急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究

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Ｕ＼学校代码：１０２８５学号：２０１３４２３２０３４Ａ襄审、考－，—－Ｈ：ＳＯＯＣＨＯＷＵＮＩＶＥＲＷＴＹｊｉＭｌｉｌｌｉｉ「ｍｍ碱為巧‘＂．．‘邏＾Ｒ：，ｍＷＵＪＪＨ＂急性髓系白血病血小板计数与細关变的，Ｂｆ網ｍ关系研究’Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｌａｔｅｌｅｔｃｏｕｎｔｓａｎｄｌｅｕｋｅｍｉａｍｕｔａｔｉｏｎｓｐｉｎａｃｕｔｅｍｙｅｌｏｉｄｌｅｕｋｅｍｉａ研究生姓名韩伟指导教师姓名韩悦专业名称内科学（血液病学）＾Ｈ研究方向恶性血液病与血小板所在－医院１＾部苏州大学麵第澡＆：：论文提交日期２０１６年３月 ．…．、苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经往明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。。论文作者签名！ｂ、ｙ心：如咪日期：＞ ＿－苏州大位论文明学学使用授权声人完全、本了解苏州大学关于收集和用学位论的规保存使文定，長；论文Ｐ学位著作权归属苏学。本学论文州大位电子内容和纸文楼的质论一文的内相。、容致苏州大学有权国图馆中向家书国社科院献文信息情报中也、中国息究（据科学技术信研所万方电子出版社）、含数国期刊（光盎版）本学中学术电子志送位论文的杂化交复印件和电子义档，允许论查願和借阅，＾、文被可１＾采用影印缩印或他其复制手段存和汇编学位论文保，可科将学位论文的全或部分部内容编入有关数。据库进行检索〇涉密论文本学位论文属在月解密后适用本规。年＿定非涉密论文□、口／．今论如等各文作者签名：Ｈ：命命期么．Ｄｌｂｙ《兴令导签名：；师期手 急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究中文摘要急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究中文摘要背景与目的：急性髓系白血病是造血系统的恶性克隆性疾病，是多能造血干细胞或已经分化的前体细胞发生体细胞突变所形成的一类疾病，其特征包括白血病细胞异常增值及正常造血细胞受损。急性髓系白血病是一组异质性疾病，许多患者伴有细胞遗传学及分子生物学的改变，从而改变导致了造血细胞系统调控改变，巨核系作为髓系的一员其造血程度会受到不同程度的影响，多数低增速程度或缺如，表现为血小板减少，在少部分病人中表现为巨核细胞数量正常甚至增加,最终导致血小板计数正常甚至增加。通常认为在初诊急性髓系白血病患者中，血小板计数下降是由于白血病细胞过度增值抑制正常巨核系增值分化，但早期学者发现急性髓系白血病中存在3q染色体异常的病人中血小板计数正常甚至升高，后相继文献报道NPM1、DNMT3A突变阳性的急性髓系白血病患者比突变阴性组有较高的血小板计数，CEBPA突变阳性的急性髓系白血病患者血小板计数较低，均提示分子学改变对巨核有不同程度的影响，然而其中的具体机制并未详细阐述。为此我们回顾分析我院急性髓系白血病人中常见基因突变与血小板计数关系及不同血小板计数急性髓系白血病患者的临床特点，其次初步探索急性髓系白血病患者参与巨核、血小板生成调节过程中的促血小板生成素、白介素6、血小板生成素受体c-MPL表达水平的变化。资料与方法：1.病例资料选自2013年1月至2015年3月于苏州大学附属第一医院住院诊疗的314例非M3型急性髓系白血病患者，男性178例，女性136例，中位年龄42（7-73）岁，其中染色体核型异常患者134例，正常核型患者180例，分析常见基因突变与血小板计数关系并初探诊断时不同血小板计数急性髓系白血病患者的临床特点。2.为了探究血小板生成相关因素的影响，予ELISA法测定初诊非M3型AML患者(n=52)外周血清的促血小板生成素（TPO）、白介素6（IL-6）表达水平，予流式细I 中文摘要急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究胞术检测非M3型AML患者(n=20)白血病髓系干细胞c-MPL表达。统计学方法采用SPSS19.0统计软件进行分析，各数值以均数±标准误表示，组间均数比较采用方差分析，两样本平均值的比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。结果：1.314例初诊非M3型急性髓系白血病患者中，DNMT3A突变阳性患者30例、9NPM1突变阳性患者46例，其初诊时血小板计数分别为87（13-403）×10/L、6099（14-271）×10/L，均高于突变阴性患者组血小板计数34（17-216）×10/L且均有统计学差异（P<0.05）；CEBPA突变阳性者35例，其初诊时血小板计数为20（4-149）9×10/L，低于突变阴性患者组血小板计数且有统计学差异（P<0.05）；FLT-ITD、C-KIT9突变患者各占49及30例，其血小板计数分别为47（13-273）×10/L、35（5-89）9×10/L，与基因突变阴性组比较无明显统计学差异。为了减少染色体异常对血小板计数的影响，进一步分析180例正常核型急性髓系白血病患者基因突变与血小板计数关系，其中，检测出DNMT3A基因突变阳性患者27例，其初诊时血小板计数为839（13-273）×10/L，检测出NPM1基因突变阳性患者36例，其初诊时血小板计数为9961（17-271）×10/L，均高于突变阴性患者组血小板计数为37（16-102）×10/L且均有统计学差异（P<0.05）；检测出CEBPA基因突变阳性者26例，其血小板计数计9数为19（4-94）×10/L，低于基因突变阴性组（P<0.05）。此外，检测到C-KIT基因突变阳性患者占11例，FLT3-ITD突变阳性患者32例，其血小板计数分别为37（13-89）99×10/L、49（14-273）×10/L，与基因突变阴性组比较无明显统计学差异。2.对不同血小板计数AML患者诱导化疗一疗程完全缓解率分析发现，初诊血小板计数小于30组的AML患者（n=118）CR率最高为85.6%，血小板计数30-100组（n=155）CR率为76.1%，血小板计数大于100的AML（n=41）患者CR率最低为65.8%，血小板计数小于30组与大于100组相比有统计学差异（85.6%vs65.8%，P<0.05）。血小板计数小于30的AML患者高危分子生物学标志比率为20.3%，血小板计数大于100组高危分子生物学标志比率最高为58.5%，相比且有统计学差异。3.初诊非M3型急性髓系白血病患者（n=52）外周血清TPO水平为（371.02±200.36）pg/ml高于健康人（n=10）（106.0±13.84）pg/ml,P<0.05，高于化疗缓解期患者（n=16）水平（165.8±16.70）pg/ml，P<0.05。根据血小板计数分为3组，血小板II 急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究中文摘要99计数小于30×10/L组（n=27），30至100×10/L组（n=18）及血小板计数大于1009×10/L组（n=7），初诊血小板计数大于100组AML患者TPO水平最高为(593.40±118.70)pg/ml，其余两组无统计学差异；DNMT3A突变阳性、FLT3-ITD突变阳性AML患者TPO水平明显高于其余突变及阴性组。初诊AML患者（n=52）的IL-6水平为（302.6±23.51）pg/ml，高于正常人（n=10）（134.00±16.68）pg/ml,P<0.05；高于AML患者化疗缓解期组（n=16）（206.40±18.33）pg/ml，P<0.05；IL-6水平与血小板计数无明显关系，各基因突变组IL-6水平无明显差异。初诊AML患者髓系白血病干细胞有c-MPL表达(3.58±1.76)%，表达水平高于健康对照组（1.30±0.66）%，P<0.05；在血小板计数大于100组表达水平最高（6.98±1.90）%。此外，DNMT3A组患者c-MPL表达水平较高（8.35±2.95）%，其余基因突变组之间c-MPL水平无明显变化。结论：1.在AML患者中，常见的基因突变对血小板有着不同的影响，与基因突变阴性者比较，伴DNMT3A，NPM1突变阳性的患者血小板计数较高，伴CEBPA患者血小板计数较低，伴FLT3-ITD及C-KIT突变患者血小板计数无明显差异。2.初诊时血小板计数小于30的AML患者诱导化疗一疗程完全缓解率最高，血小板计数大于100的急性髓系白血病患者诱导化疗完全缓解率最低，拥有较多高危的分子遗传学标志。3.初诊血小板计数大于100的AML患者TPO及c-MPL水平较高，DNMT3A、FLT3-ITD突变阳性患者TPO水平较高，DNMT3A突变阳性AML患者C-MPL水平表达升高。【关键词】：急性髓系白血病，基因突变，血小板计数。作者：韩伟指导老师：韩悦III 英文摘要急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究CorrelationbetweenplateletcountsandleukemiamutationsinacutemyeloidleukemiaAbstractBackgroundandObjective:Acutemyeloidleukemia(AML)isahematopoieticstemcellmalignantdisease，withabnormalproliferationofleukemicandimmaturecellandinjuryofnormalhematopoiesis.AMLisalsoahighlyheterogeneousdiseasewithmolecularandcytogeneticchanges,whichhaveancrucialeffectonthedifferentiationandproliferationofhematopoieticlineage.Megakaryocyte,asanimportantpartnerofmyeloidlineage,itusuallypresentedwithreducedorabsentstatusinAMLandthesepatientsalwaysexperienceathrombocytopeniaandbleedingtendency,however,somepeoplepresentwithnormalorevenadvancedmegakaryocytecountsresultinginnormalplateletcountsandeventhrombocytosis.Inthelastcentury,AMLpatientswithabnormalitiesinchromosome3qwerereportedtohavethrombocytosis,inthenextdecades,ithasbeendemonstratedpatientswithDNMT3AandNPM1presentshigherplateletcountswhilethosewithCEBPAmutationhavelowerplateletcounts,however,pathogenesishavenotbeenwellclarified.Thus,inthisstudy,wemainlyreviewedcorrelationbetweenmutationandmegakaryocyteandplateletinAMLandanalysistheclinicalcharacteristicandprognosisofAMLpatientswithnormalplateletcounts.Furthermore,weinvestigatethethrombopoietin(TPO),interlectin-6(IL-6)andc-MPLlevelsinAMLpatients.Methods:1.Weretrospectivelyreviewedthreehundredandfourteen(314)denovoAMLpatientsexceptacutepromyelocyticleukemia(APL)whoweretreatedintheFirstAffiliatedHospitalofSuzhouUniversityfrom2013Januaryto2015Aprilinthisstudy.Amongthem,were178malesand136females,themedianageondiagnosiswere42-year-old.180patientscytogenetically-normalAML(CN-AML)weremainlyenrolledtoexplorerelationbetweenmutationandplateletcounts(PLTs).Inparticular,weanalyzetheclinicalfeaturesandprognosisofAMLpatientswhohavenormalPLTsonsetofdiagnosis.IV 急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究英文摘要2.ToexplorethemechanismPLTsproductioninAML,weinvestigatedtheendogenousproductionofTPO,IL-6andc-MPLexpressionlevelsindenovoAMLpatients.Results:1.Ofallthe314AMLpatients,patientswithDNMT3Amutation(n=30)andNPM1mutation(n=46)havehigherPLTswhileCEBPAmutaions(n=35)havethelowestPLTscomparedwiththosewithoutmutations.NostatisticaldifferencewerefoundbetweenAMLpatientswithFLT3-ITD(n=49),C-KIT(n=30)mutationsubgroupsandmutation-negativegroups.TominimumtheimpactofabnormalcytogeneticsonPLTs,wemainlyfocusontheanalyzeofthe180CN-AML,mutationsinDNMT3Awerefoundin27patients,NPM1in36patients,FLT3-ITDin32patients,CEBPAin26patients,C-kitin11patientsandnomutationswerenotfoundin48patients.Theplateletcounts(PLTs)ofDNMT3A+andNPM1+AMLpatientshavehigherPLTscomparedtothosewithoutmutation,theCEBPA+AMLhavelowerPLTsthanthosewithoutmutation.92.AMLpatientswithPLTslessthan30×10/LhavehigherCRrate(85.6%)compared9withpatientswithPLTsover100×10/L(65.8%),P<0.05.Patientswithnormalplateletcountsatfirstdiagnosispresentedadversemolecularandcytogeneticallymarkersandworsechemotherapyeffect.3.DenovoAMLpatientshavehigherTPO,IL-6andc-MPLlevelsthannormalpatientsandAMLsincompleteremissionstatus.WedividedtheseAMLpatientswith3groupsaccordingtoPLTs:PLTslessthan30,PLTsfrom30to100andPLTsoverthan10099×10/L.DenovoAMLpatientswithPLTsover100×10/LhavehigherTPOandc-MPLlevels,nostatisticaldifferencesofIL-6levelswerefoundinthethreedifferentgroupsinAMLpatients.DNMT3AandFLT3-ITDpositiveAMLpresentedanexpensiveTPOtendencywhileDNMT3Apatientsshowedhigherc-MPLlevels.Conclusion:1.VariousmutationsinAMLposeaneffectonmegakaryocytesandplateletcounts,particularly,patientswithDNMT3A,NPM1mutationsusuallypresentedahigherandplateletcountswhilethosewithCEBPAmutationshavelowerwhencomparingwithpatientswithoutmolecularabnormalities.2.AMLpatientswithPLTs<30havehighercompleteremissionratewhiledenovoAMLpatientswithnormalplateletcountsatfirstdiagnosisseemedtopresentedanuniqueV 英文摘要急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究group,theyusuallyhaveadversemolecularandcytogeneticallymarkersandpoorerchemotherapyeffect.3.DenovoAMLpatientswhohavenormalPLTshavehigherTPOandC-MPLlevels,DNMT3AandFLT3-ITDpositiveAMLspresentedanexpensiveTPOtendencywhileDNMT3ApatientsshowedhigherC-MPLlevels.[Keywords]:Acutemyeloidleukemia,leukemiamutations,plateletcountsWrittenby:WeiHanSupervisedby:YueHanVI 目录第一部分急性髓系白血病血小板计数与基因突变及预后相关性临床分析................1前言.............................................................................................................................1资料和方法.....................................................................................................................1结果.............................................................................................................................3讨论...........................................................................................................................10参考文献.......................................................................................................................11第二部分急性髓系白血病中血小板生成相关机制研究..............................................13前言...........................................................................................................................13材料和方法...................................................................................................................13结果...........................................................................................................................15讨论...........................................................................................................................19参考文献.......................................................................................................................20综述..................................................................................................................................22结语..................................................................................................................................29参考文献..............................................................................................................................30英文缩略词表......................................................................................................................35攻读学位期间发表的文章..................................................................................................36致谢..................................................................................................................................37 急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究第一部分第一部分急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究前言急性髓系白血病是多能造血干细胞或已经分化的前体细胞发生体细胞突变所形成的一类疾病，其特征包括白血病细胞异常增值、分化受阻及凋亡障碍及正常造血细胞受损。急性髓系白血病是一组异质性疾病，许多患者伴有细胞遗传学及分子生物学的改变，且这些发生导致了造血细胞系统调控改变，巨核系作为髓系的一员其造血程度会受到不同程度的影响，病人个体间血小板及巨核细胞数量差异很大，多数低增速程度或缺如，表现为血小板减少及血小板严重减少，然而在少部分病人中表现为巨核细胞数量正常甚至增加,最终导致血小板计数正常甚至增加。本研究回顾分析以近年我院治疗的初诊非M3型急性髓系白血病患者为研究对象，探讨急性髓系白血病常见基因突变对巨核、血小板计数的影响及初诊血小板计数正常的急性髓系白血病患者的临床特点及预后转归。资料和方法1.病例选择。2013年1月至2015年3月就诊于苏州大学附属第一医院血液科治疗的非M3型AML，总计314例全部纳入研究，研究病例男性178例，女性136例，中位年龄42（10-73）岁。2.急性髓系白血病（Acutemyeloidleukemia,AML）的诊断。急性髓系白血病的诊断主要依靠骨髓细胞形态学（Morphology）、免疫学（Immunology）、细胞遗传学（Cytogenetics）和分子生物学（Molecularbiology）分型，即MICM分型。骨髓细胞形态学：主要依据国际FAB分型，主要包括M0型（急性髓系白血病微分化型，minimallydifferentiatedAML）；M1型（急性粒细胞白血病未分化型，AMLwithoutmutation）；M2型（急性粒细胞白血病部分分化型，AMLwithmutation）；M31 第一部分急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究型（急性早幼粒细胞白血病，acutepromyelocyticleukemia，APL）；M4型（急性粒单核细胞白血病，acutemyelomonocyticleukemia，AMML）；M5（急性单核细胞白血病，acutemonocyticleukemia，AMoL）；M6型（红白血病；erythroleukemia，EL）；M7型（急性巨核细胞白血病，acutemegakaryoblasticleukemia，AMeL）。流式细胞术分析免疫表型；髓系白血病的常见免疫表型为CD13，CD11b，CD13，CD14，CD15，CD33，CD34，CD64，CD117，MPO,HLA-DR。染色体核型分析：采用骨髓细胞直接法和（或）短期培养法，按常规制备染色体标本，采用R显带计数进行核型分析。正常核型至少分析20个分裂象，异常核型者至少分析10个分裂象，2个以上具有相同核型异常定义为异常核型。多重PCR：我院初诊AML患者常规检测白血病43种多重PCR，基因突变：常规检测DNMT3A、FLT3-ITD、NPM1、C-KIT、CEBPA突变。3.治疗方案。高白患者在诱导化疗前首先予羟基脲及白细胞清除术进行预处理。201例患者例2接受标准的“3+7方案”一线化疗，具体为去甲氧红霉素10-12mg/m/d，d1-d3；阿22糖胞苷100/m/d，d1-d7；24例患者接受IAC方案，具体为去甲氧红霉素8mg/m/d，22d1-d3；阿糖胞苷100/m/d，d1-d7；克拉屈滨，5mg/m/d，d1-d5。82例患者接受预激方案。7例患者予其他方案包括FLAG、HA方案。4.分子遗传学高中低危组分级参照2015年AML的NationalComprehensiveCancerNetwork(NCCN)指南及文献【1】，低危包括含t（15；17），inv（16）或t（16；16），t（8；21），单独的NPM1及CEBPA双突变。中危组包括：正常染色体核型，单独+8，t（9；11）；t（11；19）。高危组包括：单倍体核型，复杂核型，-5,5q-,-7,add（7q-），7q-；11q23-nont(9;11)；abn（3q），inv(3),t(3;3)；t(6;9)；t(9;22)；ASXL1，FLT3-ITD，TP53，DNMT3A及MLL-PTD突变。5.AML诱导化疗疗效评价参照NCCN指南，完全缓解（CR）具体定义为临床无贫血、出血、感染及白血病细胞浸润表现;血象血红蛋白>90g/L,白细胞正常或减低,分类无幼稚细胞,血小板>100×109/L;③骨髓象原始细胞加早幼阶段细胞(或幼稚细胞)<5%,红细胞系统及巨核细胞系统正常。部分缓解（PR）：临床、血象及骨髓象3项中有1或2项未达到完全缓解标准,骨髓象中原始细胞加早幼细胞<20%或原始细胞下降比率大于50%但未达到完全缓解。未缓解(NR)：临床、血象及骨髓象三项均未2 急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究第一部分达到完全缓解标准,骨髓中原始细胞比率无明显下降或出现新的髓外浸润表现。6.统计学处理。采用SPSS19.0统计学软件进行统计分析，计量资料采用中位数、最小值、最大值表示，秩和检验分析计量临床资料，采用卡方检验对观察指标进行单因素分析，并采用Logistic回归模型对单因素分析中P<0.2的变量纳入多因素分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。结果1.患者一般资料。所有纳入本研究的非M3型AML的314例患者，共有M0型患者9例，M1型35患者，M2型121患者，M4型70患者，M5型67患者，M6型12患者例，M7型患者0例，AML不能分型患者15例。染色体正常核型共180例，异常染色体检出者共134例，低危63例，标危36例，高危35例。染色体核型正常患者中，27例患者检测出DNMT3A突变，36例患者检测出NPM1突变，32例患者检测出FLT3-ITD突变，26例患者检测出CEBPA突变，其中CEBPA双突变21例，单突变5例，11例患者检测出C-kit突变。201例AML患者接受IA方案诱导化疗，24例患者接受IAC方案诱导化疗，82例患者接受预激方案诱导化疗,7人接受其他方案化疗。2.正常核型AML患者常见基因突变对巨核及血小板影响临床资料结果。314例初诊非M3型急性髓系白血病患者中，DNMT3A突变阳性者30例、NPM1突变阳性患者46例，其初诊时血小板中位数分别为87（13-403）×109/L、60（14-271）×109/L，均高于突变阴性患者组血小板计数34×109/L（P<0.05）；CEBPA突变阳性者35例，其中位数为20（4-149）×109/L，低于突变阴性患者组血小板计数（P<0.05）；FLT-ITD、C-KIT突变患者各占49及30例，其血小板中位计数分别为47(13-273)、35(5-89)×109/L，与基因突变阴性组比较无明显统计学差异。为了减少异常染色体核型对巨核及血小板调控影响，在此重点分析正常核型的AML患者资料。表1数据显示，与基因突变阴性组相比，伴DNMT3A突变的AML患者初诊时拥有较高的外周血白细胞及血小板计数，骨髓中原始比率较高，且患者大于巨核细胞100只的患者比率（12/27）明显高于对照组。3 第一部分急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究表1.DNMT3A突变阳性与基因突变阴性AML患者初诊时骨髓及外周血像分析。DNMT3A（共27人）基因突变阴性(共48人）P病人数2748骨髓原始细胞比率66%(25-89)51%(20-99)P<0.05巨核细胞数目P<0.05小于1043210到1001113大于100123白细胞计数33.7(0.93-350)16.2(1.9-123.2)P<0.05血小板计数83(13-273)38(7-216)P<0.05PLT>10012/276/48P>0.05PLT>5019/2714/48P<0.05PLT>3022/2727/48P<0.05表2数据显示，伴NPM1突变阳性的AML患者外周血有较高的白细胞与血小板计数，骨髓中原始细胞比率高于阴性组，骨髓内巨核细胞正常范围者及大于100只者各占比率（10/36），均高于全阴性组。表2.NPM1突变阳性与突变阴性AML患者骨髓及外周血象分析。NPM1突变阳性基因突变阴性P病人数3648骨髓原始细胞比率72%(21-99%)51%(20-99%)P<0.05骨髓巨核细胞数目P<0.05小于10163210到1001013大于100103外周白细胞计数25.5(1.8-63)16.2(1.9-123.2)P<0.05外周血小板计数61(14-271)38(7-216)P<0.05PLT>1009/366/48P>0.05PLT>5025/3614/48P<0.05PLT>3030/3627/48P<0.05表3数据显示伴FLT3-ITD的AML患者具有较高的骨髓原始细胞比率及外周白细胞计数，其骨髓巨核细胞数目分布比率及血小板计数与突变阴性组无统计学差异。4 急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究第一部分表3.FLT3-ITD突变阳性与基因突变阴性AML患者骨髓及外周血分析。FLT3-ITD突变阳性基因突变阴性P病人数3248骨髓原始细胞比率75.5%（25-98%）51%(20-99%)P<0.05骨髓巨核细胞目P>0.05小于10193210到1001013大于10033白细胞计数53.1(1.7-403)16.2(1.9-123.2)P<0.05血小板中位计数49(13-273)38(7-216)P>0.05PLT>1003/326/48P>0.05PLT>5015/3214/48P>0.05PLT>3024/3227/48P>0.05表4数据显示伴CEBPA的AML患者具有骨髓原始细胞比率高于突变阴性组，统计学无差异，外周白细胞计数，其骨髓巨核细胞数目主要表现为减少或缺如且血小板计数较低，与突变阴性组有明显统计统计学差异。表4.CEBPA突变阳性与基因突变阴性AML患者骨髓及外周血分析。CEBPA突变阳性基因突变阴性P病人数2648骨髓原始细胞比率61%（22-99）51%(20-99)P>0.05巨核细胞数目P<0.05小于10213210到100513大于10003白细胞计数13.8（1.3-162.8）16.2(1.9-123.2)P>0.05血小板计数19.5(4-94)38(7-216)P<0.05PLT>1000/266/48P>0.05PLT>504/2614/48P>0.05PLT>30/8/2627/48P<0.05表5数据显示伴C-KIT的AML患者具有较高的骨髓原始细胞比率及外周白细胞计数，其骨髓巨核细胞数目分布比率及血小板计数与突变阴性组无统计学差异。5 第一部分急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究表5.C-KIT突变阳性与基因突变阴性AML患者骨髓及外周血象特点。C-KIT（共11人）基因突变阴性(共48人）P病人数1148骨髓原始细胞比率62.5%（30-78%）51%(20-99%)P>0.05骨髓巨核细胞数目P>0.05小于1083210到100313大于10003白细胞计数15.7(2.58-244)16.2(1.9-123.2)P>0.05血小板计数37(13-89)38(7-216)P>0.05PLT>10000/116/48P>0.05PLT>501/1114/48P>0.05PLT>306/1127/48P>0.05由于考虑到许多患者存在两种及以上不同的基因突变类型，本研究进一步将染色体核型正常的AML患者基因突变情况分型来探究与血小板计数之间的关系（表6）。结果提示DNMT3A+FLT3-ITD+NPM1、DNMT3A+NPM1、NPM1+FLT3-ITD、单独DNMT3A及单独NPM1突变阳性的AML患者血小板计数较突变阴性组高，统计学均有差异（P<0.05），而单独CEBPA双突变阳性的AML患者血小板计数较阴性组低，有明显统计学差异（P<0.0001）。表6.CN-AML不同基因突变患者血小板计数比较。基因突变类型(n)血小板计数PDNMT3A+FLT3-ITD+NPM1（n=8）102(13-273)P<0.05DNMT3A+FLT3-ITD（n=3）42(40-62)P>0.05DNMT3A+NPM1（n=8）86(49-260)P<0.05NPM1+FLT3-ITD（n=4）58(17-403)P>0.05NPM1+CEBPA（n=4）37(4-117)P>0.05单独DNMT3A（n=8）98(20-143)P<0.05单独NPM1（n=16）61(14-271)P<0.05单独CEBPA双突变(n=21)16(5-49)P<0.05单独CEBPA单突变(n=5)55(19-94)P>0.05单独C-KIT(n=11)37(13-89)P>0.05单独FLT3-ITD（n=17）35(13-87)P>0.05基因突变阴性组（n=48）38（7-216）-注：P值结果均与基因突变阴性组比较所得。6 急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究第一部分3.初诊不同血小板计数在AML中预后指导意义。在分析不同血小板计数与诱导化疗一疗程完全缓解率分析中发现，初诊血小板计数小于30的AML患者CR率最高，初诊血小板计数大于100的AML患者CR率最低。表8.不同血小板计数AML患者诱导一疗程缓解情况分析。CR率PPR率PPLTs小于30（n=118）101/118P<0.057/1180.24PLTs大于30（n=196）145/19619/196PLTs小于50（n=182）147/1820.2214/1820.66PLTs大于50（n=132）99/13212/132PLTs小于70（n=241）193/2410.1717/2410.48PLTs大于70（n=73）53/737/73PLTs小于100（n=273）219/273P<0.0519/273P<0.05PLTs大于100（n=41）27/418/41为了探究影响CR的危险因素，将患者的年龄、性别、初诊时的血象、染色体核型（高/中/低），基因突变（高/中/低），化疗方案纳入Logistic回归分析发现血小板计数，高危基因突变及高危的染色体核型影响化疗效果，将以上变量纳入多因素分析后未发现独立危险因素。表8.Logisitc单、多因素分析314例初诊AML诱导化疗效果分析。变量单因素P多因素P性别（男/女）0.68年龄（是否大于60）0.200初诊血小板计数P<0.05-小于30/30至100/大于100初诊白细胞计数0.26小于100/大于100FAB分型0.26M0-M2/M4-M5/M6基因突变P<0.05-低危/中危/高危染色体P<0.05-低危/中危/高危诱导化疗方案0.39-IA/IAC//预激ECOG评分0/1/20.837 第一部分急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究4.非M3型不同血小板计数分组AML患者基本临床特征。鉴于表7结果发现初诊血小板计数小于30组化疗完全缓解率最高，血小板计数大于100的AML患者化疗效果不佳，为此进一步探究不同计数AML患者的临床特点。如表8所示，初诊血小板计数大于100的AML患者（n=41）与血小板计数小于30组（n=273）及血小板计数30-100组，血小板计数大于100组该群患者性别分布以女性为主，中位年龄47岁，高于其余两组，有统计学差异。此群患者形态学以M4、M5型多见，且有3名患者根据既往病史及形态特点考虑为MDS转化而来，此群患者初诊时骨髓原始比率低于对照组，外周血白细胞计数较低，血红蛋白水平较高。根据染色体危险度分层，41名患者中染色体高危10例，其中包括复杂核型7例，2例-7，1例inv（3），仅有一例患者为inv（16），未发现t（8；21）。基因突变分析发现，高危组14例，该群体分子遗传学高、中、低危组比较见图1.1（P<0.05）。41例患者初次诱导化疗27人完全缓解，8人部分缓解，6人未缓解患者，与血小板小于30组比有统计学差异，具体化疗缓解情况比较见图1.2（P<0.05）。对41人患者进行后期治疗主要为19名患者后续接受大剂量化疗，22例接受造血干细胞移植术治疗。表9.初诊不同血小板计数区间AML患者的临床特点比较。变量PLT小于30（n=118）PLT30-100（n=155）PLT大于100（n=41）P年龄(岁）38（9-68）43(10-73)47（14-72）P<0.05性别（男/女）72/4689/6617/24P>0.05骨髓原始（%）60（24-99）54.5（21-99）42.5（21-98）P<0.05WBC（*109/L）19.2（1.2-322）16.15（0.6-403）8.2（0.7-442）P<0.05HB（g/L）77（32-106）78（37-169）91（40-136）P<0.05u-AML484DenovoAML11714838P>0.05Secondary-AM173L染色体P<0.05低危29321中危7710530高危121810基因突变P<0.05低危26194中危779423高危154214第一疗程CR率101/118118/15527/41P<0.058 急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究第一部分化疗方案IA65/7576/10118/25P<0.05IAC7/711/142/3P>0.05预激25/3229/377/13P>0.05其他4/42/30P>0.05注：WBC：白细胞；Hb：血红蛋白；u-AML：不能分型的急性髓系白血病；denovoAML：原发急性髓系白血病；secondary-AML：继发性急性髓系白血病。图1图1.1.三组AML患者诱导化疗缓解状况分布。图1.2.三组AML患者分子遗传学高中低分层分布。9 第一部分急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究讨论急性髓系白血病是一组异质性很强的造血干细胞及前体细胞的恶性克隆性疾病，绝大多数患者存在细胞遗传及分子生物学的改变，这些事件的发生不仅直接影响正常造血的过程，也是当今决定白血病患者分层预后的主要因素【1】。由分子遗传学改变导致的白血病细胞分化、增殖及凋亡是白血病产生的生物学基础，巨核系作为髓系的一员其造血程度会受到不同程度的影响，然而在急性髓系白血病基因突变对巨核及血小板生成的调控、影响鲜有报道【2】。本研究发现常AML患者中常见基因突变的确在造血过程中对巨核分化、增殖的调控产生影响。DNA甲基化是基因组表观遗传修饰的重要组成部分，在细胞正常功能维持、个体胚胎发育及许多疾病的发生等方面起着重要作用【3】。DNA甲基化转移酶（DNMTs）基因突变近些年作为重要的恶性血液病标记之一，在成人AML发病中约占20%的比率，其中以R882热点最多【4】，2011年一项多中心的纳入了489名小于60岁AML患者统计分析发现，DNMT3A突变患者中位外周血小板计数偏高【5】，本研究结果显示DNMT3A突变阳性AML患者组有最高的血小板计数，且此类病人骨髓中拥有较高的原始细胞，推测含DNMT3A基因突变的白血病干细胞仍保持或增强了向巨核细胞成熟的潜能。NPM1基因位于染色体5q34，其突变被认为与多种恶性肿瘤的发生相关【6】，2006年ChristianThiede等在一项纳入了1485例AML的回顾分析中发现探究NPM1阳性AML患者的临床特点，结果显示与NPM1基因突变阴性组相比，NPM1突变患者有着较高的外周白细胞及血小板计数【7】。我们同样发现NPM1突变阳性的AML患者外周血小板计数高于突变阴性组。CCAAT增强子结合蛋白A(CEBPA)基因及其编码的转录因子C/EBPα蛋白通过抑制红细胞的分化和诱导髓细胞的分化从而决定了多能祖细胞的分化方向，促进造血干/祖细胞向粒系分化【8】，2009年关于CEBPA突变AML患者临床分析显示此突变患者血小板计数较低【9】，我们临床资料同样显示CEBPA患者血小板计数明显低于阴性组，然而本研究中未发现C-KIT及FLT3-ITD基因突变对巨核、血小板影响。此外，我们还对骨髓巨核细胞数目加做了分析，发现DNMT3A及NPM1患者骨髓巨核数量多表现为正常甚至增多，而CEBPA突变的AML患者中骨髓巨核细胞缺如。目前急性髓系白血病的不良预后因素主要包括年龄，不良染色体核型及高危的基10 急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究第一部分因突变【10】，鲜有报道血小板在AML患者群体中的预后价值，在一项研究中发现随着血小板计数增加，病人预后不良风险逐渐增加【11】。在我们初步探索诱导化疗效果中发现，血小板计数小于30组诱导CR率最高，而血小板计数大于100患者诱导化疗CR率最低，虽然这群患者拥有较低的出血发生率，但此群患者中位年龄偏大，大多含有不良的分子遗传学，推测血小板计数可能是不良分子生物学标志导致的表象。此外，有体外研究证实血小板可以释放血小板生长因子，其可以作用白血病细胞上的PDGF受体，进而可能影响白血病细胞增殖【12】。综上所述，在急性髓系白血病中，不同的基因突变对巨核系/血小板的产生影响不同。随着急性白血病病情的发展，所有患者都将出现血小板进行性减少，但从本研究初步结果提示发现初诊的血小板计数大于100的AML患者分子遗传标志差，化疗效果不佳，可能确实是一组异质性的群体。推测血小板计数可能是不良分子生物学标志导致的表象，由于样本数量受限，尚需扩大样本得以验证。参考文献1.GrimwadeD,IveyA,HuntlyBJ.Molecularlandscapeofacutemyeloidleukemiainyoungeradultsanditsclinicalrelevance.Blood,2016.2.AyalaRM,JoaquínML,EnriquetaA,etal.ClinicalsignificanceofGata-1,Gata-2,EKLF,andc-MPLexpressioninacutemyeloidleukemia.AmericanJournalofHematology,2009,84(2):79–86.3.TrowbridgeJJ,OrkinSH.Dnmt3asilenceshematopoieticstemcellself-renewal.NatureGenetics,2012,44(1):13-14.4.JieX,Yue-YingW,Yu-JunD,etal.DNMT3AArg882mutationdriveschronicmyelomonocyticleukemiathroughdisturbinggeneexpression/DNAmethylationinhematopoieticcells.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2014,111(7):2620-2625.5.FelicitasT,FrederikD,AndreaL,etal.IncidenceandprognosticinfluenceofDNMT3Amutationsinacutemyeloidleukemia.JournalofClinicalOncology,2011,29(21):2889-96.6.BolliN,PayneEM,GrabherC,etal.ExpressionofthecytoplasmicNPM1mutant(NPMc+)causestheexpansionofhematopoieticcellsinzebrafish.Blood,2010,115(16):3329-3340.11 第一部分急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究7.ChristianT,SinaK,EvaC,etal.PrevalenceandprognosticimpactofNPM1mutationsin1485adultpatientswithacutemyeloidleukemia(AML).Blood,2006,107(10):e99386.8.WelnerRS,DeepakB,GiovanniA,etal.C/EBPαisrequiredfordevelopmentofdendriticcellprogenitors.Blood,2013,121(20):4073-81.9.WoutersBJ,BobL,PuttenWLJV,etal.DoubleCEBPAmutations,butnotsingleCEBPAmutations,defineasubgroupofacutemyeloidleukemiawithadistinctivegeneexpressionprofilethatisuniquelyassociatedwithafavorableoutcome.Blood,2009,113(13):3088-3091.10.KlcoJM,MillerCA,GriffithM,etal.Genomicapproachesforriskassessmentinacutemyeloidleukemia.JAMA2015,111(7):2620-2625.11.FabianaO,MeganO,MichelleL,etal.PrognosticSignificanceofNPM1MutationsintheAbsenceofFLT3-InternalTandemDuplicationinOlderPatientsWithAcuteMyeloidLeukemia:ASWOGandUKNationalCancerResearchInstitute/MedicalResearchCouncilReport.JournalofClinicalOncology,2015,33(10):599-621.12.FossB,BruserudO.Plateletfunctionsandclinicaleffectsinacutemyelogenousleukemia.Thrombosis&Haemostasis,2008,99(1):27-37.12 急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究第二部分第二部分急性髓系白血病血小板计数与相关因子研究前言急性髓系白血病是造血系统的恶性克隆性疾病，其特征包括白血病细胞异常增值及正常造血细胞受损，主要表现为骨髓中髓系原始细胞明显增生而分化受阻，红系、巨核系发育相对成熟受阻。正常人体骨髓造血中，血小板的产生依赖于造血干细胞和祖细胞向巨核系细胞的增殖和分化、成熟成为大的多倍体巨核细胞并最终裂解为血小板。巨核细胞的发育过程分为四个阶段，包括巨核母细胞、噬碱性巨核细胞、颗粒性巨核细胞及成熟巨核细胞。从巨核祖细胞到释放血小板入循环的时间从4到7天不等，血小板数正常的人其血小板的循环寿命约为10天。血小板生成素(TPO)是调节造血干细胞向巨核细胞增殖、分化和血小板产生的主要调控因子，它主要是肝实质细胞中产生，也有少量在肾脏生成，此外白介素3(IL-3)、白介素6(IL-6)、白介素11(IL-11)、粒-巨噬细胞集落刺激因子、干细胞因子等也是影响巨核细胞发育的细胞因子。鉴于前期工作我们发现在非M3型不同基因突变的AML患者表现出不同趋势的外周血血小板计数及骨髓巨核分布，为研究探索其详细机制，我们初步测定非M3型急性髓系白血病患者外周血清TPO水平，IL-6水平，骨髓髓系白血病干细胞c-MPL表达水平在AML患者中的变化及与基因突变的相关性分析。材料和方法一、仪器（1）LDZ5-2低速平衡离心机北京医用离心机厂（2）流式细胞仪FC500美国Beckman-Coulter公司（3）低温冰箱日本SANYO公司（4）漩涡振荡器上海医科大学仪器厂（5）温箱美国Fisher公司（6）DK-S12型电热恒温水浴锅上海医疗器械五厂（7）Varioskanflash酶标仪美国Thermo公司13 第二部分急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究二、试剂。CD45-Percp（美国BD公司）、CD34-PE单抗（美国BD公司）、CD117-FITC（美国BD公司）、CD38-ECD单抗（美国BD公司）、CD110-APC单抗（美国BD公司）、血小板生成素ELISA试剂盒（R＆D公司）、IL-6ELISA试剂盒（proteintech公司）、2.5mmol/LEDTA抗凝剂、3%BSA/PBS、0.025%TritonX-100、1×PBS。三、实验方法。1.急性髓系白血病外周血清TPO水平测定（1）.标本收集：抽取实验及对照组患者空腹外周静脉血3ml，促凝，1000g×15min离心，放于-80℃冰箱冻存备用，2小时内完成标本处理。（2）.TPO试剂盒中所有试剂放置至室温，每孔加入DiluentRD1-150μl。血浆标本取出后10000g×10min再次离心，取上清液。（3）.每孔分别加入标准品、阴性对照及血浆标本200μl，避光室温孵育3小时。（4）.吸出每孔液体，并加入400μl洗涤液，充分洗涤，甩干，重复4次。（5）.每孔加入TPO结合物200μl，避光，室温孵育1小时。（6）.吸出每孔液体，并加入400μl洗涤液，充分洗涤，甩干，重复4次。（7）.加入200μl底物，避光孵育30min。（8）.每孔加入50μl终止液，可见颜色由蓝转黄。（9）.30min内酶标仪（波长450nm）测定。2.急性髓系白血病外周血清IL-6水平测定（1）.标本收集：抽取实验及对照组患者空腹外周静脉血3ml，置于惰性分离胶和促凝剂管，1000g×15min离心，放于-80℃冰箱冻存备用，2小时内完成标本处理。（2）.试剂盒中所有试剂放置至室温，每孔加入DiluentRD1-150μl。血浆标本取出后10000g×10min再次离心，取上清液。（3）.每孔分别加入标准品、阴性对照及血浆标本100μl，37℃孵育2小时。（4）.吸出每孔液体，并加入300μl洗涤液，充分洗涤，甩干，重复4次。（5）.每孔加入1×抗体结合物100μl，避光，37℃孵育1小时。（6）.吸出每孔液体，并加入300μl洗涤液，充分洗涤，甩干，重复4次。14 急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究第二部分（7）.每空加入1×HRP结合抗体100μl底物，37℃孵育40min。（8）.每孔加入100μl终止液，可见颜色由蓝转黄。（9）.30min内酶标仪（波长450nm）测定。3.初诊急性白血病髓系干细胞C-MPL表达测定（1）.取初诊AML患者肝素抗凝1ml，分为实验管与对照管，骨髓流式细胞仪计数后，裂红15分钟，800r/min*5min，弃上清；（2）.向实验管中加入PercpCD45、ECDCD38、PECD117、FITCCD34抗体各5ul、APCC-MPL-APC抗体10ul；同型对照管加Percp入CD45、ECDCD38、PECD117、FITCCD34，APC-IgG抗体各5ul，避光孵育30min；（3）.孵育结束后，弃上清，补足PBS，1500r/min×5min，洗涤1次，弃上清，重悬，上机。（4）.流式通道设定：通道1，CD34（FITC荧光）；通道2，CD117（PE荧光）；通道3，CD38（ECD荧光）；通道4，CD45（PerCP荧光）；通道5，CD110（APC荧光）。四、统计学分析。以SPSS19.0及GraphPad5.0统计软件对实验数据进行分析，计量资料以均数±标准差表示，均数比较采用方差分析，两样本平均值的比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。结果1.急性髓系白血病（M3型除外）患者血清TPO水平检测实验选取初诊非M3型AML52例患者，对照选取16例急性髓系白血病化疗后骨髓处于完全缓解期的患者及10例健康人。实验结果显示，初诊AML患者TPO水平为（371.02±200.26）pg/ml显著高于AML缓解期间患者（165.80±16.70）pg/ml及正常对照（106.0±13.84）pg/ml，AML化疗后缓解期患者高于正常对照组，具有统计学意义（图2）。根据血小板计数及出血危险度分为三组，分别为血小板计数小于30，血小板计数30至100组，血小板计数大于100组。进一步分组发现，血小板计数大于100组TPO水平（593.4±118.7）pg/ml高于血小板计数30-100组（461.80±57.75）pg/ml及血小板计数小于30组（235.1±22.70）pg/ml（图3）。同样，根据15 第二部分急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究测定患者基因突变情况（图3），分为5组，DNMT3A组（701.8±159.0）pg/ml，CEBPA组（261.5±46.44）pg/ml，NPM1（332.8±62.60）pg/ml，FLT3-ITD（617.2±190.6）pg/ml，突变阴性组（244.0±20.81）pg/ml,统计发现DNMT3A、FLT3-ITD与突变阴性组TPO水平增高，NPM1、CEBPA组与突变阴性组无差异，DNMT3A、FLT-ITD与CEBPA组TPO水平差异有统计学意义。图1.TPO标准曲线图。图2.不同血小板计数AML患者TPO水平。图3.不同基因突变AML患者TPO水平。2.急性髓系白血病（M3型除外）患者血清IL-6水平检测同样对初诊52例非M3型AML患者，对照选取同上（16例急性髓系白血病化疗后骨髓处于缓解期患者及10例健康人）。标准曲线见图4，实验结果显示，初诊AML患者IL-6水平（302.60±23.51）pg/ml显著高于AML缓解期间患者（206.40±18.33）pg/ml及正常对照（134.00±16.68）pg/ml，AML化疗后完全缓解期患者IL-6水平高于正常对照组，P<0.05。根据血小板计数及出血危险度将病人分为三组，血小16 急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究第二部分板计数小于30组（303.60±38.78）pg/ml，血小板计数30至100组（291.70±29.87）pg/ml，血小板计数大于100组（314.30±52.64）pg/ml，三组间IL-6水平无明显统计学意义（P>0.05）。同样，根据测定患者基因突变情况（图5），分为5组，DNMT3A组（n=5），CEBPA组（n=6），NPM1（n=4），FLT3-ITD（n=5），突变阴性组（n=32）,统计发现各组间IL-6水平表达无统计学差异（P>0.05）。图4.IL-6标准曲线图。图5.不同血小板计数AML患者IL-6水平。图6.不同基因突变AML患者IL-6水平。3.急性髓系白血病造血干细胞c-MPL表达水平测定。我们对20例AML患者骨髓白血病髓系干细胞c-MPL抗体进行测定，流式图谱见图7，结果显示c-MPL在AML患者髓系干细胞中有表达，且表达水平高于健康对照(1.30±0.66)%，有统计学意义P<0.05。根据初诊血小板计数分为血小板计数小于30，血小板计数30至100及血小板计数大于100三组，c-MPL表达水平分别为（1.86±0.50）%，（4.05±0.62）%，（6.98±1.90）%，见图8。根据测定患者基因突变情况，17 第二部分急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究分为5组，DNMT3A组（8.35±2.95）%，CEBPA组（2.00±0.67）%，NPM1（2.65±0.55）%，突变阴性组（3.67±0.73）%,统计发现各组间DNMT3A组表达水平最高，其余各组见c-MPL表达水平无差异（图9）。图7.c-MPL在AML患者中的表达18 急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究第二部分图8.不同血小板计数c-MPL表达。图9.不同基因突变之间c-MPL表达。讨论血小板生成素（TPO）主要肝脏产生，是调节巨核成熟、增殖发育过程中最重要的细胞因子，与其受体C-MPL相互结合发生受体同源二聚化反应，进而激活下游细胞内蛋白激酶分子，通过JAK-STATS途径及Ras-MAKP途径实现信号传导【1】。在常见血液系统疾病中，TPO水平的升高通常归因于巨核生成减少而低水平的TPO多见于血小板破坏增多相关的疾病【2】。此前文献报道AML患者中TPO水平较健康对照人群水平明显增加【3】，本研究结果同样发现初诊AML患者血清TPO水平升高，明显高于正常人及化疗缓解期患者，然而不同之处在于，我们根据血小板计数分组后发现血小板计数正常组TPO平均水平最高，血小板低于30组平均水平最低，推测内源性的TPO的增加并非是完全是血小板减少导致的负反馈调节机制，骨髓微环境内分泌的TPO可能在促进血小板生成中发挥重要的作用。在基因突变与TPO相关性分析研究中发现，FLT3-ITD，DNMT3A患者TPO水平较高，且CEBPA突变患者TPO水平最低，一方面可能是由于基因突变可能直接或间接增加内源性TPO的释放，另一方面推测与不同基因突变导致的血小板计数趋向介导的TPO水平有关，其具体机制尚不明确。IL-6不仅是参与免疫、炎症、肿瘤的重要细胞因子，也具有支持造血干细胞分化的作用。2012年新英格兰杂志报道卵巢癌的癌细胞生成IL-6，从而促进肝脏分泌TPO，刺激血小板生成，而大量的血小板又能促进肿瘤生长，从而形成了一个正反馈循环【4】。本研究结果中未发现此反馈调节，IL-6与血小板计数及基因突变19 第二部分急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究类型无明显差异，推测初诊AML患者的IL-6表达高水平升高与肿瘤负荷及炎症反应有关。+c-MPL作为TPO的受体，主要表达于CD34细胞、血小板、巨核细胞中，既往等发现认为c-MPL与AML病人较差的染色体核型及较短的缓解持续时间相关【5,6】，然而并目前未有文献报道基因突变与c-MPL表达的相关性，我们结果初步显示DNMT3A患者c-MPL水平表达最高，而其余基因表达无明显差异，可能符合DNMT3A突变阳性AML患者无病进展生存期短的生物学特征【7】。本研究结果还显示血小板计数正常的AML患者c-MPL水平最高，与本课题前部分结论血小板计数正常组相对预后不良相一致。此外，本实验针对白血病髓系干细胞C-MPL表达，血小板计数正常组AML患者c-MPL表达水平较高，推测c-MPL高表达的白血病干细胞仍具有较强向巨核分化增殖的能力进而导致血小板计数升高，然而其他基因突变是否具有该通路共性尚需进一步扩大样本验证。综上，我们初步研究显示，初诊AML患者血小板计数正常组TPO水平，c-MPL水平最高，DNMT3A、FLT3-ITD突变阳性的AML患者初诊时TPO水平较高，DNMT3A患者c-MPL水平表达较高，由于本实验样本较少，巨核、血小板产生的影响机制复杂，尚需进一步探索。参考文献1.ChouFS,MulloyJC.TheThrombopoietin/MPLpathwayinhematopoiesisandleukemogenesis.JournalofCellularBiochemistry,2011,112(6):1491-8.2.IchikawaN,IshidaF,ShimodairaS,etal.Regulationofserumthrombopoietinlevelsbyplateletsandmegakaryocytesinpatientswithaplasticanaemiaandidiopathicthrombocytopenicpurpura.ThrombHaemost.1996;76:156-160.3.FrancisC,ChristopheH,StéphanieD,etal.Circulatingthrombopoietinasaninvivogrowthfactorforblastcellsinacutemyeloidleukemia.Blood,2006,107(6):2525-2530.4.StoneRL,NickAM,McneishIA,etal.Paraneoplasticthrombocytosisinovariancancer.NewEnglandJournalofMedicine,2012,366(366):610-8.5.KaushanskyK.Onthemolecularoriginsofthechronicmyeloproliferativedisorders:itallmakessense.Blood.2005;105:4187-419020 急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究第二部分6.AlbitarM,ManshouriT,KantarjianH,etal.Correlationbetweenlowerc-mplproteinexpressionandfavorablecytogeneticgroupsinacutemy-eloidleukemia.LeukRes.1999;23:63-69.7.GroG.Pløen,NederbyL,GuldbergP,etal.PersistenceofDNMT3Amutationsatlong-termremissioninadultpatientswithAML.BritishJournalofHaematology,2014,167(4):478–486.21 综述急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究综述急性髓系白血病基因突变对造血、巨核分化调控及血小板生成相关机制研究急性髓系白血病（Acutemyeloidleukemia，AML）是造血系统的恶性克隆性疾病，是多能造血干细胞或已经分化的前体细胞发生体细胞突变所形成的一类疾病，其特征包括白血病细胞异常增值及正常造血细胞受损，主要表现为骨髓中髓系原始细胞明显增生而分化受阻，外周血白细胞有质和量的异常，常伴贫血和血小板减少【1】。目前，急性髓系白血病的发病机制尚不清楚，主要包括物理因素、化学因素、遗传因素以及其他血液病的进展。在过去的几十年里，白血病细胞的免疫和分子遗传学研究的飞速进展，不但揭示了许多具有重要诊断和预后价值的染色体异常、基因突变类型，而且为从分子水平上研究血液病的发病机制、开放新的靶向治疗药物提供了线索。急性髓系白血病是一组异质性较强的疾病，绝大多数AML患者可以检测到基因突变，后者对于患者的靶向治疗及预后分层起重要作用【2】。这些常见的基因突变可分为以下三类，一类基因突变持续激活通路，使造血干/祖细胞增值失调，包括RAS突变，FLT3-ITD和KIT突变等；二类基因突变使维持造血系统分化的重要转录因子功能损失，导致造血系统分化和凋亡障碍，包括NPM1等基因突变及急性髓系白血病-矮小相关转录因子(AML1-ETO)，早幼粒细胞白血病-维甲酸受体(PML-RARα)等融合基因【3】；三类突变是表观修饰学的突变，主要包括DNMT3A、TET2,ASXL1。目前绝大多数文献主要是探究分子遗传学改变包括基因突变、融合基因等对白血病细胞(粒系、单核系)的增值、分化、凋亡等功能影响，而目前针对巨核系起源的恶性血液病仅有急性巨核细胞白血病（acutemegakaryoblasticleukemia,AMeL），其主要表现为原始巨核细胞增多，常合并骨髓纤维化。巨核系作为髓系的一员，在急性粒、巨核系白血病中基因突变及转录调节因子改变对其也存在不同程度的影响【4】。实际临床工作中可发现，急性髓系白血病病人个体间血小板及巨核细胞数量差异很大，多数低增速程度或缺如，表现为血小板减少及血小板严重减少，在少部分病人中表现为巨核细胞数量正常甚至增加,最终导致血小板计数正常甚至增加，而目前鲜有文献探究急性髓系白血病中的基因突变对巨核系增值、分化功能研究。接下来将对目前AML常22 急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究综述见基因突变对造血、巨核分化的调控及正常骨髓巨核、血小板生成相关机制做一综述。AML常见基因突变对巨核的影响1.DNMT3A基因DNA甲基化是基因组表观遗传修饰的重要组成部分，在细胞正常功能维持、个体胚胎发育及许多疾病的发生等方面起着重要作用【5-6】。近年来研究发现，肿瘤相关基因存在不同程度的去甲基化或超甲基化现象，提示基因的甲基化改变与肿瘤的发生密切相关【7-8】，DNMTs可能在多种实体肿瘤和造血系统中表达异常，作为重要的恶性血液病标记之一，发现在成人AML发病中约占20%的比率，其中以R882热点最多【9】。在哺乳动物中，参与甲基化过程中主要存在3类具有活性的DNMT3s，主要包括DNMT1、DNMT3A和DNMT3B，DNMT1主要是维持甲基化作用，DNMT3A和DNMT3B主要作用是从头甲基化，近年来DNMTs成为肿瘤甲基化研究的热点。其中，DNMT3A催化甲基到CpG岛的胞嘧啶残基，引起下游基因的表达，其上调表达最终导致肿瘤的发生【10】。近年DNMT3A基因突变在恶性血液病的作用日益受到重视，来自多方的临床数据显示DNMT3A基因突变多见于急性髓系白血病，以M4、M5型AML为主，含此类突变的病人诊断时年龄较大，有着较高的白细胞及血小板计数，此外染色体核型多数正常，且认为与预后不良有关，有着较高的复发率，这些发现为疾病的诊断和预后评价提供了一个有潜力的生物标记【11】。2011年一项针对DNMT3A的多中心纳入了489名小于60岁AML患者统计分析发现DNMT3A突变患者中位外周血小板计数为71*109/L，而无此基因突变患者血小板中位计数为41*109/L【12】。2013年中国的陈竺院士团队将DNMT3AR882H基因突变移植到小鼠体内，移植模型阐述了DNMT3A突变在造血干细胞自我更新及髓系分化的调节作用，这其中包括成功移植了该基因突变的小鼠12个月后进展成了伴有血小板增多的慢性粒单核细胞白血病模型，RNA微阵列分析计数显示造血干细胞相关基因表达的改变，其中包括在模型小鼠造血干细胞巨核系MPL上调及粒系、单核系Hoxb2,Hoxa9,andMeis1通路的激活。更重要的是发现DNMT3A-R882H可以提高CDK1蛋白水平的表达进而增强细胞周期活性，导致白血病细胞的增值【13】。总之，DNMT3A在细胞的自我更新及分化过程中有着至关的作用，当平衡被打破后，将会带来一序列的病理过程并可能导致肿瘤的发生。2015年,OAGuryanova等后续建立了条件性DNMT3A基因敲出的小鼠模型，随着时间的延长，基因敲出的小鼠逐渐表现出血小板减少、贫血及单个核细胞增多，而骨髓表现出增殖旺盛及巨核病态造血，23 综述急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究同时在小鼠的脾脏发现了髓外造血【14】。2.NPM1基因NPM1是一种多功能的磷酸化蛋白，位于细胞核内，作为细胞内蛋白质的分子伴侣在核质之间穿梭，参与多种细胞内活动，包括核糖体的生物合成，防止核内蛋白质分子的积聚，通过周期素E/CDK2的磷酸化启动中心丽的复制，并作为ARF的伙伴分子调节由环境压力诱导的p53功能【15】。NPM1基因位于染色体5q34，其突变被认为与多种恶性肿瘤的发生相关，包括恶性血液病。例如急性髓系白血病，间变大细胞型淋巴瘤的t（2；5）就形成NPM1-ALK融合蛋白【16】。自从2005年发现AML种的NPM1突变，但并不清楚是一种原发的遗传损伤还是继发的染色体畸形并于2008年WHO将NPM1突变规定为单列的再现性白细胞亚星，单独的NPM1突变本身被看做是良好预后的指征，但它尝尝与FLT3-ITD、DNMT3A同时存在而不能扭转FLT3-ITD预后的负面影响【17】。总之，目前的证据提示NPM1突变是一种基础的遗传学事件，因此这种AML代表着约1/3的AML中的一种具体特定本质的白血病【18】。2006年ChristianT等在一项纳入了1485例AML的回顾分析中发现NPM1的突变比率高达27.5%，与NPM1基因突变阴性组相比，此类病人多见于正常核型，有着较高的外周白细胞及血小板计数特征，单独的NPM1突变组病人可以长期生存获益，拥有较长的无病进展状态时间长及较低的复发率【19】。那么NPM1基因突变是如何影响造血系统并进一步导致AML的发生？BolliN等早期报道NPM1在的细胞体内有促进造血干细胞的扩增的潜能【20】。2011年Cheng等首次构建了NPM1突变的小鼠模型，经过长期观察，发现仅有较少一部分老鼠骨髓发生了过度增殖变化【21】。随后，2013年PaoloSportoletti等在BLOOD上发表文章，其将NPM1A突变位点导入小鼠，这类小鼠模型在长达1年半的随访观察后小鼠出现了外周血小板计数下降，同时变异小鼠的骨髓及脾脏出现了巨核细胞的过度异常增生的生物学特征，进一步探究与野生型小鼠TPO水平无差异后，其发现巨核成熟异常增生主要归因于调节巨核早期分化成熟过程中microRNA（miR-10a,miR-10b,andmiR-20）及HOXB基因的调节改变。于此同时，陆续有文献报道NPM1突变拥有致小鼠长期可以发展为AML模型【22】。2013年Mupo等将NMP1突变与FLT3-ITD突变的小鼠杂交后，这类混合基因突变的小鼠很快进展成了白血病【23】。以上体内实验证明NPM1突变本身在体内导致白血病发生的潜能很弱，通常需要其他基因的获得才能加速促进白血病细胞的产生，其次此基因拥有较大的促进造血干细胞的潜能，然而其对于巨核的调控仍可能24 急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究综述是通过巨核相关microRNA的改变来实现的。3.CEBPA基因CCAAT增强子结合蛋白A(CEBPA)可以编码产生C/EBPα蛋白，主要是通过诱导髓细胞的分化进而决定了造血干/祖细胞向粒系分化【24-26】。C/EBPα是粒系分化的重要调控因子，在某些情况下可促进巨噬细胞的分化，在造血干细胞中表达较低，随着粒系分化而表达增加，粒-单祖细胞中表达水平达到最高，而在淋系及前体细胞及巨核系中不表达，在造血系统早期分化过程中起重要作用【27,28】。CEBPA基因的突变及其在转录、翻译及翻译后水平受到的异常调控可引起C/EBPα蛋白结构或表达异常，C/EBPαmRNA可翻译出两种蛋白质，C/EBPαP42和C/EBPαP30，C/EBPα的突变可影响蛋白质的N端，使C/EBPαP42终止，C/EBPαP30过渡表达，还影响bZIP使二聚体和DNA障碍，最终导致粒系分化成熟障碍、不成熟粒系前体细胞异常增殖，诱导AML的发生【29】。MinYe等2012年制作了一个CEBPA敲除的小鼠模型，发现C/EBPα缺失的造血干细胞表现出类似胚胎肝细胞的强大的增值能力，重要的还发现N-MYC是C/EBPα的重要下调蛋白，提示C/EBPα是由胚胎到成熟造血干细胞的一个中心调控因素【30】。2008年WHO新修订的分类标准中，已将目前孤立的CEBPA双突变已是AML患者良好预后的分子学标志，CBPPA双突变患者长期生存率与无疾病生存时间较突变野生组明显延长【31-33】。在一项儿童AML回顾分析发现，CEBPA突变阳性AML患者血小板计数明显低于突变野生型组【34】。综上，CEBPA对于巨核调控尚不清除，然而AML患者伴此突变这血小板计数明显低下，可能由于基因突变多发生在早期造血干细胞，阻断了向巨核调节的分化能力所致，还需要进一步研究探索。二、巨核系发育过程中参与的相关信号通路、细胞因子及转录因子1.巨核细胞的起源所有的血细胞包括红细胞、白细胞、血小板均来源于具有自我更新、增殖及分化能力的造血干细胞，位于骨髓里的造血干细胞不对称细胞分裂后形成多能祖细胞（multipotentprogenitorcell,MPP)，后者不再具有自我更新能力，但具有较高的增值率，也就是渐进性通过细胞周期，有较低的增殖潜能，表现为有限的分化细胞类型的数量，形成各种造血前体细胞。与其他细胞一样，巨核细胞也是由多能造血干细胞分化而来，干细胞分化为巨核细胞各阶段主要包括巨核母细胞、噬碱性巨核细胞、颗粒性巨核细胞及成熟巨核细胞。产生巨核的克隆包括能产生含多系细胞的集落，如粒-红-巨噬-巨核细胞集落形成细胞25 综述急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究（granulocyte/erythroid/macrophage/megakaryocytecolony-formingunit,GEMM-CFC）或混合集落形成细胞（mix-CFC）的早期细胞以及能够定向分化为巨核细胞的晚期祖细胞。大多数的造血干细胞（CD34+CD38-）表达血小板生成素受体C-MPL，此类细胞先分化为多能造血干细胞GEMM-CFC，继而向巨核细胞、红细胞分化。分化过程中的某个位点可以产生向巨核定向分化的前体细胞。这种介于多能干细胞及巨核系祖细胞之间的过度型细胞表达C-MPL，该基因在巨核细胞系和祖细胞中高度表达。作为最早的定向祖细胞，meg-BFC可引发巨核细胞簇（含100个或以上细胞）形成，表达干细胞标志CD34，且HLA-DR阴性。较晚期的祖细胞开始核内有丝分裂，此阶段后便形成了多倍体前体细胞。在核内有丝分裂完成后，不成熟巨核细胞的胞浆继续发育成熟后，于骨髓释放血小板至骨髓及外周血液循环中【35】。2.血小板在AML中的变化血小板是无核的细胞小碎片，作为血液中的重要有形成分之一，在止血、免疫炎症反应、血栓形成等生理和病理过程中有重要作用。在急性髓系白血病中，血小板数量减少导致的出血是最常见的临床症状之一，实际上血小板的功能在急性髓系白血病也有一定的失调【36】。早在上世纪70年代，有学者就发现在AML患者中，血小板的聚集、寿命及血小板释放因子（PF-3、PF-4、β-TG等）的改变，随后陆续有研究探索发现血小板活化功能指标包含CD62p、CD63的变化【37】。近期最重要的发现是在体外已经证实血小板与白血病原始细胞可以相互影响，主要表现为以下几点：1）急性髓系白血病细胞可以促进血小板释放血小板生长因子（Plateletderivedgrowthfactor，PDGF）及CD62p，进而活化血小板；2）血小板可以直接粘附白血病细胞或通过分泌PDGF，PF-4及血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）等介质粘附；3）AML细胞表达VEGF受体，可以与血小板分泌的VEGF结合影响白血病细胞增殖【38-39】。3.促血小板生存素许多学者都在努力发现巨核细胞增生和血小板产生的体液调控因子，直到1994年，这种蛋白才最终被提纯和克隆，并有好几种命名，血小板生成素（thrombopoietin，TPO），C-MPL配体，巨核细胞生长发育因子，血小板生成素是巨核细胞增殖、分化和血小板产生的主要调控因子，它主要是肝实质细胞中产生，也有少量在肾脏生成，在人类染色体3q27-28上有血小板生成素基因的单拷贝【35】。TPO的作用是放大巨核细胞和血小板的基础生存率，可以诱导血小板特异性蛋白以及特异性结构并增加核内有丝分裂，同时它也是一个原始多系干细胞的主要调控因26 急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究综述子。血小板生成素应用于正常或骨髓受抑的鼠可增加全部造血细胞的恢复，加速造血恢复，在造成了血小板生成素或其受体缺陷的动物，其造血祖细胞包括巨核系前体细胞正如所预期的那样将减少90—95%【40】。其他体外研究表明，TPO对早期多能干细胞有促增殖作用，尤其在联合白介素3（Interlectin-3,IL-3）及干细胞因子（Stemcellfactor,SCF）的条件下，可以诱导其进入细胞周期，而且表明是定位于C-MPL群体，裂解MPL基因。血小板及巨核细胞上高亲和力的C-MPL，该受体结合TPO并将其从循环中清除，因此直接决定着循环中的TPO水平【41】。鉴于以上机制，血浆TPO的水平往往与血小板的计数成反比，在由巨核生存障碍导致的血小板计数下降的疾病中包括再生障碍性贫血、化疗引起的血小板减少已被证实。4.c-MPLc-MPL是TPO分子的唯一功能性受体，在正常造血系统，c-MPL主要表达于不成熟的CD34+CD38-造血干、祖细胞、巨核祖细胞及血小板上，通过与TPO的结合，促进巨核细胞和造血干/祖细胞的增殖和分化，并清除和代谢TPO分子，在维持正常的血小板计数起着至关重要的作用【42】。c-MPL与TPO相互结合，发生受体同源二聚化反应，进一步激活细胞内蛋白激酶分子，主要通过JAK2/STATS途径及Ras-MAKP途径实现信号传导；近期发现成骨细胞上分泌的TPO与造血干细胞上的c-MPL相互结合，对骨内膜上造血干细胞的细胞周期进展有调节作用，因此该通路对骨髓造血干细胞与微环境的相互作用具有重要作用【43】。5.TPO/c-MPL通路鉴于c-MPL在造血干细胞静息状态下的重要维持作用，很容易联想到TPO/c-MPL通路对于白血病细胞形成会发挥作用。最早于1995年由Matsumura等发现印记杂交方法发现26/50例AML患者中有c-MPL表达，随后陆续有研究证实了C-MPL在AML患者原始细胞的表达，且高表达与较短的缓解维持期与不良生存相关【44】。体外实验探究中有人发现TPO在体外可以促进c-MPL阳性的白血病细胞增殖【45】。2006年，FrancisCorazza在一项研究中，此研究纳入了39例AML患者，发现22名急性髓系白血病患者原始细胞上表达c-MPL，且这些患者TPO的水平较c-MPL表达阴性的患者明显低，较低水平的TPO是由c-MPL清除所致。此外，该研究发现TPO不仅可以促进c-MPL+的髓系白血病细胞增殖，还可以延缓凋亡【46】。既然TPO/c-MPL在维持正常静止的造血干细胞更新发挥重要作用，那么在白血病干细胞的维持中是否可以作为靶点，作为防止复发的新策略。6.细胞因子在巨核生存调节中，还有许多重要的细胞因子例如白介素27 综述急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究6(interlectin-6,IL-6)，白介素11(interlectin-11,IL-11)都可参与巨核系分化、增殖的不同阶段。IL-6以前称干扰素、杂交瘤生长因子，在正常的骨髓体内有刺激血小板产生的作用【47】。IL-11通过IL-6诱导有很多生物学活性，可以刺激B细胞、巨核细胞以及早期多潜能干细胞，也可以刺激血小板产生。2012年新英格兰杂志报道卵巢癌的癌细胞生成IL-6，从而促进肝脏分泌TPO，刺激血小板生成，而大量的血小板又能促进肿瘤生长，从而形成了一个正反馈循环，且血小板计数升高的患者长期预后不佳【48】。7.GATA-1在整个造血过程中干细胞的发育及各系分分化成熟均需要不同的转录因子参与，并且涉及到转录因子的激活与失活、上调与下调及多因子之间的相互作用【49】。GATA-1属于锌指结构转录因子，和它的辅助因子FOG（FriendofGATA-1）在红细胞和巨核细胞的分化及发育中都有重要作用，研究发现GATA-1突变的小鼠表现为持续的血小板减少，伴不成熟的巨核细胞增生【50】。既往文献报道AML患者中有GATA-1表达，主要见于M6及M7型急性髓系白血病患者【51】。RosaM.Ayala等对49例AML患者的GATA-1表达水平进行了测定，其中发现GATA-1在18/49（43.9%）AML患者中有表达，且GATA-1的高表达与预后较低表达者预后差，并且GATA-1的高度表达患者通常年纪较大，且与白血病抗体CD34高表达相关【52】。28 急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究综述结语无论是临床现象及基础体内、外实验的探究，AML中分子遗传学的改变，导致了造血系统的紊乱，不仅导致了粒系、单核系分化、增殖的改变，而且对巨核系的发育过程产生着不同的影响，且相互机制尚不完全明确，需进一步探究以提供重要的临床指导价值。29 参考文献急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究参考文献1.CancerGenomeAtlasResearchNetwork.Genomicandepigenomiclandscapesofadultdenovoacutemyeloidleukemia.NEnglJMed.2013;368(22):2059-74.2.GrimwadeD,IveyA,HuntlyBJ.Molecularlandscapeofacutemyeloidleukemiainyoungeradultsanditsclinicalrelevance.Blood,2016,128(4):683-692.3.MrózekK,MarcucciG,PaschkaP,etal.Clinicalrelevanceofmutationsandgene-expressionchangesinadultacutemyeloidleukemiawithnormalcytogenetics:arewereadyforaprognosticallyprioritizedmolecularclassification.Blood.2007;109(2):431–448.4.AyalaRM,JoaquínML,EnriquetaA,etal.ClinicalsignificanceofGata-1,Gata-2,EKLF,andc-MPLexpressioninacutemyeloidleukemia.AmericanJournalofHematology,2009,84(2):79–86.5.SuhuaF,JacobsenSE,WolfR.Epigeneticreprogramminginplantandanimaldevelopment.Science,2010,330(6004):622-624.6.TrowbridgeJJ,OrkinSH.Dnmt3asilenceshematopoieticstemcellself-renewal.NatureGenetics,2012,44(1):13-14.7.JonesPA,BaylinSB.Theepigenomicsofcancer.Cell,2007,128(4):683-692.8.KaijLT,WeteringMVD,FangF,etal.DNAmethylationdynamicsduringintestinalstemcelldifferentiationrevealsenhancersdrivinggeneexpressioninthevillus.GenomeBiology,2013,14(5):R50-R50.9.ShahMY,LichtJD.DNMT3Amutationsinacutemyeloidleukemia.NewEnglandJournalofMedicine,2010,363(25):2424–2433.10.TrowbridgeJJ,OrkinSH.Dnmt3asilenceshematopoieticstemcellself-renewal.NatureGenetics,2012,44(1):13-14.11.GroG.Pløen,NederbyL,GuldbergP,etal.PersistenceofDNMT3Amutationsatlong-termremissioninadultpatientswithAML.BritishJournalofHaematology,2014,167(4):478–486.12.FelicitasT,FrederikD,AndreaL,etal.IncidenceandprognosticinfluenceofDNMT3Amutationsinacutemyeloidleukemia.JournalofClinicalOncology,2011,29(21):2889-96.30 急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究参考文献13.JieX,Yue-YingW,Yu-JunD,etal.DNMT3AArg882mutationdriveschronicmyelomonocyticleukemiathroughdisturbinggeneexpression/DNAmethylationinhematopoieticcells.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2014,111(7):2620-2625.14.GuryanovaOA,LieuYK,GarrettbakelmanFE,etal.Dnmt3aregulatesmyeloproliferationandliver-specificexpansionofhematopoieticstemandprogenitorcells.Leukemia,2015.2001-2005.15.LauraP,ArcangeloL,MariaPaolaM,etal.Mutatednucleophosmindetectsclonalmultilineageinvolvementinacutemyeloidleukemia:ImpactonWHOclassification.Blood,2006,108(13):4146-4155.16.ClaudiaH,CristinaM,SusanneS,etal.AMLwithmutatedNPM1carryinganormaloraberrantkaryotypeshowoverlappingbiologic,pathologic,immunophenotypic,andprognosticfeatures.Blood,2009,114(14):3024-3032.17.BrunangeloF,KatjaM,TamaraW,etal.Multilineagedysplasiahasnoimpactonbiologic,clinicopathologic,andprognosticfeaturesofAMLwithmutatednucleophosmin(NPM1).Blood,2010,115(18):3776-3786.18.VassiliouGS,CooperJL,RolandR,etal.Mutantnucleophosminandcooperatingpathwaysdriveleukemiainitiationandprogressioninmice.NatureGenetics,2011,43(5):2916–2926.19.ChristianT,SinaK,EvaC,etal.PrevalenceandprognosticimpactofNPM1mutationsin1485adultpatientswithacutemyeloidleukemia(AML).Blood,2006,107(10):e99386.20.BolliN,PayneEM,GrabherC,etal.ExpressionofthecytoplasmicNPM1mutant(NPMc+)causestheexpansionofhematopoieticcellsinzebrafish.Blood,2010,115(16):3329-3340.21.ChengK,SportolettiP,ItoK,etal.ThecytoplasmicNPMmutantinducesmyeloproliferationinatransgenicmousemodel.Blood,2010,115(16):3341-5.22.PaoloS,EmanuelaV,RobertaR,etal.ThehumanNPM1mutationAperturbsmegakaryopoiesisinaconditionalmousemodel.Blood,2013,121(17):3447-3458.23.SportolettiP,VarasanoE,RossiR,etal.MousemodelsofNPM1-mutatedacutemyeloidleukemia:biologicalandclinicalimplications.Leukemia,2014,29(2):269-278.31 参考文献急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究24.Lekstrom-HimesJ,,XanthopoulosKG.BiologicalroleoftheCCAAT/enhancer-bindingproteinfamilyoftranscriptionfactors.JournalofBiologicalChemistry,1998,273(44):28545-28548.25.SteffenK,BalazsH,ElenaL,etal.DysregulationoftheC/EBPalphadifferentiationpathwayinhumancancer.AustralianEconomicReview,2009,357(1):34-44.26.WelnerRS,DeepakB,GiovanniA,etal.C/EBPαisrequiredfordevelopmentofdendriticcellprogenitors.Blood,2013,121(20):4073-81.27.StefanF,SchlenkRF,InaS,etal.CEBPAmutationsinyoungeradultswithacutemyeloidleukemiaandnormalcytogenetics:prognosticrelevanceandanalysisofcooperatingmutations.JournalofClinicalOncology,2004,22(11):624-633.28.王丽朦朦,肖浩文,黄河.CEBPA基因突变和表达异常在急性髓系白血病中的作用研究[J].中国实验血液学杂志,2012,20(5):1256-1260.29.Cailin,Collins,Jingya,Wang,Hongzhi,Miao,etal.C/EBPαisanessentialcollaboratorinHoxa9/Meis1-mediatedleukemogenesis.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2014,111(27):9899-904.30.MinY,HongZ,GiovanniA,etal.C/EBPacontrolsacquisitionandmaintenanceofadulthaematopoieticstemcellquiescence.NatureCellBiology,2013,15(4):385-394.31.NerlovC.C/EBPαmutationsinacutemyeloidleukaemias.NatureReviewsCancer,2004,32.Liang-InL,Chien-YuanC,Dong-TsamnL,etal.CharacterizationofCEBPAmutationsinacutemyeloidleukemia:mostpatientswithCEBPAmutationshavebiallelicmutationsandshowadistinctimmunophenotypeoftheleukemiccells.ClinicalCancerResearch,2005,11(4):1372-1379.33.WoutersBJ,BobL,PuttenWLJV,etal.DoubleCEBPAmutations,butnotsingleCEBPAmutations,defineasubgroupofacutemyeloidleukemiawithadistinctivegeneexpressionprofilethatisuniquelyassociatedwithafavorableoutcome.Blood,2009,113(13):3088-3091.34.HoPA,RongZ,AlonzoTA,etal.PrevalenceandprognosticimplicationsofWT1mutationsinpediatricacutemyeloidleukemia(AML):areportfromtheChildren'sOncologyGroup.Blood,2009,113(26):6558-6566.35.ErnestBeutler,MarshallA.Lichtman,BarryS.Collar,etal.WilliamsHematology.[J].1407-1409.32 急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究参考文献36.PsailaB,BusselJB,FrelingerAL,etal.Differencesinplateletfunctioninpatientswithacutemyeloidleukemiaandmyelodysplasiacomparedtoequallythrombocytopenicpatientswithimmunethrombocytopenia.JournalofThrombosisandHaemostasis,2001,9,2302–2310.37.FossB,BruserudO.Plateletfunctionsandclinicaleffectsinacutemyelogenousleukemia.[J].Thrombosis&Haemostasis,2008,99(1):27-37.38.FossB,UlvestadE,Bruserud.Platelet-derivedgrowthfactor(PDGF)inhumanacutemyelogenousleukemia:PDGFreceptorexpression,endogenousPDGFreleaseandresponsivenesstoexogenousPDGFisoformsbyinvitroculturedacutemyelogenousleukemiablasts.EuropeanJournalofHaematology,2001,67(4):267-78.39.JingZ,ShiHL,YongJL,etal.Plateletfactor4enhancestheadhesionofnormalandleukemichematopoieticstem/progenitorcellstoendothelialcells.LeukemiaResearch,2004,28(6):631–638.40.KimuraS,RobertsAW,MetcalfD,etal.Hematopoieticstemcelldeficienciesinmicelackingc-Mpl,thereceptorforthrombopoietin.ProcNatlAcadSciUSA,1998,95:1195–1200.41.KiritoK,FoxN,KaushanskyK.ThrombopoietinstimulatesHoxb4expression:AnexplanationforthefavorableeffectsofTPOonhematopoieticstemcells.2003.Blood102:3172–3178.42.VigonI,MornonJP,CocaultL,etal.MolecularcloningandcharacterizationofMPL,thehumanhomologofthev-mploncogene:Identificationofamemberofthehematopoieticgrowthfactorreceptorsuperfamily.ProcNatlAcadSci,1992,USA89:5640–5644.43.BersenevA，WuC，BalcerekJ，etal．Lnkcontrolsmousehematopoieticstemcellself-renewalandquiescencethroughdirectinteractionswithJAK2．JClinInvest，2008;118(8):2832－284444.BouscaryD,PrudhommeC,QuesnelB,etal.C-mplexpressioninhematologicdisorders.LeukLymphoma.1995;17:19-26.45.WetzlerM,BaerMR,BernsteinSH,etal.Expressionofc-mplmRNA,thereceptorforthrombopoietin,inacutemyeloidleukemiablastsidentifiesagroupofpatientswithpoorresponsetointensivechemotherapy.JClinOncol.1997;15:2262-226846.FrancisC,ChristopheH,StéphanieD,etal.Circulatingthrombopoietinasaninvivo33 参考文献急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究growthfactorforblastcellsinacutemyeloidleukemia.Blood,2006,107(6):2525-2530.47.MatsumuraI,KanakuraY,KatoT,etal.Growthresponseofacutemyeloblasticleukemiacellstorecombinanthumanthrombopoietin.Blood.1995;86:703-709.48.StoneRL,NickAM,McneishIA,etal.Paraneoplasticthrombocytosisinovariancancer.NewEnglandJournalofMedicine,2012,366(366):610-8.49.LuC,MyrtoK,MartensJHA,etal.Transcriptionaldiversityduringlineagecommitmentofhumanbloodprogenitors.Science,2014,345(6204):1543-9.50.HitzlerJK,JosephC,YueL,etal.GATA1mutationsintransientleukemiaandacutemegakaryoblasticleukemiaofDownsyndrome.Science,2003,101(11):4301-4.51.ShimamotoT,OhyashikiK,OhyashikiJH,etal.Theexpressionpatternoferythrocyte/megakaryocyte-relatedtranscriptionfactorsGATA-1andthestemcellleukemiagenecorrelateswithhematopoieticdifferentiationandisassociatedwithoutcomeofacutemyeloidleukemia.Blood,1995,86(8):3173-3180.52.AyalaRM,JoaquínML,EnriquetaA,etal.ClinicalsignificanceofGata-1,Gata-2,EKLF,andc-MPLexpressioninacutemyeloidleukemia.AmericanJournalofHematology,2009,84(2):79–86.34 急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究英文缩略词表英文缩写英文全称中文全称AMLAcutemyeloidleukemia急性髓细胞白血病TPOThrombopoietin血小板生成素NPM1Nucleophosmin1核磷酸蛋白1FLT3Fms-liketyrosinekinaseIII型受体酪氨酸激酶CRCompleteremission完全缓解PRPartialremission部分缓解NRNon-remission不缓解HSCTHematopoieticstemcelltransplantation造血干细胞移植CDClusterofdifferentiation分化簇OSOverallsurvival总体生存率CN-AMLCytogenetically-Normalacutemyeloid正常核型急性髓系白血病leukemiaIL-11Interlukin-11白介素11IL-6Interlukin-6白介素6qRT-PCRRealtimeQuantitativeReverse反转录聚合酶链反应TranscriptionpolymeraseChainReactionELISAenzymelinkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附测定PLTPlatelet血小板MPPMultipotentprogenitorcell多能造血祖细胞MDSMyelodysplasticsyndrome骨髓增生异常综合征FCMFlowCytometry流式细胞术APLAcutepromyelocyticleukemia急性早幼粒细胞白血病DNMTsDNAmethyltransferaseDNA甲基化转移酶35 攻读学位期间发表的文章急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究攻读学位期间发表的文章1.韩伟，韩悦，陈佳等。异基因造血干细胞移植相关血栓微血管病16例并文献复习。中华血液学杂志。已接受。2.HanWei,HuLuping,ZhuLi,etal.Researchofearlyhemostaticcomplicationsin560patientsfollowingallogeneichematopoieticstemcelltransplantation.ExperimentalandClinicalMedicine.2016,Accepted.3．韩伟，韩悦，王虹等。急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究。江苏省血液学会议摘要。36 急性髓系白血病血小板计数与基因突变的关系研究致谢致谢光阴如梭，三年充实而又美好的硕士研究生生活转眼间已进入尾声，虽然在苏州大学附属第一医院学习的时间并不长，但这里的每一个人、每一处风景都给我留下深刻的印象。我有太多的感恩，曾经有多少敬爱的老师、同学、朋友给了我无私的帮助，仍历历在目，在这里请接受我诚挚谢意！首先，衷心感谢我的导师韩悦教授，韩老师严实求谨的治学态度，刻苦钻研的实干精神，高尚的医德，精湛的医术值得我终生学习。三年的教诲此刻犹如一幅幅画面浮现在我眼前，三年的培养让我受益终生。除了在科研上的殷殷教诲和做人处事的点拨之外，韩老师在生活上也给予我无限关怀。您永远是我学习的榜样。感谢血研所所长阮长耿院士，您不辞辛苦，忘我工作，为我们创造了优越的科研氛围和实验条件，感谢血研所王兆钺、戴克胜、白霞、朱明清、沈文红、戴兰、岑建农、沈宏杰、张威、马珍妮、沈飞、曹丽娟等各位老师在实验研究过程中给予的无私帮助及指导。感谢血液科主任吴德沛教授、仇惠英主任、张日主任、唐晓文主任、陈苏宁主任、王荧、吴小津、薛胜利、陈峰、马骁、胡晓慧、周海侠、陈佳、徐杨、王虹、施晓兰、周莉莉等老师在临床学习期间给予的帮助和教诲。感谢我的同学黄曼、刘磊、郑佳佳、王攀峰、刘彬、徐良静、孙研珺、白莎莎、胡星星、曹晶、季诗梦、崔巍、胡芳等给予的关心和帮助，三年间我们一起学习和生活，建立了深刻的感情，愿我们的友谊长青。感谢唐雅琼、王杰等师姐和戚佳乾、赵莹、楚甜甜、晋梦莹等师弟师妹给予支持和帮助。感谢我的父母和家人，你们的养育之恩和对我学习的支持是我不断进步最大的鼓励。祝愿您们永远健康快乐！再次衷心感谢所有帮助、关心及支持我的老师、同学、朋友及家人等。2016年3月于苏州37 巧輩化－戟謠辭Ｖ’：，．—表；户。為？议客、等■苏州方！蠢締—牽，’硕±学论貧护黛祈某祭叫＇汽—霄１．ｉ門＾学和做：＾；：护－一一ｒ一：：＾；＾．＾ｉ一ｎ－＞言：＇，：起ｖ讀＇點一＾一拭．：：醫品．：／誦琶＇觀ｙ．．．营昔￡．；＇；ｒ馬立．７：；：Ｉ．：：：ｌ；：ｆＶ苗德—＇：，／：ｉ’ｙ旁－ｓ妥－＞？．＾＇ｍ－／Ｖ；？ｉ＇ｌｉ＇妾；挤；祭Ｉ；野議＇＇－芭．转．＇面ＪＶ＇：表：整ｒ。＇替Ｖｉ議＂：；．７好京鹽茜ｌ＇．ｉ驾＇审孔ｌｉｉ瓦片一巧享。；ＶＪｉ？心仆ｉ皆接王ｉ黃專ｉ窜麵－＂——Ｉ－．—．ｊ’ｉ－．＿’ｎ６Ｖ■心Ｉｉｒ＇一；；