《黑龙江省水稻品种稻瘟病抗性基因Pi9的鉴定及稻花香稻瘟病抗性改良》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
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独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进巧的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加Ｗ标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得（：如没有其他需要特别声明的注，本栏可空）或其他教育机构的学位或证书使用过的材料一。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名；曰期；年月曰＾＾＜（／／／学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可Ｗ将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：日期：年＾月Ｚ日、导师签名：來爹＾期抑／／＾年月＾日少护 ClassifiedIndex：Code：10224Confidential(yes/no)：noNO．：130310211DissertationfortheMasterDegreeIdentificationofPi9GeneAmongRiceCultivarinHeilongjiangProvinceandImprovementofRiceBlastResistanceforDaohuaxiangCandidate:JiangSidaSupervisor:Prof.ZouDetangDegreeCategory:MasterofAgricultureCollege:CollegeofAgricultureFirstleveldiscipline:CropscienceSecondleveldiscipline:CropGeneticsandBreedingHarbinChinaJune2016 目录目录摘要.....................................................................................................................................................I英文摘要..........................................................................................................................................III1前言................................................................................................................................................11.1研究目的与意义.................................................................................................................11.2稻瘟病概述........................................................................................................................21.2.1稻瘟病的特点及危害症状............................................................................................21.2.2稻瘟病侵染与循环.......................................................................................................31.2.3稻瘟病生理小种与鉴别寄主........................................................................................51.2.4稻瘟病防治途径...........................................................................................................61.3分子标记技术及其在作物遗传育种中的应用...................................................................61.3.1分子标记的来源与定义...............................................................................................61.3.2分子标记的发展..........................................................................................................71.3.3理想分子标记的要求..................................................................................................81.3.4分子标记辅助选择育种优势.......................................................................................81.3.5分子标记技术在稻瘟病抗病育种中的应用................................................................92材料与方法....................................................................................................................................122.1试验材料..........................................................................................................................122.1.1供试水稻材料............................................................................................................122.1.2供试菌株...................................................................................................................132.2试验方法..........................................................................................................................142.2.1DNA的提取...............................................................................................................142.2.2PCR检测....................................................................................................................142.2.3稻瘟病抗病接种鉴定.................................................................................................162.3分离世代农艺、品质性状测量........................................................................................173结果与分析....................................................................................................................................183.1黑龙江省主栽水稻品种Pi9基因筛选及抗病性鉴定.......................................................183.1.1黑龙江省主栽水稻品种Pi9基因筛选.......................................................................183.1.2黑龙江省主栽水稻品种稻瘟病抗性鉴定...................................................................203.2稻花香与75-1-127分离世代分子标记选择与抗病性鉴定..............................................253.2.1稻花香与75-1-127F2世代分子标记选择..................................................................253.2.2稻花香与75-1-127F2世代稻瘟病抗性鉴定..............................................................273.3稻花香与75-1-127F2世代农艺与品质性状鉴定.............................................................354讨论...............................................................................................................................................444.1分子手段与人工接种技术相结合在稻瘟病抗性鉴定中的应用.......................................444.2黑龙江省水稻稻瘟病抗性资源筛选与利用......................................................................444.3利用Pi9基因改良优质品种稻瘟病抗性的应用前景.......................................................46I 东北农业大学农学硕士学位论文5结论..............................................................................................................................................47致谢..................................................................................................................................................48参考文献...........................................................................................................................................50攻读硕士学位期间发表的学术论文.................................................................................................55II CONTENTSCONTENTSAbstractinChinese............................................................................................................................IAbstractinEnglish..........................................................................................................................III1Introduction....................................................................................................................................11.1Objectandimportanceofthisstudy.....................................................................................11.2Summaryofriceblast..........................................................................................................21.2.1Characteristicsandhazardsymptomofriceblast............................................................21.2.2Infectionandcirculationofriceblast.............................................................................31.2.3PhysiologicalraceofRicebalstanddifferentialcultivars...............................................51.2.4Controllingmethodforriceblast....................................................................................61.3MolecularMarkertechniqueanduseinCropGeneticsandBreeding...................................61.3.1OriginanddefinitionofMolecularMarker....................................................................61.3.2DevelopmentofMolecularMarker................................................................................71.3.3Advantageofmolecularassistedselectionforseeding...................................................81.3.4Advantageofmolecularassistedselectionforseeding...................................................81.3.5UseofMolecularMarkerinbreedingforriceblastresistance.......................................92MaterialsandMethods..................................................................................................................122.1Experimentalmaterials.......................................................................................................122.1.1Ricematerialsforexperiment......................................................................................122.1.2Strainsforexperiment.................................................................................................132.2Experimentalmethods........................................................................................................142.2.1ExtractionofDNA......................................................................................................142.2.2DetectionofPCR........................................................................................................142.2.3Inoculationandidentificationofriceblast....................................................................162.3Measurementofagronomicalcharactersandqualityforsegregativegeneration.................173ResultsandAnalysis......................................................................................................................183.1Pi9genescreeningandidentificationofdiseaseresistanceamongmajorricecultivarsinHeilongjiangProvince.................................................................................................................183.1.1Pi9genescreeningamongmajorricecultivarsinHeilongjiangProvince.....................183.1.2IdentificationofresistanceforriceblastamongmajorricecultivarsinHeilongjiangProvince...............................................................................................................................203.2MolecularmarkerselectionandidentificationofdiseaseresistanceforDaohuaxiangand75-1-127segregativegeneration..................................................................................................253.2.1MolecularmarkerselectionforDaohuaxiangand75-1-127F2generation....................253.2.2IdentificationofriceblastresistanceforDaohuaxiangand75-1-127F2generation.....273.3IdentificationofagronomicandqualitycharactersforDaohuaxiangand75-1-127F2generation....................................................................................................................................35III 东北农业大学农学硕士学位论文4Discussion......................................................................................................................................444.1Applicationofcombiningmolecularandinoculationtechnologyinidentifyingriceblastresistance.....................................................................................................................................444.2ScreeningandapplicationofrisistanceresourcesofriceinHeilongjiangProvince.............444.3ProspectofusingPi9genetoimprovericeblastresistanceforhigh-qualitycultivars.........465Conclusions...................................................................................................................................47Acknowledgement............................................................................................................................48References........................................................................................................................................50PaperspublishedintheperiodofPh.M.education........................................................................55IV 摘要摘要水稻是世界粮食生产的重要组成部分，在世界粮食生产中有着举足轻重的作用。稻瘟病对水稻的危害极为严重，对水稻产量和品质都会造成严重的威胁。一直以来，稻瘟病都因为其发病范围广，变异速度快，危害严重等特点而成为水稻病害中的首要问题。以现有水稻资源为出发点，筛选其中优良的抗病资源并加以推广利用始终是稻瘟病抗性育种的首要选择。在抗稻瘟病基因中，Pi9是抗谱最广的基因之一，它能有效抵御来自多个国家和地区稻瘟病生理小种的侵染，同时，该基因在黑龙江省具有很高的应用价值。本研究利用与Pi9基因紧密连锁的pB8标记，对黑龙江省种主栽的96份水稻品种进行抗性基因筛选，同时在苗期以及分蘖盛期对其进行接菌处理。明确Pi9基因在黑龙江省96个主栽水稻品种中的分布及品种发病情况之后，从中选取品质性状优良但稻瘟病抗性较差的品种稻花香进行定向改良，利用含有Pi9单基因系的籼稻品种75-1-127作为供体亲本，优质粳稻品种稻花香品种作为受体亲本进行杂交。用pB8标记在F2世代进行分子标记选择，同时从F2世代苗期和分蘖期接种优势稻瘟病菌小种ZA5，同时对接种株系的结实率、千粒重、香味品质等性状进行检测，选择含有Pi9基因、抗病能力较强且农艺性状优良的株系。试验得到以下几项主要研究结果：(1)所选黑龙江省96个主栽水稻品种中，共44个品种携带Pi9基因，占所选品种的45%。Pi9基因分布的研究对黑龙江省水稻抗病性育种具有重要的意义。(2)所选96个主栽水稻品种的接种鉴定试验表明，携带Pi9基因的44个品种在苗期和分蘖期叶瘟平均发病级别在4级以下，整体表现为抗病。不携带Pi9基因的52个品种在相同时期平均叶瘟发病级别在5级以上，整体表现为感病，Pi9基因在黑龙江省水稻抗病性育种中具有极高的价值。(3)稻花香与75-1-127杂交F2世代113个株系中，有105个株系成功导入Pi9基因，仅8个株系不含Pi9基因，通过杂交方式可实现Pi9基因在品种间的转移。通过农艺及品质性状鉴定试验最终从抗病能力获得提升的株系中筛选出6个性状优良的个体。(4)稻花香与75-1-127杂交F2世代中，与不含Pi9基因的株系相比，携带Pi9基因的株系平均发病率降低了3个等级。利用Pi9基因对品质优良的水稻品种进行稻瘟病抗性改良具有可行性。关键词：稻瘟病；Pi9基因；水稻品种资源；稻花香；分子标记辅助选择I AbstractIdentificationofPi9GeneAmongRiceCultivarinHeilongjiangProvinceandImprovementofRiceBlastResistanceforDaohuaxiangAbstractRiceplaysanimportantroleintheworld’sfoodproduction，it’sapivotalcropintheworld.Thericeblastharmsthericeseriously,itendangerthericefromyieldandquality.Allalong,riceblastisthequestionofquestionsinricediseasesbecauseofit’swiderange,variationspeedandseriousdamage.Regardtheexistingriceresourcesasastartingpoint,thenscreeningandpromotingexcellentresistanceresourcesisalwaysthefirstchoiceinriceblastresistancebreeding.Usemolecularmarkertechnologytoscreenexcellentcultivarscouldgetresistanceresourcesquicklyandeffenciency.Pi9isoneofthewidestgeneticresistancespectrumamongtheclonedriceblastresistancegenes,itcouldresistinfectionofphysiologicalracesfrommanycountriesandregionsinthestateeffectively.Atthesametime,thegeneisvaluableofapplicationinHeilongjiangProvince.ThisstudyusedthepB8markerwhichiscloselylinkedwithPi9gene,toscreenriceblastresistancevarietiesamong96majorcultivarsinHeilongjiangProvince,atthesametime,inculatethematerialinbothseedingstageandtilleringstage,toevaluatetheresistanceofeachcultivar.AfterclearingdistrubitiongofPi9genein96Heilongjiangprovince'smajorcultivar,use75-1-127asthedonorparentwhichincludemonogeniclinesofPi9gene,HighqualityjaponicaDaohuaxiangasrecipientparentforcrossbreeding,usepB8asmakerformolecularmarkerselectioninhybridizedgroupF2generation,atthesametime,identifythericeblastresistanceatseedingstageandtillingstagebydominantriceblastrace-ZA5fortheF2generationgroup,anddetecttheagronomiccharacterssuchasripeningrate,thousandseedweightandsoonfortheinoculatedplants.ChoosethesingleplantwhichcarriesPi9geneandwhoesabilityofresistanceimprovedsuccessfullyandagronomiccharactersischoiceness.Theexperimentgotthefollowingmainresults:(1)Amongthe96selectedmajorricevarietiesinheilongjiangprovince,atotalof44cultivarscarryPi9gene,is45%oftheselectedcultivars.StudyingthedistributionofPi9genehasanimportantsignificanceforbreedingofriceblastresistanceinHeilongjiangProvince.(2)Inoculationidentificationtestfortheselected96majorcultivarsshowedthatdiseaselevelsofthe44cultivarscarryingPi9genearealllowerthanthe4thgrade,itshowsresistanceforthericeblastoverall.Diseaselevelsof52cultivarswithoutPi9geneareallhigherthanthe5thgarde,III 东北农业大学农学硕士学位论文itshowsinfectedoverall.Pi9genesishighvalueinbreedingforricediseaseresistanceofHeilongjiangProvince.(3)Among113perplantofhybridizationF2generationofDaohuaxiangand75-1-127,Pi9geneimportedinto105plantssuccessfully,only8individualsexcludedPi9genes,TotransferPi9genebetweencultivarsthroughhybridizationwillberealiztic.Finally,6unitswasfoundwhoseresistanceforriceblastandcharactersarebothchoicenessthroughtheexperimentforagronomicandquality.(4)AmongtheF2generationofDaohuaxiangand75-1-127hybridization,comparedwiththestrainswithoutPi9gene,everagediseaselevelofstrainscarryingPi9genesis3gradelower.UsePi9genetoimprovetheresistanceforriceblastamonggood-qualityricecultivarsisfeasible.Keywords:Riceblast;Pi9gene;Varietyresourcesofrice;Daohuaxiang;Molecularmarker-assistedselectionCandidate:JiangsidaSpeciality:CropGeneticsandBreedingSupervisor:Prof.ZouDetangIV 前言1前言1.1研究目的与意义水稻是世界主要粮食作物之一，在世界粮食作物中有着举足轻重的作用，其分布范围遍及世界五个大洲，全球有以稻米为主食的人口超过总人口的一半。中国作为世界水稻生产大国，水稻对粮食安全和农业可持续发展具有重要的战略意义。中国水稻产量约占全国粮食总[1]产量的38%，居世界第一位，水稻种植面积约占到中国耕地总面积的27%，居世界第二位[2][3]。因此，水稻的高产和稳产对于中国乃至全世界的粮食生产安全都有着举足轻重的作用。稻瘟病是一种世界性的病害，与白叶枯病、纹枯病并称为水稻三大病害，对水稻的高产稳产均构成了极其严重的威胁，是目前水稻生产中最严重的障碍之一。稻瘟病在世界各地都有发生，其发病面积与流行程度均高于其他水稻病害。在稻瘟病流行年份，可造成水稻减产[4]30%以上，严重时可使水稻绝产。稻瘟病生理小种繁多，变异速度快，这给稻瘟病的防治带来了极大的困难。目前，育种家对稻瘟病防治的重视程度越来越高，采用发掘抗病基因、培育抗病品种的[5]途径是目前最经济有效的方式。随着生物技术的突破性进展，分子技术在新品种选育中的应用日渐成熟，分子标记选择在育种中的推广和应用力度也逐渐增大。分子标记选择的核心内容是对与目标基因在一定连锁距离内的标记的选择，可在DNA水平上进行，避免环境因素的影响，不受等位基因显隐性的干扰，能够很大程度地提高育种效率，在提高水稻抗性、[6]品质等方面均起到重要的作用。目前分子标记辅助选择在作物遗传育种中的作用和地位已经不可替代，该技术已经成为品种性状定向改良的重要手段。黑龙江省是全国主要的水稻生产基地，蕴含着丰富的水稻品种与资源，其现有主栽品种[7]是经过多年选择的骨干品种，在品质等方面表现均比较优异，有利于对品种进行定向改良，因此利用分子生物技术从黑龙江省主栽的水稻品种入手，筛选抗病基因及优良种质资源，将[8][9]在培育高产、优质水稻品种中发挥重要的作用。张国民等利用中国以及日本的稻瘟病鉴别品种及24个抗稻瘟病的单基因系对黑龙江省的6个主栽品种进行了抗病性鉴定，试验结果表明，Pi9，PiZ-5、Pi12（t）都是在黑龙江省抗谱较广的基因，其中Pi9基因抗谱最广，达到97.75%。目前，对Pi9基因抗谱的研究比较广泛，但是对该基因在黑龙江省的分布以及利用该基因对水稻品种进行改良的研究仍然较少，利用已知携带Pi9单基因系的品种作为供体亲本对优质且抗病性较差的品种进行改良，选择与Pi9基因紧密连锁的标记对改良后的品种[10]进行鉴定并筛选，能在很大程度上对育种进程起到加速作用。本研究首先利用与Pi9基因紧密连锁的显性标记pB8作为引物，对黑龙江省主栽的96个水稻品种进行Pi9基因位点检测，同时，采用黑龙江省强致病生理小种ZA5对所选96个品种进行苗期和分蘖期接种鉴定，以明确Pi9基因在黑龙江省主栽水稻品种中的分布及黑龙江省主栽水稻品种稻瘟病抗性情况，为黑龙江省抗稻瘟病种质资源的利用与改良提供理论依据[11]。同时，对筛选试验中抗病性较差但品质性状优良的品种（稻花香）进行定向改良，稻花香食味品质在全国居于首位，是目前口感最好的大米之一，因此，选用含有Pi9单基因系的1 东北农业大学农学硕士学位论文籼稻品种75-1-127作为Pi9基因的供体亲本，利用所选定的品质性状优良但抗病性较差的粳稻品种稻花香作为受体亲本进行杂交，在杂交F2世代以pb8作为引物对所得群体进行分子标记选择，选出成功导入Pi9基因的株系。利用ZA5菌株对所得分离世代在苗期和分蘖期进行[12]抗病性鉴定以及农艺、品质性状鉴定，从分离世代中选择抗病性较强且农艺性状优良的株系，从而为实现稻花香稻瘟病抗性的改良提供依据。1.2稻瘟病概述1.2.1稻瘟病的特点及危害症状生物胁迫（即病害）是制约水稻产量的重要因素，全世界范围内报导的病害有100余种，其中稻瘟病是危害程度最为严重的病害，发病频率以及感染面积均居首位。稻瘟病（PyriculariagriseaSacc）俗称火烧瘟、嗑头瘟，是由子囊菌引起的水稻真菌性病害，俗称“水稻癌症”，[13]属于世界性水稻病害，在全球水稻产区均有发生，且一年四季都会对水稻生长产生威胁。1953年，T.IShiyama的报道称：在1560年，意大利的资料曾对稻瘟病进行过记载。我国明代学者宋应星在1637年所著《天工开物》一书中曾对有关“稻灾”的情形进行描述，他[14]认为稻苗枯死现象是灼热烫伤引起的，源于日照以及热气，当时将之成为稻热病。日本在1704年曾对该病害进行了记载，并做出相应的描述。1891年，伽瓦纳将此种病害正式命名为稻瘟病。到今天为止，已经有超过80个国家对稻瘟病的发生进行过报道，世界各大洲中，亚洲与非洲发病相对严重。由此可见，稻瘟病有着久远的历史，在全球分布广泛，对水稻生产造成的危害不容忽视。稻瘟病菌属子囊菌亚门，其无性态为稻灰梨孢（PyriculariagriseaSacc），属半知菌亚门（Devteromycotina）,丛梗孢纲、丛梗孢目、丛梗孢科、梨形孢属。有性态为（MagnaporthegriseaBarrYaegash）子囊菌亚门属（Magnaporthe），但一般不常见。该病菌不仅能侵染水稻，还可[15]以侵染小麦、大麦和粟等农作物，甚至可侵染植物的根部。目前稻瘟病菌有性世代只在人工培养基上生产，尚未在自然环境下出现，无性世代则是在水稻中进行传播，是对作物造成危害的主要类型。稻瘟病菌群体大，生理小种繁多，变异速度快，分布范围广，给水稻造成的危害不可估量，在全球范围内对水稻生产都构成了严重的威胁。我国每年稻瘟病发病面积62约为3.8×10hm，所造成的水稻减产高达15%~50%，对水稻产量及生产稳定性构成了极大的威胁。稻瘟病在水稻各时期均有发生，尤其在水稻四叶期至抽穗期感病情况最为严重。该病主要对水稻的叶片，茎秆，穗部造成损伤，其中叶瘟和穗颈瘟较常见且危害较大，严重时可使水稻茎秆损伤，植株枯萎甚至死亡，在一个生长季节里，只要条件合适，稻瘟病菌就能自主完成菌量积累过程而造成病害的流行。稻瘟病对作物的侵染有以下特点：侵染频繁，潜育期短，能够借气流和雨水飞溅传播；病原物繁殖率高但寿命不长，对环境敏感，不利条件下[16]会迅速死亡；病害传播距离远且效能高。稻瘟病菌在遗传上具有多样性和复杂性的特点，且易于变异，这是稻瘟病广泛流行的主要原因，稻瘟病菌的这种特点也经常导致一个抗病品种在大面积种植3-5年后就会“抗性丧失”成为感病品种。[17]按发病部位不同可分为苗瘟、叶瘟、节瘟、穗颈瘟、谷粒瘟等类型。2 前言(1)苗瘟三叶期之前为秧苗病症的高发期，种子所携带的细菌是其主要的致病因素。所携带的病菌首先对幼苗基部进行侵染，导致幼苗枯萎，卷缩，颜色变为褐色。当湿度达到一定标准时，[18]会有大量的灰褐色霉层出现，严重时可导致成片的秧苗枯死。(2)叶瘟叶瘟贯穿整个水稻的生长过程，分蘖期危害最为严重。发病初期，病斑为褐色点状，水渍形态。病斑逐渐扩大，严重时可导致叶片全部枯死，整片稻田如同火烧状。外界因素加之品种自身对稻瘟病抵抗能力不同，使得叶瘟病斑分为以下几种类型。慢性型病斑：此类病斑症状在稻瘟病中最为常见，病斑为梭型，最外层具有黄色或淡黄色晕圈，此类晕圈被称为中毒部。梭型内圈呈褐色，称为坏死部。中央呈灰白色，称为崩溃部。病斑两端中央的叶脉会因为感染而呈现长条状，并变为褐色，这部分成为坏死线。当湿度达到一定标准后，病斑背面也会出现灰绿色的霉层。当病斑数量较多时，病斑之间能够相互连接，形成更大且不规则的病斑，严重时可导致整个叶片枯死。急性型病斑：当发病条件适宜时，感病品种叶片上经常会产生椭圆形（接近圆形）的病斑，病斑呈暗绿色水渍状。在病斑正反两面会出现大量灰绿色霉层。急性型病斑发展很快，经常会引起流行病症。当天气和湿度达到一定条件时，可转化为慢性型病斑。褐点型病斑：病斑为针头大小，褐色。多在气候干燥的环境下产生。位于抗病品种和植株下部叶片上，在适宜的温度和湿度较高的条件下，可转为慢性型病斑。白点型：多出现于感病品种嫩叶部位，呈圆形白色小点，不形成霉层。在外界环境达到要求的情况下，此类病斑会在短时期内发生转变，转化为急性型病斑。(3)节瘟大多发生于抽穗之后，初始发病时会在稻节上产生变化，形成褐色小点，然后逐渐围绕稻节蔓延，发病部位逐渐变为黑色，且容易引起发病部位折断。发病较早的植株形成枯白穗。有时节瘟只发生在茎秆一侧，容易造成茎秆弯曲，引起植株倒伏。当湿度达到一定条件时，病节上会产生灰绿色的霉层。(4)穗颈瘟、枝梗瘟使穗颈和枝梗受到伤害，病斑多呈灰黑色和淡褐色。早期发病且比较重的植株，穗会枯死并呈现白穗，与螟虫害产生的白穗相似。发病较迟时，可对稻梨的饱满性造成影响，秕谷量增加，影响水稻产量。穗颈瘟在近几年较为严重，对水稻生产造成较大的损失。(5)谷粒瘟发生在谷粒的护颖和颖壳上，病斑呈黑褐色，形状为椭圆形或不规则的小斑点。部分颖壳不会产生发病痕迹，但护颖会因发病造成的伤害而变成褐色，进而使种子感染病菌。1.2.2稻瘟病侵染与循环日本学者曾最早稻瘟病主要以分生孢子或菌丝的方式越冬，在第二年，在气温回升至20℃左右，湿度适宜的条件下，稻瘟病菌大量产生分生孢子，分生孢子主要在午夜至凌晨之间产生，通过外力进行传播，寻找寄主并附着在寄主表层，孢子尖端的粘胶萌发并以此附着在寄主表面，继而萌发形成芽管。芽管自身能够进行特异性分化，继而产生变异，形成一种3 东北农业大学农学硕士学位论文特殊休眠结构，称之为附着胞。附着胞能够产生侵染栓，侵染栓能够穿透表皮细胞壁，继而在寄主细胞中生长，产生次生菌丝，并对临近的表皮细胞以及叶肉深处进行侵染。病菌潜伏期约为5-7d，之后产生病状，形成中心病株。被侵染的组织在短时间内产生新的菌丝和分生孢子梗，再次通过分化作用产生大量分生孢子并从病斑中释放出来，同样依靠外力进行传播，[19]新形成的分生孢子可对寄主造成重复侵染。研究表明，稻瘟病菌附着孢的形成受遗传因子和外界因素双重作用。产生附着胞以及侵入钉，在适宜的温度与湿度下进行侵染，继而在寄[20]主中生长。发病的组织会在适宜的环境条件下产生新的孢子和菌丝，对水稻进行重复侵染。对附着胞的形成，科学家进行了多年的研究，病原菌孢子在水分和温度条件均适宜的情[21]况下，仅仅依靠靠自身而不需借助外源营养物质就可以进行萌发。Unchiyama等认为，水稻某些部位的蜡质能对附着胞的形成产生刺激作用，而其他部位会抑制附着胞的形成，由此[22]可以得出，水稻叶片表面的物理与化学特性能够对附着胞的形成产生一定的影响。Xiao等则认为，物质表面硬的特性，无论亲水还是疏水，都可诱导附着胞的形成。稻瘟病菌侵染水稻是以水稻表皮上的机动细胞为主要侵染点，也可自伤口侵入。病菌侵入后即向邻近的表皮细胞或薄壁细胞扩展蔓延。寄主细胞对病菌侵染的反应主要有：形成棕色圈和维管束细胞产生深色物质围困菌丝；薄壁细胞崩散和干枯；形成黄晕圈，圈内的薄壁细胞内容物已部分消失，有人认为棕色圈薄壁细胞干枯与维管束细胞生成深色物质，可能限[23]制了病斑的扩大。[24]Howard等通过研究得出结论，病原菌的侵入以机械作用为主，顶胞细胞膜会受到硬质物质表面产生的局部压力，这种压力与粘胶分泌有关，可以激活位于细胞膜上的离子通道，进行信号传导作用,促进分生孢子的萌发作用，这一过程可能受到酶或者其他辅助作用的催[25]化影响。稻瘟病菌对寄主的侵染还会受到诱导机制的影响，Fujita,K等人在1995年经过研究得出结论，分生孢子萌发液中存在脂溶物质中，这种脂溶物质是稻瘟病菌致病因子的主要栖身地，它的诱导作用可以使得水稻病原小种产生变异，从而使得对寄主的致病能力发生改[26]变。王玉环等人在1996年对稻瘟病菌致病性进行研究，认为稻瘟病菌的致病性与稻瘟病菌孢子萌发液的诱导侵染能力呈正相关。孢子萌发液水层部分的诱导侵染活性高于脂层部分，同时，研究表明稻瘟病菌孢子萌发液存在与稻瘟病菌致病有密切关系的因子或物质。1998年，[27]罗朝喜等人对稻瘟病致病机理进行研究，从稻瘟病菌致病性菌株中，采集分生孢子的发芽液，研究发现，其中确实存在感染诱导物质。提前接种或混合接种的条件均无法抑制此类感染诱导活性的表达。另一方面，对非致病性菌株的研究表明，非致病性菌株虽然无法直接导致水稻发病，但其发芽液中存在着对水稻植株有害的物质，这种有害物质能够增加水稻染病[28]几率，增加致病性菌株的病情指数。游春平等人认为，细菌发酵液在浓度低到一定程度时，可以对发芽液中的致病物质产生抑制作用，降低孢子萌发活性。在对稻瘟病菌致病性方面，有研究认为染色体上基因位置的变化能够扰乱病菌基因的遗传，这很可能是造成稻瘟病菌致病能力的复杂性的原因之一。从实践以及以上致病机理可以得出结论，稻瘟病的传播与流行需要湿度较高的环境，气候条件能够对稻瘟病菌的传播和品种抗性两个因素产生影响，在各项气候条件中，湿度是影响稻瘟病发生的最关键因素，稻瘟病对温度具有很高的适应性，只有32℃以上的温度才能对[29]稻瘟病起到抑制作用。水稻的抽穗期是防治稻瘟病的关键时期，需要在此时期重视对稻田4 前言的管理和监测调查，采取有效措施。同时，水稻品种和栽培地域的不同都是稻瘟病发病与否的决定因素。1.2.3稻瘟病生理小种与鉴别寄主稻瘟病生理小种繁多，且极其不稳定。单个的稻瘟病菌孢子进行培养，也会产生许多不同的生理小种。日照、雨露等自然环境的复杂多变，栽培管理方式的缺陷，都加剧了稻瘟病菌生理小种的变异速度。这种特点使得稻瘟病菌能在短时间内完成变异，在抗性基因强大的[30]选择压力下产生新的生理小种，导致抗性基因失效。因此，具有抗性的品种经过几年种植[31]之后，往往会发生病原性的改变，从而失去其对稻瘟病的抵抗效果，对稻瘟病菌生理小种的研究能够为抗病新品种的培育指明方向。从20世纪60年代至今，世界各产稻国或地区都先后建立各自的鉴别品种用于稻瘟病菌生理小种研究，目前建立和利用的鉴别品种达10多套。日本、韩国、中国、印度、美国等世界水稻的主产国均根据本地的生产状况建立了相应的鉴别体系，以此对当地稻瘟病生理小种进行划分。美国采用拉克罗西、瓦格-瓦格、沙田早P、沙田早S、杜拉、辛尼斯、NP125、C25309、拉米纳德Str.3、卡罗柔十个品种作为鉴别寄主，将来自美、欧、亚三洲的165个[32]菌株划分为15个生理小种。菲律宾鉴别品种由台中低脚乌尖、沙田早S、长香糯、CI5309、拉米纳德Str.3、DA-2CO25、稗秆稻、拉克罗西、皮泰、Kataktara、瓦格-瓦格和KhaoTahHaeng17组成，在1963-1974年，共检测了3225个稻瘟病菌株，划分出255个生[33]理小种。印度在1961年以美国10个鉴别品种为基础，加入Mas5、SM6、CR906、本格[34]旺及AC1613组成了印度稻瘟病生理小种的鉴别品种。经过四年的探索，中国在1976年利用从全国各地选出的1739个稻瘟病菌株对212个水稻品种进行测定，根据品种的抗病表现最终选出了7个具有代表性的中国稻瘟病菌生理小种鉴别品种。这7个品种分别是特特普、珍龙13、四丰43、东农363、关东51、合江18、丽[35]江新团黑谷。这7个品种将全国各地提供的827个菌株划分为7个种群，43个生理小种。使特特谱致病的小种属于ZA种群，不能使特特谱致病而能使珍龙13致病的小种则属于ZB种群，以此类推。ZA、ZB、ZC种群包含的小种称为籼型小种，其余4个种群小种则称为粳型小种。在20世纪70年代末至80年代初，黑龙江省的优势种群为ZA,ZE,ZF,ZD。直到80年代末，优势种群未发生明显变化。20世纪末，黑龙江省优势小种为ZE1。1995年，商世吉，李[36]明贤，朴明浩等利用中国7个鉴别群体对黑龙江省110个稻瘟病菌株进行划分，将这110个菌株划分为4个种群，7个生理小种。同时利用日本青泽所开发的12个单基因抗性鉴别寄主为标准对上述菌株进行划分，得到77个生理小种。同时证明，Pi-b，Pi-t，Pi-zt三个基因[37][38]在稻瘟病抗性育种中具有较高的应用价值。2002年，优势小种变为ZG1。到2006年，优势小种变为ZE1,ZG1，ZE3，ZF1。由此可见，稻瘟病优势小种的数量随着主栽品种的改变而增加，种类也随之改变，而稻瘟病优势种群的改变则会引起主栽品种抗性的丧失。5 东北农业大学农学硕士学位论文1.2.4稻瘟病防治途径在稻瘟病防治中，探究稻瘟病流行的决定性因素，总结不同稻区对稻瘟病控制的经验以及相应措施，从生育期、外界环境等多方面考虑，以选育适应当地的优良品种为基础。从微观和宏观两个方面深入研究稻瘟病病菌与寄主群体之间的互作模式以及生理生化机制，分析稻瘟病菌优势小种形成的原因并相应选取能够有效抵优势小种的优良品种，可以有效减轻稻[39]瘟病对水稻带来的损害。植物侵染性病害的流行，需要在其发生发展全过程的各个阶段依次遇到适宜的或较适宜的环境条件。有些环境因素是通过改变寄主的生理状况和抗病性而影响病害的，例如光照，温度等。因此通过加强栽培管理的方式调控外界环境，加强肥水管理，调整好氮、磷、钾肥[40]的比例，能够有效提高水稻稻瘟病抗性。在水稻关键时期用药，对叶瘟的防治要在早期进行，可于分蘖期着手对叶瘟的防治工作，对穗颈瘟需要在破口期7天内对稻苗进行重点保护，孕穗期和齐穗期为其最佳的防治时期。稻瘟病的发生与气候、降雨等有着密不可分的联系，因此应该在时刻关注天气情况的前提下[42]合理施用药剂。三环唑，稻瘟灵等都是能够有效抵抗稻瘟病的化学杀菌剂，三环唑属于专用的防治稻瘟病的杀菌剂，该杀菌剂因为其较强的内吸性而具有预防和保护的作用，能够在施用药剂之后迅速进入水稻根部以及叶片。目前，对稻瘟病的防治主要采取化学防治和应用抗病新品种两种途径。化学防治虽然起到了重要的作用，但是它所造成的环境污染以及农药残留对人体造成的伤害也不容忽视。因此，发掘抗病基因，选育并推广抗病品种是控制稻瘟病最安全且有效的方法。随着人们生活水平的提高以及对环保认识的深入，对植物病虫害防治中应当优先考虑对环境的污染问题，防治技术的无公害化已经成为了今后一种趋势，世界各国对抗性资源的筛选和新品种的开发给予了高度重视。以培育抗病品种为核心，增强农业措施并适当施用农药的防治方法被逐渐[43]推广，这一措施也为我国粮食的高产稳产做出了保障。1.3分子标记技术及其在作物遗传育种中的应用1.3.1分子标记的来源与定义[44]分子标记发展于20世纪80年代，其本质是某种具有特异性的DNA片段，该片段可[45]反映出生物个体或种群中某种差异。它是继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后最为[46]可靠的全新类型的遗传标记技术。标记是便于识别的象征，人们在对生命体本质进行深入研究的时候，发现了DNA序列中存在的大量非编码序列，这些序列占到整体序列的90%以[47]上，同时，这些非编码序列具有与其他序列不同的在全基因组分布的一级结构。随后，人们通过绘制人类基因组框架草图以及对越来越多的模式生物进行基因组测序发掘了新的DNA特异序列，继而对这些序列在染色体上的位置进行定位。随着被定位DNA数量的增加，特异序列与基因片段之间的连锁也被人们加以重视和利用，整个基因组内，被标记基因的密度也逐渐增加，为人们探索各种生物基因组DNA指明了方向。6 前言[48]广义的分子标记包涵DNA序列和蛋白质的遗传及检测。如今广泛应用的狭义的分子标记概念则只包括DNA标记。该技术可从分子层面对DNA碱基序列变异进行检测，摆脱材料形式和外界条件影响；在整个基因组均有分布，数量与提供信息量充足；多态性高，易于选择；可使目标基因摆脱不良性状的干扰；部分分子标记表现为共显性，能够分别纯合与杂合基因型，保证遗传信息的完整性。分子标记的应用在生物育种方面实现了质的飞跃，为作[49]物遗传育种开启了新的篇章。1.3.2分子标记的发展日本学者Nagao和Takahashi于1963年绘制了第一张水稻的遗传连锁图，该图包含了12[50][51]个水稻连锁群。在其后的35年，水稻形态的标记数目达到209个，增长速度较慢。但是对经典遗传学的应用为今后分子标记构建遗传连锁图起到了重要的指导作用。[52]相比于形态学标记，DNA分子标记具有显著的准确、高效的特点。DNA分子标记可直接反应单个核苷酸或多个核苷酸序列间的差异，继而比较基因组间的多态性，因此DNA标记的数量十分庞大，可避免环境影响以及生育期的限制，在各个生育时期均可进行。同时[53]DNA标记可准确选择并稳定遗传。目前，随着分子生物学技术的不断进步与发展，对水稻等多个作物的测序工作已经完成，相关数据库的建立以及分子标记数目和类型也不断增加。分子标记的发展根据其所利用的核心技术手段分为三个阶段。[54]最早对限制性片段长度多态性(RFLP)的应用代表了第一代分子标记技术，该技术的最早创立者是Grozdicker，Bostein在1980年再次对RFLP技术进行描述。DNA经限制性内切酶作用之后，可以得到在长短、种类、数量上均有差别的DNA片段，通过RFLP技术对所形成的特定DNA片段大小进行检测，此过程需要通过电影以及Southern技术进行转移，并在硝酸纤维素膜上进行，通过放射自显影此检测DNA分子上不同酶切位点片及其多态性。DNA序列的变化关系到限制性内切酶位点的丢失以及酶切片段长度的变化。因此RFLP结果稳定，所标记的等位基因具有共显性特征。但由于在RFLP分析时，需要放射性同位素和核酸杂交的技术，因此在安全和自动化方面存在一定的缺陷。为克服这些缺点，1990年，Williams等人建立了随机扩增多态性DNA（RAPD）技术，该技术可利用大小为10个碱基的引物对DNA片段进行非定点式的扩增，利用琼脂糖凝胶电泳技术对扩增片段进行检测，通过溴化乙锭或银染技术对RAPD指纹进行记录，分析DNA的多态性。相对于RFLP技术，RAPD技术具有以下优点：(1)所需DNA量较少；(2)对种属间特异性以及基因组的构成不产生依赖性；(3)试验设备相对简单，在DNA探针以及引物设计等方面具有简捷性；(4)技术要求较低，检测速度快，试验周期短。(5)在基因组间分布广泛，覆盖性高，许多片段仅仅需要一个引物就可进行扩增，不需要介入同位素，安全性高。因此，RAPD在基因定位、品种鉴定等多方面都有着广泛的应用。但是RAPD技术的影响因素较多，试验缺乏重复性，其显性遗传的特性导致该技术无法对杂合子进行鉴别，会增大基因位点以及遗传距离间的计算误差,另一方面，RAPD技术敏感性较高。在RAPD和RFLP的基础上，SCAR和CPAS等技术相继建立，完善了DNA多态性的研究和分子标记技术。第二代分子标记技术以PCR技术作为核心，利用真核生物基因组中的重复序列。其中，7 东北农业大学农学硕士学位论文以15-65个核苷酸为重复单位长度的属于小卫星DNA，以2-6个核苷酸为重复单位长度的属于微卫星DNA，小卫星以及微卫星DNA在整个基因组不同位点中均有分布。1991年，Moore等以PCR技术为基础创立了SSR。1996年，Ali等人通过对人类基因组的研究开始了最早的SSR分子标记。在这之后，水稻、小麦、玉米、拟南芥等多种植物均应用了SSR分子标记。SSR即微卫星DNA，是指1-6个碱基对串联而成的简单重复序列，长度较短。对于不同的遗传材料，重复次数差异性较大，从而引发SSR座位的多态性，这种多[55]态性也是SSR标记产生的基础。SSR标记的原理：每个SSR座位两侧的单拷贝序列在同一物种中相对保守，可据此在基因组中设计引物，通过特异性引物扩增SSR序列，后经聚丙烯酰胺凝胶电泳、染色，最终通过比较染色条带相对迁移距离的大小比较所选择个体的多态性。SSR标记中很多标记为共显性，可筛选出纯合体，有利于隐性性状的选择，且多态性显著，在整个基因组中均有分布，避免环境影响，可在早期世代进行选择，具有极高的优越性。单核苷酸多态性的标记被称作第三代DNA分子标记。这种标记以基因组中分散的单个[56]碱基间存在的差异为基础。通过对单个碱基的插入、缺失和替换进行分析，因此分布密集，多态位点数量较大，适用于任何种群，能够稳定遗传并易于进行自动化分析，具有很好的前[57]景。Xu等对水稻亲本9311进行了检测，共得到SNP位点768万个，所绘制的Bin图具有具有很高的密度，并以此定位了1个具有很高价值的QTL。1.3.3理想分子标记的要求作为科学家理想的分子标记，需要具备以下几点要求：(1)有较高的多态性。(2)共显性遗传，能够通过分子标记鉴别二倍体株系的纯合性。(3)在整个基因组中均有分布。(4)分子标记要在整个基因组中均匀分布（特殊位点除外）。(5)检测手段简易，快速，试验开发成本低廉。(6)重复性好，能够在实验室内重复进行。1.3.4分子标记辅助选择育种优势选择是育种当中最关键的环节之一。在对作物性状进行选择时，常规育种虽然可通过对表型的观察获得纯合植株，但观察周期过长，导致育种效率较低。最有效、便捷的方法是直接依据个体的基因型进行选择，分子标记辅助育种通过对基因型的识别为育种提供了全新的[58]途径。Lande等在1990年将分子标记作为辅助选择的手段，随着分子标记技术的逐步应用和推广，利用该技术进行辅助选择育种突破了作物生育期的限制，在常规育种基础上结合分子标记技术可以利用与目标基因紧密连锁的标记在DNA水平上进行筛选，具有以下几种优势：[59](1)可在早期世代进行选择，也可在植物体各个时期进行筛选，从而获得目标基因型，在很大程度上缩短育种的年限，同时避免环境因素的影响以及等位基因显隐性的干扰。8 前言(2)分子标记辅助育种可针对数量性状以及质量性状进行有效选择，以常规育种为基础，利用分子标记的手段进行辅助，可以准确地定位质量性状，避免单纯常规育种中客观因素引起的误差，在育种项目进行的初期阶段，育种往往材料较少，或缺少重复鉴定，尤其对一些需要特殊条件、不易界定和掌控的表型性状的筛选具有较大风险，而采用分子标记辅助选择育种则能够有效防止目标基因的丢失，相对于传统育种具有可靠、高效的特点。(3)分子标记辅助育种在整个过程中不涉及外源基因的引入，与转基因育种有本质上的差别，充分利用了种群间的多态性，因此分子标记辅助育种可避免外源基因等因素引起的安全隐患。(4)在分子标记辅助选择中，采用共显性标记可以有效区分纯合体和杂合体，提高了分离世代植株基因型的检测的效率和准确度。在隐性农艺性状的检测中起到了重要的作用。通过分子标记辅助选择育种，可聚合多个优良基因，促进基因互作，大幅提高育种效率，巩固育种成效。基因聚合是通过杂交、回交等手段将有利基因聚合相同基因组中，通过(5)分子标记辅助选择含有多个优良基因的株系，将会为培育持久抗性的品种提供全新的途径。(6)分子标记辅助选择能够打破基因间连锁，有效分离有利基因和不利基因。在回交育种中可将主效基因导入到轮回亲本中，快速恢复轮回亲本的基因型。1.3.5分子标记技术在稻瘟病抗病育种中的应用水稻稻瘟病抗性主要包括垂直抗性和水平抗性，垂直抗性一般是指由1-2对显性主效基因控制的小种专化抗性，水平抗性主要由微效多基因控制。在推广初期，一般单基因显性控制的显性与隐性表型有明显的抗、感病界限,方便后代选择，但垂直抗性一般只针对一个或少数几个病原物小种,抗性易随优势小种的变异而丧失。具有垂直抗性的品种虽然表现优良，但是当生理小种变异时，该品种便会逐渐表现出感病，即抗性丧失；而具有水平抗性的水稻品种在进行推广时候，对稻瘟病的抵抗能力较强。目前，育种家不断从现有水稻资源以及基因的角度进行研究，以提高水稻的水平抗性。日本在20世纪60年代中期开始对水稻品种中抗病基因进行分析，鉴定出了最早的8个位点上的14个抗性基因。随后，国际水稻所以及各水稻主产国均开始对稻瘟病抗性基因以及5遗传进行系统性研究，Pi-z，Pi-1和Pi-ta是水稻主效抗性基因中最早利用RFLP进行定位的[60]基因，这三个基因分别被定位于第6,11和12条染色体上。首个被克隆出的稻瘟病抗性基因是Pib基因，利用图位克隆的方法从BL1品种中得到。最初的定位由Miyamoto利用RFLP标记完成，将Pib基因定位在二号染色体上，位于染色体[61][62]长臂一侧近尾部区域。在这基础上，Wang等将该基因进行了精细定位，将其定位在标[63]记S1916和G7030之间，并通过图位克隆法将Pib基因分离。刘洋等在2008年对Pib基因建立分子标记，利用分子标记从分离世代中选择出了纯合的含有Pib基因的抗病植株。在对Pib基因进行克隆之后，被定位于水稻第12条染色体靠近着丝点附近的Pi-ta与2Pi-ta基因也是水稻主要的抗病基因，通过对这两个基因间互作关系的探究发现，Pi-ta是22[64]Pi-ta基因存在的基础，同时Pi-ta基因具有比Pi-ta基因更广的抗谱，Bryan等通过进一2步的研究表明，Pi-ta基因是Pi-ta基因与其他抗性基因在紧密连锁条件下的产物。如今，利用分子标记技术发掘、克隆抗病基因并将抗病基因导入、聚合到水稻品种中，已经为水稻抗9 东北农业大学农学硕士学位论文病育种提供了全新的途径，能够为水稻提供稳定而持久的抗性。Pi9基因由AmanteBordeos等于小粒野生稻中发现并命名，被定位于水稻第6条染色体短臂上，近着丝粒Pi2/9位点处，在NIP基因和PK基因之间，基因全长约9.5kb，包括2个长度分别为5362bp和128bp的内元，以及由3099bp编码区和910bp3'UTR组成的全长4[65]009bp的cDNA，是目前已克隆的84个抗稻瘟病主效基因之一。由于Pi9基因可以识别不同稻瘟病菌小种的不同分子，因此Pi9基因具有广谱的抗性。目前对Pi9基因的选择主要采用pB8作为标记。该基因能够抵御来自多个国家和地区的[39]多数稻瘟病生理小种的侵染，雷财林等人利用9个日本鉴别品种、7个中国鉴别品种、31个抗稻瘟病单基因系及12个当地主栽品种，对2006年采自黑龙江省主要积温区不同水稻品[66][67]种的173个稻瘟病菌株进行致病性测定。倪大虎、陈健民等分别将Pi9导入不同水稻恢复系M12和闽恢3139中。抗性鉴定结果表明，所育成的改良品系抗瘟性均得到显著提高。经过研究得出结论，Pi9基因在黑龙江省所有积温区对稻瘟病菌株的抗谱均很广，对当前黑龙江省水稻抗病性育种具有极高的价值。随后，对水稻抗病基因的克隆不断推进，截至2015年3月，已至少报道了69个抗稻瘟病位点共84个主效抗病基因，这些基因成簇地分布于除第3染色体外的所有水稻染色体上（2个隐性，其它显性），同一染色体上包含多个抗病基因。最大的3个基因簇分别位于水稻的第6、11和12染色体。其中，Pb1,Pia,Pib,Pid2,Pid3,Pik,Pik-h/Pi54,Pik-m,Pik-p,Pish,Pit,Pita,Piz-t,Pi1,Pi2,Pi5,Pi9,pi21,Pi25,Pi36,Pi37,Pi56,Pi63,PiCO39等24个基因已被成功克隆[68]。其余大多数基因已经进行了精细定位。表1-1列出了已定位的主效抗性基因中已克隆的[69]24个基因。表1-1已克隆的主效稻瘟病抗性基因Table.1-1Themaineffectofriceblastresistancegeneshavebeencloned基因位点无毒菌株(小种)供体品种*染色体连锁标记Genelocus&AllelsStrains(race)usedDonors*Chr.LinkedmarkerPi-aB90002AichiAsahi11Pi-CO396082CO3911S2712(1.0cM)Pi-kPO6-6,Ca89等Kusabue11R543(2.0cM)S04G03与C1454之间Pi5/Pi3/Pi-iPO6-6等Tetep9的170kb内RZ536(7.9cM),Pi-1IK81-3,PO6-6等LAC11Npb181(3.5cM)Pi-shKyu77-07AShin-21与pi-t连锁RM254Pik-mIna86-137等Tsuyuake11(13.4cM)-RM144(1.2cM)(转下页)10 前言(接上页)基因位点无毒菌株(小种)供体品种*染色体连锁标记Genelocus&AllelsStrains(race)usedDonors*Chr.LinkedmarkerPik-pK6011A7(1.7cM),Pi-2592-183(ZC15)谷梅2号6RG456(1.5cM)RM224~Y6855RA之Pik-h/Pi-54H05-56-1等K311间的2cM区间Pi-tV86010K591Pai-kan-taoRG241(5.2cM),Pi-taIK81-3,K81-25等12等RZ397(3.3cM)Pi-z6RG64(2.8cM)-R2123(2.Pi-2PO6-6等Fukunishiki67cM)Pi-9PO6-6等小粒野生稻6同上Piz-tTKM.16同上OwarihatamoG271(5.0cM),pi-21/4chiG317(8.5cM)Pi-36CHL39Q618RM5647-CRG2Pi-37CHL1405等St.No.11RM543(0.7cM)pi-56PO6-6等三黄占2号9RM24022-RM24031Pi-63Kahei4pb1/Modan11C189(1.2cM)在培育抗病性新品种中，必须重视对优良种质资源的深入开发与利用。许多育种家通过[70]分子标记技术对优良种质资源进行筛选，并将筛选结果成功应用于水稻品种改良中。王军等利用稻瘟病抗性基因Pi-ta、Pib的功能标记对2009和2010年江苏省粳稻中间试验的部分粳稻品系进行基因型检测，并结合穗颈瘟抗性结果得出结论：Pi-ta、Pib基因与江苏省粳稻[71]穗颈瘟的抗性呈正相关。陈学伟等将Pid(t)1、Pi-b、Pi-ta2聚合到G46B品种中，使得该[72]品种的抗病性得到有效改善。倪大虎等在2005年将稻瘟病广谱抗性基因Pi9与白叶枯病的抗性基因Xa21聚合，同样在常规育种的基础上结合分子标记技术，将两个基因聚合到同[73]一品种中，获得了双基因的纯合植株。陈圣等在2009年将X23基因、Pi9基因和Bt基因聚合到同一株系中，这三种基因分别对水稻白叶枯病，稻瘟病和水稻螟虫具有很高的抗性，[74]聚合结果显示所得株系能同时抵抗这三种逆境。刘世平等利用SSR标记对保持系珍汕97进行改良，利用标记RZ536和RM144在BC3F1世代对含有抗性基因Pi-1的植株进行筛选，得到17株含有Pi-1的纯合株系。在优良种质资源的筛选中，合理应用分子标记技术，会为水稻新品种的选育奠定坚实的基础。11 东北农业大学农学硕士学位论文2材料与方法2.1试验材料2.1.1供试水稻材料2.1.1.1黑龙江省主栽水稻品种筛选鉴定试验材料试验材料选用黑龙江省主栽的水稻品种96份（品种名称见表2-1）；75-1-127单基因（Pi9）系，作为阳性对照；丽江新团黑谷为阴性对照。表2-196份黑龙江省主栽水稻品种名称Table.2-1Nameof96majorcultivarsfromHeilongjiangProvince品种名称Namesofcultivars石狩白毛龙盾106国主牡粘1号长白9号牡粘2号垦稻18上育397青森5号富士光龙联1号牡丹江8号龙庆稻2号牡丹江9号龙粳香1号牡丹江12号龙粳31号牡丹江18号垦香糯1号牡丹江25号龙洋1号牡丹江27号绥糯1号牡丹江28号五优稻3号稼禾1号东农421藤系137东农422绥粳4号梧农71绥粳8号朴洪根稻松粳8号国光松粳9号富国松前兴国松粳13号老头稻松粘1号早熟青森松粳14号(转下页)12 材料与方法(接上页)品种名称Namesofcultivars龙香稻1号龙稻9号龙庆稻1号龙稻10号垦稻12龙稻11号垦稻15龙稻12号垦鉴稻5莲稻1号垦鉴稻6稻花香垦粳1北稻5号垦粳3中龙稻1号垦稻8号延粘1号龙粳14号通系112龙粳18号普选10号龙粳20号滕系138龙粳26号新雪龙粳27号宾旭龙粳28号东农418垦糯1号东农423龙粳8号东农425龙粳9号东农424龙糯1号东农426合江3号东农427合江6号东农428合江8号东农429合江18号普粘7合江21号牡粘4号龙盾102农粳1号2.1.1.2品种抗病性改良亲本材料Pi9基因供体亲本：75-1-127，含有Pi9单基因系。Pi9基因受体亲本：稻花香，是享誉全国的粳稻品种，具有极其优良的品质性状。2.1.2供试菌株[75]接菌鉴定供试菌株均为ZA5，ZA5对黑龙江省主栽水稻品种具有较强致病率（63.89%），供试菌株由东北农业大学水稻研究所保存、提供。13 东北农业大学农学硕士学位论文2.2试验方法2.2.1DNA的提取[76]试验中DNA提取均采用CTAB法，具体步骤如下：第一步：将取得的新鲜叶片剪碎，取适量分别放入2mL离心管中，并按株系排序进行编号。第二步：将所得离心管放入装有液氮的泡沫盒中迅速冷却，用磨叶机磨至粉末状。第三步：事先将CTAB缓冲液预热至65℃，并分别向研磨好的叶片中加入600µL预热的缓冲液。第四步：将加入缓冲液的离心管在65℃条件下水浴40min，每隔十五分钟将管内液体摇匀一次。第五步：向水浴后的离心管中加入氯仿：异戊醇比例为24:1的溶液，并将液体充分混匀。第六步：将混匀后的离心管在室温条件下，12000r/min离心5min，并将上清液转移至1.5mL离心管中。（第五、六步可重复两到三次）第七步：加入两倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，混匀后在-20℃条件下放置十分钟，12000r/min离心5min。第八步：倒掉上清液并用70%的乙醇洗涤沉淀，直到将杂质清洗干净。并在超净工作台内将乙醇吹干。第九步：将DNA溶于50-100µLTE溶液中。第十步：向溶液中加入1µL10mg/mL的RnaseA。第十一步：将溶液置于37℃条件下保存30min，并在-20℃条件下保存。2.2.2PCR检测2.2.2.1供试引物[77]pB8引物序列见表2-2。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。pB8是基于Pi9自身设计的引物，与Pi9之间的遗传距离为0CM。表2-2引物序列与相关信息Table.2-2Primersequencesandrelatedinformation引物名碱基序列（5’to3’）片段大小NameofprimerSequencesofbasesSizeoffragmentpB8-FCCGGACTAAGTACTGGCTTCGATA500bpPB8-RCCCAATCTCCAATGACCCATAAC2.2.2.2PCR扩增PCR反应的总体积为20μL，体系组成见表2-3：14 材料与方法表2-3PCR扩增体系Table.2-3SystemforPCRamplificationPCR扩增体系DNA（25ng·μL-1）3μLPCR缓冲液（10×）2μLMgCl2溶液(25mmol•L)2μLdNTP(10mmol•L)0.2μLTaq酶0.3μL引物2μL加入ddH2O至20μL，并加入液体石蜡封盖体系。[77]PCR扩增程序如下：94℃的温度预变性6min；94℃30s，55℃30s，共35个循72℃30s，72℃延伸5min扩增产物于4℃条件下保存。2.2.2.3PCR产物电泳检测试验所得PCR产物扩增片段为500bp，适合采用琼脂糖凝胶电泳进行检测。(1)制胶根据检测样本数量将适量的琼脂粉及0.5×TBE溶液加入到锥形瓶中，混合均匀并放入微波炉中加热，待样品完全溶解后取出并冷却，并加入EB进行染色。准备好插有梳子的托架胶板，将冷却后的液体倒入，厚度约在3-5mm。等待约20min，凝胶完全凝固后，拔掉梳子，将凝固的胶体放入电泳槽中，加入电泳缓冲液至没过胶面2mm为宜。(2)点样利用微量点样器，将混合好的PCR扩增液以及DNAmaker点入点样孔中，为下一项电泳准备。(3)电泳将电泳槽盖好，将恒定电压设置在5V/cm左右，当条带跑至胶面超过1/2处时停止电泳。[79]电泳结束后，利用成像系统对凝胶进行成像，拍照并保存。15 东北农业大学农学硕士学位论文2.2.3稻瘟病抗病接种鉴定2.2.3.1接种鉴定在苗期和分蘖期利用ZA5菌株对黑龙江省96个水稻主栽品种进行抗稻瘟病鉴定。苗期接菌鉴定于2013年在东北农业大学温室内进行，于2013年4月15日播种，采用秧盘种植，选取饱满健康的种子，每穴播种10粒，在长至3叶1心时期利用ZA5菌株的孢子悬浮液进行喷雾，使液滴均匀分布于叶片及茎秆。喷雾接菌后，用塑料薄膜覆盖保湿，遮光处理24小时后置于温室中培养，控制温度与湿度。分别在处理后7-10天，根据病斑的形状、大小和数量，以国际水稻所叶瘟分级标准（表2-4）作为参照，调查水稻叶瘟发病级别，计算平均值。分蘖期接菌鉴定于2013年在东北农业大学香坊试验田进行，4月16日播种，5月20日移栽，田间随机区组排列，每份材料种植1行，每行20株，株行距13.3cm×30cm，每穴1株，田间管理按常规进行。在分蘖盛期从每行中选取3株，每株3个分蘖，采用注射接菌的方式，离颈基部20cm处人工注射ZA5生理小种，接菌量以心叶有水滴溢出为止，每稻杆约0.5mL。对已注射过的稻杆做标记，在接菌7-14天时按照国际水稻所叶瘟发病级别调查标准（表2-4）进行调查，统计发病级别并计算平均值。稻花香与75-1-127杂交F2世代接种鉴定试验于2014年进行，接种方法与黑龙江省96份主栽水稻品种接种鉴定试验相同，分别在接菌7天和14天时调查发病级别并计算平均值。表2-4国际水稻所叶瘟发病级别调查标准Table.2-4TheevaluationcriterionofriceleafblastfromtheInternationalRiceResearchInstitute发病级别症状表现评价标准DegreesofdiseaseSympotomsEvaluationCriterion0级无病高抗（HR）1级仅有小的针尖大小的褐点抗（R）2级较大褐点抗（R）3级小而圆以至稍长的褐色的坏死灰斑，直径1-2毫米抗（R）典型的稻瘟病斑或椭圆形，长1-2厘米，常限于两条4级中抗（MR）叶脉间，病斑面积不足叶面积的2%5级典型的稻瘟病斑，受害面积小于10%中感（MS）6级典型的稻瘟病斑，受害面积为10%-25%感（S）7级典型的稻瘟病斑，受害面积为26%-50%感（S）8级典型的稻瘟病斑，受害面积为51%-75%高感（HS）9级全部叶片死亡。高感（HS）16 材料与方法2.2.3.2稻瘟病抗病级别及评价标准计算将所选群体按照否携带Pi9基因为标准分为两部分，分别计算这两部分在苗期和分蘖期[80]的平均发病级别，并统计发病区间。按照表2-4的评定标准对这两部分品种在两时期的发病情况进行统计，得出两部分品种中从高抗到高感各级别的品种数量。同时计算这两个部分[81]品种在苗期和分蘖期的抗病率。抗病率=（高抗+抗病+中抗）/群体数×100%。2.2.3.2稻瘟病抗病级别及评价标准计算在2014年9月收获稻花香与75-1-127杂交F2世代中标记的株系，测量每行收获株系的结实率，千粒重，单株穗重以及糙米率和精米率，并计算平均值。在抗病能力较强的株系中选取综合性状优良的个体。2.3分离世代农艺、品质性状测量测量稻花香与75-1-127杂交F2世代中被标记株系的结实率，千粒重，单株穗重等农艺性状，同时评价标记株系的糙米率、精米率和香味等品质性状。选择与母本性状相近或优于母本的株系作为重点改良对象。糙米率（%）=糙米量/稻谷量×100%精米率（%）=精米量/稻谷量×100%17 东北农业大学农学硕士学位论文3结果与分析3.1黑龙江省主栽水稻品种Pi9基因筛选及抗病性鉴定3.1.1黑龙江省主栽水稻品种Pi9基因筛选以75-1-127为阳性对照，丽江新团黑谷为阴性对照，将选取的96份寒地粳稻品种以pB8为标记进行PCR扩增，携带Pi9基因的品种会在500bp处扩增出阳性条带（如图3-1），图3-1为部分材料扩增结果。对所有材料的扩增结果表明，所选96个品种中有44个品种扩增出目标条带，如早熟青森、垦粳1等，说明这44个品种携带Pi9基因。其余包括稻花香在内的52个品种未扩增出目标条带，则不携带Pi9基因。Pi9基因在所选品种中的占有率达到45.8%。试验材料中选自五常以及从日本引进的品种携带Pi9基因的频率相对较高，可加大力度对以上地区的品种进行推广。稻花香在500bp处未扩增出条带，证明该品种不含Pi9基因。18 结果与分析19 东北农业大学农学硕士学位论文注：图3-1为表2-1中所有品种以pB8为引物的扩增结果，其中泳道M为Marker2000，泳道1为75-1-127（阳性对照），泳道2为丽江新团黑谷（阴性对照），泳道3-泳道98分别对应表3-1中所有品种Note:Fig.3-1isPCRamplificationsofpB8specificmarkersforallthecultivarsinTable2-1，TrackMcorrespondingtheMaker2000.Track1corresponding75-1-127(Controlofpositive),Track2correspondingLijiangxintuanheigu(Controlofnegative),Track3toTrack98eachcorrespondingallthecultivarsinTable3.图3-1黑龙江省主栽水稻品种PCR扩增结果Fig.3-1PCRamplificationsformajorricecultivarsfromHeilongjiangProvince3.1.2黑龙江省主栽水稻品种稻瘟病抗性鉴定利用强致病力稻瘟病生理小种ZA5接种供试材料并调查发病级别（结果见表3-1）。并对所选试验材料的抗病性鉴定结果与分子标记结果相结合进行分析。对携带Pi9基因的供试材料进行分析可得出结论，其苗期和分蘖期两时期发病级别较低，叶瘟整体发病级别在0~5.3级和0~4.2级之间，平均发病级别分别为2.4和2.6级，表现为抗病。相同时期不含Pi9基因的供试材料叶瘟发病级别在0~8.6级和0~9.0级之间，平均发病级别分别为5.1和5.4级，表现为中感。对苗期抗病性鉴定结果分析表明：表现为高抗的材料有龙粳14号、龙粳20号、龙联1号、绥粳8号、松粳9号、北稻5号、龙洋1号、东农424等8个品种；表现为抗病的有龙盾106、龙庆稻1号、龙稻12号、宾旭、垦粳1、松前、国光、富国、合江6号、绥糯1号、东农422、垦香糯1号、龙庆稻2号、龙粳香1号、上育397、龙香稻1号、牡丹江9号、牡丹江18号、垦稻18、垦鉴稻5、龙粳26号、国主、早熟青森、稼禾1号等24个品种；表现为中抗的有老头稻、龙粳28号、龙糯1号、兴国、牡粘2号、莲稻1号、五优稻3号、合江8号、松粳香1号、通系112等10个品种，表现为中感的有石狩白毛和梧农71等2个品种。对分蘖期抗病性鉴定结果分析表明：表现为高抗的有石狩白毛、兴国、垦香糯1号共3个品种；表现为抗病的有北稻5号、梧农71、龙粳14号、龙稻12号、龙庆稻2号、上育397、富国、龙粳20号、龙联1号、莲稻1号、国光、牡粘2号、东农424、牡丹江9号、东农422、龙糯1号、绥粳8号、早熟青森、老头稻、龙庆稻1号、垦稻18、龙粳28号、合江6号、五优稻3号、松前、龙盾106、稼禾1号、绥糯1号、宾旭、垦鉴稻5、牡丹江18号、龙粳20 结果与分析26号、龙粳香1号、龙洋1号等34个品种；表现为中抗的有松粳9号、国主、松粳香1号、垦粳1、龙香稻1号、合江8号、通系112等个品种；对于不含Pi9基因的供试材料进行分析可得，其苗期和分蘖期两个时期叶瘟发病级别在0~8.6级和0~9.0级之间，平均发病级别分别为5.1和5.4级，表现为中感。对苗期抗病性鉴定结果分析表明：表现为高抗的品种仅有东农426；表现为抗病的有东农421、松粳13号、垦稻15、垦粳3、龙粳8号、东农428、延粘1号、松粳8号、垦稻12、滕系138、东农425等11个品种；表现为中抗有东农429、松粳14号、垦稻8号、龙稻1号、合江3号等5个品种；表现为中感的有垦糯1号、长白9号、朴洪根稻、东农418、牡丹江27号、普粘7、牡丹江25号、普选10号、稻花香、龙稻10号、龙稻11号等11个品种；表现为感病的有龙粳18号、合江21号、新雪、牡粘4号、藤系137、农粳1号、松粘1号、龙粳9号、牡丹江8号、青森5号、龙盾102、牡丹江28号、龙稻9号、富士光、中龙稻1号、东农423、垦鉴稻6等17个品种；表现为高感的有龙粳31号、绥粳4号、牡粘1号、牡丹江12号、合江18号、龙粳27号、东农427等7个品种。对分蘖期抗病性鉴定结果分析表明：表现为高抗的有松粳8号、东农423、东农428等3个品种；表现为抗病的有东农426、东农427、垦糯1号、松粳14号、长白9号、垦粳3、东农418、合江3号、垦稻8号等9个品种；表现为中抗的有农粳1号、垦稻12、合江18号、藤系137等4个品种；表现为中感的有龙粳27号、垦稻15、富士光、松粳13号、牡丹江12号、牡丹江28号等6个品种；表现为感病的有龙粳31号、龙稻1号、青森5号、牡粘1号、牡丹江25号、东农429、垦鉴稻6、东农425、滕系138、朴洪根稻、绥粳4号、普选10号、合江21号、牡丹江8号、龙粳8号、延粘1号、牡粘4号、龙稻11号、龙粳18号、松粘1号等20个品种；表现为高感的有普粘7、牡丹江27号、龙盾102、东农421、龙稻10号、新雪、龙稻9号、龙粳9号、稻花香、中龙稻1号等10个品种。对2014年所选材料的抗病率进行计算，苗期携带Pi9基因的品种抗病率=42/44×100%=95.45%，不含Pi9基因的品种抗病率=6/52×100%=11.54%；分蘖期携带Pi9基因的品种抗病率=52/52×100%=100%，不含Pi9基因的品种抗病率=16/52×100%=30.77%，携带Pi9基因的品种抗病率明显偏高。通过对比苗期和分蘖期稻瘟病抗性可以发现，供试材料中有些材料苗期和分蘖期的抗病水平不一致，如石狩白毛苗期发病为5.3级，表现为中感，而在分蘖期表现高抗（0级）。梧农71也有类似表现；东农421苗期发病为0.9级，表现为高抗，而在分蘖期表现高感（8.2级）。由此可得出结论，水稻不同生育时期对稻瘟病的抵抗能力也会有所差异，相同基因型在不同生育期的表达也会有所不同。从表3-1中可以看出，在相同生育时期，含有Pi9基因的供试材料其稻瘟病抗性差异较大，如苗期的龙盾106和龙粳香1号，平均抗病级别均相差2级，分别表现为高抗和抗性；分蘖期的龙稻12号和垦粳1号，平均抗病级别均相差2.6级，分别表现为抗病和中感。结果表明，Pi9基因在不同遗传背景中，起到的抗病效果不同。75-1-127品种在苗期与分蘖期均表现出极高的稻瘟病抗性，而稻花香品种在两个时期对稻瘟病的抵抗能力均有待提高。21 东北农业大学农学硕士学位论文表3-1黑龙江省主栽水稻品种Pi9基因分布及抗病性表现Tabel.3-1ThedistributionofPi9geneanddiseaseresistanceofmajorricecultivarsfromHeilongjiangProvince平均发病级别是否含有Pi9基因品种名称EveragedegreeofdiseaseWhetherornotincludeNameofcultivars苗期分蘖期Pi9geneSeedingstageTilleringstage石狩白毛√5.30.0国主√3.43.6长白9号×4.63.0垦稻18√3.02.8青森5号×6.25.8龙联1号√0.01.6龙庆稻2号√2.51.4龙粳香1号√2.53.4龙粳31号×7.55.6垦香糯1号√2.40.2龙洋1号√0.03.4绥糯1号√2.23.0五优稻3号√3.72.8东农421×0.98.2东农422√2.22.5梧农71√5.80.8朴洪根稻×4.86.6国光√2.21.8富国√2.21.6兴国√3.60.0早熟青森√3.42.8老头稻√3.52.8松粳香1号√4.03.6龙香稻1号√2.74.0龙庆稻1号√1.02.8垦稻12×3.24.2垦稻15×1.55.0垦鉴稻5√3.03.2垦鉴稻6×7.46.4垦粳1√1.93.8(转下页)22 结果与分析(接上页)平均发病级别是否含有Pi9基因品种名称EveragedegreeofdiseaseWhetherornotincludeNameofcultivars苗期分蘖期Pi9geneSeedingstageTilleringstage垦粳3×2.53.0垦稻8号×4.33.4龙粳14号√0.01.0龙粳18号×5.57.4龙粳20号√0.01.6龙粳26号√3.33.4龙粳27号×8.04.8龙粳28号√3.52.8垦糯1号×4.52.0龙粳8号×2.57.0龙粳9号×6.19.0龙糯1号√3.52.6合江3号×4.43.2合江6号√2.22.8合江8号√3.84.0合江18号×7.84.3合江21号×5.56.8龙盾102×6.28.0龙盾106√0.53.0牡粘1号×7.75.8牡粘2号√3.62.2上育397√2.51.4富士光×7.15.0牡丹江8号×6.16.8牡丹江9号√2.82.5牡丹江12号×7.75.4牡丹江18号√2.93.2牡丹江25号×5.06.2牡丹江27号×5.27.5牡丹江28号×6.35.4稼禾1号√3.43.0藤系137×5.94.4(转下页)23 东北农业大学农学硕士学位论文(接上页)平均发病级别是否含有Pi9基因品种名称EveragedegreeofdiseaseWhetherornotincludeNameofcultivars苗期分蘖期Pi9geneSeedingstageTilleringstage绥粳4号×7.66.6绥粳8号√0.02.6松粳8号×3.00.0松粳9号√0.03.5松前√1.92.8松粳13号×1.25.3松粳14号×4.22.2松粘1号×6.07.4龙稻1号×4.35.6龙稻9号×6.78.8龙稻10号×5.28.3龙稻11号×5.27.3龙稻12号√1.01.2莲稻1号√3.61.6稻花香×5.09.0北稻5号√0.00.6中龙稻1号×7.29.0延粘1号×2.87.0通系112√4.34.2普选10号×5.06.6滕系138×3.46.5新雪×5.58.4宾旭√1.03.0东农418×4.83.0东农423×7.20.0东农425×3.46.4东农424√0.02.2东农426×0.00.6东农427×8.60.8东农428×2.60.0东农429×4.06.3普粘7×4.97.6(转下页)24 结果与分析(接上页)平均发病级别是否含有Pi9基因品种名称EveragedegreeofdiseaseWhetherornotincludeNameofcultivars苗期分蘖期Pi9geneSeedingstageTilleringstage牡粘4号×5.57.0农粳1号×5.94.0注：√代表含有Pi9；×代表不含有Pi9；75-1-127为阳性对照；丽江新团黑谷为阴性对照.Note:√indicatesthecultivarcontainsthegeneofPi9;×indicatesthecultivardoesnotcontainthegeneofPi9;75-1-127iscontrolofpositive;Lijiangxintuanheiguiscontrolofnegative.3.2稻花香与75-1-127分离世代分子标记选择与抗病性鉴定3.2.1稻花香与75-1-127F2世代分子标记选择从表3-1可以得出结论，稻花香苗期和分蘖期病害级别分别为5.0和9.0级，分别表现为中感和高感；75-1-127苗期和分蘖期病害级别分别为1.7和2.5级，表现为抗病；感病对照丽江新团黑谷苗期和分蘖期平均发病级别分别为8.1和9.0级，均达到高感。对稻花香与75-1-127杂交F2世代群体113个株系利用pB8作为引物进行PCR扩增，携带Pi9基因的株系同样会在500bp处扩增出阳性条带（扩增结果见图3-2）。对分离世代株系以pB8为引物的扩增结果表明，除8个株系外，其余105个株系均在500bp处扩增出了阳性条带。由此可见，这105个株系均携带Pi9基因。杂交后代Pi9基因的占有率达到93%。25 东北农业大学农学硕士学位论文注：泳道M为Maker2000；泳道1-96分别代表编号为1-96号的株系PCR扩增结果Note:TrackMcorrespondingMaker2000;Track1toTrack96eachcorrespondingthePCRamplificationsfortheindividualsfrom1to96.图3-2分离世代PCR扩增结果Fig.3-2PCRamplificationsforsegregativegeneration26 结果与分析3.2.2稻花香与75-1-127F2世代稻瘟病抗性鉴定稻花香与75-1-127分离世代抗病性鉴定结果见表3-2，由试验结果可知，父本75-1-127在苗期和分蘖期平均抗病级别均在1级左右，表现出极高的抗病性，母本在苗期和分蘖期分别表现为高感和感病，两亲本间抗病性差异较大。利用强致病菌株ZA5对稻花香与75-1-127杂交F2世代在苗期进行喷雾接菌，对接菌植株进行标记，按国际水稻所叶分级标准分别在接菌后7天与14天调查各标记单株的发病级别。接菌处理7天的调查结果（见表3-2）表明：携带Pi9基因的105个株系中，56个株系表现为高抗，44个株系表现为抗病，3个株系表现为中抗，1个株系表现为中感，1个株系表现为感病。不含Pi9基因的8个株系中，1个株系表现为中抗，5个株系表现为感病，2个株系表现为高感。接菌处理14天的调查结果表明（见表3-2）：携带Pi9基因的105个株系中，38个株系表现为高抗，52个株系表现为抗病，10个株系表现为中抗，两个株系表现中感，两个株系表现为感病。不携带Pi9基因的8个株系中，6个株系表现为感病，2个株系表现为高感。携带Pi9基因的株系在苗期抗病能力较强。表3-2稻花香与75-1-127杂交F2世代苗期平均发病级别Table.3-2TheeveragediseasegradeforF2generationofDaohuaxiangand75-1-127inseedingstage苗期平均发病级别是否含有Pi9基因株系编号EveragedegreeofdiseaseinseedingstageWhetherornotincludeNameofstrains喷雾七天喷雾十四天Pi9SevendaysaftersparyFourteendaysafterspary1√002√1.31.63√1.21.44√005√006√3.23.67√00.48√3.33.69√0010√3.13.511√0012√3.23.613√1.92.214√00(转下页)27 东北农业大学农学硕士学位论文(接上页)苗期平均发病级别是否含有Pi9基因株系编号EveragedegreeofdiseaseinseedingstageWhetherornotincludeNameofstrains喷雾七天喷雾十四天Pi9SevendaysaftersparyFourteendaysafterspary15√0016√2.32.617√3.94.318√0.5119√1.41.420√00.421√2222√3.94.523√0024√2.52.625√0.10.426√0.61.127√5.76.628√2.83.529√3.43.930√1.61.631√1.11.632√1.91.933√1.61.934√0.7135√1.32.136√3.13.537√2.42.838√0039√0040×6.87.241√7.57.842×88.343×0.40.844√0045√0046√2.22.3(转下页)28 结果与分析(接上页)苗期平均发病级别是否含有Pi9基因株系编号EveragedegreeofdiseaseinseedingstageWhetherornotincludeNameofstrains喷雾七天喷雾十四天Pi9SevendaysaftersparyFourteendaysafterspary47√0.31.148√1.62.149√0.3150√2.3351√0052√0053√00.154√00.155√0056√0057√0.31.158√0.4259√0.51.660√0.40.961√0.11.262√2.73.163√1.42.264×4.15.665√0.11.466√0067×6.26.668×5.46.169√00.270√0071√0072√0.10.773√0.20.674√1.11.975√0.10.576√1.82.377√0078√0.31(转下页)29 东北农业大学农学硕士学位论文(接上页)苗期平均发病级别是否含有Pi9基因株系编号EveragedegreeofdiseaseinseedingstageWhetherornotincludeNameofstrains喷雾七天喷雾十四天Pi9SevendaysaftersparyFourteendaysafterspary79×88.280√00.781√2.43.282√0083√00.184√0.20.585√0086√0087√1.92.588√0089√0090√1.10.891√2.61.892√0093√1.11.594√0.20.595√0.35.596√4.55.697√0098√22.499×6.37.2100√00101√1.42.3102√00103√00104√1.42.3105√0.30.6106√2.83.1107√4.34.4108√2.93.9109√2.62.9110√2.63.4(转下页)30 结果与分析(接上页)苗期平均发病级别是否含有Pi9基因株系编号EveragedegreeofdiseaseinseedingstageWhetherornotincludeNameofstrains喷雾七天喷雾十四天Pi9SevendaysaftersparyFourteendaysafterspary111√2.85.2112√00113√00母本×6.98.2父本√0.20.9注：√代表含有Pi9；×代表不含有Pi9Note:√indicatesthecultivarcontainsthegeneofPi9;×indicatesthecultivardoesnotcontainthegeneofPi9利用强致病菌株ZA5对稻花香与75-1-127杂交F2世代在分蘖期进行注射接菌，并对注射接菌后的发病情况进行调查、统计。接菌14天的调查结果表明：携带Pi9基因的105个株系中，2个株系表现为高抗，87个株系表现为抗病，3个株系表现为中抗，11个株系表现为中感，2个株系表现为感病。不含Pi9基因的株系中，1个株系表现中抗，2个株系表现中感，3个株系表现抗病，其余的2个株系表现高感。表3-3稻花香与75-1-127杂交F2世代分蘖期平均发病级别Table.3-3TheeveragediseasegradeforF2generationofDaohuaxiangand75-1-127intilleringstage分蘖期平均发病级别是否含有Pi9基因株系编号EveragedegreeofdiseaseintilleringstageWhetherornotincludeNameofstrains注射接菌七天注射接菌十四天Pi9SevendaysafterinjectionFourteendaysafterinjection1√2.13.72√0.62.93√2.45.24√1.93.25√0.82.36√1.21.77√0.71.78√2.23.09√2.12.310√0.62.011√1.03.112√1.72.413√0.91.7(转下页)31 东北农业大学农学硕士学位论文(接上页)分蘖期平均发病级别是否含有Pi9基因株系编号EveragedegreeofdiseaseintilleringstageWhetherornotincludeNameofstrains注射接菌七天注射接菌十四天Pi9SevendaysafterinjectionFourteendaysafterinjection14√0.72.615√0.32.316√1.72.417√0.81.018√0.91.419√1.01.820√1.83.321√2.12.622√2.14.623√1.41.624√1.11.225√1.12.726√1.42.927√0.00.028√4.35.129√0.90.930√1.41.631√3.13.132√0.82.833√0.31.334√0.21.435√0.92.136√1.62.037√0.10.938√1.62.339√1.62.240×5.28.641√0.81.342×4.24.943×2.75.944√2.32.645√2.33.1(转下页)32 结果与分析(接上页)分蘖期平均发病级别是否含有Pi9基因株系编号EveragedegreeofdiseaseintilleringstageWhetherornotincludeNameofstrains注射接菌七天注射接菌十四天Pi9SevendaysafterinjectionFourteendaysafterinjection46√1.82.347√1.82.048√1.82.249√2.74.250√0.61.751√1.02.152√1.71.753√1.62.754√0.43.355√1.01.456√1.01.457√1.01.958√1.02.159√4.64.760√1.61.861√1.21.462√1.72.063√2.22.064×4.25.265√0.10.266√1.93.667×3.24.168×5.37.069√2.22.770√1.21.971√0.82.072√3.65.073√1.22.974√1.11.675√0.82.076√1.62.777√0.40.9(转下页)33 东北农业大学农学硕士学位论文(接上页)分蘖期平均发病级别是否含有Pi9基因株系编号EveragedegreeofdiseaseintilleringstageWhetherornotincludeNameofstrains注射接菌七天注射接菌十四天Pi9SevendaysafterinjectionFourteendaysafterinjection78×5.48.179√4.16.680√1.44.981√1.92.682√1.21.783√3.25.384√0.81.685√1.11.486√1.32.487√1.24.588√1.01.289√1.01.090√1.71.991√0.91.492√0.94.193√1.22.394√1.71.895√1.01.496√1.72.297√1.11.798√1.63.899×4.45.8100√1.62.2101√2.43.1102√0.91.8103√1.31.8104√2.12.6105√1.41.9106√1.14.1107√3.35.7108√0.82.2109√1.71.3(转下页)34 结果与分析(接上页)分蘖期平均发病级别是否含有Pi9基因株系编号EveragedegreeofdiseaseintilleringstageWhetherornotincludeNameofstrains注射接菌七天注射接菌十四天Pi9SevendaysafterinjectionFourteendaysafterinjection110√2.14.8111√2.65.4112√2.74.6113√0.81.9母本×5.87.3父本√0.40.8注：√代表含有Pi9；×代表不含有Pi9Note:√indicatesthecultivarcontainsthegeneofPi9;×indicatesthecultivardoesnotcontainthegeneofPi9分离世代在接菌处理7天至14天之间，平均发病率有较大的变化，平均发病级别提普遍高1级，严重时提高3级以上，应在此期间加强对稻瘟病的防治工作，通过加强田间管理等手段，为水稻营造良好的生长环境，抑制稻瘟病的发生。接种处理14天的试验结果表明，携带Pi9基因的株系在苗期和分蘖期抗病性普遍较高，平均发病级别分别为1.5和2.5级，表现为抗病。不含Pi9基因的株系在这两个时期平均发病[81]级别均为6.2级，表现为感病。相同株系在苗期和分蘖期抗病级别基本相同，结果表明Pi9基因在各时期对所选分离世代抗病性以及稻瘟病综合抗性的提高均具有很高的价值。对分离世代在两个时期接菌处理14天的各株系的抗病率进行分析，苗期携带Pi9基因的株系抗病率=101/105×100%=96.19%，不含Pi9基因的株系抗病率=0/8×100%=0；分蘖期携带Pi9基因的株系抗病率=91/105×100%=86.67%，不含Pi9基因的株系抗病率=1/8×100%=12.50%。携带Pi9基因的株系抗病率均在80%以上，不含Pi9基因的株系抗病率明显偏低。Pi9基因对稻花香抗病性的提高有显著的效果。从总体上看，稻花香与75-1-127杂交F2世代苗期和分蘖期发病情况与分子标记选择结果一致，成功导入Pi9基因的株系占到分离世代总株系的93%。在稻瘟病抗性方面，携带Pi9基因的株系抗病性明显偏高，利用Pi9基因对稻花香的稻瘟病抗性进行改良对水稻新品种的选育具有很高的可行性和重要的意义。3.3稻花香与75-1-127F2世代农艺性状与品质性状鉴定对所收获的稻花香与75-1-127杂交F2世代收获株系的结实率，千粒重，单株穗重以及糙米率、精密率和香味等品质性状进行测量及评价，选择抗病能力较强且综合性状优良的株系。农艺性状与品质性状测量结果见表3-4和表3-5。根据父母本之间农艺性状与品质性状差异，选择结实率在90%以上，千粒重在25g以上，单株穗重、糙米率、精米率与母本相近且品质优良的株系作为抗病性改良的重点研究对象。将分离世代农艺性状和品质性状的鉴定结果与分子标记选择和接种鉴定试验结果相结合进行35 东北农业大学农学硕士学位论文筛选，在稻花香与75-1-127杂交F2世代中，共筛出选携带Pi9基因且综合性状优良的抗病株系6个，将这些株系继续繁殖并筛选，有利于培育抗病能力强且综合性状优良的稻花香改良株系。表3-4稻花香与75-1-127杂交F2世代农艺、品质性状Table.3-4TheagronomicandqualitycharactersforF2generationofDaohuaxiangand75-1-127株系编号穗长（cm）结实率（%）千粒重(g)单株穗重StrainnumberPanicellength(cm)Ripeningrate（%）Thousandseedweight（g）Spikeweight（g）125.2781.9019.2227.23221.5883.5025.5329.52322.5987.7121.1723.61423.2182.1223.6332.53524.1989.2118.4223.50620.7992.1223.3326.56720.1375.5624.0529.27823.0893.9625.1126.83918.1983.0023.7530.061022.4075.2420.5325.131123.1593.1724.1628.301222.8785.2122.2030.121325.0892.2125.2127.621423.0987.0023.2028.571526.8582.2622.7826.201626.1590.8727.6633.991721.9285.1621.0430.571822.6988.6324.5327.401926.4679.2423.5529.672021.0882.2720.2530.212122.9683.6618.6524.132225.2193.1525.2131.502322.7077.5316.0222.272423.3788.2724.0430.632523.0287.8326.5333.502621.0890.2322.3732.062719.1989.2421.6932.662818.6990.1023.5730.002922.5689.2120.1927.633023.8695.6122.9533.93(转下页)36 结果与分析(接上页)株系编号穗长（cm）结实率（%）千粒重(g)单株穗重StrainnumberPanicellength(cm)Ripeningrate（%）Thousandseedweight（g）Spikeweight（g）3118.9692.3222.1834.293222.2890.3622.6632.933323.5388.6820.7531.773422.9791.5123.0031.603519.9288.9619.6127.403625.6991.2821.3531.033721.7392.1826.2030.603818.6290.0523.2528.403919.0589.2721.1826.034020.9891.7620.6625.704122.0587.8325.6931.094220.1889.2423.1929.404319.0789.0326.1834.104419.8183.1822.1930.094520.0687.2722.9631.374623.6988.7523.9530.534720.8989.2425.0329.244821.7087.7821.5928.074919.7986.2123.5729.775024.2986.2525.6829.965120.9388.0321.1227.535218.9587.6923.2831.935320.0688.6725.9331.605418.7391.2820.7428.005524.2387.4321.5933.065622.2791.7825.7532.605723.9386.5722.4230.825822.2388.8324.9329.465918.1986.1123.9830.656020.6388.9025.0533.826121.0888.5224.2728.756222.9789.2421.3029.576318.5089.6323.5531.716419.7991.9824.1230.59(转下页)37 东北农业大学农学硕士学位论文(接上页)株系编号穗长（cm）结实率（%）千粒重(g)单株穗重StrainnumberPanicellength(cm)Ripeningrate（%）Thousandseedweight（g）Spikeweight（g）6521.2590.2623.7031.426621.0892.0526.0732.766721.7890.2324.6431.856820.0389.1322.0628.956921.3390.0322.5028.137020.8189.4123.7431.187119.8890.7823.8331.617224.2390.5223.6830.987321.8385.2325.2833.207420.1887.8024.9729.537522.9293.2425.2133.577619.2889.5124.4531.467721.3090.7424.0333.507819.5988.2119.2624.007920.2990.0223.8927.578025.5088.0322.7826.238123.3789.1624.6934.508220.0291.2522.0929.088322.1089.2021.9729.468421.6087.9323.2730.278526.8388.9123.8129.348620.8788.5626.0734.028722.1688.3726.0832.278822.5089.9124.5430.348921.2490.2826.0533.579021.8887.1221.1935.089119.5386.2920.1733.589220.5988.5725.2432.919322.6589.0720.1930.189418.9888.0626.8738.409520.1989.0324.7532.429620.5787.5725.0331.259721.0086.3424.2732.409823.0782.5722.7929.33(转下页)38 结果与分析(接上页)株系编号穗长（cm）结实率（%）千粒重(g)单株穗重StrainnumberPanicellength(cm)Ripeningrate（%）Thousandseedweight（g）Spikeweight（g）9920.9088.7925.1630.0810024.6086.7824.0232.5210121.9387.2623.1127.4710220.6786.7122.6328.7910318.0387.2921.3626.4710421.2888.0523.7028.7310521.0086.8023.4831.1610622.3490.1824.9829.5610721.4188.8021.0524.6310820.8087.4625.1930.8010919.2688.0823.2128.3911020.5888.5722.9527.1311120.7889.6923.5628.1511221.6387.3423.2728.8311322.7088.2823.3926.75母本21.9891.0826.1031.23父本19.5185.7020.1828.80表3-5稻花香与75-1-127杂交F2世代品质性状Table.3-5ThequalitycharactersforF2generationofDaohuaxiangand75-1-127株系编号糙米率（%）精米率（%）香味品质（是否有香味）StrainnumberBrownricerate（%）Ricerate（%）Fragrance180.2474.33√279.6772.01√375.5171.08×484.2779.47×582.2172.62×680.5372.95√781.6173.87×880.2176.97×976.5668.07√1078.2171.05×1179.1373.98×1276.6771.53√1379.9173.21×(转下页)39 东北农业大学农学硕士学位论文(接上页)株系编号糙米率（%）精米率（%）香味品质（是否有香味）StrainnumberBrownricerate（%）Ricerate（%）Fragrance1478.6570.20×1575.2170.21√1682.0377.56√1777.2171.69×1884.8172.27×1981.2175.39×2080.1173.25×2181.2778.62√2283.8776.71√2379.3573.08×2482.7775.83×2580.6073.37√2683.2276.83×2779.2370.80×2880.2671.39√2982.1576.52√3082.8378.77×3178.6670.92×3281.2777.10×3384.3378.50√3480.2573.02×3582.9374.53×3678.2772.16√3783.2775.63√3883.1278.07√3983.1975.03×4082.0776.69×4179.8972.42×4282.1375.29√4380.2173.57×4483.2773.56×4582.5975.83√4683.2072.77×4781.2775.98×(转下页)40 结果与分析(接上页)株系编号糙米率（%）精米率（%）香味品质（是否有香味）StrainnumberBrownricerate（%）Ricerate（%）Fragrance4879.2470.43×4981.0673.24×5082.1977.46√5181.5974.28×5279.5873.31×5383.2875.42√5482.5776.85√5584.1774.79×5683.7876.96√5781.1771.93×5880.7976.28×5980.9275.94√6081.6273.08×6182.3472.19×6283.2275.13×6382.6774.83√6482.4873.52×6581.4673.62×6682.6472.58√6781.3973.43√6882.1272.59×6983.1673.34×7082.3472.75×7182.7474.62√7282.3773.30√7379.0771.83×7481.2574.30√7583.0673.95×7681.7273.09√7782.7071.05√7882.5672.68√7981.1372.56×8082.1971.27×8183.2970.28×(转下页)41 东北农业大学农学硕士学位论文(接上页)株系编号糙米率（%）精米率（%）香味品质（是否有香味）StrainnumberBrownricerate（%）Ricerate（%）Fragrance8282.2772.08√8382.1471.60×8481.0974.78√8582.0572.07×8683.1574.08×8782.1573.06√8881.2572.40√8983.0975.13√9081.2771.16×9179.2973.69×9281.7572.91√9380.2374.97×9482.0771.96×9581.7372.18×9682.3373.08√9782.5873.25√9883.1973.61×9981.1972.52√10080.7672.85√10181.2775.09√10279.1873.09×10382.5075.09×10481.0572.58×10581.3373.39√10682.3774.60×10783.0275.08√10882.7673.23×10981.3673.80×11081.2972.80×11184.2976.29√11282.6773.56×11382.6174.29√42 结果与分析母本83.9574.35√父本79.1372.50×注：√代表有香味，×代表不具备香味.Note:√indicatesthesingleplantisfragrant;×indicatesthesingleplantisnotfragrant.43 东北农业大学农学硕士学位论文4讨论4.1分子手段与人工接种技术相结合在稻瘟病抗性鉴定中的应用分子标记技术的应用已经在稻瘟病抗性品种培育上取得了巨大的成效，借助分子标记技术育种的品种中很多通过了省级和国家级的审定。在育种中应用分子标记技术可以摆脱人为因素及表型鉴定的不确定性所带来的影响，减少育种所需的年限，有利于在短时间内培育抗[83]性持久的品种。李仕贵等利用微卫星标记RM262，对含有抗病基因Pi-d（t）的地方品种地谷与感病品种江南香糯、8987的F3群体群体进行选择，发现应用该标记选择纯合和杂合[84]带型抗性植株的准确率达98%以上。金素娟等选用籼稻材料BL122作为供体亲本，利用其携带的广谱抗性基因Pi-1对GD-8S进行改良，试验利用杂交与分子标记技术相结合，最终[85]获得5个改良株系。文绍山等以P2作为供体亲本，采用分子标记选择的方式对泸恢17进行改良，获得了携带Pi9基因的改良株系。[86]在分子标记的基础上，结合接种鉴定技术能够使试验结果更加可靠。宋微等在2011年以黑龙江省48份主栽水稻品种进行接菌鉴定，共挑选出8个抗病性较高的品种，同时接菌鉴定结果与Pi-5基因的分子标记鉴定结果相吻合，从抗病基因与品种抗病性两方面验证了黑龙江省48份主栽品种的抗病性。本研究将Pi9基因的分子标记鉴定与稻瘟病菌接种鉴定表现相结合，对黑龙江省96份主栽水稻品种进行分析，既明确了Pi9基因在96个主水稻品种中的分布，又掌握了各品种的抗病性情况，为今后黑龙江省抗稻瘟病种质资源的筛选提供了依据。相信随着分子技术及相关信息学的不断完善，将分子标记技术与接种鉴定技术相结合将成为稻瘟病抗性评价的重要手段，二者相得益彰，会给今后的稻瘟病抗性育种工作开辟更广[87]阔的发展空间。4.2黑龙江省水稻稻瘟病抗性资源筛选与利用黑龙江省是全国商品粮主要生产基地，占东北三省水稻播种面积的一半以上。稻瘟病始终是黑龙江省的主要病害，据统计，黑龙江省曾有13次稻瘟病大发生年，稻谷损失总量达60亿公斤，所造成的经济损失十分严重。因此，应当充分利用黑龙江省的抗病资源应对稻瘟[89]病流行的问题。相对于南方品种，黑龙江省水稻种植时间短，品种多样性有待提高。由于积温区的不同导致黑龙江省不同地区气候和主栽品种差异较大，稻瘟病抗性基因在各种植区[90]域表现也会有所差异，因此在黑龙江省内各地区发掘适合当地的水稻抗性资源具有重要的意义，同时对品种的抗性组成进行深入探究，精确定位品种抗性基因，能够对亲本间轮换以及组配提供理论依据，延长品种的抗病时效。日本早在1981年以前就确定了以日本稻为核心的超过2800个品种的真抗性基因型，并对这些品种按照真抗性基因型的标准进行分类，黑龙[91]江省对稻瘟病抗性遗传基础鉴定方面的工作也受到了育种家的高度重视，周燕等在201544 讨论年检测了来自黑龙江省20个县、市的主栽品种的抗病性，试验采用90个稻瘟病菌株，结果表明黑龙江省菌株群体结构的复杂性导致其在致病力方面存在很大差异，所选品种中，龙粳[92]41，绥粳9、苗稻2号等14个品种抗病性较强。宋成艳等在2009年采用病斑反应型方法进行推断，将选自日本的7个菌系12个日本鉴别品种反应型进行对比和分析，试验共将141个水稻品种归纳为39个种群。将从黑龙江省选取的部分粳稻品种以抗瘟性为标准进行分类，对其中60个品种的抗性基因型做出了初步推测，并归纳出新2号型、K59型、Pi4号型、草[93]笛型、砦1号型、爱知旭形6个类型。刘华招等对2009年对黑龙江省种植面积较广的36份品种进行了筛选，利用基于基因本身的引物组合PibdomF/PibdomR、Lys145F/Lys145R以及L155/YL87、YL183/YL87分别对所选材料中Pib和Pi-ta基因进行检测，最终筛选出4[94]个含有Pib抗性基因和6个含有Pi-ta抗性基因的品种。李洪亮，李荣田将水稻品种BL6携带的抗病基因Pi1和Pi2聚合到空育131中，利用已经建立显性分子标记RM144和AP22分别对Pi1和Pi2基因进行分子标记辅助选择，为寒地粳稻品种的持久抗病性打下基础。本研究从黑龙江省主栽的96个水稻品种入手，对广谱抗性基因Pi9在黑龙江省的分布进行研究，为今后育种工作中优良品种的选育以及根据气候等条件对品种进行合理布局与配置提供依据。同时，试验结果表明Pi9基因在黑龙江省主栽水稻品种内的占有率为46%，仍有一半以上的品种不具备Pi9基因。本研究在所选试验材料中存在苗期和分蘖期抗病性均优于阳性对照75-1-127的品种，比如龙联1号，北稻5号等。此类品种可能携带除Pi9基因之外的抗稻瘟病基因，因此加强对此类品种中抗病基因的发掘与研究，对黑龙江省水稻抗病资源的拓展有着重要的意义；但有些不含有Pi9基因的供试材料如东农426、松粳8号等也表现出较强的稻瘟病抗性，说明这些品种中可能具备其它抗性资源，加大力度发掘、定位此类品种中的抗病基因，探索这些品种的抗病机理并投入生产应用，使黑龙江省的优良抗性资源得到更好地推广。同时，试验材料中存在苗期和分蘖期抗病性均较强的品种，比如龙庆稻1号，龙粳14号，龙粳20号，东农426等。加大以上品种的开发力度，发掘这些品种中存在的抗病基因以及基因间综合作用将会为黑龙江省水稻抗病育种带来突破性的进展。在配置亲本组合以及品种推广时，以本试验中黑龙江省主栽水稻品种的筛选结果为参考，合理选择携带Pi9基因的品种，可使杂交后代抗病性得到改善。在抗稻瘟病资源筛选中，同样可以从所选试验材料的亲本入手研究Pi9基因的遗传机理，选择Pi9基因遗传力较高的品种对其遗传机理进行探究，将其遗传方面的优势应用于Pi9基因的推广中，另一方面，可对亲本中农艺和品质性状优良的品种进行筛选，加以改良并投入生产应用，也可从地域入手，对Pi9基因携带率较高的地区入手，在对其遗传体系和遗传机制进行研究的同时，对当地的环境以及人为等综合因素进行分析，可探寻影响Pi9基因遗传的外界因素，进而从遗传机理和外界因素两方面为Pi9基因的推广开辟全新的途径。黑龙江省主栽水稻品种以及稻花香与75-1-127分离世代均存在含有Pi9基因，但在稻瘟病抗性鉴定中表现为感病的现象。这说明在水稻抗病、抗逆境育种中，不能只依靠单一的优良基因，而是需要多个基因的协同作用。由于稻瘟病的致病机理以及遗传背景极其复杂，使[95]得抗病性育种的研究速度落后于稻瘟病菌生理小种的变异速度，同时主栽品种的连续种植会使得当地优势小种或者其所能抵抗的生理小种在短时间内发生变化，导致优势小种交替，45 东北农业大学农学硕士学位论文使主栽品种的抗病性受到威胁。因此仅含有单个抗病基因的品种抗性往往在3-5年内便会丧失，影响水稻品种在不同种植区域和不同年份抗性的稳定程度，制约了抗病基因的推广。另一方面，水稻品种间的优良基因较为分散，仅仅依靠常规育种的方式将各个优良基因聚合到同一品种中具有很大的难度，同时也需要较多的育种年限，因此通过分子标记辅助选择的方式聚合多个不同抗谱的抗病基因将成为培育抗病性强、抗性持久品种的有效方法。近年来，[96]通过分子标记将优良基因进行聚合已经取得了显著的成效。陈红旗等将Pi-1、Pi-2、Pi-33聚合到品种金23B中，利用分子标记辅助选择的方法培育出的新品种W1具有广谱和持久的[97]抗性。阳海宁等将抗水稻白叶枯病的基因Xa23和抗稻飞虱基因Bph3导入到优良杂交品种保持系中，获得的双基因聚合品种对这两种病害的抗性得到明显改善。本试验能够为Pi9基因与其他稻瘟病抗性基因的聚合提供理论依据。在黑龙江省96份主栽水稻品种中，龙粳20，[98][99]绥粳8号等品种在苗期与分蘖期均表现出较高的抗病性，同时龙粳20与绥粳8号在产量、品质等方面均有突出的表现，可将其他优良抗性基因与Pi9基因聚合到此类品种中，以此突破单一优良基因的局限性，实现多抗、广谱、持久抗性品种的选育。4.3利用Pi9基因改良优质品种稻瘟病抗性的应用前景鉴于Pi9基因的广谱抗性及其在稻瘟病抗性方面广阔的应用前景，人们对该基因的重视程度越来越高，利用Pi9基因对优质品种的稻瘟病抗性进行改良也取得了一定的成效。刘雄[99]伦等利用分子标记辅助选择技术对34份籼稻品种进行稻瘟病抗性改良，选用pi9utr和Ins2-1两个功能分子标记对Pi9基因进行筛选，最终获得了数十个高抗稻瘟病的纯系品种。闫成业等利用75-1-127作为供体亲本，将Pi9基因转入R1005中，成功培育出3个携带Pi9基因的株系。本研究利用Pi9基因在早期世代对稻花香的稻瘟病抗性进行改良，获得了105个成功转入Pi9基因的株系，且其抗病率获得了显著的提升，相对于不含Pi9基因株系，改良株系抗病率的提升超过70%。同时在105个株系中，共有32个株系在苗期和分蘖期均未发病，可作为今后稻花香品种改良的重点研究对象。从早期世代中选择含有Pi9基因以及稻瘟病抗性优良的株系继续繁殖，有利于培育含有Pi9纯合基因系的稻花香品种。46 结论5结论(1)本研究对黑龙江省96个主栽水稻品种分子标记鉴定结果表明，黑龙江省水稻品种中，共有44个品种携带Pi9基因，52个品种不含Pi9基因，Pi9基因在所群体中的占有率为45.8%。(2)本研究对黑龙江省96个主栽水稻品种进行了稻瘟病菌接种鉴定，所得试验结果为所选品种在生产中的实际发病情况提供依据。将分子标记结果与接种鉴定结果结合，可以筛选出龙稻12号，龙粳14号，龙粳20号，绥粳8号，北稻5号等携带Pi9基因且在苗期和分蘖期抗病表现优良的品种，以上品种在农艺和品质性状等方面表现均比较优良；同时筛选出绥粳4号，龙粳8号，松粳8号等产量与品质优良但稻瘟病抗性较差的品种，可对以上品种进行稻瘟病抗性定向改良。(3)对黑龙江省96个主栽水稻品种和2份对照品种的分子标记选择及抗性鉴定试验结果表明，75-1-127品种携带Pi9基因，稻花香品种不携带Pi9基因。在抗病性鉴定试验中，75-1-127表现出极高的抗性，稻花香则表现为感病。因此利用75-1-127对稻花香的稻瘟病抗性进行改良具有可行性。(4)本研究对稻花香与75-1-127杂交F2世代113个株系进行分子标记鉴定，结果表明，113个株系中，105个株系携带Pi9基因，成功转入Pi9基因的株系在整体中的占有率达到93%。(5)对分离世代农艺与品质性状评价结果进行分析，共筛选出6个含有抗病基因、抗病能力强且综合性状优良的株系，可作为稻花香稻瘟病抗性改良的重点研究对象。(6)稻花香与75-1-127杂交F2世代群体在苗期和分蘖期的接种鉴定结果可以得出结论，相对于不含Pi9基因的株系，携带Pi9基因的株系平均发病级别降低了4个等级，同时，携带Pi9基因的株系在两个时期抗病率均在80%以上，而不含Pi9基因的株系抗病率仅在10%左右。携带Pi9基因的株系抗病性明显高于不含Pi9基因的株系和稻花香。47 东北农业大学农学硕士学位论文致谢时光荏苒，岁月如梭，硕士生涯仿佛弹指之间。回首处，几年的回忆似乎近在咫尺，却又遥不可及。在这快乐与汗水并存的几年中，在与老师、同学们共同铸就的美好时光里，我感受到了自己的成长与收获，体验到了前所未有的充实与欢乐，这宝贵的财富必将为我今后的航行扬起风帆，助我乘风破浪，勇往直前。在这离别之际，心中不免洋溢着不舍与感激。对我的导师邹德堂教授的感激更是溢于言表。回想入学之际，若无邹老师的知遇之恩，便没有这宝贵的收获与成长，没有老师对我们的付出，就没有我的今天。老师对学术的严谨，对工作的认真无时无刻不影响着我们，让我们感受到楷模的力量。遇到挫折时，老师充满鼓励的微笑总会带给我无穷的动力。空闲时，老师经常给我们讲他以前的一些经历，这让我们对知识、对今后的生活充满了憧憬与向往。从老师那里，我们不仅学到了知识，更端正了人生的态度，明确了自己的目标，老师的谆谆教诲与鼓励我将永远铭记。在这三年的学习中，赵宏伟老师从学习、生活上给予了我们极大的帮助。赵老师是难得的好老师，在本科时，我们便受到赵老师治学严谨，一丝不苟态度的感染，研究生阶段，更是受到赵老师的言传身教。老师为了我们的学业不辞辛劳，经常在百忙之中牺牲自己的休息时间来帮助我们。在今后的生活中，我会永远牢记并发扬赵老师认真负责、无私奉献的高尚品格，不辜负老师的期望。在这即将毕业之际，我想对老师说一句在心里默念了很久的话：“老师，您辛苦了”。在这三年时光中，王敬国老师，刘化龙老师，也对我产生了很大的影响。两位老师在平时的试验与生活中对我的帮助让我的效率得到很大的提升，从试验室到田间管理，都可以看见两位老师辛勤忙碌的身影。另一位值得尊敬的孙健老师对我的试验设计、论文写作等方面给予了莫大的帮助，带领我走出困惑与迷茫。孙健老师对我们的指导充满耐心与细心，不厌其烦地为我们提出宝贵的意见，在求知的道路上如灯塔一般指引着我们前行。同时，他也时刻鼓励着我们，为我们的前行提供了动力。在这离别之际，衷心地祝愿各位老师身体健康，事业有成，桃李满天下。郭丽颖师姐，沙汉景师兄，贾琰师姐，你们在学业中给予我的帮助和起到的楷模作用同样无法用语言表达。在这三年中，你们的优秀表现潜移默化地影响着我，我将以你们为目标，在今后的学习、工作中坚持不懈，不畏艰难。还有我的亲爱的同学、师弟师妹们，李宁，张文涛，胡月婷，蔡宏亮，王力冬，夏楠，吕艳超，辛柳，常汇琳，是你们帮助我顺利地完成了试验，更让我感受到了友谊与集体的力量，你们始终是我学习上的伙伴，更是我生活中的挚友，谢谢你们。饮水思源，此时我的内心溢满了对父母、家人的感激，三年如一日的支持与付出诠释了爱的真谛，你们始终是我坚强的后盾，让我感受到了无尽的温馨。我将在你们期待的目光中继续努力，奋勇前行，用辛勤的成果回报这爱的奉献。硕士生涯已经接近尾声，我将带着无尽的感激与激情踏上今后的人生旅程。结草衔环，滴水当思涌泉，老师、同学们和我的家人对我的栽培与帮助已经无法用言语表达其万一，我会将这恩情铭记于心，用实际行动来回报这人间最纯真、最动人的情谊。纵时光匆匆，有如48 致谢白驹过隙，这如金的岁月必将在我的人生中大放异彩，成为一道永恒靓丽的风景。49 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