泽，再观察是否有可见虫体，用小型手术剪分别剪开鳃片，置于玻璃板上，滴入少量生理盐水，保持湿润。在解剖镜下检查。（4）内脏和组织器官剖开鱼腹，露出体腔中的器官，肉眼观察是否有可见寄生虫及病变，用手术剪和手术镊取出完整的内脏器官，分别对心、肝、脾、肾、肠、胃等各个器官进行检查。然后用手术剪剪开肠道管腔，用手术刀轻轻刮下肠壁上的粘液，镜检；用手术剪剪碎实质性器官，用玻璃板压片，镜检。2.1.2.3寄生虫标本的制作（1）原生动物如杯体虫、车轮虫，将粘液涂抹在玻片上，抹得越薄越好，在空气中干燥后，再用硝酸银染色，在显微镜下观察其内部结构特征，如杯体虫的口围盘、车轮虫的齿体等，测量并绘出寄生虫形态学特征图。（2）单殖吸虫（小型）和甲壳动物如指环虫和甲壳动物，将虫体从75%的固定酒精中取出，用聚乙烯醇染色液进行染色，封片，玻片晾干后在显微镜下测量虫体全长及特有的几丁质结构。（3）复殖吸虫（小型）和棘头虫如复口吸虫和棘头虫，复口吸虫在采集的过程中，直接压片，在显微镜下观察并拍照。棘头虫虫体为黄色，需用酒精溶液脱色后，通过复水，苏木素或盐酸卡红染色，梯度浓度酒精脱水，酸酒精脱色，高浓度梯度酒精脱水，用二甲苯透明后，中性树胶封片。（4）绦虫将绦虫从75%的固定酒精中取出，置于高浓度梯度酒精中进行脱水，二甲苯透明，浸蜡和包埋，切片和展片，染色和封片，制作石蜡切片，在显微镜下观察其内部结构特征。（5）线虫线虫无需染色，取出虫体后放入盛有加热的酒精烧杯中烫直，待酒精冷却后，保存14 于70%酒精中或5-10%的甘油酒精中。用聚乙烯醇染色后，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察虫体内部的几丁质结构。2.1.2.4统计寄生虫感染情况的统计术语，如感染率（InfectionRates）、平均感染强度（MeanIntensity）、平均丰度（Meanabundance）以及优势度指数（Berger-Parker）等参考Bush[82]等的定义。寄生虫在宿主体内的频率分布情况，通过方差与平均数之比（S²/X）来判断。数据统计用EXCEL2013软件完成。2.2结果与分析2.2.1额尔齐斯河鳅科鱼类寄生虫的调查结果额尔齐斯河4种鳅科鱼类共发现寄生虫8种，分别是：筒形杯体虫（Apiosomacylindriformis）、车轮虫（Trichodinasp.）、指环虫（Dactylogyrussp.）、默氏复口吸虫（Diplostomummergi）、舌状绦虫（Ligulasp.）、毛细线虫（Capillariasp.）、福海泡吻棘头虫（Pomphorhynchusfuhaiensis）、鲤锚头鳋（Lernaeacyprinacea）。隶属于5门、6纲、7目、8科、8属。寄生虫的宿主、寄生部位及感染情况见表2-1。表2-1额尔齐斯河鳅科鱼类寄生虫的检查结果Tab.2-1InvestigationoftheparasitesofCobitidaeinIrtyshRiver寄生虫寄生采集感染感染平均感染平均感染方均比宿主2种类部位尾数尾数率%强度丰度S/X体表筒形杯体虫新疆高原鳅27910.35＋--鳃车轮虫新疆高原鳅鳃27962.15＋＋--新疆高原鳅27920.711±0.0840.01±0.080.996指环虫鳃小体高原鳅3133.331±0.5770.33±0.581新疆高原鳅27910437.2744.86±40.7116.72±40.7199.14默氏复口吸小体高原鳅眼3266.6724±21.1716±21.1728虫北方花鳅26311.531.67±0.630.19±0.632.09新疆高原鳅腹腔27920.711±0.080.01±0.080.99舌状绦虫北方花鳅2627.691±0.270.08±0.270.96新疆高原鳅279134.652.54±0.480.12±0.482.67毛细线虫肠道北方须鳅2414.164±0.820.17±0.824福海泡吻棘新疆高原鳅肠道27910.351±0.060.003±0.061头虫鲤锚头鳋新疆高原鳅体表27941.433±0.4050.04±0.414.58注：“-”表示未发现虫体，“-”meansnofound；15 2.2.2额尔齐斯河鳅科鱼类寄生虫名录原生动物门Protozoa动基片纲KinetofragminophoreadePuytoracetal,1974缘毛目PeritrichidaStein,1859累枝科EpistylididaeKahl,1933杯体虫属ApiosomaBlanchard,1885虫体具有含弹性纤维的柄，或具有附着盘。身体充分伸展时呈杯状，口缘围绕明显的围口盘，围口盘内有镰刀状的口沟。前端粗，向后变窄，呈漏斗状。杯体虫属在我国[83]淡水鱼类上为常见。2.2.2.1筒形杯体虫Apiosomacylindriformis寄生部位：体表、鳃丝；采样时间：2012年7月；采样地点：哈巴河；形态描述：虫体充分伸展时如漏斗状或杯状。前端有1个圆盘形的口围盘。口围盘四周有3层口缘膜结构。由纤毛构成缘膜，不连续成片。尚有1个左转的口沟在口围盘内，尾端与前庭相连。前庭不接胞咽。在体中部以下，有1个椭圆形的大核。细长棒状的小核在大核旁。在前庭附近有1个伸缩泡。有一具有弹性纤维丝的附着盘位于体后端。体表有细致横纹。虫体标本测定：体长：65.2μm；体宽：32.0μm；大核长：15.2μm；宽：8.4μm；小核长：2.2μm；宽：0.8μm。如图2-1。A.口缘膜；B.口围盘；C.前腔和包咽；D.伸缩泡；E.食物粒；F.纤毛带；G.大核；H.小核；I.附着器图2-1筒形杯体虫Apiosoma.cylindriformisFig.2-1Apiosoma.cylindriformis16 原生动物门SubkingdomProtozoa纤毛虫亚门Ciliophora寡膜纤毛纲OligohymenophoreadePuytorac,1974缘毛目PeritrichidaStein,1859壶形科UrceolariidaeF.Stein,1867车轮虫属TrichodinaEhrenbeag,1838虫体具有明显的口缘纤毛区，覆盖体顶端并进入前腔。通常将侧口膜和口缘膜称为“单运动体”和“多动体列”。在前腔中为“笔毛”。口形成为口动体型。普生种。大多种类具柄和行固着生活。常见粘囊和膜孔；柄或身体的部分具有很强伸缩力的肌原纤维联系着。生殖方式为小接合子与大接合子的营结合生殖。常寄生于鱼类的体表和鳃部。2.2.2.2车轮虫未定种Trichodinasp.寄生部位：鳃；采样时间：2014年7月；采样地点：哈巴河；形态描述：虫体大，整个齿体锥部重叠相压，齿钩端部呈刀刃状，基部膨大突出，与较大的锥部相连构成“驼峰状”外形。齿棘细长，长度大于齿钩，似三角形。标本测量数据为：身体直径：85.3μm；附着盘直径：70.2μm；齿环直径：48.0μm；齿体个数：25个；齿钩长：2.4μm；齿棘长：4.7μm。如图2-2。A.全图；B.齿体图2-2车轮虫Trichodinasp.Fig.2-2Trichodinasp.17 扁形动物门Platyhelminthes单殖吸虫亚纲Monogenea多钩亚纲PolyonchoineaBychowsky,1937指环虫目DactylogyridaeBychowsky,1937指环虫目DactylogyrineaBychowsky,1937指环虫科DactylogyridaeBychowsky,1933指环虫属DactylogyusDiesing,1850指环虫属为小型单殖吸虫，长不足2毫米，具有1-3对头器和2对眼点在体前端。一些虫种为分散的色素颗粒或无。具咽，2条肠支在伸至体末端交汇形成圈状，个别种类末端为盲支，无侧突。身体后部具有一个由不同形状的几丁质固着器组成的固着盘，固着盘具有强大的锚钩及发育完全的边缘小钩，联结棒分为背腹两部分。单个睾丸，呈圆形或椭圆形，位于体后端，卵巢之后。单个卵巢，在睾丸之前，球形，略有弯曲，卵黄腺发达，分布于体前端至体后端。2.2.2.3指环虫未定种Dactylogyrussp.寄生部位：鳃丝；采样时间：2011年8月、2014年7月；采样地点：哈巴河；形态描述：小型蠕虫，虫体长0.30-0.46mm，宽0.081-0.119mm。边缘小钩有三个部分：柄、柄轴及钩尖基突。后吸器有联结片。边缘小钩长0.016-0.028mm。中央大钩，全长0.029-0.034mm，基部长0.029-0.031mm，外突约0.003-0.007mm，内突长为0.007-0.009mm，钩尖长0.006-0.009mm。联结片呈“V”形，细长，两端略向后弯，其大小为0.002-0.008×0.019-0.030mm。交接器全长为0.019-0.039mm，支持器长为0.017-0.029mm，交接管大小为0.017-0.035×0.002-0.004mm。如图2-3。18 A.全图；B.交接器；C.后吸器图2-3指环虫Dactylogyrussp.Fig.2-3Dactylogyrussp.复殖吸虫纲Trematoda复殖吸虫亚纲Digenea鹗形目Strigeidida复口科DiplostomidaePoirier,1886复口吸虫属DiplostomumVonNordmann,1832虫体通常分透明的前后两部分。前体呈匙形、叶片状。假吸盘，有或无，圆形或椭圆形的粗大粘器。有密集的腺体在其下。后体具咽和口吸盘，呈圆柱形，食道短，肠支末端到达或近体后端。阴茎囊缺失。睾丸并列或纵列于体后。通常具有生殖腔与交配囊，开口于背端或亚背端。卵巢位于睾丸之前，具有劳氏管。卵黄腺滤泡分布在身体的两个区域，具有不同程度的变化，在前、后体或大部分在前体或后体。排泄囊，呈椭圆形，排泄系统开口于腹端，外周呈网状。本属的囊蚴寄生于鱼类或两栖类的眼球内，成虫寄生于鸟类和哺乳类的肠中。2.2.2.4默氏复口吸虫Diplostomummergi寄生部位：眼球；采样时间：2009年9月、2010年1月、2010年7月、2011年8月、2012年7月和2014年7月；采样地点：北屯、哈巴河；19 形态描述：虫体透明颜色较浅，活体标本，身体明显分为前后两部分，后体在前体的背面；虫体固定后，后体常缩入前体内。虫体呈椭圆形，前部两侧分布有腺体，口吸盘位于顶端，略小呈半椭圆形。前咽较短，咽肌质发达而呈长卵形，食道较短，肠支伸大后体末端。腹吸盘呈圆形或椭圆形，大于口吸盘，位于虫体中部略后。腹吸盘下方具有较大呈椭圆形的粘附器，其中央有分枝状裂缝的腔，开口于虫体腹面。排泄囊位于虫体后端，虫体内部不均匀分布一些折光性很强的石灰质体。虫体的大小：体长0.315mm，体宽0.185mm；口吸盘长0.037mm，宽0.029mm；咽长0.042mm，宽0.013mm；腹吸盘长0.045mm，宽0.074mm；粘附器长0.095mm，宽0.114mm。如图2-4。图2-4默氏复口吸虫DiplostomummergiFig.2-4Diplostomummergi绦虫纲Cestoidea假叶目PseudophyllideaCarus,1863舌状绦虫科LigulidaeClaus,1885舌状绦虫属Ligula,1782虫体带状，白色，肉质肥厚。长度从数厘米到十余厘米不等，前端具有沟槽，虫体不能与头节分开。裂头蚴为成长与生殖器官的形成阶段。成虫体分节，每节片有一套生殖器官，生殖腔浅。生殖孔与子宫孔开口于腹面，大多睾丸分布于背面，近髓部。卵巢在腹面，髓部。卵呈椭圆形，有盖。此属是寄生于鱼类的腹腔中为幼虫（裂头蚴）阶段。20 2.2.2.5舌状绦虫裂头蚴Ligulasp.寄生部位：腹腔；采样时间：2014年7月；采样地点：哈巴河；形态描述：虫体肉质肥厚，呈白色带状，身体中央有一条凹槽。虫体长：95.3mm，宽：6mm。头端前部具有沟槽，头节不能与虫体分开，裂头蚴没有明显的分节，每节有一套生殖器官，生殖腔较浅。如图2-5。A.虫体整体；B.虫体横切图2-5舌状绦虫裂头蚴Ligulasp.Fig.2-5Ligulasp.线形动物门Nemathelminthes无尾感亚纲AphasmidiaChitwoodetChitwood,1933嘴刺目EnoplidaChitwood,1933毛细科CapillaridaeNeveu-Lemaire,1936毛细线虫属CapillariaZeder,1800虫体小而细，线状。透明无色，口简单。食道细长，由许多单行排列的食道细胞构成，肠前端稍膨大。雄虫肛门位于尾端之腹侧，具有交合刺和交合刺鞘，交合刺鞘能伸缩，光滑或具刺。雌虫的阴门位于食道和肠连接处的腹面。卵巢、输卵管和受精囊的分界不清晰，子宫略粗，卵生，卵呈椭圆形。雌虫大于雄虫。寄生于各类的脊椎动物肠道中。21 2.2.2.6毛细线虫Capillariasp.寄生部位：肠道；采样时间：2010年1月、2014年7月；采样地点：北屯、哈巴河；形态描述：虫体细小如线状，透明无色，口简单。虫体有一条由许多单行排列的食道细胞构成的细长食道，肠前端略膨大。雄虫肛门位于尾端之腹侧，生殖系统为一条长管，射精管与泄殖腔相连，末端有一条细而长的交合刺，具鞘。雌虫的阴门位于食道和肠连接处的腹面，卵巢、输卵管和受精囊的界线不明显，子宫较粗，卵生，卵呈椭圆形。雌虫大于雄虫。如图2-6。A.雌虫头端；B.雄虫尾端；C.雌虫阴门；D.雌虫尾端图2-6毛细线虫Capillariidaesp.Fig.2-6Capillariidaesp.棘头动物门Acanthocephala古棘头虫纲PalaeacanthocephalaMeyer,1931棘吻目EchinorhynchidaSouthwell&Macfie,1952泡吻科PomphorhynchidaeYamaguti,1939泡吻棘头虫属PomphorhynchusMonticelli,1905虫体小而表面光滑，体壁核小而多。体腔系统为网状交错管道。颈细而长，呈柱状，前端膨大为球状，吻突长，圆柱状，具12-20纵列吻钩，每列10-14个。后端的吻钩略细长。吻峭壁为双层，从吻突末端延伸贯穿整个颈部。吻腺短呈棒状。体中部附近排列22 前后睾丸。具6个圆形或椭圆形的粘液腺。生殖孔位于体后末端，四周平滑。雌虫体内有大量虫卵，卵两端尖细呈纺锤形。寄生于鱼类腹腔中的消化器官组织。2.2.2.7福海泡吻棘头虫Pomphorhynchusfuhaisis寄生部位：肠道；采样时间：2010年1月；采样地点：北屯；形态描述：采样福海泡吻棘头虫1只，为雄虫。活体标本，雄虫虫体呈圆筒形，虫体呈黄色，虫体体表光滑且布有横纹。吻突位于身体前端，能伸缩，吻上有吻钩，具有12纵列，每列有14个吻钩。颈长，呈圆柱状，颈前端、吻后端形成一个大的球形泡；吻峭壁双层，两条吻腺从吻的末端向后延伸，穿越整个颈部。雄虫体内具有两个睾丸，呈椭圆形，前后排列，附在系带上；粘液腺6个，位于睾丸之后；其后有2个粘液储存囊以及1个薛氏囊，位于尾端。雄虫12.6mm，宽2.4mm；吻突长为3.5mm。如图2-7。A.雄虫整体；B.吻突图2-7福海泡吻棘头虫PomphorhynchusfuhaisisFig.2-7Pomphorhynchusfuhaisis节肢动物门Arthopoda甲壳纲Crustaced剑水蚤目Cyclopoida锚头鳋科LerraeidaeGobbold,1878锚头鳋属LerraeaLinne,1746锚头鳋的头胸部有分枝，具有1-2对角，单一或分枝角，位于头胸部的两侧。角呈23 圆锥状。颈部细软，圆柱状，渐渐扩大为身体躯干部。腹部较短，分为3节，不甚明显呈钝圆状，末端具有1对分节的小尾叉。头部有附肢5对，即第一触角、第二触角、大颚、小颚、颚足。第一触角3或4节，形似圆柱状。第二触角顶端具有粗壮的小爪，2或3节。小颚底部粗大，顶端各着生1对爪，剪刀状。大颚爪状，无齿。生殖节前突起较小，分两叶或不分。寄生于鱼类体表。2.2.2.8鲤锚头鳋Lernaeacyprinacea寄生部位：体表；采样时间：2010年7月；采样地点：哈巴河；形态描述：鲤锚头鳋采样12只，均为雌虫。雌虫身体细长，具有不明显的分节，体长6.5-12.8mm，体宽0.4-1.3mm。具头角突起，具各一对呈钝圆状的背、腹角在头胸部，腹部略粗，具有较小的不分叶生殖节前突。如图2-8。A.雄虫整体；B.头部分角；C头部附肢图2-8鲤锚头鳋LernaeacyprinaceaFig.2-8Lernaeacyprinacea2.3讨论2.3.1额尔齐斯河鳅科鱼类寄生虫的种类组成24 本调查共发现寄生虫8种，包括原虫2种，单殖吸虫1种，复殖吸虫1种，绦虫1种，线虫1种，棘头虫1种，甲壳动物1种。主要分布于体表、鳃、眼球、肠道和腹腔等部位。其中，默氏复口吸虫首次见于我国，为新纪录种；福海泡吻棘头虫系额尔齐斯[32]河2013年发现的新种，新疆高原鳅为福海泡吻棘头虫的宿主新纪录。在检查过的4种鳅科鱼类中，感染寄生虫种类最多的是新疆高原鳅（8种），其次小体高原鳅（2种）、北方花鳅（2种）和北方须鳅（1种）。额尔齐斯河鳅科鱼类寄生虫的组成以生活史复杂的类群：复殖吸虫、绦虫、线虫和棘头虫为主体，生活史简单的原虫、单殖吸虫和甲壳动物共4种。2.3.2额尔齐斯河鳅科鱼类寄生虫的感染情况4种鳅科鱼类中，新疆高原鳅的采样量最大，感染寄生虫的种类最多，为8种；其余三种鱼在额尔齐斯河的自然分布量稀少，8次采样中偶有捕获，数量不足统计学要求的30尾以上，小体高原鳅和北方花鳅各感染2种寄生虫，北方须鳅感染1种寄生虫。由于复口吸虫在鱼类眼球内处于囊蚴阶段，无法单凭形态学方法来确定虫种。因此，本文采用分子生物学方法针对鳅科鱼类感染的复口吸虫进行虫种鉴定，鉴定结果为默氏复口吸虫（Diplostomummergi），系我国首次发现的虫种新纪录，具体鉴定方法详见第4章。本次调查研究发现，默氏复口吸虫同时感染3种鳅科鱼类；而3种鳅科鱼类仅感染默氏复口吸虫，说明默氏复口吸虫具有宿主特异性。并且感染率和感染强度均较高，其中寄生小体高原鳅的默氏复口吸虫感染率较高为66.67%，为群落的核心种，默氏复口吸虫的平均丰度最大，为群落的优势种，见表2-1。2014年7月的采样过程中，一尾不[84]足10cm的新疆高原鳅眼球直径0.2cm，双眼含虫量高达357只，可见危害极其严重。除指环虫外，其余7种寄生虫在额尔齐斯河的多种鱼类均有不同程度的感染，呈现[31]多宿主特性。筒形杯体虫、车轮虫和鲤锚头鳋均为外寄生虫，多见于宿主体表、鳍条和鳃部，易在鱼类集群生活近距离接触时发生交叉感染，可造成寄生部位的损伤、炎症和继发性感染。默氏复口吸虫和舌状绦虫均属于扁形动物门，生活史复杂，历经第一中间宿主（默氏复口吸虫：锥实螺；舌状绦虫：剑水蚤）、第二中间宿主（多种淡水鱼类）和终末宿主（鸥鸟类）。额尔齐斯河位于新疆北部的阿勒泰地区，生态环境优良，没有[85]工业污染，生物资源丰富，流域内的软体动物、甲壳动物、鱼类和鸥鸟的种类繁多，25 这也为默氏复口吸虫和舌状绦虫完成生活史建立了良好的生物条件，利于寄生虫的广泛[86]传播和多宿主寄生。同时，鳅科鱼类为底栖小型鱼类，喜在高氧、低温的环境中生活，以摇蚊幼虫、颤蚓和甲壳类底栖动物为食，其接触锥实螺释放默氏复口吸虫尾蚴的几率较大，吞食内含舌状绦虫原尾蚴的剑水蚤频率较高，故易被这两种虫体感染。2.3.3小结随着额尔齐斯河的渔业发展，越来越多冷水性经济鱼类完成了人工高密度养殖的技术突破，倘若养殖水体中混杂一些小型鳅科鱼类，或以其为饵料投饲，则一定程度上增加了寄生虫的传播风险，同时作为额尔齐斯河的土著鱼类，更应该从生物多样性和经济价值方面都引起重视，为额尔齐斯河鳅科鱼类寄生虫疾病防治及鱼类寄生虫学研究积累科学资料。26 第3章额尔齐斯河鳅科鱼类默氏复口吸虫（Diplostomummergi）种群生态学研究默氏复口吸虫（DiplostomummergiDubois,1932）隶属于扁形动物门（Platyhelminthes），吸虫纲（TrematodaRudolphi,1810），鹗形目（StrigeididaLaRue,1926），复口科（DiplostomatidaePoirier,1886），复口吸虫属（DiplostomumVonNordamann,1832）[87]。复口吸虫的生活史较复杂，经过虫卵（Egg）、毛蚴（Miracidium）、胞蚴（Sporocyst）、[75]尾蚴（Cercaria）、后囊蚴（Metacercaria）和成虫（Adult）阶段，食鱼鸥鸟类的小肠中寄生其成虫，成虫产卵随着鸟粪排入水中，孵化成毛蚴后，感染第一中间宿主：椎实螺，在其体内无性生殖繁殖大量的胞蚴，待胞蚴成熟后在螺体内释放出成千上万的尾蚴。尾蚴逸出，借助旋转的尾部在水中游动，寻找合适的宿主并侵染，许多鲤科、鳅科等鱼类都是其适宜的宿主，尾蚴可侵入宿主体表的任何部位，但多集中在鳃、口腔等部位[88-89]。尾蚴在鱼类体内发育为囊蚴，顺着血管或神经移行至鱼的眼球，发育为后囊蚴。囊蚴在移行的过程中，通常造成鱼运动失控，骨骼变形，头部充血等，对鱼类神经系统造成严重的机械性损伤。当囊蚴进入鱼眼发育成后囊蚴，通常主要寄生于鱼类的眼球内，在眼内吸取宿主本身营养，可导致宿主鱼水晶体表面混浊，形成一层灰白色的薄膜，造成白内障，视力模糊，严重感染时可使鱼视网膜脱落、水晶体破裂，最终导致失明，甚[90]至鱼类的大量死亡。中国境内额尔齐斯河的4种鳅科鱼类本身属于小型底栖鱼类，尤其鱼苗受到复口吸虫的严重影响，被感染苗种生长发育缓慢，摄食及运动受到危害，造成鱼苗的大批死亡。最早的研究是在十九世纪初叶，Nordmaon在几种淡水鱼的眼球发现了复口吸虫的后囊蚴，并命名为Diplostomumvolen。Braun利用Nordmann发现的后囊蚴，人工对红嘴鸥（Larusridibundus)进行感染并获得了成虫，命名为匙形复口吸虫（Diplostomum[91-92]spathaceum）。此后，复口吸虫属在全世界已报道超过40种，其中已报道我国的有三种，即湖北复口吸虫（Diplostomumhupehensis）、倪氏复口吸虫（Diplostomumniedashui）[93]和山西复口吸虫（Diplostomumshanxinsis）。而国内对于这三种复口吸虫的研究仅限于其生活史以及感染情况方面，其他方面的相关研究甚少，尤其对我国额尔齐斯河流域27 的鱼类复口吸虫的研究调查也止步于区系调查阶段，复口吸虫的种类组成和种群生态学方面并未深入研究。通过对额尔齐斯河鳅科鱼类寄生虫调查发现，复口吸虫的感染率和感染强度均较高，则对小型鳅科鱼类而言造成严重伤害。鉴于默氏复口吸虫（Diplostomummergi）系我国境内的首次报道，因此本文除对其形态特征进行测量描述外，还对其种群生态学方面进行进一步研究，了解和完善额尔齐斯河流域内主要土著鱼类复口吸虫的发展演变及季节消长规律。旨在从寄生虫学和生态学的角度出发，为鳅科鱼类提供流行病学方面的资料，防治其疾病的发生，同时为额尔齐斯河鱼类寄生虫病防治及鳅科鱼类分区乃至整个寄生虫学研究方面提供了一定的科学资料。3.1材料与方法3.1.1默氏复口吸虫的采集和鉴定按照额尔齐斯河的气候特点，分四季（2009年4月春季、7月夏季、9月秋季，2010年1月冬季、2011年8月夏季，2012年7月夏季，2013年4月春季，2014年7月夏季及2015年8月夏季、9月秋季），在三个采样点（北屯市主河道、哈巴河县支流和185团主河道）捕获鳅科鱼类4种175尾，将采集的4种新鲜鳅科鱼类进行编号，测量体高和尾叉长；将两侧眼球完整取出，放于平皿内；将左右眼球置于玻璃板上，滴加生理盐水后，用另一块玻璃板轻压覆盖于上；将玻璃板置于解剖镜下，检查复口吸虫并计数，用吸管轻轻吸出虫体放置生理盐水中，冲洗干净；收集虫体保存于75%或95%的酒精中。默氏复口吸虫的形态学鉴定方法和分子生物学鉴定方法分别详见第2章和第4章。3.1.2种群生态学的统计方法分别计算不同鳅科宿主中复口吸虫的感染率、感染强度、平均感染丰度等，并且将2新疆高原鳅按体长大小，统计不同体长组中复口吸虫的感染情况。用方均比（S/X）来表示寄生虫在宿主体内的频率分布，S²/X<1，均匀分布；S²/X=1，随机分布；S²/X>1，聚集分布。负二项参数K值反映寄生虫聚集程度的高低，K值在0-1范围内越低，表示其聚集程度越高，K<0时，均匀分布；当K>0时，聚集分布；若K值趋于∞（一般为8[94][72]以上），则为随机分布。寄生虫种群生态学术语均参考Bush等的定义。数据统计均28 用计算机上EXCEL2013软件完成。3.2结果与分析3.2.1额尔齐斯河鳅科鱼类默氏复口吸虫的感染情况分别剖检新疆高原鳅279尾，小体高原鳅3尾，北方花鳅26尾。本次调查对3种鳅科鱼类眼内的默氏复口吸虫数目进行了数据分析，结果显示，104尾新疆高原鳅感染默氏复口吸虫，感染率为37.27%，共检出默氏复口吸虫4665只，感染强度1-357只/尾，见表3-1；2尾小体高原鳅感染默氏复口吸虫，感染率为66.67%，共检出默氏复口吸虫48只，感染强度8-40只/尾，见表3-2；3尾北方花鳅感染默氏复口吸虫，感染率为11.53%，共检出默氏复口吸虫5只，感染强度1-3只/尾，见表3-3。表3-1新疆高原鳅默氏复口吸虫的感染情况Tab.3-1TheinfectionofDiplostomummergionTriphophysastrauchii寄生寄生感染感染感染平均感染平均感染方均负二项虫宿主尾数（尾）率强度强度丰度比参数种类（%）（K）复口新疆10437.271-35744.86±40.7116.72±40.7199.140.17吸虫高原鳅表3-2小体高原鳅默氏复口吸虫的感染情况Tab.3-2TheinfectionofDiplostomummergionTriplophysaminuta寄生虫寄生感染感染率感染平均感染平均感染方均比负二项种类宿主尾数（%）强度强度丰度参数（尾）（K）复口小体266.678-4024±21.1716±21.17280.59吸虫高原鳅表3-3北方花鳅默氏复口吸虫的感染情况Tab.3-3TheinfectionofDiplostomummergionCobitisgranoei寄生虫寄生感染感染率感染平均感染平均感染方均比负二项种类宿主尾数（%）强度强度丰度参数（尾）（K）复口北方311.531-31.67±0.630.19±0.632.090.18吸虫花鳅根据寄生虫种群宿主的频率分布方均比原则判别，可知默氏复口吸虫分别在新疆高原鳅、小体高原鳅及北方花鳅体内呈现聚集分布，即三种鳅科鱼类中少数感染较多的默29 氏复口吸虫，而多数未感染或感染较少的默氏复口吸虫。根据负二项参数K值的大小，可知默氏复口吸虫分别在新疆高原鳅、小体高原鳅及北方花鳅种群中的聚集程度均较高。3.2.2不同体长组新疆高原鳅体内默氏复口吸虫的感染情况人为将新疆高原鳅的体长范围分为：L≤6、6＜L≤8、8＜L≤10、10＜L≤12、L＞12，分别计算每个体长组中寄生虫的感染率、感染强度、平均丰度等。由表3-4可知，体长组6cm以下新疆高原鳅未感染默氏复口吸虫；体长组6＜L≤8cm新疆高原鳅感染默氏复口吸虫的感染率最低；体长组8＜L≤10cm新疆高原鳅感染默氏复口吸虫的感染率为42.86%；体长组10＜L≤12cm新疆高原鳅感染默氏复口吸虫的感染率达到最高，为80.39%，而感染强度与体长8＜L≤10cm的水平相当，为43只/尾；体长组L＞12cm新疆高原鳅感染默氏复口吸虫的感染率较高，为63.16%。除体长2组L≤6cm，在其他体长组的新疆高原鳅种群中，方均比（S/X）均大于1，负二项参数K值大于0，说明不同体长组的新疆高原鳅种群中，默氏复口吸虫均呈现聚集分布。默氏复口吸虫在不同体长组新疆高原鳅的感染率和感染强度变化见图3-1。表3-4默氏复口吸虫在新疆高原鳅不同体长组的感染情况Tab.3-4TheresultofDiplostomummergiondifferentbodylengthgroupofTriphophysastrauchii宿主检查感染感染平均感染平均感染方均比负二项参体长组尾数率%强度强度丰度数（K）（cm）L≤630000006＜L≤81076.54%1-234.71±2.250.31±2.2516.480.028＜L≤108442.86%1-35743.39±48.8818.60±48.88128.490.1510＜L≤125180.39%1-22943.00±45.2934.57±45.2958.560.61L＞123863.16%1-20054.46±52.2534.39±52.2579.120.4430 图3-1不同体长组新疆高原鳅体内默氏复口吸虫的感染率和感染强度Fig.3-1InfectionrateandinfectionintensityofDiplostomummergiondifferentbodylengthgroupsofhost3.2.3不同季节新疆高原鳅体内默氏复口吸虫的感染情况默氏复口吸虫一年四季均可感染新疆高原鳅，感染率分别为61.29%、38.82%、12.12%、91.67%，平均感染强度分别为61.68±57.18、49.19±109.38、22.12±55.99、6.27±8.69。根据图3-2分析，四季的感染率呈现“V”字型，即先下降后升高的趋势，默氏复口吸虫在春季和冬季的感染率均高于夏季和秋季，感染率在秋季为最低峰值，冬季达到最高峰值；而感染强度则呈现了下降的趋势，春季感染强度达到最高峰值，感染强度在冬季为最低峰值。如图3-3所示，默氏复口吸虫在四季的负二项参数K值均大于0，分别为0.67、0.18、0.04、0.74，均呈现聚集分布。春季和冬季的K值大于夏季和秋季的K值，说明在春季和冬季的默氏复口吸虫在新疆高原鳅种群内的聚集程度均较高，而在夏季和秋季的聚集程度相对较低。31 图3-2不同季节新疆高原鳅默氏复口吸虫的感染率和感染强度Fig.3-2InfectionrateandinfectionintensityofDiplostomummergiindifferentseasonsofhost图3-3不同季节新疆高原鳅默复口吸虫的聚集度变化Fig.3-3VarietyofclusterdegreeofDiplostomumindifferentseasonsofhost3.3讨论3.3.1额尔齐斯河鳅科鱼类默氏复口吸虫的感染情况本次对额尔齐斯河四种鳅科鱼类默氏复口吸虫采样调查发现，默氏复口吸虫分别感染新疆高原鳅、小体高原鳅、北方花鳅，且默氏复口吸虫为鳅科鱼类寄生虫群落的优势种和核心种。默氏复口吸虫在三种鳅科鱼类种群中均为聚集分布，新疆高原鳅的感染强度很高，小体高原鳅的感染率较高，而北方花鳅的感染率相对较低。即三种鳅科鱼类中32 少数感染较多的默氏复口吸虫，而多数未感染或感染较少的默氏复口吸虫。3.3.2新疆高原鳅感染默氏复口吸虫的种群动态对不同体长组的新疆高原鳅默氏复口吸虫感染情况进行统计分析，鱼类年龄是由体长大小来反映的，可知随着体长的增加，默氏复口吸虫的感染率呈倒“V”字型，即先上升后下降的趋势，而感染强度呈现持续上升。这与鳅科鱼类眼球容纳默氏复口吸虫的空间，新疆高原鳅的年龄以及默氏复口吸虫的感染特点等有关。复口吸虫囊蚴的数量会[95]受到鱼类眼球的大小直接影响，随着宿主年龄的增加，默氏复口吸虫囊蚴寄生的数量[84]也在增多，这与感染默氏复口吸虫尾蚴和长期累积性地接触螺类有关。此次调查中，体长组L≤6cm的新疆高原鳅因眼球较小，可容纳默氏复口吸虫的空间较小，故该组无默氏复口吸虫的感染。体长组6＜L≤8cm、8＜L≤10cm和10＜L≤12cm的感染率和感染强度均依次升高，可见随着年龄的增长，眼球体积也增加，眼球接触默氏复口吸虫尾蚴的几率增大，可容纳数量也增加，这与前述研究结果一致。而体长组L＞12cm的感染率相对较低，这与新疆高原鳅的采集量较少有关。222通过方均比（S/X）来表示寄生虫种群空间分布，S/X<1表示均匀分布、S/X=12表示随机分布、S/X>1表示聚集分布。根据生态学平衡原则，绝大多数寄生虫的分布呈[96]现聚集分布。聚集分布是寄生虫-宿主系统中最主要的分布类型，当聚集分布的程度较高时，意味着少数宿主体内感染大量的寄生虫，这将造成少数宿主死亡，而大多数宿主受到的影响较小，此分布不仅利于寄生虫种群的繁殖、物种的延续和生存，而且宿主种群受到寄生虫造成的危害降到最低。由表3-4可知，除了体长组L≤6cm，其他体长组新疆高原鳅体内寄生默氏复口吸虫的种群分布为聚集分布，说明新疆高原鳅与默氏复口吸虫的宿主-寄生虫系统处于稳定状态，大多数新疆高原鳅未感染或只感染少量的默氏复口吸虫，而大量默氏复口吸虫寄生于少数的新疆高原鳅眼球中。负二项参数K值反映寄生虫在宿主体内聚集程度的高低，聚集度随宿主体长增加而发生变化。宿主体内寄生虫的分布模式也受到宿主、寄生虫及环境等影响，并且宿主对默氏复口吸虫的易感性、眼球的生理特性及宿主的免疫力等也可影响聚集程度的变化。3.3.3新疆高原鳅感染默氏复口吸虫的季节动态在剖检的279尾新疆高原鳅中，有104尾被感染，通过对104尾新疆高原鳅感染的默氏复口吸虫统计发现，新疆高原鳅一年四季均可被感染。不论在自然水体或集约化养33 殖环境中，均有长期存在的中间宿主（锥实螺），在鱼类种群中复口吸虫的感染呈现明显的季节性差异。在夏季和秋季，感染强度、感染率及平均丰度均最高，在全年的感染[97]率均稳定在95%-100%范围内。此次采样调查结果与前人研究有所不同，由图3-2可知，默氏复口吸虫感染率呈现“V”字型且在冬季最高，达90%以上，春、夏季感染率次之，秋季感染率最低；感染强度呈现递减趋势，春季最高。这种差异除了与鳅科鱼类本身特性有关，还受额尔齐斯河水域流速、温度影响。除此之外，感染程度还受到食鱼鸥鸟类的迁徙活动及默氏复口吸虫本身的适应性影响。不同季节的寄生虫感染情况存在的差异是由很多原因造成的，环境、寄生虫和宿主是对寄生虫的感染率和感染强度造成一定影响的三大因素。34 第4章额尔齐斯河鳅科鱼类默氏复口吸虫（Diplostomummergi）分子鉴定及系统发育研究额尔齐斯河（IrtyshRiver）起源于阿尔泰山脉，物种资源丰富，流经富蕴、福海、阿勒泰、布尔津、哈巴河等5个市县，最后注入北冰洋的喀拉海，是我国唯一的北冰洋水系河流。额尔齐斯河流域具有特殊的地理环境，加之自然生态环境条件优越，繁杂的下游水系中孕育了丰富的鱼类资源，包括多种名贵优质的经济鱼类以及许多土著鱼类。中国境内的额尔齐斯河现有35（亚）种鱼类，其中有23（亚）种土著鱼类，如鲤鱼、[25-26]银鲫、新疆高原鳅等。复口吸虫（Diplostomum）是淡水鱼类的一类常见寄生虫，主要寄生于鱼类的眼球中，危害较大，在欧洲、北美和亚洲等地区均有复口吸虫的广泛分布。复口吸虫在额尔齐斯河流域是优势虫种并且危害鱼类较为严重，而且具有高感染率、高强度等特点。鳅科鱼类属于小型鱼类，2014年7月的调查中发现在一尾新疆高原鳅的一个眼球中就寄生有上百只默氏复口吸虫，可见危害的严重程度。因此针对额尔齐斯河鳅科鱼类默氏复口吸虫的分子鉴定以及系统发育学方面进行研究是十分必要的。目前，我国有关额尔齐斯河鱼类复口吸虫区系的研究、种群生态学以及虫种新纪录的报道较多，但是针对鳅科鱼类复口吸虫的分子系统发育相关研究较少。常规的鱼类寄生虫分类依据是通过形态学来鉴定。国内有关复口吸虫的研究较少，在分类鉴定方面的研究甚至为空白，在国内仅发现并命名3种复口吸虫，而大多数研究都是由国外来进行完成的。由于复口吸虫的生活史较复杂，是一种宿主特异性不明显的寄生虫，它经过漫长的生活演化，与各个宿主有着互利共存的关系，同时对于第二中间宿主鱼类也是重要的病原。然而大部分的鱼类复口吸虫个体非常小，幼虫阶段的后囊蚴大多形态特征相似并且无成虫特征，即便是同种复口吸虫，由于宿主的差异以及地域性差异也会造成形态上微小的区别，若仅凭制作玻片在显微镜下观察其形态学来鉴定鱼类复口吸虫是不准确的。利用分子生物学的方法对DNA序列进行测定，从而进一步研究生活史复杂的寄生[98-99]虫，可以更好的解决在系统发育关系上具有的争议，相比形态学鉴定，这种方法存[100]在更好的优势。本文采取形态学结合分子生物学的方法对额尔齐斯河新疆高原鳅寄生的默氏复口吸虫种类进行了分子鉴定研究，通过分子生物学鉴定获得ITS1-5.8S-ITS2rDNA，以确定复口吸虫虫种，构建进化树并进行了系统发育研究，为新疆额尔齐斯河35 流域鱼类寄生的复口吸虫ITS1-5.8S-ITS2rDNA分子鉴定方面积累资料。4.1材料与方法4.1.1实验材料虫体样品为2009-2015年在额尔齐斯河采集的鳅科鱼类眼部的复口吸虫，虫体经生理盐水冲洗干净后，分别固定于95%的酒精中。通过苏木素或盐酸卡红染色制片后，在显微镜下观察其形态学及组织特征，初步鉴定为复口吸虫属，见图2-4。4.1.2主要试剂和仪器氨苄青霉素（Amp）上海生工生物科技技术有限公司胰蛋白胨上海生工生物科技技术有限公司DM2000DNAMarker上海生工生物科技技术有限公司胶回收试剂盒上海生工生物科技技术有限公司动物组织基因组DNA提取试剂盒上海生工生物科技技术有限公司质粒小提试剂盒上海生工生物科技技术有限公司电热恒温水浴锅（HWS12型）上海一恒科学仪器有限公司产品高速低温离心机（DIGICEN20-R型）西班牙ORTOALRESA公司产品单人单面（垂直送风）苏州苏洁净化设备有限公司产品洁净工作台（SW-CJ-1D型）苏州苏洁净化设备有限公司产品台式恒温振荡器（THZ-D型）江苏太仓市实验设备厂产品PCR仪美国Bio-Rad公司产品电泳仪（DYY-III-5型）北京六一公司产品GelDoc2000紫外凝胶成像系统美国Bio-Rad公司产品4.1.3模板DNA的提取取酒精固定的虫体样本置于TE缓冲液（pH8.0）中浸泡过夜，以除去虫体中的酒精。用上海生工动物组织基因组DNA提取试剂盒提取虫体DNA。用1.0%琼脂糖凝胶电泳来检测提取的虫体DNA，剩余的基因组DNA-20℃保存。36 4.1.3.1特异性引物的合成根据NCBI发表的序列设计引物，默氏复口吸虫（Diplostomummergi）的ITS-5.8S-ITS2rDNA基因序列扩增上下游引物为D1（F）、D2（R），引物由生工有限责任公司合成，见表4-1。表4-1PCR引物Tab.4-1PCRprimers引物名称引物序列D1（F）5'-AGGAATTCCTGGTAAGTGCAAG-3'D2（R）5'-CGTTACTGAGGGAATCCTGG-3'4.1.3.2目的基因扩增PCR扩增以提取的复口吸虫DNA为模板，反应体系为50μL。反应条件经优化后为94℃预变性2min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，10℃∞。PCR反应体系见表4-2：表4-2PCR反应体系Tab.4-2PCRreactionsystem物质体积（μL）10×TaqReactionBuffer3dNTPMixture（各10mmol/L）2引物1（10mmol/L）2引物2（10mmol/L）2TaqDNAPolymerase（2.5U/μL）1模板DNA7重蒸馏水304.1.3.3目的基因测定PCR产物用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收和纯化，将回收后的目的片段连接到PTA2载体上，再转入E.coliDH5α感受态细胞中，进行培养。每种样品至少筛选2个阳性克隆菌，送上海生工生物工程股份有限公司测序。4.1.3.4ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列比对及系统发育学分析对测序结果进行处理并分析，用DNAMANVersion6软件做序列比对，计算两两序列间的差异百分比。从GenBank下载复口吸虫属（Diplostomum）5种，共13个样本，以1个Tylodelphysclavata（GenBank登录号JQ665459.1）为外类群。其核酸序列见表37 4-3。用MEGA6软件分析和计算复口吸虫ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列的遗传距离并构建NJ系统发育树。表4-3复口吸虫的种类及序列信息Tab.4-3SpeciesandsequenceinformationofDiplostomum序号种名登录号属别1DiplostomummergiD14JX494231.1复口吸虫属2DiplostomummergiD13JX494233.1复口吸虫属3DiplostomummergiRAH1JX986838.1复口吸虫属4DiplostomummergiRAH3JX986839.1复口吸虫属5DiplostomummergiGGR3JX986842.1复口吸虫属6DiplostomumbaeriSTL1JX986856.1复口吸虫属7DiplostomumbaeriSTL3JX986857.1复口吸虫属8DiplostomumhuronenseD.RL.D.Cc.1.1GQ292509.1复口吸虫属9DiplostomumhuronenseD.RL.D.Cc.1.5GQ292507.1复口吸虫属10DiplostomumpseudospathaceumLSH1JX986851.1复口吸虫属11DiplostomumpseudospathaceumLSB2JX986850.1复口吸虫属12DiplostomumindistinctumD.RL.IVT.Nm.IF.1GQ292506.1复口吸虫属13DiplostomumindistinctumD.RL.D.Cc.1.2GQ292508.1复口吸虫属14TylodelphysclavataJQ665459.14.2结果与分析4.2.1复口吸虫ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列的PCR扩增成功扩增默氏复口吸虫ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列条带，片段大小为1265bp，与预期目的片段长度相一致。见图4-1。M:DNA标准分子量DL2000;1:阴性对照;2:默氏复口吸虫PCR产物图4-1默氏复口吸虫ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列电泳结果Fig.4-1TheelectrophoresisresultsofDiplostomummergi38 4.2.2复口吸虫ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列同源性比较待测默氏复口吸虫的ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列与GenBank中默氏复口吸虫的ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列同源性比较，结果显示待测复口吸虫为Diplostomummergi，为同源性为99.68%（1265/1269），碱基转化率为0.32%（4/1269），见图4-2。注：Query为鉴定序列，Sbjct为GenBank中默氏复口吸虫的ITS1-5.8S-ITS2rDNA图4-2默氏复口吸虫ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列比对结果Fig.4-2ThecompareresultsofDiplostomummergiITS1-5.8S-ITS2rDNAsequence39 4.2.3复口吸虫属的ITS1-5.8S-ITS2rDNA的遗传距离分析利用计算机MEGA6软件计算遗传距离，矩阵结果显示13种复口吸虫的种间遗传距离在0-0.110，待测默氏复口吸虫（DiplostomummergiW）和GenBank中DiplostomummergiD14遗传距离最近为0，说明是同一虫种。在复口吸虫属中，DiplostomumhuronenseD.RL.D.Cc.1.1和DiplostomumpseudospathaceumLSB2遗传距离最近为0.008，可见其亲缘关系最近。遗传距离矩阵见表4-4。表4-4ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列区域的遗传距离Tab.4-4ThedistanceofITS1-5.8S-ITS2rDNAgenticregion4.2.4基于ITS1-5.8S-ITS2rDNA基因的复口吸虫的系统发育分析通过MEGA6软件的运用邻接法-NJ法，分析和计算待测默氏复口吸虫（DiplostomummergiW）ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列与GenBank中复口吸虫的ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列的遗传距离，并构建NJ分子系统发育树，以Tylodelphysclavata为外类群进行系统发育研究。结果显示待测默氏复口吸虫（DiplostomummergiW）和GenBank中DiplostomummergiD14聚为一支，且支持率为100%。复口吸虫属的六个Diplostomummergi虫种聚为一支，其余复口吸虫属虫种两两对应聚为一支。最终复口吸虫属的所有虫种聚为一支。系统发育树见图4-3。40 图4-3基于ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列系统发育树（NJ树)Fig.4-3ThephylogeneticanalysisofITS1-5.8S-ITS2rDNAsequence（NJtree）4.3讨论额尔齐斯河是一条国际性河流，复口吸虫是一种广适性的寄生虫，中国境内的额尔齐斯河流域不同鱼类因地域不同而感染的复口吸虫种类也不同，并且感染率和感染强度均较高。目前复口吸虫属的分类仍然是一个有争议的状态，由于复口吸虫虫体很小，幼虫阶段-后囊蚴的形态简单，即便是同一虫种，它们身体内部的形态特征存在较高的相似性。欧洲国家已针对复口吸虫生命周期各个阶段做有单独的分类处理，而我国有关复口吸虫的相关研究报道甚少，在虫种鉴定研究方面仅限于形态学，在系统发育方面的深入研究几乎空白。本文利用形态学与分子生物学的方法结合针对鳅科鱼类眼球内的复口吸虫进行虫种鉴定，通过形态学的初步鉴定，待测虫种为复口吸虫属。然而形态学具有一定的局限性，之后利用分子生物学选取ITS作为靶基因片段进行测序的方法得到精确的虫种鉴定，因此来完善额尔齐斯河鱼类复口吸虫的种类鉴定，提供科学依据并积累相关资料。通过选用GenBank中的特异性引物进行目的基因扩增，得出片段大小为1265bp的待测序列，将待测默氏复口吸虫ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列放入GenBank中进行NucleotideBlast序列比对，结果显示该虫种为Diplostomummergi，同源性为99.68%（1265/1269），证明为同一虫种。从ITS1-5.8S-ITS2rDNA的遗传距离可以得出，待测默氏复口吸虫与41 GenBank中的默氏复口吸虫（DiplostomummergiD14）的遗传距离最近，为0；复口吸虫属虫种之间的遗传距离相对为较近的。基于ITS1-5.8S-ITS2rDNA的复口吸虫属虫种构建系统发育进化树，结果显示待测默氏复口吸虫和GenBank中的默氏复口吸虫聚为一支，复口吸虫属所有虫种最终都聚为一支，反映了复口吸虫属之间的亲缘关系相对是较近的。本文通过利用分子生物学方法对待测虫种进行遗传距离分析及构建系统发育进化树，不仅能够直观地展现物种之间的遗传距离和亲缘关系，而且有效地为虫种分类鉴定提供客观的科学依据，此次发现的默氏复口吸虫系中国虫种新纪录，在国内也是首次报道，完善了额尔齐斯河鳅科鱼类寄生虫种类鉴定的分类，同时对于丰富我国鱼类复口吸虫物种的多样性具有重大意义。42 第5章额尔齐斯河鳅科鱼类舌状绦虫（Ligulasp.）分子鉴定及系统发育研究舌状绦虫是一种常见的鱼类寄生虫，寄生于鱼类腹腔中，可引起严重的鱼类疾病。舌状绦虫的生活史较复杂，经过钩球蚴→原尾蚴→裂头蚴→成虫阶段。鸥鸟为终末宿主，虫卵随鸟粪排入水中，孵化出钩球蚴。钩球蚴在水中游动，被细镖水蚤吞食后，在其体内发育成原尾蚴。带有原尾蚴的水蚤被鱼吞食后，原尾蚴穿过鱼类的肠壁，发育成熟后以裂头蚴的形式寄生于在鱼体腹腔内。最终这些感染裂头蚴的鱼类被鸥鸟所食，裂头蚴在鸟肠内发育为成虫。舌状绦虫寄生在鱼体内的是裂头蚴时期，裂头蚴不具头节，虫体扁平带状且不分节，肉质肥厚呈乳白色，虫体长度可达几厘米甚至数十米，俗称为“面条虫”。原尾蚴穿过鱼体肠壁时，导致肠粘膜遭受破坏损伤；发育为裂头蚴后，与鱼类内脏器官缠绕交错，因压迫脏器而影响正常发育；虫体在蠕动时吸取宿主营养，同时致使内脏器官机械性损伤，鱼类表现出发育受阻、器官萎缩，继而鱼类食欲减退、日渐消[101-102]瘦；大量寄生时虫体可从鱼体口腔或腹部钻出，导致鱼类死亡，造成了严重的危害。舌状绦虫（Ligulasp.）隶属于扁形动物门（Platyhelminthes），绦虫纲（Cestaidea），假叶目（PseudophyllideaCarus,1863），舌状绦虫科（LigulidaeClaus,1885），舌状绦虫属（LigulaBloch,1782）。额尔齐斯河流域的鳅科鱼类属于小型底栖鱼类，感染一只舌状绦虫就占鱼体内脏的三分之一，造成对鳅科鱼类内脏器官的挤压而影响正常机能，甚至导致死亡，可见具有严重的危害性。目前，舌状绦虫在我国的研究主要集中在流行病学调查和疾病防控方面，而在分子鉴定方面研究几乎为空白。然而仅凭借经验对舌状绦虫进行形态学鉴定缺乏客观性，是不够准确的。本文通过选取ITS作为靶基因进行测序的分子生物学方法得到精确的虫种鉴定，不但能够丰富额尔齐斯河鳅科鱼类寄生虫的种类鉴定，而且还为我国鱼类寄生虫的分类提供科学依据，积累相关资料。5.1材料与方法5.1.1实验样品43 虫体样品为2009-2015年在额尔齐斯河采集鳅科鱼类腹腔的舌状绦虫。5.1.2样品的固定和保存固定绦虫前要将虫体放置在清水中完全伸展，用吸管将洗干净的虫体吸放于一块载玻片上，再加另一块盖玻片或载玻片覆盖其上，用细绳固定好两片载玻片（固定程度要根据绦虫的大小来定，不可过于压迫而导致虫体破裂），固定好后放置于有75%或95%酒精的玻璃平皿中，进行脱水，使虫体硬化。8-12h后，再将虫体保存于装有75%或95%[103-104]酒精的15mL离心管中。5.1.3石蜡切片标本制作由于舌状绦虫肉质肥厚，虫体也较大，不易制作玻片。因此，通过石蜡切片的方法对舌状绦虫虫体内部组织进行标本制作，以便在显微镜下观察到舌状绦虫的组织结构。（1）脱水和透明不同浓度的酒精溶液可置换出虫体组织的水分，脱水必须要充分，若脱水不充分，会将影响虫体的透明和浸蜡。将绦虫从固定酒精溶液中取出，剪取虫体中间的一小部分，放置75%酒精中进行脱水，过夜；第二天再次将剪取的虫体依次放置于90%、100%的梯度酒精中进行脱水。时间分别是：90%酒精：4h、100%酒精：2h。虫体浸蜡前必须进行透明，其目的在于用矿物油或植物油等透明剂置换出无水酒精，以便于熔化的石蜡液完全浸透到虫体组织间隙中。透明剂：二甲苯溶液。将脱水后的虫体从无水酒精中取出，放入二甲苯溶液中进行透明，时间为40min。（2）浸蜡和包埋浸蜡过程是使包埋虫体的石蜡液深入到组织间隙中，然后再通过静置晾干的方法使蜡块凝固，最终将虫体组织包埋于石蜡中。在浸蜡之前将3种不同熔点的石蜡分别编号以容器装好放在恒温箱中，使其充分熔化呈液体且杂质沉淀。选用软蜡和硬蜡两种，软[105]蜡熔点为52-58℃之间，硬蜡熔点为60-62℃之间。将透明后的虫体放入一张干净的滤纸或者是一小块缝好的纱布中，包好之后开始浸蜡，浸蜡的过程在自动恒温箱中进行。浸蜡的时间如下：软蜡1：60min。硬蜡2：60min。44 硬蜡3：60min。石蜡包埋就是将已经浸渗好的虫体包埋于浸渗剂中。浸蜡完毕时，将预热好的与第3号石蜡熔点相同的石蜡溶液倒入折好的蜡槽内，然后将虫体从第3号蜡杯中取出放入蜡槽内，注意虫体切面的摆放方向，摆好位置。冷却：自然冷却或者放入冷水中直接冷却。（3）切片和展片从纸盒中取出包埋好的蜡块，用加热的莱卡刀片将虫体周围多余的石蜡切去，在修整的过程中要露出虫体样品，将蜡块修成与切片机凹槽状相吻合的梯形状。修整好后，用铅笔在蜡块记上名称、编号。切片时采用型号为LEICARM2235手摇连续切片机。将蜡块固定在切片机凹槽内，调好所要求的距离和切片厚度，开始进行切片。切片厚度为5μm。切片后用毛笔小心挑取，以防切片破碎。切下的蜡片带有褶皱，所以在染色前必[98]须进行切片的展片和粘片，将蜡片平整的粘在载玻片上。展片的温度因石蜡熔点的不同而不同，将虫体石蜡切片用42℃温水进行展片，等蜡片充分展平后，用防脱载玻片在水中捞取蜡片，捞完后将载玻片放到玻片架上，置于38℃温箱中烘干，过夜。（4）染色和封片为了更好地观察虫体内部的特殊结构，采用配制复杂，可长期保存、耐用，染色效果好的苏木紫伊红染色液，对组织进行染色。在显微镜下观察，如图1所示。染色结果是细胞核呈蓝紫色，细胞质呈粉红色。取出已经干燥好的切片载玻片，开始进行染色，具体染色过程和时间如下：脱蜡：二甲苯脱蜡15min。脱水：100%酒精→95%酒精→80%酒精→70%酒精，分别浸泡2min。冲洗：流水冲洗1min。染色：苏木紫染液染色5min。冲洗：流水冲洗1min。脱色：盐酸酒精浸泡1min。冲洗：流水冲洗1min。二次染色：伊红染液染色1min。45 冲洗：流水冲洗1min。脱水：80%酒精1min→95%酒精1min→100%酒精2min。再次透明：二甲苯溶液透明2min。透明后放置氨水溶液中1min取出，将中性树胶滴一滴在载玻片虫体组织所在位置上，用干净的盖玻片进行封片，贴标签。5.1.4分子生物学方法鉴定5.1.4.1主要试剂和仪器参考4.1.2。5.1.4.2模板DNA提取取酒精固定的绦虫样本，剪取虫体中间的一小部分，剪碎放入TE缓冲液（pH8.0）中浸泡8-12h，目的是充分去除虫体中的无水乙醇。提取虫体模板DNA的具体方法参照4.1.3。5.1.4.3特异性引物根据NCBI发表的序列设计引物，舌状绦虫ITS-5.8S-ITS2rDNA基因序列扩增上下游引物为1F、1R。PCR引物见表5-1。引物由生工有限责任公司合成。表5-1PCR引物Tab.5-1PCRprimers引物名称引物序列1F5'-ATCTGGTCTGTCGGTCAT-3'1R5'-GATAAGAGGCAGCATCTCG-3'5.1.4.4目的基因扩增PCR扩增以提取的舌状绦虫DNA为模板，反应体系为50μL。反应条件经优化后为94℃预变性5min；94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min，10℃∞。PCR反应体系见表5-2：46 表5-2PCR反应体系Table.5-2PCRreactionsystem物质体积（μL）10×TaqReactionBuffer3dNTPMixture（各10mmol/L）2引物1（10mmol/L）2引物2（10mmol/L）2TaqDNAPolymerase（2.5U/μL）1模板DNA7重蒸馏水305.1.4.5目的基因测定使用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对PCR产物进行回收和纯化，将回收后的目的片段连接到PTA2载体上，再转入E.coliDH5α感受态细胞中，进行培养。每种样品至少筛选2个阳性克隆菌，送上海生工生物工程股份有限公司测序。5.1.4.6ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列比对及系统发育学分析对测序结果进行处理并分析，用DNAMANVersion6软件做序列比对，计算两两序列间的差异百分比。从GenBank下载绦虫属5种，共11个样本，以1个DiplostomummergiD14（GenBank登录号JX494231.1）为外类群。其核酸序列见表4-3。用MEGA6软件分析和计算舌状绦虫ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列的遗传距离并构建NJ系统发育进化树。表5-3绦虫的种类及序列信息Tab.5-3Speciesandsequenceinformationofcestode序号种名登录号属别1EubothriumcrassumAF229028.1真沟绦虫属2EubothriumsalveliniAF229029.1真沟绦虫属3Ligulasp.LIG3AF385764.1舌状绦虫属4Ligulasp.LIG2AF385762.1舌状绦虫属5Ligulasp.LIG10AF385761.1舌状绦虫属6Ligulasp.LIG1AF385760.1舌状绦虫属7Digrammainterrupta3KC900984.1双线绦虫属8Digrammainterrupta7KC900988.1双线绦虫属9Digrammainterrupta1KC900982.1双线绦虫属10DiphyllobothriumlatumAB302387.1裂头绦虫属11DiphyllobothriumlatumFDDQ768167.1裂头绦虫属12DiplostomummergiD14JX494231.1复口吸虫属47 5.2结果与分析5.2.1形态学鉴定鳅科鱼类是舌状绦虫的第二中间宿主，寄生在其腹腔内的裂头蚴是幼虫阶段，通过制作石蜡切片在显微镜下观察，发现虫体外周上下中部各有一条凹糟，左右两侧的内部结构相互对称排列，生殖器官并不明显，由于幼虫阶段内部器官尚未发育成熟，故初步鉴定为舌状绦虫属，并绘制虫体模式图，见图2-5。5.2.2分子生物学鉴定结果5.2.2.1PCR扩增ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列成功扩增出舌状绦虫ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列条带，片段大小为796bp，与预期目的片段长度相一致。见图5-1。注：M:DNA标准分子量DL2000;泳道1和2:舌状绦虫sp.PCR产物条带图5-1舌状绦虫ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列电泳结果Fig.5-1TheelectrophoresisresultofLigula.spITS1-5.8S-ITS2rDNAsequence5.2.2.2舌状绦虫ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列同源性比较测定舌状绦虫ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列片段大小为796bp，与GenBank中ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列同源性比对，结果显示该虫种为Ligulasp.，同源性为99.25%（790/796），碱基转化率为0.75%（6/796）。见图5-2。48 注：Query为鉴定序列，Sbjct为GenBank中舌状绦虫的ITS1-5.8S-ITS2rDNA图5-2舌状绦虫ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列比对结果Fig.5-2ThecompareresultsofLigulasp.ITS1-5.8S-ITS2rDNAsequence5.2.2.3绦虫属的ITS1-5.8S-ITS2rDNA的遗传距离分析利用计算机MEGA6软件计算的遗传距离，结果显示13种虫种的种间遗传距离在0~0.288之间，绦虫属虫种的种间遗传距离在0-0.221之间。待测舌状绦虫（Ligulasp.W）和GenBank中Ligulasp.LIG1遗传距离最近为0.003，说明是同一虫种，见表5-4。49 表5-4ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列区域的遗传距离Tab.5-4GeneticrDNAsequenceoftheregionfromtheITS1-5.8S-ITS2rDNA5.2.2.4绦虫属的ITS1-5.8S-ITS2rDNA的系统发育进化树分析利用MEGA6软件计算和分析，采用邻接法对13种虫种的ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列构建系统发育进化树（NJ树），以DiplostomummergiD14为外类群进行系统发育分析（见图5-3）。分析结果显示，首先双线绦虫属与舌状绦虫属种间亲缘关系较近且聚为一支；其次在舌状绦虫属种内基础上，待测舌状绦虫（Ligulasp.W）与Ligulasp.LIG1距离最近，且聚为一支，支持率高达95%；然后舌状绦虫属与裂头绦虫属聚为一支，两种真沟绦虫聚为一支；最终绦虫属的所有虫种聚为一支。图5-3基于ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列系统发育树（NJ树）Fig.5-3ThephylogeneticanalysisofITS1-5.8S-ITS2rDNAsequence（NJtree）50 5.3讨论舌状绦虫科包括两个属：双线绦虫属与舌状绦虫属。成虫的内部组织结构的区别：双线绦虫属每节节片里有2套生殖器官，舌状绦虫每节节片里仅有1套生殖器官，并且这2个属的裂头蚴都寄生于鱼类腹腔中，影响鱼类的生长发育，感染强度大时可导致鱼类死亡。通过石蜡切片的方法对待测虫种进行制片，在显微镜下观察到的虫体内部组织及生殖器官并不明显，其原因是寄生在鱼体腹腔内的舌状绦虫裂头蚴是幼虫阶段，由于幼虫肉质肥厚，无分节，幼虫发育尚未成熟，其体内的组织器官并未成形。而鸥鸟食被感染鱼后，裂头蚴在鸥鸟体内发育为成虫后才拥有成熟完整的组织结构。从裂头蚴阶段区分两个属造成对虫种形态上的鉴定难度，故仅通过形态学鉴定区分是不可靠的，因此舌状绦虫的鉴定必须结合分子生物学方法才更为准确。本文针对待测舌状绦虫通过选用GenBank中的特异性引物进行目的基因扩增，得出片段大小为796bp的待测序列，将待测舌状绦虫ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列放入GenBank中进行NucleotideBlast序列比对，结果显示该虫种为Ligulasp.，同源性为99.25%（790/796），证明为同一虫种。通过ITS1-5.8S-ITS2rDNA的遗传距离可以得出，绦虫属所有虫种的种间遗传距离相对较近；待测舌状绦虫与GenBank中的舌状绦虫（Ligulasp.LIG1）的遗传距离最近，为0.003；双线绦虫属和舌状绦虫属虫种间距离为0，可见亲缘关系最近。NJ树分析结果显示，双线绦虫属和舌状绦虫属聚为一支，说明两个属的亲缘关系很近；待测舌状绦虫与Ligulasp.LIG1聚为一支，且支持率高达95%，绦虫属的所有虫种最终都聚为一支。通过分子生物学方法对舌状绦虫进行虫种鉴定，发现舌状绦虫科的两个属虫种间遗传距离具有很近的亲缘关系。在选择序列方面，最初在我国研究的是28SrDNA序列，该序列容易扩增且保守度很高；后来利用18SrDNA序列的V4可变区，该区域可显示变化但比较短；5.8SrDNA序列保守度高但也比较短。唯有ITSrDNA序列变异度较高，能够更客观准确的进行属和种的区分。所以，本文选取ITS1-5.8S-ITS2rDNA的序列，建立舌状绦虫的系统发育体系，并且利用ITS序列进行区分属种，得到了更直观有效的分析结果。本文对舌状绦虫的系统发育关系讨论是我国首次研究，完善了对额尔齐斯河鳅51 科鱼类寄生虫对的虫种鉴定，同时填充了我国在舌状绦虫虫种鉴定以及遗传进化方面的空缺，提供了重要的科学依据。52 第6章结论通过结合常规的鱼类寄生虫学调查方法及现代分子生物学技术，于2009年4月至2015年9月对额尔齐斯河（中国段）鳅科鱼类寄生虫分类鉴定和流行病学特点等进行了调查研究，并对鳅科鱼类感染复口吸虫的种群生态学和系统发育学以及对舌状绦虫的系统发育学进行了研究，主要结论如下：（1）本次共剖检4种鳅科鱼类样本337尾，北方须鳅24尾，新疆高原鳅279尾，小体高原鳅3尾，北方花鳅31尾。共检出寄生虫8种：分别是：筒形杯体虫（Apiosomacylindriformis）、车轮虫（Trichodinasp.）、指环虫（Dactylogyrussp.）、默氏复口吸虫（Diplostomummergi）、舌状绦虫（Ligulasp.）、毛细线虫（Capillariasp.）、福海泡吻棘头虫（Pomphorhynchusfuhaiensis）、鲤锚头鳋（Lernaeacyprinacea）。隶属于5门、6纲、7目、8科、8属。默氏复口吸虫为该区系的核心种和优势虫种。（2）对额尔齐斯河鳅科鱼类默氏复口吸虫种群生态学进行统计和分析，其中新疆高原鳅默氏复口吸虫感染率和平均感染强度分别为37.27%和44.86±40.71；小体高原鳅默氏复口吸虫感染率和平均感染强度分别为66.67%和24±21.17；北方花鳅默氏复口吸虫感染率和平均感染强度分别为11.53%和1.67±0.63，结果显示默氏复口吸虫在3种鳅科鱼类种群中呈现较高的聚集程度；并且3种鳅科鱼类中少数感染较多的默氏复口吸虫，而多数未感染或感染较少的默氏复口吸虫。（3）对不同体长段新疆高原鳅体内默氏复口吸虫的频率分布进行分析，结果显示默氏复口吸虫的感染率和感染强度随着新疆高原鳅体长的变化而改变，并且在不同体长组的新疆高原鳅种群中，均呈现聚集分布。对2009-2015年额尔齐斯河新疆高原鳅默氏复口吸虫季节动态进行分析，结果显示默氏复口吸虫的感染呈现明显的季节变化，春季和冬季为高发期；感染率在四季呈现先下降后升高的趋势，而感染强度则呈现了下降的趋势，在冬季为最低峰值。（4）通过结合形态学方法及分子生物学方法，针对额尔齐斯河鳅科鱼类感染默氏复口吸虫和舌状绦虫进行虫种鉴定，将2个待鉴定种的ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列分别与GenBank中的相应序列进行比对，获得ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列测定结果，它们的同53 源性分别为：99.68%和99.25%，并构建遗传距离和系统发育进化树，同时获得2个GenBank登录号（KU821408，KU821409）。结果显示复口吸虫种类为默氏复口吸虫（Dipolostmummergi），系中国新纪录种；舌状绦虫种类为舌状绦虫（Ligulasp.）。54 参考文献[1]唐琼英,俞丹,刘焕章.斑纹薄鳅（Leptobotiazebra）应该为斑纹沙鳅（Sinibotiazebra）[J].动物学研究,2008,29(1):1-9.[2]陈景星,朱松泉.鳅科鱼类亚科的划分及其宗系发生的相互关系[J].动物分类学报,1984,9(2):201-208.[3]赵全东,刘铁钢,郭军.北方泥鳅健康养殖技术[J].黑龙江水产,2012,6(1):17-20.[4]赵睿,沈芾,那立海.大鳞副泥鳅人工繁育技术[J].中国水产,2014,9(2):59-60.[5]FüsunErkakan,F.GülerAtalay-Ekmekçi,TeodorT.Nalbant.AreviewofthegenusCobitisinTurkey(Pisces:Ostariophysi:Cobitidae)[J].Hydrobiologia,1999,403(1):13-26.[6]JunNakajima,YuzuruSuzawa.Cobitissakahoko.Anewspeciesofspinedloach(Cypriniformes:Cobitidae)fromsouthernKyushuIsland,Japan[J].IchthyolRes,2016,63(2):68-78.[7]D.Vinyoles,A.Desostoa,C.Franch,etal.Life-historytraitsofthestoneloachBarbatulabarbatula[J].JournalofFishBiology,2010,77(4):20-32.[8]M.Rabova,P.Rab,C.Ozouf-Costaz.ExtensivepolymorphismandchromosomalcharacteristicsofribosomalDNAinaloachfish,Cobitisvardarensis(Ostariophysi,Cobitidae)detectedbydifferentbandingtechniquesandfluorescenceinsituhybridization(FISH)[J].Genetica111,2001,45(1):413-422.[9]DongqiLiu,YuanpingDeng,ZhiliLi.etal.Isolationandcharacterizationof14tetranucleotidemicrosatelliteDNAmarkersintheelongateloachLeptobotiaelongata(CypriniformesCobitidae)using454sequencingtechnology[J].ConservationGenetResour,2014,68(6):119-121.[10]VasiljevV,VasiljevaED,OsinovAG.Evolutionofadiploid-triploid-tetraploidcomplexinfishesofthegenusCobitis(Pisces,Cobitidae).In:Dawley,R.M.,Bogart,J.P.EvolutionandEcologyofunisexualvertebrates[M].NewYorkStateMuseum,1998,23(3):153-169.[11]NalbantT.T.SomeproblemsinthesystematicsofthegenusCobitisanditsrelatives(Pisces,Ostariophysi,Cobitidae)[J].Rev.Roum.Biol.Ser.Biol.Anim,1993,38(2):101-110.[12]BergL.S.Ancestralareas:acladisticreinterpretationofthecenteroforiginconcept[J].EauxDouees55 Russ,1916,6(8):355-356.[13]BergL.S.Classificationoffishes,bothrecentandfossil[J].Trav.Inst.Zool.Sci.USSR.(inRussian),1940,5(3):87-345.[14]Kreyenberg.Cladisticsandtheclassificationofthegreatapes[J].Ges.Naturf.Fr.Berl,1908,12(1):106-108.[15]NicholsJ.T.NewChinesfishes[J].Proc.Biol.Soc.Wahington,1918,31(6):14-16.[16]NicholsJ.T.ThetwoChineseloachesofthegenusCobitis[J].Amer.Mus.Novitates,1925,17(5):3-6.[17]NicholsJ.T.ThefreshwaterfishesofChina[J].Nat.Hist.centralAsia,1943,9(1):197-199.[18]RendahlH.EinpaarneueUnterarenvonCobitistaenia[J].Menor.Soc.Proc.FaunaetFloraFennica,1935,10(8):330-332.[19]朱松泉.中国条鳅亚科鱼类三新种（鲤形目:鳅科）[J].动物分类学报,1992,17(2):241-247.[20]张春光,赵亚辉.北京及其邻近地区的鳅科鱼类[A].中国动物学会21世纪新北京生态生物学学术研讨会论文汇编.中国动物学会,2001.[21]何德奎,陈咏霞,陈毅峰.高原鳅属（Triplophysa）鱼类的分子系统发育和生物地理学研究[J].自然科学进展,2006,16(11):1395-1404.[22]郭晓芸.青海发现高原鳅新物种[N].中国渔业报,2015,3(2):12-14.[23]肖海,代应贵.中国高原鳅属多样性研究概述[J].水产科学,2011,30(1):53-57.[24]陈咏霞.我国鳅属及其邻近属鱼类的分类学整理和分子进化[D].中国科学院研究生院（水生生物研究所）,2007.[25]任慕莲,郭焱,张人铭,等.中国新疆额尔齐斯河鱼类资源及渔业[M].乌鲁木齐:新疆科技卫生出版社,2002:49-52.[26]任慕莲.我国额尔齐斯河的鱼类及鱼类区系组成[J].干旱区研究,2002,19(2):50-54.[27]刘开华,潘旭,谢立新.额尔齐斯河水质现状[J].西北水资源与水工程,2002,6(1):46-49.[28]赵习.北方须鳅线粒体基因组序列测定及鳅科鱼类系统发育分析[D].华中农业大学,2014.[29]倪达书,汪建国.我国鱼类寄生原生动物的研究进展[J].水生生物学报,1988,12(3):259-267.56 [30]倪达書,李连祥.多子小瓜虫的形态、生活史及其防治方法和一新种的描述[J].水生生物学集刊,1960,3(2):197-225.[31]陈启鎏.青、鲩、鳙、鲢等家鱼寄生原生动物的研究Ⅱ.寄生青鱼的原生动物[J].水生生物学集刊,1956,6(1):19-42.[32]陈启鎏.青、鲩、鳙、鲢等家鱼寄生原生动物的研究Ⅲ.寄生鳙和鲢的原生动物[J].水生生物学集刊,1956,15(2):279-298.[33]王耕南.沪宁—带淡水鱼鳃上的寄生桡足类—狭腹鳋（Lamproglena）的初步研究[J].动物学报,1958,10(2):163-172.[34]王耕南.沪宁一带四种鲺以及中华鲺生活史的初步研究[J].动物学报,1958,10(3):322-340.[35]王耕南.中国淡水魚寄生甲壳动物鲺属（Argulus）的生态与生活史的研究[J].动物学报,1961,13(1):154-170.[36]尹文英.中国淡水鱼寄生桡足类鳋科的研究[J].水生生物学集刊,1956,10(2):209-270.[37]郎所,怀明德.太湖鱼类的寄生蠕虫:复殖吸虫.—Ⅰ.发状科,叶形属,及四新种的描述[J].动物学报,1958,10(4):348-364.[38]郎所,李慧珠.太湖鱼类的寄生蠕虫:复殖吸虫.—Ⅱ.后睾科等及一新种后睾吸虫的描述[J].动物学报,1958,10(4):369-376.[39]郎所,李慧珠.太湖鱼类的寄生蠕虫—复殖吸虫Ⅵ.牛首科（BucephalidaePoche,1907）二新属四新种的描述及科的修订[J].动物学报,1964,10(4):567-580.[40]廖翔华,伦照荣.寄生在中国草鱼、鲤鱼和马口鱼的头槽绦虫的分类和亲缘关系[J].科学通报,1998,43(10):1073-1076.[41]廖翔华,施鎏章.广东的鱼苗病—一、广东九江头槽绦虫（BothriocephalusgowkongensisYeh）的生活史、生态及其防治[J].水生生物学集刊,1956,10(2):129-185.[42]潘金培,王伟俊,郑小英,W·阿尼.虹鳟复口吸虫病的研究—Ⅰ一种新的复口吸虫及其早期发育史观察[J].鲑鳟渔业,1990,3(2):1-11.[43]左文功.用食盐水治疗鲤粘孢子虫病[J].淡水渔业,1974,6(3):33-34.[44]唐仲璋,林秀敏.龙江血居吸虫及其产生的病害[J].厦门大学学报（自然科学版）,1975,1(2):139-160.57 [45]汪溥钦.福建省家畜寄生蠕虫初步调查[J].动物学杂志,1964,4(10):173-179.[46]汪溥钦.我国寄生于鱼类的棘头虫[J].动物分类学报,1981,6(2):121-130.[47]汪溥钦.福建海产鱼类寄生吸虫[J].海洋与湖沼,1982,13(2):179-194.[48]汪溥钦,郭起治.云南淡水鱼类寄生蠕虫[J].海洋与湖沼,1983,14(1):92-102.[49]汪溥钦.福建几种鱼类寄生线虫[J].动物分类学报,1984,9(3):228-237.[50]赵江山,焦丽,汪博良,等.额尔齐斯河白斑狗鱼寄生单肠四钩虫的种群生态学研究[J].干旱区研究,2011,28(4):665-668.[51]赵江山,姚卫建,焦丽,等.额尔齐斯河高体雅罗鱼单殖吸虫中国二新记录种[J].水生生物学报,2011,35(4):713-716.[52]焦丽,樊江,赵江山,等.额尔齐斯河东方欧鳊（AbramisbramaorientalisBerg）寄生虫调查研究[J].新疆农业大学学报2010,33(6):489-491.[53]郝翠兰,赵江山,焦丽,等.额尔齐斯河白斑狗鱼寄生虫种类及感染情况的调查研究[J].新疆农业科学,2011,48(1):135-138.[54]汪博良,赵江山,焦丽,等.额尔齐斯河银鲫寄生虫区系调查研究[J].新疆农业科学,2011,48(8):1505-1508.[55]张晓玲,焦丽,郝翠兰,等.额尔齐斯河鲤鱼寄生虫的种类组成及寄生特性[J].新疆农业科学,2011,49(3):576-580.[56]苗晶晶,呼晨,卢英磊,等.额尔齐斯河高体雅罗鱼寄生虫种类季节动态研究[J].新疆农业科学,2012,49(3):571-575.[57]王新,焦丽,汪博良,等.额尔齐斯河湖拟鲤寄生虫季节动态及其优势虫种的寄生情况调查研究[J].新疆农业大学学报,2012,35(1):38-41.[58]贾舒安,王娜,秦莉,等.额尔齐斯河河鲈寄生虫种类及区系研究[J].新疆农业科学,2012,49(9):1723-1726.[59]贾舒安,朱梦莹,王娜,等.额尔齐斯河河鲈寄生虫种群生态学研究[J].新疆农业科学,2013,50(3):545-552.[60]陈启鎏.鱼类、蝌蚪和甲壳动物体外寄生车轮虫（Trichodina）的研究[J].水生生物学集刊,1963,10(3):99-111．58 [61]王新,焦丽,贾舒安,王娜,郝翠兰,朱梦莹,岳城.中国双身虫一新纪录[J].干旱区研究,2014,31(6):1121-1124.[62]朱成德.舌状绦虫寄生太湖大银鱼的初步观察[J].淡水渔业,1985,2(3):32-33.[63]李明,汪建国,章晋勇,朱大玲,顾泽茂,龚小宁.鱼杯体虫（Apiosomapiscicola）的光镜及透射电镜观察[J].水生生物学报,2007,31(2):208-213.[64]谢炎福.显微镜在鱼体外寄生虫病快速诊断和后续治疗中的应用[J].渔业致富指南,2009,13(1):51-53.[65]王超,曾运丁,陈金涛,邹记兴.我国淡水鱼类寄生虫的研究概述[J].仲恺农业工程学院学报,2014,27(2):60-64.[66]郭晓强,冯志霞.无细胞酵解的发现及意义[J].医学与哲学（人文社会医学版）,2008,29(3):69-70.[67]邹祺.分子生物学的科学创新特征研究[D].郑州大学,2007.[68]PhilipsRB.PleyteKAandBrownMR.SalmonidPhylogenyinferredfromribosomalDNArestrietlonmaps[J].C.Jfish.Aquat.Sxi,1992,49(3):2345-2353.[69]DesdevisesY,JovelinR,JoussonO,MorandS.ComparisonofribosomalDNAsequencesofLamellodiscusspp.(Monogenea,Diplectanidae)parasitingPagellus(Sparidae:Teleostei)intheNorthMediterraneanSea:speciesdivergenceandcoevolutionaryinteractions[J].IntJParasitol,2000,30(3):741-746.[70]钟立强,张成锋,周凯,李冰,王建新,朱健.四个鲤鱼种群ITS-1序列的遗传变异分析[J].湖泊科学,2011,23(2):271-276.[71]TamuraK,PetersonD,PetersonN,etal.MEGA5:molecularevolutionarygeneticsanalysisusingmaximumlikelihood,evolutionarydistance,andmaximumparsimonymethod[J].MolecularBiologyandEvolution,2011,28(2):2731-2739.[72]周家健.山东山旺中中新世鳅科化石[J].古脊椎动物学报,1992,30(1):71-76.[73]成庆泰,郑葆珊.中国鱼类系统检索[M].北京:科学出版社,1987:280-299.[74]中国科学院水生生物研究所鱼病研究室.鱼病调查手册（第2版）[M].上海:上海科学技术出版社,1985:55-62.59 [75]吴宝华,孙希达,宋昌存.浙江动物志,吸虫类[M].杭州:浙江科学技术出版社,1991:77-82.[76]吴宝华,郎所,王伟俊.中国动物志扁形动物门单殖吸虫纲[M].北京:科学出版社,2000(5):113-238.[77]张剑英,杨廷宝,刘琳,等.中国海洋鱼类单殖吸虫[M].北京:中国农业出版社,2001:101-105.[78]湖北省水生生物研究所.湖北省鱼病病原区系图志[M].武汉:湖北科学出版社,1973:65-71.[79]贝霍夫斯卡娅,巴甫洛夫斯卡娅,古雪夫,等.苏联淡水鱼类寄生虫物鉴定手册[M].莫斯科:苏联科学院出版社,1962:23-26.[80]Yamaguti,SystemaHelminthum.Vol.Ⅳ.MonogeneaandAspidocotylea[M].NewYork:IntersciencePublishers,1963:699.[81]GussevAV.KeytotheparasitesoffreshwaterfishfaunaoftheUSSR[M].Leningrad:Sciencepublishinghouse,1985(2):383-385.[82]BushAO,LaffertyKD,LotzJM,etal.Parasitologymeetsecologyonitsownterms:Margolisetal.revisited[J].JournalofParasitology,1997,83(2):575-583.[83]潘炯华,张剑英,黎振昌,等.鱼类寄生虫学[M].科学出版社,1990:272-273.[84]孙军.复口吸虫的研究进展[J].生态科学,2005,24(2):168-172.[85]朱梦莹,贾舒安,王娜,郝翠兰,焦丽,岳城.鱼类寄生复口吸虫研究进展[J].动物医学进展,2013,6(5):103-106.[86]陈毅锋,陈咏霞.中国鳅属鱼类的副性征、噶氏斑纹和分类整理（鲤形目,鳅科,鳅亚科）[J].动物分类学报,2005,30(4):647-658.[87]RobertsLS&JanovyJ.Foundationsparasitology[M].Dubuque:Wm.C.BrownPublishers,1996:132-133.[88]ErasmusDA.ThemigrationofCercariaXBaylis(Strigeida)withinthefishintermediatehost[J].Parasitology,1959,49(3):173-190.[89]HöglundJ..ExperimentsonsecondintermediatefishhostrelatedcercarialtransmissionoftheeyeflukeDiplostomumspathaceumintorainbowtrout(Oncorhynchusmykiss)[J].FoliaParasitology,1995,42(2):49-53.60 [90]潘金培,王伟俊.复口吸虫病的研究及其防治方法.包括二新种的描述[J].水生生物学集刊,1963,15(1):1-45.[91]LockeSA,McLaughlinJD,MarcoglieseDJ.DNAbarcodesshowcrypticdiversityandapotentialphysiologicalbasisforhostspecificityamongDiplostomoidea(Platyhelminthes:Digenea)parasitizingfreshwaterfishesintheSt.LawrenceRiver[J].Canada.Mol.Ecol.2000,19(3):2813-2827.[92]NiewiadomskaK.ThegenusDiplostomum-taxonomy,morphologyandbiology[J].ActaParasitologica,1996,41(2):55-66.[93]郑小英.虹鳟复口吸虫病及其病原生物学的研究[D].武汉:中国科学院,1987.[94]方建平,詹火元,雷桂兰.长江黄州江段长须黄颡鱼肠道内寄生棘头虫的生态研究[J].水生生物学报,2004,28(3):279-280.[95]ChappellLH,HardieLJ,SecombesCJ.Diplostomiasis:Thediseaseandhost-parasiteinteractions.ParasiticDiseaseofFish(Eds,PikeA.W.Lewis)[M].Dyfed:SamaraPublishingLimited,1994,6(3):59-86.[96]李文祥,王桂堂.寄生虫对宿主种群的调节[J].水生生物学报,2002,26(5):550-554.[97]WoottenR.ObservationsonstrigeidmetacercariaeintheeyesoffishfromHanningfieldReservoir，Essex,England[J].JournalofHelminthology,1974,48(1):73-83.[98]RohdeK,HeffordC,EllisJT,etal.ContributionstothephylogenyofPlatyhelminthesbasedonpartialsequencingof18SribosomalDNA[J].Parasito,1996,23(6):705-724.[99]FernandezM,LittlewoodDTJ,LatorreA,etal.PhylogeneticrelationshipsofthefamilyCampulidae(Trematode)basedon18SrRNAsequences[J].Parasitology,1998,117(3):383-391.[100]陈俊锋,俞纯方,黄兵,等.分子标记技术在寄生虫分类鉴定上的应用[J].动物医学进展,2006,27(5):23-27.[101]宋长太.舌状绦虫病呈流行趋势[J].内陆水产,2007,2(1):29.[102]汪建国.淡水养殖鱼类疾病及其防治技术(8)—草鱼和青鱼疾病(六)[J].渔业致富指南,2015,3(8):53-57.[103]李健强,李六金.兽医微生物学实验实习指导[M].西安:陕西科学技术出版社,1999:144-145.[104]于三科.家畜寄生虫病学实验指导[M].西北农林科技大学校用教材.杨陵:2003:68-75.61 [105]杨捷频.常规石蜡切片方法的改良[J].生物学杂志,2006,23(1):45-46.[106]毛晓霞.石蜡切片制作方法的改良[J].安徽农学通报,2013,19(8):15-16.62 附录Ⅰ常用试剂的配制一、寄生虫采集及标本制作所用试剂1．75%无水乙醇配制量：100mL量取75mL无水乙醇，再量取25mL蒸馏水，将二者混合均匀。2．4%聚乙烯醇乳酸酚混合液配制量：100mL称取4g聚乙烯醇粉末，溶于100mL酚（石炭酸）和乳酸等量混合液中（50mL酚加50mL乳酸）。在热水中水浴约3-4h，使聚乙烯醇完全溶解成均匀透明的溶液，然后加入极少量的酸性品红（100mL加入约半粒芝麻大），使之成玫瑰红色。3．1%盐酸无水乙醇配制量：100mL先配置70%无水乙醇，量取70%无水乙醇99mL，加盐酸1mL即配成。4．乳酚透明液乳酸10mL石炭酸10mL甘油20mL蒸馏水10mL5．甘油明胶甘油100mL明胶20g石炭酸2.5g蒸馏水125mL二、分子生物学研究所用试剂6．1mol/LTris-HCl（pH8.0）配制量：1000ml63 将121.1gTris碱加入800mL双蒸水中，根据所需pH加入浓盐酸，pH为8.0，加入46ml浓HCl，用双蒸水定容至1000mL，121℃高压灭菌15min，4℃保存备用。7．0.5mol/LEDTA（pH8.0）配置量：1000mL称取186.1gNa2EDTA·2H2O和20gNaOH，溶于800mL双蒸水中，定容至1L（使pH为8.0），121℃高压灭菌15min，4℃保存备用。8．TE缓冲液（pH8.0）成分及终浓度配置100ml溶液各成份的用量10mmol/lTris-HCL1mL1mol/LTris-HCl（pH8.0）1mmol/LEDTA200μL0.5mol/LEDTA（pH8.0）蒸馏水98.8mL9．2%琼脂糖凝胶配制量：50mL称取琼脂糖凝胶1.0g于锥形瓶中，加入50mL1×Tris-乙酸（TAE）缓冲液，在微波率中加热溶解。10．LB液体培养基配制量：100mL称取1g胰蛋白胨，0.5g酵母浸粉，1gNaCl于烧杯中，加入约80mL双蒸水，充分搅拌溶解，用NaOH调节pH值至7.0，加入双蒸水定容至100mL。装入锥形瓶中，121℃高压灭菌15min，4℃保存备用。11．LB固体培养基先配置100mLLB液体培养基，向其中加入1.5g琼脂粉，搅拌混匀后，高温高压灭菌后，4℃保存备用。12．100mg/mLAmp配置量：10mL称取1gAmp溶解于10mL去离子水中，用滤菌器过滤除菌，然后封装成小份备用。13．AmpLB液体培养基64 配制量：100mL首先配置成LB液体培养基，高压后，冷却至55℃，加入Amp贮存液使其终浓度为100μg/mL。14．AmpLB固体培养基配制量：100mL称取琼脂粉1.5g溶于100mL液体培养基中，121℃高压灭菌20min，冷却至55℃，加入Amp至终浓度为100μg/mL，按平板制作方法倒平板，静置使其凝固。15．100mmol/LCaCl2配制量：100mL称取1.110gCaCl2于100mL容量瓶中，加入约80mL的双蒸水，充分搅拌溶解，用HCl调pH值为5.5，然后加水定容至100mL，搅拌溶解，121℃高温高压灭菌，4℃保存。16．电泳缓冲液50×Tris-乙酸（TAE）缓冲液成份及终浓度配制1L溶液各成分的用量2mol/LTris碱242gTris碱1mol/L乙酸57.1mL的冰乙酸（17.4mol/L）100mmol/LEDTA200mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)蒸馏水补足至1L65 附录Ⅱ部分鱼（虫）体标本图II-1新疆高原鳅图II-2小体高原鳅图II-3北方花鳅图II-3北方须鳅66 图II-4筒形杯体虫染色标本图II-5车轮虫染色标本图II-6显微镜下的指环虫图II-7默氏复口吸虫染色标本图II-8舌状绦虫石蜡切片染色标本图II-9毛细线虫染色标本图II-10福海泡吻棘头虫染色标本图II-11鲤锚头鳋染色标本67 致谢本论文是在岳城教授的悉心指导下完成的。首先感谢岳城教授收我为门下弟子，其次感谢岳城教授对我们的严格要求与谆谆教诲，还要感谢岳老师对我日常生活的关心和照顾，同样也感谢不辞辛苦给我们教课的老师们。三年的研究生生活即将结束，我必须感谢我的家人，是他们在背后默默支持着我，为了不给我增添烦恼，经常给我鼓励和放松。谢谢你们对我的养育，谢谢你们对我的包容，谢谢你们为一个25岁的我还如此操心，谢谢。感谢白莉老师在这三年的学习和班级工作中给予的支持和帮助，感谢焦丽师姐、郝翠兰师姐、还有查汗老师的学生李永畅、伊春阳同学，在实验和生活中对我的帮助。还要感谢党瑞、杨昆明、杨红霞等同学，感谢我们相处过程中的真诚与帮助，使我在一个团结友爱、积极上进的集体中度过三年时光，完成我的实验和论文。感谢我的所有朋友、同学，感谢我们都奋斗过、努力过，承受过。感谢曾陪伴过我，开导过我，劝诫过我，嘲笑过我的人们，是你们让我更优秀，是你们让我更强大，是你们让我更加理解怎么样成为一个优秀的人。最后，再次向所有帮助过我的老师、同学、朋友和亲人，表达我最真挚的谢意。68 作者简历姓名：王京京性别：女民族：回族出生年月：1990年8月教育经历：2009年9月至2013年6月就读于新疆农业大学科学技术学院动物医学专业；2013年7月至2016年6月就读于新疆农业大学动物医学学院。攻读硕士学位期间参加课题情况：1、国家自然科学基金项目《额尔齐斯河鱼类复口吸虫种类组成及种群生物学研究》（NO：31360644）2、科技支疆项目《新疆主要土著经济鱼类病害防治关键技术开发》（NO：201191136）攻读硕士学位期间发表论文情况：[1]王京京,段琛,焦丽,贾舒安,郝翠兰,王新,岳城.石河子大泉沟水库鱼类寄生虫区系调查研究[J].新疆农业科学,2014,51(1):178-182.[2]王京京,焦丽,郝翠兰,党瑞,岳城.额尔齐斯河鳅科鱼类寄生虫分类研究及流行特点分析[J].新疆农业大学学报,2015,38(6):456-458.[3]王京京,焦丽,贾舒安,郝翠兰,王新,岳城.新疆石河子大泉沟水库鱼类寄生虫区系调查研究[A].中国动物学会寄生虫学专业委员会.中国动物学会寄生虫学专业委员会第十五次全国学术会议暨第六次国际寄生虫学学术研讨会论文摘要集[C].中国动物学会寄生虫学专业委员会,2015.[4]焦丽,番林古丽·热哈提,王京京,岳城.额尔齐斯河(中国段)鱼类眼内复口吸虫的种类组成研究[A].中国动物学会寄生虫学专业委员会.中国动物学会寄生虫学专业委员会第十五次全国学术会议暨第六次国际寄生虫学学术研讨会论文摘要集[C].中国动物学会寄生虫学专业委员会,2015.69
此文档下载收益归作者所有
