《家蚕自噬基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
分类号：S884学校代码：10712UDC：591研究生学号：2011060166密级：公开2015届攻读博士学位研究生学位（毕业）论文家蚕自噬基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究学科专业：特种经济动物饲养研究方向：蚕桑病理与病原微生物研究生杨晓冰指导教师：钱永华教授焦锋副教授完成时间：2015年5月中国陕西杨凌 Classificationcode:S884_Universitycode:10712UDC:591Postgraduatenumber:2011060166Confidentialitylevel:PublicDissertationforDoctorDegreeNorthwestA＆FUniversityin2015Autophagy-relatedGeneExpressioninSilkworm(Bombyxmori)andBmCPVInfectionModelMajor:EconomicAnimalsResearchfield:PathologyandPathogenicMicroorganismsinSericultureNameofPostgraduate:YangXiaobingAdviser:QianYonghuaCo-adviser:JiaoFengDateofsubmitted:2015-5YanglingShaanxiChina 研究生学位（毕业）论文的独创性声明本人声明：所呈交的博士学位（毕业）论文是我个人在导师指导下独立进行的研究工作及取得的研究结果；论文中的研究数据及结果的获得完全符合学校《关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定》，如果违反此规定，一切后果与法律责任均由本人承担。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究结果，也不包含其他人和自己本人已获得西北农林科技大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同事对本研究所做的任何贡献均已在论文的致谢中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：#,时间:年(月2曰导师指导研究生学位（毕业）论文的承诺本人承诺：我的博士研究生jib4所呈交的博士学位（毕业）论文是在我指导下独立开展研究工作及取得的研究结果，属于我现岗职务工作的结果，并严格按照学校《关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定》而获得的研究结果。如果违反学校《关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定》，我愿接受按学校有关规定的处罚处理并承担相应导师连带责任。 关于研究生学位（毕业）论文使用授权的说明本学位（毕业）论文的知识产权归属西北农林科技大学。本人同意西北农林科技大学保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被查阅和借阅；同意西北农林科技大学将本学位（毕业）论文的全部或部分内容授权汇编录入《中国博士学位论文全文数据库》进行出版，并享受相关权益。本人保证，在毕业离开（或者工作调离）西北农林科技大学后，发表或者使用本学位（毕业）论文及其相关的工作成果时，将以西北农林科技大学为第一署名单位，否则，愿意按《中华人民共和国著作权法》等有关规定接受处理并承担法律责任。任何收存和保管本论文各种版本的其他单位和个人(包括研究生本人)未经本论文作者的导师同意，不得有对本论文进行复制、修改、发行、出租、改编等侵犯著作权的行为，否则，按违背《中华人民共和国著作权法》等有关规定处理并追究法律责任。(保密的学位论文在保密期限内，不得以任何方式发表、借阅、复印、缩印或扫描复制手段保存、汇编论文）研究生签名:<〇时间年6月2曰 家蚕自噬相关基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究摘要作为机体的一种防御和应激调控机制，细胞自噬具有清除细胞内失去功能的各种生物大分子如变性蛋白质、核酸及其他细胞成分的功能，以维持细胞的平衡状态，有利于细胞的存活，所以不管是在不同的物种间、还是在各种类型的细胞之间，自噬机制都普遍被保留下来，在进化上表现出高度的保守性。最近的研究显示自噬也参与了天然免疫应答与适应性免疫应答，在生物体应对环境应激上具有重要作用，可防止某些疾病如肿瘤、肌病等，此外，自噬机制还参与了抵御病原微生物感染的过程。家蚕属于鳞翅目昆虫，因具有变态发育特征而被自噬研究者重视，在变态发育时期，大量的家蚕幼虫组织被自噬体和其他一些蛋白水解酶降解，再由机体合成新的成虫组织和器官。本试验首先在基因转录水平及蛋白质翻译水平分析了家蚕主要自噬相关基因的表达规律。由于自噬作用在家蚕病理上的研究尚未见报道，因此本试验采用家蚕质型多角体病毒(BombyxmoriCytoplasmicPolyhedrosisVirus,BmCPV)感染家蚕，分析了自噬相关基因表达与病毒感染的关系，获得的主要结果如下：1、通过qRT-PCR方法，检测了3个自噬相关基因BmAtg8、BmAtg5、BmAtg7在家蚕不同组织中的表达模式，3个BmAtg基因在丝腺组织的相对表达水平最高，其次是脂肪体和中肠，在马氏管、肌肉和皮肤中相对表达水平较低。2、通过基因克隆的方法，构建了pET32a载体与BmAtg8基因的重组质粒。通过免疫新西兰大白兔获得了BmATG8蛋白的多克隆抗血清，使用WesternBlot方法检测了家蚕内源BmATG8和BmATG8-PE的表达。发现BmATG8和BmATG8-PE蛋白条带分别位于14kDa、12kDa的位置，并且该蛋白在家蚕不同组织中的表达模式与实时定量检测结果一致。在5龄家蚕第1-8天的丝腺组织中，BmATG8-PE/BmATG8比值出现显著的变化。3、构建了基于BmATG8蛋白氨基酸序列的系统进化树，发现BmATG8蛋白与其他物种相关蛋白的遗传距离较近，显示出自噬机制的进化保守特征。4、使用qRT-PCR技术和免疫印迹方法检测了5龄第2天家蚕中肠细胞在饥饿、雷帕霉素处理、高温和低温冲击1h条件下的3个BmAtg基因表达及BmATG8蛋白表达。发现BmAtg8基因在饥饿处理后24h表达显著上升，WB条带也显示了BmATG8蛋白表达增加的同步性；雷帕霉素处理后未发现3个BmAtg基因及BmATG8蛋白表达的显著变化；37°C高温处理1h后BmATG8的转化效率显著下降，而4°C低温冲击1h未见 家蚕BmAtg基因及蛋白的显著变化。5、分析了BmCPV感染后家蚕的典型病症，使用RT-PCR技术检测了病毒RDRP基因在整个病程中的增殖规律。多角体被食下后24h可检测到RDRP基因，在感染72h后该基因大量表达。使用苏木精-伊红染色方法(HE)观察了CPV病毒感染后的中肠石蜡切片，发现感染72h时有大量病毒多角体形成，此后多角体逐渐增多，柱状细胞出现严重的核浓缩和细胞破裂，家蚕中肠基因组DNA的降解出现在病毒感染后120h。6、使用免疫组化技术证实家蚕内源BmATG8/BmATG8PE蛋白广泛分布在细胞质中，使用透射电子显微镜观察到了家蚕中肠组织内的典型自噬体，呈现双层膜或多层膜结构。7、检测了CPV病毒感染家蚕后中肠自噬相关基因表达。发现BmAtg8基因在4龄起蚕感染CPV病毒后4h表达下降，而在24h表达上升；BmAtg5基因表达趋势和BmAtg8相似；BmAtg7基因在家蚕感染CPV后表达上升。WB检测发现CPV病毒感染5龄起蚕后，中肠组织BmATG8蛋白转化为BmATG8PE的效率有所提高，与BmAtg7基因转录表达上调效应相一致，初步认为中肠细胞自噬在CPV病毒感染的早期具有一定的调节作用。8、通过基因克隆方法获得了质型多角体蛋白基因(BmCPV)的重组质粒pET28-S10，并通过宿主菌E.coliRosseta诱导表达得到了重组多角体蛋白。构建了基于多角体蛋白氨基酸序列的系统进化树，发现多角体蛋白在CPV病毒进化过程中相对保守。该病毒具有交叉感染特性，以类似于“特洛伊木马”入侵的方式在昆虫中横向传播。9、分析了家蚕CPV病毒多角体经碱性缓冲液处理后的特点。多角体经碱性溶液解离后的病毒离子感染家蚕，致病时间比原病毒多角体提前1.2天。体外碱性溶液处理后解离的多角体，在去除碱性环境并加入多角体蛋白后，病毒离子无法重新被包埋形成多角体。关键词：家蚕，自噬，质型多角体病毒(CPV)，免疫印迹，基因表达 Autophagy-relatedGeneExpressioninSilkworm(Bombyxmori)andBmCPVInfectionModelAbstractAsadefendedandstress-regulatedmechanismoftheorganism,autophagycanclearvariousbiologicalmacromoleculesthathavelosethefunctionofcellssuchasdenaturedproteins,nucleicacidsandothercellularcomponents,inordertomaintaincellhomeostasis,andinfavorofcellsurvival.Therefore,autophagymechanismshavegenerallybeenpreserved,amongspeciesandvariouscelltypes,showingahighdegreeofconservatism.Recentstudieshaveshownthatautophagyalsoinvolvedintheinnateandtheadaptiveimmuneresponse,intermsofthebiologicalresponsetoenvironmentalstress,andthecrucialroletopreventcertaindiseasessuchascancer,myopathy,andtoresistpathogensinfection.SilkwormisinorderofLepidoptera,drawedtheautophagyresearchers’attentionsduetothemetamorphosischaracteristic.Inthemetamorphosisperiod,alargenumberofsilkwormlarvaetissuesaredegradatedbyautophagyandotherproteolyticenzymatic,andthenareusedforthesynthesisofbody'snewtissuesandorgans.Inthisexperiment,theexpressionofmainautophagy-relatedgenesinsilkworm(Bombyxmori)wasanalyzedinthegenetranscriptionlevelandproteintranslationlevel.Inaddition,sinceautophagyresearchsonsilkwormpathologyhavenotbeenreported,silkwormswereinfectedbyCytoplasmicPolyhedrosisVirus(BmCPV),andtherelationshipbetweenautophagy-relatedgeneexpressionandviralinfectionswasanalyzed.1.Theexpressionpatternsofthreeautophagy-relatedgenes(BmAtg8,BmAtg5andBmAtg7)silkwormindifferenttissuesweredetectedbyqRT-PCRmethod.TheBmAtggeneshadhighestrelativelyexpressioninsilkgland,secondlyinthefatbodyandmidgut,whilehadrelativelylowexpressioninmalpighiantubules,muscleandskin.2.TherecombinantplasmidpET32a-BmAtg8wasconstructed,andBmATG8polyclonalantibodieswereobtained.TheexpressionofendogenoussilkwormBmATG8andBmATG8-PEproteinsweredetectedusingtheWBmethod.ItfoundthatBmATG8andBmATG8-PEproteinbandswerelocatedon14kDa,12kDaposition.Theproteinexpressionpatternsindifferentsilkwormtissueswereconsistentwithreal-timequantitativetestresults.BmATG8-PE/BmATG8ratioshowedsignificantlychangesat1-8daysin5thinstarsilkgland. 3.PhylogenetictreewasconstructedbasedontheaminoacidsequenceofATG8protein.ItsuggestedthatsilkwormATG8proteinhadaclosergeneticdistancewithotherspeciesassociatedproteins,whichshowedtheevolutionarilyconservedcharacteristicofautophagymechanism.4.UsingqRT-PCRandWesternblottechnique,BmAtggeneandBmATG8proteinexpressioninsilkwormmidgutatthe5thinstarday2weredetectedafterthesilkwormsweretreatedbystarvation,rapamycin,hightemperatureandlowtemperature.ItfoundasignificantincreaseofBmAtg8geneexpressionat24hafterstarvation,andtheWBstripsalsoshowedsynchronizationincreasedproteinexpressionofBmATG8.Rapamycintreatmentdidnotsignificantlychangethe3BmAtggeneandBmATG8proteinexpression.BmATG8conversionefficiencydecreasedsignificantlyafterkeepingfor1hat37°C,whilenosignificantchangewasfoundat4°C.5.Thetypicalsymptomsofinfectedsilkwormswereanalysed.ViralRDRPgeneproliferationthroughoutthecourseoftheinfectionwasdeterminedusingRT-PCRtechnique.RDRPgenecanbedetectedat24hafterinfection,andhighlyexpressedat72h.Usinghematoxylin-eosinstaining(HE)method,CPVinfectionprocesswasobservedonthemidgutparaffin.Alargenumberofviruspolyhedrawerefoundat72hafterinfection,thenincreasedgradually,andthecolumnarcellsshowedseverenuclearenrichmentandcellrupture.GenomicDNAdegradationofSilkwormmidgutwaspresentat120hafterinfection.6.ItwasconfirmedusingimmunohistochemicaltechniquesthattheendogenousBmATG8/BmATG8PEproteinsofsilkwormwerewidelydistributedinthecytoplasm.Typicalautophagicfeaturesofsilkwormmidguttissuewereobservedusingatransmissionelectronmicroscope(TEM),showingdoublemembranestructure.7.Autophagy-relatedgeneandproteinexpressioninsilkwormmidgutweredetectedafterCPVinfection.BmAtg8geneexpressiondecreasedat4hafterCPVinfectiononsilkwormatthebeginningof4thinstar,whileincreasedat24h.BmAtg5expressiontrendsweresimilartoBmAtg8.BmAtg7geneexpressionincreasedafterCPVinfection.ThetransformationefficiencyfromBmATG8toBmATG8PEincreasedafterCPVinfectiononsilkwormatthebeginningof5thinstar,whichwasinaccordancewithBmAtg7geneupregulationontranscriptionlevel.ItsuggestedthatantagonismoccurredbetweentheCPVinfectionandmidgutautophagy.8.TherecombinantplasmidpET28-S10wasobtainedbygenecloningmethods,andrecombinantpolyhedrinwasexpressedbyinducingthehostbacteriaE.coliRosseta.Phylogenetictreewasconstructedbasedontheaminoacidsequenceofpolyhedrin,itproposedthepolyhedrinwasrelativelyconservativeinCPVvirusevolution.TheCPVvirus ownsthecharacteristicsofcross-infection,inamannersimilarto"Trojanhorse"approach.9.ThecharacteristicsoftheCPVpolyhedrawereanalyzedafteralkalinebufferprocessing.Ifpolyhedrasolutionweretreatedwithalkalinesolutionandthenusedtoinfectsilkworms,thepathogenictimewouldbeinadvanceby1.2daysthantheoriginalpolyhedrasolution.Thepolyhedradissociatedafterthealkalinesolutiontreatmentinvitro.However,whenthealkalineenvironmentwasremovedandpolyhedrinwasaddedintothedissociatedpolyhedrasolution,virusparticlescannotbere-entrappedtoformpolyhedra.KEYWORDS:Silkworm(Bombyxmori),Autophagy,CytoplasmicPolyhedrosisVirus(CPV),WesternBlot,GeneExpression 目录第一部分：文献综述................................................................................................................1第一章：细胞自噬研究进展....................................................................................................11.1细胞自噬机制概述......................................................................................................11.2自噬相关基因...............................................................................................................41.3自噬研究方法...............................................................................................................51.3.1透射电子显微镜.................................................................................................61.3.2荧光显微镜结合GFP-LC3融合蛋白...............................................................61.3.3免疫印迹法检测LC3-II/I比值的变化.............................................................61.3.4免疫组化法(Immunohistochemistry).................................................................61.3.5转录和翻译调控.................................................................................................71.3.6自噬相关蛋白的降解.........................................................................................71.3.7自噬-溶酶体共存和淬灭试验............................................................................71.3.8活体检测.............................................................................................................71.4自噬研究模型...............................................................................................................81.5自噬在病理过程中的作用.........................................................................................101.5.1自噬与病原体感染...........................................................................................111.5.2自噬与癌症.......................................................................................................111.5.3自噬与衰老.......................................................................................................121.5.4自噬与神经退行性疾病...................................................................................131.6家蚕自噬相关研究.....................................................................................................131.7小结............................................................................................................................14第二章：家蚕CPV病毒研究进展........................................................................................152.1BmCPV及多角体的形态与理化性状......................................................................152.2BmCPV的基因组与编码蛋白..................................................................................162.3BmCPV的感染过程与病理特征..............................................................................182.4BmCPV的病毒起源与防治......................................................................................202.5小结............................................................................................................................21第二部分：试验研究..............................................................................................................22第三章：家蚕Atg基因在不同组织中的表达......................................................................223.1材料与方法................................................................................................................223.1.1试验动物...........................................................................................................22 3.1.2主要仪器和试剂..............................................................................................223.1.3实时定量PCR检测Atg基因表达..................................................................233.1.4BmATG8多克隆抗体的制备..........................................................................243.1.5组织蛋白的免疫印迹分析..............................................................................253.2结果与分析................................................................................................................263.2.1家蚕自噬相关基因表达的检测......................................................................263.2.2BmATG8多克隆抗体的制备和效价..............................................................283.2.3家蚕组织蛋白的WesternBlot检测................................................................313.2.4家蚕BmATG8蛋白的系统进化.....................................................................333.3讨论与小结.................................................................................................................343.3.1讨论...................................................................................................................343.3.2小结...................................................................................................................35第四章：影响家蚕中肠Atg基因表达的应激因素..............................................................364.1材料与方法................................................................................................................364.1.1试验动物处理...................................................................................................364.1.2主要仪器和试剂...............................................................................................364.1.3实时定量PCR分析.........................................................................................364.1.4不同处理家蚕中肠的免疫印迹分析...............................................................364.2结果与分析................................................................................................................364.2.1饥饿和雷帕霉素处理对Atg基因转录表达的影响......................................364.2.2饥饿和雷帕霉素处理对ATG8蛋白表达的影响..........................................374.2.3温度冲击对Atg基因表达的影响..................................................................384.2.4温度冲击对ATG8蛋白表达的影响..............................................................394.3讨论与小结.................................................................................................................404.3.1讨论...................................................................................................................404.3.2小结...................................................................................................................41第五章：BmCPV病毒感染的病理特征与切片分析...........................................................425.1材料与方法................................................................................................................425.1.1家蚕CPV病毒攻毒方法.................................................................................425.1.2主要仪器和试剂...............................................................................................425.1.3家蚕感染CPV病毒后的体重测定.................................................................425.1.4家蚕CPV感染后中肠基因组DNA的降解检测.........................................425.1.5家蚕CPV感染后病毒RDRP基因的RT-PCR分析.....................................435.1.6家蚕中肠石蜡切片的HE染色分析................................................................435.1.7家蚕中肠组织石蜡切片的免疫组化分析.......................................................44 5.1.8家蚕中肠组织的透射电镜切片观察...............................................................455.2结果与分析................................................................................................................455.2.1家蚕BmCPV病毒感染后的病理特征..........................................................455.2.2家蚕CPV感染后中肠组织基因组DNA的降解..........................................475.2.3CPV病毒感染后RDRP基因的增殖..............................................................475.2.4家蚕中肠石蜡切片的HE染色结果...............................................................485.2.5家蚕中肠组织中BmATG8蛋白的免疫组化定位.........................................495.2.6家蚕中肠组织中的自噬体观察.......................................................................515.3讨论与小结.................................................................................................................525.3.1讨论...................................................................................................................525.3.2小结...................................................................................................................53第六章：BmCPV病毒感染影响家蚕中肠Atg基因表达....................................................546.1材料与方法................................................................................................................546.1.1试验动物与病毒感染.......................................................................................546.1.2主要试剂和仪器...............................................................................................546.1.3RT-PCR测定家蚕病毒感染后的Atg基因表达..............................................546.1.4WesternBlot检测家蚕病毒感染后BmATG8蛋白表达................................546.2结果与分析................................................................................................................546.2.1家蚕Atg基因在CPV感染病程中的表达.....................................................546.2.2家蚕BmAtg8基因在CPV感染初期的表达..................................................566.2.3家蚕BmATG8蛋白在CPV感染初期的表达................................................576.3讨论与小结.................................................................................................................586.3.1讨论..................................................................................................................586.3.2小结..................................................................................................................59第七章：BmCPV病毒多角体的性质分析...........................................................................607.1材料与方法................................................................................................................607.1.1家蚕CPV病毒的培养和收集.........................................................................607.1.2病毒基因组RNA的提取................................................................................607.1.3多角体蛋白基因片段分析..............................................................................607.1.4基于氨基酸序列的多角体蛋白进化分析.......................................................607.1.5pET28-S10重组载体构建和多角体蛋白表达...............................................607.1.6多角体的解离和包埋性质分析.......................................................................617.1.7病毒多角体解离后的致病时间分析...............................................................617.2结果与分析................................................................................................................617.2.1病毒多角体的形态...........................................................................................61 7.2.2CPV病毒多角体蛋白基因S10片段分析.......................................................627.2.3基于多角体蛋白序列的系统进化...................................................................637.2.4pET28-S10重组载体构建...............................................................................657.2.5多角体蛋白缺乏体外自包装功能...................................................................657.2.6病毒多角体解离提前感染时间.......................................................................667.3讨论与小结.................................................................................................................667.3.1讨论..................................................................................................................667.3.2小结...................................................................................................................67第八章：结论与创新点..........................................................................................................688.1结论.............................................................................................................................688.2创新点.........................................................................................................................69参考文献..................................................................................................................................70附录..................................................................................................................................80缩略词..................................................................................................................................89 第一章细胞自噬研究进展1第一部分：文献综述第一章细胞自噬研究进展1.1细胞自噬机制概述自噬是细胞内部的一种降解机制，首先由膜成分包裹部分细胞质或细胞内需降解的细胞器、蛋白质等大分子物质形成自噬体(Autophagosome)，此时，自噬体也可以与内涵体(Endosome)融合形成所谓的自噬内涵体(Amphisomes)。在细胞自噬的后期，自噬体会与溶酶体融合形成自噬溶酶体(Autophagolysosome)，并降解其内部所包裹的内容物，以实现细胞平衡以及细胞器更新的一系列过程(Toozeetal.2010)。自噬不同于凋亡，二者最大的不同点是：自噬是细胞内部发生的一种自食(Self-eating)现象，此过程是细胞经过一系列的自我调整最后实现了细胞存活和代谢平衡；而凋亡是细胞的自杀(Self-killing)现象，是细胞通过一系列步骤结束了自身的生命周期。自噬和凋亡可由相同的刺激因素引发，并受相似的调节蛋白调控，但是他们的诱发阈值却不同，虽然他们之间可发生转换和协调作用，但是详细的机制目前还不清楚(Maiurietal.2007)。使用透射电镜技术，可以观察到典型的自噬体结构，通常表现为：双层膜或多层膜，内含胞浆成分。目前认为自噬机制起到了防御和应激调控的作用，通过自噬作用以及溶酶体和其他降解酶类，细胞内部的变性蛋白质以及核酸等生物大分子，甚至那些衰老和失去功能的细胞、细胞器都可以被降解、消化，这种机能为细胞的重建和修复提供了一些必须的原料，使细胞内部的物质得以再循环和重新利用(王晓杜etal.2010)。因此，自噬机制的角色类似于机体内部的“垃圾处理厂”和“废品回收站”；在细胞遭遇病原体入侵时，自噬具有防御作用，当细胞受到细胞内毒物的损害时，自噬具有保护细胞的功能。所以有研究人员指出：凋亡过程是细胞的程序化死亡过程，相反，自噬过程则是细胞经过一定自我调整而存活的过程，然而自噬水平过高或过低，都会对细胞产生一定的危害(Kroemeretal.2008)。由自噬引发的细胞程序性死亡即细胞自噬程序性死亡(Autophagiccelldeath)(Abrahametal.2004)。生物有机体的单个正常细胞在生命周期的最后阶段将会经历程序性死亡步骤(ProgrammedCellDeath，PCD)，目前细胞凋亡(Apoptosis)被称为Ⅰ型细胞程序性死亡，该过程需要蛋白酶类(Caspase)参与，它的主要特征为染色体浓聚继而发生DNA降解、细胞内形成凋亡小体并导致细胞皱缩等，细胞最后残存的成分经巨噬细胞吞噬清除。自噬性程序性细胞死亡则被认为是Ⅱ型程序性细胞死亡，以自噬体的出现为特征，不需蛋白酶类(Caspase)参与，自噬体以及膜包裹的成分最后通过溶酶体系统得到清除(Klionsky2005a;Lockshinetal.2004)。在细胞程序性死亡过程中，自噬通常先于凋亡， 2家蚕自噬基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究进而启动凋亡，共同促进细胞死亡。哺乳动物细胞特别是癌细胞自噬与凋亡相互关系的研究已经取得了很多重要的进展，二者的关系因细胞类型、诱导因子或细胞的状态等因素不同而发生变化，或相互促进，或相互独立，有时候则相互拮抗，即自噬也可抑制凋亡，发挥保护细胞的作用。自噬体的发现可上溯至20世纪50年代，比利时科学家德迪夫(deDuve)通过电镜观察发现了自噬体(Autophagosome)这一超微结构。在一次离心分离线粒体的试验中，没有用超速离心而是用了较低的速度，这种较低速度的离心同样分离到大量的线粒体组分，但是在收集的线粒体组分中没有可检测的酸性磷酸酶的活性。这种偶然的发现导致德迪夫相信酸性磷酸酶位于其它的膜结合细胞器中。经过重新设计的分离线粒体的离心分离方法，先按照原来的方法分离得到线粒体组分后，再调整离心速度重新进行离心分离，得到大小两部分(fraction)，发现与线粒体功能有关的酶，如细胞色素氧化酶等，存在于大的部分中，而酸性磷酸酶和另一些水解酶类(核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、β-葡萄糖醛酸酶、组织蛋白酶等)存在于小的部分中，由于这5种酶都是小分子的水解酶，于是德迪夫认为大的部分是真正纯化的线粒体，而小的部分在细胞内行使消化作用，1955年他将这一部分命名为溶酶体。但直到1962年，肝细胞在电子显微镜下的自噬现象才被两位科学家Ashford和Porter报道出来。此后的1963年溶酶体国际会议(CIBAFoundationSymposiumonLysosomes)上，德迪夫(deDuve)第一次提出了“自噬”(Autophagy)的概念(deDuveetal.1955)，该名词一直沿用至今。在自噬过程中，细胞内底物分别通过三种不同的方式进入溶酶体，因此就有了三种自噬类型：巨自噬(Macroautophagy)、微自噬(Microautophagy)和以分子伴侣为介导物质进行的自噬(Chaperonemediatedautophagy,CMA)，它们有着不同的作用机制，通常所说的自噬主要指的是巨自噬(Klionsky2005b;Masseyetal.2006)。在巨自噬方式中，胞浆中的变性蛋白和失活坏死的细胞器首先被包裹进入自噬泡中，该自噬泡并非来源于溶酶体，呈现双层膜结构，并由自噬泡将其运转到溶酶体中进行降解；微自噬方式的自噬有点类似于吞噬细胞的吞噬，细胞浆中的底物通过溶酶体膜的自身变形被包裹起来。巨自噬和微自噬进入溶酶体后的过程较为相似，均发生包裹底物的膜性结构的迅速降解，于是底物被释放出来，然后溶酶体中的各种水解酶便开始对这些底物进行有效的降解。此外，待降解的底物还有一种特殊的进入溶酶体的方式即分子伴侣介导的自噬方式，首先特定的分子伴侣可以识别特定的氨基酸序列(如KFERQ等基序)并与该序列结合形成一个分子伴侣-底物复合物，但分子伴侣又具有与溶酶体膜上受体结合的功能。然后在溶酶体内部的另一种分子伴侣帮助下，底物可以在溶酶体膜上移动进入溶酶体内腔中，最终底物在各种水解酶的作用下被降解并得以重新利用(Cuervoetal.1996)。在自噬过程的晚期阶段，自噬体与溶酶体融合并依赖溶酶体的降解机制降解内容物，许多蛋白例如HOPS复合物、SNARE复合物及Rab蛋白共同作用完成了自噬体和溶酶体的融合过程与物质的降解，乃至降解产物的输出等(杜万清etal.2011)， 第一章细胞自噬研究进展3三种主要的自噬方式如图1-1所示。图1-1三种主要的自噬途径(Mizushimaetal.2008)Figure1-1Thethreemainautophagypathway自噬和泛素蛋白酶体系不同，作为机体的另一种重要的降解体系，泛素蛋白酶体系主要参与细胞内短寿命蛋白的降解过程，而自噬则参与了大多数长寿命蛋白的降解(Klionskyetal.2000)。自噬机制除了可以降解可溶性的胞浆蛋白外，还可将细胞内的细胞器或细胞器的部分(线粒体、过氧化物酶体、内质网等)等带到溶酶体中进行降解，自噬甚至还参与了某些细胞核内物质的降解与清除(Kabeyaetal.2000;Mortimoreetal.1987)。自噬机制在生物进化过程中高度保守，虽然不同自噬方式将底物运送到溶酶体的机制发生了变化，但自噬机制本身却存在于各种生物体内，参与自噬的同源基因广泛存在，无论是酵母类等细菌，还是低等的无脊椎动物，乃至高等脊椎动物和人类都保留了这一机制。由于细胞自噬理论正在完善和发展，所以自噬还是一个变化中的概念，它将随着新的发现自我更新(Klionsky2007)。自噬是一个高度动态的、多步骤的过程，它的主要组成部分有：前自噬阶段(Phagophore)(Seglen1987)，捕捉自噬信号和开始形成自噬体膜；自噬体阶段(Autophagosome)，以具有双层膜结构为主要特征；自噬内含体阶段(Amphisome)或自噬-溶酶体阶段(Autolysosome)(DeDuveetal.1966)，自噬体和内含体或溶酶体融合形成单层膜的小泡，在真菌和植物中则形成自吞噬体(Autophagicbody)。通过试验可以对自噬过程进行正向的或负向的调控(Eskelinenetal.2011)。自噬体的累积可以反映出自噬的诱导、自噬体转化的降低或阻断，如果不能有效地与内含体或溶酶体融合，或融合机制受到干扰，那么自噬体将难以转化成为自噬内含体或自噬溶酶体，自噬降解途径的作用就会降低(Kovacsetal.1982)。概括来说自噬具有如下特征：第一，正常的细胞通常很少发生高水平的自噬作用，而一些诱导因子的存在则可以诱发自噬，诱发因素一方面是来自于细胞外的(例如环境中的营养缺乏、缺氧条件、生长促进或抑制因子的浓度变化等)，另一方面也会有细胞 4家蚕自噬基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究内的(例如代谢阻碍、细胞器被破坏或衰老失去功能、部分蛋白质出现折叠错误或变性聚集等)，这些因素的通常会或多或少地存在着，因此在细胞内部，为了维持细胞的平衡状态，细胞会保持一种很低的、基础的自噬活性；第二，自噬的过程很快，在试验中自噬一旦被诱导，通常数分钟后即可看到自噬体(Autophagosome)，而两小时后自噬溶酶体(Autolysosome)就会降解消失，细胞自噬的这种快速反应机制有助于细胞尽快适应其遭遇的恶劣环境；第三，非特异性，即自噬在捕捉和包裹胞浆成分的时候不具有选择性，其原因是自噬的速度快、数量大，自噬作用一旦被激活，则不特异地选择底物，这与自噬的应急特性是相适应的；第四，保守性，自噬机制的保守性表现为自噬有利于细胞存活，所以不管是在不同的物种间、还是在各种类型的细胞之间，自噬机制都普遍被保留下来，在生物进化过程中高度保守。1.2自噬相关基因研究人员最先从酵母中克隆获得了自噬相关基因(Autophagy-relatedgene，ATG)，1997年，YoshinoriOhsumi(日本)科研小组克隆获得了第一个酵母自噬基因，将其命名为Atg1(Matsuuraetal.1997)，此后发现的自噬相关基因则根据发现的时间顺序被冠以不同的数字顺序，此数字并不反映自噬相关基因的重要性，相邻的基因之间也不一定有必然的关联性。1998年，BethLevine(美国)科研小组克隆得到了第一个哺乳动物自噬基因，该基因被命名为Beclin1(Liangetal.1998)，截至目前，已经有三十多个自噬相关基因被克隆出来(Crightonetal.2006;Nowaketal.2009;Ropoloetal.2007;Takahashietal.2007)，最初这些基因被称作APG、AUT或CVT，此外还有50多种相关基因，表1-1统计了一部分研究中常见的哺乳动物自噬相关基因。表1-1已知的哺乳动物自噬基因Table1-1Knownmammalianautophagygenes自噬基因其他名称/同系物基因功能与相应的基因产物AutophagyrelatedgeneHomologuesGenefunctionandcorrespondingproductAtg1Apg1/ULK1丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，和GABARAP结合。Apg3Apg3/Aut1/Atg3参与自噬体的形成，介导LC3修改和共轭APG5到APG12。Apg4/autophaginsApg4/Aut2/Atg4通过裂解C-末端暴露甘氨酸帮助修饰LC3。Apg5Apg5/Atg5参与自噬体的形成，共定位形成新的自噬体的隔离膜，形成一个复杂的APG12复合体。Atg6Beclin1/Apg6/Vps30/参与自噬诱导和自噬体的形成，形成一个复杂的IIIAtg6型PI3激酶VPS34，其在哺乳动物中是一种肿瘤抑制基因。Apg7Apg7/Atg7参与自噬体的形成，介导APG5共轭到APG12以及LC3的修饰。Atg8LC3自噬体膜的主要成分，加工后定位于自噬体膜。Atg9是一种涉及提供膜成分以形成自噬体的跨膜蛋白Apg10Apg10/Atg10参与自噬体的形成，介导APG5共轭到APG12以 第一章细胞自噬研究进展5及LC3的修饰。Apg12Apg12/Atg12参与自噬体的形成，形成新的自噬体的隔离膜，与APG5结合形成一个复杂的复合体。Apg16LApg16/Atg16参与自噬体的形成，与APG5和APG12形成的聚合物连接在一起。哺乳动物自噬基因相关分子机制的探讨始于Apg5的功能研究，Apg5敲除的小鼠胚胎干细胞自噬体形成受阻，主要表现为自噬体膜的延伸过程停滞，同时发现Atg5和Atg8(哺乳动物为Lc3)具有序列的同源性(Mizushimaetal.2001)。体内分析饥饿条件下的Lc3转基因小鼠发现，自噬现象在各个器官中被不同程度的诱导，并且自噬体的形成并不局限于饥饿条件，这为研究哺乳动物自噬提供了一个转基因模型(Mizushimaetal.2004)。在自噬基因相互作用研究的基础上，自噬信号通路逐渐明朗，首先被证实的是PI3K信号通路在自噬的作用，I型抗自噬，而III型促自噬(Petiotetal.2000)。通过对mTOR通路与自噬关系的研究发现，抑制mTOR通路可以促进自噬。2010年的研究结果证实了自噬和mTOR通路的关系：即自噬对mTOR具有负反馈调节作用，目前利用Rapamycin诱导自噬已成为经典模型之一(Yuetal.2010)。研究表明许多在酵母中发现的Atg基因都可以在哺乳动物中找到同源物，这些同源基因相继被被分离鉴定出来，其分子机制从酵母到哺乳动物十分相似，说明了自噬是一个进化保守的过程。1.3自噬研究方法多种方法可以用来检测自噬，然而选择自噬研究方法时需要注意的是：没有一个绝对的方法能够适用于所有生物模型和试验本身，因为一些试验方法在个别细胞、组织或器官中并不适用，或达不到预期效果(Klionskyetal.2007;Mizushimaetal.2010)。通常认为检测和鉴定自噬的标准方法是在组织的电镜切片分析中，明确地观察到双层膜状结构的自噬体，及其他相关的亚细胞结构特征。此外，常用的自噬检测方法还有免疫印迹法和荧光显微镜观察法，LC3是自噬标志物，用免疫印迹法确定两种蛋白形式(LC3-II/LC3-I)的转换效率则能反映自噬水平高低，而使用荧光显微镜观察LC3点状聚集物也可以确定自噬的发生，但是这两种方法不适用于非LC3依赖性途径的自噬(Nishidaetal.2009)。培养的细胞在正常条件下，自噬活性较低以至于常常检测不到，而自噬机制经过人工干预后则会出现变化，有利于监测，已报道的工具药有自噬诱导剂和自噬抑制剂两大类。常用的自噬诱导剂有：第一种是可以模拟内质网应激的药物如布雷菲尔德菌素(BredeldinA)、衣霉素(Tunicamycin)、毒胡萝卜内酯(Thapsigargin)等；第二种是相当于IMPase抑制剂的药物如氨甲酰氮草(Carbamazepine)、氯化锂(LithiumChloride)等；第三种类似于制造饥饿效应的如Earle's平衡盐溶液；第四种是可以抑制I型PI3K途径的药物，如酰基鞘氨醇(N-Acetyl-D-sphingosine)；第五种则是典型的mTOR通路抑制剂，如雷帕霉素(Rapamycin)；此外还有阻滞IP3R的药剂，如光溜海绵素(XestosponginB/C)。 6家蚕自噬基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究常用的自噬抑制剂主要有：抑制III型PI3K通路药物，如3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)；巴佛洛霉素A1(Bafilomycin)是质子泵抑制剂；羟氯喹(Hydroxychloroquine)是溶酶体腔碱化剂(Lysosomallumenalkalizer)。此外，在自噬试验中，对Atg基因表达进行干预的时候，常常还要配合使用一些遗传学手段，例如反义RNA干扰技术(Knockdown)、外源基因导入法(转基因技术)、突变株筛选技术等，自噬被诱导后，观察和检测自噬过程常用的策略和技术有以下几种：1.3.1透射电子显微镜早在上世纪50年代，自噬体就在透射电镜下被观察到，该技术可用于检测选择性以及非选择性的自噬体，并且可以简单地区分前自噬体、自噬体和溶酶体。前自噬体(Phagophore)的从整体上看呈现新月形或杯状的结构，由双层或多层膜构成，趋向于包裹胞浆成分；自噬体(autophagosome)则表现为液泡状结构，由双层或多层膜包裹着，膜的内部是胞浆成分(如线粒体、核糖体、内质网等)；自噬溶酶体(autophagy-lysosome)虽然也呈现液泡的形状，但与自噬体不同的是它只有单层膜结构，并且膜结构内部的胞浆成分已基本降解完毕。所以在一定程度上，透射电镜技术可以同时对自噬的发生进行定性的和定量的分析(Yla-Anttilaetal.2009)。1.3.2荧光显微镜结合GFP-LC3融合蛋白虽然使用电镜技术可以直观地观察自噬体，但是电镜试验的周期长，不能实时监测自噬的发生，所以研究人员开发了在荧光显微镜下使绿色荧光蛋白和LC3融合的方式来追踪自噬的技术。在自噬没有被激活的状态下，GFP-LC3融合蛋白无规则地分布在胞浆中；当自噬被激活时，GFP-LC3融合蛋白就会转移到自噬体膜上，荧光显微镜下就可观察到多个明亮的绿色荧光点，一个斑点就等于形成了一个自噬体，计算斑点的数量，就可以推测自噬活性的变化(Kabeyaetal.2000)。1.3.3免疫印迹法检测LC3-II/I比值的变化在自噬未被激活时，胞浆型的LC3蛋白以LC3-I型的形式存于细胞中，当自噬被激活，LC3-I在其他酶的作用下会酶解掉一小段多肽，变成有活性的LC3-II型蛋白，称作自噬体膜型，因其形成后即成为自噬体膜的成分。因此，开发LC3蛋白的抗体，使用免疫印迹的方法可得到LC3-I和LC3-II的相应条带，根据LC3-II/I的比值大小即可推测自噬水平的高低。在酵母等低等生物体内，则是使用ATG8-PE/ATG8的比值来反映(Souetal.2006)。1.3.4免疫组化法(Immunohistochemistry)一些常见的自噬蛋白相关抗体如LC3和BECN1的抗体被研制出来，在医学上可以检测一些肿瘤组织中的自噬发生情况，其中包括淋巴瘤(Heetal.2003)、乳房癌、子宫内膜腺癌(Giatromanolakietal.2011;Sivridisetal.2011)、头颈部鳞状细胞癌(Chenetal. 第一章细胞自噬研究进展72009)、肝癌(Wanetal.2010)、神经胶质瘤(Pirtolietal.2009)、非小细胞肺癌(Karpathiouetal.2011)、结肠腺癌等(Lietal.2009)，目前这种方法在肿瘤标记研究中已经被常常使用。针对一些新开发的肿瘤治疗药物，该方法可以有效地确定药物的疗效(Kuwaharaetal.2011;O'Donovanetal.2011)。它的缺陷是在一些动物组织中，LC3可以被共定位到自噬体以外的一些结构中，从而影响试验结果，因此需要其他方法或者抗体来进行辅助判断(Shibataetal.2009)。1.3.5转录和翻译调控自噬在一些情况下伴随着诱导增加而增强，如自噬基因mRNA水平的Atg8/Lc3(Naraetal.2002)和Atg12(Kourokuetal.2007)等。若自噬专用的芯片被开发作为一种高通量的工具，那么就可以监控所有参与自噬相关的基因转录调控。例如ULK1基因，该基因介导在肝脏中的转录调控(受到饥饿和昼夜信号的调节)，就可以用这个方法测定出其最大的变化值。研究表明，在一些小鼠和人类癌细胞株中，如果遇到内质网应激和缺氧环境，Lc3、Atg5和Atg12转录机制将会增加。除了Atg基因外，一种与自噬相关的蛋白质VMP1的转录也被上调，雷帕霉素处理或饥饿诱导在哺乳动物细胞中引起的自噬以及组织发生疾病引起的自噬均可以被检测到(Ropoloetal.2007)。1.3.6自噬相关蛋白的降解蛋白质的降解试验技术是一个具有代表性且行之有效的方法，可用于测量自噬通量。一般使用的策略是在标记细胞的蛋白质中掺入放射性氨基酸如蛋氨酸，对依赖于时间释放的氨基酸通过具有放射活性的标记蛋白进行测定，可以反映完整细胞或灌注器官的自噬水平(Ichimuraetal.2008)。1.3.7自噬-溶酶体共存和淬灭试验大多数自噬体最终通过和溶酶体融合的方式得到降解和再利用，因此检测自噬溶酶体的数量可以反映自噬水平。如广泛使用的DQ-BSA标签就是利用荧光团自淬火作用，借助猝灭和明亮的荧光片段的释放，DQ-BSA可有效用于检测细胞内的蛋白水解活性(Moraetal.2010)。1.3.8活体检测虽然最理想的细胞培养方法也不能代替活体环境，但在活体内或有功能的器官中监测自噬通量却是最难的。因为首先生物体具有基底的自噬水平，并且不同组织具有自噬特异性。此外，基底细胞自噬水平或对自噬感应的敏感度可能随着动物年龄、性别或环境而改变，因此，体内自噬研究的一种方法是分析GFP-LC3/Atg8(见GFP-Atg8/LC3上述荧光显微镜)的表达(Mizushimaetal.2004)。另一种方法是用免疫组织化学染色法，适用于人类研究，探讨自噬作用在神经退行性疾病、肌病和心脏疾病中的作用。但必须活检/尸检组织，缺点就是只能获得有限的样本(Nicotraetal.2010)。 8家蚕自噬基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究另外检测自噬还可使用一些非特异手段，例如检测长寿蛋白的批量降解，因为长寿命蛋白的降解主要依赖于自噬作用，这类蛋白的大量降解意味着自噬活性的上升；MDC(Monodansylcadaverine)染色法，该染色方法可以将所有的酸性液泡染色，包括自噬体、溶酶体等；而CellTrackerTMGreen染色的范围更广，可以将所有的液泡染色，所有经常用于双染色试验。这些非特异性的方法常常需要配合自噬检测的常规方法，进行定性的确认。此外，一些示踪蛋白可以在荧光显微镜下进行共定位试验。因为在自噬发生的时候，一些细胞器如线粒体、内质网、高尔基体、乃至溶酶体均被牵涉其中，那么对这些细胞器的共定位试验也常用作自噬的检测。例如当自噬体与溶酶体融合时，溶酶体膜上的Lamp-2蛋白就可用来标示自噬体的转移效率；红色荧光蛋白加线粒体基质定位信号的pDsRed2-mito载体，转染后表达一个融合蛋白，可用来检测线粒体被自噬掉的程度；特异性显示活线粒体的MitoTraker探针，其荧光可在固定后保留下来；还有Hsp60蛋白，定位于细胞内线粒体基质，内质网腔的钙网织蛋白等。1.4自噬研究模型几种常见的自噬研究模型简介如下。(1).线虫(C.elegans)。线虫几乎含有所有酵母自噬相关基因的同源基因，研究表明线虫具有的多腔隙遗传特点使其成为研究自噬途径相关功能的良好模型(AlRawietal.2011;Tianetal.2010)。LGG-1/ATG8/LC3是线虫上应用最多的自噬探测报告工具，它们都被定位于自噬体膜(Kirisakoetal.1999)。含有GFP的LGG-1/ATG8荧光报告集团可以在活体中监测自噬体的形成(Melendezetal.2003)。(2).果蝇(Drosophila)。果蝇为自噬在活体中的分析提供了一种良好的研究模型，此模型的优势是可以通过使用无性繁殖体系控制动物之间的差异性。无论是过表达某个目的基因，或者沉默某个目的基因都可以通过体细胞无性繁殖来实现，因此在必要的时候可用作纯系分析。但是在使用免疫印迹方法时只能使用果蝇来源的自噬蛋白序列相关抗体，因为哺乳动物来源的LC3抗体在果蝇中不起作用(Barthetal.2011;Rustenetal.2004)。蜕皮激素是引起幼虫细胞程序性死亡的调控因子，它可以激活凋亡诱导因子Reaper、Hid和Grim的表达，进而阻止凋亡蛋白抑制因子的活性，引起细胞凋亡，在蜕皮激素水平增加的同时，一些自噬相关蛋白出现上调表达，因此蜕皮激素也是自噬机制的诱发因素之一(李庆荣etal.2006)。(3).蜜蜂(Honeybee)。蜜蜂以及其他具有卵营养细胞的昆虫以其卵巢发育循环的特异性被认为是分析和监测生理状态下自噬水平的工具。研究表明非洲蜂后和工蜂的卵巢在外界刺激下出现规律的细胞凋亡特征，自噬和凋亡在蜜蜂器官退化中都起到了重要作用(Thompsonetal.2007)。(4).人类(Human)。自噬在人体上的研究目的主要是为了更好地认识人体的机能和 第一章细胞自噬研究进展9疾病发生规律，虽然临床上还不适合使用人体试验，但是雷帕霉素抑制剂(TORC1)如西罗莫司已经在临床上批准使用，其主要功能就是促进自噬，同时有效地抑制某些细胞(如肿瘤类)的增殖(Ostetal.2010)。在临床上，自噬领域研究最多的三类疾病是肿瘤、神经退行性疾病和免疫性疾病。其中尤其以自噬对肿瘤的作用争议最大，因为Atg基因一旦从动物体内被敲除，机体就出现许多自发肿瘤，但是Atg基因的敲除却可以提高放化疗、免疫治疗的敏感程度，因此自噬被认为是一把双刃剑(Levineetal.2008)。任何细胞，无论是正常的还是异常的(如肿瘤细胞)，保持自身一个较低水平的基础自噬活性是必不可少的，因为细胞中随时都在产生“垃圾”(如细胞合成的长寿命蛋白质最后终究会失活和变性、细胞代谢中异常合成或错误折叠的蛋白质、衰老的细胞器等)，这些垃圾需要及时清除，否则会逐渐导致细胞的功能障碍，所以一定程度上，自噬具有维持细胞平衡的功能。同时，这些垃圾经过自噬作用的消化，变成了生物体可以利用的小分子物质如氨基酸、脂肪酸，这些物质又为细胞的存活与再生提供能量和合成底物，这种能力表现了自噬机制具有“回收站”和“贮藏库”的作用。自噬活性当遭遇生物机体代谢应激(如饥饿效应、射线伤害、化疗刺激等)时大为增强，此时胞浆中会迅速形成大量自噬体进行应对，这一现象就是“自噬潮”(Autophagicflux)。自噬潮可以迅速整合细胞内部的营养和能量，保证细胞顺利度过危机，使细胞得以存活下来。因此与凋亡不同，自噬在细胞中是被优先保留的，而凋亡机制在肿瘤细胞中一般都存在缺限(Mathewetal.2007;Mizushimaetal.2008)。(5).丝状真菌(Filamentousfungi)。丝状真菌细胞自噬发生于饥饿条件下的营养缺失，自噬还和这类真菌的有性繁殖及无性繁殖相关，此过程需要营养物质从机体的一端输送到另一端，在氮缺乏的条件下自噬可以影响分生孢子的萌芽(Kikumaetal.2006)。(6).大型动物(Largeanimals)。建立大型动物研究模型是为了评估自噬在其生理病理条件下的作用，在猪中获得的证据表明上调自噬可保护心脏免受急性心肌梗死或心脏病发作造成的损害；体外研究发现自噬有助于牛乳腺的重塑，产奶期使用立体养殖模式，有利于上皮细胞形成充分发展的肺泡，在干奶期时，有减少催乳激素水平增加表达式自动旁分泌凋亡相关肽的功能(Motyletal.2007;Sobolewskaetal.2009)。(7).鳞翅目昆虫(Lepidoptera)。鳞翅目昆虫是因为具有变态发育特征而被自噬研究者关注(Beaulatonetal.1977)。一般认为在变态发育时期，大量的幼虫组织被自噬体和其他一些蛋白水解酶降解，再由机体合成新的组织和器官。昆虫在变态发育时期如家蚕和烟草天蛾幼虫，其体内的自噬作用促进了变态的发生。家蚕的研究集中于丝腺、脂肪体、中肠和卵巢，如使用MDC和LysoTracker的红染色的染料来标记丝腺和蚕卵等(Mpakouetal.2006)。家蚕自噬相关基因的系统克隆发现了11种Atg基因，其中包括MTOR通路中的部分基因(Zhangetal.2009)。在家蚕幼虫期，主要自噬基因是随着蚕龄增加而变化的，且有饥饿效应。免疫印迹发现LC3和家蚕蛋白并不结合，只有家蚕来源的ATG8抗体才能获得明显的条带(Franzettietal.2012)。 10家蚕自噬基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究(8).植物(Plants)。高等植物和低等植物中均发现了细胞自噬基因的存在，拟南芥中已发现30多个Atg基因(Xiongetal.2005)，烟草、水稻、玉米等作物中也相继报道了Atg基因的发现。在获得了拟南芥基因组后，研究人员通过比对分析，发现了自噬相关的ATG8、ATG12蛋白复合体基因，这些基因在酵母中是参与细胞自噬的关键基因(Xiongetal.2007;Yoshimotoetal.2004)，暗示了植物中存在着与酵母类似的细胞自噬机制。细胞自噬在植物中同样拥有多种功能，它可以调节植物的生长发育、衰老，在植物体遇到生物、非生物胁迫时，自噬水平随之发生变化以应对胁迫。在生产中，植物体的生长发育由于受到各种各样的非生物和生物胁迫而出现发育障碍，最后导致产量减少，自噬机制的存在对作物的田间规模生产也具有特殊意义。(9).原生动物(Protists)。自噬在原生动物的分化过程起着重要的作用，这些有机体只含有少部分的自噬相关基因。因此在此类模型中自噬过程显得更加容易监测，并能很好的与蛋白水解酶作用区分开来(Besteiroetal.2011)。(10).斑马鱼(Zebrafish)。斑马鱼有许多显著的特点使它成为自噬研究的模型，例如在透明条件下形成胚胎，这就可以在试验过程中获得可视化的转基因GFP-LC3和GFP-GABARAP鱼。加入1-苯基-2-硫脲(PTU)的媒介可抑制其黑素生成，允许后期胚胎可视化(Heetal.2009;Heetal.2010)。综上所述，自噬机制存在于大部分真核细胞中，是一种普遍的生理现象，在正常生理状态下，细胞自噬可作为机体的一种防御机制，在机体的感染、炎症、免疫、肿瘤、心血管病以及神经退行性疾病的发病机制中发挥作用，然而自噬水平一旦被过分地激活，对机体却是一种损伤(Levineetal.2004;Shintanietal.2004)。自噬研究领域的两大标志性杂志《Apoptosis》和《Autophagy》所收录的文章数量在2000年以后呈现爆炸式的增长，这也反映了自噬研究的重要性和日益增加的关注度。1.5自噬在病理过程中的作用生物体保持一定水平的自噬，可以更好地应对环境应激，预防部分疾病的发生，如肿瘤、肌病、神经退行性疾病等，可能是自噬机制适时地清除了造成疾病的有害物质；自噬一定程度上可以延缓机体的衰老，使其寿命延长；同时，自噬也被证明可以抵御某些病原微生物对机体的感染，即病原体在自噬的作用下降解。最近，研究人员发现自噬还参与了机体对疾病的免疫应答反应，但是，自噬对一些疾病的发生究竟起促进作用还是抑制作用，无法用简单的是或否来回答，这和疾病的不同发展阶段有关，在疾病发生的不同时期，自噬分别和疾病发生着拮抗、协同等作用，另外细胞所处的环境和针对疾病的治疗措施也影响着自噬和疾病的关系(Marinoetal.2004;Ogier-Denisetal.2003;Shintanietal.2004)。首先，当细胞缺乏营养时，它趋向于通过自噬作用分解胞内的一些物质材料，以维持细胞存活，倘若细胞正常运转所需能量与物质丧失来源，则会启动程序性死亡步骤 第一章细胞自噬研究进展11(Kimetal.2000)；一些毒素和病原体在感染宿主机体的初期，被激活的自噬作用就可包裹和清除它们(Talloczyetal.2002;Walkeretal.1997)；在细胞内，变性的胞浆成分(如错误折叠而形成的凝聚蛋白及受损的细胞器等)持续累积，就会对细胞产生进一步的损害，而自噬机制可以迅速清除它们以保护细胞(Lemastersetal.2002;Webbetal.2003)。所以在某些疾病的早期，自噬的作用表现为抵御疾病进一步损害机体，但是另一方面，自噬也参与了Ⅱ型程序性细胞死亡，即在无力逆转疾病和保护细胞存活的情况下，通过一系列步骤完成细胞的最后生命周期，在这类程序性细胞死亡中，细胞骨架系统保持完好，肌动蛋白依然保持聚合状态，中间丝和微丝仅仅发生了重新分布，但并没有降解；这与对应的Ⅰ型程序性细胞死亡过程有明显的不同，在Ⅰ型程序性细胞死亡中，程序一经启动，聚合在一起的肌动蛋白就解开了，中间丝亦开始降解，细胞骨架系统也在早期破碎(Burschetal.2000)。1.5.1自噬与病原体感染对于一部分病原体感染，细胞自噬可以清除感染的病原体，如巨噬细胞以胆固醇依赖方式利用自噬机制抵抗嗜肺军团菌的感染(L.pneumophila)(Ameretal.2005)，新型隐球菌(C.neoformans)感染小鼠巨噬细胞后，发现在mRNA水平上Atg基因及一些相关基因表达量升高(Fanetal.2005)，此外自噬在植物免疫反应中的作用也有报道(Liuetal.2005)。值得注意的是，在病原体感染过程中，自噬并非对所有细胞均起保护作用，在某种细胞的不同时期自噬的作用也不尽相同，一些病原体甚至可以利用被激活的自噬机制来帮助自己进一步侵染机体，即自噬促进了病原体的感染，如在脊髓灰质炎病毒和鼻病毒感染的早期，病毒可利用自噬机制促进自身的复制和扩增，自噬机制的缺失则减缓这一过程，原因可能是自噬泡为病毒基因复合物提供了膜性结构的保护，病毒离子从感染细胞中释放时并不裂解，同时自噬机制降解产生的一些小分子物质是病毒复制所必需的(Jacksonetal.2005)。在中国仓鼠的卵巢细胞中，如果自噬机制被激活，就会为考克斯氏体属细菌的最初存活和扩增提供有利条件；冠状病毒复制时，对细胞自噬过程中双层膜囊泡具有依赖性，但不被3-甲级腺嘌呤所阻断，而如果敲除的胚胎干细胞中的Atg5基因，那么冠状病毒复制就会出现缺陷，这表明Atg5基因是该病毒繁殖的必需条件(Gutierrezetal.2005)。细胞自噬与细菌或病毒的相互作用无非产生三种结果：第一是自噬阻止了病原微生物的繁殖，成功地清除病原体而保持机体正常；第二是病毒或细菌阻断了自噬通路，或者诱导了不完全的自噬过程，使自己免于受到自噬作用的限制；第三是病原体利用自噬小体提供的分解产物来促进自己的繁殖和复制(王琦etal.2010)。1.5.2自噬与癌症目前认为肿瘤多是发生在恶性转化细胞中，当细胞内外环境的平衡受到破坏，生物合成代谢明显大于分解代谢的速率，并且没有有效的转运机制将冗余的合成产物转移出 12家蚕自噬基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究去，肿瘤便会形成。肿瘤细胞有一个显著的特点就是能够逃避凋亡，即“不情愿”自我完成程序性死亡过程而采取种种措施使自己继续存活，因此有学者提出人类肿瘤和情志有相关性。自噬在肿瘤的成长过程中功不可没，它能够克服营养缺乏和低氧的环境，为肿瘤细胞提供扩增需要的营养，从而避免细胞进入凋亡途径(杜海磊etal.2010)。但是自噬在肿瘤发展的不同阶段发挥了不同的作用，如在癌症早期，如果自噬作用被抑制，癌前细胞就不断生长而没有约束，说明这个阶段自噬机制发挥了抑制肿瘤生长的作用(Ogier-Denisetal.2003)。当癌症处于维持阶段时，癌细胞在营养缺乏和缺氧条件下则会利用自噬机制提供的养分来维持生存，这种现象在供血不良的癌细胞中显得尤为重要，此时，自噬机制的存在促进了癌细胞的存活与生长(Cuervo2004)。在癌细胞接受放射性治疗的时候，自噬机制甚至可以使其免受损伤，这种保护机制的原理可能是自噬适时地消除了受损的生物大分子等冗余成分，避免启动程序性细胞死亡过程，这样就保证了癌细胞的继续生长而不会在治疗中死亡(Alvaetal.2004)。Beclin1(酵母同源物为ATG6/Vps30)是哺乳动物自噬泡形成过程中必不可少的基因，但是在人类乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌细胞中，研究发现Beclin1单等位基因缺失的频率非常高，暗示着该基因对肿瘤形成的影响。人乳腺癌细胞系中几乎检测不到Beclin1蛋白，使用病毒转染系统将Beclin1转染入细胞系后，细胞的自噬活性大为增强，细胞的成瘤能力却显著降低，说明自噬活性的高低与肿瘤细胞生长相关(Liangetal.1999)。这就提示了开发针对自噬机制的药物，通过激活自噬来治疗肿瘤，例如他莫西芬(Tamoxifen)已被广泛用于乳腺癌治疗，它可以通过激活细胞自噬进而促进Beclin1的表达，使肿瘤部分得到治疗(Scarlattietal.2004)。1.5.3自噬与衰老线粒体-溶酶体轴理论在衰老中的作用已被证明，衰老的细胞表现出较低的自噬活性，随着细胞年龄增长，心肌、骨骼肌和其他长寿命的细胞在发生有丝分裂后，线粒体和溶酶体发生明显的改变，但自噬泡的降解能力已经不足以清除持续增加的变性线粒体(Termanetal.2004)。自噬可以延缓由衰老造成的线粒体DNA突变的累积，并且与脑衰老关系密切。抗衰老是人类社会的重要课题之一，目前认为具有抗衰老作用的方式是周期性终生服用抗脂解药物同时结合轻度节食。其中的机理可能就是抗脂解药物降低了胰岛素的分泌，而短期的低胰岛素水平一定程度上激活了机体细胞的抗衰老修复机制，这种修复机制就是细胞的自噬作用(Donatietal.2004)。机体细胞自噬活性随着年龄增加而下降，这可能与年龄相关氨基酸水平的增加或基础胰岛素受体信号传导途径的增加有关。反之，自噬溶酶体可加速衰老淋巴组织中聚集细胞的病变，导致活化诱导的淋巴细胞凋亡或坏死(Gerlandetal.2004)。 第一章细胞自噬研究进展131.5.4自噬与神经退行性疾病自噬一方面可加速神经退行性疾病的发展，但在某些条件下对机体也能起保护作用(Rubinszteinetal.2005)。例如神经营养因子撤除的小脑葡氏神经元由于营养来源的缺失而启动自噬性程序性细胞死亡，最终导致死亡；多巴胺作为神经递质，也可引起自噬性程序性细胞死亡(Gomez-Santosetal.2003)。但是在这类疾病发生的早期，如果自噬机制被激活就能加速变性蛋白的清除过程，细胞得以行使正常的调节功能，这就可抑制疾病的进一步发展。以亨廷顿氏病为例，突变的蛋白小片段可以通过自噬机制被降解，避免了它们的进一步聚集和变性(Qinetal.2004)，这种蛋白聚合物是神经退行性疾病的典型特点之一，许多针对性的治疗均是以去除蛋白聚集物为主要手段。在神经退行性疾病中，神经元细胞的具有两个最主要特征：第一是胞浆中蛋白聚集物的大量出现，虽然发生突变的蛋白种类常常很多，但它们形成聚集物的形成过程却基本相同；第二是大分子蛋白裂解体系的活性改变。发病之初，分子伴侣和蛋白酶可在一定程度上延缓蛋白聚集物的形成，但如果出现受损蛋白的增多以致不能够被及时清除时，分子伴侣等酶类反过来却被蛋白聚集物所捕获，形成了更大的聚集物，细胞内聚集物的增加和细胞降解能力的降低使聚集的蛋白更加不易被降解，此时自噬途径承担了降解这些变性蛋白聚集物的唯一途径，激活自噬可加速清除这些大分子聚集物(Michaliketal.2003;Ravikumaretal.2002)。当蛋白聚集物越来越多，机体就不得不提高自噬水平来进行应对，随着这些聚集物对溶酶体蛋白酶降解逐渐产生了抵抗力，自噬作用就会持续性激活，最终会导致自噬程序性细胞死亡程序的启动，细胞周期的结束也就意味着神经退行性疾病的进一步加重。此外，研究发现自噬在肌病、心血管性疾病、炎症等发病过程中有不同程度的作用，并且这种作用往往具有两面性，即既有防御性的作用，又有自我损伤的危险，的确是一把“双刃剑”，这就提示了在研究和使用自噬机制的时候，如何把握和控制自噬水平是至关重要的一环。1.6家蚕自噬相关研究家蚕属于鳞翅目昆虫，从幼虫到成虫的变态过程中特异的幼虫期组织如丝腺、中肠和节间肌肉会发生退化。家蚕这种机体发生的体态变化使得家蚕成为类似于果蝇的自噬研究模型，关于家蚕细胞自噬的研究主要集中在变态发育方面(Zhouetal.2010;胡晨2010)。在前部丝腺的退化中，细胞自噬和凋亡现象同时被检测出来，而且蛹前期的中部丝腺中还发现了自噬小体前体液泡的形成，蜕皮激素20-羟基蜕皮酮被认为是家蚕早期丝腺细胞程序性死亡的诱发因素(Terashimaetal.2000)。GoncuE提出核浓缩、细胞分离、液泡形成是程序性死亡的最早标志，而这个时期溶酶体标志物酸性磷脂酸酶有明显的升高，表明家蚕幼虫的前期丝腺细胞的退化是在凋亡和自噬的协同作用下发生的 14家蚕自噬基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究(Goncuetal.2008)。同位素标记试验证明在家蚕前期丝腺细胞中诱导产生程序性死亡的20-羟基蜕皮酮是通过结合了丝腺细胞膜结构上的膜蛋白而发生作用的，该受体因此被称作蜕皮激素受体(Elmogyetal.2004)。通过对蜕皮激素(甾类激素)受体的定位以及形态学分析，发现蜕皮激素受体在丝腺形成和退化的时期起到了关键的作用，因此蜕皮激素被认为是引起细胞程序性死亡的因素之一(Goncuetal.2009)。此外在家蚕第五龄的化蛹期还检测到了自噬的初期信号，称为前自噬(Mpakouetal.2008)。家蚕的自噬途径在现有的自噬研究基础上得以构建，这些自噬相关基因在丝腺中都是高度转录的(Zhangetal.2009)，这表明了自噬在家蚕的变态发育中可能发挥了一个关键的作用。近来的研究表明在家蚕化蛹期，中肠细胞的自噬作用首先被激活，继而出现了凋亡信号，转录水平的半胱天冬酶在幼虫后期已经升高，而其蛋白酶活性却是在化蛹期伴随着凋亡信号出现，最终导致了细胞死亡和中肠组织的消失(Franzettietal.2012)。1.7小结虽然自噬及其引起的程序性细胞死亡已经获得广泛的关注和深入的研究，但是自噬现象的参与分子、信号转导过程、病理生理学意义还有待进一步发掘。随着认知的深入和技术的进步，未来自噬的发生发展过程可受到精细调控，届时可以通过人为干预的方式在临床医疗中改变自噬水平，或开发针对自噬机制的药物或技术，更好地为人类健康服务，这也将加深人类对生命科学的认知。细胞自噬具免疫功能，在果蝇中的研究发现自噬可以通过磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)信号通路抑制水泡性口膜炎病毒的复制，而阻遏自噬的发生则导致病毒复制的增强，说明机体内部的防病毒程序和进化上保守的自噬通路是相关联的(Shellyetal.2009)。自噬作用在家蚕病理上的研究未见报道，因此本试验使用家蚕病理模型来研究自噬作用，疾病模型首先考虑到的是蚕业生产中非常常见且带来显著经济损失的质型多角体病毒。家蚕质型多角体病毒(Bombyxmoricypovirus,BmCPV)是感染家蚕幼虫的病原微生物之一，经摄食途径传播，可引起家蚕中肠严重病变而致死，对蚕桑也危害巨大，除了进行严格的消毒控制以外，目前尚无良好治疗防制措施。BmCPV病毒的结构特征、核苷酸序列、入侵机制、病毒宿主交叉感染等已经有了深入的研究，近年来关于该病毒的研究逐渐转移到从病毒与宿主分子互作的角度来阐明BmCPV对家蚕致病机制，如利用基因芯片技术和蛋白杂交技术分析家蚕感染BmCPV的基因表达等。而本试验将在基因转录水平及蛋白质翻译水平上分析家蚕主要自噬相关基因的表达规律，以及自噬相关基因表达与病毒感染的关系。 第二章家蚕CPV病毒研究进展15第二章家蚕CPV病毒研究进展质型多角体病毒(CytoplasmicPolyhedrosisVirus,CPV)是呼肠孤病毒科(Reoviridae)的成员之一(Murphy1995)，在上世纪50年代，该病毒最早在家蚕及灯蛾体内发现，并与核型多角体病毒(NPV)区别开来。CPV病毒的分类基础是其基因组的电泳迁移率，质型多角体病毒可以分成14个电泳型(Payneetal.1976)。其中，以家蚕为主要宿主的质型多角体病毒(BombyxmoriCytoplasmicPolyhedrosisVirus,BmCPV)经电泳型分析确定为I型多角体病毒(Fujii-Kawataetal.1970)，病毒基因组由10段双链RNA分子组成(Miuraetal.1966;Rubinsteinetal.1976)，即双链核糖核酸(dsRNA)，其合成过程独立于宿主细胞RNA的合成(Kawaseetal.1968)。BmCPV的基因组编码5种结构蛋白(VP1-VP5)，病毒基因复制的分子机制与正呼肠孤病毒相似，BmCPV的宿主域主要有鳞翅目、膜翅目、双翅目和鞘翅目等。2.1BmCPV及多角体的形态与理化性状CPV病毒最为典型的特征就是可以形成多角体结构，携带病毒基因组信息的病毒离子存在于多角体晶体结构内部，电镜负染显示CPV病毒离子通常是呈二十面体结构，直径大约60-70nm，在二十面体顶点上有12个凸起。然而病毒形成的多角体却形状各异且大小不一，通常多角体呈六面体、八面体或十二面体，其直径为0.5-10um不等(Dietal.1991)，如图2-1。图2-1家蚕质型多角体病毒及多角体的形态(Dietal.1991)。1:扫描电镜下的病毒多角体形状；2:扫描电镜下的多角体横切面；3:负染色电子显微镜下的病毒离子；4:家蚕CPV病毒离子模型。Figure2.1ShapeoftheBmCPVvirionandpolyhedra.1:thecytoplasmicpolyhedronbyscanningelectronmicroscope;2:micro-sliceofthecytoplasmicpolyhedron;P3:virusparticlesbynegative-stainelectronmicroscopy;P4:ideographofthevirusparticles.负染结合冷冻电镜研究发现CPV病毒离子具有单层蛋白衣壳，该衣壳由病毒的5种结构蛋白构成(余学奎etal.1998)，蛋白衣壳按照对称结构排列，空病毒和完整病毒 16家蚕自噬基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究的衣壳相同，但是内部结构不同，空病毒内部几乎没有电子密度，而完整病毒内部是致密和有序排列的双链RNA(余学奎etal.1999)。3.88Å分辨率的CPV病毒3D结构显示其具有许多含有深槽α螺旋、β折叠的循环侧链，螺旋及折叠形成的发夹衣壳蛋白的两个构象状态之间的构象变化是多角体蛋白的识别和结合结构域(Yuetal.2008)。CPV病毒离子可被焦宁、溴酚蓝淡染，与之对应的背景则被浓染，由此可参照分析病毒离子的分布和数量；酸性染料例如橙黄G、曙红、苦味酸、酚蓝等可以很容易地使CPV病毒染色，经过加热处理后的CPV可以很容易地被次甲基蓝染色。CPV病毒在pH=3.0时相对稳定，但是在80-85℃下加热处理10min后就丧失活力，无法再感染宿主。CPV对乙醚和脱氧胆酸盐有抗性，可在其中存活很长时间，但对氯仿较为敏感(MIYAJIMAetal.1966)。组成CPV病毒的衣壳结构可以抵抗蛋白水解酶的水解，游离的CPV病毒离子悬浮于-15℃、5℃或25℃的蒸馏水中保存18天，致病力无明显变化，但是甲醛变性液处理则会使病毒衣壳逐渐变性，使用0.1%甲醛水溶液在25℃下处理3天，病毒即丧失感染活性(Hukuharaetal.1966)。值得注意的是，如果CPV被包埋在多角体中，可耐受环境中各种温度变化的冲击，抑或是其他恶劣条件，经历很长时间甚至几年后仍有感染性。因此，CPV多角体从感染的宿主细胞脱落后可散在于野外的植物叶子上、鸟粪或土壤里，经历各种天气变化并在很长的时间内保持感染力，这些多角体也成了长期抑制寄主昆虫种群的重要病原因子。CPV形成的多角体不溶于水，置于水中则形成悬浊液，但长期浸泡在水中可逐渐出现结构的破坏或变质，此外多角体也不溶于乙醇、乙醚、丙酮等有机溶剂，经一些酸性溶液如HCl的处理也不会溶解和变性，但可溶于碱性溶液如NaOH、Na2CO3等。2.2BmCPV的基因组与编码蛋白BmCPV的基因组由10段双链RNA(dsRNA)组成，琼脂糖凝胶电泳可得到相应片段(图2-2)，基因组总相对分子量为20.3×106Da。图2-2家蚕质型多角体病毒基因组在10%聚丙烯酰胺凝胶上的电泳图，图片来源(Hagiwaraetal.2001)。Figure2-2:GenomedsRNAs(S1-S10)ofBmCPV-1wereseparatedbyelectrophoresisonaSDS-10%-polyacrylamidegel.Thisfigurehasbeenmodifiedfrom(Hagiwaraetal.2001). 第二章家蚕CPV病毒研究进展17BmCPV基因组编码的结构蛋白(StructureProtein,SP)构成了病毒离子完整的衣壳，起保护内部基因组的作用；而编码的非结构蛋白(Non-StructureProtein,NSP)不参与构成病毒离子的结构，但是参与病毒的复制、装配等过程，如多角体蛋白的作用是为了形成多角体。家蚕来源的BmCPV-1型基因组全序列已测定并公布(Arellaetal.1988;Hagiwaraetal.2001;Hagiwaraetal.2000;Hagiwaraetal.2003;Hagiwaraetal.2002;Hagiwaraetal.1998)，不同株系家蚕BmCPV基因组的dsRNA编码信息并不完全一致。表2-1统计了目前已经获得的BmCPV基因组信息。表2-1家蚕质型多角体I型病毒基因组各个片段特征及其对应的蛋白质Table2-1majorfeaturesofBmCPVItypeRNAgenomeandthecorrespondingproteinsGC含量蛋白及多肽氨基酸残基分子量片段长度Genebank识别号GCProteinandAminoacidMolecularsegmentsSize(bp)AccessionNo.content(%)polypeptide(aa)massS1419043.7VP11333148kDaAF323781S2385442.2RDRP1225136kDaAF323782,AY496445S3384641.8NI1239140kDaAF323783S4326242.7VP3(p130)1058120kDaAF323784S5285241.4p101881101kDaAB035732,AB035733,AF433660S6179641.8VP4(p64)56164kDaAB030014S7150145.3VP5(p50)44850kDaAB030015S8132844.9p4439044kDaAB016436,AB016437,GQ150539S9118644.8NS5(p36)32036kDaAF061199,AF061200S1094447.6polyhedrin24828kDaM19112基因组中的Sl片段编码蛋白VP1，由1333个氨基酸残基组成，VP1蛋白参与构成了病毒衣壳结构；S2片段编码依赖RNA的RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase，RdRP)(洪靖君etal.2002)，该酶含有1225个氨基酸残基，孙京臣等应用分段反转录PCR技术和分子克隆手段从BmCPV-中国株的dsRNA中克隆获得了3个RdRP基因片段，拼接后得到了全部的RdRP基因序列，通过比对分析定位了该基因具有3个保守区域：酸性区、核苷酸结合的核心区和催化功能核心区(孙京臣2004)。基因片段S3编码含有1239个氨基酸的多肽，尚未见其功能研究的报道。基因片段S4含有3262bp个碱基，编码含1057个氨基酸残基的蛋白质VP3，分子量130kD，该蛋白也是衣壳蛋白主要成分之一。功能研究显示，VP3结合GTP和UTP，但不能与ATP和CTP结合，并且VP3具有RNA鸟苷酞转移酶功能。根据这些特征可 18家蚕自噬基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究以推测：VP3是BmCPV病毒离子中RNA结合蛋白，可能在BmCPV病毒核酸物质RNA形成帽子结构时起作用。片段S5编码推测蛋白p101，含有881个氨基酸，软件预测分子量101kD，其功能尚不清楚，同源分析也没有发现已知序列的与p101同源的其它蛋白，但该蛋白的第219~235位氨基酸与小RNA病毒科的口蹄疫病毒(FootandMouthDiseaseVirus,FMDV)高度相似(林伟etal.2002)。片段S6编码多肽p64，含有561个氨基酸残基，试验证明它富含亮氨酸以及亮氨酸拉链结构，使用该蛋白制备抗体获得的抗血清能特异性结合病毒结构蛋白VP4。片段S7编码多肽p50，由p50获得的的多克隆抗血清能特异性结合结构蛋白VP5。片段S8编码多肽p44，内含390个氨基酸残基，经过比对分析发现BmCPV病毒H株和I株的S8序列大小和编码产物几乎相同，它们的碱基序列与其蛋白质产物的一级结构具有很高的同源性；片段S9编码非结构蛋白NSP5，有320个氨基酸残基，片段S9在H株和I株病毒中存在37碱基的不同，但是这个差异却仅仅有6个氨基酸发生了变化(Hagiwaraetal.1998)，此外，S9片段中还发现有核定位序列(Zhaoetal.2003)。病毒基因片段S10最短，但是其编码的多角体蛋白确是形成多角体必不可少的，该蛋白产物含有248个氨基酸残基(Arellaetal.1988)。2.3BmCPV的感染过程与病理特征在自然条件下，病毒离子被包裹在多角体中，而多角体则可以耐受严寒、高温及酶解等恶劣条件而使内部的病毒长期保持活性。直到被宿主吞食后，多角体才在昆虫肠道的碱性环境中分解并释放出病毒离子(Rohrmann1986)。质型多角体病毒的侵染家蚕的方式以食下侵染为主，因其主要侵染中肠细胞，所以从外部创伤感染的可能性很小。病毒离子或病毒多角体在家蚕采食时被食下，随后进入中肠，中肠内的碱性消化液将多角体解离，病毒离子就被释放出来。病毒主要感染中肠的圆筒形细胞，很少感染杯状细胞，感染的部位是从后向前，即中肠后部开始，进而发展到中部、前部(吕鸿声1998)。BmCPV可感染所有龄期的家蚕幼虫，从感染到发病之间一般有较长的潜伏期，小蚕对它尤其敏感，少量病毒即可致病。感染了CPV病毒的家蚕主要表现为体形瘦弱、发育停滞、行动迟缓(Magnoler1974)。当病毒侵染大部分的中肠细胞后，病程恶化，整个中肠可见乳白色的褶皱，后部尤其明显，这是家蚕质型多角体病的典型病症之一。眠期后敏感宿主家蚕添食质型多角体病毒，利用电镜技术观察病毒入侵过程，发现家蚕食下病毒3h后的切片显示中肠组织中的圆筒形细胞、杯状细胞及肌细胞中均有病毒离子存在。病毒离子入侵中肠的过程是：首先穿过围食膜结构，靠近微绒毛的表面，整个病毒离子贴在微绒毛外部的膜上，随后直接穿过微绒毛膜的空隙，进入微绒毛内部，微绒毛的根基处即为细胞质，达到胞质部位的个别病毒可以穿透膜结构进入线粒体、内质网等细胞器，其中一部分会进入溶酶体中，这部分病毒会在水解酶的作用下变性失活， 第二章家蚕CPV病毒研究进展19最后病毒离子进入核内，进而启动复制和循环(Tanetal.2003)。但也有研究表明在病毒感染12h、24h及48h后，除了中场组织内部的圆筒形细胞外，其它类型的中肠细胞中没有发现病毒发生基质及子代病毒，表明其感染的主要是圆筒形细胞(孙京臣etal.2006)。病毒进入圆筒形细胞的方式，主要有两种观点。一种观点认为病毒入侵是以整个病毒离子为单位进行侵染，侵染过程如上所述。BmCPV病毒经口接种健康3龄起蚕，病毒被食下1.5h后，病毒已经穿过围食膜并存在于圆筒形细胞微绒毛之间，6h后的电镜切片可以看到微绒毛内部的病毒离子，9h后可以看到中肠的圆筒形细胞质中有病毒离子存在。病毒发生基质的形成是在感染24h后，此后子代病毒开始形成并逐渐增多。感染48h后，圆筒形细胞胞质中病毒编码的的多角体蛋白逐渐增加，并开始包埋将病毒离子，最终形成了新的多角体(孙京臣etal.2006)。另一种较早的观点则认为病毒离子吸附在微绒毛表面，将病毒的基因注入微绒毛内部的细胞质，而病毒衣壳则留在外面(MASAHIKO1972)。质型多角体病毒入侵后，宿主中肠细胞随之发生不同程度的病理变化，细胞松弛并膨大变形，胞质内空泡增多并逐渐充斥多角体，中肠组织失去弹性最终使细胞溃烂破裂，新形成的多角体落入肠腔(孙京臣etal.2004)。病毒侵染9天后，大量的病毒发生基质分布在家蚕中肠上皮细胞的胞质内，但不确定病毒发生基质形成的具体时间。病毒发生基质表现为电子致密的细小颗粒，均匀而分散，主要成分是酶和核糖核酸，其周围则是散在的大量病毒核心物质，即病毒的基因组成分与编码的结构蛋白和非结构蛋白，也有装配完整的病毒离子。此时的病毒大多已进入多角体包埋阶段，病毒上的管状突起向外伸展准备接受多角体蛋白的包埋。就家蚕宿主而言，中肠细胞内的主要细胞器则出现明显病变：多数线粒体变得很长，不少嵴的排列变为纵向，个别嵴已经不复存在；粗面内质网的腔、囊肿胀膨大，大量核糖体从上面脱落，以致内质网空泡化；细胞内的核糖体颗粒明显增多，表现为多聚核糖体的形式，次级溶酶体大量增生，不断地进行着自体吞噬(张建红etal.1990)。家蚕感染质型多角体病毒后，血液成分与中肠被膜组成成分中的生化指标如核酸、游离氨基酸等也都发生了一些变化，其中血液中的血糖量急剧减少，提示能量的大量消耗；中肠被膜上的糖原代谢过程很可能与病毒的增殖相关，部分蛋白酶的活性如海藻糖酶、蔗糖酶、糖原磷脂酶等变化很大(孙京臣2004)，5龄家蚕幼虫感染BmCPV后，其红血球凝集素的活性呈现明显的升高趋势(Morietal.1989)。BmCPV病毒本身不产生毒性蛋白，导致家蚕死亡的原因主要是中肠内部的代谢负担，大量的蛋白和氨基酸残基被包裹进入多角体(张轶岭etal.2011)，从而使中肠无法行使正常功能，而此时病毒却能依赖细胞内的营养成分不断繁殖，形成新的多角体，脱离宿主的多角体将会进行新一轮的感染。病毒离子包埋进入多角体的过程是个自发的过程，此过程中基因片段S10编码的多角体蛋白具有关键作用，多角体蛋白在没有病毒离 20家蚕自噬基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究子的情况下可以被包埋进入多角体，可见多角体蛋白具有自主包埋特性(Morietal.1993)。位于多角体蛋白N端的α螺旋是其包埋的识别位点，在VP3蛋白质的N端也发现了类似的结构(N端第1-79氨基酸残基)(Coulibalyetal.2007)。因此，拥有类似结构的蛋白均可以被包埋进入多角体，如来源于家蚕的β半乳糖苷酶就可以被包埋进入多角体，并且在解离后仍然具有活性(张轶岭2011)。2.4BmCPV的病毒起源与防治BmCPV病毒起源学说有内源说和外源说两种，内源说以病毒自生论和潜伏病毒激活论为代表，病毒自生论认为家蚕的基因组经过直接突变可产生多角体病毒(Mukaietal.1962)。潜伏病毒激活论认为即使是健康的家蚕，体内也含有病毒源，但是处于非活动状态，这种状态可以持续几个月甚至几个世代，在不合适的温度条件下(如高温)或者变质的食物条件下，病毒就会被激活(Vago1951)。外源说提出蚕在应激条件下从环境中感染微量的病毒，但是应激状态显著地增加了被感染蚕的灵敏度，如果没有任何应激因素，微量的病毒根本不会导致严重的疾病，一些人为诱导试验支持了这一理论(吕鸿声2008)。大规模家蚕质型多角体病的发生常常给蚕业带来重大损失，目前尚无有效药物可以治疗，最好的办法是及时诊断与积极防治。感染BmCPV家蚕的化蛹期比正常家蚕长(Sikorowskietal.1994)，雌蛾产卵量也显著低于健康蚕蛾(Sikorowskietal.1979)。中肠乳白色的病变是家蚕质型多角体病肉眼诊断的依据之一。此外，确定BmCPV感染的方法还有血清学方法、胶乳凝集反应与涉及使用抗体的ELISA法、单抗法等，免疫学方法因其成本较高多用于试验室研究诊断(孙京臣etal.2006)。家蚕对质型多角体病毒的反应模式符合加显性和超显性现象，因为控制家蚕抵抗CPV病毒侵染的基因数目比较多，近来的转录组试验也证明多个基因在家蚕感染CPV后出现了表达变化。张志芳等经过遗传方差分析发现：显性效应大于加性效应(张志芳1986)。一些对CPV病毒敏感的品种经抗性品种改造后，连续添毒4个世代，即可发现易感品种的发病率下降，并且带病家蚕的茧质有所提高(邵汝莉1981)。对281个家蚕品种资源抗CPV感染比较试验表明：不同品种间抵抗性差异较大，其中有12.45％的抗性品种，32.74％的较抗性品种，33.81％的较感性品种，21.00％的感性品种；家蚕对CPV病毒的抵抗性差异也存在于不同地理系统间，具体为热带多化性品种抗性最强，其次是中国和日本的品种，欧洲品种的抗性最弱(徐安英etal.2002)。CPV病毒的宿主范围很广，据不完全统计，家蚕来源的CPV病毒可以感染20余种昆虫，而18种其他来源的CPVs可以使家蚕发病。由于CPV病毒具有较高的稳定性和持久性，且病毒宿主特异性高，既不直接损害天敌，也不干扰作物生理，可以开发作为一类环境友好型生物杀虫剂(Changetal.2003;Summers2006)。 第二章家蚕CPV病毒研究进展212.5小结近年来对BmCPV的研究越来越倾向于从更加微观和精细的水平去探讨病毒与家蚕的相互作用和相互关系，针对BmCPV的快速检验及流行性调查，一种基于PCR技术的检测方法可以检测出微量的病毒感染(吴萍etal.2013)。使用削减杂交技术结合基因芯片，发现BmCPV感染导致了家蚕中肠一系列基因表达的变化，一些关于缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸降解、视黄醇代谢和维生素B6代谢的基因呈现表达下调，丝氨酸蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶和凋亡抑制蛋白的活性出现了不同程度的降低，而参与核糖体和蛋白酶途径的基因表达则被上调(PingWuetal.2009;Wuetal.2011)。从分子水平上研究和阐明BmCPV与家蚕的相互关系将是必然的趋势，这有利于更好地认识病毒的特点和家蚕的抗性，可对提高蚕桑生产水平、开发新的生物杀虫剂及其他基因产品提供基础信息。因此，在本试验中，我们着重研究自噬相关基因在BmCPV感染后的表达变化，分析自噬机制在家蚕正常生理条件下及病理条件下的作用。 22家蚕自噬基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究第二部分：试验研究第三章家蚕Atg基因在不同组织中的表达3.1材料与方法3.1.1试验动物以西北农林科技大学蚕桑研究所提供的家蚕品种菁松×皓月为试验动物，家蚕幼虫以新鲜桑叶为饲料饲养在25°C±1°C的环境中。家蚕幼虫饲养至5龄第2天，随机选择6头健康家蚕，分别剖取围食膜、马氏管、中肠、脂肪体、丝腺、肌肉和皮肤组织样品，液氮处理后冻存于-80°C冰箱，用于实时定量PCR检测和免疫印迹分析。5龄起蚕第1～8天，每天选取6头健康家蚕，分别剖取家蚕幼虫的中肠和丝腺组织样品，经液氮处理后，保存于-80°C冰箱备用，用于免疫印迹分析。3.1.2主要仪器和试剂(1)主要试剂有：TaqDNA聚合酶，dNTPs，NcoⅠ、SalⅠ和EcoRⅠ内切酶购自上海生工生物工程有限公司。PrimeScript™RTreagentKit反转录试剂盒、SYBR-premixExTaqⅡ定量试剂购自宝生物工程(大连)有限公司。菌株E.coliDH5α、E.coliRosseta，TrizolRNA提取试剂和质粒小提试剂盒购自北京天根公司。(2)主要仪器。表3-1本研究所用主要仪器设备Table3-1Maininstrumentsusedinthisresearch仪器名称型号生产厂家InstrumentsTypeProducers普通PCR仪C1000美国Bio-Rad荧光定量PCR仪IQ5美国Bio-Rad台式高速离心机5810R德国Eppendorf冷冻高速离心机5424德国Eppendorf自动凝胶成像仪ZF-258上海嘉鹏生物成像系统MicroChemi-DNR以色列高效液相色谱仪Waters美国核酸蛋白测定仪ND1000美国NANODROP公司恒温摇床NRY-2102C上海南荣电热恒温培养箱SGSP-02黄石恒丰电热恒温水槽DK-8D上海一恒稳压稳流电泳仪DYY-7C北京六一电泳槽DYCZ-24DN北京六一转膜槽DYCZ-40D北京六一脱色摇床TS-100江苏其林贝尔电子天平PL303上海梅特勒 第三章家蚕Atg基因在不同组织中的表达模式233.1.3实时定量PCR检测Atg基因表达使用Trizol法提取家蚕各个组织的总RNA，在核酸蛋白测定仪上测定RNA的浓度，用超纯水将RNA稀释到200ng/μL，利用Takara公司的反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA(步骤详见附录)，以此为模版进行PCR反应和实时定量检测。根据NCBI数据库上的基因序列，分别设计和筛选得到家蚕3个自噬相关基因BmAtg8、BmAtg5、BmAtg7和参照基因BmAct1的引物，引物序列见表3-2，由上海生工生物工程有限公司合成。表3-2实时定量检测所使用的引物Table3-2Primersusedinquantitativereal-timedetection引物名称引物序列5’-3’NCBI登录号片段长度PrimernamesPrimersSequenceNCBIaccessionNo.lengthBmAtg8-ForGAAGAACATTCATTTGAGAAGAGFJ_416330146bpBmAtg8-RevAATCAGACGGAACTAAATACTTCBmAtg5-ForTGGGCTATCAACAGACGTNM_001142487116bpBmAtg5-RevTTAGGACAGACAAGGCGTBmAtg7-ForATGCGGCGTTAGGTTTCGXP_004929628122bpBmAtg7-RevACAGAAATAGCAACCGAGGBmAct1-ForAGAGGTTCCGTTGTCCCGNM_001126252200bpBmAct1-RevGGCGGTGATTTCCTTCTGCA将PCR扩增得到的目的片段分别连入T载体，转化宿主菌E.coliDH5α筛选单克隆(T载体的连接、转化、筛选详见附录)，从单克隆扩大培养的菌液中提取含有目的片段的重组质粒，将此质粒作为标准品。然后把标准品依次梯度稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍，并以此梯度浓度的样品作为模版进行实时定量PCR试验，根据不同浓度模版的Ct值制作标准曲线，估算标准曲线的R2值，计算引物的扩增效率(E)，PCR扩增效率的计算公式如下：-1/斜率E=(10-1)×100%实时定量检测使用SYBR-premixExTaqⅡ(Takara,Japan)试剂在伯乐IQ5型实时定量PCR仪(BioRad,USA)上运行，反应体系为20μL：2×SYBR®PremixExTaqII10μLPrimer-For(10μM)0.5μLPrimer-Rev(10μM)0.5μLcDNA模版1μLddH2O8μL反应程序采用2步法：Step1:95°Cfor30secStep2:95°Cfor10sec,60°Cfor30sec,40cycles溶解曲线Step3:60°Cfor30sec，顺序增加0.5°C直至95°C,共计71Reps。 24家蚕自噬基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究-△Ct相对表达量计算采用2表示,其中△Ct=Cttargetgene-CtActin1。数据结果以均值±标准差(Mean±SD)的方式表示，处理样品和参照样品之间的显著性差异与否采用Wicoxom检验来确定。3.1.4BmATG8多克隆抗体的制备从GenBank上下载的家蚕BmAtg8基因序列(登录号：FJ416330)，设计扩增该基因CDS区全序列的引物：正向引物为5'-TGCCATGGGAATGAAATTCCAATACAA-3'，引物中下划线部分为NcoⅠ酶切位点。反向引物为5'-GCGTCGACTTAATTTCCATAGACAT-3'，下划线部分为SalⅠ酶切位点，引物的合成由上海生工完成。以家蚕中肠cDNA为模版扩增BmAtg8基因的编码区(CDS区)，反应体系为20μL：2×GoldStarTaqMasterMix10μL上游引物(10μM)0.5μL下游引物(10μM)0.5μLcDNA模版200ng超纯水加至20μL普通PCR反应在伯乐C1000基因扩增仪上进行，反应程序为：95°C预变性3min；95°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸45-50s，共38个循环；最后72°C延伸8min，4°C保存。扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收扩增产物送南京金斯瑞科技有限公司测序鉴定。分别双酶切纯化回收过的上述PCR产物和pET32a质粒(质粒图谱见附录)，双酶切体系为20μl：Nuclease-freewater16μL10×Buffertango2μLDNA(0.5-1μg/μl)1μLSalI0.05-0.2μL(合0.5-2U)NcoI0.5-2μL(合2-5U)将反应体系轻轻混匀并瞬时离心，置于37°C消化4小时。双酶切后的PCR产物和质粒使用琼脂糖凝胶回收，测定浓度，按照目的片段：质粒=3-10的摩尔比将二者混合，加入T4DNA连接酶在16°C连接1h。连接产物转化至E.coliTop10感受态细胞，转化和单克隆筛选步骤详见附录，由单克隆得到的菌液中含有重组质粒pET32a-BmAtg8，按照质粒小提试剂盒的说明书(天根，北京)提取重组质粒。重组质粒使用NcoⅠ和SalⅠ进行双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，取部分重组质粒样品送南京金斯瑞科技有限公司测序鉴定。 第三章家蚕Atg基因在不同组织中的表达模式25pET32a-Atg8重组质粒转化宿主菌E.coliRosseta感受态细胞，加入500μLLB培养液，置于37°C摇床摇菌1h使细菌复苏，复苏后的细菌菌液涂于含有氨苄青霉素(Amp)的LB固体培养基上，37°C保温24h后挑取单克隆至含50μg/mLAmp的5mLLB培养液中37°C摇菌培养过夜，次日使用新鲜LB液按1:50体积比稀释过夜菌，37°C振荡培养，分光光度计实时测定菌液的OD值，当OD(600nm)≈0.6时，加入IPTG诱导剂(IPTG终浓度为0.4mmol/L)，继续37°C振荡培养3h，即获得含有诱导表达蛋白的菌体。取1mL菌体，12000r/min离心30s收获沉淀，100μL1%SDS重悬菌体，煮沸5min，然后12000r/min离心1min，上清即为菌体总蛋白样品。蛋白样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(步骤参见附录)，另外提取不诱导的菌液总蛋白作为参照。为获得较多量的BmATG8重组蛋白，诱导表达1L含有重组质粒的E.coliRosseta菌液，收集菌体，12000r/min离心1min，弃上清，菌体沉淀使用含8mol/L尿素的PBS溶解，使用超声波破碎菌体细胞20min(反复冻融后再破碎效果更好)，14000r/min离心15min，0.22μm水系过滤头过滤总蛋白。使用高效液相色谱仪(Waters，美国)和Invitrogen公司的Ni2+-NTA纯化试剂盒，以亲和层析的方式纯化目的蛋白BmATG8，洗脱目的蛋白时使用500mM的咪唑溶液，洗脱后的目的蛋白含有较多盐分，使用透析袋(分子质量14000kDa)梯度透析除盐，透析袋需经过煮沸和乙醇浸泡1h以上。含咪唑的蛋白洗脱液装入透析袋，浸没于含有尿素浓度梯度的PBS液中透析，其中尿素浓度梯度分别为4mol/L、3mol/L、2mol/L和1mol/L，分别透析2h。蛋白样品经透析后使用SDS-PAGE方法检测，同时将SDS-PAGE电泳后凝胶上的BmATG8重组蛋白胶点送到华大基因公司做质谱鉴定。选择2只健康新西兰大白兔，将纯化的BmATG8蛋白配合弗氏佐剂进行3次强度免疫注射，解剖后获取多克隆抗血清，抗体的效价评定使用ELISA方法确定，抗血清存放于-20°C冰箱待用。3.1.5组织蛋白的免疫印迹分析首先将3.1.1节采集的家蚕组织样品放于液氮中研磨，提取组织总蛋白(蛋白提取法见附录)，使用考马斯亮蓝法(Bradford)测定总蛋白的浓度，然后将蛋白浓度稀释至10μg/μL，分装后冻存于-80°C冰箱备用。家蚕组织蛋白中加入等体积的2×蛋白上样缓冲液，制作含有5%浓缩胶、15%分离胶的聚丙烯酰胺凝胶，每份样品取10μL进行SDS-PAGE电泳，使样品在浓缩胶中以80V电压条件电泳15min，然后在分离胶中以120V电压保持80min直至溴酚蓝迁移至底部时停止电泳(详见附录)。准备与胶大小一致的PVDF膜一张、滤纸2张，与纤维垫一起放入1×转膜缓冲液中浸泡10~20min。转膜三明治按照纤维垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、纤维垫的顺序排好，用玻棒赶尽气泡，放入转膜仪中，使负极(黑孔板)贴近凝胶，正极(红孔板) 26家蚕自噬基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究贴近PVDF膜，在冰水中、100V下转膜50min。转膜完毕，取出膜放入PBS配制的5%脱脂奶粉中，在脱色摇床上室温缓慢摇动封闭1～2h，PBS液清洗3遍，每次5～10min。使用PBS按1:4000稀释一抗抗血清，在室温下孵育过夜。PBS液清洗3～5遍，每次5～10min，1:2000的二抗孵育1h后用PBS清洗3遍，添加ECL化学发光试剂到膜上，使用DNR生物成像系统曝光并拍照，Gel分析软件分析条带的亮度，自然光条件下观察和拍照时将DAB显色液滴加到PVDF膜上，即可显示棕色的杂交条带。蛋白印迹条带颜色的亮度值使用积分光密度(Integratedoptiondensity，IOD)表示(Mean±SD)，Wicoxom检验来确定处理样品和参照样品之间的显著性差异。3.1.6家蚕ATG8蛋白的系统进化分析根据测序获得的家蚕Atg8基因序列，使用软件BIOXM2.6分析得到了BmATG8的氨基酸序列，使用Clastaw比对软件和MEGA5.10分析家蚕ATG8蛋白与其他物种相关蛋白序列的相似性，并构建系统进化树，进化树采用邻接法绘制，节点处的数字为1000次自引导值中该节点存在的百分数。3.2结果与分析3.2.1家蚕自噬相关基因表达的检测使用表3-2中的引物进行扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳得到了相应大小的片段(图3-1)，电泳条带单一而明亮，可以用来进行实时定量分析。图3-1本试验所用定量引物扩增条带琼脂糖凝胶电泳图。扩增片段长度分别为Atg8：146bp；Atg5：116bp；Atg7：122bp；Act1：200bp，M：Marker2000。Figure3-1AgarosegelelectrophoresisofPCRproductswithquantitativeprimersusedinthisexperiment.SegmentlengthwereAtg8:146bp,Atg5:116bp,Atg7:122bp,andAct1:200bpseparately.M:Marker2000.使用定量引物扩增质粒标准品，绘制得到的标准曲线如图3-2。经计算，4个定量引物的扩增效率(PCREfficiency)分别是：Atg8为113%，Atg5为94%，Atg7为89%，Act1为93%，4个引物的扩增效率在稀释梯度范围内有很好的线性关系，除Atg7基因为89% 第三章家蚕Atg基因在不同组织中的表达模式27外其他基因的E值均在90%以上，目的基因和内参基因的扩增效率相差不大。Atg82525Atg5线性(Atg8)2020线性(Atg5)值15值15CtCt10y=-3.4705x+26.94310y=-3.032x+25.1112R2=0.99225R=0.99615001/100001/10001/1001/1011/100001/10001/1001/101模板浓度模板浓度2525Atg7Act12020线性(Atg7)线性(Act1)值1515Ct值10Ct10y=-3.603x+24.214y=-3.4855x+24.569225R=0.99895R=0.9922001/100001/10001/1001/1011/100001/10001/1001/101模版浓度模板浓度图3-2使用4个引物扩增质粒标准品得到的标准曲线Figure3-2Standardcurveof4primerswithplasmidstandards试验测定了3个Atg基因在5龄第2天家蚕的不同组织中的表达情况(图3-3)，可见3个基因在组织中的表达规律相似，以丝腺中的表达最高，其次是脂肪体和中肠，在马氏管、肌肉和皮肤中表达量最低。这反映出家蚕不同组织内自噬活性的差异，以丝腺中最高，可能与丝腺组织的生长规律与功能相关，丝腺在家蚕第5龄迅速增长并在吐丝后又迅速降解凋亡，短短十多天时间发生了较大形态变化，这要求丝腺细胞有很强的调节生长能力和自我降解能力，细胞自噬正是这种能力的体现，它一方面可以分解其他组织的营养如脂肪体为丝腺提供发育所需的物质和能量，另一方面也可以对丝腺细胞启动自噬程序性死亡过程，促进丝腺降解并为成虫组织提供基础材料。脂肪和中肠也是增生和分解活跃的细胞系，一定程度上需要自噬机制。而马氏管、肌肉和皮肤一旦形成，则需要保持相对稳定的状态，因此自噬基因表达水平较低。20.0015.616915.0010.00基因相对表达5.001.32700.52270.10030.02230.0012Atg80.00丝腺脂肪中肠马氏管肌肉皮肤家蚕组织 28家蚕自噬基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究0.97721.501.00基因相对表达0.50Atg50.05960.02090.00610.00160.00030.00丝腺脂肪中肠马氏管肌肉皮肤家蚕组织0.350.25400.300.250.200.15基因相对表达0.100.050.02190.00310.00150.00050.0001Atg70.00丝腺脂肪中肠马氏管肌肉皮肤家蚕组织图3-3个自噬相关基因在5龄第2天家蚕不同组织中的相对表达。Figure3-3Relativeexpressionof3autophagy-relatedgenesindifferenttissuesofsilkwormonthe5thinstarstageday2.3.2.2BmATG8多克隆抗体的制备和效价利用3.1.4中的引物进行PCR成功得到了BmAtg8基因全部的CDS区片段，长度为354bp(图3-4)，测序结果显示获得的PCR产物即为BmAtg8基因序列，与GenBank发表的BmAtg8基因序列相一致(Zhangetal.2009)。图3-4家蚕BmAtg8基因全部编码区扩增产物的琼脂糖电泳图Figure3-4AgarosegelelectrophoresisofBmAtg8genefullcodingregion质粒pET32a和BmAtg8基因经双酶切和连接，通过单克隆筛选获得了pET32a-BmAtg8重组质粒。NcoⅠ/SalⅠ双酶切重组质粒试验得到了5866bp和354bp2个片段(图3-5)，说明家蚕BmAtg8基因已被成功连入载体中，重组质粒的测序结果也证 第三章家蚕Atg基因在不同组织中的表达模式29实了BmAtg8基因的连入，可以进行后续的蛋白质表达试验。图3-5NcoⅠ/SalⅠ双酶切鉴定pET32a-Atg8重组质粒Figure3-5IdentificationofpET32a-Atg8recombinantplasmidswithNcoⅠ/SalⅠdigestion将pET32a-Atg8重组质粒转化至表达菌株E.coliRosseta中后，经IPTG诱导，得到了重组BmATG8蛋白，以未诱导的pET32a-Atg8重组质粒和空质粒(pET32a)转化的菌液作为参照。菌体总蛋白的SDS-PAGE电泳检测结果显示：经IPTG诱导表达的重组质粒在大约35kDa的位置出现一条蛋白条带，为融合表达蛋白(图3-6，泳道2)，空质粒则在大约21kDa的位置出现了质粒蛋白条带(图3-6，泳道4)，而未经诱导的菌体总蛋白电泳结果则没有出现特异条带(图3-6，泳道1,3)。图3-6重组质粒pET32a-Atg8经诱导表达后菌液总蛋白的SDS-PAGE检测。1：重组质粒未经诱导，2：重组质粒经诱导后，3：空质粒未经诱导，4：空质粒诱导后，5：中分子质量蛋白质Marker。Figure3-6SDS-PAGEanalysisoftotalbacterialproteinsinducedfrompET32a-Atg8recombinantplasmids.1:recombinantplasmidswithoutinduction;2:recombinantplasmidsafterinduction;3:Emptyplasmidswithoutinduction;4:Emptyplasmidsafterinduction;M:proteinMarker. 30家蚕自噬基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究图3-7重组BmATG8蛋白经过纯化后的SDS-PAGE检测。1、2：重组质粒菌液经诱导表达后的总蛋白，3、4：菌体总蛋白经过Ni柱后的流出液，5、6：从吸附柱上洗脱的蛋白，7、8：经过梯度透析后的蛋白，M：中分子质量蛋白质Marker。Figure3-7SDS-PAGEanalysisofBmATG8proteinafterpurification.1,2:recombinantplasmidsproteinsafterIPTGinduced;3,4:bacteriaproteinsafterNicolumnadsorption5,6:elutionproteinsfromNicolumn;7,8:dialyzedproteins;M:Marker.SDS-PAGE电泳分析得到了菌体中的重组蛋白经纯化回收后的结果(图3-7)，从图片可知经过Ni柱纯化、梯度透析等步骤，试验获得了较为纯净的了BmATG8重组蛋白。把图中的蛋白条带切割下来，送到华大基因公司进行了质谱鉴定，质谱分析结果表明该蛋白被分解后，部分肽段与NCBI蛋白库搜索到相应的肽段有匹配，匹配蛋白编号为Bm_nscaf3031_090，该蛋白质序列即为BmAtg8基因编码蛋白序列，因此质谱鉴定证明了重组质粒表达的蛋白就是含有家蚕BmATG8蛋白的融合蛋白，使用该蛋白作为抗原可用来制备抗体。重组表达蛋白的质谱鉴定部分结果：蛋白编号ProteinID:Bm_nscaf3031_090序列覆盖率SequenceCoverage:37.61%方框为匹配部分MatchedpeptidesshowninBox:MKFQYKEEHSFEKRKAEGEKIRRKYPDRVPVIVEKAPKARLGDLDKKKYLVPSDLTVGQFYFLIRKRIHLRPEDALFFFVNNVIPPTSATMGSLYQEHHDEDFFLYIAFSDENVYGN纯化的蛋白配合弗氏佐剂注射免疫2只新西兰大白兔，经过3次强度免疫后，获得了BmATG8重组蛋白的多克隆抗血清，使用ELISA试验鉴定了多克隆抗血清的效价，表3-3显示多克隆抗血清的效价为1:512000，此抗体可以用来检测微量的家蚕内源性蛋白质BmATG8。 第三章家蚕Atg基因在不同组织中的表达模式31表3-3预免疫血清和第3次免疫后得到的多克隆抗血清的Elisa试验结果Table3-3Elisaresultsofpre-immuneserumandAntiserumafterthe3rdimmunization稀释倍数D(450nm)预免疫血清Pre-immuneserum1:10000.1601:10002.9801:20002.7991:40002.591抗血清Antiserum1:80002.0771:160001.4811:320000.971空白对照Blank0.057效价Titer1:512000注：效价在最高稀释浓度条件下样品与空白样的比值≧2.1Note:ThetiteristhehighestdilutionofS/B(Sample/Blank)≧2.13.2.3家蚕组织蛋白的WesternBlot检测使用BmATG8蛋白的多克隆抗体杂交家蚕中肠总蛋白时得到了2条明显的印迹条带(图3-8)，一条是BmATG8蛋白，大小约为14kDa，另一条是被ATG7加工修饰后形成的BmATG8-PE活性蛋白形式，位于大约12kDa处。实际上，BmATG8-PE的分子量大于BmATG8蛋白，但PE基团的结合使BmATG8-PE带上了更多的负电荷，使其在电泳时有较快的迁移速度，在聚丙烯酰胺凝胶上位于BmATG8蛋白条带的下面(Franzettietal.2012)。图3-8使用BmATG8多克隆抗体杂交家蚕中肠组织总蛋白，DAB显色图Figure3-8WesternBlotoftotalmidgutproteinswithBmATG8antibody,coloredbyDAB.BmATG8抗体与家蚕各个组织的免疫印迹分析结果显示，使用近似的蛋白质上样量，丝腺、脂肪体、中肠组织中能得到比较明显的杂交条带，提示了在这3种组织内，ATG8和ATG8-PE蛋白的表达量相对较高，这一定程度上反映出这3类组织中的细胞自噬水平相对较高(图3-9)。原因可能是家蚕的丝腺组织在幼虫5龄初期迅速生长，到吐丝前丝 32家蚕自噬基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究腺器官生长至最大，吐丝结束后丝腺就降解消失，因此丝腺细胞必须具有较强的自我分解能力；脂肪体作为家蚕储存能量的场所，不断进行着储藏脂肪和分解脂肪的活动，以维持蚕体生命活动所需的能量平衡，同样需要较高的降解能力；而中肠是家蚕幼虫主要的消化器官，研究发现部分昆虫肠细胞具有干细胞分化能力，肠壁上有不断脱落降解的细胞，也有不断形成的新细胞(唐旭东etal.2010)，同时在消化桑叶组分的过程中很可能也需要细胞自噬的参与。而马氏管、围食膜、肌肉、皮肤等组织一经形成，则需保持相对稳定的状态，细胞的代谢水平和更新换代比较慢，故这些组织细胞内自噬作用相对较弱，反映在BmATG8的免疫印迹条带上就很浅。BmATG8的免疫印迹结果和3.22节中Atg8基因的转录表达具有较高的一致性。图3-9家蚕5龄第2天幼虫不同组织中BmATG8蛋白的免疫印迹分析。1：围食膜，2：马氏管，3：脂肪体，4：肌肉，5：皮肤，6：丝腺，7：中肠。Figure3-9BmATG8proteinExpressionindifferentsilkwormtissuesmeasuredbyWesternBlotatday2of5thlarvalinstar.1:Peritrophicmembrane;2:Markovtube;3:Fatbody;4:Muscles;5:Skin;6:Silkgland;7:Midgut.研究表明ATG8PE蛋白是自噬体膜的主要成分，其功能和哺乳动物LC3-Ⅱ相似，是ATG8蛋白活性形式，需要经过ATG4和ATG7等自噬相关蛋白修饰。因此BmATG8PE蛋白的量一定程度上提示了自噬降解活性的水平。图3-10家蚕5龄幼虫第1~8天幼虫丝腺BmATG8蛋白的免疫印迹分析Figure3-10WBanalysisofATG8proteinsinsilkglandfromday1today8on5thinstarlarva图3-10显示了在家蚕5龄幼虫第1～8天的丝腺组织内BmATG8/BmATG8PE蛋白的免疫印迹条带。本试验中5龄家蚕幼虫丝腺组织内的BmATG8PE蛋白量始终呈现高表达，在5龄第1～2天和7～8天的表达量相比5龄中期略高，一方面说明自噬机制在丝腺内发挥着重要作用，对于丝腺细胞的再生和回收不可或缺；另一方面说明在眠期和即将到来的化蛹期，自噬活性增强意味着该机制对家蚕眠期生理、变态发育也有重要调节作用。 第三章家蚕Atg基因在不同组织中的表达模式33由于技术问题本试验没有获得较好的5龄家蚕第1～8天中肠组织免疫印迹图，常常只能得到1条杂交代，得到的条带具有随着龄期增加而增多的趋势。3.2.4家蚕BmATG8蛋白的系统进化38HdGABARAP_gi|298108445|gb|ADI56518.1|92MmGABARAP_gi|523584239|gb|AGQ51506.1|LvATG8_gi|411013040|gb|AFV99179.1|81ZnGABARAP_gi|646677241|gb|KDQ97907.1|PaATG8_gi|610516271|dbj|BAO58963.1|61CfGABARAP_gi|506969291|gb|AGM32989.1|TcGABARAP_gi|642926483|ref|XP_973073.2|76MdGABARAP_gi|665818292|ref|XP_008557966.1|93NvGABARAP_gi|345492299|ref|XP_003426810.1|38DmATG8_gi|24641085|ref|NP_727447.1|CcGABARAP_gi|498984937|ref|XP_004530489.1|CqATG8_gi|170033122|ref|XP_001844428.1|84AaGABARAP_gi|56684619|gb|AAW21996.1|MhGABARAP_gi|121543929|gb|ABM55629.1|HaATG8_gi|389604114|gb|AFK91514.1|75GmATG8_gi|400073886|gb|AFP66874.1|DpATG8_gi|357624756|gb|EHJ75410.1|79BmATG8_gi|114052412|ref|NP_001040244.1|55BmATG8(Shaanxi)0.030.020.010.00图3-11家蚕ATG8蛋白与其他物种相关蛋白的亲缘关系Figure3-11PhylogeneticrelationshipofSilkwormATG8proteinwithotherspecies.为了分析BmATG8的保守程度，本试验从NCBI蛋白数据库下载了18条相关的氨基酸序列，包含有家蚕(Bombyxmori)，大蜡螟(Galleriamellonella)，棉铃虫(Helicoverpaarmigera)，大红斑蝶(Danausplexippus)，美洲大蠊(PeriplanetaAmericana)，家白蚁(Coptotermesformosanus)，赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)，黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)，致倦库蚊(Culexquinquefasciatus)，曼粉蚧(Maconellicoccushirsutus)，毁侧沟茧蜂(Microplitisdemolitor)，中华按蚊(Anophelessinensis)，地中海实蝇(Ceratitiscapitata)，埃及伊蚊(Aedesaegypti)，丽蝇蛹集金小蜂(Nasoniavitripennis)，杂色鲍(Haliotisdiversicolor)，南美白对虾(Litopenaeusvannamei)，内华达古白蚁(Zootermopsisnevadensis)，文蛤(Meretrixmeretrix)等。从系统进化树可以看出，家蚕ATG8蛋白与其他物种的遗传距离较近，佐证了自噬机制进化保守的观点。 34家蚕自噬基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究3.3讨论与小结3.3.1讨论自噬在家蚕变态发育和免疫中发挥着重要的作用，目前家蚕自噬相关基因的系统克隆发现了11种自噬相关Atg基因，包括mTOR通路中的部分基因，这些Atg基因在丝腺中都呈现高转录表达(Zhangetal.2009)。本试验中的三个自噬相关基因BmAtg8、BmAtg5、BmAtg7在丝腺组织中的相对表达也是最高的，其中家蚕BmAtg7基因的检测尚未见相关报道，本试验首次确定了该基因的组织表达，并在后续试验中分析了它的表达变化情况。为研究BmATG8蛋白晶体特征，Hu等使用pET28a载体构建了该基因的重组质粒，并在E.coliBL21菌株中诱导表达获得了BmATG8蛋白(Huetal.2010)。本试验选择pET32a质粒的原因是考虑到该质粒中含有Trx融合表达标签，可以使表达的目的蛋白质具有更好的溶解性，pET32a上的质粒序列使ATG8蛋白增加了约21kDa，质粒氨基酸序列和ATG8蛋白质之间有肠激酶(Enterokinase)酶切位点，通过酶切可以把质粒蛋白和BmATG8蛋白分开，本试验制备的多克隆抗体主要用于家蚕组织中的ATG8蛋白表达，因此质粒蛋白的存在与否并不影响后续的试验结果，可以直接使用重组蛋白来制备抗体。本试验尝试使用了三种内参抗体：Actin、Tubulin和GAPDH，抗体氨基酸序列来自哺乳动物大鼠，三种内参抗体均未获得与家蚕组织蛋白的免疫印迹条带，推测原因可能是哺乳动物来源的抗原序列虽然和家蚕的氨基酸序列相似，而空间结构存在显著差异，因此不能和家蚕的蛋白结合。通常机体内的自噬被激活后，会有大量LC3Ⅰ型蛋白脂化后转变为LC3Ⅱ型，后者是定位于自噬体膜的蛋白质活性形式(Kabeyaetal.2000)。这两种蛋白具有组织表达特异性，如在HEK293细胞系中以LC3Ⅰ型蛋白为主要存在形式，而在海拉细胞系(heLacells)中则是LC3Ⅱ型为主(Mizushimaetal.2004)。自噬研究中，仅仅测定LC3Ⅱ一种蛋白质的表达量并不能准确地判断自噬水平的变化情况(Kabeyaetal.2004)，通常使用二者的比值(LC3Ⅱ/LC3Ⅰ，即二者的转化效率)来反映机体自噬反应水平。本试验使用Gel软件分析了WB条带的积分光密度值，BmATG8-PE的值大于BmATG8，反映这种蛋白在家蚕丝腺、脂肪体和中肠组织内以BmATG8PE为主要存在形式。有研究表明家蚕丝腺细胞内的细胞程序性死亡(Programmedcelldeath,PCD)是由蜕皮激素(20-hydroxyecdysone)的累积效应导致，蜕皮激素对活体内丝腺或体外培养细胞的诱导都可以出现PCD(Terashimaetal.2000)。本试验中，自噬蛋白BmATG8在5龄第2天各组织中的表达以丝腺最高，而细胞自噬程序性死亡又是PCD的方式之一，因此认为蜕皮激素也是引起细胞自噬的信号之一。一种明显的现象就是在家蚕的休眠期，蜕皮 第三章家蚕Atg基因在不同组织中的表达模式35激素的高表达引起了蜕皮效应，被蜕掉的皮肤细胞理论上也存在着PCD过程，推测此过程同样伴随着细胞自噬的发生，这有待试验的进一步证实。此外，对中肠Atg基因的定量检测也发现家蚕从食桑期到化蛹前期，Atg5、Atg6、Atg8(Franzettietal.2012)以及Atg12基因(Zhangetal.2009)随着蜕皮激素的升高，都呈现上升表达，大蜡螟(Galleriamellonella)和黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)的Atg8研究也得到了相似的结果(Khoaetal.2012)。但是蜕皮激素作用于细胞并导致自噬水平上升的内在机制尚不清楚，有待进一步研究。家蚕ATG8与大红斑蝶(Danausplexippus)ATG8蛋白、曼粉蚧(Maconellicoccushirsutus)γ-氨基丁酸受体相关蛋白(γ-GammaAminobutyricAcidreceptorassociatedprotein,GABARAP)等蛋白质的序列一致性都在95%以上，甚至与褐家鼠(Rattusnorvegicus)GABARAP的序列一致性也达到90%，而它们的序列与微管结合蛋白轻链-3(Rattusnorvegicusmicrotubule-associatedproteinlightchain3,LC3)、啤酒酵母ATG8(Sac-charomycescerevisiaeATG8,ScATG8)、布氏锥体虫ATG8(TrypanosomabruceiATG8,TbATG8)虽然不太一样，但是蛋白质结晶衍射及构象分析结果表明它们的空间结构基本一致(胡晨2010)，进一步说明了自噬机制的进化保守性。3.3.2小结本试验利用qRT-PCR试验技术测定了自噬相关基因BmAtg8、BmAtg5、BmAtg7在家蚕不同组织中的相对表达，均在丝腺组织内表达最高，脂肪体和中肠次之，在马氏管、肌肉和皮肤中相对表达较低。通过双酶切和连接试验，经单克隆筛选成功构建了pET32a-BmAtg8重组质粒，以诱导表达的重组蛋白为抗原免疫新西兰大白兔，制备了BmATG8蛋白的多克隆抗体，抗体效价经ELIAS试验评定，可以用于后续的免疫相关试验。在对家蚕组织的免疫印迹试验中，杂交得到了BmATG8和BmATG8-PE两条蛋白条带，分别位于14kDa、12kDa的位置，对5龄家蚕各个组织的免疫印迹试验结果与qRT-PCR检测结果相一致。5龄家蚕丝腺组织第1-8天，BmATG8-PE/BmATG8比值出现显著的变化。基于氨基酸序列构建的系统进化树表明家蚕ATG8蛋白与其他物种相关蛋白的遗传距离较近，提示自噬机制的进化保守特征。 36家蚕自噬基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究第四章影响家蚕中肠Atg基因表达的应激因素4.1材料与方法4.1.1试验动物处理试验动物同3.1.1。家蚕饲养至5龄第2天，随机选择72头，分成3个处理组：参照组、饥饿组和雷帕霉素组，每组24头。参照组家蚕使用新鲜桑叶正常饲喂，每6小时喂一次；饥饿组家蚕在第一次饲喂后即不再喂食；雷帕霉素组家蚕预先准备50头，在第一次饲喂时每头家蚕单独饲喂浓度为10μg/μL的雷帕霉素10μL，添食时把雷帕霉素溶解于二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide,DMSO)，将新鲜桑叶切成约1cm2的方块，取10μL雷帕霉素溶液涂于桑叶表面，饲喂家蚕，选取吃的相对完全的家蚕作为处理组，以后正常饲喂。分别在处理后的12h、24h解剖家蚕，取出中肠组织，生理盐水冲洗2次后使用液氮速冻，保存于-80°C冰箱。随机选取36头5龄第2天的家蚕，分成参照组、低温组和高温组，每组12头。参照组家蚕置于正常25±1°C的环境中，低温组家蚕放在4°C环境中1h，高温组家蚕放在37°C环境中高温冲击1h。处理完毕后剖取家蚕中肠组织，液氮速冻后保存于-80°C冰箱。4.1.2主要仪器和试剂同3.1.2。4.1.3实时定量PCR分析同3.1.3。4.1.4不同处理家蚕中肠的免疫印迹分析同3.1.5。4.2结果与分析4.2.1饥饿和雷帕霉素处理对Atg基因转录表达的影响处在饥饿条件下的机体，通常会分解自身的组成物质来维持生命的基本需求，因此饥饿应激会促使机体激活自噬降解途径或增加其他水解酶的活性来分解自身物质。图4.1显示在饥饿处理12h后，BmAtg8、BmAtg5和BmAtg7基因表达并没有发生显著变化，预计此时还没有达到饥饿诱导自噬的阈值。饥饿处理24h后，BmAtg8基因出现明显的表达上升，表明家蚕开始启动自噬机制来应对饥饿应激，因为自噬现象的大量发生必然伴随自噬体膜的扩张，这就需要大量的BmATG8和BmATG8PE蛋白参与。BmAtg5和 第四章影响家蚕中肠Atg基因表达的应激因素37BmAtg7基因在受到饥饿刺激后表达变化差异不明显，原因可能是这两个基因编码的蛋白在自噬机制中仅仅是起调节作用，并不像BmAtg8基因那样编码自噬体膜结构的必需成分BmATG8。雷帕霉素虽然是自噬诱导剂，但是本试验使用雷帕霉素作为诱导剂喂食给家蚕后，3个自噬相关基因并没有显著的表达变化，推测是家蚕机体的其他自调功能消除了药物的影响(图4-1)。1*参照0.8饥饿雷帕霉素0.60.4基因的相对表达0.2Atg80处理12h处理24h0.01参照饥饿0.008雷帕霉素0.0060.004基因相对表达Atg50.0020处理12h处理24h0.005参照0.004饥饿雷帕霉素0.0030.002基因相对表达Atg70.0010处理12h处理24h图4-1饥饿和雷帕霉素处理5龄第2天家蚕后3个自噬相关基因在中肠的表达变化Figure4-1Expressionof3autophagy-relatedgenesinsilkwormmidgutatthe5thinstarstageday2afterstarvationandrapamycintreatment.4.2.2饥饿和雷帕霉素处理对BmATG8蛋白表达的影响图4-2显示了饥饿和雷帕霉素处理后BmATG8和BmATG8PE蛋白的表达，免疫印迹的结果采用积分光密度值分析软件进行处理并进行了显著性比较。家蚕在不摄入桑叶的情况下，常常还能生存数天左右。免疫印迹结果发现在饥饿处理后12h后，家蚕BmATG8和BmATG8PE均没有明显变化，说明家蚕机体自噬水平变化不大。在饥饿处理24h后，两种蛋白总量均有所增加，尤其是BmATG8PE活性形式 38家蚕自噬基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究蛋白的量较参照组增加明显，且BmATG8PE/BmATG8比值显著高于参照组家蚕，提示了BmATG8蛋白的转化效率增加，家蚕中肠细胞自噬水平上升，这反映了家蚕在饥饿条件下能利用自噬来平衡机体，以避免营养缺乏导致的死亡威胁。结合上节的BmAtg8基因表达分析可知，家蚕在饥饿24h后，其BmAtg8基因及其编码的BmATG8蛋白表达同步上升，表现出转录和翻译的一致性。作为自噬诱导剂，雷帕霉素处理家蚕12h后中肠细胞内BmATG8PE有所减少，说明部分活性蛋白BmATG8PE被消耗，但是BmATG8PE/BmATG8比值没有较大差异。处理24h后中肠BmATG8和BmATG8PE的蛋白量均有所增加，提示自噬可能被诱导，雷帕霉素处理能够迅速消耗活性形式的BmATG8PE。C*32.5参照比值饥饿2雷帕霉素1.51ATG8-PE/Atg80.5012h24h处理后时间图4-2饥饿和雷帕霉素处理5龄第2天家蚕后的ATG8和ATG8PE免疫印迹结果A：处理12小时后；B：处理24小时后；C：基于A、B两图的灰度值分析，使用Gel-Proanalyzer4软件Figure4-2TheWesternblottingofATG8toATG8-PEanalysisafterstarvationandRapamycintreatmentonsilkwormat5thinstarstageday2.A:12haftertreatment;B:24haftertreatment;C:theATG8-PE/ATG8ratiowasanalyzedbasedfigureA,BbyGel-Proanalyzer4.4.2.3温度冲击对Atg基因表达的影响使用37°C高温和4°C低温冲击家蚕1h，发现家蚕中肠组织3个自噬相关基因表达均没有显著的变化(图4-3)。可能是由于温度变化后持续的时间较短，蚕体对于温度的反应尚未表现在基因转录水平，但是后续的蛋白检测表明在温度冲击下，家蚕出现了蛋白水平的调节。 第四章影响家蚕中肠Atg基因表达的应激因素390.250.20.150.1基因相对表达0.05Atg80参照1h低温1h高温1h不同温度处理0.0120.010.0080.006基因相对表达0.0040.002Atg50参照1h低温1h高温1h不同处理温度0.00350.0030.00250.0020.0015基因相对表达0.001Atg70.00050参照1h低温1h高温1h不同处理温度图4-3高温和低温冲击5龄第2天家蚕1h后3个自噬相关基因在中肠的表达Figure4-3Expressionof3autophagy-relatedgenesinthemidgutafterhighandlowtemperaturetreatmentonsilkwormatthe5thinstarday2for1h.4.2.4温度冲击对BmATG8蛋白表达的影响家蚕在最适的温度下能够发挥最大的生产效益，温度的剧烈变化不仅影响家蚕的产丝量，有时还会造成规模性的疾病暴发。高温和低温均能影响自噬蛋白BmATG8和BmATG8PE的表达(图4-4)。4°C低温冲击1h，家蚕中肠细胞内BmATG8和BmATG8PE的表达量均被下调，但是转化率没有明显变化，说明低温环境消耗了家蚕中肠细胞内的两种蛋白。而37°C高温冲击下活性形式的BmATG8PE蛋白显著地被消耗，但BmATG8的转化率却显著降低，推测这是家蚕在高温环境下的一种自我调节机制发挥作用，下调BmATG8转化率，以免过度消耗机体。 40家蚕自噬基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究B参照0.354°C低温处理0.337°C高温处理0.25比值0.20.150.10.05**ATG8-PE/ATG80-0.05处理1小时后图4-4使用高温和低温冲击处理5龄第2天家蚕1小时后的ATG8和ATG8PE免疫印迹结果。A：免疫印迹图；B：基于A图的灰度值分析。Figure4-4WesternblottinganalysisofATG8toATG8-PEafterhighandlowtemperaturetreatmentfor1honsilkwormat5thinstarstageday2.A:WesternBlots;B:GrayvalueanalysisofATG8-PE/ATG8basedfigure4-4(A).4.3讨论与小结4.3.1讨论家蚕自噬诱导因素研究中，目前使用较多的是激素刺激和饥饿手段。蜕皮激素是诱导家蚕丝腺细胞自噬的因素之一，家蚕的变态发育主要是由保幼激素和蜕皮激素的协调作用所引发。在5龄家蚕化蛹前期，给家蚕注射保幼激素可以延长家蚕食桑时间2-3天。因此在一定程度上，保幼激素扮演了自噬抑制剂的角色，而蜕皮激素却诱发和促进自噬的发生。蜕皮激素受体在丝腺形成和退化期具有重要作用，被认为是引起细胞程序性死亡的因素之一(Goncuetal.2009)。丝腺内核浓缩、细胞分离、液泡形成是程序性死亡的最早标志，此时溶酶体标志物酸性磷脂酸酶明显升高，提示导致家蚕幼虫前期丝腺细胞退化的因素是凋亡和自噬的协同作用(Goncuetal.2008)。转录水平的表达研究表明自噬相关基因Atg8、Atg5的表达上调时间要早于凋亡相关基因，因此可以推导出家蚕变态发育的调节顺序：激素累积→自噬基因表达升高→凋亡基因表达升高→其他相关水解酶协同作用→完成变态发育。在自噬通路的Tor途径中，家蚕脂肪体中两个Tor基因的同系物(BmTor1和BmTor2)在受到饥饿24h和家蚕蜕皮激素刺激(20-hydroecdysone,20E)12h后均表现上调表达，证明了家蚕在这两种条件下动员自身能量消除外界应激的反应能力(Zhouetal.2010)。相似地，本试验发现饥饿诱导家蚕中肠组织，在自噬通路的泛素样途径中的BmAtg8基因及其编码蛋白均呈现上升表达，说明在饥饿的诱导下，家蚕对自噬的动员和依赖不仅发 第四章影响家蚕中肠Atg基因表达的应激因素41生在脂肪体，中肠也有类似的反应。另一研究表明家蚕幼虫期Atg基因在中肠组织的表达是随着蚕龄增加而变化的，且具有饥饿效应(Franzettietal.2012)。雷帕霉素是常见的自噬诱导剂，例如使用雷帕霉素处理家蚕BMN-e细胞系，可以提高细胞自噬水平，诱导BMN-e细胞系细胞出现凋亡现象，这种凋亡在自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3MA)的作用下可被抑制，家蚕细胞自噬水平的提高与细胞凋亡具有正相关性(李佳芮etal.2009)。雷帕霉素诱导同样可以促使果蝇脂肪体细胞的自噬水平显著升高(Rustenetal.2004)。但对于药物雷帕霉素的诱导，本试验仅发现ATG8蛋白量的增加，BmAtg8基因的上调表达差异则不显著。ATG8蛋白(哺乳动物同源物为LC3)经过加工后是自噬体膜的重要组成成分，其C端在蛋白形成后被切割，暴露出甘氨酸残基，并与磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)偶联形成ATG8-PE蛋白，在自噬体形成过程中，ATG8-PE被转运至自噬体的内膜和外膜上。因此，ATG8-PE的量在某种程度上反映了自噬体的多少，于是ATG8-PE/ATG8的比例(即转化效率，哺乳动物为LC3Ⅱ/LC3Ⅰ)常用来衡量自噬水平的高低(Kabeyaetal.2000)。本试验中BmATG8-PE/BmATG8比值在饥饿24h后显著上升，说明自噬被激活，可能有大量自噬泡的形成。37°C高温处理显著降低了比值，提示了BmATG8-PE在高温下被消耗，机体为避免过量自噬对自身的伤害，下调了BmATG8的转化效率，以维持生命。4.3.2小结使用qRT-PCR技术和免疫印迹方法检测了家蚕中肠细胞在饥饿、雷帕霉素处理、高低温度冲击1h后的BmAtg基因及BmATG8蛋白表达，发现在饥饿处理后24h，BmAtg8基因表达显著上升，免疫印迹条带也显示了BmATG8蛋白表达增加的同步性，此时BmATG8的转化效率也明显升高，说明在饥饿条件下自噬被诱导。雷帕霉素处理后未发现BmAtg基因及BmATG8蛋白表达的显著变化，可能是因为该药物的主要作用被家蚕活体中的基础自噬水平所掩盖，药物的刺激没有诱发更高水平的自噬。高低温冲击能激发机体的调节机制来适应环境温度，本试验仅发现在37°C高温处理1h后BmATG8的转化效率下降。本试验使用的极端温度处理时间较短，可能家蚕中肠BmAtg基因对温度应激的反应尚未出现，对于温度应激对家蚕自噬机制的作用，还需进一步分析。 42家蚕自噬基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究第五章BmCPV病毒感染的病理特征与切片分析5.1材料与方法5.1.1家蚕CPV病毒攻毒方法试验动物同3.1.1。家蚕CPV病毒收集：质型多角体病毒由本试验室保存，取适量病毒多角体喂食4龄起蚕，使病毒复壮和增殖。取5龄具有典型中肠型脓病的家蚕，剖取中肠，除去围食膜等内容物，加0.9%生理盐水冲洗2次，放在研钵中，加入0.01MpH7.8的磷酸缓冲液(0.2M磷酸二氢钠7mL与0.2M磷酸氢二钠93mL混合，再稀释20倍)，研磨成悬浊液，再用纱布过滤除去组织碎片等(李忠平etal.1981)。收集得到的多角体悬液使用生理盐水漂洗2次，2000r/min离心5min，弃上清，沉淀用少量生理盐水溶解，即得浓度较高的病毒多角体悬液，显微镜下用血细胞计数板检测和计算多角体浓度。CPV病毒攻毒方法：家蚕饲养到4龄，随机选取试验组和参照组家蚕各150头，每头蚕单独饲养在一个培养皿中。光学显微镜下观察和计算多角体浓度，使用0.9%生理盐水将病毒多角体稀释到1×108个/mL，将10μL病毒多角体涂在切好的大小约1cm2的桑叶背面，稍微晾干几分钟后单独饲喂给每头蚕，使每头蚕食入多角体数量约为1×106个，等蚕吃完病毒桑叶后再添加新鲜桑叶，选择吃的较为完全的家蚕作为试验对象。参照组家蚕添食等量的生理盐水，添食生理盐水方法和添食病毒法相同，添食后正常饲喂并按计划时间点剖取中肠样品。5.1.2主要仪器和试剂同3.1.2。石蜡切片制备使用RM2235型莱卡切片机(German)完成，电镜照片采集使用JEOL-1230型透射电子显微镜(Japan)。5.1.3家蚕感染CPV病毒后的体重测定病毒感染组和对照组各30头家蚕在感染病毒前称量体重，饲养至病毒感染后第9天再次称量体重，比较病毒感染前后的变化。解剖病毒感染第9天的家蚕，观察中肠形态，并取正常家蚕中肠作为对照。5.1.4家蚕CPV感染后中肠基因组DNA的降解检测在病毒感染后的0h、24h、48h、72h、96h、120h、144h分别剖取病毒组和参照组家蚕中肠组织各2份，用于分析家蚕中肠基因组DNA的降解。使用酚-氯仿法提取中肠组织基因组DNA(步骤详见附录)，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性。 第五章BmCPV病毒感染的病理特征与切片分析435.1.5家蚕CPV感染后病毒RDRP基因的RT-PCR分析在CPV病毒感染家蚕后的2h、4h、8h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、96h、120h、144h分别剖取CPV感染组和参照组家蚕中肠组织各6份，液氮速冻后放于-80°C冰箱。分别提取感染组和参照组家蚕中肠组织的总RNA，测定RNA浓度并稀释至200ng/μL，反转录为cDNA(步骤详见附录)，作为病毒RDRP基因PCR扩增检测的模板。为了确定家蚕CPV病毒基因在感染后的复制规律，本试验选择病毒基因组中的S2片段(编码病毒RDRP蛋白，GenBank登录号：AY496445)为目的基因设计引物，扩增片段长度为215bp，引物序列如下：上游引物：5′-CTCAGGGTAAACAAGCAGG-3′下游引物：5′-GACTTCCACATTCTTAGCGT-3′将上述引物和cDNA模板按照如下比例配成20μL的PCR反应体系：2×GoldStarTaqMasterMix10μL上游引物(10μM)1μL下游引物(10μM)1μLcDNA模版200ng超纯水加至20μL执行以下PCR反应程序：95°C预变性3min95°C变性30s55°C退火30s20循环72°C延伸30s72°C延伸10min，4°C保存。扩增产物使用1%琼脂糖凝胶电泳检测。5.1.6家蚕中肠石蜡切片的HE染色分析用于苏木精-伊红染色(Hematoxylin-Eosinstain，HE)观察的样本，在病毒感染后的24h、48h、72h、96h、120h、144h分别剖取CPV感染家蚕和参照组家蚕的中肠组织各3份，生理盐水冲洗后迅速放入新鲜配制的10%中性甲醛固定液固定，4°C过夜固定。将固定好的中肠组织制作成石蜡切片，步骤如下：(1).脱水：中肠组织首先进行梯度脱水，70%、80%、90%各浸泡1次，每次30min，再放入95%、100%乙醇浸泡各2次，每次20min。(2).透明：样品放入100%乙醇和二甲苯各半的混合液15min，然后放入二甲苯2次，每次15min(至透明为止)。(3).浸蜡：在55-60°C烘箱中，把样品放入二甲苯和石蜡各半的混合液15min，再放入纯石蜡中浸透2次，每次60min。 44家蚕自噬基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究(4).包埋：取少量融化的石蜡倒入包埋盒中，保持石蜡为液态，用预热好的镊子把浸透好的中肠组织放入包埋盒，摆好方向，轻轻倒入融好的石蜡，自然冷却。(5).切片：包埋好的样品使用石蜡切片机(莱卡RM2235型)切成4μm厚度的薄片，用毛笔将薄片放入预热的40-45°C蒸馏水中。(6).贴片：取洁净的载玻片，使用其中间位置以与石蜡切片成30-45度角轻提玻片，使石蜡切片贴在玻片上，60°C烘干30min。(7).脱蜡复水：石蜡切片连同架子一起放入预热至60°C的水浴锅中，保持30min至蜡融化。然后使用二甲苯脱蜡2次，每次5-8min，再依次放入100%、95%、90%、80%、70%梯度乙醇溶液中5-8min，最后放入蒸馏水中5min。(8).HE染色：先放入苏木精染液中染色8-10min，自来水轻轻冲洗返蓝约10-15min，使用含有1%盐酸的乙醇溶液分化10s，然后再次使用自来水轻轻冲洗直至蓝色恢复，50%、70%、80%乙醇各保持3min，再用0.5%伊红乙醇液对比染色1-3min。(9).脱水透明：切片放入100%乙醇中3-5min，再用二甲苯浸泡2次，每次3-5min。(10).封片观察：使用二甲苯稀释的中性树胶作为封片剂，滴加到玻片上，盖上盖玻片，在普通光学显微镜下观察和拍照。5.1.7家蚕中肠组织石蜡切片的免疫组化分析石蜡切片的制作同5.1.5中的第1-6步骤，之后的免疫组化(Immunohistochemistry)步骤如下：(1).脱蜡：石蜡切片使用二甲苯浸泡脱蜡2次，每次10min。(2).水化：玻片放入梯度乙醇溶液水化，100％乙醇、95％乙醇(2次)、80％乙醇，每次5s。用PBS(pH7.4)清洗3次，每次5min。(3).抗原修复：浸没在0.01mol/L的柠檬酸-柠檬酸盐缓冲液中，微波加热3min，PBS清洗3次，每次5min。(4).添加含0.3％过氧化氢的甲醇200uL，在黑暗中的室温下搅拌孵育15min。然后用PBS清洗3次，每次5min。(5).封闭：使用山羊血清(0.1mg/mL)封闭20min。(6).一抗杂交：浸入BmATG8多克隆抗体，4°C孵育过夜。然后用PBS清洗3次，每次5min。20%蛋清孵育30min，去除内源性生物素。(7).二抗标记：使用UltrasensitiveS-P超敏试剂盒(福州迈新)在室温下滴加生物素标记的第二抗体，孵育10min，PBS清洗3次，每次5min。然后滴加耦合过氧化物酶的链霉菌抗生物素蛋白，室温下孵育10min，PBS清洗3次，每次5min。(8).显色：用DAB检测试剂盒显色5-10s，添加蒸馏水停止显色。(9).苏木精染色：苏木精染液染色30s，PBS缓冲液洗涤5min。(10).脱水：80％乙醇、95％乙醇(2次)、100％的乙醇、二甲苯(2次)，每次2min。 第五章BmCPV病毒感染的病理特征与切片分析45(11).封片观察：将60％的中性树脂(溶于二甲苯)滴在样品上，盖上盖玻片，在XSZ-HS7光学显微镜下观察和拍照。5.1.8家蚕中肠组织的透射电镜切片观察收集透射电子显微镜(Transmissionelectronmicroscopy,TEM)样本，在病毒感染后的4h、8h、12h、16h、20h、24h分别剖取3头CPV感染家蚕和参照组家蚕的中肠组织并迅速放入2.5%戊二醛固定液(电镜专用，使用0.1mol/LpH7.2的PBS缓冲液稀释)固定，4°C固定24h。取出固定的家蚕中肠组织，制备透射电子显微镜样品，制样程序如下：(1).固定后漂洗：用0.1M/L，pH7.2的PBS缓冲液漂洗，5min、10min、15min、20min、25min、30min各洗一次。(2).锇酸固定：用1%锇酸4°C下固定2h。(3).漂洗：如步骤1。(4).脱水：用30%、50%乙醇脱水各一次，每次15min，之后放在70%的乙醇中过夜(第1天)，次日再用80%、90%乙醇脱水各一次，每次20min，接着用100%乙醇脱水两次，每次30min，最后用100%的丙酮脱水两次，每次30min。(5).渗透：首先使用比例为树脂(Epon812)：丙酮=1:3的渗透液渗透2h；其次使用树脂：丙酮=1:1的渗透液渗透5h；然后用树脂：丙酮=3:1的渗透液渗透12h(即封上封口膜放入摇床过夜)(第2天)；最后再使用纯树脂渗透两次，每次24小时(第3、4天)。(6).包埋：放入30°C的烘箱烘干24小时(第5天)。(7).调换温度：将温度有30°C掉换成60°C继续烘干24小时(第6天)。(8).抠出胶粒，样品制备完毕(第7天)。(9).制备好的样品经过刀片修割后使用超薄切片机切成60-70nm的薄片，切片固定后进行醋酸铀-柠檬酸铅双染色，然后使用透射电子显微镜(JEOL-1230,Japan)在80kV下观察并拍照。5.2结果与分析5.2.1家蚕BmCPV病毒感染后的病理特征相比于正常家蚕，感染了CPV的家蚕表现为发育迟缓、体形瘦小，最终死亡。家蚕的体重比较可以看出感染CPV的家蚕体重增长受到抑制(图5-1)，病毒感染阻碍了肠道的消化吸收功能。研究表明CPV病毒编码的蛋白本身并没有毒性，导致家蚕死亡的直接原因是病毒的无限制繁殖耗尽了家蚕中肠内的基因和蛋白组分，家蚕中肠丧失消化吸收功能，机体营养代谢失调而死。 46家蚕自噬基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究3.52.713.02.5*(g)参照组1.332.0病毒感染组1.5家蚕体重1.00.290.310.50.0第1天第9天图5-1病毒感染后第1天和第9天的参照组和CPV感染组家蚕的体型与体重比较。左：正常家蚕，右：病毒感染家蚕。Figure5-1ComparisonofSilkwormbodyweightbetweenthecontrolsandCPVinfectiongroupatthe1stand9thdayafterinfection.L:normal;R:BmCPVinfected.家蚕中肠组织的解剖观察发现，正常家蚕中肠呈浅绿色，富有弹性，而CPV感染家蚕后第9天的中肠组织呈乳白色，质地较脆，中肠后部有白色褶皱，这是家蚕质型多角体病的典型病症之一(图5-2)。取被感染家蚕中肠组织放于玻片上压片观察，可看到大量聚集成团或零散的病毒多角体(第七章图7-1)。图5-2家蚕5龄第3天中肠组织，左：正常家蚕，右：CPV感染家蚕Figure5-2Silkwormmidguton5thinstarstageday3,L:normal,R:CPVinfected 第五章BmCPV病毒感染的病理特征与切片分析475.2.2家蚕CPV感染后中肠组织基因组DNA的降解家蚕感染CPV后中肠基因组DNA降解分析表明，病毒感染后的96h以内，中肠细胞的细胞核还保持着相对完整。家蚕感染CPV后120h，中肠组织基因组DNA发现有明显的降解现象(图5-3，右)，提示了家蚕中肠细胞核已经受到破坏，导致核内的基因组DNA发生不同程度的浓缩和降解，而正常家蚕中肠基因组DNA则相对完整(图5-3，左)。结合中肠组织的HE染色图片可见，病毒感染120h后中肠组织内有大量病毒多角体聚集于细胞内部，细胞出现破裂和溶解。图5-3家蚕感染CPV病毒后中肠基因组DNA电泳图，左：正常家蚕，右：CPV感染家蚕Figure5-3ElectrophoresisofsilkwormmidgutgenomicDNAafterCPVinfection,L:normal,R:CPVinfected.5.2.3CPV病毒感染后RDRP基因的增殖BmCPV的基因组由10条独立的双链RNA片段组成，其中RDRP基因编码依赖于RNA的RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase,RDRP)，该酶是病毒转录和复制过程中的重要酶，RDRP基因在BmCPV基因组中的长度排列第二，因此常以S2片段表示，该基因的增殖可以反映出BmCPV侵染家蚕的不同阶段。虽然有证据表明在家蚕食下BmCPV病毒多角体后的3h，中肠内部的电镜照片已经可以看到病毒的侵入(Liuetal.2012)，但是病毒开始复制的具体时间尚不清楚，推测与蚕体的生理状态以及病毒感染量有关系。本试验发现在BmCPV感染家蚕后24小时，病毒RDRP基因已经可以被检测到，提示此时病毒已经开始了复制(图5-4)。并且随着时间的增加，该基因的表达量也有了明显升高，在感染后72小时，RDRP基因可以被轻易检测到，而这个时间可以明显地观察到病毒形成的多角体(见HE染色结果，图5-5)，提示此时是病毒繁殖高峰期，同时伴随着多角体的大量形成。 48家蚕自噬基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究图5-4质型多角体病毒感染4龄起蚕后中肠组织内病毒RDRP基因的增殖Figure5-4ProliferationofviralRDRPgeneafterBmCPVinfectiononsilkwormatthebeginningof4thinstarstage.5.2.4家蚕中肠石蜡切片的HE染色结果HE染色试验结果发现从家蚕感染CPV病毒后72h，中肠组织被病毒多角体充满，推测多角体的初步形成是在72h之前，但是此时中肠组织内的柱状细胞还相对完整(图5-5)。随着病程的增加，在感染后120h，多角体逐渐增多造成中肠组织内的柱状细胞出现严重的核浓缩和细胞破裂，几乎找不到染色后的核内遗传物质，从图5-3也可以看出此时中肠细胞基因组DNA开始降解，而正常家蚕中肠组织形态则始终保持完整。参照组家蚕病毒感染家蚕ControlsBmCPVinfection24h48h 第五章BmCPV病毒感染的病理特征与切片分析4972h96h120h144h图5-5家蚕中肠组织石蜡切片的HE染色图，gc：杯状细胞，cc：柱状细胞，cp：病毒多角体。Figure5-5ParaffinsectionofsilkwormmidguttissuebyHEstaining,gc:gobletcell;cc:columnarcell;cp:CPVpolyhedra.5.2.5家蚕中肠组织中BmATG8蛋白的免疫组化定位利用第3章中获得的多克隆抗体进行了免疫组化分析，发现家蚕内源的BmATG8/BmATG8PE蛋白主要分布在细胞质中，DAB染色后呈现棕色(图5-6)，柱状细 50家蚕自噬基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究胞的胞核部分呈现蓝色，杯状细胞内部形成空泡，这可能和它的分泌功能相关。免疫组化技术也可以粗略确定家蚕BmATG8蛋白表达在整个CPV病毒感染病程中变化趋势，这部分试验由本试验室的吴永鹏同学完成(吴永鹏2014)。参照组病毒感染组NegativecontrolBmCPV-infected4h8h12h16h 第五章BmCPV病毒感染的病理特征与切片分析5120h24h图5-6家蚕中肠石蜡切片的免疫组化分析，gc：杯状细胞，cc：柱状细胞。Figure5-6Immunohistochemicalanalysisofsilkwormmidgutparaffin,gc:gobletcell;cc:columnarcell.5.2.6家蚕中肠组织中的自噬体观察使用透射电子显微镜技术，在家蚕中肠组织中观察到了溶酶体和自噬体结构，二者均包含有待降解的内容物，自噬体呈现出双层或多层膜结构(图5-7)。 52家蚕自噬基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究图5-74龄第一天家蚕中肠细胞内通过透射电子显微镜观察到的典型自噬体特征。自噬体(A、B：a)；自噬溶酶体(C、D：al)；溶酶体(E：l)；髓鞘状结构(F：箭头)。标尺：A,B,D,E,F0.2μm;C0.1μm.Figure5-7Representativeautophagicfeaturescanbedetectedinsilkwormlarvalmidgutcellson4thinstarstageday1byusingTEM.Autophagosomes(A,B:a),Autolysosomes(C,D:al)andLysosomes(E:l)wereobservedinthecytoplasmofmidgutcells.Myelin-likestructures(F:arrow)thatcontainwhorlsofmembranescanalsobeobserved.Bars:A,B,D,E,F0.2μm;C0.1μm.家蚕幼虫从化蛹前期到化蛹期的中肠组织内部可以观察到一些自噬现象，如BmATG8蛋白的表达增加等(Franzettietal.2012)。而本试验则从4龄第一天家蚕幼虫的中肠组织内观察到了典型的自噬体结构(图5.7：A，B)，其特征为双层膜或多层膜结构包裹着待降解的内容物，自噬体进一步与溶酶体结合形成了自噬-溶酶体(图5.7：C，D)，同时细胞内也能看到溶酶体(图5.7：E)，也包含有待降解的内容物，这表明自噬机制不仅仅在家蚕的变态发育期发挥作用，而在家蚕幼虫的生长期同样存在调节功能。5.3讨论与小结5.3.1讨论目前生产上家蚕中肠型脓病的防治主要以预防为主，诊断技术也相对落后，主要通 第五章BmCPV病毒感染的病理特征与切片分析53过肉眼判断典型症状。有学者利用血清学、酶联抗体、胶乳凝集反应单克隆抗体法诊断家蚕病毒病，但它们存在不同的缺陷，如有的准确性低、有的无法定量、有的操作烦琐等，因此一种基于BmCPV多角体蛋白基因的荧光定量PCR检测方法经试验验证，被认为是一种可以快速、准确检测家蚕质型多角体病毒感染的方法，并且可以应用在早期阶段及流行性调查(吴萍etal.2013)。这种检测方法也被运用于家蚕核型多角体病毒(Bombyxmorinuclearpolyhedrosisvirus,BmNPV)、马尾松毛虫质型多角体病毒(DendrolimusspectabilisCytoplasmicpolyhedrosisvirus,DsCPV)等的检测(姚勤etal.2005;赵同海etal.2001)。孙京臣的研究发现在CPV病毒感染12h、24h，圆筒形细胞中发现了病毒发生基质以及子代病毒，同时认为该病毒只感染中肠圆筒形细胞(孙京臣etal.2006)，未曾提示病毒基因开始大量增殖的时间。本试验先用肉眼和显微镜检测确定了BmCPV的病毒株，然后使用RT-PCR技术确定了病毒RDRP基因的增殖情况，认为病毒基因的复制是在病毒食下后的24h以内。BmCPV对家蚕的致死原因尚有争议，可以肯定的是病毒的大量繁殖给家蚕造成了中肠的代谢负担，许多家蚕的蛋白和氨基酸残基被包裹进入多角体，从而使中肠无法行驶正常功能，而病毒本身不产生毒性蛋白(张轶岭etal.2011)。家蚕死亡后，中肠细胞内形成的多角体脱离宿主，将会进行新一轮的感染。本试验的家蚕中肠基因组DNA检测也可以看出，直到CPV感染后的120h，中肠基因组才发生降解，而此时病毒多角体早已充满了中肠组织，因此认为导致家蚕死亡的直接原因是CPV多角体以竞争性使用家蚕体内的蛋白为作用方式，过量的多角体聚集在胞质中阻碍了肠细胞功能的发挥，使蚕体缺乏相应的营养而逐渐萎缩，直至死亡。5.3.2小结本试验分析和确认了BmCPV感染后家蚕的典型病症，使用RT-PCR技术检测了病毒RDRP基因在整个病程中的增殖规律，认为病毒基因在病毒食下后24h之前即开始自我复制，在72h后病毒基因组可以很容易地被检测到。通过中肠石蜡切片的HE染色发现，家蚕感染CPV病毒72h时病毒多角体大量形成，此后多角体逐渐增多，柱状细胞出现严重的核浓缩和细胞破裂，结合家蚕中肠基因组DNA降解结果，认为家蚕中肠细胞破裂和溶解性死亡的高峰时间发生在120h左右。BmATG8/BmATG8PE蛋白是自噬检测的标志性蛋白，免疫组化试验证实了家蚕内源BmATG8/BmATG8PE蛋白广泛分布在细胞质中，且自噬体在家蚕4龄即可被观察到，因此认为自噬机制在家蚕的生长发育中是不可或缺的组成部分，后续的试验分析表明自噬在家蚕受到病毒感染时也发挥着重要作用。 54家蚕自噬基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究第六章BmCPV病毒感染影响家蚕中肠Atg基因表达6.1材料与方法6.1.1试验动物与病毒感染试验动物同5.1.1。家蚕病毒感染后全病程的中肠样本采集同5.1.4。另外，通过第5章的试验和相关电镜研究结果(Tanetal.2003)，我们认为CPV病毒在被家蚕食入的第一天内，即入侵中肠细胞并开始复制病毒基因，病毒离子进入中肠的时间约在4h左右，病毒基因开始复制的时间则在24h之前就已经开始。因此，为了探明家蚕自噬基因BmAtg8及其编码蛋白BmATG8在CPV病毒入侵早期(24h内)对病毒的应答效应，本试验分别选择4龄和5龄健康家蚕，使用5.1.1节中同样的感染方法和剂量接种了150头家蚕，挑取吃的比较完全的家蚕作为试验对象，分别在感染后的0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h剖取中肠样品各12份，液氮速冻后保存于-80°C冰箱。6.1.2主要试剂和仪器同3.1.2。6.1.3RT-PCR测定家蚕病毒感染后的Atg基因表达Trizol法提取病毒感染后不同时间点收集的病毒组和参照组家蚕中肠组织总RNA，确定浓度后反转录成cDNA(步骤详见附录)，以此cDNA为模版进行Atg基因的qRT-PCR分析。实时定量PCR试验所用PCR引物、反应体系、反应程序、数据统计和差异显著性检验和3.1.3相同。6.1.4WesternBlot检测家蚕病毒感染后BmATG8蛋白表达家蚕中肠组织总蛋白提取、SDS-PAGE电泳、WesternBloting杂交、免疫印迹条带亮度分析、显著性检验同3.1.6。6.2结果与分析6.2.1家蚕Atg基因在CPV感染病程中的表达本试验中CPV感染病程是指从家蚕食下病毒多角体到出现严重中肠病变几近死亡的这段时间，即感染后的144h内。图6-1显示在家蚕感染CPV病毒后的2h、4h、48h、120h、144h，被感染的家蚕中肠组织BmAtg8基因表达下降，而在24h、60h时BmAtg8基因表达却高于参照组家蚕。结合HE染色结果及免疫组化结果，可知当病毒多角体被家蚕食下，释放出的病毒离子进入中肠细胞时(2h、4h)，病毒首先抑制了BmAtg8基因的转录表达，以利于自身的存活。而当病毒基因开始利用家蚕机体的材料组装自己的基因时(24h前)，家蚕上调 第六章BmCPV病毒感染影响家蚕中肠Atg基因表达55了BmAtg8基因的表达以应对病毒感染。病毒感染后48h，BmAtg8基因表达再次下降，而在之后的60h，是病毒多角体开始形成的时间(吴永鹏2014)，家蚕表现出上调BmAtg8基因表达以应对病毒多角体形成。此后的120h和144h，即病毒基因迅速繁殖和形成大量多角体以后，BmAtg8基因表达又处于抑制状态。由于到了CPV病毒感染后期，即病毒大量繁殖，家蚕机体免疫能力下降可能导致其他病菌的同步繁殖和继发性的机体功能障碍，因此本试验选择在病毒感染的初期(24h内)内利用qRT-PCR和WB两种方法来确定病毒食下和病毒基因复制对BmAtg8基因转录表达以及BmATG8蛋白表达是否有影响(6.2.2节和6.2.3节)。1.4CPV感染组*1.2参照组**10.8***0.6*基因的相对表达0.4Atg80.202h4h8h12h24h36h48h60h72h96h120h144hBmCPV感染后的时间图6-1家蚕感染CPV病毒后中肠组织BmAtg8基因的表达规律，*：差异显著。Figure6-1BmAtg8geneexpressionpatternsinsilkwormmidgutafterCPVinfection,*:significantdifference.从图6-2可以看出被感染的家蚕中肠组织BmAtg5基因在感染CPV病毒后的2h、12h出现表达下调，而在24h、36h、60h、144h时表达上升。在家蚕自噬通路的泛素样途径中，ATG5的主要功能是参与形成ATG6/5/12G复合体，用于形成前自噬复合体结构(Preautophagosomalstructure，PAS)，该结构和ATG8PE一起被定位于的自噬体膜(Zhangetal.2009)，因此在家蚕感染CPV病毒的初期，该基因的表达和BmAtg8基因有相似之处。0.06CPV感染组0.05参照组*0.040.03**基因的相对表达0.02*Atg50.0102h4h8h12h24h36h48h60h72h96h120h144hBmCPV感染后的时间图6-2家蚕感染CPV病毒后中肠组织BmAtg5基因的表达规律。Figure6-2BmAtg5geneexpressionpatternsinsilkwormmidgutafterCPVinfection. 56家蚕自噬基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究家蚕感染CPV后BmAtg7基因的表达则出现了明显的上升(图6-3)，仅仅在病毒感染后24h、48h表现为差异不显著，这提示了BmAtg7基因在病毒感染中具有的识别和应对功能。在泛素样自噬通路中，ATG7蛋白的主要作用是激活组织内泛在的ATG8蛋白，使其成为活性形式的ATG8PE。说明在病毒感染后，BmAtg7基因表达上升，家蚕机体表现出提供更多的ATG8PE活性蛋白来形成自噬体以降解入侵的病毒。0.016**CPV感染组0.014参照组0.012**0.01**0.0080.006基因的相对表达*0.004***Atg70.00202h4h8h12h24h36h48h60h72h96h120h144hBmCPV感染后的时间图6-3家蚕感染CPV病毒后中肠组织BmAtg7基因的表达规律。Figure6-3BmAtg7geneexpressionpatternsinsilkwormmidgutafterCPVinfection.6.2.2家蚕BmAtg8基因在CPV感染初期的表达为了阐明家蚕在感染CPV病毒后BmAtg8基因的调节机制，本试验分别使用4龄和5龄起蚕接种病毒，研究BmAtg8基因在感染24h内的变化。从图6-4可以看出，BmAtg8基因在4龄家蚕CPV感染后4h表达下降，而在24h表达上升，与图6-1中所示的规律一致。0.6*CPV处理组0.5参照组0.4*0.3基因相对表达0.20.1Atg800h4h8h12h16h20h24hCPV感染4龄眠起家蚕后时间图6-44龄起蚕感染CPV病毒后中肠组织BmAtg8基因的表达规律Figure6-4BmAtg8geneexpressioninmidgutof4thinitialinstarsilkwormafterCPVinfection.5龄家蚕的感染试验则与4龄家蚕不同，BmAtg8基因在感染CPV后4h、8h、12h、20h均呈现下调表达，提示自噬水平降低，病毒的食下感染抑制了BmAtg8基因转录图6-5。 第六章BmCPV病毒感染影响家蚕中肠Atg基因表达570.6CPV感染组0.5**参照组0.4*0.3基因相对表达0.2*0.1Atg800h4h8h12h16h20h24hCPV感染5龄眠起家蚕后时间图6-55龄起蚕感染CPV病毒后中肠组织BmAtg8基因的表达规律Figure6-5BmAtg8geneexpressionpatternsinmidgutof5thinitialinstarsilkwormafterCPVinfection.综合4、5龄起蚕对病毒感染的反应，可以认为CPV病毒的早期入侵和基因复制和BmAtg8基因转录表达是相互对立、相互排斥的。6.2.3家蚕BmATG8蛋白在CPV感染初期的表达通过免疫印迹杂交，获得了CPV病毒感染5龄起蚕后早期(4-24h内)中肠组织BmATG8/BmATG8PE的免疫印迹条带，并对条带的灰度值进行了比较(图6-6A)。B50比值40CPV感染家蚕参照组30*20*10BmATG8PE/BmATG804h8h12h16h20h24h家蚕感染CPV病毒后时间图6-6CPV病毒感染后4-24h的中肠组织ATG8-PE/ATG8蛋白的免疫印迹图，A：免疫印迹条带；B：基于图A的ATG8-PE/ATG8灰度值比值。Figure6-6ATG8-PE/ATG8blotsoftotalmidgutproteinsat4–24hafterCPVinfection.A:ResultsofWesternblot;B:ATG8-PE/ATG8ratiobasedontheGrayvalueofblotsinFigure6-6A. 58家蚕自噬基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究条带亮度分析结果发现在处理后的4h和16h，病毒感染家蚕BmATG8PE/BmATG8比值比参照组显著升高(图6.6B)。4h是病毒离子刚刚进入中肠上皮细胞的时间，而16h是病毒基因组复制开始的早期，分析原因可能是家蚕中肠细胞内自噬机制对病毒的入侵具有识别效应，且在病毒基因复制早期，提高了BmATG8蛋白的转化效率，目的是为了阻碍病毒入侵与复制。在自噬通路中，ATG8转化为ATG8PE需要经过ATG7修饰，因此试验中病毒处理家蚕的BmATG8PE/BmATG8比值的升高与上节中BmAtg7基因转录表达上调具有一致效应。病毒感染4龄起蚕的WB试验效果不佳，故不作分析。6.3讨论与小结6.3.1讨论较早的生理生化研究显示，家蚕感染BmCPV后，血液及中肠被膜的核酸、蛋白质、碳水化合物、游离氨基酸和尿酸均发生了变化，血糖量急剧降低，红血球凝集素的活性明显升高(Morietal.1989)。近年来，从分子水平上探讨BmCPV病毒与家蚕的相互作用和相互关系已成为该领域的研究趋势。使用新一代分子生物学技术如削减杂交技术和基因芯片技术，发现BmCPV感染引起了家蚕中肠组织一系列基因表达的变化，如关于缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸降解、视黄醇代谢和维生素B6代谢的基因呈现表达下调，而参与核糖体和蛋白酶途径的基因表达则被上调。同时丝氨酸蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶和凋亡抑制蛋白的活性出现了不同程度的降低(PingWuetal.2009;Wuetal.2011)。本试验侧重于从细胞自噬的角度探讨家蚕对CPV病毒感染的反应，自噬机制已被证明具有消除细菌或病毒入侵的功能，如自噬可以通过磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)信号通路抑制果蝇水泡性口膜炎病毒的复制，若抑制自噬，该病毒复制则会增强(Shellyetal.2009)。颅内注射辛德毕斯病毒的小鼠，当过表达Beclin-1，可导致病毒复制的下降和增加的细胞存活(Liangetal.1998)。其他与自噬具有拮抗作用的病毒还有人类免疫缺陷病毒1(HumanImmunodeficiencyVirus1,HIV-1)(Kyeietal.2009)、烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus,TMV)(Liuetal.2005)、单纯疱疹病毒1(Herpessimplexvirus1,HSV-1)(Talloczyetal.2002)等。但也有试验表明，自噬在一些病毒侵染过程中具有协同作用，自噬机制的缺陷可导致病毒基因不能复制(Espertetal.2007)，某些病毒可利用自噬机制的部分原料来优化病毒的产量，以利于自身的繁殖，如脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)(Jacksonetal.2005)、甲型流感病毒A(InfluenzaAvirus:H1N1和H9N2)(Zhouetal.2009)、冠状病毒(Coronaviruses)中的非典型肺炎病毒(SARS)和鼠肝炎病毒(mousehepatitisvirus,MHV)(Reggiorietal.2010)等。所以自噬在不同的病菌入侵过程中具有不同的作用，本试验认为中肠细胞自噬在 第六章BmCPV病毒感染影响家蚕中肠Atg基因表达59BmCPV病毒感染的早期具有一定的调节作用，当病毒入侵后和开始复制的时候，自噬基因BmAtg8表达被抑制，BmATG8转化率增加可以增强溶酶体降解部分病毒的功能，但未能阻止病毒的大规模复制。6.3.2小结通过对CPV病毒感染家蚕自噬相关基因的表达的检测，发现BmAtg8基因在4龄起蚕感染CPV病毒后4h表达下降，而在24h表达上升，BmAtg5基因表达趋势和BmAtg8相似，BmAtg7基因在家蚕感染CPV后表达上升。免疫印迹检测发现CPV病毒感染5龄家蚕后，提高了中肠组织BmATG8蛋白转化为BmATG8PE的效率，这与BmAtg7基因转录表达上调效应相一致，认为中肠细胞自噬在BmCPV病毒感染的早期具有一定的调节作用，。 60家蚕自噬基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究第七章BmCPV病毒多角体的性质分析7.1材料与方法7.1.1家蚕CPV病毒的培养和收集家蚕CPV病毒收集同5.1.1。取少量染病家蚕中肠组织和纯化后的病毒多角体悬液置于载玻片上，盖玻片覆盖，在光学显微镜下观察病毒多角体的形态特征。所用试剂和仪器同3.1.2。7.1.2病毒基因组RNA的提取纯化后的病毒多角体悬液使用Trizol试剂处理(步骤详见附录)，提取病毒基因组RNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测。利用Takara公司的反转录试剂盒将病毒RNA反转录成cDNA(步骤详见附录)。7.1.3多角体蛋白基因片段分析参照GenBank上的BmCPV病毒S10片段序列(登录号：M19112.1)设计引物：上游引物：5'-CGGAATTCATGGCAGACGTAGCAGG-3'，下划线部分为EcoRⅠ酶切位点。下游引物：5'-GCGTCGACTCACTGACGGTTACTCAGAG-3'，下划线部分为SalⅠ酶切位点。使用上节获得的病毒cDNA模板，扩增病毒基因S10片段的编码区，反应体系和反应程序同3.1.4。扩增产物使用1%琼脂糖凝胶电泳检测，使用胶回收试剂盒回收，同时送南京金斯瑞科技有限公司测序鉴定。7.1.4基于氨基酸序列的多角体蛋白进化分析同3.1.6。7.1.5pET28-S10重组载体构建和多角体蛋白表达分别使用EcoRⅠ和SalⅠ内切酶双酶切S10基因产物和pET28a质粒(质粒图谱见附录)，双酶切体系、步骤及连接后的转化、单克隆筛选步骤同3.1.4。重组获得的pET28-S10质粒经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切鉴定，1%琼脂糖凝胶电泳检测，同时进行测序鉴定。使用3.1.4中的蛋白诱导表达方法获得多角体蛋白，因pET28a质粒含有卡那霉素抗性蛋白位点(Kanamycin)，故采用卡那霉素作为重组质粒筛选和蛋白表达的抗生素。诱导表达5mL重组多角体蛋白菌液，反复冻融破裂菌体细胞，使用蛋白提取试剂盒提取菌体总蛋白。 第七章BmCPV病毒多角体的性质分析617.1.6多角体的解离和包埋性质分析由于病毒多角体在碱性环境中能够解离并释放出病毒离子，因此使用pH10.0的0.1M碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液按照2：1、1：1和1：2的比例与病毒多角体悬液混合，即使用100μL碱溶液+50μL多角体悬液、75μL碱溶液+75μL多角体悬液、50μL碱溶液+100μL多角体悬液三种混合体系。使多角体在4°C下解离6h、24h，使用血球计数板统计碱性缓冲液处理后病毒多角体的浓度。将0.9%生理盐水按照同等比例稀释病毒多角体悬液作为参照，即使用100μL生理盐水+50μL多角体悬液、75μL生理盐水+75μL多角体悬液、50μL生理盐水+100μL多角体悬液三种体系，同样放置6h、24h，统计生理盐水稀释后的多角体浓度，即可计算获得病毒多角体经碱处理后的解离率(解离比例)，计算公式为：多角体解离率=(1-碱处理后多角体浓度/同比稀释后的多角体浓度)×100%按照碱溶液：多角体悬液=1:1的比例混合，即75μL碱溶液+75μL多角体悬液，4°C下解离24h后，统计解离率(命名为A体系，150μL)。然后向体系A中加入与碱溶液等摩尔效应的HCl(使用1M的HCl，加入11.25mL)，再加入7.1.4提取的菌体蛋白溶液(含大量多角体蛋白)使原体系A体积达300μL，轻轻混匀，室温下静置6-24h(命名为体系B)，光学显微镜下统计体系B的多角体浓度，此操作目的是确定解离后的病毒离子能否在去除碱性环境后并有大量多角体蛋白存在的条件下是否能够重新被包埋形成多角体。7.1.7病毒多角体解离后的致病时间分析采用碱溶液按1:1体积比处理24h后的多角体悬液(200μL碱溶液+200μL多角体悬液)感染家蚕30头，以生理盐水按1:1体积比稀释相同的多角体悬液感染家蚕30头。统计被感染家蚕的致病时间和死亡时间，比较两种多角体悬液感染家蚕后的致病效率。7.2结果与分析7.2.1病毒多角体的形态从具有典型中肠型脓病的家蚕中肠组织内可以看到大量的病毒多角体，经过纯化后得到了较为纯净的BmCPV病毒多角体(图7-1)。图7-1光学显微镜下的质型多角体形态。A：发病家蚕中肠细胞压片直接观察；B：经过纱布过滤的病毒多角体。 62家蚕自噬基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究Figure7-1CPVpolyhedraundertheopticalmicroscope.A:CPVpolyhedrapickedfromsilkwormmidgutdirectly;B:CPVpolyhedrafilteredthroughgauze.7.2.2CPV病毒多角体蛋白基因S10片段分析提取获得了家蚕CPV病毒的基因组RNA，1%琼脂糖凝胶电泳可以分辨出相应的RNA片段(图7-2)，与综述部分图2.2相似。图7-2家蚕质型多角体病毒基因组RNA凝胶电泳图Figure7-2GelelectrophoresisofBmCPVgenomeRNA.CPV病毒多角体蛋白基因(S10)全长944bp，包含一个744bp的开放阅读框(ORF)，编码长度为248个氨基酸残基的多角体蛋白，预测分子量为28.46kDa，等电点为7.12(孟祥坤2010)。本试验通过PCR反应获得了多角体基因S10片段的CDS区序列，加上酶切位点的全部序列长度为763bp(图7-3)。图7-3多角体蛋白基因编码区扩增结果Figure7-3PCRResultofpolyhedringenecodingregion.通过测序获得了CPV病毒陕西株的S10片段的ORF序列，并翻译获得了多角体蛋白的氨基酸序列(见附录)。在NCBI网站上经BLAST在线比对，发现陕西株CPV1型病毒基因S10序列和其他中国株CPV1的序列一致性最为接近，为97%(如苏州株GQ924589，台湾株HM345580)。和日本来源的CPV1序列一致性为91%左右(如株系A，B，C1，C2)。与舞毒蛾(LdCPV1)序列一致性为87%，与马尾松毛虫(DpCPV1)序列一致性为86%。 第七章BmCPV病毒多角体的性质分析637.2.3基于多角体蛋白序列的系统进化质型多角体蛋白和基因序列相对保守，因此常被用于多角体病毒间的起源进化分析。本试验从NCBI网站上下载了32条多角体蛋白氨基酸序列，序列统计见表7-1，结合此次测定得到的陕西本地CPV1型病毒株系(称作陕西株，BmCPV-Shaanxi)多角体蛋白基因预测氨基酸序列，使用MEGA5.10软件构建了N-J(Neighbor-Joining)系统进化树(图7-4)。表7-1NCBI来源的质型多角体蛋白序列Table7-1ProteinsequenceofCytoplasmicpolyhedrosisfromNCBICPV类型宿主种类NCBI登录号简写病毒株系CPVtypeHostspeciesAccessionNo.AbbreiationsVirusStrainsCPV1家蚕BombyxmoriACX54964BmCPV1-Suzhou苏州ADN52340BmCPV1-Taiwan台湾BAA07022BmCPV1-AA(Japan)BAA07023BmCPV1-BB(Japan)BAA19860BmCPV1-PP(Japan)BAA07024BmCPV1-C1C1(Japan)BAA07025BmCPV1-C2C2(Japan)AAA46694BmCPV1-CanadaCanada舞毒蛾LymantriadisparAAK73529LdCPV1USA马尾松毛虫DendrolimuspunctatusAAK01928DpCPV1武汉AAO91915DpCPV1武汉AAP33166Hunan1DpCPV1武汉AAN17827Hunan1DpCPV1武汉CPV4琥珀蚕AntheraeaassamensisAAP44509AaCPV4India柞蚕AntheraeamylittaAAP44507AmCPV4India柞蚕AntheraeapernyiAAP44510ApCPV4IndiaCPV5棉铃虫HeliothisarmigeraAAY96322HaCPV5武汉白切根虫EuxoascandensAAA42915EsCPV5Canada斜纹夜蛾OrgyiapseudotsugataAAA50750OpCPV5USACPV8棉铃虫HeliothisarmigeraAAA50751HaCPV8USACPV14棉铃虫HeliothisarmigeraAAY34355HaCPV14武汉烟青虫HeliothisassultaAAY96324HasCPV14武汉舞毒蛾LymantriadisparAAK73096LdCPV14USACPV15粉纹夜蛾TrichoplusianiAAF99341TnCPV15USACPV16云杉色卷蛾ChoristoneurafumiferanaAAC58535CfCPV16Canada云杉卷叶蛾ChoristoneuraoccidentalisABW87644CoCPV16AustraliaCPV17蓝带蚊UranotaeniasapphirinaAAW80667UsCPV17USACPV18冬尺蠖OperophterabrumataABB17220ObCPV18UKCPV19冬尺蠖OperophterabrumataABB17224ObCPV19UK库蚊CulexrestuansABA61432CrCPV19USACPV20蚋SimuliumubiquitumABH85367SuCPV20USACPVx按蚊CulexondAnophelesspACM79859CaCPV0507BS3新疆 64家蚕自噬基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究从多角体蛋白的进化树可以看出，BmCPV1型病毒的进化具有地域特异性，中国境内的陕西株、苏州株和台湾株亲缘关系很近，而在日本的株系A、B、C1、C2、P和加拿大株系则有较近的亲缘关系。几乎所有电泳型相同的病毒株系各自聚为一类，如马尾松毛虫、舞毒蛾与家蚕虽属于不同物种，但同属CPV1型，具有较近的亲缘关系。不同宿主的CPV可以聚为一类，说明CPV病毒的进化与宿主关系较小，但与电泳型关系更大，这也提示了CPV病毒可以在物种间横向传播。BmCPV1-Shaanxi98BmCPV1-Suzhou-ACX54964.1BmCPV1-Taiwan-ADN52340.147BmCPV1-A-BAA07022.199BmCPV1-Canada-AAA46694.1BmCPV1-C1-BAA07024.19774BmCPV1-C2-BAA07025.1BmCPV1-B-BAA07023.1BmCPV1-P-BAA19860.18699DpCPV1-AAO59393.1DpCPV1-AAK01928.181LdCPV1-AAK73529.184Hunan1DpCPV1-AAP33166.1478768Hunan1DpCPV1-AAN17827.1ObCPV18-ABB17220.199HaCPV14-AAY34355.1HasCPV14-AAY96324.198TnCPV15-AAF99341.19ObCPV19-ABB17224.199EsCPV5-AAA42915.197HaCPV5-AAY96322.199OpCPV5-AAA50750.193HaCPV8-AAA50751.199UsCPV17-AAW80667.1CrCPV19-ABA61432.199CfCPV16-AAC58535.199CoCPV16-ABW87644.198SuCPV20-ABH85367.1AmCPV4-AAP44507.180AaCPV4-AAP44509.19999ApCPV4-AAP44510.1LdCPV14-AAK73096.1CaCPV0507BS3-ACM79859.10.40.30.20.10.0图7-4基于多角体蛋白氨基酸序列的系统进化树Figure7-4Phylogenetictreebasedontheaminoacidsequenceofpolyhedrin. 第七章BmCPV病毒多角体的性质分析657.2.4pET28-S10重组载体构建通过EcoRⅠ/SalⅠ双酶切和T4连接酶的连接，筛选获得了重组质粒pET28-S10(图7-5)，测序结果也证实了病毒多角体蛋白基因S10已被正确连入质粒。重组质粒转化表达宿主菌E.coliRosseta感受态细胞后，经IPTG诱导，得到了多角体蛋白(图7-6，泳道2)。图7-5pET28-S10重组质粒的双酶切鉴定Figure7-5IdentificationofrecombinantplasmidpET28-S10bydoubledigestion.图7-6pET28-S10诱导表达后提取的菌体总蛋白SDS-PAGE检测。1：未诱导的重组质粒，2：诱导的重组质粒，M：中分子质量蛋白质Marker。Figure7-6SDS-PAGEanalysisoftotalextractedbacterialproteinsafterinductionofpET28-S10expression.1:recombinantplasmidswithoutinduction;2:recombinantplasmidsafterinduction;M:proteinMarker.7.2.5多角体蛋白缺乏体外自包装功能表7-2碱处理后CPV病毒多角体的解离率Table7-2DissociatedratioofCPVpolyhedraafteralkalitreatment多角体解离率(%)Dissociationrate多角体:缓冲液(体积比)放置6h放置24hPolyhedra:Buffer(V:V)Keepfor6hKeepfor24h2:158751:172831:27690 66家蚕自噬基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究使用pH10.0的0.1M碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液按照不同比例处理病毒多角体后，多角体发生解离并释放出病毒离子的效率如表7.2。碱性缓冲液对多角体的解离具有时间效应，时间越长，被解离的多角体比例越大。当碱性缓冲液和多角体悬液比例为1:1处理24h后，多角体解离率为83%，可达到释放绝大多数病毒离子的效果，因此本试验采用1:1的比例，处理24h作为后续试验的准备。当使用1M盐酸和重组多角体蛋白处理后，得到的体系B中的多角体浓度约为体系A的50%，说明在去除碱性环境并加入多角体蛋白后，体系B中并没有形成更多的多角体，亦即碱性环境中解离的多角体和病毒离子在缺失细胞环境条件下不具有重新包埋形成多角体的能力，可能多角体的包埋需要细胞内的某种转运机制。7.2.6病毒多角体解离提前感染时间感染致病参照试验发现碱处理对BmCPV感染能力产生影响，包裹在多角体中的CPV病毒与游离的CPV病毒感染能力不同。使用等体积的多角体和碳酸盐缓冲液混合24h后感染家蚕30头，统计发现第7天即开始出现严重的病变和死亡，家蚕总体平均死亡时间为9.9天。而用等体积的多角体与生理盐水混合液感染家蚕30头后，严重病变和死亡开始的时间是第8天，平均死亡时间为11.1天，比前者滞后了1.2天(表7.3)。可见解离的病毒致病时间有所提前，但游离的病毒在自然环境下易于失活，多角体包涵的病毒则可以长期存活。CPV病毒包裹于多角体中，类似形成一个病毒木马，该多角体被家蚕食入后，遇到家蚕肠道的碱性环境即分解开来，释放里面的CPV病毒离子，进入中肠细胞后进行病毒基因的自我复制和繁殖，最终达到损坏家蚕肠道结构并致其死亡。表7-3CPV病毒离子和多角体感染家蚕后的死亡统计表Table7-3DeathstatisticsofsilkwormafterinfectionbyCPVvirionsandpolyhedra.死亡家蚕数DeathNumber病毒感染后时间解离病毒离子正常多角体DayafterinfectionVirionsPolyhedrad741d854d954d1032d1164d1225d1356d144合计30307.3讨论与小结7.3.1讨论家蚕CPV病毒多角体从死亡的家蚕体内散落至周围环境后，在自然条件下，多角 第七章BmCPV病毒多角体的性质分析67体可以耐受严寒、高温及酶解等恶劣条件而使内部的病毒长期保持活性，直到被宿主吞食后，多角体才在昆虫肠道的碱性环境下分解，释放出病毒离子感染宿主肠道细胞(Rohrmann1986)。本试验即是使用保存数年的CPV多角体感染家蚕，使病毒复壮和增殖，经纯化后作为试验材料。由于多角体蛋白的序列比较保守，常常被用于分析CPV病毒的系统进化(吕新军etal.2008)。本试验构建了CPV病毒多角体蛋白的系统进化树，可以得知该病毒的进化影响因素主要是物种和地域，CPV病毒的14种电泳型多数分布于不同物种中，可能是CPV在物种间传播时，宿主自身的免疫功能促进了病毒的演化。如家蚕来源的CPV病毒可以感染20余种昆虫，而18种其他来源的CPV病毒可以使家蚕发病(Changetal.2003;Summers2006)。但同一宿主在感受不同来源的CPV病毒时，也可能保持原病毒的电泳型而使自身的CPV病毒多样化，如舞毒蛾和冬尺蠖均有两种电泳型的CPV。由于CPV病毒具有较高的稳定性、持久性、宿主特异性(指不直接损害天敌)，不干扰作物生理，因此具备环境友好型生物杀虫剂的开发前景。病毒离子包埋进入多角体的过程是个自发的过程，多角体蛋白在没有病毒离子的情况下可以被包埋进入多角体，可见多角体蛋白具有自主包埋特性(Morietal.1993)。位于多角体蛋白N端的α螺旋可能是其包埋的识别位点，在VP3蛋白质的N端也发现了类似的结构(Coulibalyetal.2007)，拥有类似结构的蛋白均可以被包埋进入多角体，如来源于家蚕的β-半乳糖苷酶就被包埋进入多角体，在多角体解离后该酶仍然具有活性(张轶岭2011)。本试验初步分析了多角体蛋白在没有细胞环境下的包埋能力，发现体外解离的多角体，去除碱性条件并加入多角体蛋白后未能重新形成多角体，推测多角体蛋白的包埋可能需要细胞内转运机制的协助，因而只能在活体内或细胞内部完成包埋过程。7.3.2小结试验构建了多角体蛋白基因的重组质粒pET28-S10，并通过宿主菌E.coliRosseta诱导表达得到了重组多角体蛋白。基于多角体蛋白氨基酸序列的系统进化树显示，多角体蛋白在CPV病毒进化过程中相对保守。该病毒具有交叉感染特性，以类似于“特洛伊木马”入侵的方式在昆虫中横向传播。家蚕CPV病毒多角体经碱性缓冲液处理后发生解离，解离后的病毒离子被家蚕食入后，可以很快的侵入中肠致家蚕发病，致病时间比病毒多角体提前1.2天。体外碱性溶液处理后解离的多角体，在去除碱性环境并加入多角体蛋白后，病毒离子无法重新被包埋形成多角体。 68家蚕自噬基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究第八章结论与创新点8.1结论1、通过qRT-PCR方法，检测出三个自噬相关基因BmAtg8、BmAtg5、BmAtg7在家蚕不同组织中的表达模式，在丝腺组织的相对表达最高，其次是脂肪体和中肠，在马氏管、肌肉和皮肤中相对表达水平较低。2、通过双酶切和连接试验，经单克隆筛选成功构建了pET32a-BmAtg8重组质粒，以诱导表达的重组蛋白为抗原免疫新西兰大白兔，制备了BmATG8蛋白的多克隆抗体，抗体效价经ELIAS试验评定，效价较高(1:512000)。在对家蚕组织的免疫印迹试验中，杂交显示出了BmATG8和BmATG8-PE两条蛋白条带，分别位于14kDa、12kDa的位置，对5龄家蚕各个组织的免疫印迹试验结果与qRT-PCR检测结果相一致。5龄家蚕丝腺组织第1-8天，BmATG8-PE/BmATG8比值出现显著的变化。3、基于氨基酸序列构建的系统进化树表明家蚕ATG8蛋白与其他物种的遗传距离较近，提示自噬机制的进化保守特征。4、分别使用饥饿、雷帕霉素、高低温度冲击方法处理5龄第2天家蚕，发现BmAtg8基因在饥饿处理后24h表达显著上升，WB条带也显示了BmATG8蛋白表达增加的同步性，说明在饥饿条件下自噬被诱导;雷帕霉素处理后未发现3个BmAtg基因及BmATG8蛋白表达的显著变化;37°C高温处理1h后BmATG8的转化效率显著下降，而4°C低温冲击1h未见家蚕自噬相关基因及蛋白的显著变化。5、本试验分析和确认了BmCPV感染后家蚕的典型病症，使用RT-PCR技术检测了病毒RDRP基因在整个病程中的增殖规律，多角体被食下后24h可检测到该基因，在72h后该基因大量表达。此时，中肠石蜡切片的HE染色发现有大量病毒多角体形成，此后多角体逐渐增多，柱状细胞出现严重的核浓缩和细胞破裂，家蚕中肠基因组DNA的降解出现在病毒感染后120h。6、免疫组化试验证实家蚕内源BmATG8/BmATG8PE蛋白广泛分布在细胞质中，使用透射电子显微镜观察到了家蚕中肠组织内的典型自噬体，呈现双层膜结构。7、通过对CPV病毒感染家蚕自噬相关基因的表达的检测，发现BmAtg8基因在4龄起蚕感染CPV病毒后4h表达下降，而在24h表达上升，BmAtg5基因表达趋势和BmAtg8相似，BmAtg7基因在家蚕感染CPV后表达上升。WB检测发现CPV病毒感染5龄起蚕后，提高了中肠组织BmATG8蛋白转化为BmATG8PE的效率，这与BmAtg7基因转录表达上调效应相一致，中肠细胞自噬在CPV病毒感染的初期具有一定的调节作用。8、构建获得了多角体蛋白基因的重组质粒pET28-S10，并通过宿主菌E.coliRosseta 第八章结论与创新点69诱导表达得到了重组多角体蛋白。基于多角体蛋白氨基酸序列的系统进化树显示，多角体蛋白在CPV病毒进化过程中相对保守。该病毒具有交叉感染特性，以类似于“特洛伊木马”入侵的方式在昆虫中横向传播。9、家蚕CPV病毒多角体经碱性缓冲液处理后发生解离，解离后的病毒离子被家蚕食入后，致病时间比病毒多角体提前1.2天。体外碱性溶液处理后解离的多角体，在去除碱性环境并加入多角体蛋白后，病毒离子无法重新被包埋形成多角体。8.2创新点1、首次在4龄起蚕中肠细胞内使用透射电子显微镜技术(TEM)观察到了自噬体、自噬溶酶体和溶酶体形态。2、首次确定了家蚕不同组织内自噬相关基因(BmAtg8、BmAtg5、BmAtg7)的表达情况，3个自噬相关基因在丝腺内表达量最高，其次是中肠和脂肪体，在马氏管、皮肤、肌肉中表达量少，BmATG8蛋白在不同组织中的表达和BmAtg8基因转录同步。3、首次探讨了家蚕CPV病毒感染和自噬相关基因表达及BmATG8蛋白表达的相关性，认为自噬基因在病毒感染的时候具有一定的调节功能，自噬在病毒感染的初期具有一定的调节作用。4、首次尝试了质型多角体蛋白的体外包装试验，认为质型多角体蛋白不具备在细胞环境缺失条件下的自包装功能。 70家蚕自噬基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究参考文献AbrahamMC,ShahamS.2004.Deathwithoutcaspases,caspaseswithoutdeath.TrendsCellBiol,14(4):184-93.AlRawiS,Louvet-ValleeS,DjeddiA,SachseM,CulettoE,HajjarC,BoydL,LegouisR,GalyV.2011.PostfertilizationautophagyofspermorganellespreventspaternalmitochondrialDNAtransmission.Science,334(6059):1144-7.AlvaAS,GultekinSH,BaehreckeEH.2004.Autophagyinhumantumors:cellsurvivalordeath?CellDeathDiffer,11(9):1046-8.AmerAO,SwansonMS.2005.AutophagyisanimmediatemacrophageresponsetoLegionellapneumophila.CellMicrobiol,7(6):765-78.ArellaM,LavalleeC,BelloncikS,FuruichiY.1988.Molecularcloningandcharacterizationofcytoplasmicpolyhedrosisviruspolyhedrinandaviabledeletionmutantgene.JVirol,62(1):211-7.BarthJM,SzabadJ,HafenE,KohlerK.2011.AutophagyinDrosophilaovariesisinducedbystarvationandisrequiredforoogenesis.CellDeathDiffer,18(6):915-24.BeaulatonJ,LockshinRA.1977.UltrastructuralstudyofthenormaldegenerationoftheintersegmentalmusclesofAnthereaepolyphemusandManducasexta(Insecta,Lepidoptera)withparticularreferenceofcellularautophagy.JMorphol,154(1):39-57.BesteiroS,BrooksCF,StriepenB,DubremetzJF.2011.AutophagyproteinAtg3isessentialformaintainingmitochondrialintegrityandfornormalintracellulardevelopmentofToxoplasmagondiitachyzoites.PLoSPathog,7(12):e1002416.BurschW,HocheggerK,TorokL,MarianB,EllingerA,HermannRS.2000.Autophagicandapoptotictypesofprogrammedcelldeathexhibitdifferentfatesofcytoskeletalfilaments.JCellSci,113(Pt7)1189-98.ChangJH,ChoiJY,JinBR,RohJY,OlszewskiJA,SeoSJ,O’ReillyDR,JeYH.2003.AnimprovedbaculovirusinsecticideproducingocclusionbodiesthatcontainBacillusthuringiensisinsecttoxin.JournalofInvertebratePathology,84(1):30-37.ChenY,LuY,LuC,ZhangL.2009.Beclin-1expressionisapredictorofclinicaloutcomeinpatientswithesophagealsquamouscellcarcinomaandcorrelatedtohypoxia-induciblefactor(HIF)-1alphaexpression.PatholOncolRes,15(3):487-93.CoulibalyF,ChiuE,IkedaK,GutmannS,HaebelPW,Schulze-BrieseC,MoriH,MetcalfP.2007.Themolecularorganizationofcypoviruspolyhedra.Nature,446(7131):97-101.CrightonD,WilkinsonS,O'PreyJ,SyedN,SmithP,HarrisonPR,GascoM,GarroneO,CrookT,RyanKM.2006.DRAM,ap53-inducedmodulatorofautophagy,iscriticalforapoptosis.Cell,126(1):121-34.CuervoAM.2004.Autophagy:insicknessandinhealth.TrendsCellBiol,14(2):70-7.CuervoAM,DiceJF.1996.Areceptorfortheselectiveuptakeanddegradationofproteinsbylysosomes.Science,273(5274):501-3.deDuveC,PressmanBC,GianettoR,WattiauxR,AppelmansF.1955.Tissuefractionationstudies.6.Intracellulardistributionpatternsofenzymesinrat-livertissue.BiochemicalJournal,60(4):604-617. 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80家蚕自噬基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究附录附录1:家蚕中肠总RNA的抽提与cDNA的合成准备工作：配制DEPC水，并用它处理提取RNA所用的试验器材和配制75%乙醇。(1).组织样从-80℃冰箱中取出，称取50～100mg，在DEPC处理的研钵中，加液氮研磨成粉末，加入1mL的TRIzol试剂(Invitrogen)，放置5min。(2).吸取混合液放入DEPC处理的EP管中，于4℃冷冻离心机中12000r/min，离心10min，吸上清到新EP管。(3).加入0.2mL氯仿，振荡混匀30s，室温放置3min，于4℃冷冻离心机中12000g，离心15min，吸上清到新EP管，每管约0.45-0.55mL。(4).加入等体积的异丙醇，混合均匀后于-80℃冰箱中冷冻2～3个小时，取出待溶解后，4℃，12000r/min，离心20min。(5).小心倒掉上清，向沉淀中加入500μLDEPC水配制的70%的乙醇溶液，混匀，于-80℃冰箱中放置30～60分钟后取出，4℃，12000r/min，离心20min，重复本操作1次。(6).小心倒掉上清，并将残留的酒精蒸发干净，用50μL～80μLDEPC水溶解沉淀，取出10μL用于电泳和测定浓度，剩下的于-80℃下保存。cDNA的合成使用Takara公司的反转录试剂盒(PrimeScript®RTreagentKit)，在0.2ml离心管中配制如下体系：5×PrimeScript®Buffer2.0μLRTEnzymeMixI0.5μLOligodTPrimer(50μM)0.5μLRandom6mers(100μM)2.0μLTemplateRNA500ngRNaseFreedH2O添加至10ul将上述体系轻轻混匀，置于37℃反应30min，然后85℃，5sec，冷却后将合成的cDNA稀释倍作为PCR模版。附录2:酚-氯仿法提取家蚕中肠组织基因组DNA家蚕中肠样品从-80°C冰箱取出，加入液氮研磨至粉末状。(1).用勺子将粉末加入到含有1mL裂解液(内含10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA和0.5%的SDS，pH调至8.0)的1.5mL离心管中，再加入10ul蛋白酶K(10mg/ml)，37°C孵育过夜。(2).8000r/min离心10min，取上清放入新的1.5mL离心管，加入等体积的酚：氯 附录81仿：异戊醇(25：24：1)，温和摇动10min。(3).12000r/min离心10min，取上清放入新的1.5mL离心管，重复1次。(4).取上层溶液到新的1.5mL离心管，加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，12000r/min离心10min。(5).取上层溶液到新的1.5mL离心管，加入等体积的异丙醇，轻微晃动使DNA析出，-20°C下保存1h，12000r/min离心10min。(6).弃上清，70%乙醇洗涤DNA，晾干，超纯水溶解，检测基因组DNA完整性。附录3:质粒pET32a图谱及酶切位点 82家蚕自噬基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究附录4:质粒pET28a图谱及酶切位点附录5:琼脂糖凝胶电泳回收DNA(试剂盒法)(1).1.5%琼脂糖凝胶电泳将目的DNA片段与其他片段分开。(2).电泳结束，用洁净刀片在紫外线灯下切出目的DNA片段。(3).将含DNA的琼脂糖胶块装入1.5mL离心管，加入2~4倍胶体积的溶胶液，55°C水浴5~10分钟，每隔2~3min取出离心管摇动数秒，使胶彻底溶解。(4).琼脂糖凝胶完全溶解后，冷却至室温，将融化的胶液转移至插入套管的吸附柱内(使用前需要平衡液平衡2min)，12000r/min离心1min，弃去废液，重复此步骤直至 附录83剩余融化胶液全部通过吸附柱。(5).向离心柱内加入600μLBufferPW，12000g离心1min，弃去废液，重复洗涤1次。(6).12000r/min开盖离心2min后，取出吸附柱，干燥3~5min。(7).将吸附柱插入一个新的1.5mL离心管，在吸附柱内硅胶膜中心位置加入30~50μL超纯水，室温放置2min，离心1min。(8).离心管中即得纯化的目的DNA，-20°C保存备用。附录6：T载体的连接、转化及单克隆筛选提前准备向含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板上涂抹20μl的IPTG(50mg/ml)、40μl的X-gal(20mg/ml)，置于37°C培养箱预热2h。(1).按照如下比例配制T载体连接体系：2×SolutionⅠ5.0μLpMD19-T0.5μLDNA目的片段2~4μLdH2O加至10μL(2).轻轻混匀，瞬时离心，16°C连接1小时。(3).转化：将5.0μL连接产物加入到50μLDH5a感受态细胞中，轻弹混匀，冰上放置30min，42°C热激90sec，冰上放置2min。(4).加入500μLLB液体培养基，37°C150r/min摇动1h使细菌复苏。(5).将复苏的菌液均匀涂在预热好的LB平板，37°C恒温培养过夜。(6).单克隆的挑取：在无菌操作台，取灭菌的玻璃试管加入4μL50mg/ml氨苄青霉素，再加入4mLLB培养基，用灭菌枪头挑取白斑放入玻璃试管，同时挑取蓝斑作为参照，37°C，150r/min摇动培养16h以上，即可提取菌液中的质粒。附录7：质粒提取(试剂盒法)(1).将1mL菌液移入1.5mL离心管，12000r/min离心1min，去除上清。(2).加入250μL溶液I，充分混匀使菌体重悬。(3).加入250μL溶液II，轻轻颠倒5～10次，静置3min，此时溶液应变得粘稠而透明。(4).加入350μL溶液III，轻轻颠倒5～10次，可见白色絮状蛋白质沉淀析出。(5).12000r/min离心10min，转移上清(约700μL)到吸附柱中。(6).12000r/min离心1min，弃去废液。(7).加入600μL漂洗缓冲液，12000r/min离心1min，弃去废液，重复清洗1次。(8).吸附柱开盖12000r/min离心2min，去除残留的乙醇。 84家蚕自噬基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究(9).吸附柱放入新的1.5mL的离心管，在膜中央加入50-100μL的洗脱缓冲液，室温静置1min，12000r/min离心1min。(10).核酸蛋白测定仪测定浓度后，-20°C保存。附录8：家蚕组织蛋白提取(试剂盒法)(1).每1mL预冷的裂解液加入5uL磷酸酶抑制剂、1uL蛋白酶抑制剂和10uLPMSF，混匀，冰上保存数分钟待用。(2).取出冷冻的组织样品，在研钵中加液氮共研磨至粉末，用冷却的勺子取组织粉末加入1mL上述配制好的预冷裂解液中，手动混匀15-30次，冰上放置10min。(3).13000r/min，4°C离心15min，上清转移至新的预冷的离心管中，即为全蛋白提取物。(4).分装保存于-80°C，避免反复冻融。附录9蛋白质定量(BCA法)(1).按照下表的比例配制标准品，制作标准曲线。管号10mMTris-HCl(pH=7.5)标准品用量BSA终浓度1700μL100μlBSA250μg/μL2400μL取1号液400μL125μg/μL3450μL取2号液300μL50μg/μL4400μL取3号液400μL25μg/μL5400μL取4号液100μL5μg/μL6400μL空白0μg/μL(2).按工作液的溶液A：溶液B=50：1配混合液，每个样本需2mL。(3).在每个试管中加入2mL溶液A、B混合液以及0.1mL标准品，于37°C水浴30min。(4).用分光光度计测定562nm处BSA标准品的吸光值，空白对照为10mMTris-HCl(pH7.5)，绘制标准曲线。(5).测样品浓度时，用10mMTris-HCl(pH=7.5)稀释样品100倍。(6).加2mL溶液A、B混合液+0.1mL稀释的蛋白样本，60°C水浴30min。(7).测OD562nm，调出标准曲线，读出对应浓度值，再乘以稀释倍数100，即为该样品浓度。附录10：SDS-PAGE电泳第一步，配制电泳所需试剂及溶液(1).1.5MTris-HCL(pH8.8):Tris碱90.8g去离子水400mL 附录85溶解后，加浓盐酸调pH至8.8，然后定容至500mL。(2).0.5MTris-HCL(pH6.8):Tris碱30.3g去离子水400mL溶解后，加浓盐酸调pH至6.8，然后定容至500mL。(3).10%APS：APS0.1g，加去离子水至1mL，现配现用。(4).2×蛋白上样缓冲液：0.5MTris-HCL(pH6.8)1.25mL甘油2.5mL20%SDS1mL0.5%溴酚蓝0.2mL加去离子水至10mL，-20°C保存，使用前加入β-巯基乙醇(终浓度为5%)。(5).10×蛋白电泳缓冲液：Tris碱30.3g甘氨酸144gSDS1%w/v加去离子水至1L，使用时稀释成1×电泳缓冲液。(6).TEMED，直接使用原液，避免挥发。第二步，制备聚丙烯酰胺凝胶(5%浓缩胶、15%分离胶)。15%分离胶溶液的配制：蒸馏水4.6mL30%Acr-Bis(29：1)10mL1.5MTris-HCL(pH8.8)5mL10%SDS200μL10%过硫酸铵(APS)200μLTEMED10μL轻轻混匀，缓慢注入两玻璃板之间(液面最高处应在梳子下方约0.5cm处)。然后缓慢加入1mL无水乙醇，37°C放置30min，待胶凝固，吸干胶上面的乙醇。5%浓缩胶溶液的配制：蒸馏水4.1mL30%Acr-Bis(29：1)1mL1MTris-HCL(pH6.8)0.75mL10%SDS60μL10%过硫酸铵(APS)60μLTEMED6μL 86家蚕自噬基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究轻轻混匀，缓慢注入两玻璃板之间分离胶的上方，插入梳子，室温放置待其凝固。凝固后把做好的浓缩-分离胶板放入电泳装置中，加入1×蛋白电泳缓冲液，轻轻拔出梳子。第三步，蛋白样本的电泳取20~100μg总蛋白，加入同体积的2×蛋白上样缓冲液，于沸水中煮5min，然后6000r/min离心2min，取上清即为蛋白样品，把蛋白样本加入加样孔。电泳时使用电压为浓缩胶80V，约电泳15min，分离胶120V，约90min，至溴酚蓝迁移至底部，停止电泳，取下PAGE胶即可进行染色或免疫印迹分析。附录11：BmAtg8基因及预测蛋白质(菁松×皓月家蚕品种)1ATGAAATTCCAATACAAAGAAGAACATTCATTTGAGAAGAGAAAGGCTGAGGGCGAAAAAATCCGCAGGAAATATMKFQYKEEHSFEKRKAEGEKIRRKY76CCAGATCGCGTTCCTGTAATTGTAGAGAAAGCGCCGAAGGCTAGGCTTGGAGACCTCGACAAAAAGAAGTATTTAPDRVPVIVEKAPKARLGDLDKKKYL151GTTCCGTCTGATTTAACAGTTGGCCAGTTCTACTTCTTGATCCGGAAACGTATTCACCTGCGGCCTGAAGACGCAVPSDLTVGQFYFLIRKRIHLRPEDA226CTTTTCTTCTTCGTGAACAATGTCATTCCACCCACATCTGCAACAATGGGGTCTCTCTACCAAGAACACCATGATLFFFVNNVIPPTSATMGSLYQEHHD301GAAGATTTCTTTCTATACATAGCATTTTCCGACGAAAATGTCTATGGAAATTAAEDFFLYIAFSDENVYGN*附录12：陕西株多角体病毒S10基因序列及预测的多角体蛋白病毒S10片段(多角体蛋白基因)序列信息及多角体蛋白一级结构NucleotidesequenceofSegment10(polyhedringene)andprimarystructureofPolyhedrin.1ATGGCAGACGTAGCAGGAACAAGTAACCGAGACTTTCGCGGACGCGAACAAAGACTATTCAACAACGAACAATAC1MADVAGTSNRDFRGREQRLFNNEQY76AACTATAACAACAGCCTAAACGGAGAAGTGAGCGTGTGGGTATACGCATACTACTCAGATGGGTCAGTACTCGTA26NYNNSLNGEVSVWVYAYYSDGSVLV151ATCAATAAGAACTCACAGTACAAAGTTGGCGTTTCAGAGACATTCAAGACACTTAAGGAATATCGCGAGGGACAA51INKNSQYKVGVSETFKTLKEYREGQ226CACAATGACTCTTACGATGAGTACGAGGTGAACCAAGGCATCTACTATCCTAACGGCGGTGACGCTCGTAAATAC76HNDSYDEYEVNQGIYYPNGGDARKY301CACTCGAATGCTAAACCACGCGCGATCCAGATCGTCTTCAGTCCTAGTGTGAACGTACGCACCATCAAAATGGCT101HSNAKPRAIQIVFSPSVNVRTIKMA376AAGGGTAACTCAGTCTCTGTACCTGATGAGTATCTACAGCGGTCTCACCCATGGGAAGCAACCGGAATTAAATAC 附录87126KGNSVSVPDEYLQRSHPWEATGIKY451CGCAAGATTAAGAGAGACGGAGAAATCGTTGGTTACAGTCATTACTTTGAACTACCCCATGAATATAACTCCATT151RKIKRDGEIVGYSHYFELPHEYNSI526TCGCTAGCAGTAAGTGGTGTACACAAGAACCCATCATCATACAATGTTGGATCAGCACACAACGTAATGGACGTC176SLAVSGVHKNPSSYNVGSAHNVMDV601TTCCAATCATGTGACCTCGCTCTTAGATTCTGCAACCGCTACTGGGCTGAACTCGAATTGATCAATCACTATGTT201FQSCDLALRFCNRYWAELELINHYV676TCACCGAATGCTTACCCATATCTCGATATTAACAATCACAGTTATGGAGTAGCTCTGAGTAACCGTCAG226SPNAYPYLDINNHSYGVALSNRQ附录13：试验相关溶液配制(1).LB培养基的配制500mL:胰蛋白胨5gNaCl5g酵母提取物2.5g超纯水400mLpH值调至7.4，定容至500mL，高压灭菌冷却后4°C保存。固体LB培养基再加入7.5g琼脂(AgarPower)，灭菌后冷却至50°C，再分装到无菌培养皿中，冷却后4°C保存。含有抗生素(Amp,Kana)的LB平板即在50°C时加入抗生素，摇匀后分装到培养皿中冷却，4°C保存。(2).PBS缓冲液1000mL：NaCl8.2g，KCl0.2g，Na2HPO43.58g，KH2PO40.25g，加超纯水800mL，溶解后加超纯水定容至1000mL，调pH至7.4，高压灭菌，4°C保存。也可根据需要调节pH至其他值。(3).考马斯亮蓝R-250染色液1000mL：称取R-250为0.5g，加水450mL溶解，再加入450mL甲醇或乙醇、100mL冰醋酸，混匀后使用滤纸过滤，室温保存。(4).R-250的脱色液1000mL：醋酸70mL，甲醇或乙醇200mL，蒸馏水730mL，混匀使用。(5).蛋白纯化洗脱缓冲液：Na2HPO47.8g，NaCl17.532g，咪唑34g，加超纯水800mL，溶解后加超纯水定容至1000mL，调pH至8.0。(6).WB转膜缓冲液：甘氨酸2.9g，SDS，0.37g，Tris5.8g，甲醇200mL，用ddH2O定容至1000mL，室温保存。(7).10×TBE储存液：Tris54.5g，硼酸27.8g，EDTA14.6g，pH调至8.0，定容至500mL，室温保存，使用时10倍稀释。(8).10×TAE储存液：(9).50mg/mL氨苄青霉素(Ampicillin)、50mg/mL卡那霉素(Kanamycin)：称取0.25g 88家蚕自噬基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究Ampicillin或kanamycin溶解于5mL超纯水，0.22μm过滤膜过滤，-20°C保存，使用时稀释1000倍。 缩略词89缩略词Amp,Ampicilin,氨苄青霉素BmCPV,BombyxmoriCytoplasmicPolyhedrosisVirus,家蚕质多角体病毒BSA,BovineSerumAlbumin,牛血清白蛋白DMSO,Dimethylsulfoxide,二甲基亚砜DEPC,DiethyPyrocarbonate,焦碳酸二乙酯E.coli,Escherichiacoli,大肠杆菌EDTA,ThyleneDiaminetetraaceticAcid,乙二胺四乙酸HE,Hematoxylin-Eosinstain,苏木精-伊红染色IPTG,Iisoprophylthio-β-D-galactoside,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷kDa,Kilodalton,千道尔顿ORF,OpenReadingFrame,开放阅读框PCD,ProgrammedCellDeath,细胞程序性死亡PCR,PolymeraseChainReaction,多聚酶链式反应qRT-PCR,quantitativeRealTime-PCR,实时定量-多聚酶链式反应RDRP,RNA-dependentRNApolymerase,依赖于RNA的RNA聚合酶rpm,revolutionperminute,每分钟转数RT-PCR,ReverseTranscriptional-PCR,逆转录-多聚酶链式反应SDS-PAGE,SDS-PolyacrylamideGelElectrophoresis,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS,SodiumDdodecylSulpate,十二烷基硫酸钠TEM,TransmissionElectronMicroscopy,透射电子显微镜X-gal,5-bromo-4-chloro-3-indo1y1-β-D-galactose,5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷Tris,Tris-hydroxymethyl-aminomethane,三-羟甲基-氨基甲烷 90家蚕自噬基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究致谢时光匆匆，四年的光阴眨眼而过，回首四年来的学习和研究生活，需要感激的人太多太多。首先感谢我的导师钱永华教授和焦锋副教授，在我学习知识和探索未知的道路上，他们一直是我的明灯，指引我克服困难、一路前行。两位老师在本研究的选题、开题论证、及试验设计等环节倾注了大量精力。焦锋老师以严谨的科学态度和高涨的科研热情悉心指导我在试验实施过程中的试验操作和数据分析工作，并教导我们戒骄戒躁、实事求是地进行科研数据收集和整理，保证了本试验的顺利完成，同时在生活中给予我们以无微不至的关怀。能够跟随两位导师进行博士阶段的研究和学习，我倍感荣幸！感谢中国农业大学生物学院刘庆洪老师在试验选题中提供的建议。感谢周恩民教授、呼天明教授、张智英教授、曾文先教授在论文开题中提供的宝贵建议，感谢徐秀荣老师、苏超老师、任占军老师在中期考核中提供的意见，感谢吕志强老师提供质粒，感谢董武子老师、蓝贤勇老师在试验数据分析中提供的意见，感谢刘红梅老师、王秀平老师在家蚕饲养中提供技术支持。感谢在试验中提供帮助的蚕桑试验室张敏娟老师、电镜分析试验室郭付振老师、旱区作物逆境生物学国家重点试验室王晓娜老师、动物营养与饲料科学科研平台关勤农老师。感谢博士生吴素丽、朱江江、张志强、曹平华等同学在试验中提供的便利，及蚕桑试验室的硕士吴永鹏、朱大鹏、郭龙、刘立群、盛琳波、李昭良，硕士生李洪建、杨晶、吴亥、蒋涛等师弟师妹们在试验过程中的协助和在生活中的关心，使我在辛苦的研究过程中保持了愉快的心情。感谢家人的陪伴和关爱，他们是我今生最宝贵的精神财富。 个人简介91个人简介杨晓冰，男(1981.6-)，汉族，中共党员，河南省新郑市人。教育经历博士：2011年被西北农林科技大学动物科技学院录取，师从钱永华教授，攻读特种经济动物饲养专业。硕士：2004~2007年就读于西北农林科技大学动物科技学院，专业为动物遗传育种与繁殖，获农学硕士学位。学士：2000~2004年就读于西北农林科技大学动物科技学院动物，专业为动物科学，获农学学士学位。博士期间发表文章：[1]杨晓冰,李洪建,吴永鹏,刘庆洪,张敏娟,钱永华,焦锋.家蚕细胞自噬相关蛋白BmATG8的多克隆抗体制备与组织表达分析[J].蚕业科学,2014,05:818-823.[2]XiaobingYang,SuliWu,DapengZhu,HaiWu,TaoJiang,YonghuaQian,FengJiao.Expressionof2-dehydro-3-deoxyphosphooctonatealdolase(KdsA)geneinmulberryleaves(MorusalbaL.)isdownregulatedunderhighsaltanddrought.(GENETICSANDMOLECULARRESEARCH已接收)[3]XiaobingYang,SuliWu,YongpengWu,YangLiu,YonghuaQian,FengJiao.LackofConnectionbetweenMidgutCellAutophagyGeneExpressionandBmCPVInfectioninthemidgutofBombyxmori.(JournalofInsectScience已接收)[4]Su-LiWu,Xiao-BingYang,Li-QunLiu,TaoJiang,HaiWu,ChaoSu,Yong-HuaQian,FengJiao.Agrobacterium-MediatedTransientMaFTExpressioninMulberry(MorusalbaL.)Leaves.(Bioscience,biotechnology&biochemistry已接收，共同第一作者)
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