《几种芳香物质对柑橘采后主要致病菌的作用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
学校代号１０５３０学号２０１４３１１５１５７３分类号Ｑ８１５密级公开硕士学位论文几种芳香物质对柑橘采后主要致病菌的作用学位申请人吴雅兰指导教师陶能国教授学院名称化工学院学科专业化学工程与技术研究方向生物化工二零一七年六月 湘潭大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研宄所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写的成果作品。对本文的研宄做出重要贡。献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。８作者签名：Ｉ：日期：２０１７年６月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权湘潭大学可以将本学位论文的全部或部分内容编、入有关数据库进行检索，可以采用影印缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。涉密论文按学校规定处理。作者签名：ｍ曰期：２０１７年６月８日／导师签名：２０１７６８：曰期年月曰 EffectofSeveralkindsofaromaticsubstancesincitruspostharvestmainpathogenicfungusCandidateWuYalanSupervisorProf.TaoNengguoCollegeCollegeofChemicalEngineeringProgramChemicalEngineeringandTechnologySpecializationBiochemicalEngineeringDegreeMasterofEngineeringUniversityXiangtanUniversityDateJune,2017 摘要本文以柑橘采后主要致病菌作为研究对象，探究了柠檬烯、月桂烯和香茅醛对指状青霉、意大利青霉和酸腐病菌菌丝体生长以及孢子萌发的作用。其中，柠檬烯、月桂烯对病原菌菌丝体生长和孢子萌发主要为促进作用，香茅醛主要为抑制作用。主要结果如下：(1)对菌丝体而言，柠檬烯在低浓度下对指状青霉(0.2-0.8μL/mL)、意大利青霉(0.2-1.6μL/mL)和酸腐病菌(0.2-3.2μL/mL)表现出促进作用。月桂烯的促进作用的浓度范围分别为：指状青霉(0.2-6.4μL/mL)、意大利青霉(0.2-1.6μL/mL)和酸腐病菌(0.2-6.4μL/mL)。柠檬烯和月桂烯对三种菌的抑制作用不明显。香茅醛在低浓度下同样对三种菌表现出促进作用，对青霉而言，其浓度小于0.2μL/mL时，表现出促进作用，对酸腐而言，其浓度小于0.8μL/mL时，表现出促进作用。高浓度香茅醛显著抑制指状青霉、意大利青霉和酸腐病菌菌丝体生长，最小抑菌浓度MIC均为1.6μL/mL，最小杀菌浓度MFC分别为3.2、1.6、1.6μL/mL。(2)对孢子而言，柠檬烯在低浓度下对指状青霉(0.1-0.4μL/mL)、意大利青霉(0.4μL/mL)和酸腐病菌(0.4-1.6μL/mL)促进作用明显，超过这一浓度范围，表现为抑制作用。月桂烯促进作用更强，在所测试的浓度范围(0-3.2μL/mL)内一直表现出明显的促进作用。香茅醛在低浓度下对指状青霉(0.05μL/mL)、意大利青霉(0.1μL/mL)和酸腐病菌(0.05-0.2μL/mL)促进作用明显，超过这一浓度范围，表现为抑制作用。(3)低浓度柠檬烯对指状青霉孢子萌发的促进作用明显：通过转录组学和蛋白组学关联分析，找到19个柠檬烯诱导指状青霉孢子萌发的差异基因和蛋白。通过荧光定量PCR验证，验证差异表达的基因，其中有11个基因表达上调，8个基因表达下调，细胞膜上相关基因大量上调。通过代谢组学分析35种差异代谢物，关联48种代谢途径，与细胞膜上进行的ABC转运途径相关，这是指状青霉对柠檬烯信号的响应。综上，柠檬烯可能充当指状青霉孢子萌发的信号分子，其作用位点在细胞膜上。(4)月桂烯在较高浓度仍对指状青霉的孢子萌发表现出较强的促进作用：GC-MS分析和GC定量，发现月桂烯在指状青霉孢子萌发过程中不断减少，代谢组学研究发现月桂烯可以转化成丙酮酸，同时实验验证得到丙酮酸含量激增。丙酮酸进入柠檬酸循环，产生ATP，这与胞内ATP、ADP、AMP含量升高结果一致。综上，月桂烯可能充当指状青霉孢子萌发的营养物质，减少的月桂烯可以转化为丙酮酸，为孢子萌发提供能量。(5)高浓度香茅醛对指状青霉有很强抑制作用：香茅醛处理，导致指状青霉细胞形态发生明显破坏。通过荧光显微镜观察发现，荧光染料碘化丙啶(PI)能透I 过经过香茅醛处理的指状青霉的细胞膜，这一现象可以作为香茅醛诱导指状青霉发生膜损伤的直接证据。而胞外电导率和OD260nm值的上升，也证实了胞内物质发生了泄露，细胞膜通透性增加。通过活体实验，证实了香茅醛有作为柑橘采后保鲜剂的潜能。关键词：指状青霉；意大利青霉；酸腐病菌；柠檬烯和月桂烯；香茅醛II AbstractInthispaper,themainpathogensofcitrusweretakenastheresearchobject,andtheeffectsoflimonene,myrcene,citronellalonthethemycelialgrowthandspores’germinationofPenicilliumdigitatum,P.italicum,andGeotrichumcitri-aurantiiwereexplored.Amongthem,limoneneandmyrcenestimulatedthepathogenmycelialgrowthandspores’germination,whilecitronellalwasjusttheopposite.Themainresultswereasfollows:(1)Formycelium,limoneneshowedstimulatingeffecttoP.digitatum,P.italicum,andG.citri-aurantiiinlowconcentrationsof0.2-0.8,0.2-1.6and0.2-3.2μL/mL,respectively.Stimulatingeffectoftheconcentrationofmyrcenewere0.2-6.4(forP.digitatum),0.2-1.6(forP.italicum),0.2-6.4(forG.citri-aurantii)μL/mL,respectively.Inhibitingeffectoflimoneneandmyrceneonthesefungiwasnotobvious.Citronellalalsostimulatedthesefungiinlowconcentrations.Whenitsconcentrationwaslessthan0.2,0.2and0.8μL/mL,respectively,citronellalshowedthepromotingeffectstoP.digitatum,P.italicumandG.citri-aurantii.HighconcentrationsofcitronellalsignificantlyinhibitedthemycelialgrowthofP.digitatum,P.italicum,andG.citri-aurantii,theminimuminhibitoryconcentration(MIC)wereall1.6μL/mL,andtheminimumfungicidalconcentration(MFC)were3.2,1.6and1.6μL/mL,respectively.(2)Forspores,limoneneshowedstimulatingeffecttoP.digitatum,P.italicum,andG.citri-aurantiiatlowconcentrationsof0.1-0.4,0.4and0.4-1.6μL/mL,respectively.Myrcenehavebeenshowedhighstimulatingeffectwhentheconcentrationwas3.2μL/mLorless.CitronellalshowedstimulatingeffecttoP.digitatum,P.italicum,andG.citri-aurantiiinlowconcentrationsof0.05,0.1and0.05-0.2μL/mL,respectively.(3)LimoneneshowedstimulatingeffecttoP.digitatumspores’germinationinlowconcentrations.Throughtranscriptomicsandproteomicsassociationanalysis,19differentiallyexpressedgenesandproteinswerefound.QuantitativePCRwasusedtoverifythe19differentiallyexpressedgenes,foundingthat11geneswereup-regulatedand8genesweredown-regulated.Alargenumberofrelatedup-regulatedgeneswereonthecellmembrane.Wefound35speciesofdifferencesmetabolitesassociatedwith48kindsofmetabolicpathwaysinmetabonomics.ThisisrelatedtotheABCtransportpathway,conductingonthecellmembrane,whichistheresponseofP.digitatumtothelimonenesignal.Inconclusion,limonenemightbeactasasignalmoleculeinIII inducingthespores’germinationofP.digitatum,andthatreceptorinthecytoplasmicmembranewouldbethesite.(4)MyrceneshowedstimulatingeffecttoP.digitatumspores’germinationeveninhighconcentrations.GC-MSandGCquantitativeanalysistheconcentrationofmyrceneinthespores’germinationprocessofP.digitatum,foundthatmyrceneisdecreasingconstantly.Associatedmetabonomicsanalysis,foundthatthemyrcenecanbeconvertedtopyruvicacid.Withmyrcenetreated,pyruvicacidcontenthasrisensharply.PyruvicacidisconvertedinTCAcircletoproduceATP.Undertheactionofmyrcene,thecontentofATP,ADP,AMPhasrisensharply.Inconclusion,myrcenemightbeactasnutrientsininducingthespores’germinationofP.digitatum.Myrcenecanbeconvertedintopyruvatetoprovideenergyforspores’germination.(5)Themycelialgrowthandspores’germinationofP.digitatumwereinhibitedbycitronellalinadose-dependentmanner.MICandMFCweredeterminedtobe1.60µL/mLand3.20µL/mL,respectively.Itwasfoundthattheplasmamembraneofcitronellal-treatedP.digitatumsporeswasobviouslydamaged.Asconvincedbythepropidiumiodidestainresults,aswellasahigherextracellularconductivityandahigherreleaseofcellconstituentsincitronellal-treatedsamplesthanincontrolsamples,thecellmembranepermeabilitywasdestroyed.Moreover,invivotestresultsdemonstratedthatwax+citronellal(WC;10×MFC)treatmentcouldeffectivelyreducetheincidenceofgreenmoldafter5dofstorageat25±2℃.ThesefindingssuggestedthattheplasmadamagemechanismcontributestotheantifungalactivityofcitronellalagainstP.digitatum,andthatcitronellalisapotentialalternativeasfungicidalagentsincontrollinggreenmoldofcitrusfruit.Keywords:Penicilliumdigitatum;P.italicum;Geotrichumcitri-aurantii;Limoneneandmyrcene;CitronellalIV 缩略词表缩略符号英文中文含义ATPAdenosinetriphosphate三磷酸腺苷ABCMTABCmultidrugtransporterABC多药转运蛋白ABCTABCtransporterABC转运蛋白ADPAdenosinediphosphate二磷酸腺苷AMPAdenosinemonophosphate一磷酸腺苷ARPAntibioticresponseprotein抗性反应蛋白CATCatalase过氧化氢酶Chs3Chitinsynthaseactivator几丁质合成激活酶COGClusteroforthologousgroup直系同源簇CWPCellwallprotein细胞壁蛋白GOGeneontology基因本体论GSTGlutathioneS-transferase谷胱甘肽-S-转移酶HPHydrophobin疏水蛋白HSPHeatshockprotein热激蛋白iTRAQIsobarictagsforrelativeandabsolute同位素标记相对和绝对定quantitation量KEGGKyotoencyclopediaofgenesand京都基因与基因组百科全genomes书MFCMinimumfungicidalconcentration最小杀菌浓度MICMinimuminhibitoryconcentration最小抑菌浓度MPMembraneprotein膜蛋白NADPGHNADP-specificglutamateNADP特异性谷氨酸脱氢dehydrogenase酶NHENa+/H+exchangerNa+和H+交换蛋白OPLS-DAOrthogonalpartialleastsquares正交偏最小二乘-判别分析discriminantanalysisPCAprincipalcomponentanalysis主成分分析PCRpolymerasechainreaction聚合酶链反应PGPolygalacturonase多聚半乳糖醛酸酶PMIPPlasmamembraneironpermease细胞膜铁透性酶RNA-SeqRNAsequencing转录组测序技术SODSuperoxidedismutase超氧化物歧化酶Ssd1Cellwallbiogenesisprotein细胞壁生物合成蛋白磷酸phosphataseSsd1酶V 目录第1章绪论........................................................................................................................11.1研究目的及意义....................................................................................................11.1.1柑橘采后病害..............................................................................................11.1.2柑橘采后致病菌..........................................................................................11.1.3课题的提出..................................................................................................41.1.4选题意义......................................................................................................51.2国内外研究进展....................................................................................................61.2.1柑橘精油......................................................................................................61.2.2柑橘精油成分..............................................................................................61.2.3柑橘精油各成分的作用..............................................................................71.3研究内容及方法....................................................................................................81.4研究目标成果........................................................................................................9第2章几种芳香物质对柑橘采后主要病原菌菌丝体生长和孢子萌发的影响..........102.1引言......................................................................................................................102.2实验材料..............................................................................................................102.2.1病原菌........................................................................................................102.2.2实验试剂....................................................................................................102.2.3实验仪器设备............................................................................................102.3实验方法..............................................................................................................112.3.1对菌丝体生长的影响................................................................................112.3.2对孢子萌发的影响....................................................................................112.3.3数据统计及图形分析................................................................................122.4结果与分析..........................................................................................................122.4.1对菌丝体生长的影响................................................................................122.4.2对孢子萌发的影响....................................................................................162.5小结与讨论..........................................................................................................20第3章柠檬烯对指状青霉孢子萌发作用的分子机理..................................................213.1引言......................................................................................................................213.2材料与方法..........................................................................................................213.2.1病原菌........................................................................................................213.2.2转录组和蛋白组测序................................................................................213.2.3蛋白组与转录组关联分析........................................................................22VI 3.2.4荧光定量PCR...........................................................................................223.2.5GC-TOF-MS代谢组学..............................................................................223.3结果与分析..........................................................................................................223.3.1Unigene的长度分布..................................................................................233.3.2NR分类......................................................................................................243.3.3GO分类......................................................................................................253.3.4COG分类...................................................................................................263.3.5差异表达基因的代谢途径富集分析........................................................263.3.6差异表达蛋白的的代谢途径富集分析....................................................283.3.7转录组与蛋白组关联分析........................................................................283.3.8荧光定量PCR...........................................................................................313.3.9GC-TOF-MS代谢组学..............................................................................343.4小结与讨论..........................................................................................................38第4章月桂烯对指状青霉孢子萌发的作用机理初探..................................................404.1引言......................................................................................................................404.2实验材料..............................................................................................................404.2.1病原菌........................................................................................................404.2.2实验试剂....................................................................................................404.2.3实验仪器设备............................................................................................414.3实验方法..............................................................................................................414.3.1气相色谱法测定月桂烯的含量................................................................414.3.2气相色谱质谱联用法测定月桂烯的物质变化........................................424.3.3GC-TOF-MS代谢组学..............................................................................424.3.4紫外分光光度法测定丙酮酸含量............................................................424.3.5高效液相色谱法测定ATP、ADP和AMP含量....................................424.3.6高效液相色谱法测定麦角固醇含量........................................................434.3.7紫外分光光度法测定H2O2含量..............................................................434.4结果与分析..........................................................................................................434.4.1外源月桂烯在指状青霉胞内胞外含量变化............................................434.4.2外源月桂烯在指状青霉胞内成分变化....................................................444.4.3GC-TOF-MS代谢组学..............................................................................454.4.4月桂烯对指状青霉孢子孢内丙酮酸含量的影响....................................494.4.5月桂烯对指状青霉孢子胞内ATP、ADP和AMP含量的影响............494.4.6月桂烯对指状青霉孢子胞内麦角固醇含量的影响................................50VII 4.4.7月桂烯对指状青霉孢子胞内H2O2含量的影响......................................514.5小结与讨论..........................................................................................................51第5章香茅醛对指状青霉的抑制作用..........................................................................535.1引言......................................................................................................................535.2实验材料..............................................................................................................535.2.1供试果实....................................................................................................535.2.2病原菌........................................................................................................535.2.3实验试剂....................................................................................................545.3实验方法..............................................................................................................545.3.1显微镜观察细胞形态结构........................................................................545.3.2荧光分光光度法测定细胞膜膜完整性....................................................545.3.3细胞物质泄漏测定....................................................................................545.3.4活体实验....................................................................................................555.4实验结果..............................................................................................................555.4.1香茅醛对指状青霉菌丝体和孢子形态结构的影响................................555.4.2香茅醛对指状青霉孢子膜完整性的影响................................................565.4.3香茅醛对指状青霉孢子胞外电导率和OD260nm的影响.........................575.4.4香茅醛对柑橘腐烂率的影响....................................................................585.5小结与讨论..........................................................................................................58第6章结论与展望..........................................................................................................606.1本论文主要的研究成果......................................................................................606.1.1柠檬烯对柑橘采后主要致病菌的作用....................................................606.1.2月桂烯对柑橘采后主要致病菌的作用....................................................606.1.3香茅醛对柑橘采后主要致病菌的作用....................................................616.2存在的问题及展望..............................................................................................61参考文献............................................................................................................................62致谢....................................................................................................................................68攻读硕士学位期间发表学术论文情况............................................................................69攻读硕士学位期间参加研究项目情况............................................................................69VIII 第1章绪论1.1研究目的及意义1.1.1柑橘采后病害柑橘是世界上最重要的经济水果作物，广泛种植于6大洲的100多个国家。中国是世界柑橘的发源地，据中华人民共和国国家统计局统计，2015年我国种植面积为2521.30千公顷，柑橘产量为3600.08万吨，柑橘产量稳居世界第一[1]。同时，柑橘成熟期集中，易造成季节性过剩，储存不当导致品质下降，加剧过剩期的卖难问题，导致大量的经济损失[2]。柑橘类水果通常又种植在偏远山区，远离消费市场。收获的果实通常要在它们进入消费市场前储存、运输，在此期间，果实极易受到真菌的侵染，导致果实采后病理性疾病如绿霉病、青霉病、酸腐病等的发生[3]，最终整果生理紊乱，腐烂变质[4]。在柑橘类水果中，绿霉病和青霉病是在果实收获后最具破坏性、造成最大经济损失的病害，它们主要是由指状青霉和意大利青霉所引起的，这两种真菌并不导致其他果蔬的采后腐烂，是柑橘类水果的特征致病菌，其致病原因是果实受到机械损伤，果皮油胞受损，休眠致病菌孢子出现在果实的表面变得活跃，并迅速萌发、定植到受伤的组织中[5]。柑橘采后病害中，酸腐病的发生仅次于绿霉病和青霉病，尤其是在高降雨量的时期，发病率极高，它是由酸腐病菌所引起的，这种致病菌繁殖快、生长周期短、对环境适应能力强，难以被杀菌剂杀死，极难控制，随着绿霉病和青霉病的防治不断加强，酸腐病的发生也在日益增多[6]。另外，柑橘采后发生的病害还有蒂腐病、黑斑病、黑腐病等等[7-9]，但是，人们对于病害发生规律的认识仍不够深入，鉴于此，认识柑橘采后病害的发生，探究柑橘腐烂机理对于柑橘采后病害控制尤为重要[10]。1.1.2柑橘采后致病菌(1)指状青霉指状青霉属菌物界、无性型真菌门、半知菌纲、壳霉目、杯霉科、指状青霉属，其菌丝多为单倍体、白色、有隔膜、丝状，其孢子多为无性分生孢子，成橄榄状，大小约4-6μm，有特殊香味。在固体培养基上培养指状青霉，起初为白色绒状菌落，略带粘性，后变为淡绿色，随后由绿变灰[11]。指状青霉菌落和孢子形态如图1-1，图1-2所示。1 图1-1指状青霉菌落形态图1-2指状青霉孢子形态指状青霉孢子通过柑橘果皮表面的伤口侵染柑橘果实，柑橘果实果皮油胞内的柑橘精油能够刺激这些孢子的萌发，孢子迅速萌发，在果实表面定植，蔓延生长，果实内的养分和水分非常有利于指状青霉的生长，指状青霉菌丝通过伤口侵入果实内继续生长，最终导致整果腐烂。由指状青霉侵染引起的腐烂的果实带有指状青霉特有的气味，果实表面覆盖大量的孢子，呈橄榄绿色，果皮软化，外力易破碎[12]。如图1-3所示。图1-3指状青霉侵染的柑橘果实(2)意大利青霉意大利青霉属菌物界、无性型真菌门、半知菌纲、壳霉目、杯霉科、意大利青霉属，其菌丝与指状青霉类似，其孢子呈圆球形，大小约为2-4μm，有特殊气味，气味比指状青霉的略淡。在固体培养基上培养意大利青霉，起初为白色绒状菌落，后变为青绿色，产孢能力强于指状青霉，产红色色素[13]。意大利青霉菌落和孢子形态如图1-4，图1-5所示。2 图1-4意大利青霉菌落形态图1-5意大利青霉孢子形态意大利青霉孢子小，通过伤口侵染柑橘果实后，刚开始在伤口处形成白色的菌斑，然后逐渐由白转青，迅速扩散蔓延。青霉病烂果表面较干，呈现青绿色，外力极易破碎[14]。如图1-6所示。图1-6意大利青霉侵染的柑橘果实(3)酸腐病菌酸腐病菌属菌物界、半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丝孢科，节卵孢属，其菌丝体多为竹节状、乳白色、有隔膜、有分支、粘稠，其孢子呈椭圆球形、或短棒状形，大小约为4-9μm，有酸腐气味。在固体培养基上培养酸腐病菌，菌丝呈平面扩散，生长快，粘稠[15]。酸腐病菌菌落和孢子形态如图1-7，图1-8所示。3 图1-7酸腐病菌菌落形态图1-8酸腐病菌孢子形态酸腐病菌侵染柑橘果实，引起酸腐病，柠檬、甜橙和酸橙最感病，橘类次之。高温、高湿、缺氧及伤口都有利于本病发生，被酸腐病菌侵染的柑橘果实有酸臭味，病果上可长出稀薄的白霜状霉层，病果可流出汁液，酸腐病一个独特的特征就是病果极易招引果蝇产卵，有幼蛆爬行，完全腐烂的果实溃烂不成形[16]。如图1-9所示。图1-9酸腐病菌侵染的柑橘果实1.1.3课题的提出柑橘采后病害的控制主要依赖物理防治、化学防治和生物防治，这些防治方法对于控制柑橘的采后病害有一定的作用，但人们对于病害的发生规律的认识仍不够深入。前期研究发现，油胞受损是柑橘腐烂的先决条件，没有受到机械损伤的果实很难腐烂，我们推测，是不是油胞中的某些物质诱导了果实的病害发生。柠檬烯、月桂烯、香茅醛在柑橘油胞中含量较高，其含量变化随柑橘的成熟而增加，并且，成4 熟的柑橘较生果易腐烂，这二者之间是不是存在某种联系[17-19]，所以本研究选取了这几种物质作为研究对象。(1)柠檬烯柠檬烯(Limonene)又名苎烯，1-甲基-4异丙基-环己烯，CAS号：5989-27-5，分子式：C10H16，分子量：136.23。结构式如图1-10所示。图1-10柠檬烯结构式(2)月桂烯月桂烯(Myrcene)又名香叶烯，7-甲基-3-亚甲基-1,6-辛二烯，CAS号：123-35-3，分子式：C10H16，分子量：136.23。结构式如图1-11所示。图1-11月桂烯结构式(3)香茅醛香茅醛(Citronellal)又名雄刈萱醛，3,7-二甲基-6-辛烯醛，CAS号：106-23-0，分子式：C10H18O，分子量：154.27。结构式如图1-12所示。CHO图1-12香茅醛结构式1.1.4选题意义我国是柑橘大国，大部分柑橘用于鲜销，在柑橘的贮藏和运输的过程中，会因5 为真菌的侵染造成大量的腐烂，导致重大经济损失[20]。目前，我国大部分柑橘贮藏与保鲜采用传统的杀菌剂，这不仅会让致病菌产生抗性，还会污染环境。柑橘防腐问题已迫在眉睫，然而人们对柑橘腐烂原因的认识仍不深入。本研究通过探究影响柑橘腐烂的因素，分析柑橘精油中各成分的作用，认识柑橘采后病害的发生，为采后病害防治提供一定的理论依据。1.2国内外研究进展1.2.1柑橘精油橘皮、橘渣是伴随柑橘加工业而产生的废弃物，其中包含如柑橘类精油、维生素等多种具有生理活性的物质。柑橘精油提取常用的方法有水蒸气蒸馏法、冷榨法、微波辐射法、有机溶剂浸提法、超临界流体萃取法、快速萃取法等[21]。其中，水蒸气蒸馏法是应用最广泛的方法。许景秋[22]采用介绍了从橙皮中提取柠檬烯的无害化方法。陈静静等[23]采用水蒸气蒸馏法提取橙皮中的橙皮油，发现橙皮油中含有90%的柠檬烯。张兆沛等[24]提取了沙田柚果皮精油，并经气相色谱和气质联用联机分析，鉴定出15种沙田柚精油中的主要的挥发性物质，发现沙田柚精油的主要成分为D-柠檬烯，占78.94%。SinghP等[25]采用水蒸气蒸馏法提取了甜橙(Citrussinensis)和柚子(Citrusmaxima)果皮精油的成分，发现柠檬烯的含量分别为90.66%和31.83%，并且柠檬烯浓度为500ppm时完全抑制黄曲霉(Aspergillusflavus)的生长，同时，介绍了柠檬烯可以作为食品的抗菌和抗氧化防腐剂，可以延长食物的保质期，具有抗氧化活性。1.2.2柑橘精油成分橘渣中最主要的精油成分是柠檬烯，它是一种功能性天然单萜类化合物，广泛地存在于众多富含精油的植物、果蔬中，是除派烯以外大自然分布最广的萜烯[26]。柠檬烯存在三种同分异构体，分别是右旋、消旋和左旋柠檬烯，其中右旋柠檬烯在自然界中含量最多、分布最广，同时，右旋柠檬烯也在橘皮精油中占比最大，并且，有研究表明，其含量随柑橘果实的成熟而增加[27-28]。月桂烯在柑橘精油中含量较高，仅次于柠檬烯，deAndradeDutraK等[29]鉴定了不同品种的柑橘精油成分，发现酸橙中柠檬烯占57.7%，其次是γ-萜烯(17.2%)，β-派烯(57.7%)，α-派烯(2.0%)，甜橙中柠檬烯和月桂烯的含量分别占93.8%和2.1%，椪柑中柠檬烯占94.2%，月桂烯占1.6%，葡萄柚中柠檬烯占94.2%，月桂烯占1.8%。TolbaH等[30]研究发现桉树精油主要成分是香茅醛(69.77%)、香茅醇(10.63%)和异蒲勒醇(4.66%)，其中，香茅醛对立枯丝核菌和稻长蠕孢菌有较强的抗菌活性。6 Carrillo-HormazaL等[31]研究的结果表明，酚类化合物(如肉桂醛、百里香酚和香芹酚)和其他单萜(如香茅醛)显示出较高的抗菌活性。刘顺珍等[32]采用水蒸气蒸馏法提取金橘叶和金橘果皮中精油，通过GC-MS分析检测金橘叶和金橘果皮中的精油组分，比较两者精油组分的异同，发现金橘叶精油中鉴定出27种成分，占总量的91.37%；金橘果皮精油中共鉴定出34种化学成分，占总量的96.23%，金橘叶和金橘果皮精油中都含有α-蒎烯、芳樟醇、β-石竹烯等13种物质。1.2.3柑橘精油各成分的作用柑橘精油有很多的功效，其中的各种组分也各有其不同的作用。王伟江[33]发现柠檬烯作为食品添加剂被广泛使用，柠檬烯具有多种生理作用，特别是有很好的抗癌活性。高大等[34]探讨了柠檬烯对K562白血病细胞增殖的影响及机制，发现柠檬烯在0.125-1.0mmol/L的浓度范围内，对K562细胞增殖有抑制作用，并通过观察细胞形态学变化、DNA琼脂糖凝胶电泳梯形条带、流式细胞仪检测等方法，共同证实了柠檬烯能诱导K562细胞凋亡。王玲等[35]研究了柠檬烯对MGC803细胞生长抑制和凋亡的影响，发现柠檬烯可引起MGC803细胞凋亡；柠檬烯处理，MGC803细胞内活性氧ROS明显升高，caspase-3蛋白的表达水平明显上升，这种作用机制可能是柠檬烯使MGC803细胞内产生大量的活性氧，也可能与细胞内caspase-3基因的表达变化有关。李厚金等[36]以柠檬烯为起始原料，利用微生物对柠檬烯进行生物转化，得到α-松油醇等有重要应用价值的含氧衍生物，并系统地综述了柠檬烯的微生物转化菌株和所得到转化产物的结构，分析了微生物对柠檬烯的主要转化途径，探究了影响其转化效率的主要因素，证实了柠檬烯转化产物具有区域和立体选择性，并且难以通过人工合成方法得到，此外，发现了在转化过程中诱导的高活性酶，如单加氧酶和羟化酶等。柑橘精油的各种组分让果实具有了独特的果香，其中，有些成分能抑制微生物的生长，有些成分能促进微生物生长，但也并不绝对，有些在低浓度下促进微生物的生长，而在高浓度下表现出促进作用。卢海燕等[37-38]用柠檬烯乳化液浸泡青椒和菠菜3min，研究柠檬烯对青椒和菠菜采后生理和贮藏品质的影响，发现柠檬烯乳化液浸泡处理对青椒和菠菜的腐烂有明显的抑制作用，可以减缓青椒中维生素C，叶绿素，可滴定酸的消耗和分解，可以保持菠菜的细胞膜结构，显著提高青椒和菠菜的贮藏品质。赵菊莲等[39-41]发现柠檬烯复合液能明显地抑制草莓、杏和油桃的腐烂变质，减缓果实维生素C、可溶性固形物、可滴定酸的消耗和分解，使果实原有营养指标缓慢减少的情况下，延缓果实采后生理变化，减少营养物质的损失，延长果实鲜食的供应期，提高其耐贮藏性。关天旺等[42]发现柠檬烯对常见致腐菌有良好的抑制作用，介绍了柠檬烯对肉类、水7 果等食品的防腐作用、抑菌机理及其应用的研究进展，展望柠檬烯作为天然防腐剂在食品保鲜中的应用前景。高红亮等[43]研究了乳化柠檬烯在橙汁保鲜中的应用，发现添加0.25g/L的柠檬烯保鲜效果较差，贮存期间细菌总数变化，只有4d明显低于空白对照，pH值和感官品质与空白对照相比，始终与空白对照无明显差异；而添加≥0.50g/L的柠檬烯，保鲜效果明显，柠檬烯处理组各项指标如细菌总数、pH值和感官品质等都明显优于对照组。韩青梅等[44]用扫描电镜观察了指状青霉在柑橘果实表面侵染定植的现象，发现接种后48h，果实伤口周围的分生孢子大都已萌发，并产生了新的分生孢子，但远离伤口的孢子却仍然未萌发，证实了受伤果皮伤口处的物质刺激了指状青霉孢子的萌发。Rodríguez等[45-47]研究发现挥发性萜烯含量的增加和肉质果实在成熟期间的防御能力下降之间具有相关性，这使得柑橘类水果更容易被坏死营养型真菌感染；全基因表达分析结果显示，柠檬烯基因的上调下调与果实对微生物的免疫密切相关，柠檬烯促进微生物的侵染导致果实果肉腐烂可能参与与肉质果实种子的传播过程；通过转基因的方式，使得柠檬烯合成酶基因下调，改变果实的单萜含量，将导致它能够抵抗指状青霉的侵染。Simas等[48]研究发现指状青霉、绿色木霉和葡萄孢菌是典型的水果收获后的病原体，使用精油来控制水果的真菌疾病是一种替代合成杀菌剂的好方法，通过最低抑制浓度测定实验证实了柠檬醛和其他纯单方精油有较好的抑制作用，其他单方精油只有温和的抗真菌活性，实验中测试的纯手型挥发性化合物主要有(+)-α-派烯，(+)-β-派烯，(-)-α-派烯，(-)-β-派烯，柠檬醛(橙花醛+香叶醛)，γ-萜品烯，(+)-柠檬烯和(-)-柠檬烯。除开柠檬醛，(+)-α-派烯和(+)-β-派烯，其他所有测试的纯手性挥发性化合物都刺激指状青霉孢子的萌发。1.3研究内容及方法本研究选取了引起柑橘腐烂最主要的三种致病菌，考察了十个碳原子的三种萜烯类物质对它们的作用。(1)明确三种致病真菌菌丝体生长和孢子萌发的特点，明确芳香物质对三种致病菌菌丝体生长和孢子萌发的机理。如果是促进作用，则明确其最佳促进的浓度，如果是抑制作用，则明确其最小抑菌浓度和最小杀菌浓度。(2)根据低浓度下柠檬烯诱导指状青霉的孢子萌发，进一步明确低浓度下柠檬烯对指状青霉孢子萌发的机理。通过转录组学和蛋白组学关联分析，找到柠檬烯诱导指状青霉孢子萌发的差异基因和蛋白，通过荧光定量PCR验证，验证差异表达的基因，通过代谢组学分析差异代谢物，明确其关联的代谢途径，并与多组学比较，解析其诱导萌发的机理。8 (3)根据月桂烯即使在较高浓度仍对指状青霉的孢子萌发表现出较强的促进作用，进一步明确月桂烯对指状青霉孢子萌发的作用。通过GC-MS分析和GC定量，测定月桂烯在指状青霉孢子萌发过程中月桂烯的浓度变化，通过代谢组学分析差异代谢物，验证胞内代谢物的变化，测定指状青霉孢子丙酮酸、麦角固醇、H2O2等物质含量变化，测定胞内ATP、ADP、AMP含量变化，综合所有实验结果，明确月桂烯在指状青霉孢子萌发过程中所扮演的角色。(4)根据高浓度下香茅醛对指状青霉的强抑制作用，进一步明确其抑制作用的机制。通过荧光染料碘化丙啶(PI)对指状青霉染色，观察其细胞膜损伤情况，计算细胞膜完整率，检测胞内物质泄露情况，通过活体实验验证其是否能作为柑橘采后保鲜剂。1.4研究目标成果本研究拟在课题组前人工作基础上，分析柑橘精油中的主要成分对病原菌的作用，明确其作用机理，分析柑橘发病原因，柑橘采后病害发生机理研究，丰富人们对柑橘采后病害规律的认识，为柑橘采后病害控制提供理论依据。(1)根据柑橘精油成分的不同，先区分柑橘精油中各个成分对柑橘采后病原菌的作用，明确其是以促进作用为主，还是以抑制作用为主，同时，明确其对应的浓度节点。(2)以促进作用为主的成分：明确其在病原菌胞内的物质流向，作用机理，找出其诱导病原菌孢子萌发的原因，从而有针对性的解决采后病害的问题。(3)以抑制作用为主的成分：明确其抑制作用机理，开发其应用价值，解决实际问题。9 第2章几种芳香物质对柑橘采后主要致病菌菌丝体生长和孢子萌发的影响2.1引言柑橘果实腐烂的主要原因是其外果皮油胞受到机械损伤，导致油胞内的芳香物质释放，引起致病菌的侵染[19]。油胞内的芳香物质主要包含：柠檬烯、月桂烯、香茅醛、柠檬醛、芳樟醇、α-松油醇等，这些芳香物质中，柠檬烯、月桂烯、香茅醛在低浓度下可以促进指状青霉的生长[3]。为了认识柑橘采后病害发生的规律，我们首先应该找到这三种芳香物质对病原菌作用的基本规律。因此，本章选取了柑橘油胞中的柠檬烯、月桂烯、香茅醛作为研究对象，选取了柑橘主要病害的三种致病菌指状青霉、意大利青霉和酸腐病菌作为实验菌种，探究了这三种单一组分对柑橘采后主要致病菌菌丝体生长和孢子萌发的影响。2.2实验材料2.2.1病原菌指状青霉(PenicilliumdigitatumSacc.)、意大利青霉(P.italicumWehmer)、酸腐病菌(Geotrichumcitri-aurantiiLink)分离于发病的柑橘果实表面，菌种保藏于湘潭大学生物与食品工程系专业实验室。孢子悬浮液浓度为106个/mL。2.2.2实验试剂表2-1主要试剂一览表产品名称规格产地/厂家柠檬烯>99.0%(GC)美国阿拉丁工业公司月桂烯>90.0%(GC)美国阿拉丁工业公司香茅醛>96.0%(GC)美国阿拉丁工业公司吐温-80化学纯(CP)天津市光复精细化工研究所无水乙醇分析纯(AR)天津市恒兴化学试剂制造有限公司葡萄糖分析纯(AR)西陇化工股份有限公司琼脂分析纯(AR)西陇化工股份有限公司2.2.3实验仪器设备10 表2-2主要实验设备设备名称设备型号设备产地手提式压力蒸汽无菌器MLS-3020日本SANYO电子有限公司分析天平FA1004N上海精密科学仪器厂垂直流洁净工作台SCW-CJ-1F苏州安瑞净化科技有限公司生化培养箱SPX-250B上海博迅实业有限公司超低温冰箱DW-86L388海尔集团有限公司电子天平BL320HSHIMADZU公司血球计数板MQ上海市求精生化试剂有限公司2.3实验方法2.3.1对菌丝体生长的影响[49]三种芳香物质对菌丝体生长的影响采用污染食物技术法进行。首先，将含有2.5%吐温-80的PDA培养基高压灭菌20min，冷却，在培养基凝固之前加入相应浓度的精油(柠檬烯、月桂烯、香茅醛)，配制成终浓度为0.00、0.20、0.40、0.80、1.60、3.20、6.40μL/mL的培养基，将培养基混合均匀，然后倒入直径为9mm的培养皿中，放置10min，待培养基凝固，最后用6mm的打孔器在培养7d的病原菌平板边缘打下菌苔，分别置于各培养皿中间，在25±2℃条件下倒置培养5d。采用十字交叉法每隔24h测菌苔直径。以0.00μL/mL的培养基作为对照，每个浓度3次重复。2.3.2对孢子萌发的影响[19](1)孢子萌发曲线将含有2.5%吐温-80的马铃薯葡萄糖培养基(PDB)高压灭菌20min，冷却，加入孢子悬浮液，使其最终浓度为5×106个/mL，将培养基混合均匀在25±2℃，150rpm摇床培养，定时测定萌发率。萌发率(%)=(萌发的孢子数/总孢子数)×100(2)三种芳香物质对孢子萌发的影响将含有2.5%吐温-80的PDB培养基高压灭菌20min，冷却，加入相应浓度的柠檬烯(或月桂烯、香茅醛)，使其最终浓度为：柠檬烯和月桂烯(0.00、0.10、0.20、0.40、0.80、1.60，3.20μL/mL)，香茅醛(0.00、0.050、0.10、0.20、0.40、0.80，1.60μL/mL)，同时加入孢子悬浮液，使其最终浓度为5×106个/mL，将培养基混合均匀，于11 25±2℃，150rpm摇床培养。根据萌发曲线定时测定萌发率。2.3.3数据统计及图形分析在Excel中对所有的数据进行分析，根据传统的分析方法计算标准偏差，使用SPSS16.0软件、One–wayANOVA模式分析实验结果的显著性差异(P<0.05)。2.4结果与分析2.4.1对菌丝体生长的影响(1)柠檬烯对三种病原菌菌丝体的生长的影响表2-3柠檬烯对指状青霉菌丝体生长的影响浓度菌斑直径(mm)(n=3)μL/mL1d2d3d4d5d0.006.0±0.00e12.7±1.53f23.0±2.00e28.3±0.58f39.7±1.53c0.208.5±0.50bc18.3±0.57bc32.0±0.00c41.0±2.65b47.7±1.53a0.4011.0±1.00a21.3±0.58a35.0±1.00ab42.3±2.08a46.0±1.73ab0.809.3±0.58b19.0±1.00b36.0±2.65a39.0±1.00bc43.7±1.53b1.607.7±0.58cd16.7±0.58cd32.3±0.58bc37.0±1.00cd40.3±2.08c3.207.0±1.00de15.7±2.08de31.0±1.00cd34.3±0.58de39.7±0.58c6.406.0±0.00e14.0±1.00ef29.0±2.00d32.3±2.52e39.3±1.15c注：“a-d”表示同一时间不同浓度处理组之间的差异(P<0.05)表2-4柠檬烯对意大利青霉菌丝体生长的影响浓度菌斑直径(mm)(n=3)μL/mL1d2d3d4d5d0.009.0±0.50d14.5±0.50c20.8±1.04e27.0±1.00e33.7±0.58c0.2011.3±0.58bc19.7±1.53b29.3±0.58c34.5±0.50c40.8±0.76b0.4013.2±0.29a24.3±0.58a27.7±1.53a37.7±0.58a43.7±1.53a0.8012.0±0.00b19.8±1.04b31.3±0.58b36.0±1.00b41.3±1.15b1.6010.7±0.58c18.3±0.58b27.7±1.53d31.0±1.00d40.0±1.00b3.209.7±0.58d15.0±1.00c18.7±0.58f24.7±0.58f31.0±1.00d6.408.8±0.76d14.7±0.58c18.0±0.00f24.3±0.58f31.2±0.29d注：“a-f”表示同一时间不同浓度处理组之间的差异(P<0.05)12 表2-5柠檬烯对酸腐病菌菌丝体生长的影响浓度菌斑直径(mm)(n=3)μL/mL1d2d3d4d5d0.008.0±0.00d22.7±0.58c35.7±1.15b54.0±1.00d65.7±0.58c0.2016.3±0.58a31.3±2.31ab48.0±2.00a66.3±1.53ab81.0±1.00b0.4017.0±1.00a33.3±0.58a51.0±1.73a68.3±1.53a85.3±1.15a0.8016.3±0.58a33.0±1.00ab49.7±3.06a65.7±2.08abc82.3±3.79ab1.6015.3±0.58b32.5±0.50ab48.0±1.73a64.3±1.52bc80.7±2.08b3.2014.0±0.00c30.8±1.04b48.2±1.04a63.3±1.15c80.0±1.00b6.408.0±0.00d22.5±1.32c37.3±1.15b52.0±1.73d68.7±2.52c注：“a-d”表示同一时间不同浓度处理组之间的差异(P<0.05)结果表明：柠檬烯对指状青霉、意大利青霉和酸腐病菌菌丝体的生长具有较好的促进作用，随着柠檬烯浓度的增加，促进作用减弱。低浓度柠檬烯对指状青霉、意大利青霉和酸腐病菌菌丝体的生长促进作用的浓度范围分别为0.2-0.8μL/mL、0.2-1.6μL/mL、0.2-3.2μL/mL，其中柠檬烯浓度分别为0.2，0.4，0.4μL/mL时，促进作用最强。高浓度柠檬烯(6.4μL/mL)既没有促进指状青霉和酸腐病菌菌丝体的生长，也没有明显抑制其生长，但对意大利青霉菌丝体的生长表现出一定的抑制作用。(2)月桂烯对三种病原菌菌丝体的生长的影响月桂烯对指状青霉菌、意大利青霉、酸腐病菌菌丝体生长的影响如表2-6、表2-7、表2-8所示。表2-6月桂烯对指状青霉菌丝体生长的影响浓度菌斑直径(mm)(n=3)μL/mL1d2d3d4d5d0.006.0±0.00d12.7±1.53d23.0±2.00d28.3±0.58d39.7±1.53d0.2010.2±0.29a18.0±0.50a29.7±0.58a37.7±0.58a43.2±0.76a0.4010.3±0.58a17.8±1.04ab28.3±1.15bc37.7±1.17a43.3±0.58a0.809.5±0.50ab16.5±0.50abc28.8±1.26bc37.7±0.58a42.7±1.53a1.608.2±0.29c16.2±0.29bc28.3±1.53bc36.3±2.08ab42.7±0.58a3.208.3±0.76bc16.2±0.76bc27.7±1.26bc34.7±1.53c41.7±1.44a6.407.7±1.53c15.0±1.00c26.3±1.53c35.7±1.53ab41.5±0.50ab注：“a-d”表示同一时间不同浓度处理组之间的差异(P<0.05)13 表2-7月桂烯对意大利青霉菌丝体生长的影响浓度菌斑直径(mm)(n=3)μL/mL1d2d3d4d5d0.009.0±0.50c14.5±0.50c20.8±1.04b27±1.00b33.7±0.58c0.2011.2±0.28ab17.8±2.25a27.3±2.08a31.8±0.76a38.1±2.02a0.4011.7±0.58a17.3±1.52ab28.3±2.51a33.0±2.00a41.3±1.53a0.8010.7±1.15ab17.3±2.31ab26.7±2.89a31.7±2.88a40.8±1.44a1.6010.5±1.50b16.3±0.58abc25.5±0.50a31.2±1.04a36.5±0.50b3.209.1±0.29c15.0±0.00bc20.2±0.29b26.5±0.50b34.0±1.00c6.409.3±0.58c14.7±0.58bc20.0±0.00b26.1±0.76b33.3±0.58c注：“a-c”表示同一时间不同浓度处理组之间的差异(P<0.05)表2-8月桂烯对酸腐病菌菌丝体生长的影响浓度菌斑直径(mm)(n=3)μL/mL1d2d3d4d5d0.008.0±0.00f22.7±0.58d35.7±1.15f54.0±1.00e65.7±0.58d0.2022.3±1.53a35.0±1.00a63.3±0.58a76.7±1.15a87.3±1.53a0.4021.3±0.58ab33.7±0.58a59.7±1.53b73.0±1.73b82.7±2.52b0.8019.7±1.53bc30.3±2.52b53.7±2.08c61.7±1.53c73.0±1.00c1.6018.2±0.29c27.0±1.00c46.3±1.15d57.3±1.15d65.7±0.58d3.2015.7±1.15d26.0±1.00c45.7±1.53d54.3±1.53e67.3±2.08d6.4013.0±2.00e22.7±2.08d41.3±2.08e51.0±2.00e62.3±2.52d注：“a-f”表示同一时间不同浓度处理组之间的差异(P<0.05)结果表明：月桂烯在所测浓度范围内对三种病原菌的生长表现出明显的促进作用。与柠檬烯相比，月桂烯对三种病原菌的促进作用更强，其促进作用的浓度范围分别为：指状青霉(0.2-6.4μL/mL)、意大利青霉(0.2-1.6μL/mL)和酸腐病菌(0.2-6.4μL/mL)。在所测试的浓度范围(0.2-6.4μL/mL)内，月桂烯对指状青霉和酸腐病菌菌丝体的生长一直表现出较强的促进作用，对意大利青霉来说，当浓度大于3.2μL/mL时，月桂烯对其促进作用不明显，但也没有表现出抑制作用。(3)香茅醛对三种病原菌菌丝体的生长的影响香茅醛对指状青霉菌、意大利青霉、酸腐病菌菌丝体生长的影响如表2-9、表2-10、表2-11所示。14 表2-9香茅醛对指状青霉菌丝体生长的影响浓度菌斑直径(mm)(n=3)μL/mL1d2d3d4d5d0.006.0±0.00a12.7±1.53b23.0±2.00b28.3±0.58b39.7±1.53b0.206.0±0.00a16.2±1.26a27.2±2.47a32.8±0.29a43.2±2.36a0.406.0±0.00a12.8±1.60b20.3±1.53c27.3±1.53b35.5±1.80c0.806.0±0.00a6.3±0.29c17.7±0.76d23.2±2.00c29.8±1.26d1.606.0±0.00a6.0±0.00c14.1±0.29e19.3±0.58c28.5±0.5d3.206.0±0.00a6.0±0.00c6.0±0.00f6.0±0.00d6.0±0.01e6.406.0±0.00a6.0±0.00c6.0±0.00f6.0±0.00d6.0±0.00e注：“a-e”表示同一时间不同浓度处理组之间的差异(P<0.05)表2-10香茅醛对意大利青霉菌丝体生长的影响浓度菌斑直径(mm)(n=3)μL/mL1d2d3d4d5d0.009.0±0.50b14.5±0.50bc20.5±1.04bc27.0±1.00b33.7±0.58c0.2012.2±0.76a19.0±1.00a29.5±0.87a34.0±1.00a42.2±1.04a0.409.5±1.32b15.3±0.58b22.0±1.00b27.2±0.29b35.8±0.76b0.806.0±0.00c13.8±1.44c19.0±2.65c26.5±1.32b31.7±2.08d1.606.0±0.00c6.0±0.00d6.0±0.00d6.0±0.00d6.0±0.00e3.206.0±0.00c6.0±0.00d6.0±0.00d6.0±0.00d6.0±0.00e6.406.0±0.00c6.0±0.00d6.0±0.00d6.0±0.00d6.0±0.00e注：“a-e”表示同一时间不同浓度处理组之间的差异(P<0.05)表2-11香茅醛对酸腐病菌菌丝体生长的影响浓度菌斑直径(mm)(n=3)μL/mL1d2d3d4d5d0.008.0±0.00c22.7±0.58c35.7±1.15d54.0±1.00c65.7±0.58d0.2019.7±0.58a37.3±1.15a63.7±0.58a74.7±2.30a86.7±1.15a0.4017.2±0.76b34.0±1.00b60.3±0.58b72.7±2.30a81.3±1.53b0.808.3±0.58c23.3±1.52c48.7±1.15c60.3±1.52b72.3±1.53c1.606.0±0.00d6.0±0.00d6.0±0.00e6.0±0.00d6.0±0.00e3.206.0±0.00d6.0±0.00d6.0±0.00e6.0±0.00d6.0±0.00e6.406.0±0.00d6.0±0.00d6.0±0.00e6.0±0.00d6.0±0.00e注：“a-e”表示同一时间不同浓度处理组之间的差异(P<0.05)15 低浓度香茅醛对三种菌菌丝体的生长有一定的促进作用，浓度范围为0.2、0.2-0.4、0.2-0.8μL/mL。随着香茅醛浓度的增加，促进作用减弱，高浓度香茅醛显著抑制三种菌丝体生长，MIC均为1.6μL/mL，MFC分别为3.2、1.6、1.6μL/mL。2.4.2对孢子萌发的影响(1)孢子萌发曲线图2-1指状青霉孢子萌发曲线图2-2意大利青霉孢子萌发曲线图2-3酸腐病菌孢子萌发曲线16 结果表明：三种菌的孢子萌发呈现“S”形曲线趋势，其中，指状青霉，6h开始萌发，12h的萌发率为63.3%，18h完全萌发；意大利青霉，9h开始萌发，12h的萌发率为55.3%，21h完全萌发；酸腐病菌孢子，3h开始萌发，6h的萌发率为38.0%，12h完全萌发。根据以上结果，分别选取12h，12h，6h作为芳香物质对指状青霉、意大利青霉、酸腐病菌孢子萌发影响的时间点。(2)柠檬烯对三种病原菌孢子萌发的影响图2-4柠檬烯对指状青霉孢子萌发的影响图2-5柠檬烯对意大利青霉孢子萌发的影响图2-6柠檬烯对酸腐病菌孢子萌发的影响17 结果表明：柠檬烯在低浓度下对指状青霉(0.1-0.4μL/mL)、意大利青霉(0.4μL/mL)和酸腐病菌(0.4-1.6μL/mL)的孢子萌发促进作用明显。在高浓度(3.2μL/mL)下，对三种菌孢子萌发表现出抑制作用。(3)月桂烯对三种病原菌孢子萌发的影响图2-7月桂烯对指状青霉孢子萌发的影响图2-8月桂烯对意大利青霉孢子萌发的影响图2-9月桂烯对酸腐病菌孢子萌发的影响结果表明：月桂烯促进作用更强，当浓度≤3.2μL/mL时，月桂烯对三种菌一直表现出较强的促进作用。18 (4)香茅醛对三种病原菌孢子萌发的影响图2-10香茅醛对指状青霉孢子萌发的影响图2-11香茅醛对意大利青霉孢子萌发的影响图2-12香茅醛对酸腐病菌孢子萌发的影响结果表明：香茅醛在低浓度下对指状青霉(0.05μL/mL)、意大利青霉(0.1μL/mL)和酸腐病菌(0.05-0.2μL/mL)促进作用明显。当香茅醛浓度≥0.2μL/mL时，抑制指状青霉孢子萌发，当香茅醛浓度≥0.4μL/mL时，抑制意大利青霉孢子萌发，当香茅醛浓度≥0.8μL/mL时，抑制酸腐病菌孢子萌发。19 2.5小结与讨论柠檬烯在低浓度下对指状青霉(0.2-0.8μL/mL)、意大利青霉(0.2-1.6μL/mL)和酸腐病菌(0.2-3.2μL/mL)表现出促进作用。柠檬烯在高浓度(3.2-6.4μL/mL)下，既没有对青霉的生长表现出促进作用，也没有明显抑制其生长。酸腐病菌对柠檬烯的耐受能力更强，3.2μL/mL时仍促进作用明显，即使在6.4μL/mL时，也未表现出抑制作用。柠檬烯在低浓度下对指状青霉(0.1-0.4μL/mL)、意大利青霉(0.4μL/mL)和酸腐病菌(0.4-1.6μL/mL)的孢子萌发促进作用明显。在高浓度(≥3.2μL/mL)下，对三种菌孢子萌发表现出抑制作用。这与前人的报道结果相符[19]。月桂烯在所测浓度范围内对三种病原菌的生长表现出明显的促进作用。月桂烯的促进作用比柠檬烯的更强，其促进作用的浓度范围也更宽，分别为：指状青霉(0.2-6.4μL/mL)、意大利青霉(0.2-1.6μL/mL)和酸腐病菌(0.2-6.4μL/mL)。月桂烯不抑制三种菌的生长。外源添加月桂烯，会导致青霉孢子扩散得更快。当浓度≤3.2μL/mL时，月桂烯对三种菌孢子萌发一直表现出较强的促进作用。这与前人的报道结果相符[3]。香茅醛在低浓度下对三种菌表现出促进作用，对青霉而言，其浓度小于0.2μL/mL时，表现出促进作用，对酸腐而言，其浓度小于0.8μL/mL时，表现出促进作用。高浓度香茅醛抑制三种菌菌丝体生长，指状青霉(≥0.8μL/mL，MIC=1.6μL/mL，MFC=3.2μL/mL)、意大利青霉(≥1.6μL/mL，MIC=MFC=1.6μL/mL)和酸腐病菌(≥1.6μL/mL，MIC=MFC=1.6μL/mL)。低浓度香茅醛对指状青霉(0.05μL/mL)、意大利青霉(0.1μL/mL)和酸腐病菌(0.05-0.2μL/mL)孢子萌发的促进作用明显。当香茅醛浓度大于0.2、0.4、0.8μL/mL时，指状青霉、意大利青霉、酸腐病菌孢子萌发受到抑制。芳香物质在低浓度下诱导微生物的生长，在高浓度下抑制微生物的生长。王华[17]研究发现，砂糖橘精油在低于1.25μL/mL、2.5μL/mL时可以显著促进指状青霉、意大利青霉的孢子萌发，超过这一浓度，抑制其萌发。王笑[19]也曾做过类似的报道，柠檬烯促进指状青霉孢子的萌发，当孢子悬浮液浓度分别为106个/mL和107个/mL时，其对应的最佳促进作用浓度为0.25μL/mL和0.50μL/mL。这种低浓度促进、高浓度抑制的现象有两种解释，一种观点认为，这是一种毒物刺激效应，是指较低浓度的有毒物质不但对微生物无害，反而会起有益的作用，另一种观点认为，这是生物体自身的保护机制，即低浓度所引起的刺激作用是生物体对有毒物质的反抗[19]。综上可知，芳香物质对柑橘主要致病菌菌丝体生长和孢子萌发的作用表现为低浓度促进、高浓度抑制，柠檬烯、月桂烯主要为促进作用，香茅醛主要为抑制作用。20 第3章柠檬烯对指状青霉孢子萌发作用的分子机理3.1引言柠檬烯是橘皮精油中最主要的成分，低浓度下能显著促进柑橘采后病原菌的孢子萌发[19]，另外，柑橘采后病害最为严重的就是由于指状青霉侵染所导致的绿霉病[4]。合成杀菌剂如抑霉唑、噻菌灵、嘧霉胺、咯菌腈等能有效地减少采后腐烂[50]，一些植物精油也能够选择控制柑橘采后病害，低毒并且安全环保，但人们对于病害的认识并不深入[51-52]，要想真正控制柑橘采后病害，我们必须找到病害发生的根源。柠檬烯作为橘皮精油中含量最多的组分，可能也是柑橘采后病害发生的根源，选取柠檬烯作为指状青霉孢子萌发的作用机理解析，具有普遍意义。本章在前期实验基础上，进一步通过转录组学、蛋白组学、代谢组学综合分析，荧光定量PCR验证，解析柠檬烯对指状青霉孢子萌发作用的分子机制。3.2材料与方法3.2.1病原菌指状青霉(P.digitatumSacc.)分离于发病的柑橘果实表面，菌种保藏于湘潭大学生物与食品工程系专业实验室。孢子悬浮液浓度为106个/mL。3.2.2转录组和蛋白组测序[53-56]根据前期实验结果，选取7h和9h柠檬烯处理组和对照组的4个样本，命名为：C1、C2、T1、T2。委托深圳华大基因科技服务有限公司进行。应用RNA-Seq技术分析柠檬烯处理对指状青霉基因及相关代谢通路的影响，应用iTRAQ技术分析相应蛋白及相关代谢通路的影响。(1)转录组差异基因表达水平参数设定为FDR≤0.001且|log2Ratio|≥1。即选取差异表达基因列表(FDR≤0.001且|log2Ratio|≥1)参数进行筛选，差异表达基因为FDR≤0.001且倍数差异不低于1倍的基因。iN(xi)!2P(ix)(xi1)N1N2x!i!1N1其中，N1为对照组基因片段数目，N2为处理组基因片段数目。(2)蛋白组差异蛋白按NR、Swiss-Prot、KEGG和COG的优先级顺序将Unigene序列与以上蛋白库做blastx比对(evalue<0.00001)，以Mascot搜索结果为基础，根21 据Mascot的加权方式，根据一组肽段的比例来进行定量(同位素报告集团的相对含量)。根据公式计算P值，以P<0.05为阈值，满足此条件的GOterm定义为在差异蛋白质中显著富集的GOterm。通过GO显著性分析能确定差异蛋白的主要生物学功能。把蛋白质变化量大于1.2倍和P<0.05的确定为差异显著的蛋白。MNMm1iniP1i0Nn其中，N为所有蛋白中具有GO注释信息的数目，n为N中差异蛋白的数目，M为所有注释到某个GO条目的数目，m为注释到某个GO条目的差异蛋白数目。3.2.3蛋白组与转录组关联分析[57-69]根据转录组和蛋白组的测序结果，分别将Unigene注释到NR，NT，Swiss-Prot，KEGG，COG，GO库，并分别对注释到每个库以及所有注释上的Unigene数目进行统计。从转录组和蛋白组水平同时进行GO及代谢通路上的富集分析，并将两组学的信息进行整合分析，从基因集共表达的层面上研究基因表达调控。3.2.4荧光定量PCR[70-72]根据前期实验结果，选取0h、7h和9h柠檬烯处理组和对照组的5个样本，命名为：C0、C1、C2、T1、T2。委托南京百思禾生物科技有限公司进行样品检测和分析。依据转录组和蛋白组关联分析的结果，选择19个功能已知，且转录与蛋白关联分析得出的差异基因进行荧光定量PCR定量分析，数据计算方法采用2-ΔΔCT法。3.2.5GC-TOF-MS代谢组学[73-76]根据前期实验结果，选取7h和9h柠檬烯处理组和对照组的4个样本，命名为：C1、C2、T1、T2，每个样本6个生物学重复。委托上海百趣生物医学生物科技有限公司进行样品检测和分析。基础数据分析包括：数据预处理，PCA分析，正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)，差异化合物筛选和鉴定。高级数据分析包括：代谢通路分析。采用OPLS-DA模型第一主成分值(VIP值)，并结合t检验的P值来寻找差异性表达代谢物。取阈值VIP>1且P<0.05的代谢物为差异代谢物。22 3.3结果与分析3.3.1Unigene的长度分布图3-1C1-Unigene的长度分布结果图3-2T1-Unigene的长度分布结果图3-3C2-Unigene的长度分布结果23 图3-4T2-Unigene的长度分布结果图3-5All-Unigene的长度分布结果应用RNA-Seq技术，总计产出18946958220nt数据。组装结果总Unigene22817个，总长44748785nt，平均长度1961nt，N50达到2938nt。Unigene功能注释，注释到NR，NT，Swiss-Prot，KEGG，COG，GO库的Unigene分别是19098个，19062个，13065个，12696个，9706个，12054个，所有注释上的Unigene是20707个。由图3-1、图3-2、图3-3、图3-4、图3-5可知，在C1、T1、C2、T2的样本中，Unigene长度分布都不超过3000nt，并且Unigene长度分布随着序列的增加而减少。3.3.2NR分类图3-6表示NR注释的e-value分布(A)、NR注释的相似度分布(B)和NR注释的物种分布(C)。由图可知，指状青霉的主要转录组数据明显匹配指状青霉PHI26(35.2%)和指状青霉Pd1(34.9%)。24 图3-6NR分类图3.3.3GO分类图3-7GO分类图25 由图3-7可知，代谢过程、催化活性、细胞过程以及绑定是占主导地位的基因类别，Unigene数量分别为7689，7015，6793和6396。单个组织的过程、细胞、细胞部分、细胞器、生物膜也占据较大比例，Unigene数量在2000以上，5000以下。此外，生物附着、细胞连接以及细胞死亡等被检测出的Unigene数量均小于10。3.3.4COG分类图3-8COG分类图由图3-8可知，通用一般功能预测的Unigene数量为3602，占比最高，其次分别为碳水化合物的运输和代谢(1591)，氨基酸运输和代谢(1455)，复制、重组和修复(1345)，转录(1321)，翻译、核糖体结构和生物转化(1256)。3.3.5差异表达基因的代谢途径富集分析应用RNA-Seq技术分析柠檬烯处理对指状青霉基因及相关代谢通路的影响，结果如表3-1所示。26 表3-1差异表达基因的代谢途径富集分析差异基因的代谢所有基因的代谢序号代谢途径途径注释途径注释代谢途径ID(102)(12696)1代谢途径44(43.14%)3658(28.81%)ko011002次生代谢产物的生物合成21(20.59%)1496(11.78%)ko011103淀粉和蔗糖代谢12(11.76%)672(5.29%)ko005004甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢10(9.8%)217(1.71%)ko002605氨基糖和核苷酸糖代谢9(8.82%)418(3.29%)ko005206乙醛酸和二甲酸代谢5(4.9%)111(0.87%)ko006307戊糖和葡萄糖醛酸互变途径4(3.92%)130(1.02%)ko000408氮代谢4(3.92%)143(1.13%)ko009109减数分裂4(3.92%)318(2.5%)ko0411310一碳代谢3(2.94%)63(0.5%)ko0067011半乳糖代谢3(2.94%)143(1.13%)ko0005212果糖和甘露糖代谢3(2.94%)224(1.76%)ko0005113过氧物酶体3(2.94%)264(2.08%)ko0414614细胞周期3(2.94%)364(2.87%)ko0411115RNA转运3(2.94%)470(3.7%)ko0301316MAPK信号通路3(2.94%)482(3.8%)ko0401117谷胱甘肽代谢2(1.96%)120(0.95%)ko0048018氰基氨基酸代谢2(1.96%)125(0.98%)ko0046019赖氨酸降解2(1.96%)156(1.23%)ko0031020组氨酸代谢2(1.96%)160(1.26%)ko0034021丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢2(1.96%)170(1.34%)ko0025022脂肪酸代谢2(1.96%)193(1.52%)ko0007123内吞作用2(1.96%)235(1.85%)ko0414424酪氨酸代谢2(1.96%)337(2.65%)ko0035025抗坏血酸代谢1(0.98%)42(0.33%)ko0005326柠檬酸循环1(0.98%)48(0.38%)ko0002027脂肪酸生物合成1(0.98%)52(0.41%)ko0006128戊糖磷酸途径1(0.98%)93(0.73%)ko0003029类固醇生物合成1(0.98%)93(0.73%)ko0010030ABC转运途径1(0.98%)107(0.84%)ko0201031β-丙氨酸代谢1(0.98%)116(0.91%)ko0041032氧化磷酸化1(0.98%)125(0.98%)ko0019033色氨酸代谢1(0.98%)154(1.21%)ko0038034苯丙氨酸代谢1(0.98%)170(1.34%)ko0036035甘油酯代谢1(0.98%)184(1.45%)ko0056136甘油磷脂代谢1(0.98%)198(1.56%)ko0056437嘧啶代谢1(0.98%)227(1.79%)ko0024038精氨酸和脯氨酸代谢1(0.98%)281(2.21%)ko0033039糖酵解和糖质新生1(0.98%)295(2.32%)ko0001040嘌呤代谢1(0.98%)342(2.69%)ko0023027 由表中数据可知，102个差异表达的基因被映射到KEGG数据库中，并关联代谢途径。其中，代谢途径，次生代谢产物的生物合成，淀粉和蔗糖代谢，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，氨基糖和核苷酸糖代谢，乙醛酸和二甲酸代谢等代谢途径均在一定程度上受到柠檬烯的刺激。与遗传信息相关的代谢途径，如减数分裂(4，3.92%)、RNA转运(3，2.94%)、嘧啶代谢(1，0.98%)和嘌呤代谢(1，0.98%)等也受到了一定程度的影响。此外，生物膜上的相关蛋白、物质转运相关代谢途径也受到刺激，如过氧物酶体(3，2.94%)、MAPK信号通路(3，2.94%)、内吞作用(2，1.96%)和ABC转运途径(1，0.98%)等。能量是细胞生命活动的枢纽，与能量代谢直接相关的柠檬酸循环(1，0.98%)、糖酵解和糖质新生(1，0.98%)等代谢途径也受到一定程度的影响。3.3.6差异表达蛋白的的代谢途径富集分析iTRAQ量化项目共生成300554个光谱图，18297个肽段，鉴定出3717个蛋白质。应用iTRAQ技术分析柠檬烯处理对指状青霉蛋白及相关代谢通路的影响，结果如表3-2所示。由表中数据可知，2678个差异表达的蛋白被映射到KEGG数据库中，并关联代谢途径。其中，通过与转录组数据进行关联分析，发现柠檬烯处理对指状青霉孢子萌发作用的主要代谢途径有：代谢途径、次生代谢产物的生物合成、淀粉和蔗糖代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、脂肪酸代谢、柠檬酸循环、戊糖和葡萄糖醛酸互变途径、氮代谢、减数分裂、半乳糖代谢、MAPK信号通路、内吞作用、戊糖磷酸途径、ABC转运途径、嘧啶代谢、糖酵解和糖质新生、嘌呤代谢等。3.3.7转录组与蛋白组关联分析关联分析转录组与蛋白组的数据，得到柠檬烯诱导指状青霉孢子萌发的差异基因和差异蛋白。结果如表3-3、表3-4所示。其中，表达量上调的基因有12个，分别为ABCT1、ARP、CAT1、CAT2、Chs3、CWP、GST、HSP、NADPGH、NHE、PG、PMIP。表达量下调的基因有7个，分别为ABCMT、ABCT2、HP1、HP2、MP、SOD、Ssd1。其中，表达量上调的蛋白有7个，表达量下调的基因有12个，CAT2、CWP、GST、MP、NHE、PG、PMIP与基因表达量的变化相反，这是由于生物体内反馈机制造成的。28 表3-2差异表达蛋白的代谢途径富集分析差异蛋白的代谢途径注释序号代谢途径代谢途径ID(2678)1代谢途径675(25.21%)ko011002次生代谢产物的合成271(10.12%)ko011103剪接体104(3.88%)ko030404嘌呤代谢98(3.66%)ko002305RNA转运93(3.47%)ko030136核糖体85(3.17%)ko030107内质网蛋白加工83(3.1%)ko041418细胞周期79(2.95%)ko041119真核生物中的核糖体生物发生71(2.65%)ko0300810减数分裂71(2.65%)ko0411311氧化磷酸化68(2.54%)ko0019012嘧啶代谢68(2.54%)ko0024013RNA降解66(2.46%)ko0301814MAPK信号通路56(2.09%)ko0401115淀粉和蔗糖代谢54(2.02%)ko0050016糖酵解/葡萄糖生成54(2.02%)ko0001017内吞作用50(1.87%)ko0414418mRNA监测途径49(1.83%)ko0301519氨基酰-tRNA生物合成46(1.72%)ko0097020酪氨酸代谢45(1.68%)ko0035021丙酮酸代谢43(1.61%)ko0062022果糖和甘露糖代谢42(1.57%)ko0005123甘油磷脂代谢37(1.38%)ko0056424色氨酸代谢35(1.31%)ko0038025氨基糖和核苷酸糖代谢34(1.27%)ko0052026DNA复制34(1.27%)ko0303027过氧化物酶体33(1.23%)ko0414628甘油脂代谢33(1.23%)ko0056129柠檬酸循环29(1.08%)ko0002030RNA聚合酶28(1.05%)ko0302032氮代谢22(0.82%)ko0091033戊糖和葡萄糖醛酸互变途径22(0.82%)ko0004034泛酸和辅酶A生物合成19(0.71%)ko0077035组氨酸代谢19(0.71%)ko0034036谷胱甘肽代谢19(0.71%)ko0048037类固醇生物合成19(0.71%)ko0010038半乳糖代谢18(0.67%)ko0005239赖氨酸生物合成18(0.67%)ko0030040ABC转运途径17(0.63%)ko0201029 表3-3转录组与蛋白组关联的差异基因序号基因ID基因名称中文名称差异倍数1Unigene3860ABCMTABC多药转运蛋白-0.8892Unigene866ABCT1ABC转运蛋白13.8153CL856.Contig9ABCT2ABC转运蛋白2-0.8884CL3148.Contig1ARP抗性反应蛋白1.9755Unigene4642CAT1过氧化氢酶11.2426Unigene1284CAT2过氧化氢酶20.5897Unigene933Chs3几丁质合成激活酶0.7128Unigene7022CWP细胞壁蛋白0.8539CL2648.Contig2GST谷胱甘肽-S-转移酶0.19810Unigene3297HP1疏水蛋白1-5.11511Unigene288HP2疏水蛋白2-4.44112Unigene2671HSP热激蛋白1.05713Unigene1768MP膜蛋白-0.24214Unigene539NADPGHNADP特异性谷氨酸脱氢酶3.55615Unigene1919NHENa+和H+交换蛋白0.49516Unigene6800PG多聚半乳糖醛酸酶5.46717Unigene4710PMIP细胞膜铁透性酶0.2618Unigene7032SOD超氧化物歧化酶-0.40319Unigene450Ssd1细胞壁生物合成蛋白磷酸酶-0.264表3-4转录组与蛋白组关联的差异蛋白差异倍数序号蛋白名称T1/C1T1/C2T2/C1T2/C21ABCMT0.7230.7150.70.6872ABCT12.6852.7652.7463.0043ABCT20.777-0.7630.8124ARP1.3891.4041.2461.2655CAT11.2981.258--6CAT20.7350.732--7Chs31.2621.206--8CWP0.4380.3350.5920.4219GST0.6880.727--10HP10.8030.7590.7090.6811HP2--0.8140.80212HSP1.8311.5241.8741.67413MP7.029.1036.1291014NADPGH1.3571.2991.2151.20315NHE0.7190.69--16PG0.7990.6740.7740.66617PMIP0.546-0.568-18SOD-0.824-0.81519Ssd10.8260.8160.832-30 3.3.8荧光定量PCR(1)细胞壁相关的基因表达水平图3-9细胞壁相关上调基因表达水平(对照组；处理组)图3-10细胞壁相关下调基因表达水平(对照组；处理组)31 多聚半乳糖醛酸酶PG的表达量上调。PG能降解果胶使细胞壁破损，有利于孢子破壁萌发。几丁质合酶激活剂Chs3、细胞壁蛋白CWP、细胞壁生物起源蛋白质磷酸酶Ssd1的表达量下调，利于细胞壁降解。HP1、HP2是一类具有强表面活性的分泌型小分子量疏水蛋白，能在亲水-疏水界面通过自我组装形成一层紧密稳定的约10nm厚的两性蛋白膜，HP1，HP2下调，说明孢子疏水作用减弱，亲水性增强，有利于孢子的萌发。(2)细胞膜相关的基因表达水平图3-11细胞膜相关上调基因表达水平(对照组；处理组)与细胞膜相关的基因表达大量上调，如ABCT1、ABCT2、NHE、PMIP、ARP、MP，上调倍数最高达100倍以上，这一现象说明细胞膜上物质的转运与指状青霉孢子的萌发相关。32 细胞膜上表达量上调的基因有：ABC转运蛋白(ABCT1、ABCT2)、细胞膜铁透性酶(PMIP)、Na+/H+交换蛋白(NHE)、CipC-类抗生素反应蛋白质(ARP)、膜蛋白(MP)。ABC转运蛋白是细胞膜上的运输ATP的酶，其表达量在7h时处理组是对照组的100多倍。PMIP对Fe有很高的亲和性，PMIP表达上调，利于孢子内Fe的供给。NHE是存在于所有真核细胞的一种跨膜蛋白，是维持细胞内pH值在中性或偏碱性的重要膜蛋白，并涉及到细胞内外离子的跨膜转运、细胞体积及胞内渗透压的控制。ARP在孢子萌发过程中有很特殊的作用。MP是细胞膜上的结构蛋白。图3-12细胞膜相关下调基因表达水平(对照组；处理组)细胞膜上表达量下调的基因有：ABC多药转运蛋白(ABCMT)。ABCMT能利用水解ATP的能量将各种药物从细胞质内转运到细胞外。(3)细胞质相关的基因表达水平细胞质内表达量上调基因有：过氧化氢酶(CAT1、CAT2)、热休克蛋白(HSP)、NADP特异性谷氨酸脱氢酶(NADPGH)。过氧化氢酶是催化过氧化氢分解成氧和水的酶，存在于细胞的过氧化物体内。CAT1、CAT2上调，催化细胞内H2O2分解成H2O。HSP是一类具有高度保守性的蛋白质，当细胞在受到外界因素刺激时，会迅速短暂地大量合成，并通过与细胞内部分蛋白质结合，协助将其运送。NADPGH上调，催化L-谷氨酸氧化脱氨生成α-酮戊二酸。细胞质内表达量下调基因有：超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)。SOD能消除生物体在新陈代谢过程中产生的超氧阴离子等有害物质，SOD下调，说明柠檬烯不是有害物质。谷胱甘肽S-转移酶(GST)表达量下调也同样验证了这一观点，谷胱甘肽(GSH)在谷胱甘肽S-转移酶(GST)催化下，可与许多卤代化合物和环氧化合物结合，生成含GSH的结合产物，GST表达量下调，说明这一过程没有受到诱导。33 图3-13细胞质相关上调基因表达水平(对照组；处理组)图3-14细胞质相关下调基因表达水平(对照组；处理组)3.3.9GC-TOF-MS代谢组学柠檬烯诱导后指状青霉孢子萌发代谢组学共鉴定出203个代谢物，其中77个代谢物在各组的比较中没有显著性差异，剩下的126个为差异代谢物。在这126个差异代谢物中，符合C1/T1差异显著、C2/T2差异显著的代谢物分别有73个和88个。其中有35个代谢物C1/T1，C2/T2均差异显著，其相对表达水平如表3-6所示。34 表3-6差异显著的代谢物(C1/T1&C2/T2)相对表达水平编号中文名C1C2T1T21N-乙酰-D-甘露糖胺0.0002b0.0001b0.0010a0.0011a2双缩脲0.0004b0.0003b0.0020a0.0024a3柠苹酸0.0006c0.0006c0.0034b0.0090a4水杨酸0.0007c0.0000c0.1040a0.0152b5马来酰胺酸0.0008b0.0008b0.0031a0.0037a6DL-2-哌啶甲酸0.0008c0.0009c0.0028b0.0045a7乳清酸0.0011b0.0007b0.0025a0.0035a8磷酸单苯酯0.0011b0.0005b0.0022a0.0028a9阿特拉津-2-羟基0.0016bc0.0004c0.0064a0.0054ab10DL-2-氨基丁酸0.0016b0.0011b0.0039a0.0054a11甘油酸0.0018b0.0010b0.0054a0.0052a12棕榈油酸0.0021c0.0000d0.0091a0.0032b132-羟基丁酸0.0023b0.0012b0.0046a0.0054a14甲羟戊酸内酯0.0028c0.0000d0.2652a0.0336b15木糖0.0029b0.0035b0.0155a0.0171a16内醚糖0.0033b0.0029b0.0098a0.0134a17水杨醛0.0034b0.0016b0.0100a0.0104a18月桂酸0.0061b0.0029b0.0179a0.0148a19衣康酸0.0061b0.0061b0.0321a0.0429a20莽草酸0.0070b0.0064b0.0262a0.0298a21塔格糖0.0073b0.0066b0.0206a0.0267a22N-氨基甲酰谷氨酸0.0082b0.0000c0.0316a0.0078b23苏糖醇0.0094c0.0098c0.0169b0.0229a24甘露糖基甘油酸0.0107b0.0000c0.0512a0.0119b25阿洛糖0.0121b0.0153b0.0460a0.0604a26马来酰亚胺0.0123b0.0141b0.0479a0.0610a27苄氧羰酰基甘氨酸0.0152b0.0000c0.0627a0.0158b28肉桂酸0.0256b0.0000c0.0967a0.0256b29磷酸甲酯0.0273c0.0159c0.0526b0.0835a305,6-二甲基苯并咪唑0.0304b0.0000d0.1584a0.0168c31单棕榈酸甘油0.0344c0.0179d0.0771b0.1156a32柠檬酸0.0414c0.0467c0.0884b0.1439a33核糖0.0886b0.0253c0.2164a0.2069a34乙醇胺0.0963b0.0420b0.2901a0.3370a35肉豆蔻酸0.2276b0.0016c0.8232a0.2126b35 将这35个C1/T1，C2/T2均差异显著的代谢物在KEGG中注释，有28个能够在KEGG中链接到，如表3-7所示。表3-7差异代谢物的KEGG注释(C1/T1&C2/T2)编号中文名KEGGLink1N-乙酰-D-甘露糖胺/2双缩脲http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C065553柠苹酸http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C008154水杨酸http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C008055马来酰胺酸http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C015966DL-2-哌啶甲酸http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C004087乳清酸http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C002958磷酸单苯酯http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C027349阿特拉津-2-羟基http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C0655210DL-2-氨基丁酸http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C1173511甘油酸http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C0025812棕榈油酸http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C08362132-羟基丁酸http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C0598414甲羟戊酸内酯/15木糖http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C0018116内醚糖/17水杨醛http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C0620218月桂酸http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C0267919衣康酸http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C0049020莽草酸http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C0049321塔格糖/22N-氨基甲酰谷氨酸http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C0582923苏糖醇http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C1688424甘露糖基甘油酸/25阿洛糖http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C0148726马来酰亚胺http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C0727227苄氧羰酰基甘氨酸http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C0371028肉桂酸http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C0042329磷酸甲酯/305,6-二甲基苯并咪唑http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C0311431单棕榈酸甘油/32柠檬酸http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C0015833核糖http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C0012134乙醇胺http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C0018935肉豆蔻酸http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C0642436 将28个能够在KEGG中链接到的差异代谢物按通路分类，可以关联到以下主要代谢途径。如表3-8所示。表3-8差异代谢物的代谢途径注释(C1/T1&C2/T2)编号中文名代谢途径1双缩脲阿特拉津降解；代谢途径；在不同环境中微生物的代谢苯丙氨酸代谢；多环芳烃降解；萘降解；铁载体非核糖体环肽2水杨酸的生物合成；糖类的生物合成；代谢途径；次生代谢产物的生物合成；在不同环境中微生物代谢；降解芳香族化合物；3马来酰胺酸烟酸和烟酰胺代谢；在不同环境中微生物的代谢4DL-2-哌啶甲酸赖氨酸降解；代谢途径；次生代谢产物的生物合成5乳清酸嘧啶代谢；代谢途径6磷酸单苯酯对氨基苯甲酸降解；在不同环境中微生物的代谢7阿特拉津-2-羟基阿特拉津降解；代谢途径；在不同环境中微生物的代谢戊糖磷酸途径；甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢；甘油脂代谢；8甘油酸乙醛酸和二羧酸代谢；9棕榈油酸脂肪酸的生物合成102-羟基丁酸丙酸代谢戊糖和葡萄糖醛酸互变途径；淀粉和蔗糖代谢；氨基糖和核苷11木糖酸糖代谢；代谢途径；ABC转运途径12水杨醛萘降解；糖类的生物合成；在不同环境中微生物的代谢13月桂酸脂肪酸的生物合成14衣康酸C5-支链二元酸代谢苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成；糖类的生物合成；来15莽草酸源于莽草酸途径的萜类和类固醇的生物合成；生物碱的生物合成；代谢途径；次生代谢产物的生物合成；氨基酸的生物合成16N-氨基甲酰谷氨酸组氨酸代谢17阿洛糖ABC转运途径苯丙氨酸代谢；类苯基丙烷的生物合成；代谢途径；次生代谢18肉桂酸产物的生物合成；在不同环境中微生物代谢；芳香族化合物的降解195,6-二甲基苯并咪唑核黄素代谢；卟啉和叶绿素代谢；代谢途径柠檬酸循环；乙醛酸和二羧酸代谢；糖类的生物合成；代谢途20柠檬酸径；次生代谢产物的生物合成；在不同环境中微生物代谢；2-氧代羧酸代谢；氨基酸的生物合成21核糖戊糖磷酸途径；ABC转运途径；22乙醇胺甘油磷脂代谢；代谢途径；逆行神经信号23肉豆蔻酸脂肪酸的生物合成37 3.4小结根据前人研究[5,19]，推测柠檬烯作为营养物质直接促进指状青霉孢子萌发的可能性不大，柠檬烯在高浓度下可以转化成α-松油醇，并且外源添加柠檬烯，随着培养时间的延长，柠檬烯的含量保持不变，这一结果非常符合柠檬烯作为信号分子的特点。通过转录组学关联分析，102个差异表达的基因被映射到KEGG数据库中，并关联到50多个代谢途径。其中，代谢途径，次生代谢产物的生物合成，淀粉和蔗糖代谢，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，氨基糖和核苷酸糖代谢，乙醛酸和二甲酸代谢等代谢途径均在一定程度上受到柠檬烯的刺激。与遗传信息相关的代谢途径，如减数分裂(4，3.92%)、RNA转运(3，2.94%)、嘧啶代谢(1，0.98%)和嘌呤代谢(1，0.98%)等也受到了一定程度的影响。此外，生物膜上的相关蛋白、物质转运相关代谢途径也受到刺激，如过氧物酶体(3，2.94%)、MAPK信号通路(3，2.94%)、内吞作用(2，1.96%)和ABC转运途径(1，0.98%)等。能量是细胞生命活动的枢纽，与能量代谢直接相关的柠檬酸循环(1，0.98%)也受到一定的刺激。通过转录组学和蛋白组学关联分析，找到19个柠檬烯诱导指状青霉孢子萌发的差异基因和蛋白：Unigene3860、Unigene866、CL856.Contig9、CL3148.Contig1、Unigene4642、Unigene1284、Unigene933、Unigene7022、CL2648.Contig2、Unigene3297、Unigene288、Unigene2671、Unigene1768、Unigene539、Unigene1919、Unigene6800、Unigene4710、Unigene7032、Unigene450，对应的基因名称分别为：ABCMT、ABCT1、ABCT2、ARP、CAT1、CAT2、Chs3、CWP、GST、HP1、HP2、HSP、MP、NADPGH、NHE、PG、PMIP、SOD、Ssd1。通过荧光定量PCR验证，验证差异表达的基因，其中有11个基因表达上调，分别为：ABCT1、PG、CAT2、HSP、ABCT2、PMIP、NHE、CAT1、ARP、NADPGH、MP。8个基因表达下调，分别为：Chs3、CWP、SOD、Ssd1、GST、HP1、ABCMT、HP2。其中，与细胞膜相关的基因表达大量上调，如ABCT1、ABCT2、NHE、PMIP、ARP、MP，上调倍数最高达100倍以上，这一现象说明细胞膜上物质的转运与指状青霉孢子的萌发相关。通过代谢组学分析35个差异代谢物，关联48个代谢途径。这48个代谢途径与其他组学的数据相比较，可以得出柠檬烯诱导指状青霉孢子萌发的关键代谢途径和关键代谢物，关键代谢途径为：戊糖磷酸途径、脂肪酸的生物合成、苯丙氨酸代谢、萘降解、乙醛酸和二羧酸代谢、阿特拉津降解、糖类的生物合成、生物碱的生物合成、来源于鸟氨酸，赖氨酸和烟酸的生物碱的生物合成、代谢途径、次生代谢产物的生物合成、在不同环境中微生物代谢、芳香族化合物的降解、氨基酸的生物合成、ABC转运途径，关键代谢物为对应途径上的差异代谢物。38 差异代谢物的表达量水平大量上调，说明了指状青霉的代谢受到了柠檬烯的刺激。直接与柠檬烯信号响应相关的为ABC转运途径，ABC转运途径上的木糖、阿洛糖和核糖的表达量均上调，ABC转运途径发生在细胞膜上，这是指状青霉细胞膜对柠檬烯信号的响应。综上可知，柠檬烯可能充当指状青霉孢子萌发的信号分子，其作用位点可能在细胞膜上。39 第4章月桂烯对指状青霉孢子萌发的作用机理初探4.1引言月桂烯在橘皮精油含量很高，仅次于柠檬烯，且在本研究实验浓度内均能显著促进柑橘采后病原菌孢子的萌发，其作用机理可能有别于柠檬烯。因此，选取月桂烯作为指状青霉孢子萌发的作用机理解析，与柠檬烯形成对比。此前，月桂烯被发现刺激意大利青霉和指状青霉菌丝体生长，刺激率分别为24.69%和22.37%[18]。月桂烯的浓度随着果实的成熟从6.37%增加到7.43%，水果易受致病菌侵染的可能性也相应增加[77]。本章在前期实验基础上，进一步测定了胞内月桂烯含量及物质变化、差异代谢物综合分析、胞内能量变化，初步探究月桂烯对指状青霉孢子萌发的作用机制。4.2实验材料4.2.1病原菌指状青霉(P.digitatumSacc.)分离于发病的柑橘果实表面，菌种保藏于湘潭大学生物与食品工程系专业实验室。孢子悬浮液浓度为106个/mL。4.2.2实验试剂表4-1主要试剂一览表产品名称规格产地/厂家麦角固醇标准品>97.0%(HPLC)美国阿拉丁工业公司ATP钠盐标准品>99.0%(HPLC)美国阿拉丁工业公司ADP钠盐标准品>98.0%(HPLC)美国阿拉丁工业公司AMP钠盐标准品>99.0%(HPLC)美国阿拉丁工业公司丙酮酸标准品>98.0%(HPLC)美国Sigma公司磷酸氢二钠分析纯(AR)天津市恒兴化学试剂制造有限公司磷酸二氢钠分析纯(AR)西陇化工股份有限公司三氯乙酸分析纯(AR)天津市恒兴化学试剂制造有限公司硫酸亚铁铵分析纯(AR)西陇化工股份有限公司硫氰酸钾分析纯(AR)西陇化工股份有限公司40 4.2.3实验仪器设备表4-2主要实验设备设备名称设备型号设备产地手提式压力蒸汽无菌器MLS-3020日本SANYO电子有限公司分析天平FA1004N上海精密科学仪器厂垂直流洁净工作台SCW-CJ-1F苏州安瑞净化科技有限公司生化培养箱SPX-250B上海博迅实业有限公司超低温冰箱DW-86L388海尔集团有限公司电子天平BL320HSHIMADZU公司移液枪WKYIII-100北京明力普瑞科技有限公司血球计数板MQ上海市求精生化试剂有限公司紫外分光光度计UV-2450SHIMADZU公司高效液相色谱仪LC-20ATSHIMADZU公司气质联用仪2010QP-PlusSHIMADZU公司气相色谱仪7890AAGILENT公司4.3实验方法4.3.1气相色谱法测定月桂烯的含量[78]在50mL离心管中加入PDB培养基，再加入不同浓度的月桂烯，使终浓度为0.20，0.40，0.80，1.60，3.20μL/mL，同时加入孢子悬浮液使其最终浓度为106个/mL，最终体积为5mL。对照组不加孢子，月桂烯的浓度为0.2μL/mL。25±2℃，180r/min，摇床培养。取出离心管，破碎孢子，10000r/min冷冻离心30min，取上清液。上清液用5mL乙酸乙酯萃取三次，分液，合并上清液，无水硫酸钠干燥4h，过滤，等待气相色谱分析。气相色谱条件：石英毛细管柱(30mm×320μm×0.25μm)；检测器为FID检测器；检测器温度为250℃；进样口温度为250℃；空气流量为450mL/min；氢气流量为40mL/min；程序升温条件为100℃(保留2min)，然后30℃/min至250℃；进样量为1μL；分流比为100:1；载气为氮气，流量为1mL/min。在色谱条件下测定各样品中月桂烯的响应值(吸收峰面积)，根据月桂烯标准曲线，计算样品中月桂烯的浓度，并计算月桂烯的含量。41 4.3.2气相色谱质谱联用法测定月桂烯的物质变化[78]气相色谱条件：同4.3.1。质谱条件：电子轰击(EI)离子源；电子能量70eV；离子源温度200℃；接口温度为220℃；质量扫额描范围m/z5～450。4.3.3GC-TOF-MS代谢组学根据前期实验结果，选取0h和6h月桂烯处理组和对照组的3个样本，命名为：C0、C1、T1。每个样本6个生物学重复。委托上海百趣生物医学生物科技有限公司进行样品检测和分析。基础数据分析包括：数据预处理，PCA分析，正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)，差异化合物筛选和鉴定。高级数据分析包括：代谢通路分析。采用OPLS-DA模型第一主成分值(VIP值)，并结合t检验的P值来寻找差异性表达代谢物。取阈值VIP>1且P<0.05的代谢物为差异代谢物。4.3.4紫外分光光度法测定丙酮酸含量[4]准确称取0.1g样品，加入试剂一(8%的三氯乙酸)，冰水浴条件下研磨除去蛋白质，定容至10mL，静置30min，4000r/min，离心5min，取上清液测定(三氯乙酸为蛋白质沉淀剂，上清液不可用于测蛋白浓度)。取1mL上清液，加入2mL试剂二(8%的三氯乙酸中含0.05%的2,4-二硝基苯肼)，混匀后，37℃水浴准确反应10min，加入试剂三(1.5mol/L的NaOH溶液)，室温下放置5min，测定吸光度OD505nm值。测定各样品中丙酮酸的响应值(OD505nm值)，根据丙酮酸标准曲线，计算样品中丙酮酸的浓度，并计算丙酮酸的含量。4.3.5高效液相色谱法测定ATP、ADP和AMP含量[79]高效液相色谱分析条件选择：250mm×4.6mm的C18柱(5μm)，柱温：25℃，流速：1.0mL/min，进样体积：20μL。流动相：0.05mol/L的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液(内含1mmol/L的EDTA，pH=6)，缓冲液与甲醇的比例为97.5:2.5(V/V)，UV检测波长为259nm，ATP、ADP和AMP的保留时间分别为9.659min，11.582min，18.413min。在色谱条件下测定各样品中ATP、ADP和AMP的响应值(吸收峰面积)，根据ATP、ADP和AMP标准曲线，计算样品中ATP、ADP和AMP的浓度，并计算ATP、ADP和AMP的含量。根据ATP、ADP和AMP的含量计算能荷。能荷计算公式：42 ATP1/2ADP能荷ATPADPAMP4.3.6高效液相色谱法测定麦角固醇含量[80-81]配好PDB培养基灭菌，调节孢子终浓度为1.0×106个/mL，月桂烯终浓度为0.0，0.2μL/mL，置于恒温箱160r/min振荡培养3h，6h。处理完后，置于4000r/min下离心10min，水洗1次。取0.008g的干燥样品(真空冷冻干燥)，充分研磨，放入试管中，加入皂化剂(4mL25%的NaOH+无水乙醇8mL)，在85-90℃的温度水浴2h，皂化完全后将其冷却至室温，用石油醚3mL萃取3次，饱和NaCl溶液洗2次，用旋转蒸发仪减压浓缩近干，即得非皂化物，用乙醇溶解，定容至10mL，0℃冰箱贮存备用待测。麦角固醇高效液相色谱分析条件选择：250mm×4.6mm的C18柱(5μm)，柱温：30℃，流速：1.0mL/min，进样体积：20μL。流动相：纯甲醇，UV检测波长为282nm。在色谱条件下测定各样品中麦角固醇的响应值(吸收峰面积)，根据麦角固醇标准曲线，计算样品中麦角固醇的浓度，并计算麦角固醇的含量。4.3.7紫外分光光度法测定H[82]2O2含量配好PDB培养基灭菌，调节孢子终浓度为1.0×106个/mL，月桂烯终浓度为0.0，0.2μL/mL，置于恒温箱160r/min振荡培养3h，6h。处理完后，置于4000r/min下离心10min，水洗1次。取样品0.1g，加入4mL50%的三氯乙酸，于4000r/min下离心30min。取上清液1.6mL与0.4mL10mmol/L的硫酸亚铁铵和0.2mL2.5mol/L的硫氰酸钾混合。试样在480nm下测定吸光值。对照组用1.6mLPBS(pH7.0)，4mL50%的三氯乙酸、0.4mL10mmol/L硫酸亚铁铵和0.2mL2.5mol/L的硫氰酸钾混合进行校正。4.4结果与分析4.4.1外源月桂烯在指状青霉胞内胞外含量变化利用GC定量技术，探究外源添加月桂烯在指状青霉胞内外含量变化，实验结果如图4-1所示。随着培养时间的增加，指状青霉孢子胞内胞外月桂烯的含量降低。体系为1mL，培养24h后，初始月桂烯添加量为0.2μL/mL的组分，检测到的月桂烯的含量降为0.07μL/mL，外源添加月桂烯浓度为0.4、0.8、1.6、3.2μL/mL的组分，其含量也分43 别降为0.24、0.51、0.98、2.27μL/mL。这一结果说明，月桂烯在指状青霉孢子内可能存在物质转化。图4-1胞内胞外总月桂烯含量变化(对照组；胞外；胞内)注：(a)0.2μL/mL；(b)0.4μL/mL；(c)0.8μL/mL；(d)1.6μL/mL；(e)3.2μL/mL4.4.2外源月桂烯在指状青霉胞内成分变化利用GC-MS定性分析，探究指状青霉胞内月桂烯物质成分变化，实验结果如图4-2所示。月桂烯的保留时间为3.309min。通过GC-MS分析，外源月桂烯在指状青霉孢子内没有检测到转化为其他物质。培养12h后，初始月桂烯添加量为0.2、0.4、0.8、1.6、3.2μL/mL的组分，GC-MS上机检测结果显示，除了月桂烯的峰，44 没有其他物质的峰出现。这一结果说明，月桂烯可能转化成了其他GC-MS检测不到的其他物质。图4-2胞内总月桂烯物质变化4.4.3GC-TOF-MS代谢组学月桂烯诱导后指状青霉孢子萌发代谢组学共鉴定出243个代谢物。其中87个代谢物在各组的比较中没有显著性差异，剩下的156个差异代谢物为差异代谢物。在这156个差异代谢物中，符合C/C1差异显著这种情况的代谢物共有108个，符合C/T1差异显著这种情况的差异代谢物共有88个，符合C1/T1差异显著这种情况的差异代谢物共有75个。45 在这三类差异代谢物中，有20个代谢物C/C1，C/T1，C1/T1均差异显著，其相对表达水平如表4-1所示。结果显示，这些差异代谢物的表达水平以上调的为主，说明了月桂烯刺激了指状青霉的物质代谢，导致大量差异代谢物表达量的上调。表4-3差异显著的代谢物(C/C1&C/T1&C1/T1)相对表达水平编号中文名CC1T114-甲基苯甲醇0.0001c0.0037b0.0058a2D-果糖-1,6-二磷酸0.0001c0.0051a0.0023b3角鲨烯0.0001c0.0752a0.0310b4硫酸0.0002c0.0030b0.0062a5羟胺0.0008c0.0024a0.0013b6正缬氨酸0.0008c0.0034b0.0062a71,3-二酮环辛烷0.0024c0.0252b0.0460a8尿囊酸0.0027b0.0073a0.0004c91,2,4-丁三醇0.0070b0.0160a0.0031c10尿素0.0078c0.0264a0.0128b11N-乙酰-D-半乳糖胺0.0094c0.0139b0.0199a12葡萄糖-6-磷酸0.0123c0.0244b0.0369a13D-甘油磷酸0.0125c0.3316b0.5315a143-吲哚丙酮酸0.0126c0.0361a0.0201b15N-甲基-DL-丙氨酸0.0229c0.0726b0.0888a16甘油0.0626a0.0346b0.0232c17苏氨酸0.0686c0.1004b0.1390a184-乙酰氨基丁酸0.0867b0.1510a0.0159c19乳酸0.1690c0.3070b0.6121a20丙氨酸1.1307c3.6480b4.7854a将这20个C/C1，C/T1，C1/T1均差异显著的代谢物在KEGG中注释，有18个能够在KEGG中链接到，如表4-2所示。其中1,2,4-丁三醇和N-甲基-DL-丙氨酸没有在KEGG数据库中。46 表4-4差异代谢物的KEGG注释(C/C1&C/T1&C1/T1)编号中文名KEGGLink14-甲基苯甲醇http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C067572D-果糖-1,6-二磷酸http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C003543角鲨烯http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C007514硫酸http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C000595羟胺http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C001926正缬氨酸http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C0182671,3-二酮环辛烷http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C010668尿囊酸http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C0049991,2,4-丁三醇/10尿素http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C0008611N-乙酰-D-半乳糖胺http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C0113212葡萄糖-6-磷酸http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C0325113D-甘油磷酸http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C00093143-吲哚丙酮酸http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C0033115N-甲基-DL-丙氨酸/16甘油http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C0011617苏氨酸http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C00188184-乙酰氨基丁酸http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C0294619乳酸http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C01432http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C0004120丙氨酸http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C00133(5)将代谢物按通路分类将18个能够在KEGG中链接到的差异代谢物按通路分类，可以关联代谢途径，如表4-3所示。通过对数据的分析，找到了月桂烯诱导指状青霉孢子萌发的关键代谢途径和关键代谢物。关键代谢途径为：减数分裂、过氧物酶体、RNA转运、MAPK信号通路、内吞作用、柠檬酸循环、ABC转运、嘧啶代谢、糖酵解和糖质新生、嘌呤代谢，关键代谢物为其关键代谢途径上检测到的差异代谢物。47 表4-5差异代谢物的代谢途径注释(C/C1&C/T1&C1/T1)编号中文名代谢途径二甲苯降解；代谢途径；在不同环境中微生物代谢；芳香族化14-甲基苯甲醇合物降解苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成；甲烷代谢；代谢途径；2D-果糖-1,6-二磷酸在不同环境中微生物代谢；碳代谢卟啉和叶绿素代谢；萜类和类固醇生物合成；来自类萜生物碱3角鲨烯的生物合成和酮化合物；代谢途径；次生代谢产物的生物合成嘌呤代谢；半胱氨酸和蛋氨酸代谢；硫代谢；代谢途径；在不4硫酸同环境中微生物代谢；ABC转运途径5羟胺氮代谢；在不同环境中微生物代谢6尿囊酸嘌呤代谢；代谢途径；在不同环境中微生物代谢嘌呤代谢；嘧啶代谢嘧啶代谢；精氨酸和脯氨酸代谢；生物素7尿素代谢；阿特拉津降解；代谢途径；在不同环境中微生物代谢；ABC转运途径8N-乙酰-D-半乳糖胺半乳糖代谢；磷酸转移酶系统9D-甘油磷酸甘油脂类代谢；甘油脂类代谢；代谢途径；ABC转运途径103-吲哚丙酮酸色氨酸代谢；代谢途径戊糖和葡萄糖醛酸酯互变现象；半乳糖代谢；甘油脂类代谢；11甘油代谢途径；ABC转运途径甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢；缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的生物合成；卟啉和叶绿素代谢；氨酰生物合成；代谢途径；次12苏氨酸生代谢产物的生物合成；在不同环境中微生物代谢；氨基酸的生物合成；ABC转运途径134-乙酰氨基丁酸精氨酸和脯氨酸代谢；代谢途径丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；半胱氨酸和蛋氨酸代谢；牛磺酸，亚牛磺酸代谢；合硒化合物代谢；丙氨酸代谢；氨酰生14丙氨酸物合成；代谢途径；在不同环境中微生物代谢；氨基酸的生物合成；ABC转运途径；硫中继系统；蛋白质的消化和吸收48 4.4.4月桂烯对指状青霉孢子孢内丙酮酸含量的影响图4-3胞内丙酮酸含量变化(对照组；处理组)外源添加月桂烯，指状青霉孢子内丙酮酸含量激增，培养3h，处理组孢子内丙酮酸含量达20.1±3.31μg/g，是对照组(6.5±0.28μg/g)的3.08倍。4.4.5月桂烯对指状青霉孢子胞内ATP、ADP和AMP含量的影响图4-4胞内ATP含量变化(对照组；处理组)图4-5胞内ADP含量变化(对照组；处理组)49 图4-6胞内AMP含量变化(对照组；处理组)培养6h，处理组胞内ATP含量(10.35±0.54μg/g)、AMP含量(1.07±0.74μg/g)升高，显著高于对照组(6.25±0.44μg/g、3.47±0.56μg/g，P<0.05)。0-6h，处理组胞内ADP的含量逐渐升高，但与对照组无显著性差异(P<0.05)。图4-7胞内能荷含量变化(对照组；处理组)能荷降低，有利于细胞对ATP的利用，能荷升高，有利于ATP的供给。初始孢子能荷为0.96±0.02，培养6h时，处理组能荷(0.76±0.04)显著高于对照组能荷(0.58±0.02，P<0.05)。4.4.6月桂烯对指状青霉孢子胞内麦角固醇含量的影响图4-8胞内麦角固醇含量变化(对照组；处理组)50 初始孢子麦角固醇含量较高，约为7.18±0.75mg/g。培养3h时，处理组麦角固醇含量降低，为5.50±0.10mg/g。培养6h时，处理组麦角固醇含量(5.23±0.37mg/g)降低，接近正常指状青霉菌丝体(4.93±0.94mg/g)麦角固醇含量，此时对照组麦角固醇含量为6.20±0.20mg/g。4.4.7月桂烯对指状青霉孢子胞内H2O2含量的影响图4-9胞内H2O2含量变化(对照组；处理组)培养3h时，H2O2含量降低，但处理组与对照组无显著性差异(P<0.05)。4.5小结与讨论随着培养时间的增加，指状青霉孢子胞内胞外月桂烯的含量降低。培养24h后，初始月桂烯添加量为0.2μL/mL的组分，检测到的月桂烯的含量降为0.07μL/mL，浓度为0.4、0.8、1.6、3.2μL/mL的组分，其含量也分别降为0.24、0.51、0.98、2.27μL/mL。通过GC-MS分析，外源月桂烯在指状青霉孢子内没有检测到转化为其他物质。在以往的报道中[19]，外源添加柠檬烯，指状青霉孢子内有α-松油醇产生，并且柠檬烯在指状青霉胞内胞外的含量维持恒定。通过代谢组学分析，月桂烯可能可以转化成1-脱氧-d-木酮糖-5-磷酸，1-脱氧-d-木酮糖-5-磷酸分解成D-3-磷酸甘油醛和丙酮酸，D-3-磷酸甘油醛也可以通过糖酵解途径转化成丙酮酸，也就是说，月桂烯可以最终转化成丙酮酸，参与柠檬酸循环，为生命活动提供能量。通过实验验证，外源添加月桂烯，指状青霉孢子内丙酮酸含量激增，培养3h，处理组孢子内丙酮酸含量达20.1±3.31μg/g，是对照组(6.5±0.28μg/g)的3.08倍。前人研究指出，丙酮酸可通过乙酰-CoA和三羧酸循环实现体内糖、脂肪和氨基酸间的互相转化，因此，丙酮酸在三大营养物质的代谢联系中起着重要的枢纽作用[4]。通过HPLC分析，培养6h时，处理组胞内ATP含量(10.35±0.54μg/g)升高，显51 著高于对照组(6.25±0.44μg/g，P<0.05)。0-6h，指状青霉孢子胞内ADP的含量逐渐升高，但处理组与对照组无显著性差异(P<0.05)。培养6h时，处理组胞内AMP含量(1.07±0.74μg/g)升高，显著高于对照组(3.47±1.65μg/g，P<0.05)。0~3h，胞内能荷降低，这是因为细胞对与ATP的利用增强，与孢子萌发过程规律是相符合的，3~6h，月桂烯处理组能荷升高，说明了月桂烯增加了ATP的供给。ATP作为细胞内能量传递的“能量通货”，储存和传递化学能，在核酸合成中也具有重要作用[79]。综上可知，月桂烯可能充当指状青霉孢子萌发的营养物质，其转化为丙酮酸有利于孢子萌发的能量供给。52 第5章香茅醛对指状青霉的抑制作用5.1引言控制柑橘采后病害对于保持柑橘质量、减少经济损失至关重要的。Jhalegar等[50]研究表明合成杀真菌剂，如抑霉唑，噻菌灵，嘧霉胺，咯菌腈等等，能最大限度地减少柑橘的采后腐烂，但是，它们的频繁使用导致了菌株产生抗性，降低了其有效性，并且还会给人类健康增加风险。因此，需要寻找合成杀真菌剂的替代物。植物精油是一个不错的选择。它们在采后病害控制上得到了有效而安全的使用[51,84-85]。香茅醛是柑橘和其他植物精油中的有效挥发性成分[86-87]。其抗真菌活性已得到一些研究证明[88-90]。Scora等[91]研究发现，香茅醛能够抑制指状青霉、意大利青霉和乌来青霉，抑菌圈分别为43，43和31mm2。Zore等[92]证明香茅醛可以通过影响膜完整性和阻止细胞周期抑制白色念珠菌的生长。Nakahara等[93]测试了香茅醛对9种真菌生长的影响，证明它们可以被112mg/L剂量的香茅醛完全抑制。在最近的研究中，已经观察到香茅醛是一些植物精油中的主要成分之一，并且显示出对在苹果，番茄和香蕉中引起严重破坏的病原体具有良好的抗真菌活性[94-95]。所以，我们推测香茅醛可能是控制柑橘类水果的采后疾病的潜在的抗真菌物质。本工作的目的是通过体外和体内实验评价香茅醛对指状青霉的影响。在前期的研究中，香茅醛在低浓度下促进指状青霉菌丝体的生长和孢子萌发，在高浓度下却表现出明显的抑制作用。在前期实验基础上，进一步测定了高浓度下香茅醛对指状青霉形态结构、膜完整、胞外电导率、OD260nm的影响，测定了香茅醛对柑橘果实发病率的影响，解析香茅醛对指状青霉孢子萌发的作用机制。5.2实验材料5.2.1供试果实柑橘品种为脐橙(CitrussinensisOsbeck)果实，2015年11月购买于湘潭大学附近农产品批发市场。挑选成熟度一致，大小、色泽均一，无机械伤口、无瑕疵的成熟果实作为实验材料。果实采后室温放置24h后处理。5.2.2病原菌指状青霉(P.digitatumSacc.)分离于发病的柑橘果实表面，菌种保藏于湘潭大学生物与食品工程系专业实验室。孢子悬浮液浓度为106个/mL。53 5.2.3实验试剂表5-1主要试剂一览表产品名称规格产地/厂家香茅醛>96.0%(GC)美国阿拉丁工业公司吐温-80化学纯(CP)天津市光复精细化工研究所果蜡食品级甘肃省农科院农产品贮藏加工研究所碘化丙啶分析纯(AR)北京索莱宝科技有限公司次氯酸钠化学纯(CP)西陇化工股份有限公司5.3实验方法5.3.1显微镜观察细胞形态结构[84]样品前处理：在50mL的离心管中加入PDB液体培养基，再加入不同浓度的香茅醛，使其终浓度为MIC(1.6μL/mL)和MFC(3.2μL/mL)，加入菌悬液使其终浓度为106个/mL，最终体积为5mL，不添加香茅醛的为对照组。在25℃，180r/min，摇床培养，菌丝体培养120min，孢子培养6h。取出离心管，破碎孢子，10000r/min冷冻离心30min，弃上清液，样品置于0℃冰箱待测。取出样品，通过石炭酸-棉兰进行染色，制片，镜检。5.3.2荧光分光光度法测定细胞膜膜完整性[96]样品前处理同5.3.1，香茅醛浓度为MIC(1.6μL/mL)，菌丝体培养120min，孢子培养6h，不添加香茅醛的为对照组。膜完整的孢子细胞不能被碘化丙啶(PI)染色，而膜损伤的孢子细胞能够被PI染色，PI的荧光能够在荧光显微镜下检测到。取出样品，通过PI进行染色5min，离心弃上清，蒸馏水水洗三次，制片，于荧光显微镜下观察拍照，计算膜完整率。膜完整率(%)=(1-染色的孢子数/总孢子数)×1005.3.3细胞物质泄漏测定[3]样品前处理同5.3.1，香茅醛浓度为MIC(1.6μL/mL)和MFC(3.2μL/mL)，菌丝体培养30，60，120min，孢子培养2，4，6h，不添加香茅醛的为对照。香茅醛对指状青霉孢子胞外电导率采用电导率仪进行测定，胞外OD260nm值采用紫外分光光度法进行测定。54 5.3.4活体实验[97]果实前处理：将果实室温摊开放置1d，用自来水清洗干净，在1%的NaClO溶液(v/v)中浸泡2min，蒸馏水清洗3次，自然风干。在果实赤道部位用手术刀划伤口3×3×6(长×宽×深)，每个伤口接种20μL菌悬液，静置4h。在含有香茅醛的果蜡中浸泡30s，不含香茅醛的作为对照组，置于室温，RH为80-95%的环境中贮藏，每隔24h统计果实腐烂率。每组20个果实，3次重复。腐烂率(%)=(腐烂的果实数/总果实数)×1005.4实验结果5.4.1香茅醛对指状青霉菌丝体和孢子形态结构的影响对照组MICMFC菌丝体孢子图5-1香茅醛对指状青霉菌丝体和孢子形态结构的影响结果表明：香茅醛可以破坏指状青霉菌丝体和孢子的形态结构。正常形态的菌丝体(A)和孢子(D)形态规则饱满，香茅醛MIC处理组(B)和MFC处理组(C)菌丝体的形态呈现不规则和变形的状态，MIC处理组(E)的孢子显示表面凹凸、呈现畸形，MFC处理组(F)孢子形态异常，更加无序和粗糙。55 5.4.2香茅醛对指状青霉孢子膜完整性的影响明暗对照组处理组图5-2香茅醛对指状青霉孢子PI染色结果图5-3香茅醛对指状青霉孢子膜完整率的影响(对照组；处理组)结果表明：香茅醛可以破坏指状青霉孢子的膜完整性，导致膜完整率降低。由图5-2可知，香茅醛处理指状青霉孢子后，经过PI染色，对照组产生红色荧光的孢子少，处理组产生红色荧光的孢子多，结果说明香茅醛能够破坏指状青霉的细胞膜，导致荧光染料PI进入细胞。由图5-3可知，培养后6h，香茅醛处理组和对照组的膜完整率值分别为58.4%和90.2%，处理组膜完整性遭到破坏，对照组膜完整性良好。56 5.4.3香茅醛对指状青霉孢子胞外电导率和OD260nm的影响图5-4香茅醛对指状青霉菌丝体和孢子胞外电导率的影响(对照组；MIC；MFC)图5-5香茅醛对指状青霉菌丝体和孢子OD260nm的影响(对照组；MIC；MFC)结果表明：香茅醛处理，指状青霉菌丝体和孢子胞外电导率值增加，OD260nm值增加。由图5-4可知，香茅醛的处理，导致指状青霉细胞胞外电导率增加。培养6h处理组孢子的胞外电导率为162.0±1.0μS/cm，显著(P<0.05)高于对照组的(133.3±3.2μS/cm)，但显著(P<0.05)低于MFC处理组(169.2±2.0μS/cm)由图5-5可知，培养30min(菌丝)和6h(孢子)时，MIC和MFC的处理导致细胞成分释放显著增加(P<0.05)。香茅醛处理30min时，菌丝体的OD260nm值是0.36±0.03，显著(P<0.05)高于对照组(0.16±0.02)，但显著(P<0.05)低于MFC香茅醛处理组(0.56±0.03)。MFC香茅醛处理组的指状青霉孢子悬浮液培养2h后，OD260nm值保持平稳上升趋，MIC和MFC处理组OD260nm值在6h达到峰值，分别为0.45±0.02和0.65±0.17。57 5.4.4香茅醛对柑橘腐烂率的影响表5-1香茅醛对柑橘腐烂率的影响腐烂率(%)处理组贮藏时间(d)12345果蜡0a25a80a100a100a果蜡+香茅醛(1×MFC)0a10b65b100a100a果蜡+香茅醛(10×MFC)0a0c0c5b30b结果表明：香茅醛能够有效抑制柑橘绿霉病的发生。由表5-1可知，贮藏2d时，对照组脐橙水果开始腐烂，而果蜡+香茅醛(10×MFC)处理组的脐橙水果发病率得到显著(P<0.05)的推迟。随着培养时间延长，贮藏4d后，对照组脐橙水果的发病率为100%，全部腐烂，而果蜡+香茅醛(10×MFC)处理组的发病率仅为5%。5.5小结与讨论在最近的研究中，香茅醛对指状青霉表现出明显的抗真菌活性，其MIC和MFC值分别为1.60μL/mL和3.20μL/mL。MIC值高于香茅醇、香叶醇、橙花醛、香叶醛和桃金娘科类精油，但低于柠檬醛，辛醛和α-松油醇[3,88]。此外，其MFC值低于柠檬醛和α-松油醇[3]。香茅醛浓度高于0.20μL/mL时，指状青霉孢子的萌发也明显受到抑制，这一结果与先前的报道一致[93-94]。香茅醛的浓度为0.050μL/mL时可以刺激指状青霉孢子的萌发，这种现象也与一些以往的研究相吻合，Droby等[5]报道，柠檬烯、α-派烯、β-派烯和月桂烯以相对较低的浓度刺激指状青霉和意大利青霉。在我们之前的研究中，砂糖橘精油、β-月桂烯、萜烯-4-醇和香茅醛能轻微刺激指状青霉和意大利青霉孢子的萌发和菌丝的生长[84,18]。细胞质膜的渗透性和完整性维持真菌生存能力上有重要功能[98,18]。前人研究表明，精油的亲油性，使他们能够优先透过真菌的膜结构，导致膜扩张，增加膜流动性和渗透性，从而干扰蛋白质运输，抑制呼吸，改变在真菌的离子运输过程，引起的其他细胞内容的泄漏[18,99,100,3]。PI染色和显微镜的结果表明，指状青霉孢子膜的完整性在香茅醛处理后明显下降。此外，指状青霉暴露在香茅醛中会引起细胞外58 OD260nm和电导率的增加。这些发现表明，香茅醛可以诱导细胞的指状青霉细胞质膜完整性受损，这是与其他研究也是一致的[92]。结果表明，香茅醛在指状青霉体内引起的明显抑制作用，引起脐橙果实腐烂。这些结果在体外试验也得到了证实。结果与其他精油、挥发性化合物在控制柑橘类水果采后病害方面一致[97,81,51,85]。综上可知，香茅醛抑制指状青霉菌丝的生长和孢子萌发是因为膜损伤机制，香茅醛可以结合果蜡控制柑橘类水果采后绿霉病的发生。59 第6章结论与展望6.1本论文主要的研究成果本文以柑橘采后主要致病菌作为研究对象，探究了柠檬烯、月桂烯和香茅醛对致病菌菌丝体生长以及孢子萌发的作用，其中，柠檬烯、月桂烯对致病菌主要为促进作用，香茅醛主要为抑制作用。本文探究了柠檬烯、月桂烯和香茅醛对指状青霉的作用机理，柠檬烯、月桂烯分别作为信号分子、营养物质诱导指状青霉孢子萌发，香茅醛损伤细胞膜抑制指状青霉。6.1.1柠檬烯对柑橘采后主要致病菌的作用对菌丝体而言，柠檬烯在低浓度下对指状青霉(0.2-0.8μL/mL)、意大利青霉(0.2-1.6μL/mL)和酸腐病菌(0.2-3.2μL/mL)表现出促进作用。对孢子而言，柠檬烯在低浓度下对指状青霉(0.1-0.4μL/mL)、意大利青霉(0.4μL/mL)和酸腐病菌(0.4-1.6μL/mL)促进作用明显，超过这一浓度范围，表现为抑制作用。通过转录组学和蛋白组学关联分析，找到19个柠檬烯诱导指状青霉孢子萌发的差异基因和蛋白。通过荧光定量PCR验证，验证差异表达的基因，其中有11个基因表达上调，8个基因表达下调。通过代谢组学分析35种差异代谢物，关联48种代谢途径。所有组学数据关联的ABC转运途径均受到柠檬烯的刺激，ABC转运途径上的相关基因上调也得到验证，这些基因均位于细胞膜上，同时，细胞膜上大量基因表达水平上调。得出结论：柠檬烯可能充当指状青霉孢子萌发的信号分子，其作用位点可能在细胞膜上。6.1.2月桂烯对柑橘采后主要致病菌的作用对菌丝体而言，月桂烯的促进作用的浓度范围分别为：指状青霉(0.2-6.4μL/mL)、意大利青霉(0.2-1.6μL/mL)和酸腐病菌(0.2-6.4μL/mL)，抑制作用不明显。对孢子而言，月桂烯促进作用更强，在所测试的浓度范围(0-3.2μL/mL)内一直表现出明显的促进作用。外源添加月桂烯，随着培养时间的增加，指状青霉孢子内月桂烯的含量降低。外源添加月桂烯，指状青霉孢子内丙酮酸含量激增。培养6h时，处理组胞内ATP、ADP、AMP含量升高，能荷呈现有利于孢子萌发的方向动态变化。结论：月桂烯可能充当指状青霉孢子萌发的营养物质，其转化为丙酮酸，参与柠檬酸循环，有利于孢子萌发的能量供给。60 6.1.3香茅醛对柑橘采后主要致病菌的作用对菌丝体而言，香茅醛在低浓度下对指状青霉、意大利青霉和酸腐病菌表现出促进作用，对青霉而言，其浓度小于0.2μL/mL时，表现出促进作用，对酸腐而言，其浓度小于0.8μL/mL时，表现出促进作用。高浓度香茅醛显著抑制指状青霉、意大利青霉和酸腐病菌菌丝体生长，最小抑菌浓度MIC均为1.6μL/mL，最小杀菌浓度MFC分别为3.2、1.6、1.6μL/mL。对孢子而言，香茅醛在低浓度下对指状青霉(0.05μL/mL)、意大利青霉(0.1μL/mL)和酸腐病菌(0.05-0.2μL/mL)促进作用明显，超过这一浓度范围，表现为抑制作用。香茅醛的添加，指状青霉的形态结构遭到破坏。经过PI染色，对照组产生红色荧光的孢子少，处理组产生红色荧光的孢子多，说明了香茅醛能够破坏指状青霉的细胞膜，导致荧光染料PI进入细胞，膜完整率降低。香茅醛的处理，导致指状青霉细胞胞外电导率增加，细胞成分释放增加。活体实验结果表明，香茅醛能够有效抑制柑橘绿霉病的发生。得出结论：香茅醛通过损伤指状青霉细胞膜抑制其生长。6.2存在的问题及展望本研究选取了引起柑橘腐烂最主要的三种致病菌，考察了柠檬烯、月桂烯和香茅醛对它们菌丝体生长和孢子萌发的作用，探究了其对指状青霉的作用机理。但是由于时间和条件有限，本文也存在许多不足，需要进一步的研究探讨。(1)柠檬烯本文在柠檬烯诱导指状青霉孢子萌发方面还需要做很多的验证工作，如细胞膜上的受体蛋白的变化情况、酶活性的变化情况等，同时，柠檬烯对其他病原菌的作用机理尚不明确，有待于进一步验证。(2)月桂烯本文在探究月桂烯影响指状青霉孢子萌发方面，还需要考虑到孢子萌发相关酶活性的变化，通过提取孢子的RNA，分析比对找对其中的差异基因，并找出孢子体内月桂烯诱导产生的功能基因和蛋白等，从分子水平和蛋白水平解析其诱导机制。(3)香茅醛本研究通过实验得出，香茅醛对控制果蔬采后致病菌菌丝体生长和孢子萌发有一定的作用，特别是对于指状青霉，在香茅醛处在低浓度下时可以促进其生长，在香茅醛浓度较高时又抑制其生长，其抑制作用主要通过膜损伤机制而达成，但是促进作用的机制尚不明晰，而促进作用与抑制作用之间的平衡点也尚不明确。61 参考文献[1]朱丽华.柑橘类水果采后病害及其防治[J].世界农药,2005,27(2):18-21.[2]黄友洪.湖南省柑橘产业发展研究[D].长沙:湖南农业大学,2013.[3]ZhouHE,TaoNG,JiaL.Antifungalactivityofcitral,octanalandα-terpineolagainstGeotrichumcitri-aurantii[J].FoodControl,2014,37:277-283.[4]郑世菊.柠檬醛对指状青霉线粒体的作用初探[D].湘潭:湘潭大学,2015.[5]DrobyS,EickA,MacarisinD,etal.Roleofcitrusvolatilesinhostrecognition,germinationandgrowthofPenicilliumdigitatumandPenicilliumitalicum[J].PostharvestBiologyandTechnology,2008,49(3):386-396.[6]HaoWN,ZhongGH,HuMY,etal.Controlofcitruspostharvestgreenandbluemoldandsourrotbyteasaponincombinedwithimazalilandprochloraz[J].PostharvestBiologyandTechnology,2010,56(1):39-43.[7]周娜,胡军华,姚廷山,等.柑橘种质抗柑橘蒂腐病菌扩展能力的评价[J].园艺学报,2015,42(10):1889-1898.[8]张晓彬,王宏毅,卢友民,等.蜜柚黑斑病症状及病原鉴定[J].福建农林大学学报:自然科学版,2014,43(3):245-250.[9]AkimitsuK,OhtaniK,ShimagamiT,etal.Citrusasamolecularcontactpointforco-evolutionofAlternariapathogens[J].PhysiologicalandMolecularPlantPathology,2016,95(1):93-96.[10]BoubakerH,KarimH,ElHamdaouiA,etal.ChemicalcharacterizationandantifungalactivitiesoffourThymusspeciesessentialoilsagainstpostharvestfungalpathogensofcitrus[J].IndustrialCropsandProducts,2016,86:95-101.[11]闵晓芳,邓伯勋,陈丽锋,等.柑橘采后致病青霉的鉴定[J].果树学报,2007,24(5):653-656.[12]朱从一.柑橘采后青霉属病原菌生物学特性及其系统发育[D].武汉:华中农业大学,2011.[13]陶能国,王华,王长锋,等.两株柑橘采后致病真菌的分离及生物学特性研究[J].湘潭大学自然科学学报,2013,35(3):75-78.[14]柳丽梅,张强,杨书珍,等.碳酸铵和碳酸氢铵对柑橘青霉病的抑制作用[J].华中农业大学学报,2014,33(2):65-69.[15]王哲.柑橘酸腐病菌的致病机理及其拮抗酵母的研究[D].武汉:华中农业大学,2012.[16]刘霞.柑橘果实采后酸腐病侵染规律及防治技术的研究[D].浙江:浙江大学,2009.[17]王华.柑橘精油及其组分对采后致病青霉菌的作用[D].湘潭:湘潭大学,2012.[18]TaoNG,JiaL,ZhouHE.Anti-fungalactivityofCitrusreticulataBlancoessentialoilagainstPenicilliumitalicumandPenicilliumdigitatum[J].FoodChemistry,2014,153(1):265-271.[19]王笑.柠檬烯对指状青霉孢子萌发的作用初探[D].湘潭:湘潭大学,2015.[20]SimasDLR,deAmorimSHBM,GoulartFRV,etal.Citrusspeciesessentialoilsandtheircomponentscaninhibitorstimulatefungalgrowthinfruit[J].IndustrialCropsandProducts,2017,98:108-115.[21]贾静波.柑橘精油提取及其应用研究进展[J].宁夏农林科技,2016,57(1):38-39.62 [22]许景秋.从橙皮中提取柠檬烯无害化方法的研究[J].大庆师范学院学报,2005,25(4):19-20.[23]陈静静,谷雪贤.从废弃的柑橘皮中提取d-柠檬烯的工艺研究[J].化工时刊,2008,22(5):42-44.[24]张兆沛,高志英,盛艳平,等.沙田柚果皮精油的气相色谱-质谱分析[J].粮油加工,2010(8):35-36.[25]SinghP,ShuklaR,PrakashB,etal.Chemicalprofile,antifungal,antiaflatoxigenicandantioxidantactivityofCitrusmaximaBurm.andCitrussinensis(L.)Osbeckessentialoilsandtheircyclicmonoterpene,limonene[J].FoodandChemicalToxicology,2010,48(6):1734-1740.[26]贺兵,郝玉庆.天然活性单萜-柠檬烯的抑菌作用研究进展[J].中国微生态学杂志,2009,21(3):288-289.[27]李思思,王涛,董志红,等.右旋柠檬烯的研究进展及其新型专利技术[J].河南医学研究,2013,22(4):636-638.[28]贾雷.椪柑精油及其抑菌组分对柑橘采后青,绿霉菌的作用[D].湘潭:湘潭大学,2013.[29]deAndradeDutraK,deOliveiraJV,NavarroDMAF,etal.ControlofCallosobruchusmaculatus(FABR.)(Coleoptera:Chrysomelidae:Bruchinae)inVignaunguiculata(L.)WALP.withessentialoilsfromfourCitrusspp.plants[J].JournalofStoredProductsResearch,2016,68(1):25-32.[30]TolbaH,MoghraniH,BenelmouffokA,etal.EssentialoilofAlgerianEucalyptuscitriodora:Chemicalcomposition,antifungalactivity[J].JournalofMedicalMycology,2015,25(4):128-133.[31]Carrillo-HormazaL,MoraC,AlvarezR,etal.ChemicalcompositionandantibacterialactivityagainstEnterobactercloacaeofessentialoilsfromAsteraceaespeciesgrowinginthePáramosofColombia[J].IndustrialCropsandProducts,2015,77(1):108-115.[32]刘顺珍,刘红星,张丽霞,等.金橘叶和金橘果皮挥发油成分的分析[J].安徽农业科学,2011,39(26):15968-15970.[33]王伟江.天然活性单萜——柠檬烯的研究进展[J].中国食品添加剂,2005(1):33-37.[34]高大,肖镇,吕爱娥.D-柠檬烯对K562细胞增殖及凋亡的影响[J].中国实验血液学杂志,2006,14(6):1120-1122.[35]王玲,张秀珍.D-柠檬烯对人胃癌MGC803细胞增殖和凋亡的影响[J].生命科学仪器,2009,7(1):26-28.[36]李厚金,蓝文健.天然单萜柠檬烯的微生物转化[J].化学进展,2011,23(11):2318-2325.[37]卢海燕,梁颖,刘贤金.柠檬烯乳化液对青椒采后生理和贮藏品质的影响[J].食品工业科技,2012,33(18):332-336.[38]卢海燕,梁颖,刘贤金.柠檬烯乳化液对菠菜采后生理和贮藏品质的影响[J].食品工业科技,2013,34(1):338-341.[39]赵菊莲,水建军.柠檬烯复合液对草莓采后保鲜效果的影响[J].中国食物与营养,2014,20(3):51-54.[40]赵菊莲,杨生虎.柠檬烯乳化液对杏采后保鲜效果的影响[J].中国食物与营养,2014,20(4):42-45.63 [41]赵菊莲,曹正帅,张红霞.柠檬烯复合液对油桃采后保鲜效果的影响[J].中国食物与营养,2015,1(1):35-37.[42]关天旺,刘嘉煜.柠檬烯的防腐作用及抑菌机理研究进展[J].保鲜与加工,2015,15(6):83-87.[43]高红亮,王雪梅,孙永红,等.天然防腐剂柠檬烯在橙汁保鲜中的应用[J].食品科学,2010(8):257-259.[44]韩青梅,赵华,成玉林,等.指状青霉侵染柑橘果实的细胞学研究[J].菌物学报,2013,32(6):967-977.[45]RodríguezA,SanAndrésV,CerveraM,etal.Terpenedown-regulationinorangerevealstheroleoffruitaromasinmediatinginteractionswithinsectherbivoresandpathogens[J].PlantPhysiology,2011,156(2):793-802.[46]RodríguezA,ShimadaT,CerveraM,etal.Terpenedown-regulationtriggersdefenseresponsesintransgenicorangeleadingtoresistanceagainstfungalpathogens[J].PlantPhysiology,2014,164(1):321-339.[47]RodríguezA,PerisJE,RedondoA,etal.Impactofd-limonenesynthaseup-ordown-regulationonsweetorangefruitandjuiceodorperception[J].FoodChemistry,2017,217:139-150.[48]尤亮.农杆菌介导的指状青霉转化体系的建立[D].武汉:华中农业大学,2014.[49]YahyazadehM,OmidbaigiR,ZareR,etal.EffectofsomeessentialoilsonmycelialgrowthofPenicilliumdigitatumSacc[J].WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology,2007,24(8):1445-1450.[50]JhalegarMDJ,SharmaRR,SinghD.InvitroandinvivoactivityofessentialoilsagainstmajorpostharvestpathogensofKinnow(Citrusnobilis×C.deliciosa)mandarin[J].JournalofFoodScienceandTechnology,2015,52(4):2229-2237.[51]Pérez-AlfonsoCO,Martínez-RomeroD,ZapataPJ,etal.TheeffectsofessentialoilscarvacrolandthymolongrowthofPenicilliumdigitatumandP.italicuminvolvedinlemondecay[J].InternationalJournalofFoodMicrobiology,2012,158(2):101-106.[52]CastilloS,Pérez-AlfonsoCO,Martínez-RomeroD,etal.Theessentialoilsthymolandcarvacrolappliedinthepackinglinesavoidlemonspoilageandmaintainqualityduringstorage[J].FoodControl,2014,35(1):132-136.[53]祁云霞,刘永斌,荣威恒.转录组研究新技术:RNA-Seq及其应用[J].遗传,2011,33(11):1191-1202.[54]成海平,钱小红.蛋白质组研究的技术体系及其进展[J].生物化学与生物物理进展,2000,27(6):584-588.[55]赵静,王宏伟,田二杰,等.蛋白质组学实验技术及其应用[J].动物医学进展,2015,36(1):116-120.[56]BroschM,YuL,HubbardT,etal.AccurateandsensitivepeptideidentificationwithMascotPercolator[J].JournalofProteomeResearch,2009,8(6):3176-3181.[57]RitchieMD,HolzingerER,LiR,etal.Methodsofintegratingdatatouncover64 genotype-phenotypeinteractions[J].NatureReviewsGenetics,2015,16(2):85-97.[58]SchwanhäusserB,BusseD,LiN,etal.Globalquantificationofmammaliangeneexpressioncontrol[J].Nature,2011,473(7347):337-342.[59]VogelC,MarcotteEM.Insightsintotheregulationofproteinabundancefromproteomicandtranscriptomicanalyses[J].NatureReviewsGenetics,2012,13(4):227-232.[60]MaierT,GüellM,SerranoL.CorrelationofmRNAandproteinincomplexbiologicalsamples[J].FEBSLetters,2009,583(24):3966-3973.[61]MuersM.Geneexpression:Transcriptometoproteomeandbacktogenome[J].NatureReviewsGenetics,2011,12(8):518-518.[62]BouchalP,DvořákováM,RoumeliotisT,etal.CombinedProteomicsandTranscriptomicsIdentifiesCarboxypeptidaseB1andNuclearFactorκB(NF-κB)AssociatedProteinsasPutativeBiomarkersofMetastasisinLowGradeBreastCancer[J].MolecularandCellularProteomics,2015,14(7):1814-1830.[63]PetersenHO,HögerSK,LoosoM,etal.Acomprehensivetranscriptomicandproteomicanalysisofhydraheadregeneration[J].MolecularBiologyandEvolution,2015:32(8):1928-1947.[64]WangJ,MeiH,ZhengC,etal.ThemetabolicregulationofsporulationandparasporalcrystalformationinBacillusthuringiensisrevealedbytranscriptomicsandproteomics[J].MolecularandCellularProteomics,2013,12(5):1363-1376.[65]曹文君,李运明,陈长生.基因表达谱富集分析方法研究进展[J].生物技术通讯,2008,19(6):931-934.[66]CrokenMMK,QiuW,WhiteMW,etal.GeneSetEnrichmentAnalysis(GSEA)ofToxoplasmagondiiexpressiondatasetslinkscellcycleprogressionandthebradyzoitedevelopmentalprogram[J].BMCGenomics,2014,15(1):515-528.[67]WangS,YouZ,YeL,etal.QuantitativeproteomicandtranscriptomicanalysesofmolecularmechanismsassociatedwithlowsilkproductioninsilkwormBombyxmori[J].JournalofProteomeResearch,2014,13(2):735-751.[68]ChenQ,GuoW,FengL,etal.TranscriptomeandproteomeanalysisofEucalyptusinfectedwithCalonectriapseudoreteaudii[J].JournalofProteomics,2015,115:117-131.[69]TrevisanS,ManoliA,RavazzoloL,etal.Nitratesensingbythemaizerootapextransitionzone:amergedtranscriptomicandproteomicsurvey[J].JournalofExperimentalBotany,2015,66(13):3699-3715.[70]欧阳松应,杨冬,欧阳红生,等.实时荧光定量PCR技术及其应用[J].生命的化学,2004,24(1):74-76.[71]李亚萍.荧光定量PCR[J].生物技术世界,2008(2):58-59.[72]StoreyJD,TibshiraniR.Statisticalsignificanceforgenomewidestudies[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2003,100(16):9440-9445.[73]杨军,宋硕林,许国旺.代谢组学及其应用[J].生物工程学报,2005,21(1):1-5.[74]KindT,WohlgemuthG,LeeDY,etal.FiehnLib:massspectralandretentionindexlibrariesfor65 metabolomicsbasedonquadrupoleandtime-of-flightgaschromatography/massspectrometry[J].AnalyticalChemistry,2009,81(24):10038-10048.[75]夏建飞,梁琼麟,胡坪,等.代谢组学研究策略与方法的新进展[J].分析化学,2009,37(1):136-143.[76]阿基业.代谢组学数据处理方法——主成分分析[J].中国临床药理学与治疗学,2010(5):481-489.[77]贾雷,何湘丽,陶能国,等.不同发育期椪柑精油对意大利青霉和指状青霉的抑制作用[J].食品工业科技,2013,34(7):68-72.[78]PrietoSGA,PereaVJA,OrtizLCC.Microbialbiotransformationof(R)-(+)-limonenebyPenicilliumdigitatumDSM62840forproducing(R)-(+)-terpineo[J].Vitae,2011,18(2):136-172.[79]ZhengSJ,JingGX,WangX,etal.CitralexertsitsantifungalactivityagainstPenicilliumdigitatumbyaffectingthemitochondrialmorphologyandfunction[J].FoodChemistry,2015,178:76-81.[80]TaoNG,OuYangQL,JiaL.CitralinhibitsmycelialgrowthofPenicilliumitalicumbyamembranedamagemechanism[J].FoodControl,2014,41:116-121.[81]OuYangQL,TaoNG,JingGX.TranscriptionalprofilinganalysisofPenicilliumdigitatum,thecausalagentofcitrusgreenmold,unravelsaninhibitedergosterolbiosynthesispathwayinresponsetocitral[J].BMCGenomics,2016,17(1):599-615.[82]TaoNG,FanF,JiaL,etal.OctanalincorporatedinpostharvestwaxofSatsumamandarinfruitasabotanicalfungicideagainstPenicilliumdigitatum[J].FoodControl,2014,45:56-61.[83]DuanXF,JingGX,FanF,etal.Controlofpostharvestgreenandbluemoldsofcitrusfruitbyapplicationofsodiumdehydroacetate[J].PostharvestBiologyandTechnology,2016,113:17-19.[84]WangH,TaoNG,HuangSR,etal.EffectofShatangju(CitrusreticulataBlanco)essentialoilonsporegerminationandmyceliumgrowthofPenicilliumdigitatumandP.italicum[J].JournalofEssentialOilBearingPlants,2012,15(5):715-723.[85]RegnierT,CombrinckS,VeldmanW,etal.Applicationofessentialoilsasmulti-targetfungicidesforthecontrolofGeotrichumcitri-aurantiiandotherpostharvestpathogensofcitrus[J].IndustrialCropsandProducts,2014,61:151-159.[86]Carrillo-HormazaL,MoraC,AlvarezR,etal.ChemicalcompositionandantibacterialactivityagainstEnterobactercloacaeofessentialoilsfromAsteraceaespeciesgrowinginthePáramosofColombia[J].IndustrialCropsandProducts,2015,77:108-115.[87]TolbaH,MoghraniH,BenelmouffokA,etal.EssentialoilofAlgerianEucalyptuscitriodora:Chemicalcomposition,antifungalactivity[J].JournalofMedicalMycology,2015,25(4):128-133.[88]LeeYS,KimJ,ShinSC,etal.AntifungalactivityofMyrtaceaeessentialoilsandtheircomponentsagainstthreephytopathogenicfungi[J].FlavourandFragranceJournal,2008,23(1):23-28.[89]RammaneeK,HongpattarakereT.Effectsoftropicalcitrusessentialoilsongrowth,aflatoxinproduction,andultrastructurealterationsofAspergillusflavusandAspergillusparasiticus[J].Food66 andBioprocessTechnology,2011,4(6):1050-1059.[90]TrindadeLA,deAraújoOliveiraJ,deCastroRD,etal.InhibitionofadherenceofC.albicanstodentalimplantsandcoverscrewsbyCymbopogonnardusessentialoilandcitronellal[J].ClinicalOralInvestigations,2015,19(9):2223-2231.[91]ScoraKM,ScoraRW.EffectofvolatilesonmyceliumgrowthofPenicilliumdigitatum,P.italicum,andP.ulaiense[J].JournalofBasicMicrobiology,1998,38(5‐6):405-413.[92]ZoreGB,ThakreAD,JadhavS,etal.TerpenoidsinhibitCandidaalbicansgrowthbyaffectingmembraneintegrityandarrestofcellcycle[J].Phytomedicine,2011,18(13):1181-1190.[93]NakaharaK,AlzorekyNS,YoshihashiT,etal.ChemicalcompositionandantifungalactivityofessentialoilfromCymbopogonnardus(citronellagrass)[J].JapanAgriculturalResearchQuarterly,2013,37(4):249-252.[94]AguiarRWS,OotaniMA,AscencioSD,etal.FumigantantifungalactivityofCorymbiacitriodoraandCymbopogonnardusessentialoilsandcitronellalagainstthreefungalspecies[J].TheScientificWorldJournal,2014:ID492138[95]ArancibiaMY,López-CaballeroME,Gómez-GuillénMC,etal.Releaseofvolatilecompoundsandbiodegradabilityofactivesoyproteinligninblendfilmswithaddedcitronellaessentialoil[J].FoodControl,2014,44:7-15.[96]LiuJ,ZongY,QinG,etal.PlasmamembranedamagecontributestoantifungalactivityofsiliconagainstPenicilliumdigitatum[J].CurrentMicrobiology,2010,61(4):274-279.[97]FanF,TaoNG,JiaL,etal.UseofcitralincorporatedinpostharvestwaxofcitrusfruitasabotanicalfungicideagainstPenicilliumdigitatum[J].PostharvestBiologyandTechnology,2014,90:52-55.[98]PaulS,DubeyRC,MaheswariDK,etal.Trachyspermumammi(L.)fruitessentialoilinfluencingonmembranepermeabilityandsurfacecharacteristicsininhibitingfood-bornepathogens[J].FoodControl,2011,22(5):725-731.[99]TyagiAK,MalikA.Liquidandvapour-phaseantifungalactivitiesofselectedessentialoilsagainstCandidaalbicans:microscopicobservationsandchemicalcharacterizationofCymbopogoncitratus[J].BMCComplementaryandAlternativeMedicine,2010,10(1):65-76.[100]MandrasN,NostroA,RoanaJ,etal.Liquidandvapour-phaseantifungalactivitiesofessentialoilsagainstCandidaalbicansandnon-albicansCandida[J].BMCComplementaryandAlternativeMedicine,2016,16(1):330-337.67 致谢值此论文完成之际，谨向所有指导和帮助过我的师长、同学、朋友、亲人表示由衷的感谢。首先要感谢的是我的授业恩师陶能国教授，陶老师在我三年的研究生生涯中给予了我很大的帮助，从理论知识的学习，科研思维的培养、实验能力的指导，到生活质量的追求、未来人生的规划、人生价值的实现，陶老师都能很好的引导我，言传身教，对我产生了深刻的影响，也为我树立了良好的榜样。在陶老师的悉心指导和亲切关怀下，本论文得以顺利进行，我的综合素质也得到了很大的提高。陶老师乐观的人生态度、丰富渊博的知识、对新事物的好奇心、对科学的严谨态度和不断进取的敬业精神都深深的影响着我，使我终生受益。在此完成学业之际，特向陶老师致以最真挚的谢意！感谢课题组张妙玲老师和敬国兴老师对我的帮助和鼓励，感谢他们在工作上给予我的帮助和支持；感谢师兄师姐凡凤、杨焱、郑世菊、王笑、欧阳秋丽、段小芳、刘圣权对我无私的指导和鼓励；感谢同门谢思以及师弟师妹许灵春、窦诗雯、汤旭、孙腾、陈悦、杨艳琴、辛志彤、吴育藩、杨文蒿等的理解和协助。在论文的完成中，感谢朋友王靖、周阳思雨、肖畅、戴晴、李小芝、蔡英、刘磊等给予了真诚的关心、支持和帮助，在此向他们表示深深的谢意！向多年来一直支持我学业的亲人们表示感谢，是他们的爱让我不断的成长，他们给了我不断战胜困难的勇气，他们对我的默默付出，我将感激终生。感谢国家自然科学基金(NO.31572172)和湖南省教育厅科学研究重点项目(NO.15A181)对本研究的资助支持。最后，谨向所有关心及帮助过我的人表达诚挚的谢意！68 攻读硕士学位期间发表学术论文情况(1)WuYL,OuYangQL,TaoNG*.PlasmamembranedamagecontributestoantifungalactivityofcitronellalagainstPenicilliumdigitatum[J].JournalofFoodScienceandTechnology,2016,53(10):3853-3858.(2)WuYL,DuanXF,JingGX,OuYangQL,TaoNG*.CinnamaldehydeinhibitsthemycelialgrowthofGeotrichumcitri-aurantiiandinducesdefenseresponsesagainstsourrotincitrusfruit[J].PostharvestBiologyandTechnology,2017,129:23-28.攻读硕士学位期间参加研究项目情况(1)国家自然科学基金：柠檬烯诱导指状青霉孢子萌发的作用机理(编号：31572172)(2)湖南省教育厅科学研究重点项目：萜烯烃类诱导柑橘采后绿霉发生的机制解析(编号：15A181)69
此文档下载收益归作者所有
