《疾病标志物化学发光小动物成像研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
分类号０６５７．３密级公开学号１５１８０２■＂■国■ａｇＭｉａｇａ硕士学位论文（学术型）学发光小动物成像研究题目疾病标志物化作者崔红波指导教师吕家根教授—级学科名称化学—级学科名称分析化学提交日期二〇一八年五月 学位论文原创性声明本人声明所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行研究工作所取得的研究成果。尽我所知，除文中已经注明引用的内容和致谢的地方外，本论文不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人或他人已申请学位或其他用途使用过的成果？对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表雜意。本学位论文若有不实或者侵犯他人权利的一，本人愿意承担切相关的法律责任《作者签名：日期：年上月Ｖ日学位论文知识产权及使用授权声明书本人在导师指导下所完成的学位论文及相关成果，知识产权归属陕西师范大学。本人完全了解陕西师范大学有关保存、使用学位论文的规定，允许本论文被査阅和借阅，学校有权保留学位论文并向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版，有权将本论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以釆用任何复制手段保存和汇编本论文？本人保证毕业离校后，发表本论文或觥本论文成果时署名单位仍为陕西师范大学？保密论文解密后适用本声明。作者签名：典合此日期：年Ｓ月上日＾ 摘要化学发光成像由于暗场测量的优势，使其公认为灵敏度最高的非侵入式成像一技术之，在基础医学、临床医学和药物研发等研究领域中显现出极高的学术研宄价值和应用前景。当前以活体动物为对象的化学发光成像研究，全部集中在对、体内活性氧的直接检测和与活性氧代谢调节相关的大分子检测，而直接针对蛋白核酸等大分子一方面是医学和药学研，尤其是疾病标志物的检测尚无相关报道。一究亟需高灵敏的活体研宄方法；另方面是化学发光成像受检测对象所限，无法满足以上需求。超越活性氧，实现对活体中蛋白标志物的靶向性成像检测，意义重大，也极具挑战性。本实验室在前期的化学发光成像研宄工作中，研究制备了高效率的化学发光－探针５６二甲酰。小动物实验表明，该探针能够对体内辣根过氧化物酶，肼荧光素ＨＲＰ富集区域实现成像定位和检测一（）。据此，我们设计了种成像检测蛋白标志物的新思路，即利用目标蛋白抗体实现对蛋白的靶向识别，通过成像检测抗体标记的ＨＲＰ，进而实现对蛋白标志物的定位和水平检测。如能实现以上思路，有望为一活体病理、药理以及疾病诊断提供种全新的视角和创新技术平台。根据上述研究思路，本论文首先从蛋白标志物入手，实现对肿瘤标志物血管ＡＦＰ－ａＴＮＦ－ａ内皮生长因子（ＶＥＧＦ），甲胎蛋白（），肿瘤坏死因子（）的活体成像检测；随后，以肿瘤标志物血管内皮生长因子受体２（ＶＥＧＦＲ２）为靶标，实现了对小鼠移植瘤的靶向成像、药效研究中的应用潜质，以炎症；为探究化学发光成像在药理为模板，初步实现了地塞米松剂量、给药频率与药效的活体水平表征。以上结果支持了我们的研究思路。，创新和拓展了化学发光成像的应用对象和技术方法本文具体研究内容简述如下：。第１章，绪论本章节对无光源光学成像技术生物发光成像及化学发光成像基本原理，成像探针的种类及应用，近十年生物发光化学发光在成像领域的应用。及研宄前沿，以及两种成像各自的特点进行了归纳总结评价。－ａ第２章，兴趣蛋白的活体成像研究选取兴趣蛋白ＶＥＧＦ、ＡＦＰ、ＴＮＦ为靶ＨＲＰ标记－，６二甲酰标，以抗体为识别探针５，对，肼荧光素为化学发光成像探针裸鼠体内的靶标蛋白成像－ＨＰＲ。在裸鼠皮下注射靶标蛋白，用靶标蛋白对应的抗体。复合物实现靶向识别，实现了活体检测兴趣蛋白的目的第３章，基于肿瘤蛋白标志物成像的肿瘤靶向。在裸鼠体内实现对兴趣蛋白的灵敏活体检测，极大地鼓舞了我们对蛋白标志物检测的研究热情。本章节中，Ｉ 将对肿瘤蛋白标志物的检测，应用到具体疾病模型中。选取肿瘤细胞膜蛋白标志物ＶＥＧＦＲ２作为靶标－ＨＲＰ，以抗ＶＥＧＦＲ２复合物为识别和报告探针，成功靶向了－人源结肠癌细胞系ＨＣＴ１１６在裸鼠皮下的移植瘤。第４章，以急性炎症为模型的小动物药效评价。炎症与癌症，心血管疾病，阿兹海默症等重大疾病相关联，影响着人们的身体健康。前期工作中，我们已经实现了对炎症的高效灵敏检测一，化学发光成像对炎症表征来说是个有力工具。为了开发化学发光成像在抗炎药物药效、药理及新药开发方面的潜力，本章节以地塞米松为抗炎药物，以小鼠急性关节炎为疾病模型，对地塞米松给药剂量、给药频率与药效进行活体表征，对比给药前后化学发光信号的变化，实现了通过化学发光成像对抗炎药物药效的活体评价。第５章，对本文的主要工作做了总结，并对今后的工作进行了展望。关键词：小动物化学发光成像，蛋白标志物，肿瘤诊断药物评价，，ｎ ＡｂｓｔｒａｃｔＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｉｍａｇｉｎｇｈａｓｂｅｅｎｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄａｓｏｎｅｏｆｔｈｅｍｏｓｔｓｅｎｓｉｔｉｖｅ－ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅｉｍａｇｉｎｇｔｅｃｈｎｉｑｕｅｄｕｅｔｏｔｉｉｅａｄｖ＾ｉｔａｇｅｏｆｄａｒｋｆｉｅｌｄｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ．Ｉｔｈａｓｇｒｅａｔａｌｉｃａｔｉｏｎｐｏｔｅｎｔｉａｌｉｎｂａｓｉｃａｌｍｅｄｉｃｉｎｅｃｌｉｎｉｃａｌｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄｄｒｕｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔ．ｐｐ，，ｇｐＮｏｗｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｉｍａｉｎｏｆｌｉｖｉｎａｎｉｍａｌｓｆｏｃｕｓｅｓｏｎｔｈｅｄｉｒｅｃｔｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ，ｇｇｇｏｆｔｈｅｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓＲＯＳ）ｏｒｔｈｅｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｒｅｕｌａｔｉｏｎｏｆ（ｇｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｅｎｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｈｏｗｅｖｅｒｔｈｅｒｅｉｓｎｏｒｅｏｒｔｏｎｔｈｅｄｉｒｅｃｔｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｙｇ，ｐｒｏｔｅｉｎｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄａｎｄｏｔｈｅｒｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓｅｓｅｃｉａｌｌｔｈｅｂｉｏｍａｒｋｅｒｓｏｆｍｕｌｔｉｌｅｐ，，ｐｙｐｓｅｒｉｏｕｓｄｉｓｅａｓｅｓｖｉａｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｉｍａｇｉｎｇ．Ｏｎｔｈｅｏｎｅｈａｎｄｍｅｄｉｃａｌａｎｄ，－ｉｔ；ｊｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｒｅｓｅａｒｃｈｎｅｅｄｓｈｉｈｌｙｓｅｎｓｉｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄｓｏｎｔｈｅｏｔｈｅｒｈａｎｄｐｇ；，ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｉｍａｇｉｎｇｉｓｉｍｐｅｄｅｄｂｙｔｈｅｌｉｍｉｔｅｄｏｂｊｅｃｔ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｉｔｉｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｔｏｄｅｔｅｃｔｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒｓｂｅｓｉｄｅｓＲＯＳｉｎｖｉｖｏｂｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｉｍａｉｎ．ｐｙｇｇｈｔ－Ａｈｉｌｅｆｉｃｉｅｎｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒｏｂｅ５ｄｉｆｏｒｍｌｈｄｒａ２：ｍｅｆｌｕｏｒｅｃｅｉｎｗａｓｇｙｐ，ｙｙ９ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｅｄｉｎｏｕｒｒｅｖｉｏｕｓｗｏｒｋ．ＳｍａｌｌａｎｉｍａｌｅｘｅｒｉｍｅｎｔｓｓｈｏｗｔｈａｔｔｈｅｒｏｂｅｃａｎｐｐｐｌｏｃａｔｅａｎｄｄｅｔｅｃｔｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅＨＲＰｅｎｒｉｃｈｅｄｒｅｉｏｎｉｎｖｉｖｏ．Ｈｅｒｅｂｙｔａｋｉｎｇ（）ｇ，ａｄｖａｎｔａｇｅｏｆｔａｒｇｅｔｒｅｃｏｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｌａｂｅｌｅｄｗｉｔｈＨＲＰａｎｄｐｒｏｔｅｉｎ，ｔｈｅＨＲＰｗｏｕｌｄｂｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｉｍａｇｉｎｇ，ｗｈｉｃｈｍｅａｎｓｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒｓｃｏｕｌｄｂｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．Ｗｅｅｎｖｉｓａｅｔｈａｔｔｈｅｒｏｏｓｅｄｍｅｔｈｏｄｗｉｌｌｏｆｆｅｒａｎｅｗｇｐｐｐｅｒｓｅｃｔｉｖｅａｎｄｉｎｎｏｖａｔｉｖｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｐｌａｔｆｏｒｍｆｏｒｐａｔｈｏｌｏｇｙｈａｒｍａｃｏｌｏａｎｄｐ，ｐｇｙ，ｄｉｓｅａｓｅｄｉａｇｎｏｓｉｓｉｎｖｉｖｏ．Ｔｈｉｓａｅｒｒｅａｌｉｚｅｓｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒｓｓｕｃｈａｓｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｐｐｐ，－－ｒｏｗ－ｇｔｈｆａｃｔｏｒＶＥＧＦａｌｐｈａｆｅｔｏｒｏｔｅｉｎＡＦＰｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒａＴＮＦａｉｎ（），ｐ（），（）ｖｉｖｏａｎｄｔｈｅｎｄｅｔｅｃｔｓｔｈｅｔｕｍｏｒｍａｒｋｅｒｓｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｔｏｒ２，ｇｐ（ＶＥＧＦＲ２）ｉｎｖｉｖｏ．ＵｓｉｎｇＶＥＧＦＲ２ａｓｔｈｅｔａｒｇｅｔ，ｔｈｅｔａｒｇｅｔｉｍａｇｉｎｇｏｆｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄｔｕｍｏｒｉｎｍｉｃｅｗａｓｒｅａｌｉｚｅｄ．Ｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｉｍａｇｉｎｇｉｎｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙａｎｄｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ，ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｗａｓｕｓｅｄａｓａｔｅｍｐｌａｔｅｍｏｄｅｌ．Ｔｈｅｆｒｅｑｕｅｎｃｙｏｆａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｅｆｉｃａｃｙｏｆｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅｗｅｒｅｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｙｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄｉｎｖｉｖｏ．Ｔｈｅａｂｏｖｅｒｅｓｕｌｔｓｖａｒｉｆｙｔｈｅｏｒｉｇｉｎａｌｉｔｙｏｆｏｕｒｉｄｅａｓａｎｄｅｘａｎｄｐｔｈｅｌｉｃａｔｉｏｎａｎｄｔｅｃｈｎｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｓｏｆｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｉｍａｉｎ．ａｐｐｇｇＴｈｅｔｈｅｓｉｓｃｏｖｅｒｓｔｈｅｆｏｌｌｏｗｉｎｇａｓｐｅｃｔｓ：ｉｎ 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Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅＩｍａｇｉｎｇ，Ｓｍａｌｌａｎｉｍａｌｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒｓ，Ｉ＾ｉｍｏｒｄｉａｏｓｉｓＤｒｕｅｖａｌｕａｔｉｏｎｇｎ，ｇｖ 目录ｍ要ｉＡｂｓｔｒａｃｔ．ｉｎ第１章绪论ｉ１．１生物发光成像１１．１．１生物发光成像概述１１丄１．１萤火虫荧光素酶１１丄１．２海肾焚光素酶２１．１．１．３分泌型膜锚定荧光素酶３１．１．１．４细菌荧光素酶．．３１丄２生物发光成像应用４１．１．２．１细菌感染的检测４１．１．２．２肿瘤的生长和转移的监测５１．１．２．３转录基因表达的监控６１．１．２．４基因治疗６１．２化学发光成像７１．２．１化学发光成像概述７１．．２１．１鲁米诺及其衍生物７１．２．１．２光泽精及吖啶类衍生物８１．２．１．３过氧化草酸酯类化合物９１．２．１．４其他化学发光体系９１．２．２化学发光成像应用１０１１０．２．２．１炎症的检测１．２．２．２光动力治疗的监测１２１．３本文的研究内容和创新性１４１．３．１研究ｒｔ容１４１．３．２本文的创新点１５第２章兴趣蛋白的活体成像研究１７ ２．１弓１７｜言２．２实验部分１７２．２．１试剂与仪器１７２１．２．２实验步骤９２．２．２．１细胞毒性实验１９２．２．２．２兴趣蛋白的活体成像检测２０２．３结果与讨论２１．１２３．细胞毒性实验２１２．３．２兴趣蛋白的活体成像检测２２（１）ＶＥＧＦ的靶向成像２２⑵ＡＦＰ的靶向成像２３３ＴＮＦ－ａ的（）靶向成像２４２．３．３４＾２６第３章基于肿瘤蛋白标志物成像的肿瘤朝向２７３．１引言２７３．２实验部分２７３．２．１试剂与仪器２７３．２．２实验步骤２８３．３结果与讨论２９３．３．１实验结果２９３．３．２小结３３第４章以急性炎症为模型的小动物药效评价３５４．１引言３５４．２实验部分３５４．２．１试剂与仪器３５４．２．２实验步骤３６４．３结果与讨论３７ ４３３７．．１实验结果４．３２小４６－结第５章总结４７参考文献４９ 第１章绪论第１章绪论１．１生物发光成像１１１．．生物发光成像概述体内以分子报告形式表达的酶（荧光素酶等），调节分子底物氧化，产生可见一光，对这发光过程敏感检测得到的图像即为生物发光成像。在过去的数十年中，生物发光己经发展成为小型实验动物分子成像的有力工具，促进了生命过程的研究。这种无创的光学成像形式，促进了在分子水平上，对体内疾病发展过程的实时分析。生物发光成像技术己经被研宄人员应用于监控转基因表达，感染过程，。肿瘤的生长和转移，移植，毒理学，病理学和基因治疗等方面生物发光成像操作简单便于在整个疾病过程中进行监测，可在不处死实验动一。物的情况下对生物过程进行定位和量化在同实验动物上对不同指标多次测量，。可尽量减小个体差异的影响，也减少了对实验动物的需求。自然界中己经发现了多种不同的生物发光体系，每个都需要特定的酶和底物研究中常用的生物发光报告基团包括，北美萤火虫中的荧光素酶，还有从高粱，水母，海肾，珊瑚，叩头虫和几种细菌中克隆出的荧光素酶。接下来介绍几种较为常用的荧光素酶。Ｕ．１．１萤火虫荧光素酶从北美萤火虫中克隆出的萤火虫荧光素基因，是最广泛的也是最有特点的生物发光报告基因利用萤火虫荧光素酶－荧光素系统的生物发光－成像，很快成为体内细胞追踪的标准方法。萤火虫荧光素酶的底物Ｄ荧光素，是一２＋－。种小分子，可在细胞膜上自由扩散莖火虫荧光素酶在Ｄ荧光素，ＡＴＰ，Ｍｇ和氧气的存在下发光－；莖火虫荧光素酶和Ｄ荧光素的反应是辉光型的，发光持续时间长。经哺乳动物细胞密码子优化后的改良萤火虫荧光素酶，具有更高的光子输出效率。为了使荧光素酶有更好的组织穿透能力，己经普遍用于体内细胞追踪，Ｍ发展了具有红移光谱的萤火虫荧光素酶。莖火虫荧光素发射光在黄绿光波段，碱Ｗ一－。性介质中峰值为５６２ｎｍ（范围：５５０５７０ｒａｎ）萤火虫荧光素酶是个ｐＨ敏感１ 陕西师范大学硕士学位论文－至６２０的酶，在酸性条件下（ｐＨ５６），峰值红移（最大移ｎｍ），在高温及重金４［］属离子作用下也会红移。此外，莖火虫荧光素酶对不同凋亡细胞氧化应激的敏感性不同。Ｃｚｕｐｒｙｎａ等Ｗ提出萤火虫焚光素酶的活性减弱有可能与活性氧相关，当６Ｈ水平与活性氧水平持平时萤火虫荧［］。Ｋｉｔａａｍａｐ光素酶的活性有大幅度改变ｙ等，报道了萤火虫荧光素酶的热不稳定性，以及ｐＨ敏感的光谱特性，因此，可以作为敏感的多色发光标记或生物发光共振能量转移供体使用。此外，为了减弱光吸收和组织散射的影响，分离出了红光荧光素酶变体，已经有应用于体内研宄的报道。ｒ＾ｓＪ＋ＡＭＰ＋ｐｐｉ＋ｃｏｓ＊ＵａｈｔＤ－ＬｕｄＭｎｘＫＯ＾ｒ＾ｉｎＲｅｎＪｔｅＴ叫Ｌｕｃｔｆｅｒａｓｅ＊００１１ｉ＾ｊｆＹ，Ｃｏｅｉｄｒ＾ｅｒｓｚｌｒｉｄ＾ｏｌｕｍｌｒｍｃａｎｔｒｅａｃｔｌｃｍｓｃａＭｙｒｎｉｂｙＲｍ＾ｍｎｉＧａｕａｓｋｆｍ＾ｒａｓｅ图－ｉｉ荧光素酶的反应过程１．１丄２海肾荧光素酶从海洋生物（海肾）中纯化出的海肾荧光素酶，通过催化腔７一］ｃｏｅ［－肠荧光素（ｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ）氧化，发出蓝绿色的光。海肾荧光素酶是个３６ｋＤａ的单体酶，在氧气存在下，可以催化非ＡＴＰ依赖的氧化反应，产生波长为４８２ｎｍ的Ｐ］发光。由于海肾荧光素酶闪光的动力学特性，海肾荧光素酶与腔肠荧光素的相互８［］。Ｂｈａｕｍｉｋ－作用产生光子的持续时间较短等，使用海肾荧光素酶腔肠荧光素进行生物发光成像，对小鼠体内细胞进行追踪，同时也验证了，海肾荧光素酶和萤一一火虫荧光素酶，能够在同动物中双重成像。这策略已被用于各种需要追踪两个分子的研宄中，也包括通过使用两个不同的报告基因对两个细胞群体进行细胞一些局限性追踪。然而，海肾荧光素酶与其底物也有，包括不稳定，底物渗透性２ 第１章绪论９［］差，以及自氧化产生高背景信号等。海肾荧光素酶的底物类似物数量在不断增加，Ｍ在活体应用中，新的类似物可增加荧光素酶的信号强度。海肾荧光素酶底物类－ｆ－ｈ－ｅ似物腔肠荧光素，，异构体与海肾荧光素酶的反应活性比天然腔肠荧光素高，４－８倍。海肾荧光素酶发射的光是蓝光，很容易被组织吸收和散射。因此，在成像，空间分辨率低等缺陷，中有灵敏度差。为了解决这些缺陷海肾荧光素酶红移变体，即ＲＬｕｃ８被设计和合成出来，其最大发射波长为６６０ｎｍ（波长峰值为５４７ｎｍ），１｜｜２１３［］［］［］与天然海肾荧光素酶相比，它稳定性更好，光穿透率更高。１１．１３．．分泌型膜锚定荧光素酶一）分泌型膜锚定焚光素酶（Ｇａｕｓｓｉａｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ是个分子量小亮度高的发光蛋白，化学反应活性高于海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶。分泌型膜锚定荧光素酶、海肾荧光素酶，均以腔肠荧光素为底物，但分泌型膜锚定荧光素酶，不依赖ＡＴＰ１４［］就能产生光信号，且因其具有细胞外泌物的性质，故血液浓度与在特定生物系１５［］统中的表达水平相关。分泌型膜锚定荧光素酶的缺陷是，光信号会被邻近的色素分子猝灭，例如血红素分子，以及体内闪光型生物发光反应。为了克服猝灭这一缺陷，研宄人员应用能够从血液中捕获分泌型膜锚定荧光素酶的抗体，开发了一１６［］种微滴度结合测定法，使用该方法可使灵敏度提高近１０倍。为了克服光衰减一１７［］快这缺点，ＭａｕｒｅｃＭ４３Ｉｇｉ等对分泌型膜锚定荧光素酶突变体（ＧＬｕ）进行了－分离和鉴定，该突变体可在ＴｒｉｔｏｎＸ１００洗涤剂存在下，增强光稳定性，适合高通量应用，使得无需溶解细胞或生物体，就能。分泌型膜锚定荧光素酶的分泌性质，同时对无创检测和生命过程的量化也有很大的意义，够检测酶活性。然而分泌型膜锚定荧光素酶的分泌特性，严重减弱了表达该荧光素酶的细胞在体内的２２一［１］２］［生物发光信号。Ｅｌｍｅｒ等报道，可以通过增加个ＣＤ８跨膜区，来改良分泌型膜锚定焚光素酶，从而克服这种缺陷，同时会在表达分泌型膜锚定荧光素酶的一泌型膜锚定荧光素人和小鼠原代Ｔ细胞上，产生个膜锚定结构，与存在天然分酶的Ｔ细胞相比，改良后能够产生更明显的体内生物发光信号。１１丄．４细菌荧光素酶细菌荧光素酶（Ｂａｃｔｅｒｉａｌｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）在功能上有别于以上三种荧光素酶。细菌荧光素酶是从发光杆菌中分离出来的，它的发光反应涉及长链醛的氧化和黄素单［２３］［２４］经被用于细菌感染的生物核苷酸的还原，在４９０ｎｍ处产生蓝绿色的发光，己２５一［］发光成像研宄。细菌荧光素酶是个特别的生物报告系统，它可以自己产生底物，无需外源添加Ｃｏｎｔａｇ等首先探讨了生物发光活体成像研究微生物病源学３ 陕西师范大学硕士学位论文２７［］的可行性。这些研宄者通过携带细菌荧光素酶操纵子的质粒，稳定转染了三种鼠伤寒沙门氏杆菌。报道表明，其，转染后的细菌病理学行为不受细菌荧光素酶标记的影响，且发光信号足以进行有效的活体检测。细菌荧光素酶的发光能力弱于萤火虫荧光素酶，在组织中短波长越短，这会影响成像数，信号强度减弱越多一据的量化。Ｆｒａｎｃｉｓ等，通过克隆革兰氏阳性菌核糖体锚定位点，构建了种新的发光杆菌细菌荧光素酶操纵子，使用该操纵子标记的发光细菌，可以实现无创成２一［种定量的非侵入性的技术像＼Ｍｉｎ等发明了，来检测生物发光细菌在体内，．的迁移。研宄表明，表达荧光素酶的五ｃＷ细菌的成像过程，能够给小鼠异种移植２９３］［［￣瘤或转移瘤模型中标记细菌的定量显示提供方法。１．１．２生物发光成像应用１．２．１．１细菌感染的检测在细菌感染的研宂中，生物发光成像的主要优点是，随着时间的推移，活体３１［］动物全身的感染过程可以重复多次进行可视化监测。将荧光素酶基因转染至细菌中，并用其对小鼠细菌感染成像。通过荧光素酶基因转染得到的带有荧光素酶基因的细菌，其原有的生理学特性和侵袭能力还能够保持不变，并且可以在不需要外源加入底物的条件下长时间发光，。当实验研究中需要增强发光强度时可以通过注入长链脂肪醛的方式来增加发光强度带有荧光素酶标记的细菌，可以对细菌感染的治疗效果进行实时评估，这是一３３一个方面［］目前生物发光成像技术应用最广泛的。Ｇｕｏ等将种稳定产生生物发—ＭＲＳＡ光的社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（ＣＡ的菌株，即ＵＳＡ３００，接）口上，种到小鼠皮肤全层切，以不同途径给药通过生物发光成像技术，定量比较创面上金黄色葡萄球菌菌落的发光强度以及创面面积，以此来评估不同给药途径的抗生素，对皮肤感染细菌的治疗效果。Ｊａｗｈａｒａ等用发光大肠杆菌感染小鼠的皮肤组织，，实时监测激光强度的不同对小鼠皮肤感染大肠杆菌的治疗效果的影响。跟踪带有荧光素酶标记的细菌，监测宿主动物体内细菌侵袭的变化过程。＿３５］Ｔｏ［ｒｒｅｓ等，将转染了生物发光报告结构的发光大肠杆菌ｃｏ／ｚＯ１０４：Ｈ４，接种至小鼠肠道，观察肠道中大肠杆菌动态分布的变化，并分析其致病过程。Ｊｅｓｓｉｃａ一Ｃａｍｐｂｅｌｌ等在２０１４年构建了个表达焚光素酶的衣原体（Ｃ．菌株，（并且发现在细胞培养液中，荧光素酶活性即生物发光强度）与衣原体的复制相４ 第１章绪论关，。将表达荧光素酶的衣原体菌株接种入小鼠阴道就可以通过生物发光信号监一３测同小鼠体内的感染过程［叱经过不同的途径侵入宿主的细菌，通过各种途径播散至全身，并在非原发位一点繁殖，个复杂的系统形成新的感染灶。由于机体是，无法凭借实验和经验确３７Ｈ［］定所有病灶，因此需要通过成像的方法实时监控ａｒｄ，发现新的感染灶。ｙ等用表达荧光素酶基因的李斯特菌感染小鼠，跟踪观察该细菌的感染途径和散播过程，发现了新的感染灶和定植途径，且。小鼠胆囊中发现了定植发现该细菌能在管腔细胞外复制和繁殖，从而影响整个泌尿系统。１．２．２１．肿瘤的生长和转移的监测近年来，将荧光素酶标记的肿瘤细胞，以不同方式接种到免疫缺陷小鼠体内，，可以通过生物发光成像技术建立起了多种自发性或实验性肿瘤转移模型，对动物体内不同部位的肿瘤发展转移情况进行无创的长期，、实时检测。例如在肺定植模型中５－Ｃ－，静脉注射Ａ４９１ＵＣ８人肺癌细胞生物发光成像技术监测在体内的，用肺转移情况。每周对麻醉小鼠进行成像，以便对体内肺癌生长情况进行评估。在－对结肠癌转移模型的研宄中Ｔ－２９ｈｉｃ－Ｄ６，将表达荧光素酶的人体结肠癌细胞Ｈ接ＳＣＩＤ－ｂｅ种到ｉｇｅ小鼠皮下，建立起结肠癌自发性转移模型，且能够通过生物发光成像技术检测到肺及淋巴结等部位的转移此外，也有将表达荧光素酶的小鼠结肠癌细胞Ｃ２６注入ＢＡＬＢ／ｃ小鼠左肝或脾内，建立结肠癌肝转移模型，利用生物发光成像技术，监测肝脏内转移瘤的生长状况，并将生物发光结果与准病理分析（被肿瘤组织取代的肝组织区域和肝重测量等）相比较，证实生物发光成像是一种检测实验性结肠癌在肝内生长情况的可靠方法［４１］－此外ｉｎ１，Ｎｏｔｔｇ等建立荧光素酶高表达的人葡萄膜黑色素瘤细胞株０ＣＭ（ＦＲＴ／Ｌｕｃ，将肿瘤细胞接种于小鼠眼前房诱导原位生长，或移植到左心室模拟血）Ｍｏ行微转移，运用生物发光成像技术每周监测肿瘤的转移和生长情况ｕｃｈｅｓｓ；等利用计算机断层扫描技术，磁共振成像技术以及生物发光成像技术检测神经母细１？］胞瘤在裸鼠体内的发展与骨转移情况，以及对治疗药物的响应ａｗａ；Ｎｏｇ等将ＨＴ１０８０纤维肉瘤细胞，Ａ５４９肺腺癌细胞，ＲＥＮＣＡ小鼠肾癌细胞等五个不同种类，的肿瘤细胞均标记荧光素酶以此来研究各肿瘤在体内的生长与转移情况的区别，Ｃａｃｅｒｅｓ等Ｍ在乳腺癌细胞ＭＣＦ－７中分别表达了萤火虫荧光素酶和绿色荧光蛋白（ＧＦＰ），以此来比较在动物体内外实验中两种报告分子的特点。结果显示，绿色荧光蛋白转染的肿瘤适合于对皮下和腹腔内的肿瘤进行检测，深部组织损害则不适用；而荧光素酶转染的肿瘤可作为皮下和腹腔内肿瘤以及腹腔或静脉接种引起５ 陕西师范大学硕士学位论文的深部组织损害检测的手段。１．１２．．３转录基因表达的监控为了在活体中研宄目的基因表达时间和表达触发原因，将萤光素酶基因插入目的基因的启动子下游，并将其稳定整合于相应实验动物染色体中，以此构建转基因动物模型，利用生物发光成像技术，检测目的基因在体内的表达。可以通过一这方法来研宄动物生长发育过程中，我们感兴趣的重要基因的表达时间，以及表达部位等情况，也可以观察药物诱导的特定基因的表达，以及其他生命过程所４引起的相关基因的表达或沉默［５］。Ｃｈｅｎ等在萤光素酶的表达受胰岛素基因启动子调控的转基因小鼠体内，单次注射胰腺Ｐ细胞毒素链脲佐菌素，构建糖尿病小鼠模型，。采用活体生物发光成像技术，检测胰岛素基因的表达情况实验表明高血糖肝组织中胰岛素基因表达增高，即证实了肝脏组织中部分细胞能够生成胰岛素。该研究结果也表明，在反式转录因子、转录调控序列以及目的基因三者相同的情，目的基因表达情况能够通过萤光素酶的表达水平况下、底物的发光强度来反映。１．１．２．４基因治疗基因治疗中一，常将个或多个目的基因，以特定方式安全有效地转入体内靶细胞中，，可将萤光素酶基因插入载体中以其作为报告基因，观察在被试动物体内目的基因能否够持续、高效和特异性的表达。这种方式具有非侵入性、免疫反应轻微及低毒性的优点。此外，还可以在被脂质体包裹的ＤＮＡ分子中插入萤光素４６［］酶基因，以其作为报告基因观察载体中ＤＮＡ的运输和基因治疗情况。Ｓｍｉｔｈ等研究发现，以猴疱疹病毒（ＨＳＶ）为基础的荧光素酶载体，能在多种小鼠组织中感染，且能够建立持久的潜在感染。ＨＳＶ在肝星状细胞中的感染和持续存在的能［４７］力表明，基于ＨＳＶ的载体可能具有治疗遗传性和后天性肝病的潜力。Ｃｈｏｕ等将带有萤光素酶基因标记的能够稳定表达鼠甲胎蛋白（ＡＦＰ）基因的质粒转入减毒的鼠伤寒沙门氏菌菌株中，并用不同剂量的该菌株喂养小鼠，以此来治疗小鼠肝癌。通过生物发光成像可以看到体内的鼠伤寒沙门氏菌成功表达了抗原，还可以观察到鼠伤寒沙门氏菌作为活菌疫苗在体内的清除过程，。此外该研究也表明了携带ＡＦＰ基因的减毒伤寒沙门氏菌口服ＤＮＡ疫苗可能是预防肝癌发展的一种有效策略。综上所述，生物发光成像技术，，信噪比高，应用范围广，灵敏度好己经成ｔ％为对微小病灶高特异性灵敏检测的金标准。但生物发光成像需要在成像前进行６ 第１章绪论细胞转染，操作繁琐，耗时，此外，在面对未知疾病，未知病灶时，其检测能力受到很大的限制。１．２化学发光成像１．２．１化学发光成像概述化学发光Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ是指化学反应过程中，反应产物吸收化学反应中（）产生的化学能一，由基态跃迁至激发态，又由激发态回到基态，并发射出定波长的光一时刻发光的强度及发光的积分强度来进行成像。根据化学发光的原理对某分析的手段，即称为化学发光成像分析。化学发光成像具有高灵敏度和宽的动态范围、低背景光千扰、不需要复杂的转染过程等优势。发光体系产生光辐射的能量来源不同是化学发光与其它形式的发光分析方法的本质区别。由手化学发光成像无需激发光源，从而将拉曼散射和瑞利散射对结果的影响降到最低，避免了杂散光和背景光的干扰，，降低了噪音的影响有效提高了信噪比。１．２１．１．鲁米诺及其衍生物４９－［］鲁米诺及其衍生物鲁米诺衍生物按照图１２给出的简化反应路ｇ进行反应。５Ｇ二甲基亚砜或二甲基甲酰胺［］在非质子介质中，化学发光只需要氧气Ｉ强碱。在（）质子溶剂水、水溶剂混合物或低醇）中，鲁米诺及其衍生物常被高锰酸钾、次氯酸（一盐、碘、过氧化氢、铁氰化钾等氧化剂氧化发光，同时，反应体系中也会存在些用于增强反应效果的催化剂或增敏剂，如各种小分子酶类（髓过氧化物酶、辣５－１５３５４［］］［血红蛋白［切血红素Ｃ、卤素或过硫根过氧化物酶等），细胞色素，，氯化酸阴离子，金属离子［Ｆｅ（ＩＩＩ），Ｃｏ（ＩＩ），Ｃｕ（ＩＩ）］及其配合物等，都能够对化学发光信号．产生明显增敏效果，利用该原理可以对体系中的催化剂和增敏剂进行间接定量分一析。鲁米诺及其衍生物是目前应用最为广泛的类化学发光试剂，其兼具实用性和成本低两大特点。鲁米诺及其衍生物在免疫分析、环境监控、在医药卫生等领５６＊５域中应用广泛［＼７ 陕西师范大学硕士学位论文ＮＨＯＨＡ／Ｍｔａｌｙｓｔ６Ｈ０２２＾＾ｊ＾ｏｘｉｄａｎｔ／ＯＮ＾ｒＴｔｉ￣￣ｒＹ〇！？＾ｆｔＵＵｎＵＬ．ｓｌｕｔｉＩＩｆｏｏｎＨＯＯ〇Ｌｕｍｉｎｏｌａ－ｒｏｘｅｏｘｅｈｙｄｙｐｒｙｄａｍｏｎ－ｎ２ＮＨＯＨ＊２４２－—ｈｖ（５ｎｍ）－Ｉ＾Ｘ〇＾ｏ３－ＡｍｉｎｏｐｈｔｈａＩａｔｅｅｍｉｔｔｅｒ图－２鲁米诺碱性溶液中的化学发光反应机理１近十年的文献报道了化学发光技术在预测传染病病程和研宄中性粒细胞过氧，会释放活性氧化物酶系统抗菌活性方面的应用。当多形核白细胞被激活时，可一以用鲁米诺与活性氧反应实现对活性氧的检测。过氧化氢是第个被认为与化学５９［］发光相关的分子，之后证实超氧阴离子自由基和羟基自由基也参与了发光的过？＾［］程。近年来，已有数百篇文献利用化学发光法探究中性粒细胞代谢过程，发６２＿６６［］光强度已经同急慢性疾病关联起来。已经通过化学发光的方法测定了药物对６７＾［１中性粒细胞代谢的影响。在少数情况下，中性粒细胞代谢的改变可能具有临床意义。通过化学发光的方法研宄白细胞使人们对炎症过程和活性氧相关疾病有７＿１７２【］了更深入的了解。１．２．１．２光泽精及吖啶类衍生物－－除去光泽精（ＢｉｓＮｍｅｔｈｙｌａｃｒｉｄｉｎｉｕｍｎｉｔｒａｔＬｕｃｉｅｎｉｎ和芳基亚甲基二氢叮陡类，ｇ）化合物外，所有吖啶类衍生物均有两个部分组成：吖啶杂环和离体基团Ｘ，各部。吖啶杂环在氧化后产生荧光－分在发光中均起着重要的作用：激发态的Ｎ甲基吖－，通常在介质中释放甲基吖啶酮能够发出蓝光，而甲氧基取代啶酮；未取代的Ｎ７３－［］的Ｎ甲基吖啶酮则发出绿色光。光泽精是吖啶类衍生物中应用最广的发光试剂。在碱性水溶液中，光泽精可７４－［］，生成激发态的Ｎ甲基吖啶酮，。另外以与过氧化氢反应辐射出蓝绿色的光，光泽精在溶解氧存在的环境中一，能够与系列还原剂反应产生明显的化学发光信号。基于光泽精及吖啶类衍生物高量子产率和背景信号低（不需要催化剂）的特７５－７６７７［］点【］、、，光泽精化学发光体系被成功应用于甲状腺刺激激素抗坏血酸免疫７８［７９８Ｇ８１［］］［］［］球蛋白、活性氮和活性氧、维生素Ｂ１２、多巴胺等的高灵敏检测。光泽＿８２８５一精也被用来对氧化应激后细胞超氧阴离子反应的特异性定量［】。系列吖啶酯８ 第１章绪论类化合物基于其在碱性水溶液中能够与过氧化氢反应发光的特性，也作为标记试８６】［剂应用于高效液相色谱和免疫分析联用技术中，已实现了对脱氧核糖核酸氯酚类、伯胺类、和羧酸类的定量检测。１．２．１．３过氧化草酸酯类化合物过氧化草酸酯类化合物是通过二芳基草酸酯与氧化剂过氧化氢进行亲核反应，生成二芳基双氧基中间体，如二氧杂环丁二酮等，中间体随后将能量传递给受体荧光剂常为蒽类衍生物），使其跃迁至激发态，激发态中间体不稳定，又回到（一８７［】。低能态，并辐射出定波长的光，而产生发光的其自身无法与氧化剂反应产一生化学发光，过氧化草酸酯类化合物的发光光谱与受体荧光剂荧光光谱致。通－３０％过能量转移产生化学发光的过氧化草酸酯体系，其发光量子产率高达２０％，是目前发光量子产率最高的发光体系。过氧草酸酯类化合物，其化学发光实用性一－三氯。吴强，是现阶段应用较为广泛的类化学发光试剂其典型的化合物是數［２４６，，Ｏ４－二硝基ＮＰＯ苯基］草酸酯（ＴＣＰ）和双［２苯基］草酸酯（Ｄ。易离去基团存在于，），ＤＮＰＯ和ＴＣＰＯ结构中，因此有利于亲核反应的进行。过氧化草酸酯类化合物的化学发光被用于过氧化氢酶类的活性检测，如尿酸酶，胆碱氧化酶、胆固醇氧化８８［］酶、黄嗓呤氧化酶和葡萄糖氧化酶。小分子药物，激素分子，寡核苷酸，以及部分化学药品经萃取或柱层析后，由于其符ｆ生化后（柱前或柱后荧光＃记）或天然的４荧光特性，能够作为能量受体和发射体，因此可以被过氧化草酸酯体系量化。１．２．１．４其他化学发光体系金属配合物或螯合物如钌、铼等镧系金属同样能够产生稳态化学发光，目前（）２＋研宄最多应用最广泛的是金属钌配合物。向钌联吡啶Ｒｉｘｂ３）溶液中加入胺类（（ｐｙ）（特别是脂肪族叔胺）、共辄二烯烃、有机酸以及某些有机或无机化合物，能够产生８９－６２０ｎｍ的【］波长为６１０橘红色化学发光现象，反应所产生的基态发光体还能够继９Ｇ２＋［］ｂ续参与反应，这种具有可再生性的化学发光能力也是Ｒｕ（ｐｙ３体系最大的优）点２＋。由于金属钌配合物具有稳定的光电化学性质，因此关于Ｒｕ（ｂｐｙ３的相关报道）９Ｕ９４［】多以电化学发光为主。在酸性介质中高锰酸钾能与一系列有机化合物如：酸类化合物反应生成处于（）２＋７３４ｎｍ的。利用高锰酸钾化激发态的Ｍｎ，随后向低能态跃迁辐射出波长为红光一学发光反应体系可以测定两类物质，其中类是能够与高锰酸钾直接产生化学发光反应的有机物一，该类有机物的分子结构中大多数都含有多个氨基或羟基。另。类是可以通过能量转移机理来测定的荧光物质作为化学发光的新体系，高锰酸９ 陕西师范大学硕士学位论文钾体系曾被应用于尿酸、吗啡、肾上腺素、可卡因、维生素等药物的分析和测定９５－Ｍ［。利用高锰酸钾在酸性条件下的强氧化性，对众多复杂分析物进行了定量检９９８［７］［］测，例如体液中的阿片生物碱、尿液中的神经递质代谢产物、河水中的多羟９９１ＱＱ１Ｇ１［］［］血清中的烷基硫脲嘧啶［］基苯、减肥产品中的肾上腺素胺、人、人全血中的谷胱甘肽等。铈ＩＶ体系的化学发光机理较为简单：铈ＩＶ被酚类或含巯基的化合物等还原（）（）ＩＩＩＩＩＩ，为铈（，反应释放的化学能被铈（吸收，同时跃迁至激发态不稳定的激发态））一铈（ＩＩＩ回到低能态，并辐射出定波长的光。与酸性高锰酸钾体系相比，利用铈ＩＶ）（），作为氧化剂的化学发光体系由于介质中的共存氯离子对测定不产生干扰，更适用于环境中有机污染物的定量分析在酸性介质中，铈ＩＶ通过与许多物质发（）一，生氧化还原反应，从而产生化学发光或荧光特性利用该反应体系己经建立了些化合物的测定方法ＩＩ－ＩＶ。何治柯等人发现钌联吡啶能够被铈氧化，从而产生（）（）非常微弱的化学发光现象－，并且发现巴比妥酸、ａ羟基羧酸、丙酮酸、盐酸小檗碱、１０３１０４［］［］抗坏血酸等可作为增敏剂，其信号增强的强，对该反应有着显著的增强作用度跟增敏剂的浓度成正比一，据此建立起系列测定有机酸的新方法。除此之外，－洛粉碱及其衍生物１２二氧杂环丁烷类化合物、镧系金属螯合物、焦性没食子酸、、，多羟基酚（如没食子酸、苏木色精等）等化学发光体系的应用也较为广泛。酰胼类化合物，如鲁米诺，在免疫分析和氧代谢研宄中仍然是最常用的化学发光试剂，因为它们可以用于不同类型的检测，但它们需要催化剂和增强剂，这可能会产生较高的背景信号，也具有较高的。吖啶类衍生物与蛋白质很容易偶联，，，所以灵敏度较高量子产率。此外不需要催化剂背景信号低。在荧光剂存在的情况下，过氧化草酸酯类化合物是最有效的非生物发光体，荧光剂和草酸盐是独立选择的，，。因此其效率高灵活性好。综上所述鲁米诺及酰肼类衍生物、吖啶类衍生物、过氧化草酸酯类化合物和无机金属配合物等传统化学发光试剂能够，现己被应用于临床诊断产生高效的稳态化学发光、环境监控、食品药品分析等多种领域。１．２．２化学发光成像应用１．２．２．１炎症的检测炎症是对有害刺激引起的组织损伤的生物反应。这是防御系统中最重要的过一程之，以防止局部伤害和感染，需要进；但是当它发展成为长期有害的疾病时１０ 第１章绪论行药物治疗。典型的炎症性疾病，例如风湿性关节炎、哮喘、结肠炎和肝炎是世。界上致死和残疾的主要原因慢性炎症也会导致各种疾病的产生，包括癌症、心血管疾病以及神经退行性疾病等。在炎症过程中，活性氧和其他高活性自由基在炎症的发生和发展过程中发挥１［ｑ。化学发光探针可以与部分自由基反应，产生化学发光信号着重要的作用，化１Ｑ６［］学发光成像以其独到的优势成为了炎症成像表征的重要手段。２００４年，Ｃｈｅｎ一ＬＰＳ诱导的ＤＢＪ等第次将鲁米诺用于１小鼠关节炎成像检测。十余年来，越来越多的科研工作者将目光聚焦在化学发光成像这一领域。一Ｐｋ和ＬｅｅＰＥＧ和Ｌ－０ａｒ等人将１２结合在商品化量子点表面，制备了种过氧化氢响应的纳米粒子（ＨＮＰｓ），以ＨＮＰｓ作为化学发光能量转移（ＣＲＥＴ）的能量受体－，接收Ｌ０１２过氧化氢体系化学发光反应产生的化学能，从而产生８００ｒｎｎ左右的近红外光。为了验证该探针作为活体诊断试剂的实际能力，他们％该探针分别用于活体肿瘤模型、脂多糖诱导的急性炎症模型和胶原诱导的类风湿性关节炎模型的非侵入性活体近红外成像一，成功验证了ＨＮＰｓ是种极具潜力的过氧化氢相关疾病的诊断试剂。一１（）８Ｔａｎ［］ｅｒｏｘ课题组设计合成了种新型的对超氧阴离子自由基（Ｓｕｉｄｅｒａｄｉｃａｌｇｐ，０广响应的聚合物纳米探针ＰＣＬＡ－０广，通过ＣＲＥＴ过程实现对Ｏ广的超灵敏检测，）并将该探针成功用于？？ＬＰＳ诱导的急性炎症模型和乳腺癌模型动物〇２的超低水平检测。这种新型的近红外探针能够实现深层组织成像，从而为＾床应用上〇广相关的生物和医学研究提供新的思路和方法。一１９８７年，ＰａｕｌＳｃｈａａｐ发现了种可以被酶或者其他分析物活化的新化学发光－探针－３二如图１，该探针主体部分是金刚烷氧杂环丁烷结构，通过从苯酚中去除（）保护基团来引发化学发光。＂＊Ｏ＞，．Ｍｅ．Ｐｎ？ＭｅＯ．Ｐ＇「〇１ｎ＾。卜ｗ＋ｕｉ？〇ｊ＇ＯＭｅ＋ｆｅＶ４７０ｎｍＹ＾＾Ｊ图－Ｓｃｈａａ１３ｐ发现的化学发光体系一一［１（Ｗｅｅｎ］ｎ电子系统结合在此后，Ｇｒ等将个取代基与扩展的起，并将近红外１１ 陕西师范大学硕士学位论文一的荧光基团引入该体系中，，合成了种发射光在近红外波段的化学发光探针并将其应用到－半乳糖苷酶和脂多糖诱导的腹膜炎的检测中。Ｐ炎症组织中含有大量的中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞，这些细胞通过过“”一｜１（）［］氧化物酶（呼吸爆发）产生活性氧，这是细胞防御机制的部分。一ＭＰＯ是种血红素有关的酶，在中性粒细胞和巨噬细胞中表达丰富，是吞噬细胞氧化爆发和炎症过程的关键介质ＭＰＯ催化过氧化氢和氯离子转化为次氯一１１２［］ＭＰＯ的酸，次氯酸是体内产生的反应活性最强的氧化剂之。循环浓度已被证实可以预测主要心脏不良事件的风险。此外，ＭＰＯ衍生的氯化化合物的数量也被［１１３］用作疾病发展的特定生物标志物。在体内环境下监测ＭＰＯ活性有助于建立ＭＰＯ与病理过程间的关系，促进ＭＰＯ抑制剂的临床前分析。通过鲁米诺的化学１１４［］发光成像来显示ＭＰＯ的活性已经有研究报导过了。但是鲁米诺仅适用于对浅，对深部病灶的敏感性要低得多部病灶的检测，用于检测深部病灶时往往无法检１１５Ｚｈａｎ［］测到信号。ｇ等通过化学发光能量转移的方法，将鲁米诺产生的蓝色光激发纳米颗粒在近红外光谱范围内发光，从而达到对深层组织内ＭＰＯ的活性检测。１１６Ｋ－［］ｉｅｌｌａｎｄ等将鲁米诺衍生物Ｌ０１２应用于活体内的ＭＰＯ检测。Ｒｅｅｃｅ等使用鲁１１７Ｌ－０［］米诺衍生物１２检测了血浆中的ＭＰＯ活性。１．２．２．２光动力治疗的监测一光动力疗法（ＰＤＴ）是种利用光能激活预先给药的光敏药物来实现局部肿瘤控制的癌症治疗方式。众所周知的是，ＰＤＴ的细胞毒性主要是通过光化学反应过程中产生的活性氧所介导的一ＰＤＴ治疗的成功的关。与其他类型的放射治疗样，一键是要有个合适的剂量。ＰＤＴ治疗的效果取决于光敏剂在靶标位置的浓度，光１１８［］ＰＤＴ剂敏剂的光吸收以及分子氧的存在这三个基本因素的相互作用。目前临床“”，量测量主要基于两个参数即提供的光照以及药物的剂量。光剂量常被描述为能量通量以及单位面积（浅层照射时）或单位长度（间质照射时）的通量率。这些参数没有考虑到每个特定靶标的光学不均匀性有很大差异。靶标组织中光敏剂的浓度由药物的药代动力学决定，与光学性质相似的是，其在病人体内和病人间都有极大地差异。由于该问题比较复杂，在现有的ＰＤＴ剂量测量时这些变化被忽略了。］０２是ＰＤＴ过程主要的细胞毒性物质，可通过在７０ｒｎｎ处检测发光来１２检测一一＊０２的生成量，这方式提供了最终的标记和理想计量的测量方式然而，这方式还存在以下三个问题：即发光极弱，易受人体红外光的千扰，半衰期为ｎｓ级，以及波长超过了大多数传统的光学探测器。虽然从技术上来说克服这些缺点是有１２ 第１章绪论一可能的，但是办发光的这些特性，使其作为种具有实际应用价值的测量方法确实太难太昂贵了。在ＰＤＴ过程中，主要任务是监测仏的浓度和总量。活性氧（ＲＯＳ）特异性化学发光探针由于其灵敏度高易于检测的优点，已被用于对ＲＯＳ的产生进＿行评估￣ＰＤＴ过。Ｐｉｎ等使用如图１４所示探针即ＦＣＬＡ，将其用来监控程中淋巴瘤细胞中的产生，其结果表明无论治疗方案如何，ＰＤＴ过程中产生的ＦＣＬＡ的发光与相应的细胞毒性呈线性相关。ＦＣＬＡ化学发光体系细胞毒性小，且对ＰＤＴ治疗结果千扰也很小＞０，是定量ＰＤＴ过程中２产生的有效手段，可以应用于ＰＤＴ１２１［］过程的实时监控。Ｈ３Ｔ＾丨＾ＳＦＣＬＡ图ＦＣＬＡ的分子结构ＰＤＴＦｅ－此外，鲁米诺也可以介导。ｉｒｒ等为了评价鲁米诺体系（如图１５）激活光敏剂血卟啉的效率，将鲁米诺，过氧化氢，和硫酸亚铁（作为催化剂）加入小１２２鼠杂交瘤细胞的培养液［］。结果显示，鲁米诺能激活血卟啉的结合物，从而产生约１００％的细胞毒性。Ｗａｎｇ等在荷瘤鼠（接种Ｈｅｌａ细胞）上评价鲁米诺体系作为１２３一一［］体内激发源的治疗效果。他们已经证明了这发光体系在ＰＤＴ中有定的潜。力，与单纯的化学发光体系相比，鲁米诺介导的ＰＤＴ组肿瘤抑制率约为３０％〇ｎ／２°－：ｆＹＴ４ｉＴｉ（〇〇Ｐｈｏｔｏ￥ｄｎｓ９ｉ２６ｒＬＪ＼ＡｎｒｉｎｏｐｈＳｉａｌｔｉｅ图－５１鲁米诺体系激活血卟啉的过程之后，Ｗａｎ等研宄了鲁米诺信号增强剂对化学发光介导的ＰＤＴ的抗肿瘤活ｇ１３ 陕西师范大学硕士学位论文性的影响，并观察到５５％的抑瘤率。因此，他们证明了使用信号增强剂是提高该一１２３ｆｌ体系效率的方法之。综上所述，化学发光与生物发光方法是原理极其相似的光学检测方法，同样无需激发光源一，且具有与生物发光相似的灵敏度。同时，化学发光与生俱来的、个重要特性是，几乎所有的化学发光探针对次氯酸ＲＯＳ、ＲＮＳ等氧化性分子、自由基都具有高灵敏度的响应。就活体组织或完整生物体中的相关生物研究而言，由于化学发光成像具有无背景荧光，且能够高灵敏响应氧化性分子的特性，在灵敏度上展现出独特的优势。但也正是由于化学发光成像探针对活性氧的选择性响一应，造成了与其他光学成像相比应用范围小这缺陷。１．３本文的研究内容和创新性１．３．１研究内容化学发光成像在活体检测中有诸多优势，但其检测对象往往局限在活性氧和与活性氧相关的代谢过程中，使其在病理学研究和药物开发方面的推广受到限制。因此，将化学发光成像的应用范围进行拓展，才能够为化学发光成像注入新的活力。本文致力于扩展化学发光活体成像的应用范围：，开展了以下工作１．兴趣蛋白的活体成像研究。以在生命过程中具有重要意义的ＹＥＧＦ、ＡＦＰ、ＴＮＦ－ａ为靶标－。ＨＲＰ，进行化学发光活体成像通过尾静脉注射蛋白对应的抗体复－二甲合物来对裸鼠进行预处理，以５，６酰肼荧光素为化学发光成像探针，对裸鼠体内皮下注射的靶标蛋白进行成像，实现了对兴趣蛋白的化学发光活体检测。２。．基于肿瘤蛋白标志物成像的肿瘤靶向以肿瘤细胞膜蛋白标志物ＶＥＧＦＲ２。作为靶标，对荷瘤鼠的肿瘤组织进行化学发光成像通过尾静脉注射抗ＶＥＧＦＲ２－ＨＲＰ５６－二甲复合物预处理荷瘤鼠，以，，酰肼荧光素为化学发光成像探针成功实现了通过ＶＥＧＦＲ２－－１ＨＲＰ复合物，靶向人源结肠癌细胞系ＨＣＴ１６在裸鼠皮下的移植瘤，通过化学发光活体成像的方式对肿瘤组织进行了表征。３．以急性炎症为模型的小动物药效评价。本章节以地塞米松为抗炎药物，以小一３鼠急性关节炎为疾病模型．５８，对地塞米松次给药后小时，小时的炎症水平进行了表征，又对两次给药后３．５小时的炎症水平进行了表征，分析其给药前后的化１４ 第１章绪论学发光信号强度，实现了对给药剂量，给药频率的化学发光活体成像表征。１３２．．本文的创新点扩展了化学发光成像检测的新对象６－二甲。根据５，酰肼荧光素对体内辣根过氧化物酶一ＨＲＰ的抗（ＨＲＰ）响应敏感这性质，通过标记体识别目标蛋白，实现体内靶标蛋白的化学发光成像检测。并在移植瘤模型中，成功的运用此方法，靶向肿瘤细胞表面蛋白，从而达到了对实体瘤的成像。成功的扩展了化学发光成像的应用范围一，并通过对实体瘤的靶向，表明了这方法在疾病研宄中具有广阔的应用前景。对抗炎药物药效进行化学发光活体成像表征６－二甲。５，酰胼荧光素在炎症成像方面有着良好的性能６－二甲，运用５酰肼荧光素对实验动物给药前后的炎症部位进，行成像，通过对给药前后的化学发光成像结果进行分析，对药物作用时间，给药一，剂量进行评价为药代动力学研究提供依据，这方法有可能成为药物筛选的有力工具。１５ 陕西师范大学硕士学位论文１６ 第２章兴趣蛋白的活体成像研究第２章兴趣蛋白的活体成像研究２．１引言１２４一荧光成像已经成为生物成像的金标准［］，但需要激发光源这特性，会引起光毒性一、光依赖性生物现象扰动以及荧光背景高等系列问题。这会影响成像结果的客观性，无法达到我们期待的灵敏度。此时，生物发光成像和化学发光成像的暗场优势就显现了出来：无需激发光源，背景信号低，灵敏度高，对生命过程一１２５。生物发光成像现在已经发展成为些肿瘤模型检测的金标准［］干预少等。但由于生物发光成像需要进行繁琐的转染操作，限制了其在未知疾病，未知病灶检测中的应用。化学发光成像，则多对体内活性氧进行表征，而对大量生物分子例如一蛋白，核酸等的研究方面，却仍然是片空白。检测对象的局限性，限制了化学发光成像在生命分析和临床医学方面的应用。因此，扩展化学发光成像的检测对一。象，就成为化学发光成像研宄的个重要方面我们以蛋白为研究对象，选择了在肿瘤血管生成中具有重要作用的ＶＥＧＦ，己经被应用于临床诊断的肿瘤标志物ＡＦＰ，以及在免疫响应中具有重要调节作用的ＴＮＦ－ａ－，通过抗体ＨＲＰ复合物靶向裸鼠体内的靶标蛋白，实现了在裸鼠体内对兴趣蛋白的活体成像检测。将化学发光成像对活性氧的检测，发展至对体内蛋白的检测，拓展了化学发光成像的应用范围。２．２实验部分２．２．１试剂与仪器⑴实验试剂１７ 陕西师范大学硕士学位论文表２－１实验试剂试剂名称规格生产厂家ＶＥＧＦ试剂盒９６Ｔ欣博盛生物科技有限公司ＡＦＰ试剂盒９６Ｔ上海酶联生物科技有限公司ＴＮＦ－ａ试剂盒９６Ｔ上海酶联生物科技有限公司磷酸缓冲溶液５００ｍＬ／０．００６７Ｍ（Ｐ〇４）Ｈｃｌｏｎｅ公司ｙ异氟烷１００ｍＬ瑞沃德生物科技有限公司无水乙醇２．５Ｌ／ＡＲ广东光华科技股份有限公司ＮａＯＨ５００／ＡＲ国药集团化学试剂有限公司ｇＤＭＥＭ培养基５００ｍＬＧｉｂｃｏ公司二甲亚砜５００ｇ／ＡＲ国药集团化学试剂有限公司２５０ＭＴＴ（噻哩蓝）ｍｇ／９８％北京索莱宝科技有限公司胎牛血清５００ｍＬＧｉｂｃｏ公司０２５１０ＬＧｉ．％胰蛋白酶消化液０ｍｂｃｏ公司２ｃｎｒｅｃ－其它试剂未经说明均为市售分析纯试剂，水为超纯水（１８．２ＭａｒＤｉｔ３ＵＶ，Ｑ，ＭｉｌｌｉｏｒｅＦＲ）〇ｐ，－３１ｘ－５二甲－二甲酰①ｌ〇ｍｏｌｌ／５６酰肼荧光素储备液：准确称取５６肼荧光素固体，，ｍ１０．００２１ｇ溶于０．１ｍＬ０．１ｏｌＩ／ＮａＯＨ，加入纯水０．９ｍＬ稀释，密封避光保存。－－－３１３１②２ｘｌ〇ｍｏｌＩ／５６－二甲酰肼荧光素工作液：将浓度为５ｘｌ〇ｍ〇ｌＬ的５６－二甲，，＝：酰肼储备液于活体实验前以储备液：纯水２３的体积比稀释。－１③２００ｍＬＶＥＧＦ标准品溶液：将ＶＥＧＦ标准品冻干粉以ＰＢＳ溶解，配制成２０００ｐｇ１１１ｐｇｍｌ／的原液，使用时取１０Ｌ２０００ｍｌ／标准品原液加９０ｉＬ０．０１ｍｏｌＩ／ｐｐｇ（ＰＢＳ稀释，备用。－１－６５０－④ｍＬＴＮＦａ标准品溶液：ＴＮＦａ标准品冻干粉以ＰＢＳ溶解，配制成６５００ｐｇ将－－１１１ｐｇｍＬ的原液，使用时取１０ｐＬ６５００ｐｇｍｌ／标准品原液加９０ｐＬ０．０１ｍｏｌＬＰＢＳ稀释，备用。－＇１１１⑤用于细胞毒性实验的浓度为３ｍｇｍｌ／，２．５ｍｇｍＬ，２ｍｇｍＬ，１．５ｍｇ－－１１１１－ｍＬｍｍＬ０．５ｍｍＬ５６二甲，，的，分别称取纯化ｇｇ，酰肼荧光素溶液配制时－２ｍ２ｍｍｍ后的５６二甲酰肼焚光素３ｍ，．５，，１．５，ｌｍ，０．５ｇ，溶于Ｏ．ｌｍＬ，ｇｇｇｇｇ－１０．１ｍｏｌＬＮａＯＨ，再加入含血清ＤＭＥＭ培养基（含１０％胎牛血清）０．９ｍＬ稀释，１８ 第２章兴趣蛋白的活体成像研究°４Ｃ避光保存。－ＭＴＴＨ１ＭＴＴ溶液：称取２５０ｍ７．４０ｒａＬ０．０１ｍｏｌＬＰＢＳ⑥ｇ，溶于的５，并用微ｐ°孔滤器除菌，分装，４Ｃ保存。⑵仪器与材料表２－２实验仪器仪器名称生产厂家小动物活体成像系统ＸｔｒｅｍｅＩＩ美国Ｂｒｕｋｅｒ公司－ＶＭＲ美国Ｍ吸入式麻醉系统ＭＡＴＲＸｉｄｍａｘｋ公司碧迪医疗器械（上海）有限”Ｘ胰岛素注射针２９Ｇ１／２公司酶标仪ＭｕｌｔｉｓｋａｎＦＣ赛默飞世尔科技－ＣＪ－超净台ＳＷ１ＦＤ苏州安泰空气技术有限公司细胞培养箱ＨＷＪ－３上海跃进医疗器械厂－（－－品系：ＢＡＬＢ／ｃｎｕｄｅ），６８２５，裸鼠，雄性周龄，体重２０ｇ由西安交通大学实验动物中心提供，符合国家技术服务监督局规定，无特殊病原体动物（ｓｐｅｃｉｆｉｃｔｈｏｅｎｆｒｅｅａｎｉｍａｌＳＰＦ）级质量标准ａ＿ｐｇ，＞动物饲养条件：每笼４只分开饲养，用Ｃｏ灭菌的固体压缩鼠和蒸懼水进一－Ｔ－：行喂养，环境温度２２２５，相对湿度４０％６０％，每三夭更换次垫料并用７５％。乙醇对鼠笼进行消毒，整个词养过程中１２小时光照／１２小时黑暗每天观察动物的健康状况，，隔天测量体重。研宄工作结束后实验动物以过量吸入乙醚的方式麻醉处死。。实验过程中对动物的处置符合西安交通大学实验动物中心相关规定２．２．２实验步骤２．２．２．１细胞毒性实验ｃｏ－用０．２５％胰蛋白酶消化液消化Ｃａ２细胞，并用含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培－养基重悬，以５０００８０００６，制成均匀的单个细胞悬液每孔个细胞接种于９孔培养一６Ｘ５＋Ｘ＝板上（共需要设置１５３５个），体积为２００吣，９６孔板四周不种细胞，°Ｃ用无菌ＰＢＳ填满。在Ｃ〇２细胞培养箱中３７、５％Ｃ０２以饱和湿度的条件下培养２４小时。ＤＭＥＭ培养基配５６－二甲培养结束后，将培养基弃掉，加入用含血清的制的，１９ 陕西师范大学硕士学位论文血清ＤＭＥＭ培养基的对照组一酰肼荧光素溶液２００，ｐＬ，并设置含组在Ｃ〇２细胞°培养箱中３７Ｃ、５％Ｃ〇２以饱和湿度的条件下培养４８小时。培养结束后，弃去培养基，用ＰＢＳ小心清洗３次，加入含血清的ＤＭＥＭ培养基１８０ｐＬ，再加入ＭＴＴ°溶液２０ｐＬ，３７Ｃ继续孵育４小时，终止培养。小心吸取上清液，弃去上清液并加入１５０ＬＤＭＳＯ，振荡１０分钟，使紫色结晶溶解。在酶标仪上，测定５７０ｎｍ波ｐ长下各孔吸光度值。２．２．２．２兴趣蛋白的活体成像研究⑴ＶＥＧＦ的靶向成像取裸鼠３只，实验前２小时中断饮食。尾静脉注射ＨＲＰ标记的抗ＶＥＧＦ抗体－３２００４２ｘｌ〇ｍ〇１５－二甲酰肼荧２５０Ｌ。ｌ＾６ｉ，小时后腹腔注射，光素以氧气／异叫）０１．７Ｌｍｉｔｒ５％）实验动物氟烷混合气体麻醉（混合气流速，将其，异氟烷浓度为仰面置于ＢｒｕｋｅｒＸｔｒｅｍｅＩＩ多功能成像系统的载物台上，以如下条件：Ｅｘｐｏｓｕｒｅ＝＝＝＞＜ｔｉｍｅ１０ｍｉｔｔＦＯＶ１Ｂｉｎｎｉｎ４ｉｎ；ｓｅｎｓｉｖｉ９ｃｍ４ＤＨｉｇｈｙ；；ｇ；ＣＣ°＝－＝ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ９０Ｃ拍摄化学发光图像，以如下条件：Ｅｘｐｏｓｕｒｅｔｉｍｅ４ｓｅｃｏｎｄ；＝ＦＯＶ＝＝ｘ－＝ＭｏｄｅＨｉｈＳｅｅｄ１９ｃｍＢｉｎｎｉｎｌｌＸＲａ０．４ｍｍＣＣＤｇｐ；；ｇ；ｙ；°＝＝ｔｅｍｅｒａｔｕｒｅ－９０ＣＫＶＰ４５ＸｒｕｋｅｒＭＩｐ；拍摄光图像，并利用Ｂ软件进行图片叠加处理，以及获取化学发光积分强度（拍摄过程中氧气／异氟烷混合气体流速为４５０－１）４０ｎｉＬｍｉｎ，异氟烷浓度为３％。拍摄至分钟时，将实验鼠取出，右后肢根部皮内注射２０ｐｇＶＥＧＦ标准品，左后肢根部注射８００ｐｇＡＦＰ标准品，左前肢根部注射５０ｐｇＢＳＡ溶液。注射完毕后，将实验动物放回载物台，以先前所设条件继续拍摄。⑵ＡＦＰ的靶向成像取裸鼠３只，实验前２小时中断饮食。尾静脉注射ＨＲＰ标记的抗ＡＦＰ抗体２００－３１＼－二甲酰肼荧光素，４小时后腹腔注射２５０２１〇１１１〇１１／５６。以氧气／叫私，异氟烷７１混合气体麻醉（混合气流速０．Ｌｍｉｒｒ，异氟烷浓度５％）实验动物，将其仰面置Ｘ＝于ＢｒｕｋｅｒｔｒｅｍｅＩＩ多功能成像系统的载物台上，以如下条件：Ｅｘｐｏｓｕｒｅｔｉｍｅ１０ｅｎ＝ｃｍｎｎｎ＝ｘ＝－ｍｉｎＨｉｓｓｉｔｉｖｉｔＦＯＶ１９Ｂｉｉ４４ＣＣＤｔｅｍｅｒａｔｕｒｅ９（ＴＣ；ｇｈｙ；；ｇ；ｐ拍＝＝摄化学发光图像，以如下条件：Ｅｘｐｏｓｕｒｅｔｉｍｅ４ｓｅｃｏｎｄ；ＭｏｄｅＨｉｇｈＳｐｅｅｄ；°＝＝ｘ－＝＝－＝ＦＯＶ１９ｃｍＢｉｎｎｉｎｌｌＸＲａ０．４ｍｍＣＣＤｔｅｍｅｒａｔｕｒｅ９０ＣＫＶＰ４５；ｇ；ｙ；ｐ；拍摄Ｘ光图像，并利用ＢｒｕｋｅｒＭＩ软件进行图片叠加处理，以及获取化学发光积４１５０Ｌｍｉｒ分强度（拍摄过程中氧气／异氟烷混合气体流速为ｍｒ，异氟烷浓度为３％）。拍摄至４０分钟时，将实验鼠取出，右后肢根部皮内注射８００ｐｇＡＦＰ标准品，左后肢根部皮内注射２０ｐｇＶＥＧＦ标准品，左前肢根部注射５０ｐｇＢＳＡ溶液。注射完毕２０ 第２章兴趣蛋白的活体成像研宄，。后，将实验材料放回载物台以先前所设条件继续拍摄⑶ＴＮＦ－ａ的靶向成像３２小时中断饮食－。尾静脉注射ＨＲＰ标记的抗ＴＮＦ取裸鼠只，实验前ａ抗体－３１ｘ－二甲酰肼荧光素２００４２５０Ｌ２ｌ〇ｍｏｌ：／。以氧气／异，小时后腹腔注射ｎ５６叫，ｉ氟烷混合气体麻醉（混合气流速０．７Ｌｍｉｒｒ，异氟烷浓度为５％）实验动物，将其仰面置于ＢｒｕｋｅｒＸｔｒｅｍｅＩＩ多功能成像系统的载物台上，以如下条件：Ｅｘｐｏｓｕｒｅ＝＝＝ｘｔｉｍｅ１０ｍｉｎＨｉｈｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔＦＯＶ１９ｃｍＢｎｎｉｎ４４ＣＤｉ；ｇｙ；；ｇ；Ｃ＝ｚ－ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅＱＣＴＣ拍摄化学发光图像，以如下条件：Ｅｘｐｏｓｕｒｅｔｉｍｅ４ｓｅｃｏｎｄ；＝＝－＝Ｍｏｄ＝ｘｅＨｉｇｈＳｐｅｅｄ；ＦＯＶ１９ｃｍ；Ｂｉｎｎｉｎｇｌ］；ＸＲａｙ０．４ｍｍ；ＣＣＤ°＝－９０＝４ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅＣ；ＫＶＰ５拍摄Ｘ光图像，并利用ＢｒｕｋｅｒＭＩ软件进行图片叠加处理，以及获取化学发光积分强度（拍摄过程中氧气／异氟烷混合气体流速为４５０１ｉ３％）。拍摄至４０分钟时ｍＬｍｒｒ，将实验鼠取出，异氟烷浓度为，左后肢处皮内６５ＴＮＦ－ａ标准品处注射２０ＶＥＧＦ５０注射，ｐｇ，右后肢ｐｇ标准品左前肢根部注射ｐｇＢＳＡ溶液。注射完毕后，将实验材料放回载物台，以先前所设条件继续拍摄。２．３结果与讨论２３１．．细胞毒性实验在探针应用于活体实验之前，需要考察探针对生命体的影响，我们预先进行了５６－二甲ａｃｏ－２）作为肿瘤细，酰肼荧光素细胞毒性的试验。以人结肠癌细胞系（Ｃ胞模型，ＭＴＴ为染色剂，用酶标仪测定５７０ｎｍ波长下各孔的吸光度值，以如下公＝－－Ｘ１式：细胞活度）（ＡＡ）／（ＡＡＷ）００，将吸光度值换算为细胞（％＾ｍ＿｜－，所得结果如图２１所示活度：－１２０．１１１１１１１０．００．５１．０１．５２．０２．５３．０￣１ＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｍｍＬ（ｇ）２－１－图：５６二甲酰胼荧光素细胞毒性实验结果，２１ 陕西师范大学硕士学位论文８０％５－二甲酰肼荧光素浓度的增由图中可以看出，且６，细胞活度均大于随着，－二甲酰胼荧光素对细大，细胞活度并没有明显的下降趋势，因此５６，可以认为，，。胞无毒性，可用于活体内生命过程的探究２．３．２兴趣蛋白的活体成像研究⑴ＶＥＧＦ的靶向成像以抗ＶＥＧＦ抗体预处理裸鼠，ＶＥＧＦ标准品为靶标蛋白（右下肢根部，黄圈处），ＡＦＰ标准品（左下肢根部，红圈处）和ＢＳＡ（左前肢根部，蓝圈处）为干扰２－２蛋白进行活体成像（裸鼠为仰卧位）实验：，实验结果如图所示Ｐ／ｓｅｃ／ｃｎｉ／ｓｑ图２－２ＶＥＧＦ靶向化学发光成像结果機■：ｒ８〇．■１■．▲ＢＳＡ＇－＾＾■４＿３ｘ丨０６０－■｜ｆ■＿ＳＨ■Ｓ■＇■￡名２ｘ１０５４０－Ｈ｜ｉ与■、－ｇ１ｘ１０２０■０２０４０６０８０１００１２０１４０１６００２０４０６０８０１００１２０１４０１６０ＴｉｍｅｍｉｎＴｉｍｅｍｉｎ（）（）图２－３ＶＥＧＦ靶向成像信号与时间变化关系）（取组内均值作图２２ 第２章兴趣蛋白的活体成像研究２－２ＶＥＧＦ由图的成像结果可知，在标准品注射之前，四肢的信号强度基本持平；分别注射蛋白之后，仅有靶标区域即ＶＥＧＦ所在区域出现明显的发光信号，而干扰蛋白ＡＦＰ标准品和ＢＳＡ所在区域发光信号强度与未注射时基本相同，即发光信号是由于抗ＶＥＧＦ抗体在ＶＥＧＦ标准品所在位置聚集而产生的，千扰蛋白并不会引起抗ＶＥＧＦ抗体的聚集。通过，对三个区域化学发光信号的平均积分强度２－３），，进行分析（图，我们发现在成像过程中靶标区域信号的平均积分强度在注射靶标后６０分钟内迅速升高，约在注射酰肼荧光素后１１０分钟出现峰值，此时靶标区域信号强度约为干扰蛋白区域信号强度的８倍，此后靶标区域信号强度缓慢减弱。由此可见在活体内应用抗ＶＥＧＦ抗体靶向ＶＥＧＦ是可行的。２）ＡＦＰ（的靶向成像以抗ＡＦＰ抗体预处理裸鼠，ＡＦＰ标准品为靶标蛋白（右下肢根部，黄圈处），ＶＥＧＦ（）ＢＳＡ（）标准品左下肢根部，红圈处和左前肢根部，蓝圈处为干扰蛋白进行活体成像（裸鼠为仰卧位）实验，实验结果如下图所示：１２｜（１攀■＿？ｘＰ／ｓｅｃ／ｃｍ／ｓｑ图２－４ＡＦＰ靶向化学发光成像结果２３ 陕西师范大学硕士学位论文３５，ｎ■ＡＦＰ＿■？＿ＶＥＧＦ３０－■’？▲ＢＳＡ■＞ｘ丨亡々６．０１０■１＂■２＞■｜■？■、－４．０ｘｔ■１０老｜－－＇５＾卜■Ｓ４＞？．．Ｊ〗〇Ｓ－■２．０Ｍ０＾＾＾■５．？．．．．？：＇■：未－■〇．〇卜．Ｉ，一二＇二．？—，ｏｒ■，■，■，，、＿０２０４０６０８００２０４０６０８０１００１２０１４０１６０１８０１００１２０１４０１６０１８０ＴｉｍｅｍｉｎＴｉｍｅ（ｍｉｎ）（）图２－５ＡＦＰ靶向成像信号与时间变化关系（取组内均值作图）由图２－４的成像结果可知ＡＦＰ标准品注射之前，在，四肢的信号强度基本持平；分别注射蛋白之后，仅有靶标区域即ＡＦＰ所在区域出现非常明显的发光信号，而干扰蛋白ＶＥＧＦ标准品和ＢＳＡ所在区域发光信号强度与未注射时基本相同，即发光信号是由于抗ＡＦＰ抗体在ＡＦＰ标准品所在位置聚集而产生的，干扰蛋白并不会引起抗ＡＦＰ抗体的聚集。通过，对三个区域化学发光信号的平均积分强度进行２－５），靶标区域信号的平均积分强度在注射分析（图，我们发现，在成像过程中靶标后７０分钟内迅速升高，且约在注射酰肼荧光素后１３０分钟出现峰值，此时靶３．５标区域信号强度约为干扰蛋白区域信号强度的倍，此后靶标区域信号强度逐渐减弱。由此可见在活体内应用抗ＡＦＰ抗体靶向ＡＦＰ是可行的。⑶ＴＮＦ－ｃｔ的靶向成像Ｆ－ａ抗体预－ｏ以抗ＴＮ处理裸鼠，ＴＮＦｉ标准品为靶标蛋白（左下肢根部，黄圈处），ＶＥＧＦ标准品（右下肢根部，红圈处）和ＢＳＡ（左前肢根部，蓝圈处）为干扰蛋白进行活体成像（裸鼠为仰卧位）实验，实验结果如下图所示：２４ 第２章兴趣蛋白的活体成像研究斷Ｐ／ｓｅｃ／ｃｉｎ／ｓｑ图２－６ＴＮＦ－ａ靶向化学发光成像结果■．１．２ｘ１０ｍ７ＮＦ－ａ４０■■３５．ＩＢｓｆ■＊卜＇｜＾３０－？■＜８０ｘ１０ＩＥ２５．＾ｔ２０－Ｃ■ｚ＇１５．Ｓ￥４．０ｘ１０■卜ｗ■■■Ｓ１０＿１：＂▲Ａ▲▲〇？■■■ｏ．！■．．■▲＿．｜，，，＿，—〇■■０２０４０６０８０１００１２００２０４０６０８０１００１２０Ｔｉｍｅｍｉｎ（）Ｔｉｍｅｍｉｎ（）图２－７ＴＮＦ－ａ靶向成像信号与时间变化关系）（取组内均值作图２－－由图６的成像结果可知，在ＴＮＦｏｉ标准品注射之前，四肢的信号强度基本持ＴＮＦ－平，仅有靶标区域即ａ所在区域出；分别注射蛋白之后现非常明显的发光信ＳＡ号，而干扰蛋白ＶＥＧＦ标准品和Ｂ所在区域发光信号强度与未注射时基本相同，－－ａ标准品所在位置聚集而产生的即发光信号是由于抗ＴＮＦａ抗体在ＴＮＦ，干扰蛋－ａ抗体的聚集白不会引起抗ＴＮＦ。通过对三个区域化学发光信号的平均积分强度２－７进行分析（图），我们发现，在成像过程中，靶标区域信号的平均积分强度在注射靶标后６０分钟内迅速升高，且约在注射酰肼荧光素后１００分钟出现峰值，此５．５时靶标区域信号强度约为干扰蛋白区域信号强度的倍，此后靶标区域信号强度－－逐渐减弱。由此可见在活体内应用抗ＴＮＦａ抗体靶向ＴＮＦａ是可行的。综上所示，通过对体内不同兴趣蛋白的化学发光成像，我们发现：注射发光－二甲酰肼探针５６，经抗体预处理的裸鼠并无明显的化学发光信号改变，荧光素后；２５ 陕西师范大学硕士学位论文注射探针后４０分钟，靶标蛋白，及两种干扰蛋白分别经皮下注入裸鼠体内，此后，靶标蛋白区域－７０分钟，化学发光信号发生了明显的改变；注射靶标后约６０，靶标区域信号值出现峰值。２．３．３小结本章对体内兴趣蛋白进行了化学发光成像表征。首先通过细胞毒性实验对所５６－二甲用化学发光成像探针酰肼焚光素的毒性进行了检测，发现细胞活度均大于，８０％，且不随探针浓度升高而明显下降，因此认为满足进行活体实验的要求。随后，－ＨＲＰ复合物对兴趣蛋白进行靶向通过抗体，实现了对体内兴趣蛋白的化学发光活体成像表征，实现了对体内微量蛋白（低至ｐｇ级）的化学发光成像，成功的将化学发光活体成像的检测对象，从ＲＯＳ扩展到蛋白质，为多种疾病蛋白标志物在活体内跟踪检测提供了新的研究思路和平台，为相关疾病过程的研究提供了支持。２６ 第３章基于肿瘤蛋白标志物成像的肿瘤靶向第３章基于肿瘤蛋白标志物成像的肿瘤靶向３．１引言目前可以通过ｘ射线检査，超声检查，核磁共振检查，扫描断层检查以及内腔镜检查等多种途径对肿瘤进行诊察，但由于这些方式各自的局限性，在肿瘤的。早期诊断上并不能显示出独到的性能肿瘤蛋白标志物在肿瘤早期诊断中，占据非常重要的地位。有许多研宄证实，实体瘤生长和转移依赖于新生血管形成。ＶＥＧＦ１２６【］是目前已知的最重要的促新血管生成的因子，作为ＶＥＧＦ在新生内皮上最重要的受体，ＶＥＧＦＲ２几乎介导了形成肿瘤新生血管所必需的绝大多数内皮细胞功能。我们己经实现了通过化学发光成像对体内兴趣蛋白的靶向成像，在本章中，通过－成像体内ＶＥＧＦＲ２，达到对裸鼠人源结肠癌ＨＣＴ１１６皮下移植瘤的检测。将对兴趣蛋白的活体成像应用于对肿瘤的检测，有助于肿瘤病灶的早期发现和治疗。３．２实验部分３．２．１试剂与仪器⑴实验试剂３－表１实验试剂试剂名称规格生产厂家ＶＥＧＦＲ２试剂盒９６Ｔ上海酶联生物科技有限公司异氟烷１００ｍＬ瑞沃德生物科技有限公司无水乙醇２．５Ｌ／ＡＲ广东光华科技股份有限公司ＮａＯＨ５００ｇ／ＡＲ国药集团化学试剂有限公司ＤＭＥＭ培养基５００ｍＬＧｉｂｃｏ公司胎牛血清５００ｍＬＧｉｂｃｏ公司０．２５％胰蛋白酶消化液１００ｍＬＧｉｂｃｏ公司２７ 陕西师范大学硕士学位论文２８－其它试剂未经说明均为市售分析纯试剂．２ＭＳ２ｃｎｒＤｉｒｅｃｔ３ＵＶ，水为超纯水（１，Ｑ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＦＲ）〇－３－１ｘ－ｌ〇ｍ－二甲①５ｏｌＬ５６二甲酰：准确称取５，６，肼荧光素储备液酰肼荧光素固体－１００２０１．１ｌＬＮＯＨ０．９ｍＬ。．０１ｇ溶于．ｍＬ０ｍｏａ，再加入纯水稀释，密封避光保存＿３１－３＞＜－二甲酰＞＜＠２１０１１１〇１１／５６肼荧光素工作液：５１０１１１〇１１＾储备液于活体实验前，＝６－二甲以５酰肼荧光素储备液：纯水２：３的体积比进行稀释。，１２１③０．０３３ｍｇｍｌ／ＶＥＧＦＲ抗体工作液：１ｍｇｍｌ／抗体原液２０ｎＬ加５８０ｎＬ０．０１＂１ｍｏｌＬＰＢＳ〇⑵仪器与材料表３－２实验仪器仪器名称型号生产厂家多功能成像系统ＸｔｒｅｍｅＩＩ美国Ｂｒｕｋｅｒ公司－ＶＭＲ美国Ｍ吸入式麻醉系统ＭＡＴＲＸｉｄｍａｒｋ公司－ＳＷ－ＣＪ超净台１ＦＤ苏州安泰空气技术有限公司细胞培养箱ＨＷＪ－３上海跃进医疗器械厂－－ＢＡＬＢ／ｃ－）６８２５裸鼠（品系：ｎｕｄｅ，雄性，周龄，体重２０ｇ，由西安交通大学实验动物中心提供，符合国家技术服务监督局规定，无特殊病原体动物（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｈｏｇｅｎｆｒｅｅａｎｉｍａｌＳＰＦ）级质量标准ｐ，动物饲养条件：每笼４只分开饲养，用Ｃｏ灭菌的固体压缩鼠粮，和蒸馏水进°一－２５Ｃ相对湿度４０％－６０％行喂养，每三天更换，环境温度２２，次垫料并用７５％乙醇对鼠笼进行消毒，整个饲养过程中１２小时光照／１２小时黑暗。每天观察动物一天测量体重的健康状况，隔。研究工作结束后，实验动物以过量吸入乙醚的方式麻醉处死。实验过程中对动物的处置符合西安交通大学实验动物中心相关规定。３．２．２实验步骤⑴荷瘤鼠模型的构建°ＨＣＴ－１１６细胞使用含１０％血清的ＤＭＥＭ培养基，在Ｃ０２细胞培养箱中３７Ｃ、５％Ｃ０２以饱和湿度的条件下培养，细胞密度达到８０％左右进行传代。进行肿瘤细胞接种时－７０％的，取细胞密度在６０％指数生长期细胞，胰酶消化后，用无血清６６ＤＭＥＭ培养基重悬ｘ－ｘ〇，皮下接种肿瘤细胞（右下肢根部），每只鼠接种６ｌ〇９ｌ个细胞。每天观察其肿瘤的生长状况，待肿瘤长径达４ｍｍ时进行后续实验（此过２８ 第３章基于肿瘤蛋白标志物成像的肿瘤靶向程所需时间约１周）。⑵基于肿瘤蛋白标志物成像的肿瘤靶向取步骤⑴中所建立的移植瘤模型动物，实验前２小时中断饮食。分为两组：Ａ组５６－二甲５０Ｂ组脉注，直接腹腔给药的酰肼荧光素２吣；，尾静，－１ｘ－射ＨＲＰ标记的ＶＥＧＦＲ２抗体２００叫，１小时后经由腹腔给药２ｌ（Ｈｍ〇ｌＬ的５６，ｍ１二甲酰肼焚光素２５０ｎＬ；。并以氧气／异氟烷混合气体麻醉（混合气流速０．７Ｌｉｉｒ，异氟烷浓度为５％）实验动物，将其仰面置于ＢｒｕｋｅｒＸｔｒｅｍｅｌｌ多功能成像系统的＝＝ｍ１ＦＯＶ载物台上：Ｅｘｏｕｒｅｔｉｍｅ０ｍｉｎＨｉｈｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔ１９ｃ，以如下条件ｐｓ；ｇｙ；；°＝＝Ｂ＞＜－ｏｕｒｅｉｎｎｉｎ４４ＣＣＤｔｅｍｅｒａｔｕｒｅ９０Ｃ拍摄化学发光图像，以如下条件：Ｅｘｓｇ；ｐｐ＝＝＝＝ｘ＝ｅｅｅｄｃｍ－ａｔｉｍｅ４ｓｅｃｏｎｄＭｏｄＨｉｈＳＦＯＶｌ９Ｂｉｎｎｉｎｌ１ＸＲ０．４ｍｍ；ｇｐ；；ｇ；ｙ；°＝－＝ＣＣＤｔｅｍｅｒａｔｕｒｅ９０Ｃ；ＫＶＰ４５拍摄Ｘ光图像，并利用ＢｒｕｋｅｒＭＩ软件进行图ｐ片叠加处理，以及获取化学发光积分强度（拍摄过程中氧气／异氟烷混合气体流速％－１为４５０ｍＬｍｉｎ，异氟烷浓度为３％）。取步骤（１）中所建立的移植瘤模型动物，实验前２小时中断饮食。尾静脉注－３－１射ＨＲＰ标记的ＶＥＧＦＲ２抗体２００吣ｘｍｏ－，１小时后经由腹腔给药２ｌ〇ｌＬ的５６，二甲酰胼焚光素２５０ｎＬ，此为Ｃ组实验动物。以氧气／异氟烧混合气体麻醉（混合－１％ｒｕｋｅｒｒｅｍｅｌｌ气流速０．７Ｌｍｉｎ，异氟烷浓度为５）实验动物，将其仰面置于ＢＸｔ＝ｍ多功能成像系统的载物台上，以如下条件：Ｅｘｐｏｓｕｒｅｔｉｍｅ１０ｉｎ；Ｈｉｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ；ｇ＇°＝＝＞＝ＦＯＶ１９ｃｍＢｉｎｎ＜ｅｍｅｒａｕｒｅ－Ｃ拍摄化学ｉｎ４４ＣＣＤｔｔ９０像，以如下；ｇ；ｐ发光图＝＝ｍ＝＝ｘ条件：Ｅｘｐｏｓｕｒｅｔｉｅ４ｓｅｃｏｎｄ；ＭｏｄｅＨｉｇｈＳｐｅｅｄ；ＦＯＶ１９ｃｍ；Ｂｉｎｎｉｎｇｌｌ；°－ａ＝ｅｍｅ＝－＝ＸＲ０．４ｍｍＣＣＤｔｒａｔｕｒｅ９０Ｃ；４５拍摄Ｘ光图像（拍摄过程中ｙ；ｐＫＶＰ１－二甲酰氧气／异氟烷混合气体流速为４５０ｍＬｍｉｒｒ，异氟烷浓度为３％）。在注射５６，肼荧光素后３５分钟时，在肿瘤的异侧（即左下肢根部）皮下注射ＶＥＧＦＲ２抗体５０沖。以先前所设条件继续拍摄。３．３结果与讨论３．３．１实验结果⑴荷瘤鼠模型的构建接种肿瘤细胞３天后，接种部位出现鼓包，触摸柔软，；１周后接种部位肿瘤。。明显，长径大于４ｍｍ，且触之较硬此时可用于后续成像实验２９ 陕西师范大学硕士学位论文⑵基于肿瘤标志物成像的肿瘤成像Ａ５６－－二甲酰肼荧光素组的实验结果如３１组荷瘤鼠，即直接腹腔给药，所示（蓝）色圈为正常组织区域，红色圈为肿瘤组织区域：ｉ．１．４２；：；：ｔｉ４ｎｉ＇１：．：－０：：９．＞．３：：；＾；；＿ｒｉ．‘：ｉ〇：ｉ．４５■：＇：：；：ｆ？２Ｚ；Ｐ／ｓｅｃ／ｃｎｉ／ｓｑ图３－１Ａ组荷瘤鼠化学发光成像结果－６３４ｘ．１０ｉ肿瘤组织■？、．正常组织？＂３３ｘ－４－５ｉ１０Ｉｓ＾－３５ａｘ．ｇｉｏ，－Ｓ茭２？Ｓ〇？；■■一３．１ｘ１０．．．■■Ｓ．■．．．？？：．？．．〇｜〇＇………丨⑵丨２〇ｉ２０４０６０８０１００１２０Ｔｉｍｅｍｉｎ（）Ｔｉｍｅｍｉｎ（）图３－２Ａ组荷瘤鼠化学发光成像信号分析（取组内均值作图）Ｂ组荷瘤鼠，即尾静脉注射ＶＥＧＦＲ２抗体对荷瘤鼠进行预处理，１小时后注５６－二甲－，实３３，射，酰肼焚光素成像组验结果如图所示（蓝色圈为正常组织区域红色圈为肿瘤组织区域）：３０ 第３章基于肿瘤蛋白标志物成像的肿瘤靶向１：．，＇、．■．；＇：！Ｖ；，；Ｉ４：．Ｉ－■＊」．（ＩＩ）－：夂．－十），Ｐ／ｓｅｃ／ｃｎｉ／ｓｑ图３－３Ｂ组荷瘤鼠化学发光成像结果１６１．５ｘ１０■．冲瘤组织１、丨■＊？正常组织＿＂＂■＊－＾＾１２＊．＇＇ｌ．ＯｘｌＯ，■１Ｊ．ＳＳ■ｚ，〇＇８？＞５名Ｈ．ｘ０ｘＷ＇＇Ｉｉ４．，．＾＾■■？？？＿？？？攀參參參＾＾０２０４０６０８０１００１２００２０４０６０８０１００１２０ＴｉｍｅｍｉｎＴ（）ｉｍｅｍｉｎ（）图３－４Ｂ组荷瘤鼠化学发光成像信号分析（取组内均值作图）ＩＭＭ—ｉｆＨＢＳ图３－５成像荷瘤鼠肿瘤解剖结果３１ 陕西师范大学硕士学位论文Ｃ组荷瘤鼠，即尾静脉注射ＶＥＧＦＲ２抗体对荷瘤鼠进行预处理，１小时后注６－二甲酰胼荧光素成像至３５分钟时射５，成像，在肿瘤的异侧皮下追加注射，３－ＶＥＧＦＲ２抗体，实验结果如图６所示（蓝色圈为正常组织区域，红色圈为肿瘤组织区域）：＇４．．Ｓ（）ＬＡ．｜｜ｊ６．５Ｐ／ｓｅｃ／ｃｎｉ／ｓｑ图３－６Ｃ组荷瘤鼠化学发光成像结果６’■肿瘤组织？正常电织■—？．ｗ）＿＇？智３ｇ４，■４侧：■ｇ■■｜■国＊Ｓ２：目．０ｘ１０一？？？？？？Ｓ？．〇￣￣￣￣￣°２０４０６０８０１００ｉ２０Ｔ〇＾＾ＴＯＯＴｉｍｅｍｉｎＴｉｍｅｍｉｎ（）（）图３－７Ｃ组荷瘤鼠化学发光成像信号分析（取组内均值作图）通过对三组模型鼠的成像结果进行分析，发现了如下现象：３２ 第３章基于肿瘤蛋白标志物成像的肿瘤靶向－１．Ａ组，即未经ＶＥＧＦＲ２抗体预处理组，肿瘤组织处与正常组织处在注射５６，二甲（３－酰肼荧光素前后均无明显的发光信号增强图１），通过对发光信号积分强３－２）－二甲度分析（图，确认５６酰肼荧光素无法对未经ＶＥＧＦＲ２抗体预处理的荷，瘤鼠肿瘤组织产生响应。２．Ｂ组，即尾静脉注射ＶＥＧＦＲ２抗体预处理组，肿瘤组织处，在注射发光探正常组织发光信号无明显改变（图－针后，发光信号明显增强，而３３）。通过对发（＞４图３），光信号积分强度分析，肿瘤组织处积分信号强度约为正常组织处的６倍一有明显的差异，认为通过ＶＥＧＦＲ２抗体靶向肿瘤这目的实现了。３－．荷瘤鼠断颈法处死后，对肿瘤部位进行解剖，其结果如图３５，肉眼可见白色肿瘤组织，肿瘤组织周围及表面有血管包被，切开肿瘤组织，无脓肿流出，结合Ａ、Ｂ两组实验结果，可以认为通过ＶＥＧＦＲ２抗体靶向肿瘤细胞表面ＶＥＧＦＲ２位点６－二甲，经ＶＥＧＦＲ２抗体上标记的ＨＲＰ歧化过氧化氢产生活性氧，与５，酰肼一荧光素反应来对肿瘤细胞成像这路径是可行的。－４１６二甲．Ｃ组，即尾静脉注射ＶＥＧＦＲ２抗体预处理，小时后注射５，酰肼荧光３５ＶＥＧＦＲ２抗体－－素，再过分钟肿瘤对侧皮下注射。Ｃ组成像结果如图３６，图３７所示５６－二甲酰肼荧，可见，注射，肿瘤部位，，光素后信号值升高并随时间的推移。３５ＶＥＧＦＲ２抗体后信号值逐渐增强当分钟时，在对侧即左侧下肢根部皮下注射，一－３７５９－分钟这时间段内，注射抗体位点信号值迅速增强，而在６０７０分钟，肿瘤部位信号减弱，抗体位点信号值达到峰值，此后，抗体位点信号值减弱，而肿瘤部位信号值逐渐增强。根据Ｃ组实验结果，我们可以推测，抗体在体内运输２５ｍｍ所需的时间约为３０分钟左右。３．３．２小结。本章节通过对肿瘤膜蛋白标志物的靶向，实现了对肿瘤的化学发光成像表征ＶＥＧＦＲ２－ＨＲＰ我们以肿瘤细胞膜蛋白ＶＥＧＦＲ２作为靶标，通过抗体复合物对裸鼠皮下移植瘤进行靶向，肿瘤组织化学发光信号明显。这证实了我们的设计思路能够对肿瘤进行表征，可以实现对实体瘤中具体标志物丰度的成像表征，展现出了化学发光成像在肿瘤检测中的潜力，为病理学研究、药物筛选、以及药物开发提供了可靠的研究手段和平台。３３ 陕西师范大学硕士学位论文３４ 第４章以急性炎症为模型的小动物药效评价第４章以急性炎症为模型的小动物药效评价４．１引言药效是药物评价和筛选的重要指标。药效评价分为体内体外两个方面：体外、检测，考察药物对病原体酶、受体、细胞、姐织等的直接作用，为体内检测提，，供依据；体内检测考察药物对模型动物的作用评价其治疗效果。常见体内检测包括：药物浓度（血液、尿液、其他体液或者组织中的药物浓度）检测，疾病，病理切片的观察等。体内检测时标志物的检测，为了进行生物检测样本的收集，一，而且难以实时监测药物作用效果。因此常需要消耗大量的实验动物，需要种无创的，具有实时监测能力的方法，来表征药效。，典型的炎症性疾病炎症与多种重大疾病的产生和发展有着密切的联系，例、哮喘如风湿性关节炎、结肠炎和肝炎是世界上致死和致残的主要原因，慢性炎症会导致癌症，阿兹海默症等多种重大疾病的产生。因此，对抗炎药物的作用效果和作用机理的研宄具有重要意义。本章节中，应用化学发光成像技术，对地塞米松在治疗小鼠急性关节炎过程中的药效进行了活体评价。４．２实验部分４．２．１试剂与仪器⑴实验试剂４－表１实验试剂试剂名称规格生产厂家地塞米松磷酸钠注射液２ｍｇ／ｌｍＬ／支辰欣药业股份有限公司降植烷９６Ｔ北京百灵威科技有限公司异氟烷２５ｍＬ／９５％深圳市瑞沃德生命科技有限公司无水乙醇２．５Ｌ／ＡＲ广东光华科技股份有限公司ＮａＯＨ５００／ＡＲ国药集团化学试剂有限公司ｇ３５ 陕西师范大学硕士学位论文２（－．２Ｍａｃｎｒｒｅｃｔ３ＵＶ，水为超纯水１８，Ｄｉ其它试剂未经说明均为市售分析纯试剂Ｑ，ＭｉｌｌｉｏｒｅＦＲ）〇ｐ，＿３１－ｘ二甲－二甲①５ｌ０ｍｏｌｌ／５６酰肼荧光素储备液：准确称取５６酰肼荧光素固体，，－００２１．０１溶于０．１ｍＬＯ．ｌｍｏｌＬＮａＯＨ，．９ｍＬ稀释ｇ再加入纯水０，密封避光保存。－Ｓ－二甲酰肼荧ｘ１②光素工作液：ＳｌＯｍｏｌＬ储备液于活体实验前－＝以５６二甲酰肼荧光素储备液：纯水２：３的体积比进行稀释。，１１③０．２２７５ｍｇｍｌ／地塞米松磷酸钠注射液：取浓度为２ｍｇｍｌ／的地塞米松磷酸钠°注射液ｌｍＬ５％葡萄糖注射液７．８ｍＬ４Ｃ冷藏备用。，加入，⑵仪器与材料表４－２实验仪器仪器名称型号生产厂家小动物活体成像系统ＸｔｒｅｍｅＩＩ美国Ｂｒｏｋｅｒ公司－ＶＭＲ美国Ｍ吸入式麻醉系统ＭＡＴＲＸｉｄｍａｒｋ公司”胰岛素注射针２９ＧＸ１／２碧迪医疗器械（上海）有限公司－小鼠（品系－：昆明），雌性，６８周龄，体重３５４０ｇ，由西安交通大学实验动物中心提供，符合国家技术服务监督局规定，无特殊病原体动物（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｈｏｅｎｐｇｆｒｅｅａｎｉｍａｌ，ＳＰＦ）级质量标准动物词养条件：每笼４只分开饲养，用Ｃｏ灭菌的压缩鼠粮，蒸馏水进行喂养，°一－－２５Ｃ环境温度２２，相对湿度４０％６０％，每三天更换次垫料并用７５％乙醇对鼠笼进行消毒，整个饲养过程中１２小时光照／１２小时黑暗。每天观察动物的健康状况，一乙醚的方式麻醉处死隔天测量体重。研究工作结束后，实验动物以过量吸入。实验过程中对动物的处置符合西安交通大学实验动物中心相关规定。４．２．２实验步骤⑴急性炎症模型的构建１将昆明鼠用０．７Ｌｍｈｒ的氧气／异氟烷混合气体（异氟烷浓度为５％）麻醉，用电子显示游标卡尺测量双侧下肢厚度。后用胰岛素注射针在小鼠右下肢跖关节０－１５处注射１卟降植烷。正常给与饮食，２４小时后右下肢跖关节及掌部有肉眼可一见红肿。此时，测量双侧下肢厚度，并中断饮食，准备下步实验。⑵地塞米松磷酸钠注射液抗炎作用的成像表征取步骤⑴所构建实验动物数只，中断饮食２小时，腹腔注射的３６ 第４章以急性炎症为模型的小动物药效评价－１５６－二甲５０。以氧气／异氟烷混合气体麻醉（混合气流速０．７Ｌｍｉｎ，，酰肼荧光素２叫异氟烧浓度４％）实验动物，将其俯卧位置于ＢｒｕｋｅｒＸｔｒｅｍｅｌｌ多功能成像系统的ｍ＝＝载物台上，以如下条件：Ｅｘｐｏｓｕｒｅｔｉｅｌ０ｍｉｎ；Ｈｉｇｈｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ；ＦＯＶ１９ｃｍ；°＝Ｂｘ＝－ｉｎｎｉｎｇ４４ＣＣＤｔｅｍｅｒａｔｕｒｅ９０Ｃ拍摄化学发光图像，以如：Ｅｘｏｓｕｒｅ；ｐ下条件ｐ＝＝＝＝ｘ＝ｔｉｍｅ４ｓｅｃｏｎｄｏｄｅｈＳｄＦＯＶ９ｃｍ－；ＨｉｅｅｌＢｉｎｎｉｎｌ１ＸＲａ０．４ｍｍＭｇｐ；；ｇ；ｙ；°＝＝ＣＣＤ－ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ９０Ｃ；ＫＶＰ４５拍摄Ｘ光图像，并利用ＢｒｕｋｅｒＭＩ软件进行图片叠加处理，以及获取化学发光积分强度（拍摄过程中氧气／异氟烷混合气体流速１％为々ＳＯｍＬｎｉｉｉｒ，异氟烷浓度为３）。拍摄完毕后，正常给与饮食，并将实验动物分为四组：Ａ组－，为炎症未干预组，不做任何治疗，在建模成功后，１２小时，注射５６，二甲酰肼荧光素２５０ｐＬ以先前所设条件进行拍摄（成像前２小时中断饮食）；Ｂ组５一，建模成功后，４．小时，尾静脉注射地塞米松磷酸钠注射液次，进行３－．５小时后（以建模成功计８５６二甲酰肼荧ｉ干预治疗，，小时）注射６５０Ｌ，５素２ｊ以先前所设条件进行拍摄（成像前２小时中断饮食）；Ｃ组４一．５小时，建模成功后，，尾静脉注射地塞米松磷酸钠注射液次，进行７－干预治疗．５６二甲酰肼荧光，小时后（以建模成功计，１２小时）注射５５０，素２ｐＬ以先前所设条件进行拍摄２■（成像前小时中断饮食）；Ｄ组，尾静脉注射地塞米松磷酸钠注射液两次（以建模成功计，分别为４．５小８－时．５３．５６，小时），进行干预治疗，小时后（以建模成功计，１２小时）注射５，二甲酰肼荧光素２５０ｎＬ以先前所设条件进行拍摄（成像前２小时中断饮食）。４．３结果与讨论４．３．１实验结果（１）急性炎症模型的构建小鼠右下肢注射降植烷２４小时后，肉眼可见红肿，测量右侧下肢建模前后的５－－厚度和宽度，，建模小鼠掌部厚度增加０．１ｍｍ宽度增加０．２０．５ｍｍ不等不等，－此时认为建模成功，建模成功结果如图４１所示：３７ 陕西师范大学硕士学位论文ＵＨＶｈＢＨｍＭＭｍ图４－１急性关节炎模型造模结果⑵地塞米松磷酸钠注射液抗炎作用的成像表征Ａ组，即炎症未干预组，在建模成功后０小时和１２小时炎症昆明鼠的化学发光成像结果如下（蓝色圈为正常组织区域，绿色和红色圈均为炎症组织区域）：ＨＵＢ■６．０Ｈ４２＿ｒ１．７■Ｐ／ｓｅｃ／ｃｍ／ｓｑ图４－２Ａ组０小时（以建模成功计）化学发光成像３８ 第４章以急性炎症为模型的小动物药效评价ＷＷＩ－－－－－１００ｍｉｉｉ０１０ｍｉｎ１２２２ｉｎｉｎ２３３３ｍｉｎＩ：４．２Ｈ＿Ｐ’ｓｅｃ／ｃｎｉ７ｓｑ￣４７９－５９６０－７０ｍ３７ｍｍ４ｍｍｉｕ４－３Ａ组１２小时图（以建模成功计）化学发光成像＜８０ｘ１０■８＿ＱｘｌＱ６２ＳＳ■炎症组织？Ｉｌ丨卜、龍？￥一Ｉ卜：常组织１＾＂６？＇．０ｘ１０６ｇ！５．０ｘ１０■■０）ＣＣ＾？ｓ■ＳａｅＪ４，４＇■０ｘ１〇－■＾ｇ４．０Ｘ１０？＾ｇＳ＾＾ｗ＇４－．Ｓ２０ｘｗ－．ｌ（）２．〇ｘ＾ｌ〇？？＊？？，？■■〇（？￣￣，￣￣〇＞：．ｔ￣■■；一＂」．；■－．（—■＿—．■．１０２０４０６０８０１０００２０４０６０８０１００Ｔｉｍｅ（ｍｉｎ）Ｔｉｍｅ（ｍｉｎ）■ＯｈＩ丨．３〇：ｊｄ．Ｌ■，．■．Ｈ２０■＾Ｈ？－１０■－￣■￣￣￣￣￣￣￣￣￣ｏ■■．．Ｊ．．．．．０２０４０６０８０１００Ｔｉｍｅｍｉｎ（）４－４Ａ组给药前后化学发光信号与时间关系图（取组内均值作图）３９ 陕西师范大学硕士学位论文Ｂ一４一．５），即次剂量给药（以建模成功计，在小时给药次３．５组，小时后成像组，在给药前后炎症昆明鼠的化学发光成像结果如下（蓝色圈为正常组织区域，绿色和红色圈均为炎症组织区域）：－－－－－（ｉ１００ｍｉｎ０ｌ）ｍｉｎ１２２２ｍｉｉ２３３３ｍｉｎ■１．８ＩＸ４１°Ｉ■〇５■Ｐ／ｓｅｃ／ｃｍ／ｓｑ３７－４７ｍ－－ｉｎ４９５９ｍｉｎ６０７０ｎｉｉｎ图４－５Ｂ组给药前（以建模成功计０小时）化学发光成像结果，即Ｉ１ＭＭ１－Ｏ－Ｏ－－－ｉｍｎＯｎｉｉｎ１２２２ｎｕｉｉ２３ｎｕｎｌｌＯ３３＂Ｉ１．３｜Ｘ４１°０■．９■〇５■Ｐ／ｓｅｃ／ｃｎｉ／ｓｑ３７－ｉ－ｉ－７０ｎｉ４７ｍｎ４９５９ｎｉｉｉ６０ｉｎ４－Ｂ组给药后（以建模成功计图６，即８小时）化学发光成像结果４０ 第４章以急性炎症为模型的小动物药效评价—￣２．０ｘ１０；炎症组织２．０ｘ１０ｉＩ｜｜、伽？正職织控ＥＩ＇■？．正常组织．．４＇Ｊ１￡ｌ－ＳｘｌＯ一之．丨５ｘｌＯ＇？？ｓｆ画ＳＣ１．０ｘ１０＇？ｉ＇｜Ｉ１．０ｘ１０■？、５■．０ｘ１０５＾ｔ．０ｘ１０■■＾窆■？？？？＿＿０）ｔ．－ｉ－＿？＿＿．，＿！，１．ａ—ｔ，＿＿．ｔ？．—＿（，，；｜，〇．〇，，，；，｜１ｐ０２０４０６０８０１０００２０４０６０８０１００Ｔｉｍｅ（ｍｉｎ）Ｔｉｍｅ（ｍｉｎ）５０￣￣￣￣１■治疗前｜？治疗后１＿４０■■＿■＊３０■ｒｚ■Ｈ２０－？？？？－１０ｓｐｉ０２０４０６０８０１００Ｔｉｍｅ（ｍｉｎ）图４－７Ｂ组给药前后化学发光信号与时间关系）（取组内均值作图一一Ｃ组，．，．，即次剂量给药（以建模成功计在４５小时给药次）７５小时后成（，像组，在给药前后炎症昆明鼠化学发光成像结果如下蓝色圈为正常组织区域绿色和红色圈均为炎症组织区域）：４１ 陕西师范大学硕士学位论文－－－－－１００ｎｉｉｎ０ｌ（）ｍｉｎ１２２２ｍｉｎ２３３３ｎｉｉｎ６０曙國疆■，３７－－５９－４７ｍｉｎ４９ｉｎｉｎ６０７０ｍｉｉＰ／ｓｅｃ／ｃｎｉ／ｓｉｑ４－（图８Ｃ组给药前以建模成功计，即为０小时）化学发光成像结果－－－－２３－１００ｎｉｉｉｉ０１０ｉｎｉｎ１２２２ｎｉｉｉｉ３３ｍｉｎｕ６－〇ＨＨＨ＾ＭＭｙｉ：Ｐ／／ｎｉ／３７－４７ｍ－－ｓｅｃｃｓｉｎ４９５９ｍｉｎ６０７０ｍｉｎｑ４－９Ｃ组给药后（以建模成功计１２）图，小时化学发光成像结果４２ 第４章以急性炎症为模型的小动物药效评价———６０ｘ１０１０６０ｘ炎症组织■炎症组织｜？Ｅ？．Ｊ常组织丨，｜正常组织？■＾？安＾＂＊■４＇－１！４．０ｘ１０■■２Ｓ４．０ｘ１０■？＿？■Ｉ？｜｜￡－＾■＾＇＝４＾２－写与２．０ｘ１０．０ｘ１０＾＾＊Ｉ？｜■■（？４ｔ１？〇．＞■￣？．￣ｒ■￣？，￣１■Ｉ？，，０．０．＿＿１＊＿％，１％ｆ．．，，，０２０４０６０８０１００〇２０４０６０８０１００Ｔｉｍｅｍｉｎ（Ｔｍｉ）ｉｍｅｎ（）￣治疗前Ｉ：？ＭＭｌ：？！４５．■Ｈ？３０－＾Ｈ＿１５！〇０２０４０６０８０１００Ｔｉｍｅｍｉｎ（）４－图１０Ｃ组给药前后化学发光信号与时间关系（取组内均值作图）Ｄ组，即两次剂量给药（以建模成功计，分别在４．５小时，８．５小时尾静脉注射地塞米松），３．５小时后成像组，在给药前后炎症昆明鼠的化学发光成像结果如下（蓝色圈为正常组织区域，绿色和红色圈均为炎症组织区域）：ＩＵ８１－－０－－－１０Ｏｍｉｎ１０ｍｎ１２２２ｎｉｉｎ２３３３ｍｉｉｉｉ■ＭＭＨ■６０國ｍｉ：Ｐ／ｓｅｃ／ｃｎｉ／ｓｑ４－图１１Ｄ组给药前（以建模成功计，即为０小时）化学发光成像结果４３ 陕西师范大学硕士学位论文６．０匿－４７ｍ－ｉ６０－Ｐ／ｓｅｃ／ｃｎｉ／ｓ３７ｉｉｉ４９５９ｎｉｉｉ７０ｍｉｎｑ４－１２Ｄ图组给药后（以建模成功计１２），即为小时化学发光成像结果４６０ｘ１〇６０ｘ１０？■１ｍＭｓｉ１■．．Ｅ常组织＾年常组织☆？＇？ｆｉＳ４４■＊－４Ｃ之４．０ｘ１ｏ．０ｘｌ０ｇＳ＝ＩＳ１■＝ｅｇ＾＇、２．．０ｘ１Ｏ￡；２０ｘ１０ｇｆ＾＂＾＾Ｓ．－－０ａ—？？Ｓ￣ｓ＞８．ｔ＿ｔ，０．０？■■￣ｔ■１■Ｉ．０，，，＿，ｆ？，ｔｆ，，，＿０２０４０６０８０１０００２０４０６０８０１００ＴｉｍｅｍｉｎＴｉｍｅ（ｍｉｎ）（）￣６〇￣￣￣■治疗前■■｜｜？治疗后４－５Ｈ－Ｚ３０■Ｈ－１５■＃拳＊？？．？＊？ｉ０．．．．．．．，．０２０４０６０８０１００Ｔｉｍｅｍｉｎ（）图４－１３Ｄ组给药前后化学发光信号与时间关系（取组内均值作图）４４ 第４章以急性炎症为模型的小动物药效评价通过对四组模型鼠的成像结果进行分析：，发现了如下现象一１．Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ四组在给药前，即２４小时的节点上，成像信号出现了些差异。我们认为，这个差异是可以理解的：由于实验动物间的个体差异，使我们在同一时间建模的鼠，炎症的发展状况有所不同，因此活性氧水平不同；此外，每只实验动物对麻醉剂的耐受程度不一样，因此心跳等基本生命体征有所区别，会影响血液的携氧量；再者，每只实验动物对药物以及探针的运输也有所差异。２－．由Ａ组，即炎症未干预组在０小时和１２小时的化学发光成像图片（图４２，图４－３。）可知，在０小时到１２小时间，模型鼠炎症部位活性氧水平稳定对Ｔ／ＮＴ（图４４）在０小时和１２小时间进行比较，可以看出，在这两个时间节点，Ｔ／ＮＴ并没有明显差异。因此，认为该炎症模型在建模成功１２小时内，炎症水平恒定，一时间段内进行抗炎药物药效的表征可以在这。一Ｃ组的化学（３．经Ｂ组实验，即次剂量给药后３．５小时成像，发光成像图片图一－－４５，图４６）可看出。在同标度下，给药后３．５小时与给药前相比，炎症组织处（图４－发光信号明显下降。通过对化学发光信号的平均积分强度进行分析１０），我们发现给药后３．５小时，炎症组织处发光信号的平均积分强度约为给药前的二分之一。而Ｔ／ＮＴ值表明，在给药后３．５小时，炎症部位信号值下降明显，且治疗后的Ｔ－。证明在３／ＮＴ值在２３．５这个区间内．５小时时，地塞米松药效持续，能够对急性炎症进行抑制一４－．由Ｃ组，即次剂量给药，７．５小时后成像的化学发光成像图片（图４８，一图４－９）可知，在同标度的情况下，给药８小时后所拍摄的成像信号略低于给药前－。但经过对化学发光信号的平均积分强度进行分析（图４１０），我们发现给药后８小时所拍摄图片背景信号（即正常组织的信号）也较低，Ｔ／ＮＴ值在给药前与给药８小时后并无明显差异，此时地塞米松药效已经减弱，炎症水平恢复如给药前水平。对比Ｂ、Ｃ两组，我们可以知道，地塞米松磷酸钠注射液在使用说明建议的给，可以对急性炎症进行抑制，而在给药８小时后药时间，即４小时内，药物作用一减弱为零，炎症部位活性氧水平恢复至给药前，炎症水平与给药前保持致，此时药效消失。由Ｂ、Ｃ组实验我们知道了地塞米松磷酸钠注射液的药效无法维持较长的时间，那么给药剂量对炎症的抑制效果会不会有影响呢？因此我们做了Ｄ组实验。５．经Ｄ组实验，即两次剂量给药后３．５小时成像，Ｄ组的化学发光成像图片（图一４－－１１，图４１２）可看出。在同标度下，两次给药后３．５小时与给药前相比，炎症组织处发光信号明显下降。通过对化学发光信号的平均积分强度进行分析（图４５ 陕西师范大学硕士学位论文４－１３），我们发现两次给药后３．５小时，炎症组织处发光信号的平均积分强度约为一给药前的八分之。而Ｔ／ＮＴ值表明，在两次给药后３．５小时，炎症部位信号值下／ＮＴ值在－降明显，且治疗后的Ｔ１２这个区间内。对比Ｃ、Ｄ两组实验，我们可以看出Ｄ组即两次给药３．５小时拍摄组信号减弱更明显。因此，我们认为在急性炎症治疗的过程中，可以通，炎症抑制效果更好一过间隔一方式维持对炎症的抑制定时间多次给药这，从而起到对炎症的治疗作用。４．３．２小结本章节实现了对抗炎药物药效的化学发光活体成像表征。本文以小鼠急性关节炎为炎症模型，以糖皮质激素类抗炎药物地塞米松为治疗药物，进行药物干预，对药物干预前后的化学发光成像信号进行采集，通过对化学发光成像信号强度的一。分析，实现了对地塞米松药效的评价这表明，化学发光成像能够作为种有力的药物评价手段，为药效评价，药物筛选提供数据支持，也可以为药代动力学研。宄提供依据，为药物准确使用及个性化医疗提供支持４６ 第５章总结第５章总结５６－二甲酰肼焚光素对。根据本文探索了化学发光成像检测的多个应用途径，ＨＲＰＨＲＰ一灵敏检测的特点，通过携带标记的抗体靶向体内目标蛋白这方式，成功将化学发光成像对ＲＯＳ的检测，扩展到对多种体内蛋白的检测。又通过对肿瘤细胞膜蛋白的靶向，实现了对肿瘤的靶向，证明了先前设计思路在疾病诊断方面的应用前景一，为肿瘤检测以及肿瘤药物筛选提供了种更为简便，平价的策略。此外，成功的在小鼠急性关节炎模型中，对抗炎药物的作用时间及给药剂量进行了成像评价，证明了可以通过化学发光成像的方法对药效进行评价，为药代动力学研宄提供方法和依据，为药物的准确使用以及精准医疗提供依据。４７ 陕西师范大学硕士学位论文４８ 参考文献参考文献１ＦｒａａＨ．Ｆｉｒｅｆｌｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ：ａｈｉｓｔｏｒｉｃａｌｅｒｓｅｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｃｅｎｔｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔｓ．［］ｇｙｐｐｐｏ－ｔｏｃｈｅｍ．ｈｏｂｉｏｌｉ．２００８２：４６．［Ｊ］ＰｈＰｔｏ．Ｓｃ７１５８，（）Ｗ－２ＬｉａｎＹＷａｌｃｚａｋＰＢｕｌｔｅＪ．ＣｏｍａｒｉｓｏｎｏｆｒｅｄｓｈｉｆｔｅｄｆｉｒｅｆｌｌｕｃｉｆｅｒａｓｅＰ［］ｇ，，ｐｙｐｙＲＥ９ａｎｄｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌＬｕｃ２ａｓｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｉｍａｉｎｒｅｏｒｔｅｒｅｎｅｓｆｏｒｉｎｇｇｐｇｖ－ｉｖｏｉｍａｉｎｏｆｓｔｅｍｃｅｌｌｓ［Ｊ．Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｏｔ．２０１２１７（１）：４１４６．ｇｇ］ｐ，［３］ＳｅｌｉｇｅｒＨ，ＢｕｃｋＪ，ＦａｓｔｉｅＷ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｓｐｅｃｔｒａｌｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｆｉｒｅｆｌｙｌｉｇｈｔ［Ｊ］，Ｊ．－Ｇｅｎ．１．Ｐｈｓｉｏｌ９６４４８１：９５１０４．ｙ，（）［４］ＳｅｌｉｇｅｒＨ，ＭｃＥｌｒｏｙＷ．Ｔｈｅｃｏｌｏｒｓｏｆｆｉｒｅｆｌｙｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ：ｅｎｚｙｍｅｃｏｎｆｉｕｒａｔｉｏｎａｎｄｓｅｃｉｅｓｓｅｃｉｆｉｃｉｔＪ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９６４５２１：ｇｐｐｙ［］，，（）７５－８１．［５］ＣｚｕｐｒｙｎａＪ５ＴｓｏｕｒｋａｓＡ．ＦｉｒｅｆｌｙｌｕｃｉｆｅｒａｓｅａｎｄＲＬｕｃ８ｅｘｈｉｂｉｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｔｏｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓｉｎａｏｔｏｔｉｃｃｅｌｌｓＪ．ＰＬｏＳＯｎｅ２０１１６５：ｅ２００７３．ｙｐｐ［］，，（）６ＫｉｔａａｍａＡＹｏｓｈｉｚａｋｉＨＯｈｍｉａＹｅｔａｌ．Ｃｒｅａｔｉｏｎｏｆａｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅｆｉｒｅｆｌ［］ｙ，，ｙ，ｙｗ－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｉｔｈＨｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔｃｏｌｏｒＪ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ２００３ｐ［］，７７３－：３３３３３８．（）［７］ＭａｇｕｉｒｅＣＡ，ＤｅｌｉｏｌａｎｉｓＮＣ，ＰｉｋｅＬ，ｅｔａｌ．Ｇａｕｓｓｉａｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｖａｒｉａｎｔｆｏｒ－ｎｈｉｈｔｈｒｏｕｈｐｕｔｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｓｃｒｅｅｉｎａｌｉｃａｔｉｏｎｓＪ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００９８１１６：ｇｇｇｐｐ［］，（）７－１０２７１０６．［８］ＢｈａｕｍｉｋＳ，ＧａｍｂｈｉｒＳ．ＯｐｔｉｃａｌｉｍａｇｉｎｇｏｆＲｅｎｉｌｌａｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｒｅｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅｍ－ｅｘｒｅｓｓｉｏｎｉｎｌｉｖｉｎｉｃｅＪ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ２００２９９１：３７７３８２．ｐｇ［］，，（）［９］ＬｕｋｅｒＫＥ，ＬｕｋｅｒＧＤ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｉｍａｇｉｎｇｔｏａｎｔｉｖｉｒａｌｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄｔｈｅｒａｐｙ：ｍｕｌｔｉｐｌｅｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｅｎｚｙｍｅｓａｎｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ａｎｔｉｖｉｒａｌ．Ｒｅ－ｓ．２００８７８３：１７９１８７．，（）［１０］ＺｈａｏＨＤｏｌｅＴＣＷｏｎＪｅｔａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅａｎａｌｏｓｆｏｒ，ｙ，ｇＲ，ｇｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓｏｆＲｅｎｉｌｌａｌｕｃｉｆｅｒａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｌｉｖｅｃｅｌｌｓａｎｄｌｉｖｉｎａｎｉｍａｌｓＪ．ｇ［］０－：４．Ｍｏｌ．Ｉｍａｇ．２０４３（１）４３５，［１１］ＬｏｅｎｉｎｇＡＭ，ＦｅｎｎＴＤ，ＷｕＡＭ，ｅｔａｌ．ＣｏｎｓｅｎｓｕｓｇｕｉｄｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｏｆＲｅｎｉｌｌａｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｉｅｌｄｓｅｎｈａｎｃｅｄｓｔａｂｉｌｉｔａｎｄｌｉｈｔｏｕｔｕｔＪｒｔｉ．Ｅ．Ｄｅｓ．Ｓｌｙｙｇｐ］．Ｐｏｅｎｎｅ．［ｇ－２００６１９９：３９１４００．，（）４９ 陕西师范大学硕士学位论文－ｒａｕｉｒｒｅ－［１２ＬｏｅｎｉｎＡＭＤｌｅｓｃｕＡｎｄｒａｓｉＡＧａｍｂｈＳＳ．ＡｄｓｈｉｆｔｅｄＲｅｎｉｌｌａ］ｇ，ｇ，ｅｒａａｎｎｒｅｒｒ－ｎａｌｕｃｉｆｓｅｆｏｒｔｒｓｉｅｔｐｏｔｅｇｅｎｅｅｘｒｅｓｓｉｏＪ．Ｎｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２０１０７１：ｐ［］，？（）￣５６．１３ＬｏｅｎｎＷｕＡＭｒｅ－ｅｎａｒｅｎｎｉＡＭＧａｍｂｈｉＳＳ．ＲｄｓｈｉｆｔｅｄＲｉｌｌｉｆｏｎｉｓｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ［］ｇ，？－ｖａｒｉａｎｔｓｆｏｒｉｍａｇｉｎｉｎｌｉｖｉｎｓｕｂｅｃｔｓＪ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２００７４８：６４１６４３．ｇｇｊ［］，，（）１４ＭａｕｉｒｅＣＡＤｅｌｉｏｌａｎｉｓＮＣＰｉｋｅＬＮｉｅｒｓＪＭｅｔａｌ．Ｇａｕｓｓｉａｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｖａｒｉａｎｔ［］ｇ？？５，ｆｏｒｈ－ｔｉｈｔｈｒｏｕｈｕｔｆｕｎｃｉｏｎａｌｓｃｒｅｅｎｉｎａｌｉｃａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００９ｇｇｐｇｐｐ，８１－１１１６：７０２７０６．（）１５ＴａｎｎｏｕｓＢＡ．Ｇａｕｓｓｉａｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｒｅｏｒｔｅｒａｓｓａｆｏｒｍｏｎｉｔｏｒｉｎｂｉｏｌｏｉｃａｌ［］ｐｙｇｇ４－ｒｏｃｅｓｓｅｓｉｎｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｉｎｖｉｖｏＪ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２００９４：５８２５９１．ｐ［］，（）１６ＢｏｖｅｎｂｅｒＭＳＳＤｅｅｌｉｎＭＨＴａｎｎｏｕｓＢＡ．ＥｎｈａｎｃｅｄＧａｕｓｓｉａｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｂｌｏｏｄ［］ｇ，ｇｇ，ａｓｓａｆｏｒｍｏｎｉｔｏｒｉｎｏｆｉｎｖｉｖｏｂｉｏｌｏｉｃａｌｒｏｃｅｓｓｅｓＪ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０１１８４２：ｙｇｇｐ［］，（）－１１８９１１９２．［１７］ＭａｇｕｉｒｅＣＡ５ＤｅｌｉｏｌａｎｉｓＮＣ？ＰｉｋｅＬ，ｅｔａｌＧａｕｓｓｉａｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｖａｒｉａｎｔｆｏｒｈ－ｉｈｔｈｒｏｕｈｕｔｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｓｃｒｅｅｎｉｎａｌｉｃａｔｉｏｎｓＪ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００９８１１６：ｇｇｐｇｐｐ［］，（）７－１０２７１０６．［１８］ＷｕｒｄｉｎｇｅｒＴ？ＢａｄｒＣ，ＰｉｋｅＬ，ｅｔａｌ．Ａｓｅｃｒｅｔｅｄｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｆｏｒｅｘｖｉｖｏｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇｏｆｖｏ－ｉｎｖｉｒｏｃｅｓｓｅｓ［Ｊ］．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２００８５２：１７１１７３．ｐ，，（）［１９］ＢａｄｒＣＥ，ＨｅｗｅｔｔＪＷ，ＢｒｅａｋｅｆｌｅｌｄＸＯ，ｅｔａｌ．ＡｈｉｇｈｌｙｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｓｓａｙｆｏｒｍｏｎｉｔｏｒｉｎｔｈｅｓｅｃｒｅｔｏｒａｔｈｗａａｎｄＥＲｓｔｒｅｓｓＪ．ＰＬｏＳＯｎｅ２００７２６：ｅ５７１．ｇｙｐｙ［］，，（）ｒａｍａｔｓｕｓａ－［２０］ＨｉＮＫａｉＡ，ＨａａｋａｗａＫｅｔａｌ．Ｓｅｃｒｅｔｅｄｒｏｔｅｉｎｂａｓｅｄｒｅｏｒｔｅｒ，ｙ，ｐｐｓｙｓｔｅｍｓｆｏｒｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｅｖｅｎｔｓ：ｃｒｉｔｉｃａｌｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｂｙｅｎｄｏｌａｓｍｉｃｙｐｍｍｕｎｏ－ｒｅｉｃｕｌｕｍｓｔｒｅｓｓｌｅｈｏｄ：ｔＪ．Ｊ．Ｉ．Ｍｔｓ．２００６３１５（１）２０２２０７．［］，ｓ－ｅｒｎａｎｄｅｚｅａ－２１ＴａｎｎｏｕＢＡＫｉｍＤＥＦＪＬｔｌ．ＣｏｄｏｎｏｔｉｍｉｚｅｄＧａｕｓｓｉａｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ［］，，？ｐｃＤＮＡｆｏｒｍａｍｍａｌｉａｎｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｉｎｖｉｖｏ［Ｊ］，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００５，－１１３：４３５４４３．（）２２ＳａｎｔｏｓＥＢＹｅｈＲＬｅｅＪｅｔａｌ．ＳｅｎｓｉｔｉｖｅｉｎｖｉｖｏｉｍａｉｎｏｆＴｃｅｌｌｓｕｓｉｎａ［］，，，ｇｇｇｍｅｍｂｒａｎｅｂｏｕｎｄＧａｕｓｓｉａｐｒｉｎｃｅｐｓｌｕｃｉｆｅｒａｓｅＪ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００９１５３：［］，（）－３３８３４４．２３ＺｉｅｌｅｒＭＢａｌｄｗｉｎＴＯ．ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅＪ．Ｃｕｒｒ．Ｔｏ．［］ｇ，ｙ［］ｐｅｎｅ－Ｂｉｏｒｇ．１９８１１２：６５１１３．，－Ｍａ２４ＴｕＳＣｅｒＨＩ．ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｂｉｏｌｎｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅＪ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．［］，ｇｙ［］Ｐｈｏ－ｔｏｂｉｏｌ．１９９５６２４：６１５６２４．，（）５０ 参考文献２５ＤｅｒｚｅｌｌｅＳＤｕｃｈａｕｄＥＫｕｎｓｔＦｅｔａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄ［］，，，，，ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆａｃｌｕｓｔｅｒｏｆｅｎｅｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｃａｒｂａｐｅｎｅｍｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｇＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓＪ．Ａｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００２６８８：［］ｐｐ，（）－３７８０３７８９．２６ＭｅｉｈｅｎＥＡ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅＪ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．［］ｇｇｙ［］－１９９１５５１：１２３１４２．，（）［２７］ＣｏｎｔａｇＣＨ，ＣｏｎｔａｇＰＲ，ＭｕｌｌｉｎｓＪＩ，ｅｔａｌ．Ｐｈｏｔｏｎｉｃｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌ－ａｔｈｏｅｎｓ：ｉｎｌｉｖｉｎｈｏｓｔｓＪ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９５１８４５９３６０３．ｐｇｇ［］，（）２８Ｆｒａｎｃ－ｔｔｉｓＫＰＪｏｈＤＢｅｌｌｉｎｅｒＫａｗａｈａｒａＣｅｔａｌ．Ｍｏｎｉｏｒｉｎｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎ［］，，ｇ５ｇＳｔａｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓｉｎｌｉｖｉｎｍｉｃｅｕｓｉｎａｎｏｖｅｌｌｕｘＡＢＣＤＥｐｇｇｍｍｕｎ－ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ［Ｊ］．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉ．２０００，６８（６）：３５９４３６００．－Ｍ－ａｖｅ２９ｉｎＪＪＮｕｅｎＶＨＫｉｍＨＪｅｔａｌ．ｕａｎｔｉｔｔｉｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｉｍａｉｎｏｆ［］，ｇｙ，，Ｑｇｇ－ｔｕｍｏｒ－ｔａｒｅｔｅｒａｎｖｎａｎａａｏｃｉｎｂａｃｔｉｉｌｉｉｇｉｍｌｓＪ．Ｎｔ．Ｐｒｔｏ．２００８３４：６２９６３６．ｇｇ［］，（）３０－Ｊ－ＪＰａｒｋＪＨｅｖｅｒｅａ－ｍＭｉｎＪＫｉｍＨｔａｌ．Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｌｔｉｅｉｍａｉｎｏｆｔｕｍｏｒｓａｎｄ［］，，，ｇｇ－ｍｅ－ｔｔａｓｔａｓｅｓｕｓｉｎｇｔｕｍｏｒｔａｒｇｅｔｉｎｇｌｉｇｈｅｍｉｔｔｉｎｇＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｉｍａ．］ｇＢ－ｉｏｌ．２００８１０１：５４６１．，（）３１ＣｏｎｔａＣＨＢａｃｈｍａｎｎＭＨ．Ａｄｖａｎｃｅｓｉｎｉｎｖｉｖｏｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｉｍａｉｎｏｆ［］ｇ，ｇｇｆ－ｅｎｅｅｘｒｅｓｓｉＪ：ｏｎ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎ．２００２４２３５２６０．ｇｐ［］ｇ，３２］ＭｃＬａｕｈｌｉｎＨＰ，ＣａｓｅＰＧ＾ＣｏｔｅｒＪ？ｅｔａｌ．ＦａｃｔｏｒｓａｆｆｅｃｔｉｎｓｕｒｖｉｖａｌｏｆＬｉｓｔｅｒｉａ［ｇｙｇｍｏｎｏｃｔｏｅｎｅｓａｎｄＬｉｓｔｅｒｉａｉｎｎｏｃｕａｉｎｓｏｉｌｓａｍｐｌｅｓＪ．ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｙｇ［］ｇｙ，２０－１１１９３ｌｌ：７７５７８５．，（）３３ＧｕｏＹ，ＲａｍｏｓＲＩ，ＣｈｏＪＳ？ｅｔａｌ．Ｉｎｖｉｖｏｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｉｍａｇｉｎｇｔｏｅｖａｌｕａｔｅ［］ｍ－ａｃ－ｓｙｓｔｅｉｃａｎｄｔｏｐｉｃａｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓａｇａｉｎｓｔｃｏｍｍｕｎｉｔｙｑｕｉｒｅｄｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｔ－ＳｔａｈｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓｉｎｆｅｃｔｅｄｓｋｉｎｗｏｕｎｄｓｉｎｍｉｃｅＪ．ＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂＡｅｎｔｓｐｙ［］ｇＣｈｅｍｏ－ｔｈｅｒ２０１３５７２：８５５８６３．，，（）［３４］ＪａｗｈａｒａＳ？ＭｏｒｄｏｎＳ．ＭｏｎｉｔｏｒｉｎｇｏｆｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌａｃｔｉｏｎｏｆｌａｓｅｒｂｙｉｎｖｉｖｏｉｍａｉｎｏｆｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＥ．ｃｏｌｉｉｎａｃｕｔａｎｅｏｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．ａｓｅｒｓｅｄ．ｇｇｗｏｕｎｄ［Ｊ］ＬＭＳｃ—ｉ．２００６２１３：１５３１５９．，（）－－ｎｃｅ３５ＴｏｒｒｅｓＡＧｉＲｏａｓｅｚｅｔａＩｎｖｉｖｏｂｉｏｌｕｍｉｎｅｉｍａｉｎ］，ＣｅｚａＲＪ，ＬｏｐＭ，ｌｓｃｅ［ｊｇｇｏｆＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ０１０４：Ｈ４ａｎｄｒｏｌｅｏｆａｅｒｏｂａｃｔｉｎｄｕｒｉｎｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎｏｆａｇｍｏｕｓｅｍｏｄｅｌｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｎＪ］．ＢＭＣＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１２，１２：１１２．［３６ＣａｍｂｅｌｌＪＨｕａｎＹＬｉｕＹｅｔａｌ．ＢｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅＩｍａｉｎｏｆＣｈｌａｍｄｉａ［］ｐ５ｇ，，ｇｇｙｒｕｍｎｄｉｎＩｎｆｅｃｔｉｉｎｉｃｅＳＯＮＥ２０４９：ｅ６３４．ｍｕｒｉｄａＡｓｃｅｏｎＭＪ］．ＰＬｏ１７ｌ０１ｇ［，，（）５１ 陕西师范大学硕士学位论文［３７］ＨａｒｄｙＪ，ＦｒａｎｃｉｓＫＰ，ＤｅＢｏｅｒＭ，ｅｔａｌ．ＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＬｉｓｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓｉｎｔｈｅｍｕｒｉｎｅｇａｌｌｂｌａｄｄｅｒ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００４，３０３（５６５９）：－８５１８５３．３８ＪｅｎｋｉｎｓＤＥＯｅｉＹＨｏｍｉＹＳｅｔａｌ．ＢｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔｉｍａｉｎＢＬＩｔｏｉｍｒｏｖｅ［］，，ｇ，ｇｇ（）ｐａｎｄｒｅｆｉｎｅｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｍｕｒｉｎｅｍｏｄｅｌｓｏｆｔｕｍｏｒｇｒｏｗｔｈａｎｄｍｅｔａｓｔａｓｉｓＪ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘ．］［ｐ２０８－Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．２００３；７３３７４４．，（）３９ＶｅｅｎｅｎｄａａｌＬＭＨｉｌｌｅｅｒｓｂｅｒＲＶＳｍａｋｍａｎＮｅｔａｌ．Ｓｎｅｒｉｓｔｉｃｅｆｆｅｃｔｏｆ［］，ｇｇ，，ｙｇｔｓｅｒｏａｒｕｃｎｉｎｅｒｓｔｉｔｉａｌｌａｃｇｕｌａｔｉｏｎａｎｄｄｏｘｏｂｉｉｎｉａｍｕｒｉｎｅｔｕｍｏｒｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅｍｏｄｅｌ－ｏｆａｒ－ｓｏｌｉｔａｒｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｌｉｖｅｒｍｅｔｓｔａｓｉｓＪ．Ａｎｎ．Ｓｕ．Ｏｎｃｏｌ．２００６１３２：１６８１７５．ｙ［］ｇ，（）４０ＳｍａｋｍａｎＮＫｒａｎｅｎｂｕｒ０ｅｔａ－ＭａｒｔｅｎｓＡｌ．Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎｏｆｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ［］，，ｇ，ｉｍａｉｎｏｆｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｌｉｖｅｒｍｅｔａｓｔａｓｅｓｉｎｔｈｅｍｏｕｓｅ［Ｊ］．Ｊ．Ｓｕｒ．Ｒｅｓ－２００４１２２２：ｇｇｇ，（）２２５－２３０．－４１Ｎｏ－ｔｔｉｎＩＣＢｕｉｓＪＴｕｅＩｅｔａｌ．Ｗｈｏｌｅｂｏｄｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔｉｍａｉｎｏｆｈｕｍａｎ［］ｇ５ｊ？Ｑ，ｙｇｇｕｖｅａｌｍｅｌａｎｏｍａｉｎａｎｅｗｍｏｕｓｅｍｏｄｅｌｏｆｌｏｃａｌｔｕｍｏｒｒｏｗｔｈａｎｄｍｅｔａｓｔａｓｉｓＪ．ｇ［］ｎｖｅｌｍｏｌｓＳｃｉ４６－：１Ｉｓｔ．Ｏｐｈｔｈａ．Ｖｉ．．２００５５５８１１５８７．，（）４２ＭｏｕｃｈｅｓｓＭＬＳｏｈａｒａＹＮｅｌｓｏｎＭＤｅｔａｌ．Ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌｉｍａｉｎａｎａｌｓｉｓｏｆ［］？，Ｓｇｇｙｔｕｍｏｒｒｏｒｅｓｓｏｎａｎｄｏｎｅｒｏｎｎｍｕ－ｒｉｎｅｃａｎｃｅｒｍｏｅｍｕｉｂｒｅｓｏｔｉｉａｄｌＪ．ＪＣｏｔｐｇｐ［］ｐｒ－Ａｓｓｉｓｔ：Ｔｏｍｏｇ．２００６３０３５２５５３４．，（）Ｋ－［４３］ＮｏａＭＹｕａｓａＴｉｍｕｒａＳｅｔａｌ．Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｌａｂｅｌｅｄｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｇｗ，，，ｇｇｒｏｗｔｈａｎｄｍｅｔａｓｔａｓｉｓｉｎｄｉｆｅｒｅｎｔｉｎｖｉｖｏｍｏｄｅｌｓ［Ｊ］．ＣａｎｃｅｒＬｅｔ．２００５，２１７２）：（２４３－２５３．４４ＣａｃｅｒｅｓＧＺｈｕｘ－［］Ｊｉａｏｅｔａｌ．ＩｍａｉｎｏｆｌｕｃｉｆｅｒａｓｅａｎｄＧＦＰｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｈｕｍａｎ，ｙ，，ｇｇｔ－ｕｍｏｒｓｉｎｎｕｄｅｍｉｃｅＪ］．Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ２００３１８４：２１８２２３．［，，（）［４５］ＣｈｅｎＸ，ＬａｒｓｏｎＣＳ，ＷｅｓｔＪ，ｅｔａｌ．ＩｎｖｉｖｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｅｘｔｒａｐａｎｃｒｅａｔｉｃｉｎｓｕｌｉｎｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｄｉａｂｅｔｉｃｍｉｃｅｂｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｉｍａｉｎｇＪ．ＰＬｏＳＯｎｅｇｙｇ［］，２０１０５（２：ｅ９３９７．，）—４６ＳｍｉｔｈＰＧＯａｋｌｅＦｅｒｎａｎｄｅｚＭｅｔａｌ．Ｈｅｉｅｓｖｉｒｕｓｓａｉｍｉｒｉｂａｓｅｄｖｅｃｔｏｒ［］，ｙＦ，，ｐｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｕｓｉｎｇｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅｏｐｔｉｃａｌｉｍａｇｉｎｇＪ，ＧｅｎｅＴｈｅｒ．２００５１２：１４６５［］，－１４７６．４７ＣｈｏｕＣＫＨｕｎＪＹＬｉｕＪＣｅｔａｌ．ＡｎａｔｔｅｎｕａｔｅｄＳａｌｍｏｎｅｌｌａｏｒａｌＤＮＡｖａｃｃｉｎｅ［］，ｇ，，ｐｒｅｖｅｎｔｓｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａａｎｄｃｏｌｏｎｃａｎｃｅｒｔｈａｔｅｘｐｒｅｓｓ？—ｌｈａｆｅｔｔｉＪ．ＣＧＴｈ．２００６１３８：７４６７５２ａｐｏｐｒｏｅｎａｎｃｅｒｅｎｅｅｒ．［］，（）［４８］ＨａｒｌａａｒＮＪ，ＨｅｓｓｅｌｉｎｋＪＷ，ＪｏｎｇＪＳ，ｅｔａｌ，ＢｉｏｌｘｕｎｉｎｅｓｃｅｎｃｅａｓＧｏｌｄＳｔａｎｄａｒｄｆｏｒ５２ 参考文献ＶａｌｉｄａｔｉｏｎｏｆＯｐｔｉｃａｌＩｍａｇｉｎｇＭｏｄａｌｉｔｉｅｓｉｎＰｅｒｉｔｏｎｅａｌＣａｒｃｉｎｏｍａｔｏｓｉｓＡｎｉｍａｌＪＥｕｒ－Ｍｏｄｅｌｓ．Ｓｕｒ．Ｒｅｓ．２０１０４５：３０８３１３［］，ｇ，４９Ｂ－［ＮｏｎｒｅｅｎＳｉｒａｉｌａｌＥｌＺａｈａｂＳｕｚａｎａＨａｍｄａｎｅｔａｌ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ］ｊ，，，，ｍ－ＰｈｏｓｈｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｎｄＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅＪ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅ．２０１６８８：１７０２０２．ｐ，［］，［５０］Ｄ．Ｆ．Ｒｏｓｗｅｌｌ，Ｅ．Ｈ．Ｗｈｉｔｅ．Ｔｈｅｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｏｆｌｕｍｉｎｏｌａｎｄｒｅｌａｔｅｄｍｏ－ｈｄｒａｚｉｄｅｓ［Ｊ］．ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｌ１９７８，５７：４０９４２３．ｙｙ，［５１］Ｒ．Ａ．ＲａｄｉＨ＊ＲｕｂｂｏＥ．Ｐｒｏｄａｎｏｖ．Ｃｏｍａｒｉｓｏｎｏｆｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｓｕｅｒｏｘｉｄｅ，，ｐｐｄｉｓｍｕｔａｓｅａｎｄｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｃｏｎｌｕｍｉｎｏｌｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙ－ｘａｎｔｈｉｎｅｏｘｉｄａｓｅｃａｔａｌｚｅｄｒｅａｃｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｈｓ．Ａｃｔａ１９８９９９４１：ｙｐｙ，，（）８９－９３．［５２Ｒ．ＲａｄｉＨ．ＲｕｂｂｏＬ．Ｔｈｏｍｓｏｎｅｔａｌ．Ｌｕｍｉｎｏｌｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｕｓｉｎ］，，，ｇｘａｎｔｈｉｎｅａｎｄｈｙｏｘａｎｔｈｉｎｅａｓｘａｎｔｈｉｎｅｏｘｉｄａｓｅｓｕｂｓｔｒａｔｅｓＪ．Ｅ，ＰｒｏｄａｎｏｖＦｒｅｅｐ［］，ａｄｃａ－Ｒｉ：ｌＢｉｏｌ．Ｍｅｄ．１９９０８２１２１１２６．，（）５３Ｅ．Ｈ．ＪａｎｓｅｎＲ．Ｈ．ｖａｎｄｅｎＢｅｒＧ．Ｚｏｍｅｒ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎ［］，ｇ，－ｎｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆａｎｅｗｅｎｚｙｍｅｌａｂｅｌｐｒｏｄｕｃｉｎｇａｌｏｎｇｔｅｒｍｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｔ－ｓｉｎａｌＪ，Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．１９８９４１：１２９１３５．ｇ［］，（）［５４］Ａ．Ａ．Ａｋｈｒｅｍ，Ｇ．Ｎ．Ｓｅｍｅｎｋｏｖａ，Ｓ．Ｎ．Ｃｈｅｒｅｎｋｅｖｉｃｈ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｏｆ－ｌｕｍｉｎｏｌｃａｕｓｅｄｂｙｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｏｆｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅＰ４５０ａｎｄｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅＣｗｉｔｈｃｕｍｅｎｅｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ：ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｓｔｕｄｉｅｓ．ＢｉｏｍｅｄＪ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ１９８５系［］，，４４－－（１１１２：１５９１１５９７．）Ａ－５５．Ｖ．ＫｏｚｌｏｖＡ．Ｎ．ＯｓｉｏｖＶｌａｄｉｍｉｒｏｖＩｕＡ．Ａｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｌｕｍｉｎｏｌｄｅｅｎｄｅｎｔ［］，ｐ，ｐｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｏｆｈｕｍａｎｓｅｒｕｍｉｎｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆｈｙｄｒｏｇｅｎｐｅｒｏｘｉｄｅ［Ｊ，］Ｂ－ｉｏｆｉｚｉｋａ１９９０３５２：３４７３４９．，，（）－ｍｏｎ５６ＸｉｕａｎＴａｎＺｈｅｎｈｕａＳｏｎ．ＨｕｍａｎＳａｌｉｖａＢａｓｅｄｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｉｔｏｒｉｎｏｆ［］ｊ，ｇｇＱｇｃｌａｒｉｔｈｒｏｍｃｉｎｂｆｌｏｗｉｎｊｅｃｔｉｏｎｃｈｅｍｉｌｉｕｎｉｎｅｓｃｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ：ＡｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｙｙｐｕｄＪ－ｓｔ，Ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４１７２：１３２０１３３１．ｙ［］ｐｐ，［５７］ＸｉａｏｈｕａＬｉ，ＺｈｕｊｕｎＺｈａｎｇ，ＬｉａｎｇＴａｏ，ｅｔａｌ．ＡｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏａｒｒａｙｂａｓｅｄｏｎｃａｔａｌｙｓｉｓｂｙＣｅ〇２ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓａｎｄｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｒａｔｅｏｆｒｅｍｏｖａｌｏｆｈｙｄｒｏｇｅｎｐｅｒｏｘｉｄｅｂｙｈｕｍａｎｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ［Ｊ］．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ－．２０１３１７１１．：６３７，［５８］ＬｉｎｆｅｎＹｕ，ＱｕｎＬｉ，ＨｏｎｇｗｅｉＧａｉ，ｅｔａｌ．ＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒｅｓｐｏｎｓｅｏｆｍｕｒｉｎｅｍａｃｒｏｈａｅｓｏｎｍｕｌｉｌｕｉｄｉｃｃｈｉｉｏｃｈｅｍｏｔｅｃｈｎｏｌｐｇｌｔｉａｙｅｒｍｃｒｏｆｐｓＪ，Ａｌ．Ｂ．Ｂｉ．［］ｐｐ２０１２６６－１：７８６７９５．，５３ 陕西师范大学硕士学位论文５９Ｍ．Ｐ．ＷｍａｎｎＰ．ｖｏｎＴｓｃｈａｍｅｒＤ．ＡＤｅｒａｎｌｅａｕ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ［］ｙ，，Ｈ２Ｏ２ｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙｈｕｍａｎｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓｄｕｒｉｎｇｔｈｅｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｂｕｒｓｔ［Ｊ］，Ａｎａｌ．Ｂ５－ｉｏｃｈｅｍ．１９８７１６２：３７１３７８．，（）６０Ｒ．ＬｏｃｋＡ．ＪｏｈａｎｓｓｏｎＫ．Ｏｒｓｅｌｉｕｓｅｔａｌ．Ａｎａｌｓｉｓｏｆｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ［］，，，ｙｅｒｏｘａ－ａｍｕｍｎｅｓｃｅｎｃｅｒｒｉｄｓｅｌｉｆｉｅｄｃｈｅｍｉｌｉｏｄｕｃｅｄｂｙｈｕｍａｎｎｅｕｔｏｈｉｌｓｒｅｖｅａｌｓｐｐｐｐａｒｏｌｅｆｏｒｔｈｅｓｕｅｒｏｘｉｄｅａｎｉｏｎｉｎｔｈｅｌｉｈｔｅｍｉｔｉｎｒｅａｃｔｉｏｎＪ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｐｇｇ［］－１９８８１７３２４５０４５５．：，（）６１Ｒ．ＴａｋａｈａｓｈｉＫ．ＥｄａｓｈｉｅＥ．Ｆ．Ｓａｔｏｅｔａｌ．Ｌｉｉｍｉｎｏｌｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅａｎｄ［］，ｇ，，ａｃｔｉｖｅｏｘｅｎｅｎｅｒａｔｉｏｎｂａｃｔｉｖａｔｅｄｎｅｕｔｒｏｈｉｌｓＪ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｈｓ．ｙｇｇｙｐ［］ｐｙ－１９９１２８５２：３２５３３０．，（）６２Ｐ．Ａ．ＡｎｔｏｎＳ．Ｒ．ＴａｒａｎＳ．Ｒ．Ｖｉｎａｅｔａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｄｎｅｕｔｒｏｈｉｌ［］，ｇ，ｇ，ｐｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｉｎｆａｍｉｌｉａｌｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａｎｆｅｖｅｒＪ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８８［］，８２－（：１４８１５６．）［６３］Ｂ．Ａｓｍａｎ，Ｋ．Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ，Ｐ．Ｗｉｊｋａｎｄｅｒ，ｅｔａｌ．ＰｅｒｉｐｈｅｒａｌＰＭＮｃｅｌｌａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｒｅｌａｔｉｏｎｔｏｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｊｕｖｅｎｉｌｅｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｔｉｓ［Ｊ］，Ｊ，Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．１９８８，９６（５）：４－１８４２０．６４Ｂ．Ｉ．Ｃｏｂｌｅ，Ｇ．ＢｒｉｈｅｉｍＣ．Ｄａｈｌｒｅｎ，ｅｔａｌ．ＦｕｎｃｔｉｏｎｏｆＥｘｕｄａｔｅＮｅｕｔｒｏｈｉｌｓｆｒｏｍ［］，ｇｐｍｍｕｎｏ－ＳｋｉｎｉｎＰｓｏｒｉａｓｉｓＪ．ＡｌｌｅｒＡｌ．Ｉｌ．１９８８８５：３９８４０３．［］ｇｙｐｐ，６５Ｐ．ＬＰｏｏｖＩ．Ｍ．ＲｏｓｌｙｉＶ．Ａ．Ｍａｌｏｖｅｔａｌ．Ｔｈｅｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｏｆｔｈｅ［］ｐ，，，ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓｉｎｆｏｏｄｐｏｉｓｏｎｉｎｇＪ．ＴｅｒＡｒｋｈ．１９９０６２１１：［］，（）２８－３０．６６］Ｋ．Ｄａｌｈｏｆ，Ｊ．Ｂｒａｕｎ，Ｈ．Ｋｏｔｈｅ，ｅｔａｌ．ＯｘｉｄａｔｉｖｅＭｅｔａｂｏｌｉｓｍｏｆＰｕｌｍｏｎａｒｙ［ｅ－ＰｈａｇｏｃｙｔｓｉｎＡｃｕｔｅＰｎｅｕｍｏｎｉａＪ．Ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ１９９４６１：１４４１４９．［］，，［６７］Ｋ．Ｍａｒｋｉｅｗｉｃｚ，Ｊ．Ｋａｎｔｏｒｓｋｉ，Ｐ．Ｍａｌｅｃ，ｅｔａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｏｆｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ，ｐｒｏｐｒａｎｏｌｏｌ，ａｎｄｖｅｒａｐａｍｉｌｏｎｔｈｅｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｏｆｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓｉｎｄｕｏｄｅｎａｌｕｌｃｅｒａｅｒ－－ｔｉｅｎｔｓＪ．Ａｒｃｈ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｈ．Ｅｘ．１９８９３７１２：１４１１４７．ｐ［］ｐ，（）［６８］Ｍ．Ｗｅｉｓｓ，Ｎ．Ｍｉｒｏｗ，Ａ．Ｂｉｒｋｈａｈｎ，ｅｔａｌ．ＢｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓａｎｄｔｈｅｉｒＳｏｌｖｅｎｔｓＩｎｆｌｕｅｎｃｅＮｅｕｆｒｏｈｉｌＧｒａｎｕｌｏｃｔｅＦｕｎｃｔｉｏｎＪ．Ｂｒ．Ｊ．Ａｎａｅｓｔｈ．１９３３７０３：ｐｙ［］，（）３１７－３２１．Ｍ－６９．Ｍ．ＢｅｄｎａｒＲ．ＨｏｏｌｅＲ．Ｔａａｎｅｓｅｔａｌ．ｉｃｌｉｄｉｎｍｅｎｔｓｌｕｍｉｎｏｌ［］．ＤＴｏｅａｕ，ｙ，ｐ，ｐｇｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｈｅｍｉｌｍｎｉｎｅｓｃｅｎｃｅｉｎｈｕｍａｎｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ［Ｊ］．Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．－１９９５１０２：８５８９．，（）－Ｍｏｒｄ７０］Ｌ．Ａ．ＰｉｅｒｃｅＷ．Ｏ．ＴａｍｏｗｉＩ．Ａ．Ｃｒｅｅ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｅｆｆｅｃｔｓｏｎｈａｏｃｔｅ［，，ｐｇｙ５４ 参考文献ｃｈｅｍｎ－ｉｌｕｍｉｎｅｅｎｃｅｉｎｖｉｒｏＪＣｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｒｅｓ９９２：９９８ｓｃｔ［］．Ｉｔ．Ｊ．１５２５３．，，（）７１Ｍ．ＲｉｓｔｏｌａＭ．ＬｅｉｒｉｓａｌｏＲｅｏＨ．Ｒｅｐｏ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｏｘｙｅｎｒａｄｉｃａｌ［］，ｐ，ｇｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎｓｐｏｎｄｙｌｏａｒｔｈｒｏｐａｔｈｉｅｓｂｙｗｈｏｌｅｂｌｏｏｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅＪ．Ａｎｎ．［］－Ｒｈ＿．Ｄｉｓ１９９１５０１１：７８２７８６．，（），７２ＡａｎｒｏｖｉｃｕｍｉｎｕｍＳａｌｉｍｕａｅ－ａｎｃｅｄ．ＳｔｋｏｖｉｃＤ．Ｒ．Ｍｉｔ．ＡｌｔｓＳｔｌｔＬｕｍｉｎｏｌＥｎｈ［］，ＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙＨｕｍａｎＮｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓＪ］．ＦｒｅｅＲａｄｉｃ．Ｒｅｓ．［－Ｃｏｍｍｕｎ１９９１１４：４７５５．，，７３Ｇ．ＺｏｍｅｒＪ．Ｆ．Ｃ．ＳｔａｖｅｎｕｉｔｅｒＲ．Ｈ．ｖａｎｄｅｎＢｅｒ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ［］，，ｇａｎｄｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆａｃｒｉｄｉｎｉｕｍｅｓｔｅｒｌａｂｅｌｅｄｃｏｍｏｕｎｄｓＪ．Ｐｒａｃｔ．Ｓｅｃｔｒｏｓｃ１９９１１２：ｐ］ｐ，，［５０５－５２２．７４ＲｉｃｈａｒｄＭａｓｋｉｅｗｉｃｚＤｏｔｓｅｖｉＳｏａｈ，ｈｏｍａｓＣ．Ｂｒｕｉｃｅ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ［］，ｇＴｒｅａｃｔｉｏｎｓｏｆｌｕｃｉｅｎｉｎ．１．ＲｅａｃｔｉｏｎｓｏｆｌｕｃｉｇｅｎｉｎｗｉｔｈｈｙｄｒｏｇｅｎｅｒｏｘｉｄｅＪ，Ｊ．ｇｐ［］ｅｃ－Ａｍ：．Ｃｈｍ．Ｓｏ．１９７９１０１１８５３４７５３５４．，（）７５Ｃ．ＤｏｄｅｉｎｅＬ．ＴｈｕｎｕｓＲＸｅｅｕｎｅ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅａｓｄｉａｎｏｓｔｉｃｔｏｏｌ．Ａ［］ｇ，，ｊｇｒｅｖａａ－ｉｅｗＪ．Ｔｌａｎｔ２０００５１３：４１５４３９．［］，，（）ａｒｋｓｔａｎ－７６Ｂ．ＥｄｗａｒｄｓＡ．ＳＪ．Ｃ．Ｖｏｅｔａｌ．Ｕｎｕｓｕａｌｌｕｍｉｅｓｃｅｎｔｒｏｅｒｔｉｅｓｏｆｏｄｄ［］，ｐ，ｙ，ｐｐａｎｅｖｅｎ－－ｕｍｎｄｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄｎａｐｈｔｈｙｌｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄｄｉｏｘｅｔａｎｅｓＪ．Ｊ．Ｂｉｏｌｉ．［］Ｃｈｅｍｕｍｎ－ｉｌｉ．１９９０５１：１４．，（）７７ＹｏｎｉｎＤｏｎＪｉａｏＷａｎＹｉｎｅｎｅｔａｌ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒｅｓｏｎａｎｃｅ［］ｇＰｇｇ，ｇ，ｇＰｇ，ｅｎｅｒｇｙｔｒａｎｓｆｅｒｂｅｔｗｅｅｎＣｄＳｑｕａｎｔｕｍｄｏｔｓａｎｄｌｕｃｉｇｅｎｉｎａｎｄｉｔｓｓｅｎｓｉｎｇａｌａｕｍｉｎ－８ｉｃｔｉｏｎＪ．Ｊ．Ｌ．２０１７１８１：４３３４３．ｐｐ［］，ｒａａＦｅｈｒｉｄｉｎｉｕｍｅｅｒ－ａｂｅｌｌｅｄｓｅｖｎｎ７８Ｒ．Ｃ．ＨａｔＬ．Ｒ．Ｔｆ．Ｔｅｕｓｅｏｆａｃｓｔｌｔｒｔａｉｄｉｉ［］，ｐｍｍｕｎｏａｕｎｏｅｏｄ－ｉｓｓａｓＪ：ｙ．Ｊ．Ｉｍｍｌ．Ｍｔｈｓ１９８７１０１１９１９６．，，（）［］［７９］ＡｎｄｒｅａｓＤａｉｂｅｒ，ＭａｔｔｈｉａｓＯｅｌｚｅ，ＳｅｂａｓｔｉａｎＳｔｅｖｅｎ，ｅｔａｌ．Ｔａｋｉｎｇｕｐｔｈｅｃｕｄｇｅｌｓｆｏｒｔｈｅｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｅｎａｎｄｎｉｔｒｏｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｓｓａｓａｎｄｔｈｅｉｒｙｇｙｕｏｖａｓｃｕａｒｅｄｏｘｏ－ｓｅｉｎ：ｔｈｅｃａｒｄｉｌｓｙｓｔｅｍＪ．ＲＢｉｌ．２０１７１２３５４９．［］，［８０］Ｓ．Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ，Ｊ．Ａ．Ｍｃｂｒｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｃ．Ｗａｌｋｅｒ．ＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒｅｃｅｐｔｏｒａｓｓａｙｆｏｒｍｅａｓｕｒｉｎｖｉｔａｍｉｎＢ１２ｉｎｓｅｒｕｍｅｖａｌｕａｔｅｄＪ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ１９９４４０４：５３７．ｇ［］，，（）８１ＷｅｎｕｅＧａｏＬｉｍｉｎｉＺｈｏｎｕａｎＬｉｕｅｔａｌ．Ｅｆｉｃｉｅｎｔｈｉｃｉｅｎｉｎ／ｔｈｉｏｕｒｅａ［］ｙ，ｇＱ，ｇｙ，ｇｄｉｏｘｉｄｅｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｓｙｓｔｅｍａｎｄｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｆｏｒｓｅｌｅｃｔｉｖｅａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｖｅｄｏａｍ－－ｉｎｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎＪ．ＳｅｎｓｏｒｓＡｃｔｕａｔ．ＢＣｈｅｍ．２０１７２３８：４６８４７２．ｐ［］，［８２］Ａ．Ｇａｓｂａｒｒｉｎｉ，Ｐ．Ｐａｓｉｎｉ，Ｂ．Ｎａｒｄｏ．ＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＲｅａｌＴｉｍｅＩｍａｇｉｎｇｏｆＰｏｓ－ｔＩｓｃｈｅｍｉｃＯｘｙｇｅｎＦｒｅｅＲａｄｉｃａｌｓＦｏｒｍａｔｉｏｎｉｎＬｉｖｅｒｓＩｓｏｌａｔｅｄＦｒｏｍＹｏｕｎｇ５５ 陕西师范大学硕士学位论文ａｎｄ－ＯｌｄＲａｔｓ［Ｊ］．ＦｒｅｅＲａｄｉｏ．ＢｉｏｌＭｅｄ．１９９８２４２：２１１２１６．５（）８３Ｊ．Ｓ．ＳｕｎＹ．Ｓ．Ｈａｎ，Ｉ．Ｈ．Ｈｕａｎ．Ａｓｉｍｌｅｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅａｓｓａｙｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎ［］，ｇｇｐｇｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓｉｎｉｓｃｈｅｍｉｃｌｉｍｂｉｎｕｒＪ，ＦｒｅｅＲａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１９９６２０１：ｊｙ［］，（）－１０７１１２．８４Ａ．ＫｌｅｅｒｉｓＬ．Ｇ．ＫｏｒｋｉｎａＳ．Ａ．Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ．Ａｕｔｏｘｉｄａｔｉｏｎｏｆｄｏｐａｍｉｎｅ：Ａ［］ｇ，，ｃｏｍａｒｉｓｏｎｏｆｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔａｎｄｓｅｃｔｒｏｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｄｅｔｅｃｔｉｏｎｉｎｂａｓｉｃｓｏｌｕｔｉｏｎｓＪ．ｐｐｐ［］Ｆｒｅｅａｄ－Ｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１９９５１８２：２１５２２２．，（）８５Ｂ．ＫｕｃｉｉｋｋａａＧ．ＨａｋｌａｒＡ．Ｓ．Ｙａｌｃｉｎ．ＮＭＤＡｅｘｃｉｔｏｔｏｘｉｃｉｔａｎｄｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌ［］ｙ，，ｙｅｎｅｒａｔｉｏｎｉｎｒａｔｂｒａｉｎｈｏｍｏｅｎａｔｅｓ：ＡｌｉｃａｔｉｏｎｏｆａｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｇｇｐｐａａｅｕｒｏｃｈｅｍＲｅｓ－ｓｓＪ：８ｙ［］．Ｎ．．１９９６２１１２）１５３５１５３．，（８６Ａ．ＭａｚｕｍｄｅｒＭ．ＭａｌｅｓｓｉＭ．Ｍ．Ｂｅｃｋｅｒ．Ａｈｉｈｔｈｒｏｕｈｕｔｍｅｔｈｏｄｔｏ［］，ｊ，ｇｇｐｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｋｉｎｅｔｉｃｓａｎｄｅｒｍｏｄｎａｍｃｓｕｃｌｅｉｃｃ８－ｔｈｉＪ：１９９６ｙ．Ｎ．Ａｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９８２６（）２０００．［］，８７ＪｏｈｎＷ．Ｂｉｒｋｓ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅａｎｄｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｒｅａｃｔｉｏｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎｉｎ［］ｐｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ［Ｍ］，ＶＣＨＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９８９．８８Ｋ．ＮａｋａｓｈｉｍａＮ．ＫｕｒｏｄａＳ．Ｋａｗａｕｃｈｉｅｔａｌ．Ｐｅｒｏｘｏｘａｌａｔｅｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ［］，，ｇ，ｙａｓｓａｙｆｏｒｏｘｉｄａｓｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｂａｓｅｄｏｎｄｅｔｅｃｔｉｎｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙｆｏｒｍｅｄｈｄｒｏｅｎｇｙｇ－ｅｒｏｘｉｄｅＪ．Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．１９９５１０３：１８５１９１．ｐ［］，（）８９ＢｒｅｅＡ．ＧｏｒｍａｎＰａｕｌＳ．ＦｒａｎｃｉｓＮｅｉｌＷ．Ｂａｒｎｅｔｔ．［］，，，Ｔｒｉｓ２２－ｂｔｓｃｅｉｒｉｄｌｒｕｈｅｎｉｕｍＩＩｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｎｃｅＪ．Ａｎａｌｓｔ２００６１３１：（，ｐｙｙ）（）［］ｙ，，６－１６６３９．９０ＷｕｉａｎＭｉａｏ．Ｅｌｅｃｔｒｏｅｎｅｒａｔｅｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅａｎｄｉｔｓｂｉｏｒｅｌａｔｅｄ［］ｊｇａＪＣｈＲ２－２５５３ｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ｅｍ．ｅｖ．００８１０８７：２５０６．ｐｐ［］，（）９ｌ－－１ＥａｎＨ．ＤｏｅｖｅｎＧｒｅｏｒＪ．ＢａｒｂａｎｔｅＥｍｉＫｅｒｒｅｔａｌ．Ｒｅｄｒｅｅｎｂｌｕｅ［］ｇ，ｇｙ，ｙ，ｇｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｅｒａｔｅｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｕｔｉｌｉｚｉｎａｄｉｇｉｔａｌｃａｍｅｒａａｓｄｅｔｅｃｔｏｒＪ．ｇ［］Ａｎａ－ｌ．Ｃｈｅｍ．２０１４８６：２７２７２７３２．，＾－９２ＪＪａｎ－ＹｏｎＬ－ｕｎｈｏＷｏｎｅｅ．Ｓｏｌｉｄｓｔａｔｅｔｒｉｓ２２ｂｉｒｉｄｌｒｕｔｈｅｎｉｕｍＩＩ［］，ｇ，ｇ（ｐｙｙ）（）－ｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｅｒａｔｅｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｓｅｎｓｏｒｂａｓｅｄｏｎｉｏｎｉｃｌｉｑｕｉｄ／ｓｏｌｅｌｇｔ－ｉｔａｎｉａ／ＮａｆｉｏｎｃｏｍｏｓｉｔｅｆｉｌｍＪ．Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０１５７３６：５５６０．ｐ［］，－９３－ＰＹｏｎｉｎＤｏｎＴｉｎＴｉｎｇＧａｏＹｉｎｈｏｕｅｔａｌ．Ａｎｏｄｉｃｅｌｅｃｔｒｏｅｎｅｒａｔｅｄ［］ｇｇｇ，ｇ，ｇＺ，ｇ２＋ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｏｆＲｕ（ｂｐｙ）３ｗｉｔｈＣｄＳｅｑｕａｎｔｕｍｄｏｔｓａｓｃｏｒｅａｃｔａｎｔａｎｄｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＤＮＡＪ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．２０１５５：１５３９２．［］，［９４］ＪｉｎｇＺｈａｎｇ，ＨｏｎｇｌａｎＱｉ，ＺｈｅｊｉａｎＬｉ，ｅｔａｌ．Ｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｅｒａｔｅｄｃｈｅｍｉｌｉｕｎｉｎｅｓｃｅｎｃｅ５６ 参考文献ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃｓｙｓｔｅｍｂａｓｅｄｏｎｂｉｏｃｌｅａｖａｇｅｏｆｒｏｂｅｓａｎｄｈｏｍｏｅｎｅｏｕｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ，ｐｇ］－Ａｎａｌ：１，．Ｃｈｅｍ．２０１５８７６５１０６５５，９５ＪａｓｏｎＷＣＰａｕｌＳＦＳｉｍｏｎＷＬ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓｕｓｉｎ［］，，ｇｆｌｏｗｉｎｅｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｃｏｕｐｌｅｄｗｉｔｈｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎＪ．Ａｎａｌ．ｊ［］２００－Ｃｈｉｍ：．Ａｃｔａ３４８０６７７７．，，９６ＬｏｅｚＰａｚＪＬＴｏｗｎｓｈｅｎｄＡ．Ｆｌｏｗｉｎｅｃｔｉｏｎｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ［］ｐ３ｊｎｅｎｅｎａｎ－ｏｆｉｘｎｉｒａｍｉａｎｄｃｈｌｏｒｒｏｍａｚｉＪ．ＡｌＣｏｍｍｕ１９９６３３１：３１３３．ｐｐ［］，，（）９７ＰａｕｌＳ．ＦｒａｎｃｉｓＪａｃｕｉＬ．ＡｄｃｏｃｋＪａｓｏｎＷ．Ｃｏｓｔｉｎｅｔａｌ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ［］，ｑ，，ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｏｐｉｕｍｐｏｐｐｙ（Ｐａｐａｖｅｒｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）ａｌｋａｌｏｉｄｓＪ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．［］ｅｎａ－Ｂｉｏｍ．Ａｌ．２００８４８：５０８５１８．，９８ＪａｃｕｉＬ．ＡｄｃｏｃｋＮｅｉｌＷ．ＢａｒｎｅｔｔＪａｓｏｎＷ．Ｃｏｓｔｉｎｅｔａｌ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆ［］ｑ，，，ｓｅｌｅｃｔｅｄｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｅｒｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｕｓｉｎｇｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃｃｏｌｕｍｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｈｐｙ－ｃｏｕｌｅｄｃｈｅｍｕｍｎｅｓｃｅｎｃｅｅｅｃｔｎ．Ｔａａｎａ：ｗｉｔｈｉｌｉｄｔｉｏＪｌｔ２００５６７５８５５８９．＾ｐ［］，，－－－－９９ＳｈｕｎＬｉＦａｎＬｉＫｅＺｈａｎＪｉｎＭｉｎＬｉｎ．Ｐｏｓｔｃｏｌｕｍｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｅｎｅｄｏｓｂｅｎｚｉｌ［］，ｇ，ｇｄ－ｏａａｎ１２４ｂｅｎｚｅｎｅｔｒｉｏｌｂａｓｅｄｏｎａｃｉｄｉｃｔｓｓｉｕｍｅｒｍａｎａｎａｔｅ，，ｐｐｇｈｅｎｕ－ｃｌｕｉｉｉｍｅｓｃｅｎｃｅＪ．Ｔａｌａｎｔａ２００６６８：６４６６５２．［］，，１００ＷｅｉｓｈｅｎｉｎＨａｉｉｎＳｈｉＴｒｉｓｈａＭａｙｅｔａｌ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｂｅｎｚｙｌｔｒｉｅｔｈｌ［］ｇＬ，ｙｇ，，ｙａｍｍｏｎｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅｆｒｏｍｏｌｙｍｅｒｉｃｍｅｄｉａｂｙｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｈｏｒｅｓｉｓｗｉｔｈｐｐｕｒａｖｅａｂｓｏｒｂａｎｃｅｅｅｃｎ－ｌｔｎ：ｉｏｌｔｄｔｔｉｏＪ．Ａａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ２００７５８３９８１０２，［］，，－ｎａｎａｎ－ａｎｅａｅｅｒｍｎａｒｏｕｒａｃ１０１ＹｕｅＷｅｉＺｈｕＪｕＺｈＹＴｕＺｈｔＬＤｔｉｔｉｏｎｏｆｏｌｔｈｉｉｌ［］，ｇ，ｇ，ｐｐｙａｎｓｅｒｕｍｕｓｈｉｈ－ａｎｄｍｅｔｈｌｔｈｉｏｕｒａｃｉｌｉｎｈｕｍｉｎｇｇｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｕｉｄｙｐｑｃｈｒｏｍａｔｏｒａｐｈｙｗｉｔｈｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎＪ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｒ．Ｂ２００７ｇ［］ｇ，，８５４－：２３９２４４．１０２ＧｅｏｆｆｒｅＰ．ＭｃＤｅｒｍｏｔｔＪｅｓｓｉｃａＭ．ＴｅｒｒＸａｖｉｅｒＡ．Ｃｏｎｌａｎ，ｅｔａｌ．Ｄｉｒｅｃｔ［］ｙ，ｙ，ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｔｈｉｏｌｓａｎｄｄｉｓｕｌｆｉｄｅｓｗｉｔｈｍａｎｇａｎｅｓｅ（ＩＶ）ｈｅｍ－ｃｉｌｉｍｉｉｎｅｓｃｅｎｃｅＪ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０１１８３：６０３４６０３９．［］，１０３伯安，王望峰，，．反相流动注射化学发光法测定盐酸小檗碱［Ｊ．湖［］史曾艳等］２００５２３３－北民族学院学报（自然科学版：２３９２４２．），，（）＾７－ＡｃｏｓｔａＡ［１０４］ＣａｉｔａｎＶａｌｌｖｅＬＦＶａｌｅｎｃｉａＭｉｒｏｎＭＣｃｏｓｔａＲ．ｐｙ，，Ｃｈｅｍ－ｍｅｒｃａｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｓｏｄｉｕｍ２ｐｔｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅｂｙｆｌｏｗｉｎｊｅｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｕｓｉｎｇｃｅｒｉｘｍｉ（ＩＶ）ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄｂｙｑｕｉｎｉｎｅｆＪ］．Ｔａｌａｎｔａ，２０００，－５１：１１５５１１６１．［１０５ＢｕｔｋｅＴＭ，ＳａｎｄｓｔｒｏｍＰＡ．Ｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓａｓａｍｅｄｉａｔｏｒｏｆａｏｐｔｏｓｉｓ［Ｊ．］ｐ］５７ 陕西师范大学硕士学位论文－ＩｍｍｕｎｏｌＴｏｄａｙ１９９４１５１：７１０．，，（）１０６ＷＴ．ＣｈｅｎＣＨ．ＴｕｎｇＲ．Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ．ＩｍａｉｎＲｅａｃｔｉｖｅＯｘｅｎＳｐｅｃｉｅｓｉｎ［］，，ｇｇｙｇ－ｒｈｒｉ．ｌｍａｉｎ３：１６２．Ａｔｔｉｓ［Ｊ］Ｍｏ．Ｉ２００４，３１５９ｇｇ，（）［１０７ＥｘｍＳｏｏｋＬｅｅＶ．Ｇ．ＤｅｅａａｎＤｏｎＧｉｌＹｏｕｅｔａｌ．Ｎａｎｏａｒｔｉｃｌｅｓｂａｓｅｄｏｎ］，ｐｇ，ｇ，ｐｕａｎｔｕｍｄｏｔｓａｎｄａｌｕｍｉｎｏｌｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｉｎｖｉｖｏｉｍａｉｎｇｏｆｑｇｈｄｒｏｅｎｅｒｏｘｉｄｅｂｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒｅｓｏｎａｎｃｅｅｎｅｒｔｒａｎｓｆｅｒＪ．Ｃｈｅｍ．ｙｇｐｙｇｙ［］－Ｃｏｍｍｕｎ．．２０１６５２：４１３２４１３５，［１０８］ＰｉｎｇＬｉ，ＬｕＬｉｕ，ＨａｉｂｉｎＸｉａｏ．Ａｎｅｗｐｏｌｙｍｅｒｎａｎｏｐｒｏｂｅｂａｓｅｄｏｎｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒｅｓｏｎａｎｃｅｅｎｅｒｇｙｔｒａｎｓｆｅｒｆｏｒｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅｉｍａｇｉｎｇｏｆ－ｉｎｔｒｉｎｓｉｃｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅａｎｉｏｎｉｎｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１６１３８：２８９３２８９６．，０９Ｏｒｔ－Ｄｉｏｘｅ１ｉＧｒｅｅｎＳａｍｅｒＧｎａｉｍＲａｃｈｅｌＢｌａｕｅａｌ．ＮｅａｒＩｎｆｒａｒｅｄｔａｎｅ［］，，，ＬｕｍｉｎｏｐｈｏｒｅｓｗｉｔｈＤｉｒｅｃｔＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅＥｍｉｓｓｉｏｎＭｏｄｅ［Ｊ］．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．－Ｓｏｃ：．２０１７１３９１３２４３１３２４８．，［１１０］ＨａｍｐｔｏｎＭＢ，ＫｅｔｔｌｅＡＪ，ＷｉｎｔｅｒｂｏｕｍＣＣ．Ｉｎｓｉｄｅｔｈｅｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｐｈａｇｏｓｏｍｅ：ｍ－ＯｘｉｄａｎｔｓｅｌｏｅｒｏｘｉｄａｓｅａｎｄｂａｃｔｅｒｉａｌｋｉｌｌｉｎＪ．Ｂｌｏｏｄ１９９８９２：３００７，ｙｐ，ｇ［］，，３０１７．［１１１］Ｈａｅｇｅｎｓ，Ａ”Ｖｅｒａｏｏｙ，Ｊ．Ｈ，Ｈｅｅｒｉｎｇａ＾Ｐ”Ｍｏｓｓｍａｎ，Ｂ．Ｔ．＆Ｗｏｕｔｅｒｓ，Ｅ．Ｆ．ｅ－Ｍｙｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｍｏｄｕｌａｔｅｓｌｕｎｇｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｒｅｓｐｏｎｓｅｓｔｏｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｅｎ－ａｇｔｓＪ．Ｅｕｒ，Ｒｅｓｉｒ．Ｊ．２００８３１：２５２２６０．［］ｐ，［１１２］Ｗｉｎｔｅｒｂｏｕｍ，Ｃ．Ｃ．Ｒｅｃｏｎｃｉｌｉｎｇｔｈｅｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄｂｉｏｌｏｇｙｏｆｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎ－ｓｅｃｉｅｓＪ，ＮａｔＣｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００８４：２７８２８６．ｐ［］，１１３ＭａｌｌｅＥ．ＦｕｒｔｍｔｌｌｌｅｒＰ．Ｇ．ＳａｔｔｌｅｒＷ．＆ＯｂｉｎｅｒＣ．Ｍｅｌｏｅｒｏｘｉｄａｓｅ：ａｔａｒｅｔ［］，，，，，ｇ，ｙｐｇ－Ｊａａｃｏ２：４ｆｏｒｎｅｗｄｒｕｇｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＪ？Ｂｒ．．Ｐｈｒｍｌ．００７１５２８３８８５．［］，１１４ＧｒｏｓｓＳ．ＢｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｉｍａｉｎｏｆｍｅｌｏｅｒｏｘｉｄａｓｅａｃｔｉｖｉｔｉｎｖｉｖｏＪ．Ｎａｔ．［］，ｇｇｙｐｙ［］ｅｄ００９－１４４６１Ｍ．２５：５５．，［１１５］ＺｈａｎｇＮ，ＦｒａｎｃｉｓＫＰ，ＰｒａｋａｓｈＡ，ｅｔａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｔｔｈｒｏｕ－ａｃｉｖｉｔｙｉｎｄｅｅｐｔｉｓｓｕｅｓｇｈｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔｅｘｃｉｔａｔｉｏｎｏｆｎｅａｒｉｎｆｒａｒｅｄｎａｎｏ－ａｒｔｉｃｌｅｓＪ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０１３１９４：５００５０５．ｐ［］，（）１１６ＫｉｅｌｌａｎｄＡＢｌｏｍＴＮａｎｄａｋｕｍａｒＫＳｅｔａｌ．Ｉｎｖｉｖｏｉｍａｇｉｎｇｏｆｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｅｎ［］，，，ｙｇｎ－ａｎｄｎｉｔｒｏｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓｉｎｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｕｓｉｎｇｔｈｅｌｕｍｉｎｅｓｃｅｔｒｏｂｅＬ０１２［Ｊ］，Ｆｒｅｅｐｃａｅｄ－ＲａｄｉｌＢｉｏ．＆Ｍ．２００９４７：７６０７６６．，，［１１７］ＲｅｅｃｅＪＧＳａｒａＣＭＤａｖｉｄＰＷ．Ａｒａｉｄｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅａｓｓａｆｏｒｍｅａｓｕｒｉｎ，，ｐｙｇｅｒｏｘ－ｍｅｌｏｉｄａｓｅａｃｔｉｖｉｔｉｎｈｕｍａｎｌａｓｍａＪ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１５６：６２７１．ｙｐｙｐ［］，５８ 参考文献［１１８］Ｋ．Ｊｉａｎｇ，Ｙ．Ｃｈｅｎｇ，Ｓ．Ｍ．Ｗｕ．Ｔｈｅｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃｔｈｅｒａｐｙｏｆｔｕｍｏｒ［Ｊ］，Ｌａｓｅｒ－Ｊｏｕｒｎａｌ２００４２５１：８８９９０５．，，（）ｎＭ－１１９Ｍ．Ｊ．Ｎｉｅｄｒｅ．Ｓ．ＰａｔｔｅｒｓｏｎＢ．Ｃ．Ｗｉｌｓｏｎ．Ｄｉｒｅｃｔｎｅａｒｉｎｆｒａｒｅｄｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ［］，，ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｓｉｎｌｅｔｏｘｙｇｅｎｅｎｅｒａｔｅｄｂｈｏｔｏｄｎａｍｉｃｔｈｅｒａｉｎｃｅｌｌｓｉｎｖｉｔｒｏｇｇｙｐｙｐｙｆ，ａｎｄ－ｔｉｓｓｕｅｓｉｎｖｉｖｏ［Ｊ］．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｅｏｂｉｏｌ．２００２７５：３８２３９１．，ｕ－１２０Ｋ．ＴｅｒａｎｉｓｈｉＴ．Ｎｉｓｈｉｕｃｈｉ．Ｃｃｌｏｄｅｘｔｒｉａｂｏｕｎｄ［］，ｇｙ－－－ｍｅ－－ｗ６（４ｔｈｏｘｈｅｎｌｉｍｉｄａｚｏ［ｌ２ａｒａｚｉｎ３７Ｈｏｎｅｓｉｔｈｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎａｓｒｅｅｎｙｐｙ）ｓ］ｐｙ（）ｇ＾ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔｒｏｂｅｓｆｏｒｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅａｎｉｏｎｓ［Ｊ］．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００４，３２５：ｐ－１８５１９５．＾［１２１］Ｙ．Ｆ．Ｑｉｎ，Ｄ．．Ｘｉｎｇ，Ｊ．Ｚｈｏｕ，ｅｔａｌ．ＦｅａｓｉｂｉｌｉｔｙｏｆＵｓｉｎｇＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｙｌＣｙｐｒｉｄｉｎａｃ－ＬｕｉｆｅｒｉｎＡｎａｌｏｇｉｎａＮｏｖｅｌＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅＭｅｔｈｏｄｆｏｒＲｅａｌｔｉｍｅｗＰｈｏｔｏｄｎａｍｉｃＴｈｅｒａＤｏｓｉｍｅｔｒＰｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｅｏｂｉｏｌ．８１６：［Ｊ］，２００５ｙｐｙｙ，（）－１５３４１５３８．［１２２］Ｒ．Ｌａｐｔｅｖ，Ｍ．Ｎｉｓｎｅｖｉｔｃｈ，Ｇ．Ｓｉｂｏｎｉ，ｅｔａｌ．ＩｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅａｃｔｉｖａｔｅｓｔａｒｅｔｅｄｈｏｔｏｄｎａｍｉｃｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｌｅｕｋａｅｍｉｃｃｅｌｌｓＪ．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒｇｐｙ［］，２００６－９５：１８９１９６．，－１２３ａｎＨａｎｅａｅｍｃａｏｅｃｕｅｎｄｕｃｅｄ－ｔｖａｔＨ．Ｙｕ．ＣｈｏｎＢ．Ｗｔｌ．ＣｈｉｌＭｌｌＩＬｉｈｔＡｃｉｅｄ［］，ｇ，ｇ，ｇＳｓｔｅｍｆｏｒＡｎｔｉｃａｎｃｅｒａｎｄＡｎｔｉｆｉｍｇａｌＡｃｔｉｖｉｔｉｅｓＪ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２１３４：ｙ［］，－１３１８４１３１８７．１２４ＳｕｚｕｋｉＫＫｉｍｕｒａＴＳｈｉｎｏｄａＨｅｔａｌ．Ｆｉｖｅｃｏｌｏｕｒｖａｒｉａｎｔｓｏｆｂｒｉｈｔｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ［］，，，ｇｒｏ－ｔｅｉｎｆｏｒｒｅａｌｔｉｍｅｍｕｌｔｉｃｏｌｏｕｒｂｉｏｉｍａｉｎｇ［Ｊ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１６７：１３７１８．ｐｇ］，１２５ＬａｚａｒｉｄｅｓＡｒａｓｆｅｅａｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ｅｒＬＷｈｉｔｌｅＭＪＳｔｌｄＤＢｔｌ．ＡＦｌＧｕｉｄｅｄＬａｓ［］，ｙ，，ＡｂｌａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍｆｏｒＲｅｍｏｖａｌｏｆＲｅｓｉｄｕａｌＣａｎｃｅｒｉｎａＭｏｕｓｅＭｏｄｅｌｏｆＳｏｆｔＴｉｓｓｕｅＳａｒｃｏｍａ［Ｊ］，Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ，２０１６，６（２）：１５５．１２６］侯振江张宗英．血管内皮生长因子及其受体检测在恶性肿瘤诊疗中的应用［Ｊ．［，］－诊断学：理论与实践２００５１４：８６８８．，，（）５９ 陕西师范大学硕士学位论文６０ 致谢致谢三年一，是个说长不长说短不短的时间，很庆幸，在步入社会前的这三年，我是在陕师大度过的一。作为个本科阶段学习生物专业的学生，只学过基础化学，在考研调剂过程中一，是陕师大化学化工学院给了我个能够展示自我的平台，在此要感谢漆红兰老师的引荐一，也要感谢咱化学化工学院所有的老师们给了我个非常宝贵的机会。这三年时间，我的导师吕家根老师是我研宄方向的领路人，在我实验进展不顺利的时候，是他帮我分析实验思路和实验过程中的缺陷，拨开层层迷雾，为我的科研工作保驾护航。在此要感谢吕家根老师对我倾注的心血，感谢老师对我这个并不是很聪明的学生不抛弃不放弃。谢谢您教会我如何分析解决问题，谢谢您教会我将要走上工作岗位所必备的技能一。师恩深似海，走上工作岗位后，我定牢记您对我的教诲，，踏实做人认真做事。另外，还要感谢岳宣峰和杜建修二位老师在我研究工作以及工作方面给的宝贵建议、；以及大型仪器中心的郭新爱老师左萍老师、刘凯强老师和樊娟老师在我实验工作中给与的无私帮助；感谢分析化学专业的各位老师给予我的帮助和指导！。在此，我向各位老师致以最诚挚的感谢感谢实验室的同门在我学习和工作中给与我的帮助和支持，感谢同门师兄弟师姐妹们，张胜海，冯少红，史云，赵春欣，段瑞，闫思谕，程梦琪，谷旻，余一。格婦，刘晶，感谢你们路以来给与我的支持感谢我的舍友汪贲文，樊帆，赵丹，苏昊，感谢你们在这三年陪伴我，同窗之谊，没齿难忘。感谢刘伟亮同学在我论文收尾阶段的友情帮助，感谢分析、化生专业的同学们给我的温暖与感动。一一最后，感谢我的父母，给我路以来的支持和帮助。离家十载，我就像只风筝，越飞越远。你们始终没有拉紧风筝线，而是让我自己去探索，去经历，去找到自己合适的方向和位置，爸爸妈妈，我爱你们。一来师大的那天，还历历在目，未曾想过就这样很快离去。在这里疯过，闹过，哭过，笑过，这里的记忆，将成为我人生中最宝贵的财富。在人生的十字交叉口上，有迷茫有无助，但我相信，师大给与我的，必将助我成长。即便远去，这里的回忆不会淡忘。比心！崔红波２０１８年４月６１ 陕西师范大学硕士学位论文６２ 攻读硕士学位期间研究成果攻读硕士学位期间研究成果Ｘ＊［１ＪｉｎＬｉｕＨｏｎｂｏＣｕｉＳｉｕＹａｎｕｎａｎＪｉｎＤａｕａｎＷａｎ，ＬｉｎｉｅＭｅｎＧｏｌｄ］ｇ，ｇ，ｙ，ｇ，ｑｇｇｊｇ，ｎａｎｏｓｔａｒｓｄｅｃｏｒａｔｅｄＭｎ〇２ｎａｎｏｓｈｅｅｔｓｆｏｒｍａｇｎｅｔｉｃｒｅｓｏｎａｎｃｅｉｍａｇｉｎｇａｎｄｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌｅｒａｓｉｏｎｏｆｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｃｅｌｌＪ．ＭａｔｅｒｉａｌｓＴｏｄａｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．［］ｙＣ－２０１８．１６：９７１０４＊２ＣｈｕｎｘｉｎＺｈａｏＨｏｎｂｏＣｕｉＪｉｎＤｕａｎＳｈｅｎｈａｉＺｈａｎＪｉａｅｎＬｖＴｈｅ［］，ｇ，ｇ，ｇｇ，ｇ，ｓｅ－ｃａｔａｚｎｃｅｓｃｅｎｃｅｉｎｏ－ｏｎｕｍｏｎａｎｄａｃａｌｆｌｙｉｇｈｍｉｌｕｍｉｎｅｏｆｌｕｍｌｄｉａｚｉｉｉｔｓｐｐｌｉｔｉｏｎｔ－ｒｏｅｎｅｒｏｘｅｄｅｔｅｃｔｏｎａｎｄｒａａｆｏｒｃａｔａｌｓｆｒｅｅｈｙｄｇｉｄｉｔｒｔｈｒｉｔｉｓｉｍａｇｉｎｇＪ．ｙｐ［］ａ－２２０９ＡｎｌｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０１７．９０３：２２０１ｙ（）一［３］吕家根，赵春欣，段瑞，崔红波，张胜海．种酶联免疫分析方法，ＣＮ１０６７７１１３５Ａ．６３
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