《建兰花叶病毒广东分离物分子特征与侵染性克隆构建》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
学校代码：10564学号：2013202111分类号：S432.1密级：硕士学位论文建兰花叶病毒广东分离物分子特征与侵染性克隆构建李霞指导教师：饶雪琴副教授学院名称：农学院专业名称：植物病理答辩委员会主席：周国辉教授中国·广州2016年6月 华南农业大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名：日期：学位论文提交同意书本学位论文符合国家和华南农业大学关于研究生学位论文的相关规定，达到学位授予要求，同意提交。导师签名：日期：学科带头人签名：日期： 摘要兰花(Cymbidiumspp.)清幽脱俗极具观赏价值和收藏价值，近年来，随着社会的进步，兰花越来越受到人们的重视，同时，兰花也是是广东顺德等地的高效创汇产业。但是，病毒病严重危害着兰花产业的发展。兰花病毒病可造成兰花花叶、坏死以及花朵变色和畸形，严重影响其品质，其中建兰花叶病毒(Cymbidiummosaicvirus，CymMV)是造成兰花经济损失的主要病毒之一。本研究获得了三个建兰花叶病毒分离物，分别标记为CymMV-GDFS1、CymMV-GDFS2、CymMV-GDFS3。三个分离物基因组全长序列分别由6227、6222、6224个碱基组成，各包含5个开放阅读框，分别为4254bp的RdRp、702bp的TGB1、339bp的TGB2、276bp的TGB3、以及672bp的CP基因。对这三个分离物的的全基因组核苷酸序列相似性进行分析，结果表明CymMV-GDFS1与CymMV-GDFS2相似性最低为98.1%，CymMV-GDFS2与CymMV-GDFS3相似性为98.5%，CymMV-GDFS1与CymMV-GDFS3相似性最高为99.3%。与已报导的其它12个CymMV全长序列相比较，相似性在87.3%-97.3%之间；与Hawaii的两个分离物CymMV-18-30、CymMV-18-1的相似性都较低，分别为87.3%与88.5%；而与除此之外的其它10个分离物的相似性在96%-97.3%之间。这三个CymMVCP基因序列与54个国内CymMVCP序列相比较，核苷酸与氨基酸的相似性分别为86%-99%、91%-100%；与57个国外CymMVCP序列相比较，核苷酸与氨基酸的相似性分别为88%-99%、90.5%-100%。根据111个CymMVCP序列分别构建核苷酸和氨基酸系统进化树，核苷酸进化树分析表明CymMV-GDFS1与CymMV-FS4亲缘关系最近，而CymMV-GDFS2、CymMV-GDFS3与CymMV-DEK30亲缘关系最近；氨基酸进化树表明CymMV-GDFS1与CymMV-FS4亲缘关系同样最近、CymMV-GDFS3与CymMV-ZH2亲缘关系最近、CymMV-GDFS2与CymMV-C-LZ02亲缘关系最近，而三个分离物之间亲缘关系较远。这三个分离物RdRp序列与已报导的12个CymMVRdRp序列相比较，相似性为87.3%-97.9%。本研究通过分段克隆的方法将获得的三个CymMV分离物成功地连接到改造后的植物双元表达载体pCAMBIA2300，构建了含有CymMV病毒序列的侵染性克隆，通过农杆菌介导分别接种本生烟，接种40天后，本生烟表现病毒性的侵染症状，利用RT-PCR和ELISA都能从本生烟叶片中检测到CymMV。初步证明构建的侵染性克隆具有生物学活性，可以成功地侵染本生烟。I 在构建侵染性克隆的基础上，通过酶切连接将绿色荧光蛋白GFP序列连接到含有CymMV病毒的侵染性克隆表达载体上。通过农杆菌介导瞬时表达分别接种本生烟，三天后用共聚焦显微镜观察本生烟叶片，发现病毒主要聚集在叶表皮细胞壁与细胞核周围。关键词：兰花；建兰花叶病毒；侵染性克隆；遗传多样性II MolecularCharacteristicsandConstructionofInfectionsCloneofGuangdongIsolatesofCymbidiumMosaicVirusLiXia(CollegeofAgriculture,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642,China)Abstract:Orchid(Cymbidiumssp.)isquietandrefined,fullofornamentalandcollectionvalue.Forthepastfewyears,withtheprogressofthesociety,moreandmorepeoplepayattentiontoorchid,atthesametime,theorchidalsoisefficientforeignexchangeearningindustryinshunde,guangdongandotherplaces.Butmeanwhile,Virusdiseasescauseseriousdamagetothedevelopmentoforchidindustry.Inornamentalorchids,theviruscauseschloroticornecroticspotsonleavesandflowers,seriouslyaffectthequality.ThemostprevalentandeconomicallydamagingofthesevirusesisCymbidiummosaicvirus(CymMV).ThecompletegenesequenceofthreeGuangdongisolates,CymMV-GDFS1,CymMV-GDFS2andCymMV-GDFS3wasobtained.Theresultsdemonstratedthatthecompletesequenceofthesethreeisolatescomprised6227bp,6222bp,6224bp,respectively.Allofthemencodesfiveopenreadingframes(ORFs),4254bpRdRp,702bpTGB1,339bpTGB2,276bpTGB3and672bpsequenceofCP.Comparingthesimilarityofgenomenucleotidesequenceofthethreeisolates,thesimilarityofCymMV-GDFS1andCymMV-GDFS2islowto98.1%,CymMV-GDFS2andCymMV-GDFS3is98.5%whilesimilarityofCymMV-GDFS1andCymMV-GDFS3isupto98.1%.Comparingwithother12reportedCymMVfull-lengthsequences;thehomologousatntis87.3%-97.3%.OfwhichthesimilaritywithtwoHawaiiisolates,CymMV-18-30andCymMV-18-1is87.3%and88.5%,respectively.Andinadditionthesimilaritywithother10isolatesis96%-97.3%.Comparingwith54domesticCPsequences,theisolatesshare86%-99%and91%-100%homologousatntandaalevels,respectively.Comparingwith57overseasCPsequences，theisolatesshare88%-99%and90.5%-100%homologousatntandaalevels,respectively.Phylogeneticanalysiswiththese111CPntsequencesindicatesthatCymMV-GDFS1andCymMV-FS4sharecloserrelationshipwhileCymMV-GDFS2,CymMV-GDFS3andCymMV-DEK30sharecloserrelationship.ontheotherhand,Phylogeneticanalysiswiththese111CPaasequencesindicatesthatCymMV-GDFS1andCymMV-FS4alsosharecloserrelationship,CymMV-GDFS3andCymMV-ZH2sharecloserrelationship,whileCymMV-GDFS2andCymMV-C-LZ02sharecloserrelationship,buttherelationshipbetweenthreeisolatesarefaraway.ThesimilaritybetweenthesethreeRdRpandother12III RdRpsequencesare87.3%-97.9%.ThesethreeCymMVgenomesequenceswillbeconnectedtothemodifiedbinaryexpressionvectorpCAMBIA2300piecewise,constructedvirusinfectiousclonewithsequencesofCymMV,withagrobacteriummediatedrespectivelyinoculateNicotianabenthamiana,fortydaysafterinoculation,N.benthamianaexpressionobvioussymptomsofinfection,positivesymptomshavebeendetectedusingRT-PCRandELISArespectivelyinthetobaccoleafwithsymptoms.Preliminaryprooftheinfectiousclonespossessbiologicalactivity,cansuccessfullyinfectN.benthamianaandwithsimilarincidencedegree.OnthebasisofinfectiouscloneandgreenfluorescentproteinsequencesareconnectedwithCymMVvirusforexpressionvector,TransientexpressionwillbecarriedouttoinoculateN.benthamianaviaagrobacterium.Threedayslater,confocalmicroscopewillbeusedtoobservetheN.benthamianaleafsandfoundvirusproteinmainlygatheredaroundtheleafepidermalcellwallandnucleus.Keywords:orchid;Cymbidiummosaicvirus;infectionsclone;geneticdiversityIV 缩写词及中英文对照缩写英文名中文名aaaminoacid氨基酸AmpAmpicillinsodium氨苄青霉素ASAcetosringone乙酰丁香酮BLASTBasicLocalAlignmentSearchTool基因检索工具bpbasepair碱基对dday天ddH2ODoubledistilledwater双蒸水DNAdeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸ggram克dNTPsdeoxyribonucleotidetriphosphates脱氧核苷三磷酸EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸hhour小时ODOpticalDensity光密度IPTGIsopropyl-β-D-thiogalactopyranoside异丙基-β-D-硫代半乳糖苷Kankanamycin卡那霉素kDaKiloDalton千道尔顿LLiter升MMarker分子量标记mgmilligram毫克minminute分钟mLmilliter毫升molmole摩尔mmol/Lmillimolar/Liter毫摩尔每升NCBINationalCenterforBiotechnologyInformation美国国立生物信息中心ntnucleotide核苷酸ORFOpenreadingframe开放阅读框PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应RNAribonucleicacid核糖核酸V rpmrevolutionsperminute每分钟转数ssecond秒RT-PCRreversetranscription-PCR反转录-聚合酶链式反应TBETris-borateElectrophoresisBufferTris-硼酸电泳缓冲液TrisTris(2-hydroxymethy)aminomethane三羟甲基氨基甲烷vvolume体积wweight重量X-gal5-Bromo-4-chloro-3-indolylβ-D-galactopyranoside5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷μgmicrogram微克µLMicrolitre微升kbkilobase千碱基ELISAenzymelinkedimmunosorbentassy酶联免疫吸附试验APSAmmoniumpersulfates过硫酸铵RifRifampicin利福平nmnanometer纳米NosNitricoxidesynthase一氧化氮合酶+ssRNApositivesenseSingle-strandedRNA单链正义RNACymMVCymbidiummosaicvirus建兰花叶病毒%percent百分号CKcheck对照GFPGreenFluorescentProtein绿色荧光蛋白RdRpRNAdependentRNApolymeraseRNA依赖RNA聚合酶CaMVCauliflowermosaicvirus花椰菜花叶病毒cDNAcomplementaryDNA互补脱氧核糖核酸VI 目录1前言..........................................................................................................................................................11.1兰花病害概述....................................................................................................................................11.2建兰花叶病毒....................................................................................................................................21.2.1建兰花叶病毒引致的兰花症状.................................................................................................21.2.2广东建兰花叶病毒研究进展......................................................................................................21.2.3建兰花叶病毒的基因组结构....................................................................................................31.2.4建兰花叶病毒的遗传多样性....................................................................................................31.2.5建兰花叶病毒检测方法..............................................................................................................41.3侵染性克隆研究...............................................................................................................................61.4研究目的意义.....................................................................................................................................82材料与方法............................................................................................................................................82.1材料......................................................................................................................................................82.1.1植物材料及病毒来源..................................................................................................................82.1.3菌种及载体.....................................................................................................................................92.1.4主要仪器及设备............................................................................................................................92.1.5主要试剂的配制..........................................................................................................................102.2广东建兰花叶分离物的遗传多样性分析...............................................................................112.2.1RNA提取用具的处理................................................................................................................112.2.2总RNA的提取.............................................................................................................................112.2.3RT-PCR扩增的引物...................................................................................................................122.2.4RT-PCR分段扩增CymMV全长和CP序列......................................................................132.2.5RT-PCR产物的回收...................................................................................................................142.2.6目的片段的TA克隆...................................................................................................................142.2.7大肠杆菌JM109感受态的制备..............................................................................................152.2.8重组质粒的转化...........................................................................................................................152.2.9重组质粒的抽提..........................................................................................................................162.2.10重组质粒的双酶切及序列测定.............................................................................................162.2.11序列分析......................................................................................................................................172.3建兰花叶病毒侵染性克隆构建..................................................................................................20VII 2.3.1植物双元表达载体pCAMBIA2300-35S改造....................................................................202.3.2两个目的片段分别连接到pCAMBIA2300-JT...................................................................212.3.3农杆菌GV3101菌株感受态细胞的制备.............................................................................222.3.4电击转化.......................................................................................................................................222.3.5农杆菌介导的植物接种.............................................................................................................232.3.6侵染性克隆检测接种本生烟发病情况.................................................................................232.3.6.1RT-PCR检测..............................................................................................................................232.3.6.2ELISA检测................................................................................................................................232.4瞬时表达...........................................................................................................................................242.4.1三个分离物全长表达载体的构建..........................................................................................242.4.2PCR扩增获得pCAMBIA1302上GFP到Nos间1037bp目的条带........................252.4.3农杆菌介导的植物接种.............................................................................................................252.4.4观察接种后烟草GFP荧光变化情况....................................................................................253结果与分析..........................................................................................................................................263.1CymMV广东分离物的遗传多样性分析..................................................................................263.1.1RT-PCR分别获得CymMV分离物两个目的片段............................................................263.1.2CymMV分离物目的片段的克隆及重组质粒鉴定...........................................................263.1.3CymMV序列分析.......................................................................................................................273.1.3.1全基因组的结构特征和序列分析.......................................................................................273.1.3.2CymMV全基因组序列相似性和进化树分析.................................................................293.1.3.3CymMVCP序列相似性和进化树分析............................................................................313.1.3.3CymMVRdRp序列相似性和进化树分析.......................................................................343.1.3.4CymMVTGB1序列相似性和进化树分析.......................................................................363.1.3.5CymMVTGB2序列相似性和进化树分析.......................................................................393.1.3.6CymMVTGB3序列相似性和进化树分析.......................................................................413.2侵染性克隆构建..............................................................................................................................443.2.1植物双元表达载体pCAMBIA2300-35S改造....................................................................443.2.2CymMV分段连接到pCAMBIA2300-JT.............................................................................443.2.3CymMV全长重组质粒转化农杆菌GV3101......................................................................453.2.4侵染性克隆检测接种本生烟发病情况.................................................................................46VIII 3.3瞬时表达............................................................................................................................................483.3.1CymMV分离物全长表达载体的构建..................................................................................483.3.2CymMV分离物全长瞬时表达观察病毒在本生烟的移动............................................493.3.3CymMV分离物全长瞬时表达荧光观察............................................................................503.3.4CymMV分离物全长与GFP序列连接侵染烟草症状观察..........................................523.3.5CymMV分离物全长与GFP序列连接侵染烟草RT-PCR验证..................................524结论与讨论..........................................................................................................................................534.1CymMV遗传多样性分析.............................................................................................................534.2建兰花叶病毒侵染性克隆构建.................................................................................................554.3结论....................................................................................................................................................574.4进一步需要解决的问题...............................................................................................................57致谢...................................................................................................................................................58参考文献............................................................................................................................................59附录...................................................................................................................................................65IX 1前言1.1兰花病害概述兰花(Cymbidiumspp.)是附生或地生草本，通常在假鳞茎基部或下部长出叶子，花的颜色多样，有白、纯白、白绿、黄绿、淡黄、淡黄褐、黄、红、青、紫等。兰花按生态习性主要分为地生兰（如大花蕙兰）、气生兰（绝大部分兰花皆有气生习性，如蝴蝶兰）、腐生兰（如丹霞兰）三大类。由于地生兰大部份品种原产中国，因此地生兰又称中国兰，并被列为中国十大名花之首。中国兰花主要为春兰、蕙兰、建兰、寒兰、墨兰五大类（庄西卿，2004），有上千种园艺品种。随着社会的进步，文明的提高，养殖和欣赏兰花的人越来越多，兰花的经济价值不断攀升，药用价值、食用价值、香用价值等兰花的本身价值，也不断被人们发现（潘一山，1991；余诚，2006），因此催生和壮大了兰花产业的发展。近年来，花卉产业已成为全球贸易的一大产业，全球的花卉消费额截止2010年为止就已超过2000亿美元，年平均增长速度接近10%（旷野，2011）。在花卉产业当中，兰花类所占的比例是相当大的，根据2010年花卉业的相关统计数据，中国兰花类种植面积超过10，000hm2，销售量近4亿盆，销售额近32亿元，占全国花卉销售额约4%，兰花产业已成为花卉产业的重要组成部分（朱留华，2002）。广东兰花栽培历史悠久，生产的墨兰(Cymbidiumsinensevar.margicoloratum)多出口韩国和日本，兰花组织培养也开始大面积推广，并有一定的规模，是广东顺德等地的高效创汇产业。由于病毒病的发生逐年加重，兰花栽培的经济效益受到极大影响（周国辉，2004；梁敏国，2004）。兰花病毒病可造成植株叶斑、坏死以及花朵变色、畸形等症状，严重影响兰花品质。兰花病毒最早的记载是1943年，澳大利亚Magee报道了新南威尔士建兰上的一种“黑病”（blackdisease），后来证实为建兰病毒病（范成明等，2004）。迄今为止，至少报道了50种可以侵染兰花的病毒，常见的病毒有建兰花叶病毒(Cymbidiummosaicvirus，CymMV)（Jensen,1951）、齿兰环斑病毒(OdontoglossumRingspotvirus，ORSV)（Jensen,1951；Pauletal.,1965）、建兰环斑病毒(Cymbidiumringspotvirus，CymRSV)、万代兰花叶病毒(Vandamosaicvirus，VMV)、石斛兰花叶病毒(Dondrobiummosaicvirus，DMV)、番茄环斑病毒(Tomotoringspotvirus，TomRSV)、兰花斑点病毒(Orchideckvirus，OFV)（Kondoetal.,2006）、黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus，1 CMV)（Pérezetal.,1960）、石斛兰叶脉坏疽病毒（Dendrobiumveinnecrosisclosterovirus，DVNV)（Lesemann,1977）及番茄斑萎病毒（Tomatospottedwiltvirus，TSWV)（Huetal.,1993）等。其中，建兰花叶病毒是危害各种观赏兰花的主要病毒之一（Huetal.,1993；肖火根等，1996；张健如等，1984）。1.2建兰花叶病毒1.2.1建兰花叶病毒引致的兰花症状建兰花叶病毒由Jensen首次报导（Jensen,1951），它侵染栽培兰花，因此也称为兰花花叶病毒，在病毒侵染初期或症状轻微时，往往症状不明显。栽培环境对症状表现也有一定影响，并且不同的寄主症状也不相同：侵染建兰属（Cymbidium）症状为花叶、斑驳，老叶有条纹和褐色坏死环或斑，尤以叶背面更明显；侵染卡特里亚兰属（Cattleya）症状为叶有黑色坏死条和环斑，后长幼叶无症状，花坏死；侵染Laeliocattleyashoshone杂种症状为老叶褪绿条纹、环、凹陷斑和条纹。老病叶死去脱落，后长幼叶仅有轻微症状；侵染蝴蝶兰属（Phalaenopsis）症状为老叶出现轮纹、条纹，幼叶为花叶（沈淑琳，1988）。也有报导将兰花病毒病的症状分为两类，黄化和斑驳，兰花病毒病在叶部表现枯死及畸形，受病害感染兰株叶片内出现斑驳状或线条状的组织枯死，枯死处的叶背面发生凹陷，产生明显透明白斑，由于枯死斑内叶肉组织变薄，而使叶片产生扭曲萎缩，严重的出现裂叶现象（王婷婷，2013）。1.2.2广东建兰花叶病毒研究进展广东北高南低，极少受北方寒流的影响，并且东南季风为本地带来大量降水，有利于兰花的生长发育。据统计，广东有兰科植物71属208种（含变种），主要的病毒病害就是CymMV（王英强，2001），但是，本地区对CymMV的研究主要停留在对病毒的检测上。吴竹妍等（2011）从广东省广州市、深圳市、东莞市、珠海市、佛山市等地兰花基地采集到68株疑似病毒侵染的兰花植株，结果超过半数的兰花检测出CymMV。郑平等（2001）普查检测了来自顺德、东莞、汕头、深圳、梅州等地491份国兰样本，855分洋兰样品及82分野生兰花样品，其中CymMV感染率达22.6%。周国辉等（2004）采集广东顺德等地疑似病毒侵染的墨兰和文心兰植株，经RT-PCR检测70%的样品获得CymMVCP序列目的条带。梁敏国等（2004）从广州兰圃、芳村兰场、华南植物园、深圳苗圃场采集的兰花标本，经ELISA检测22个样品2 含有病毒，其中10个样品有CymMV。1.2.3建兰花叶病毒的基因组结构建兰花叶病毒隶属线形病毒科（Flexiviridae）马铃薯X病毒属（Potexvirus），病毒粒体为核糖核蛋白体，由外壳蛋白和正义的单链RNA基因组(+ssRNA)组成（Kondoetal.,2015；Wongetal.,1997；潘俊松等，1997）。电镜下观察到的CymMV呈线状，直径13nm，长约475nm，呈螺旋对称，螺纹明显，螺距为2.8nm（潘俊松等，1997）。已经报道的CymMV基因组全长为6.3kb，包含5个开放阅读框(ORF)，3’-末端有一个poly(A)结构，5’-末端有m7GpppA帽（Wongetal.,1997）。ORF1编码160kDa的RNA依赖RNA聚合酶（RNA-dependentRNApolymerase，RdRp），ORF2-4是三个重叠的ORFs，被称为三基因连锁蛋白（triplegeneblock，TGB），由TGB编码分子量分别为26kDa/13kDa/10kDa的蛋白也称为运动蛋白（movementprotein，MP），为CymMV病毒在细胞间运动所需，TGB1同时具有沉默抑制子的功能（Lucas,2006；Verchot-Lubicz,2005；Verchot-Lubiczetal.,2007）。ORF5编码24kDa的衣壳蛋白（coatprotein，CP），CP是病毒粒子组装所需并且有助于病毒粒子在细胞间的运动（Voinnetetal.,2000）。1.2.4建兰花叶病毒的遗传多样性CymMV在全球范围都有报道，并且存在多种分离物。潘俊松等（1999）通过RT-PCR扩增获得CymMV海南分离物CP序列，核苷酸与氨基酸序列相似性分析显示与已报导CymMVCP序列相似性分别为88.8%–96.1%和75.6%–91%。Ajjikuttira等（2002）通过对比26个亚洲分离物CP序列发现它们核苷酸与氨基酸的相似性分别为89.1%-99.7%和93.2%-100%，并且序列之间没有明显的地区差异。周国辉等（2004）通过RT-PCR扩增获得三个CymMV广东分离物CP序列，序列分析结果表明所获得的核苷酸序列与世界各地已报道的CymMVCP基因序列高度同源，通过对CymMVCP序列进化树分析，表明CymMV的多样性可能起因于其广泛的地理分布，而不是起因于寄主多样性。李欲轲等（2014）成功克隆获得了CymMV贵州分离物CP序列，序列相似性分析显示，该分离物的CP基因与16种已报道的CymMV各地分离物相似性均达95%以上，而与同属其他3种病毒CP基因相似性均低于48%。Rao等（2014）通过多序列比较，发现89个CymMV分离CP序列核苷酸与氨基酸的相似性分别为84.6%–100%和89.5%–100%，其中20个广州分离物与国内报导的CymMV分离物核苷3 酸与氨基酸的相似性分别为85.4%–99%和91.1%–99.6%，与国外报导的CymMV分离物核苷酸与氨基酸的相似性分别为84.6%–99.3%和89.5%–100%，并且N-末端比C-末端更保守。目前已经报导的CymMV全长序列共有12个，CP序列的报导相对较多（Kimetal.,1998；Sherpaetal.,2006；Vaughanetal.,2008；Wongetal.,1997；Yoonetal.,2012；李欲轲等，2014；潘俊松等，1999；张昌伟等，2013；周国辉等，2004）。Moles等（2007）根据85个CP核苷酸序列及37个RdRp部分核苷酸序列系统发育分析将CymMV分为A、B亚组，虽然CP序列核苷酸之间有差异但是在氨基酸之间没有表现出来，这说明核苷酸之间的变异有可能是同义替换造成的（Yoonetal.,2012）。Vaughan等（2008）也将已报导的CymMV全长序列划分为A、B两个亚组，并将获得的海南分离物CymMV-18-29归于亚组A，海南分离物CymMV-18-1、CymMV-18-30归于亚组B。Zhen等（2011）从海南香草兰分离得到CymMV海南分离物全长序列，进化树分析表明CymMV海南分离物归于亚组A，并且亚组A分离物间地域差异较小。1.2.5建兰花叶病毒检测方法对于建兰花叶病毒引起的兰花病毒病害，目前还没有有效的防治方法。因此，对于建兰花叶病毒的检测就尤为重要。检测方法主要有生物学检测、电镜检测、血清学及分子生物学方法。(1)鉴别寄主检测鉴别寄主是检测CymMV传统方法之一，但由于CymMV侵染不同兰花，症状表现不同，并有隐症现象，而且栽培环境对鉴别寄主症状表现也有一定影响。对于CymMV而言，不同的鉴别寄主，接种后症状表现及症状表现时间也有很大区别。CymMV接种毛蔓陀罗4天就出现黄褐色病斑；接种决明和望江南5-7天后都出现直径小于1mm的黑褐色坏死斑；接种番杏8天后先出现退绿色病斑，随后病斑变黄；接种蔓陀罗12天后才出现退绿斑，随后形成黑褐色枯斑；接种昆诺藜20天以后才出现褪绿黄褐色病斑（李梅等，2001；明艳林等，2006；潘俊松等，1997）。(2)电镜检测CymMV病毒的粒子为线状，电镜观察十分方便，因此，采用电镜直接观察病毒粒子是病毒检测较好的手段。孙光荣（1983）等从上海植物园采集有轻微花叶症状的兰花叶片，通过浸出法制样，2%磷钨酸负染，电镜下检查，查出大量棒状及稍稍弯曲4 的线状病毒颗粒，经试验进一步验证这些病毒颗粒为建兰花叶病毒及齿兰环斑病毒。孟春梅等（2007）利用免疫吸附电镜技术研究了侵染蝴蝶兰以及实验植物曼陀罗、苋色藜的CymMV和ORSV，发现样品细胞内病毒内含体清晰可见，金颗粒集中特异性强，而健康样品内几乎无金颗粒存在。有研究分离提纯厦门地区有退绿斑驳症状的蝴蝶兰叶片的病毒粒体，2%的磷钨酸负染后，透射电镜观察到大量CymMV线状病毒，病毒粒体长约470-490nm，宽约13nm（李梅等，2001）。(3)血清学检测抗血清的制备为病毒的检测提供基础，利用制备的抗血清为血清学检测奠定基础，目前，血清学方法是国内外检测兰花病毒的常用方法，除了琼脂双扩散、微量凝集法、对流免疫及ELISA外，近年还发展了一些新的血清学方法（张建军等，1999）。李欲柯（2014）采集了贵州省林业科学院表现出褪绿和花叶症状的长瓣兜兰病叶，ELISA检测为CymMV阳性。梁敏国和刘光华（2004）采用双抗体夹心法（DAS-ELISA）检测采集自广东不同地方带有花叶、黑褐色坏死斑等症状的不同兰花叶片，经检测发现这些兰花分别带有建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒，并且有的叶片同时含有两种病毒。孟春梅等（2007）采用胶体金免疫电镜技术，在带有CymMV的蝴蝶兰叶片细胞内观察到病毒内含体上胶体金分布密集而健康蝴蝶兰叶片则几乎没有胶体金分布。胶体金免疫的原理利用金的电荷分布将抗体抗原吸附从而进一步观察得出结论（常国权等，1992）。(4)分子生物学检测分子生物学检测法是通过检测病毒核酸来证实病毒的存在。由于是从核酸的水平来检测病毒，所以比血清学方法的灵敏度高，特异性更强，并且可以进行大批量的样品检测具有检测速度快，操作简便等优点，但需要较复杂的仪器（刘沛然等，2009）。潘俊松等（1999）通过RT-PCR扩增获得了CymMV海南分离物的CP基因，并克隆测序，序列对比后发现获得的分离物与国外分离物有差异。周国辉等（2004）采集广州顺德的墨兰和文心兰，以提取的带有症状的植株叶片总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，获得CymMV广东分离物的CP基因。杨翠云等（2006）通过2004-2005年对上海口岸进境和进境后种植的260个兰花品种上CymMV检测方法的研究建立了快速检测的免疫捕捉PCR技术（IC-RT-PCR）。随后建立起了多重RT-PCR同时检测两种或三种兰花病毒的方法（Alietal.,2014；Kimetal.,2015；李欲轲等，2014）。借助新兴的环介导等温扩增技术，随之建立了一种灵敏、特异、快速的分子生物学检测方法—环介5 导等温扩增技术（Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP），并且该检测方法比RT-PCR更灵敏，且具有操作简单，肉眼可见检测结果等特点（许春英等，2009）。1.3侵染性克隆研究侵染性克隆是指病毒具有侵染性的或能通过体外转录产生有活性的转录产物cDNA，其实质就是包含病毒完整基因组信息的基因库（Boyeretal.,1994）。在己知的植物病毒中，百分之九十以上是RNA病毒，在其复制过程中不出现DNA环节，而迄今主要是在分子水平进行改造和研究，因此，限制了病毒的分子生物学研究。DNA重组技术的出现促进了病毒学工作者将RNA病毒的基因组转化为互补的cDNA拷贝，然后插入到细菌质粒中进行复制，这种遗传操作使得研究工作变得非常方便。病毒侵染性全长克隆首先在Qβ噬菌体上获得成功（Taniguchietal.,1978），随后人们将这种技术应用到其它病毒中，如脊髓灰质炎病毒和类病毒上，取得了非常满意的效果，雀麦花叶病毒（Bromemosaicvirus，BMV），则是第一例成功构建侵染性克隆的植物病毒（Ahlquistetal.,1984）。通常，原核表达系统用于制备侵染性克隆，可以通过简单操作将病毒基因组克隆到细菌质粒。但由于特定病毒蛋白对宿主菌的毒性，连接到载体并转化转化到大肠杆菌（Escherichiacoli）的病毒全基因组cDNA不一定能稳定表达，有可能发生点突变或大片段缺失（Skotnickietal.,1993；Sriburietal.,2001）。引起不稳定有可能是大肠杆菌在复制质粒时有严格的碱基选择而这种选择作用会导致序列变异从而导致克隆侵染性的失去，也有可能是病毒自身序列存在隐形启动子和病毒蛋白翻译起始的隐形核糖体结合位点，从而在大肠杆菌中表达了毒性蛋白质（Fakhfakhetal.,1996；Fornsetal.,1997）。克服这种不稳定性可以通过替换宿主菌或克隆载体（Boyeretal.,1994）或者在关键位置插入内含子等方法解决（Johansen,1996；Vancanneytetal.,1990）。根据转录方式的不同，可将侵染性克隆分为体外转录侵染性克隆（体外转录侵染性RNA）和体内转录转录侵染性克隆（体内转录侵染性cDNA）。体外转录侵染性克隆主要是将病毒cDNA置于T3、SP6、λ（Pm）以及最常用的T7等来源于不同噬菌体原核启动子下游，通过体外转录，产生有侵染性的RNA（Dunnetal.,1983；Meltonetal.,1984）。Thompson等（2015）利用T7启动子成功构建了从四季豆上分离的黄瓜花叶病毒代表株系Bn57的侵染性克隆。体内转录侵染性克隆主要是利用如花椰菜花叶病毒35S启动子直接在植物体内高效转录，不需要体外转录的过程，并且不易降解获得的6 侵染性RNA较稳定（Vanetal.,1993）。有研究利用35S启动子直接在植物体内高效转录获得了侵染性强的三叶草黄脉病毒的cDNA克隆（Takahashietal.,1997）。侵染性cDNA克隆可以以质粒的形式在体外长期保存，但是构建的载体在转录之前要先进入到植物细胞核，这在一定程度上降低了侵染效率。病毒基因组全长的获得主要有两种方式，分段扩增然后拼接成全长cDNA或一步法扩增获得全长cDNA。大麦温和花叶病毒（Barleymildmosaicvirus，BaMMV）RNA2通过分段扩增两段cDNA拼接后获得有侵染性的体外转录物（Timpeetal.,1995），使用一步法RT-PCR获得了菊花矮化类病毒（Chrysanthemumstuntviroid，CSV）韩国分离物的全长侵染性克隆（Yoonetal.,2014）。构建的侵染性克隆侵染植物的方法有多种，如农杆菌侵染，基因枪轰击，人工摩擦接种，显微注射法，电穿孔转染（Hulletal.,2002；Kostetal.,1995；Liuetal.,2002；Wertetal.,2006）。其中农杆菌侵染只适用于cDNA克隆，而其它的方法适用于cDNA以及RNA转录产物。构建成功的克隆侵染植物后侵染性也受到多种因素的影响，如病毒复制酶，寄主因子等，有些构建的侵染性克隆在不同寄主上的侵染能力有很大差异甚至没有侵染力（Daglessetal.,1997；Heatonetal.,1989；Yoonetal.,2014）。同时非病毒序列及点突变也会对侵染性造成影响，一般认为病毒cDNA5′端与启动子之间存在非病毒核苷酸会强烈影响转录物的侵染力，而3′端的非病毒序列影响相对较小（Boyeretal.,1994）。因此，要获得高效率的侵染性，就要求转录产物在序列和结构上必须尽量与自然的RNA病毒保持一致性。目前在Potexvirus中，部分病毒已经成功的构建了利用T7启动子的体外转录侵染性克隆，如三叶草黄花叶病毒（Cloveryellowmosaicvirus，CyMV）（Holyetal.,1993）、木瓜花叶病毒（Papayamosaicvirus，PapMV）（Sitetal.,1993）、马铃薯X病毒（PotatovirusX，PVX）（Hemenwayetal.,1990）及CymMV侵染性克隆（Yuetal.,1998）。和其它Potexvirus病毒一样，CymMV编码五个蛋白，分别为RdRp、TGB1、TGB2、TGB3、CP，但每个蛋白行使功能的确切位置还不了解。有人将GFP序列与CymMVTGB1或CP序列连接转化烟草叶片，发现GFP/TGBp1可以在4种不同烟草叶片临近细胞间移动，而GFP/CP只在本生烟叶片细胞间移动（Howardetal.,2004）。Lu等（2009）研究两个不同的CymMV分离物时发现，分离物M2可以导致兰花和本生烟的系统侵染，而分离物M1只能导致兰花的系统侵染，进一步的研究发现M1的CP蛋白对病毒在细胞间的移动起到主导作用。Ju等（2005）构建连接有GFP的侵染性克隆PVX-GFP:TGBp2，7 并将GFP与TGB2连接构建表达载体pRTL2-GFP:TGBp2，将构建好的载体接种烟草与原生质体，观察到绿色荧光主要集中早囊泡与内质网。Mitra等（2003）的结果认为TGB2与内质网的定位有关但不是病毒运动所必须的，它的作用更有可能是帮助PVX病毒粒子离开内质网。Krishnamurthy等（2003）用同样的方法证实TGB3是PVX运动所必须的。1.4研究目的意义CymMV是发生最普遍、造成兰花产业损失最严重的病害之一，可以引起兰花叶斑、坏死等症状，严重影响兰花的经济价值和观赏价值，因此，开展针对该病毒的研究工作十分必要。本研究通过测定建兰花叶病毒的全基因组序列，并与国内国外已报道的全基因组序列进行比较，以期了解广东分离物全基因组特点。目前，对于CymMV基因组的分组研究较少，通过全序列及CP序列等的进化树分析，以期为CymMV基因组的分组提供一定的理论依据，进一步了解该病毒的进化规律，有利于抗病毒基因工程的开展。同时，对于CymMV基因功能的研究较少，本研究通过构建CymMV侵染性克隆，为进一步分析基因组的结构和功能奠定基础。除此之外我们可以将不同的ORF序列与不同的荧光蛋白序列相连，通过序列突变、缺失、基因互补等手段，进一步研究CymMV各部分在病毒侵染和传播过程中的作用。2材料与方法2.1材料2.1.1植物材料及病毒来源兰花样品采集于广东省内，保存于-20℃，经ELISA鉴定为感染建兰花叶病毒的样品。2.1.2主要试剂ExTaq酶、TaKaRaPrimeScriptOneStepRT-PCRKit、DL2000Marker、DL15000Marker、6×LoadingBuffer、10×LoadingBuffer、限制性内切酶BamHⅠ、KpnⅠ、SacⅠ、EcoRⅠ、T4DNA连接酶等购自大连宝生生物工程有限公司；X-gal、IPTG、Amp、Kan、Rif、1×TE等购自上海生工生物工程有限公司；8 胰蛋白胨（Tryptone）、酵母浸出液（YeastExtract）、琼脂粉、琼脂糖、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、β-巯基乙醇、无水乙醇、NaCl等生化试剂购自广州精科化玻仪器公司；快速质粒小提试剂盒、RNApreppure植物总RNA提取试剂盒购于天根生化科技（北京）有限公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购于北京康润科技有限公司；液氮购自广州气体厂。2.1.3菌种及载体pMD19-T-simple载体购自大连宝生生物工程有限公司；pCAMBIA2300-35S、含GFP序列载体pCAMBIA1302为本实验室保存；Escherichia.coliJM109，农杆菌GV3101菌株为本实验室保存。2.1.4主要仪器及设备离心机：HeRaeuslabfuge400R型冷冻高速离心机（上海医疗分析仪器厂）；Thermoscientific冷冻高速离心机(德国)；Eppendorfcentrifuge5804R冷冻高速离心机（德国）；PCR仪：TaKaRaPCRThermalCycler型PCR仪；核酸蛋白检测仪：NanoPhotometerTMPearl61010-1（德国ImplenGmbH）；DYY-6C型电泳仪（北京六一仪器厂）；UVP凝胶成像系统（美国SYNGENE公司）；移液器（芬兰Thermo、德国Eppendorf公司）；94-2定时恒温磁力搅拌器（上海浦东荣丰科学仪器公司）；FA2104电子天平（上海天平仪器厂）；pH计：PHS-3C（上海雷磁）；国产微波炉（美的公司）；HARRIS超低温冰柜（美国Forma公司）；冰箱（海尔）；电热恒温水浴锅DK-S22（上海精宏实验设备公司）；HVE-50灭菌锅（日本Hirayama公司）；单人型超净工作台（苏州净化设备厂）；9 SZ-93型自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）；HealForce生物安全柜(上海力申科学仪器有限公司)；通风橱：订制；制冰机：YKKYFM70；烘干机：上海一恒科学仪器有限公司；超纯水机：锐思捷Unique超纯水机（厦门锐思捷科学仪器有限公司）；TCSSP2型激光扫描共聚焦显微镜（德国Leica）。2.1.5主要试剂的配制70%乙醇：按体积比7/3的无水乙醇和双蒸水混匀，之后移入棕色玻璃瓶中室温保存；5×TBE溶液：27.5g硼酸、54gTris、3.73gEDTA溶于蒸馏水中，调pH至8.0，定容至1000mL；0.5×TBE溶液：将5×TBE溶液稀释10倍使用；1%琼脂糖凝胶：1g琼脂糖微波炉加热完全溶解于100mL0.5×TBE溶液中，加入5µLGoldenView混匀；LB液体培养基（PH7.0）：1%(W/V)Tryptone（胰蛋白胨），0.5%(W/V)YeastExtract（酵母抽提物），1%(W/V)NaCl，配制成1L溶液；LB固体培养基(PH7.0)：1LLB液体培养基，加入15g琼脂粉；0.1mol/LCaCl2溶液：称取1.1g无水CaCl2，溶于90mL蒸馏水中，定容至100mL，装于250mL三角瓶中，高温高压灭菌30min，4℃保存；50%甘油：将市售相对密度为1.26的甘油加双蒸水稀释1倍，高温高压灭菌；100mg/mLAmp母液：取100mg氨苄青霉素，加1mL双蒸水溶解，抽滤灭菌，20℃保存，使用时，终浓度为100µg/mL；50mg/mLKan母液：取50mg卡那霉素，加1mL双蒸水溶解，抽滤灭菌，20℃保存，使用时，终浓度为50µg/mL；10mmol/L乙酰丁香酮（AS）母液：称19.6mg的AS，先溶于少量甲醇中，然后慢慢加蒸馏水定容至10mL，4℃保存，使用时按100µm/L加入；1mol/L2-（N-吗啡啉）乙磺酸（MES）：称取19.52g的MES溶于水，用NaOH溶液调节PH至5.7，定容至100mL，过滤除菌，4℃保存，使用时按100mmol/L加入培养基中；X-gal：白色粉末，溶于二甲基甲酰胺溶液中，母液浓度为20mg/mL，避光保存10 于-20℃，无需过滤除菌；IPTG：白色粉末，溶于水溶液中，母液浓度为200mg/mL，需过滤除菌，避光保存于-20℃；利福平（Rif）：红色粉末，溶于甲醇，需过滤除菌，母液浓度为50mg/mL，20℃保存；抗原包被缓冲液(0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.6)：Na2CO31.59g；NaHCO32.93g；蒸馏水加至1升；洗涤缓冲液(0.02MPBS-吐温缓冲液，PBST，pH7.4)：NaCl8.0g；Na2HPO4·12H2O2.93g；KH2PO40.2g；KCl0.2g；蒸馏水加至1升后加Tween-200.5mL；抗血清稀释缓冲液(0.02MPBST，牛血清白蛋白溶液)：取0.1g牛血清白蛋白溶于用灭菌蒸馏水配制的PBST缓冲液100mL中即成；底物溶液(邻苯二胺溶液)pH5.0：柠檬酸2.55g；Na2HPO4.12H2O9.2g加蒸馏水500mL；称取40mg邻苯二胺(OPD)，溶解后加上述缓冲液至100mL，临用前加30％H2O20.15mL即成(注意邻苯二胺需现配现用)；反应的终止液：2M的H2SO4（98%的H2SO4的摩尔浓度为18.4mol/L）。2.2广东建兰花叶分离物的遗传多样性分析2.2.1RNA提取用具的处理用于RNA提取的各种型号的枪头、离心管和PCR管，配制和保存提取缓冲液之前的所有玻璃器具，均用0.1%DEPC水溶液浸泡24h后高压灭菌，在烘箱中烘干备用。2.2.2总RNA的提取根据天根植物总RNA提取试剂盒说明书进行，以下所有离心步骤均在室温下进行。具体操作步骤如下：(1)匀浆处理50-100mg植物叶片在液氮中迅速研磨成粉末，加入450µLRL（使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇），涡旋剧烈震荡混匀。(2)将所有溶液转移至过滤柱CS上(过滤柱CS放在收集管中)，12,000rpm离心2-5min，小心吸取收集管中的上清至RNase-Free的离心管中，吸头尽量避免接触收11 集管中的细胞碎片沉淀。(3)缓慢加入0.5倍上清体积的无水乙醇（通常为225µL），混匀（此时可能会出现沉淀），将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，12,000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。(4)向吸附柱CR3中加入350µL去蛋白液RW1，12,000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。(5)DNaseI工作液的配制：取10µLDNaseI储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70µLRDD溶液，轻柔混匀。(6)向吸附柱CR3中央加入80µL的DNaseI工作液，室温放置15min。(7)向吸附柱CR3中加入350µL去蛋白液RW1，12,000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。(8)向吸附柱CR3中加入500µL漂洗液RW（使用前请先检查是否已加入乙醇），室温静置2min，12,000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。(9)重复步骤8。(10)12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。(11)将吸附柱CR3放入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100µLRNase-FreeddH2O，室温放置2min，12,000rpm离心2min，得到RNA溶液。2.2.3RT-PCR扩增的引物根据CymMV的基因组全长序列CymMV-Taiwan（登录号：GenBank：AY571289）设计扩增全长的引物，分两段扩增，用引物CYⅠ-F/CYⅠ-R扩增CymMV前面2409bp(目的片段Ⅰ)，用引物CYⅡ-F/CYⅡ-R扩增CymMV后面4039bp(目的片段Ⅱ)。同时设计检测CP序列所用的引物CymMV-a/CymMV-b（表1），引物分别为：12 表1分段扩增三个分离物全长及CP序列的引物扩增片段位引入酶切扩增大小引物引物序列（5’-3’）置（nt）位点（bp）CYⅠ-F5’-末端GGGGTACCGGAAAACCAAACCTCACGTCTACKpnI2381CYⅠ-R2381-2409GAGGCATCAGGTATTAAAGAGATATAGGCCYⅡ-F2161-2188TAATGACTGGCTCAACAAGATCGGAAGC4039CYⅡ-R3’末端GGGAGCTCAATAATCTGGCTAAATATATSacⅠCymMV-a5482-5501ATGGGAGAGCCCACTCCAAC670CymMV-b6134-6154GTTATTCAGTAGGGGGTGCAG注：划线加粗部分为加入的酶切位点2.2.4RT-PCR分段扩增CymMV全长和CP序列RT-PCR的扩增用TaKaRaPrimeScript1stepRT-PCRKitVer2，反应体系按其说明书建议的进行，具体步骤如下：(1)RT-PCR反应体系：RNasefreeddH2O3.0µL上游引物(10μmol)0.4µL上游引物(10μmol)0.4µL2×1stepbuffer5.0µLPrimescript1stepenzymemix0.2µL模板RNA1µL总体积10µLRT-PCR扩增程序为:50℃30min;94℃5min，94℃30s，60℃30s，72℃2min（扩增片段Ⅱ时为4min，扩增CP序列为1min），35个循环;72℃10min，16℃保存。（2）电泳观察结果：取5µLRT-PCR反应产物与1µL6×LoadingBuffer混匀后在1%琼脂糖凝胶上电泳（5V/cm，30min），以DL2000DNAMarker（或DL15000DNAMarker）为分子量对照，在UVP凝胶成像系统中观察结果并拍照。分别获得2381bp和4039bp的目的条带。13 2.2.5RT-PCR产物的回收用北京润康诚业生物科技有限公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒，参照试剂盒说明进行目的条带的回收，具体步骤如下：(1)电泳：根据DNA片段的大小选择相应浓度的琼脂糖凝胶进行电泳。(2)切胶：电泳结束后，在紫外灯下迅速切出目的片段，尽量去除胶块边缘不含DNA的部分，并将胶块尽可能地切碎。(3)称量：将胶块装入一个预先称量过的1.5mL离心管中，称取重量，计算胶重。每管内的胶块不应超过700mg。(4)溶胶：按每1mg凝胶加入1µL膜结合液（MB）的比例（1:1）加入膜结合液（MB），混匀后置于55ºC水浴，每间隔1-2分钟混匀一次，直至胶块完全溶解（约5分钟左右）。(5)DNA结合：待凝胶溶液冷却至室温后，转移到插入收集管的离心吸附柱内，静置1分钟，室温下12,000rpm离心1分钟，弃除收集管中的废液，将离心吸附柱重新插回收集管中。最大容量950µL时，可将凝胶溶液分批转移到同一吸附柱内，分次离心。(6)清洗：加入600µL膜漂洗液（MW，请确认已加入无水乙醇！）于离心吸附柱中，室温下12,000rpm离心30秒，弃除收集管中的废液，将离心吸附柱重新插回收集管中。(7)再次清洗：加入600µL膜漂洗液（MW）于离心吸附柱中，室温下12,000rpm离心30秒，弃除收集管中的废液，将离心吸附柱重新插回收集管中。将离心吸附柱去盖再次离心2分钟，彻底除去残余漂洗液。(8)洗脱：小心取出离心吸附柱，将其套入一个1.5mL灭菌离心管中。向硅胶吸附膜的中央加入30µL洗脱缓冲液（EB），室温静置1分钟后，12,000rpm离心1分钟收集纯化的DNA片段。(9)储存：弃除离心吸附柱，获得的DNA片段可直接用于后续反应或于－20℃长期保存。2.2.6目的片段的TA克隆采用pMD19-TSimple载体进行TA克隆，构建重组质粒。连接反应按生产商推荐的方法进行，具体步骤为：电泳确定回收产物的纯度和浓度，按照载体与目的片段14 的摩尔比为1比3到1比10分别加入T载体和回收的目的片段，SolutionⅠ5µL，补充ddH2O至总体积10µL，16℃连接过夜。2.2.7大肠杆菌JM109感受态的制备大肠杆菌JM109感受态的制备具体步骤如下：(1)从-80℃保藏的JM109菌株用牙签挑取少许菌液稀释划线于LB固体培养基上，37℃培养12~16h；(2)挑取单菌落接种于30mLLB液体培养基中，37℃下培养12~16h；(3)按1%的接种量将大肠杆菌菌液接种于50mLLB培养基中；(4)37℃摇床培养1.5~2.0h至OD600为0.4左右，置冰水浴预冷；(5)转移至50mL预冷的离心管中，4℃恒温6000rpm离心10min；(6)弃尽上清液，将菌体置于冰水浴中，用30mL预冷的100mmol/LCaCl2-MgCl2混合液轻轻混匀洗涤一次；(7)4℃恒温，6000rpm离心10min；(8)弃尽上清液，将沉淀用1mL预冷的CaCl2-甘油混合液重新轻轻悬浮；(9)每管100µL分装至预冷的离心管中(冰浴中操作)，迅速置–80℃冰箱冷冻保存备用。2.2.8重组质粒的转化重组质粒的转化具体步骤如下：(1)从-70℃冰箱中取出感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上(2)将连接反应液加入感受态细胞悬液(含量不超过50ng，体积不超过10µL)轻轻弹匀，冰上放置30分钟；(3)42℃水浴热击90s，立即置冰上5min；(4)分别向管中加入800µLLB液体培养基(不含Amp)，混匀后，于37℃150rpm(此时严禁转速过高)振荡培养1.5小时；(5)给已经做好的含Amp（终浓度100μg/mL）的LB筛选平板上涂布40µLX-gal（20mg/mL）和4µLIPTG（200mg/mL），并晾干；(6)上述菌液4000rpm离心5min，倒掉上清，取沉淀涂布于含Amp、X-gal、IPTG的筛选平板上；15 (7)37℃倒置培养，观察菌落生长状况。2.2.9重组质粒的抽提挑取转化后长出的单菌落，接种于含抗生素的5mLLB培养液中，37℃180rpm震荡培养过夜后菌液PCR，将鉴定为阳性的克隆抽取质粒。质粒抽提采用天根生化科技（北京）有限公司快速质粒小提试剂盒（DP105），具体步骤如下：使用前请先在漂洗液PWT中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。(1)取1-4mL过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000rpm离心1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。(2)向留有菌体沉淀的离心管中加入150µL溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA和TIANRed），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。(3)向离心管中加入150µL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。(4)向离心管中加入350µL溶液P5，立即快速地上下颠倒混匀12-20次，充分混匀，此时将出现絮状沉淀。12,000rpm离心2min。注意：加入溶液P5后应立即混合，应快速上下颠倒混匀，避免产生局部沉淀。(5)将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。(6)向吸附柱CP3中加入300µL漂洗液PWT（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。(7)将吸附柱CP3放入收集管中，12,000rpm离心1min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。(8)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100µL洗脱缓冲液TB，12,000rpm离心30sec将质粒溶液收集到离心管中。2.2.10重组质粒的双酶切及序列测定连接到T载体的目的片段Ⅰ两端带有酶切位点KpnⅠ和BamHⅠ，目的片段Ⅱ两端带有酶切位点BamHⅠ和SacⅠ，因此可以分别双酶切进行重组质粒的鉴定。反应16 体系分别为：片段Ⅰ10×KBuffer2µL，KpnⅠ1µL(10U/µL)，BamHⅠ1µL(10U/µL)待检测质粒1000ng，加ddH2O至终体积20µL；片段Ⅱ10×MBuffer2µL，SacⅠ1µL(10U/µL)，BamHⅠ1µL(10U/µL)待检测质粒1000ng，加ddH2O至终体积20µL。双酶切鉴定正确的质粒送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果拼接得到CymMV基因组全长。将含有目的片段的JM109菌液保存于15％的甘油中，具体为：取一灭菌干净的1.5mL离心管，于超净台上加入700mL菌液，300mL50％甘油，混匀，于-70℃保存。2.2.11序列分析通过测序拼接获得三个CymMV分离物的全长，这些序列分别和NCBI已经报道序列进行对比，利用生物学软件DNAStar进行相似性分析；利用生物学软件MEGA5.2经过1000次重复得到序列Neighbour-joining进化树。参与全长、RdRp、TGB序列相似性及进化树分析的CymMV病毒的编号在NCBI上的登录号见表2，参与CP序列相似性及进化树分析的CymMV病毒的编号在NCBI上的登录号见表3。表2参与全长、RDRP、TGB序列对比的基因序列IsolateAccessionhostDateCountrynumberCymMV-JapanAB197937不祥不祥JapanCymMV-type2AF016914Cattlleyasp不祥KoreanCymMV-SMi2AM055640不祥不祥YunnanCymMV-plm1AM055720Phaiustankervilliae不祥India:PalampurCymMV-TaiwanAY571289不祥不祥TaiwanCymMV-18-1EF125178Dendrobiumsp不祥USA:HawaiiCymMV-18-29EF125180Dendrobiumsp不祥USA:HawaiiCymMV-18-30EF125179Dendrobiumsp不祥USA:HawaiiCymMV-M2EU314803不祥不祥TaiwanCymMV-HNXLHQ681906Vanillaplanifolia2009China:HainanCymMV-NJ-1JQ860108Phalaenopsissp2011China:NanjingCymMV-SingaporeU62963Cattleyaorchid不祥Singapore17 表3参与CP序列对比的基因序列IsolateAccessionhostDateCountrynumberCymMV-CHN-ZJHZ67DQ067886Cymbidium2005ChinaCymMV-CHN-ZJHZ62DQ067884Cymbidium2005ChinaCymMV-CHN-ZJHZ52DQ067882Cymbidium2005ChinaCymMV-CHN-HBWH21DQ067880ChineseCymbidium2005ChinaCymMV-gd1AY360408Oncidiumsp.2003ChinaCymMV-BJKTLC3GU295169Cattleya×hybrida2009ChinaCymMV-CHN-ZJHZ69DQ067887Cymbidium2005ChinaCymMV-CHN-ZJHZ63DQ067885Cymbidium2005ChinaCymMV-CHN-ZJHZ61DQ067883Cymbidium2005ChinaCymMV-CHN-HBWH22DQ067881Cymbidium2005ChinaCymMV-CHN-FJZZ13DQ067879ChineseCymbidium2005ChinaCymMV-GZKTLC6GU295170Cattleya×hybrida2009ChinaCymMV-SCDXZC4GU295172Cymbidiumhybrid2009ChinacultivarCymMV-gd3AY360410Cymbidiumsinense2003ChinavarmargicoloratumCymMV-KMMLC2GU295171Cymbidiumsinensis2009ChinaCymMV-ZJXTHC1GU295167Cymbidium2009ChinaensifoliumCymMV-FS1KF853246Oncidiumsp.2011ChinaCymMV-FS2KF853247Phalaenopsis2011ChinaCymMV-FS4KF853249Phalaenopsis2011ChinaCymMV-FujianEF632297Vanillaplanifolia不祥ChinaCymMV-HNXLHQ681906Vanillaplanifolia2009ChinaCymMV-type2AF016914Dendrobiumsp不祥KoreanCymMV-18-29EF125180Dendrobiumsp不祥USA:HawaiiCymMV-FS5KF853250Phalaenopsis2011ChinaCymMV-GZ1KF853251Cymbidiumhybrid2010ChinaCymMV-CHKF853252Cymbidiumsinense2010ChinaCymMV-GZ2KF853253Phalaenopsis2010ChinaCymMV-GZ3KF853254Phalaenopsis2010ChinaCymMV-FS6KF853255Dendrobiumsp.2010ChinaCymMV-ZH1KF853256Cymbidiumsinense2011ChinaCymMV-ZH2KF853257Phalaenopsis2011ChinaCymMV-FS7KF853258Phalaenopsis2012ChinaCymMV-FS8KF853259Cymbidiumhybrid2012ChinaCymMV-FS9KF853260Dendrobiumsp.2012ChinaCymMV-FS10KF853261Phalaenopsis2012ChinaCymMV-SZ1KF853262Phalaenopsis2012ChinaCymMV-SZ2KF853263Phalaenopsis2012ChinaCymMV-SZ3KF853264Phalaenopsis2012ChinaCymMV-SZ4KF853265Phalaenopsis2012ChinaCymMV-SKP2AJ585203Orchids2003India18 CymMV-CYK9AB541542Cymbidiumsp.2007SouthKoreaCymMV-CYK7AB541540Cymbidiumsp.2007SouthKoreaCymMV-CK25AB541534Cymbidiumvirescens2007SouthKorea续上表CymMV-DEK26AB541558Dendrobiumsp.2007SouthKoreaCymMV-DEK21AB541554Dendrobiumsp.2007SouthKoreaCymMV-ONK23AB541570Oncidiumsp.2007SouthKoreaCymMV-CK15AB541524Cymbidiumvirescens2007SouthKoreaCymMV-CYK5AB541538Cymbidiumsp.2007SouthKoreaCymMV-CYK13AB541546Cymbidiumsp.2007SouthKoreaCymMV-CYK15AB541548Cymbidiumsp.2007SouthKoreaCymMV-DEK28AB541560Dendrobiumsp.2007SouthKoreaCymMV-DEK30AB541562Dendrobiumsp.2007SouthKoreaCymMV-CYK11AB541544Cymbidiumsp.2007SouthKoreaCymMV-CK13AB541522Cymbidiumsp2007SouthKoreaCymMV-CK27AB541536Cymbidiumvirescens2007SouthKoreaCymMV-ONK19AB541566Oncidiumsp.2007SouthKoreaCymMV-ONK21AB541568Oncidiumsp.2007SouthKoreaCymMV-DEK32AB541564Dendrobiumsp.2007SouthKoreaCymMV-KC-3AJ606103Phalaenopsis2003SouthKoreaCymMV-KC-13AJ606104Phalaenopsis2003SouthKoreaCymMV-CyI1AJ564562Phaiustancarvilleae2003IndiaCymMV-plm1AJ581998Cymbidium2003IndiaCymMV-OrissaAJ871374Orchids2004IndiaCymMV-MDG01AM236024Vanillaplanifolia2006MadagascarCymMV-FIJ01AM236029Vanillaplanifolia2006FijiCymMV-skt1AJ581997Cattleya2003IndiaCymMV-SKP1AJ585202Orchids2003IndiaCymMV-CHN-FJZZ12DQ067878ChineseCymbidium2005ChinaCymMV-krlAJ698947Cattleyasp.2004IndiaThongchalGodCymMV-Lembang-BandungAB693984Cymbidium2012IndonesiapurpureumCymMV-GunungSindurAB693982Dendrobiumsp.2009IndonesiaCymMV-MalangAB693986PhalaenopsisKlon2012Indonesia237ECymMV-SurabayaAB693987Oncydiumsp.2012IndonesiaCymMV-AscocendaSingaAF405719AscocendaSinga2001SingaporeChibaChibaCymMV-ArantheraAnneAF405721ArantheraAnne2001SingaporeBlackBlackCymMV-ArundinaAF405725Arundina2001SingaporegraminifoliagraminifoliaCymMV-ArandaNasreenAY049770ArandaNasreen2001SingaporeGayoonGayoonCymMV-VandaPoepoeAF405729VandaPoepoeDian2001SingaporeDianaCymMV-FPo05AM236030Vanillatahitensis2006FrenchPolynesiaCymMV-MalaysiaAJ428273不祥2002MalaysiaCymMV-TaiwanAY571289不祥2004TaiwanCymMV-CSAY429021Cymbidiumsinense2003Taiwan19 CymMV-M2EU314803不祥2007TaiwanCymMV-OncAY376393Oncidium1996ThailandCymMV-MokAY376392Mokara1996Thailand续上表CymMV-CatAY376391Cattleya1996ThailandCymMV-Japan1AB197937不祥2005JapanCymMV-USA1EF125178Dendrobiumsp.2006USACymMV-USA2EF125179Dendrobiumsp.2006USACymMV-USA3EF125180Dendrobiumsp.2006USACymMV-RUN01AM236022Vanillaplanifolia2006ReunionislandCymMV-RUN03AM236023Vanillaplanifolia2006ReunionislandCymMV-18-1EF125178Cymbidiumsp不祥USA:HawaiiCymMV-NHRIK1EU683880不祥2008SouthKoreaCymMV-NIHHSK2HQ644132Phalaenopsissp不祥SouthKoreaCymMV-C-LZ21KP137372Calanthesp2013China:TibetCymMV-C-LZ18KP137371Vandacristata2013China:TibetCymMV-C-LZ14KP137370Bulbophyllumsp2013China:TibetCymMV-C-LZ06KP137369Cymbidiumfaberi2013China:TibetCymMV-C-LZ02KP137368Cymbidiumfaberi2013China:TibetCymMV-ZHP1FJ356061Doritaenopsissp2008ChinaCymMV-ZHD1EU672821Dendrobiumcv2006ChinaCymMV-xmGQ507023mothorchid2009China:XiamenCymMV-FRA10AM236027Vanillabahiana不祥France:CherbourgCymMV-FRA08AM236026Vanillasp不祥France:CherbourgCymMV-FPo04AM236020Vanillatahitensis2006FrenchPolynesiaCymMV-FPo01AM236019Vanillatahitensis2006FrenchPolynesiaCymMV-SMi2AM055640Paphiopedilum不祥不祥dianthumCymMV-CP01KF225473不祥2011ChinaCymMV-18-30EF125179Dendrobiumsp不祥USA:Hawaii2.3建兰花叶病毒侵染性克隆构建2.3.1植物双元表达载体pCAMBIA2300-35S改造将接头JT-F和JT-R溶解于1×TE溶液中至终浓度为100μmol，各取5µL的单链，混合后70℃保温10min，徐徐冷却至室温，与经KpnⅠ和SacⅠ酶切的pCAMBIA2300-35S载体连接，反应体系为：连接酶10×Buffer2µL，T4DNA连接酶1µL，接头与载体按3：1分子比，加ddH20至终体积20µL，于16℃连接过夜，转化大肠杆菌，双酶切正确、测序成功的改造质粒标记为pCAMBIA2300-JT，改造后的质粒添加了KpnⅠ、BamHⅠ、SacⅠ等酶切位点。接头为JT-F：CTACTGAAGGGATCCTGCGCATGGTACCTAGCGTJT-R：CTAGACGCTAGGTACCATGCGCAGGATCCCTTCAGTAGAGCTKpnⅠBamHⅠSacⅠ20 2.3.2两个目的片段分别连接到pCAMBIA2300-JT具体构建如图1所示，将片段Ⅰ和片段Ⅱ分别从T载体上双酶切回收后依次连接到同样双酶切后回收的载体pCAMBIA2300-JT，获得侵染性克隆载体。图1质粒pCAMBIA-CymMV的构建示意图21 2.3.3农杆菌GV3101菌株感受态细胞的制备于50µg/mLRif的LB培养基平板上活化保存于-80℃的农杆菌GV3101菌株，28℃培养两天，挑取单菌落接种于5mL含50µg/mLRif的LB液体培养基中，28℃180rpm过夜摇菌，形成种子液。取此5mL菌液，加入到100mL的LB液体培养基中，28℃180rpm摇2h左右，至OD600为0.6-0.8。分装到2mL的离心管中，冰浴10min，冰浴时不时摇匀，让细菌进入休眠状态。4℃4000rpm离心10min，去除上清液，加入200µL的冰预冷的10%甘油重悬菌体，4℃下4000rpm离心10min，收集沉淀。再用200µL的冰预冷的10%甘油重复洗1-2次。最后加入100µL冰预冷的10%甘油重悬沉淀，即为农杆菌感受态细胞，于-80℃冰箱保存备用。所有操作都在无菌条件下进行。2.3.4电击转化取干净灭菌的1.5mL离心管，加入1mLLB液体培养基28℃预热。从-80℃冰箱中取出GV3101感受态细胞，冰浴解冻。在解冻后的100mL感受态细胞中加入待转化质粒pCAMBIA-CymMVDNA1µL（约50ng），轻微混匀。取无菌的电击杯冰浴，将其中的50µL感受态细胞加入到电击杯中，冰浴1min。打开Cyto-Pulse电击仪，将电击杯放入电击仪中，设定点击参数：a.电压（voltage）=1100Vb.脉冲宽度（pulsewidth）=0.2000millisec（可增加至0.5000millisec）c.脉冲间隔（pulseinterval）=0.2secd.脉冲次数（timesofpulse）=5times（Ntime）电击：将电击后的样品（50µL）全部加入到预热的LB培养液中。28℃150rpm下摇菌1-2h，以利于细菌的复苏和质粒编码抗性基因的表达。取100mLLB固体培养基加热融化，待冷却到60℃以下时，加入100µL浓度为50mg/mLKan母液，100µL浓度为50mg/mLRif母液，混匀后分倒5个培养皿；将转化后复苏的菌液在4℃4000rpm离心5min收集菌体，弃除大部分上清，打匀沉淀后全部涂布于上述LB平板上，正向放置30min待液体吸收，28℃倒置培养24-36h。待菌落长至1-2mm大小时挑取单菌落于5mL液体LB培养基中（含100µL/mLRif和50µg/mLKan）28℃180rpm摇菌培养12-16h，浑浊后进行菌液PCR，分别扩增片段Ⅰ和片段Ⅱ，获得两个目的片段的为转化成功的菌株，转化成功的菌株送测序然后保22 存。具体为：取一灭菌干净的1.5mL离心管，于超净台上加入700mL菌液，300mL50％甘油，混匀，于-70℃保存。2.3.5农杆菌介导的植物接种含重组质粒的农杆菌过夜培养与含抗生素(Kan和Rif)的LB培养液中，28℃180rpm震荡培养至对数期（OD600为0.6左右），6000rpm离心1min收集菌体。然后用含终浓度100mmol·L－1MES、10mmol·L－1MgCl－12和100μmol·L乙酰丁香酮的无菌水重悬液，调整菌液浓度使其OD600约为1.0左右，室温下放置2-3小时。接下来用1mL注射器针头在供试植物叶片背部针刺2-3个小孔，一手按住叶面小孔处，一手用无针头的针管将菌液沿小孔慢慢注入叶背组织空隙处。空载体pCAMBIA2300-JT为阴性对照，感染建兰花叶病毒植株摩擦接种为阳性对照，每个处理6个重复，注射后在温室中培养(昼27℃/夜22℃)，观察烟草发病情况。供试植株为3-4周龄的本氏烟。2.3.6侵染性克隆检测接种本生烟发病情况本生烟注射接种含有CymMV全长序列重组质粒的农杆菌30-40天后观察症状，RT-PCR及ELISA检测新叶是否含有病毒外壳蛋白。2.3.6.1RT-PCR检测检测方法同2.1.9。2.3.6.2ELISA检测ELISA检测具体步骤如下：（1）取显症植物叶片和健康叶片用抗原包被缓冲液配制1：100（1g叶片/100mL包被缓冲液）的样品悬浮液，过滤或3000rpm低速离心后备用。（2）将抗原按设计在酶联扳上加样，每孔200µL，于4℃冰箱过夜（或25℃温箱孵育3-5小时，或37℃孵育2小时）。（3）洗板甩去酶标板上各孔中的液体，用PBST洗3次酶标板，每隔3-5分钟洗1次，每次每孔加PBST各300ul，最后一次洗完将酶标板上洗涤液甩干。（4）用IgG稀释缓冲液将购买的PVY特异抗体以1:40000的倍数进行稀释。4℃保存备用。（5）加CymMV特异抗体在酶标板上每孔加入100µL稀释后的抗体，各重复23 1次；37℃恒温箱中孵育2小时。（6）加入酶标抗体洗板3次后，加酶标抗体。每孔加入用血清稀释液按1：10000比例稀释的酶标抗体液100µL，在37℃电热恒温培养箱中孵育2小时。（7）加底物溶液洗板3次后，加入底物溶液，每孔100µL，置37℃电热恒温培养箱中蔽光10分钟显色。ELISA结果判断方法：当样品OD492值大于或等于阴性对照OD492值的2倍，样品判断为阳性。2.4瞬时表达2.4.1三个分离物全长表达载体的构建在侵染性克隆载体CymMV全长后面加入GFP序列，用引物GFP-F/NOS-R从pCAMBIA1302上扩增GFP到Nos间1037bp的片段，SacⅠ和EcoRⅠ双酶切回收后与同样双酶切回收后将Nos切掉的pCAMBIA-CymMV-GDFS1、pCAMBIA-CymMV-GDFS2、pCAMBIA-CymMV-GDFS3、pCAMBIA2300-JT相连，连接产物转化大肠杆菌JM109。选取抗性菌株揺菌，菌液PCR与双酶切检测，双酶切检测结果正确的送测序。连接成功的载体分别标记为pCAMBIA-CymMV-GDFS1G、pCAMBIA-CymMV-GDFS2G、pCAMBIA-CymMV-GDFS3G、pCAMBIA-GFP。引物序列如表4所示。表4扩增pCAMBIA1302上GFP到Nos间序列的引物扩增大小引物引入酶切位点引物序列（5’-3’）（bp）GFP-FSacICGAGCTCCATGGTAGATCTGACTAGTAAAGG1037NOS-REcoRIGGAATTCCCCGCCAATATATCCTGTCAAAC注：下划线加粗部分为加入的限制性酶切位点24 2.4.2PCR扩增获得pCAMBIA1302上GFP到Nos间1037bp目的条带扩增体系（25µL）如下：灭菌双蒸水17.3µL10×ExTaqBuffer2.5µL2.5mmol/LdNTPMixture2.0µL上游引物1.0µL下游引物1.0µLDNA聚合酶0.2µLDNA模版1.0µL总体积25µLPCR扩增程序为:94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，35个循环;72℃10min，16℃保存。2.4.3农杆菌介导的植物接种含重组质粒的农杆菌过夜培养与含抗生素(Kan和Rif)的LB培养液中，28℃180rpm震荡培养至对数期（OD600为0.6左右），6000rpm离心1min收集菌体。然后用含终浓度100mmol/LMES、10mmol/LMgCl2和100μmol/L乙酰丁香酮的无菌水重悬液，调整菌液浓度使其OD600约为1.0左右，室温下放置2-3小时。含有重组质粒pCAMBIA-CymMV-GDFS1G、pCAMBIA-CymMV-GDFS2G、pCAMBIA-CymMV-GDFS3G、pCAMBIA-GFP、pCAMBIA2300-JT的农杆菌重悬液分别接种本生烟。2.4.4观察接种后烟草GFP荧光变化情况注射3天后，用B-100A型高强度手提式长波紫外灯检测GFP荧光的变化情况，并用带有紫外和黄色滤光片的数码相机拍照记录。同时，剪取注射区域附近的叶片用激光扫描共聚焦显微镜观察荧光分布情况。40天后观察叶片的发病情况。25 3结果与分析3.1CymMV广东分离物的遗传多样性分析3.1.1RT-PCR分别获得CymMV分离物两个目的片段实验材料是保存于实验室从广州、佛山等地采集的8份兰花样品，经过ELISA鉴定都带有CymMV病毒。以提取叶片的总RNA为模板，使用引物CYⅠ-F/CYⅠ-R为引物扩增时全部都有目的条带，当使用引物CYⅡ-F/CYⅡ-R为引物扩增时，只有三个样品有目的条带并且都是采集自佛山的样品，后续实验就以这三个样品为实验材料，分别标为CymMV-GDFS1、CymMV-GDFS2、CymMV-GDFS3。分别用引物CYⅠ-F/CYⅠ-R，CYⅡ-F/CYⅡ-R对这3份提取的总RNA进行RT-PCR扩增。扩增产物在1.0%琼脂糖凝胶上电泳后，可以分别观察到2381bp和4039bp的目的条带如图2所示。图2三个兰花分离物总RNA的RT-PCR分段扩增电泳图A、B分别为扩增的目的片段Ⅰ、Ⅱ，M：15000Marker；1：空白对照；2：GDFS1；3：GDFS2；4：GDFS3；3.1.2CymMV分离物目的片段的克隆及重组质粒鉴定将目的片段Ⅰ与目的片段Ⅱ分别切胶回收、连接到pMD19-TSimple载体后转化大肠杆菌JM109。重组质粒分别进行RCR及双酶切鉴定。内切酶KpnⅠ和BamHⅠ分别酶切pMD19T-Ⅰ，内切酶SacⅠ和BamHⅠ分别酶切pMD19T-Ⅱ，双酶切电泳后可以分别观察到目的条带如图3所示，3A中分别得到了2300bp的目的条带与2700bp26 的载体片段，3B中分别得到了4000bp的目的条带与2700bp的载体片段，与预期结果一致，表明已成功分别将三个分离物的目的片段Ⅰ与目的片段Ⅱ插入到pMD19-Tsimple载体中，分别标记为pMD19T-Ⅰ-GDFS1、pMD19T-Ⅰ-GDFS2、pMD19T-Ⅰ-GDFS3与pMD19T-Ⅱ-GDFS1、pMD19T-Ⅱ-GDFS2、pMD19T-Ⅱ-GDFS3。将双酶切正确的样品分别送样测序。将含有pMD19T-Ⅰ、pMD19T-Ⅱ的E.coliJM109保存于15%的甘油中。图3阳性重组质粒的双酶切鉴定A、B分别为扩增的目的片段Ⅰ、Ⅱ重组质粒的双酶切，M：15000Marker；1：pMD19T-Ⅰ-GDFS1；2：pMD19T-Ⅰ-GDFS2；3：pMD19T-Ⅰ-GDFS3；3.1.3CymMV序列分析3.1.3.1全基因组的结构特征和序列分析pMD19T-Ⅰ、pMD19T-Ⅱ分别测序后用软件SeqMan拼接，获得了三个分离物CymMV-GDFS1、CymMV-GDFS2、CymMV-GDFS3的全长序列，结果显示三个分离物分别由6227、6222、6224个碱基组成。用EditSeq和ExPASy在线软件ProtParam分析氨基酸的理化参数，可知三个CymMV分离物各开放阅读框碱基含量及编码氨基酸的特征。CymMV-GDFS1全长各碱基含量A、G、T、C分别为26.54%、19.55%、24.64%、29.20%。5’末端1-73bp为非编码区，ORF1(74-4327bp)编码1419个氨基酸的RdRp，ORF2(4334-5035bp)/ORF3(5011-5349bp)/ORF4(5204-5479bp)编码230/113/92个氨27 基酸的三联体蛋白TGB1/TGB2/TGB3，ORF5(5482-6153bp)编码224个氨基酸的CP，3’末端6154-6227bp为非编码区。CymMV-GDFS2全长各碱基含量A、G、T、C分别为26.52%、19.64%、24.54%、29.30%。5’末端1-72bp为非编码区，ORF1(73-4326bp)编码1419个氨基酸的RdRp，ORF2(4332-5033bp)/ORF3(5008-5346bp)/ORF4(5201-5476bp)编码234/113/92个氨基酸的三联体蛋白TGB1/TGB2/TGB3/，ORF5(5479-6150bp)编码224个氨基酸的CP，3’末端6151-6222bp为非编码区。CymMV-GDFS3全长各碱基含量A、G、T、C分别为26.55%、19.56%、24.56%、29.33%。5’末端1-73bp为非编码区，ORF1(74-4327bp)编码1419个氨基酸的RdRp，ORF2(4334-5035bp)/ORF3(5011-5349bp)/ORF4(5204-5479bp)编码230/113/92个氨基酸的三联体蛋白TGB1/TGB2/TGB3/，ORF5(5482-6153bp)编码224个氨基酸的CP，3’末端6154-6224bp为非编码区。三个分离物四种碱基含量与G+C含量之间差别不大(表6)；三个分离物间GDFS1与GDFS3各ORF核苷酸位置完全一样，而GDFS2的ORF1起始位置提前一个碱基，ORF2起始位置提前两个碱基，ORF3、ORF4、ORF5则分别提前了3个碱基（表7）。表6CymMV分离物碱基含量碱基含量（%）分离物GATCG+CGDFS119.5526.5424.6429.2048.75GDFS219.6426.5224.5429.3048.94GDFS319.5626.5524.5629.3348.8928 表7CymMV分离物各ORF特征开放阅读框分离物核苷酸位置（nt）氨基酸数（aa）氨基酸分子量（kDa）(ORF)ORF174-43271417160ORF24334-503523026GDFS1ORF35011-534911313ORF45204-54799210ORF55482-615322424ORF173-43261417160ORF24332-503323026GDFS2ORF35008-534611313ORF45201-54769210ORF55479-615022424ORF174-43271417160ORF24334-503523026GDFS3ORF35011-534911313ORF45204-54799210ORF55482-6153224243.1.3.2CymMV全基因组序列相似性和进化树分析核苷酸相似性分析显示（表8），本实验克隆获得的3个CymMV全长序列与已报导的12个CymMV全长序列相似性在87.3%-97.3%之间，3个CymMV全长序列之间的相似性为98.1%-99.3%之间。CymMV-GDFS1与CymMV-GDFS2相似性最低为98.1%，CymMV-GDFS2与CymMV-GDFS3相似性为98.5%，CymMV-GDFS1与CymMV-GDFS3相似性最高为99.3%。其中本实验克隆的三个分离物与来自Hawaii的CymMV-18-30相似性都是最低87.3%，CymMV-GDFS1和CymMV-GDFS3与来自Korean的CymMV-type2相似性都是最高的为都是97.3%，此外，本实验克隆的三个分离物与来自Hawaii的另一个分离物CymMV-18-1的相似性为88.5%，本实验克隆的三个分离物和除此之外的10个分离物相似性都在96%-97.3%之间。29 表8CymMV分离物全长与GenBank已知全长核苷酸相似性比对123456789101112131415187.387.387.386.887.487.387.387.487.587.488.787.498.387.7CymMV-18-30298.199.39697.296.79797.196.696.696.997.388.597CymMV-GDFS1398.595.997.196.796.696.896.696.596.29788.596.9CymMV-GDFS249697.296.99797.196.896.796.897.388.597CymMV-GDFS3596.395.795.796.695.795.895.596.48896.8CymMV-HNXL697.397.197.49797.196.797.788.697.3CymMV-Japan796.996.996.896.896.397.288.497CymMV-M2896.896.796.796.49788.496.8CymMV-NJ-1996.896.896.897.588.797.7CymMV-plm11096.796.497.188.796.8CymMV-Singapore1196.197.188.696.8CymMV-SMi21296.989.996.6CymMV-Taiwan1388.697.6CymMV-type21489.1CymMV-18-115CymMV-18-29利用MEGA5.2对这15个CymMV序列进行近邻相连法（neighborjoining）分析，获得这15个序列的系统进化树（图4）。从图中可以看出15个序列分成了2个大的亚组，和本实验所得的三个序列相似性最低的Hawaii的两个序列独立成为一个亚组，这也说明这两个序列和其它序列的亲缘关系也较远。另一个大的亚组里，三个得到的序列和来自日本的分离物CymMV-Japan的亲缘关系是最近的，其次和来自南京的分离物CymMV-NJ-1的亲缘关系也较近，CymMV亲缘关系可能和地理位置关系较大。由图也可以看出这15个分离物除了下面2个分离物外，其它大都集中在亚组A，说明CymMV遗传变异性小，亲缘性较高。30 亚组A亚组B图4CymMV分离物全长与GenBank已知序列基因组全长的系统发育进化树3.1.3.3CymMVCP序列相似性和进化树分析通过DNAStar软件分别分析三个分离物CP核苷酸序列和氨基酸序列的相似性。核苷酸相似性分析显示（附录A、C），本实验中克隆的3个CymMVCP序列与已报道的111个CymMVCP序列相似性为86%-99%之间，本实验获得三个CymMV与来自台湾的CymMV-Cat相似性最低，CymMV-GDFS2与9个分离物、CymMV-GDFS3与2个分离物相似性最高。其中，本实验获得的3个CymMVCP序列之间的相似性在97.6%-99.9%之间，与54个国内已报导的CymMVCP序列相似性在86%-99%之间，与57个国外已报导的CymMVCP序列相似性在88%-99%之间。CymMV-GDFS1与CymMV-GDFS2相似性最低为97.6%，CymMV-GDFS1与CymMV-GDFS3相似性为97.8%，CymMV-GDFS2与CymMV-GDFS3相似性最高为99.9%；与54个国内已报导的CymMVCP序列相比较，分离物CymMV-GDFS1、CymMV-GDFS2、CymMV-GDFS3与来自台湾的CymMV-Cat相似性最低都为86%，31 CymMV-GDFS1与来自佛山的CymMV-FS2、CymMV-FS4、CymMV-FS5、来自台湾的CymMV-Taiwan相似性最高都为99%；与57个国外已报导的CymMVCP序列相比较，CymMV-GDFS2与来自India的CymMV-CyI1、来自France的CymMV-FPo01相似性最低为88%，分离物CymMV-GDFS2与来自朝鲜的CymMV-DEK28、CymMV-DEK30、来自日本的CymMV-Japan1相似性，分离物CymMV-GDFS3与CymMV-Japan1、SouthKorea的分离物CymMV-ONK23相似性最高都为99%。氨基酸相似性分析显示（附录B、D），本实验中克隆的3个CymMVCP序列与已报道的111个CymMVCP序列相似性为90.5%-100%之间，CymMV-GDFS1与3个分离物相似性最低，CymMV-GDFS2、CymMV-GDFS3与50个分离物相似性最高。其中，本实验获得的3个CymMVCP序列之间的相似性在98.7%-100%之间，与54个国内已报导的CymMVCP序列相似性在91%-100%之间，与57个国外已报导的CymMVCP序列相似性在90.5%-100%之间。CymMV-GDFS1与CymMV-GDFS2、CymMV-GDFS2的相似性都为98.7%，CymMV-GDFS2与CymMV-GDFS3相似性为100%；与54个国内已报导CymMVCP序列相比较，CymMV-GDFS1与CymMV-Cat的相似性最低为91%，CymMV-GDFS2、CymMV-GDFS3与参与比较的国内分离物中27个的相似性最高都为100%。与57个国外已报导的CymMVCP序列相比较，CymMV-GDFS1与来自Malaysia的CymMV-Malaysia、来自Indonesia的CymMV-Lembang-Bandung相似性最低都90.5%，CymMV-GDFS2、CymMV-GDFS3与参与比较的国外分离物中23个相似性最高都为100%。利用MEGA5.2对这114个CymMVCP序列进行近邻相连法（neighborjoining）分析，获得这114个序列核苷酸和氨基酸的环状系统进化树（图5、6）与树状系统进化树（附录E）。从图中可以看出核苷酸序列之间CymMV-GDFS1与CymMV-FS4亲缘关系最近，而CymMV-GDFS2、CymMV-GDFS3与CymMV-DEK30亲缘关系最近(图5)；氨基酸序列之间CymMV-GDFS1与CymMV-FS4亲缘关系同样最近、CymMV-GDFS3与CymMV-ZH2亲缘关系最近、CymMV-GDFS2与CymMV-C-LZ02亲缘关系最近(图6)，而三个分离物之间亲缘关系较远。32 CymMV-CHN-HBWH21/DQ067880CymMV-Mok/AY376393CymMV-NHRIK1/EU683880CymMV-Cat/AY376391CymMV-Onc/AY376393CymMV-FRA10/AM236027CymMV-DEK32/AB541564CymMV-GZ2/KF853253CymMV-CYK15/AB541548CymMV-CYK13/AB541546CymMV-SZ3/KF853264CymMV-SZ4/KF853265CymMV-SZ1/KF853262CymMV-SZ2/KF853263CymMV-FRA08/AM236026CymMV-FS7/KF853258CymMV-FS8/KF853259CymMV-Malang/AB693986CymMV-FS9/KF85326074CymMV-C-LZ21/KP137372CymMV-USA2/EF125179CymMV-xm/GQ507023996889CymMV-ZHP1/FJ356061CymMV-18-30/EF1251795861CymMV-GZ3/KF853254CymMV-ZHD1/EU672821CymMV-FPo04/AM236020995354CymMV-Taiwan/AY57128984447CymMV-FS6/KF85325530CymMV-FPo01/AM236019928CymMV-FS2/KF853247CymMV-FS5/KF8532505783328098CymMV-FS4/KF853249CymMV-ZH1/KF853256CymMV-GDFS1CymMV-FS10/KF853261915165338CymMV-CYK7/AB541540CymMV-Surabaya/AB693987100304881CymMV-ArantheraAnneBlack/AF405721018CymMV-DEK26/AB54155824CymMV-DEK28/AB54156095CymMV-VandaPoepoeDiana/AF405729CymMV-KC-13/AJ606104100CymMV-C-LZ14/KP13737061001CymMV-Japan1/AB19793710032CymMV-ONK21/AB54156886CymMV-Malaysia/AJ42827380CymMV-ONK23/AB541564CymMV-CP01/KF22547384CymMV-C-LZ02/KP1373680CymMV-C-LZ18/KP137371307CymMV-ZH2/KF85325713CymMV-CYK11/AB541544CymMV-C-LZ06/KP137369266310097CymMV-CYK5/AB541538CymMV-USA3/EF12518098940100CymMV-CHN-ZJHZ52/DQ06788273CymMV-CHN-ZJHZ61/DQ067883CymMV-18-29/EF12518028681710CymMV-CK15/AB541524CymMV-USA1/EF1251781001895CymMV-CK13/AB54152203569CymMV-CK27/AB541536CymMV-18-1/EF12517833CymMV-DEK21/AB5415540CymMV-HNXL/HQ6819060199CymMV-KC-3/AJ6061041900CymMV-CHN-FJZZ13/DQ0678792377CymMV-CHN-HBWH22/DQ0678818251CymMV-CHN-FJZZ12/DQ067878CymMV-Lembang-Bandung/AB693984CymMV-CYK9/AB5415427498CymMV-plm1/AJ581998982620234361CymMV-type2/AF016914CymMV-skt1/AJ581997CymMV-CK25/AB541534CymMV-Cyl1/AJ56456210CymMV-gd1/AY36040814348179998207CymMV-krl/AJ698947CymMV-Orissa/AJ87137477CymMV-FPo05/AM236030956836CymMV-CH/KF853252CymMV-SKP2/AJ58520395CymMV-FS1/KF8532463502523CymMV-FS3/KF853248CymMV-SKP1/AJ585202CymMV-SMi2/AM0556402167CymMV-NIHHSK2/HQ6441323951CymMV-CHN-ZJHZ62/DQ067884CymMV-gd3/AY360410CymMV-ONK19/AB541566CymMV-CHN-ZJHZ69/DQ067887CymMV-SCDXZC4/GU295172CymMV-CHN-ZJHZ63/DQ067885CymMV-KMMLC2/GU295171CymMV-ZJXTHC1CymMV-GZKTLC6/GU295170CymMV-BJKTLC3/AY571289CymMV-RUN01/AM236022CymMV-RUN03/AM236023CymMV-GZ1/KF853251CymMV-CHN-ZJHZ67/DQ067886CymMV-GDFS3CymMV-GDFS2CymMV-GunungSindur/AB693982CymMV-Fujian/EF632297CymMV-M2/EU314803CymMV-DEK30/AB541562CymMV-CS/AY429021CymMV-FIJ01/AM236029CymMV-MDG01/AM236024CymMV-ArandaNasreenGayoonCymMV-18-29/EF125180CymMV-Arundinagraminifolia/AF405725CymMV-AscocendaSingaChiba/AF405719图5CymMVCP序列与GenBank已知CP序列核苷酸系统进化树33 CymMV-CHN-ZJHZ63CymMV-CHN-ZJHZ62CymMV-MalaysiaCymMV-SCDXZC4CymMV-ZJXTHC1CymMV-GZKTLC6CymMV-BJKTLC3CymMV-KMMLC2CymMV-DEK32CymMV-GZ2CymMV-FS10CymMV-FPo01CymMV-FPo04CymMV-USA2CymMV-CHN-HBWH21CymMV-ZHD18CymMV-NHRIK1CymMV-CYK15CymMV-C-LZ1866760CymMV-18-30CymMV-FPo10513CymMV-CYK13CymMV-FS8CymMV-FPo08CymMV-Fujian151CymMV-ZH1CymMV-C-LZ06250CymMV-Onc0CymMV-Cat390CymMV-MokCymMV-SZ20CymMV-GDFS30CymMV-USA107338138CymMV-18-101CymMV-FS6CymMV-Arundinagraminifolia25719CymMV-ArantheraAnneBlackCymMV-FS1011CymMV-USA3CymMV-CHCymMV-18-29CymMV-DEK3006118CymMV-krl580014147CymMV-type2CymMV-C-LZ02611216CymMV-SKP2CymMV-FS7015CymMV-Orissa0CymMV-ONK2120CymMV-Lembang-Bandung24CymMV-CK15035CymMV-M2251124CymMV-DEK21CymMV-Japan100CymMV-DEK28CymMV-FS302CymMV-CyI1CymMV-CYK93012CymMV-CHN-ZJHZ6716038CymMV-VandaPoepoeDianaCymMV-GDFS20030CymMV-RUN03CymMV-ONK231018CymMV-NIHHSK2550CymMV-CYK5CymMV-C-LZ140CymMV-CsCymMV-gd302CymMV-ZH2CymMV-gd1364CymMV-AscocendaSingaChibaCymMV-FS9064CymMV-SZ402023CymMV-SZ1CymMV-FIJ012319CymMV-SZ399CymMV-RUN014703CymMV-SMi21CymMV-HNXL643CymMV-Taiwan30CymMV-FS21287CymMV-FS56215333010CymMV-CHN-ZJHZ5234CymMV-CYK11261267CymMV-CHN-ZJHZ61CymMV-CHN-ZJHZ69591849CymMV-GZ1CymMV-ZHP161483951CymMV-FS4CymMV-MalangCymMV-GDFS1CymMV-KC-1313CymMV-MDG0164CymMV-SurabayaCymMV-skt1CymMV-xmCymMV-GZ3CymMV-C-LZ21CymMV-GunungSindurCymMV-SKP1CymMV-ONK19CymMV-plm1CymMV-CP01CymMV-CYK7CymMV-FPo05CymMV-KC-3CymMV-CK27CymMV-CK13CymMV-CK25CymMV-DEK26CymMV-ArandaNasreenGayoonCymMV-CHN-HBWH22CymMV-CHN-FJZZ13CymMV-CHN-FJZZ12图6CymMVCP序列与GenBank已知CP序列氨基酸系统进化树3.1.3.3CymMVRdRp序列相似性和进化树分析通过DNAStar软件分别分析三个分离物RdRp核苷酸序列的相似性。核苷酸相似性分析显示（表9），本实验克隆获得的3个RdRp全长序列与已报导的12个CymMVRdRp全长序列相似性在87.3%-97.9%之间，本实验获得的3个CymMVRdRp全长序列之间的相似性在98%-99.7%之间。CymMV-GDFS1与CymMV-GDFS2、CymMV-GDFS2与CymMV-GDFS3相似性都为98%，CymMV-GDFS2与CymMV-GDFS3相似性为99.7%；与已报导的12个CymMVRdRp全长序列相比较，分离物CymMV-GDFS1、CymMV-GDFS3与来自Hawaii的CymMV-18-30相似性最低34 都为87.3%，CymMV-GDFS1、CymMV-GDFS3与来自台湾的CymMV-Taiwan相似性最高都为97.9%。表9CymMV分离物RdRp序列与GenBank已知RdRp序列核苷酸相似性对比123456789101112131415197.19797.496.996.797.797.687.997.387.397.196.997.196.3CymMV-Japan296.49796.796.597.297.187.797.187.196.796.596.795.7CymMV-M239796.696.597.39787.797.18797.396.697.295.9CymMV-NJ-149796.998.197.688.29887.597.496.997.496.8CymMV-plm1596.597.597.288.197.287.496.996.796.996CymMV-Singapore697.196.987.996.987.396.796.496.796CymMV-SMi279888.397.887.797.997.197.996.7CymMV-Taiwan88897.787.497.49797.496.5CymMV-type2988.598.9888887.987.4CymMV-18-11087.697.497.197.497CymMV-18-291187.387.487.386.8CymMV-18-30129899.796.2CymMV-GDFS1139896CymMV-GDFS21496.2CymMV-GDFS315CymMV-HNXL利用MEGA5.2对这15个CymMVRdRp序列进行近邻相连法（neighborjoining）分析，获得这15个序列核苷酸的系统进化树（图7）。从图中可以看出本实验获得的三个分离物RdRp序列之间的亲缘关系很近，三个分离物组成一个小的亚组，其中CymMV-GDFS1与CymMV-GDFS3的亲缘关系更近，与其它分离物比较这三个分离物与来自南京的分离物CymMV-NJ-1亲缘关系最近。35 亚组A亚组B图7CymMV分离物RdRp序列与GenBank已知RdRp序列核苷酸进化树分析3.1.3.4CymMVTGB1序列相似性和进化树分析通过DNAStar软件分别分析15个分离物TGB1序列核苷酸与氨基酸的相似性。核苷酸相似性分析显示（表14），本实验中克隆的3个CymMVTGB1序列与已报导的其它12个CymMVTGB1序列相比较相似性在83.9%-97%之间，本实验获得的3个CymMVTGB1序列相似性在98.8%-100%之间。CymMV-GDFS1与CymMV-GDFS3相似性为100%，CymMV-GDFS1与CymMV-GDFS2、CymMV-GDFS2与CymMV-GDFS3相似性都为98.8%；与已报导的12个CymMVTGB1序列相比较，CymMV-GDFS2与来自Hawaii的CymMV-18-1、CymMV-18-30相似性最低都为83.9%，CymMV-GDFS1、CymMV-GDFS3与来自台湾的CymMV-M2相似性最高为97%。氨基酸相似性分析显示表（表10），本实验中克隆的3个CymMVTGB1序列与已报导的其它12个CymMVTGB1序列相比较相似性在84.3%-97%之间，本实验获得的3个CymMVTGB1序列相似性在90%-100%之间。CymMV-GDFS1与CymMV-GDFS3相似性为100%，CymMV-GDFS1与CymMV-GDFS2、CymMV-GDFS236 与CymMV-GDFS3相似性都为90%；与已报导的12个CymMVTGB1序列相比较CymMV-GDFS3与CymMV-18-1、CymMV-18-30，CymMV-GDFS1与CymMV-18-30相似性最低都为84.3%，CymMV-GDFS2与来自云南的CymMV-SMi2相似性最高为97%。表10CymMV分离物TGB1序列与GenBank已知TGB1序列核苷酸(右上部分)和氨基酸（左下部分）相似性对比1234567891011121314151***98.894.796.496.79595.294.695.486.99683.994.983.998.8CymMV-GDFS2290***94.696.79795.495.294.995.687.296.284.295.184.2100CymMV-GDFS3396.689.6***9695.194.495.493.894.686.99683.695.783.694.6CymMV-HNXL496.689.698.3***97.796.99796.597.68898.184.296.484.296.7CymMV-Japan596.289.197.997.9***96.395.996.19787.597.684.795.984.797CymMV-M2696.289.197.997.997.4***95.495.596.488.596.784.69584.695.4CymMV-NJ-1789.195.290.490.490.490***95.595.98796.884.296.284.295.2CymMV-plm188794.888.388.388.787.896.5***96.188.196.484.794.684.794.9CymMV-Singapore99790.497.997.998.397.490.989.1***87.597.28495.48495.6CymMV-SMi21085.29386.586.586.186.594.394.886.5***88.493.587.193.587.2CymMV-Taiwan1196.689.698.398.397.997.990.488.397.986.5***84.697.284.696.2CymMV-type21289.384.39191919185.784.39186.191***84.210084.2CymMV-18-11394.987.896.696.696.696.289.68796.684.896.690.2***84.295.1CymMV-18-291489.384.39191919185.784.39186.19110090.2***84.2CymMV-18-30159010089.689.689.189.195.294.890.49389.684.387.884.3***CymMV-GDFS1利用MEGA5.2对这15个CymMVTGB1序列进行近邻相连法（neighborjoining）分析，获得这15个序列氨基酸和核苷酸的系统进化树（图8）。从图中可以看出核苷酸序列之间CymMV-GDFS1、CymMV-GDFS2、CymMV-GDFS3构成一个分支与CymMV-M2亲缘关系最近（图8A）；氨基酸序列之间CymMV-GDFS1与CymMV-GDFS3构成一个分支，CymMV-GDFS2单独构成一个分支（图8B）。37 A亚组A亚组BB图8CymMV分离物TGB1序列与GenBank已知CymMVTGB1序列核苷酸（A）与氨基酸进化树分析（B）38 3.1.3.5CymMVTGB2序列相似性和进化树分析通过DNAStar软件分别分析15个分离物TGB2序列核苷酸与氨基酸的相似性。核苷酸相似性分析显示（表15），本实验中克隆的3个CymMVTGB2序列与已报导的其它12个CymMVTGB2序列相比较相似性在87.9%-98.8%之间，本实验获得的3个CymMVTGB1序列相似性在99.7%-100%之间。CymMV-GDFS1与CymMV-GDFS2相似性为100%，CymMV-GDFS1、CymMV-GDFS2与CymMV-GDFS3相似性都为99.7%。与已报导的12个CymMVTGB2序列相比较，CymMV-GDFS3与来自Hawaii的CymMV-18-1、CymMV-18-30相似性最低都为87.9%，CymMV-GDFS1、CymMV-GDFS2与来自台湾的CymMV-Taiwan相似性最高为98.8%。氨基酸相似性分析显示（表11），本实验中克隆的3个CymMVTGB2序列与已报导的其它12个CymMVTGB2序列相比较相似性在93.8%-100%之间，本实验获得的3个CymMVTGB2序列相似性在99.1%-100%之间。CymMV-GDFS1与CymMV-GDFS2相似性为100%，CymMV-GDFS1与CymMV-GDFS3、CymMV-GDFS2与CymMV-GDFS3相似性都为99.1%。与已报导的12个CymMVTGB2序列相比较，CymMV-GDFS3与来自Hawaii的CymMV-18-1、CymMV-18-30相似性最低都为93.8%，CymMV-GDFS2、CymMV-GDFS2与CymMV-plm1、CymMV-Singapore、CymMV-SMi2、CymMV-Taiwan相似性最高都为100%表11CymMV分离物TGB2序列与GenBank已知CymMVTGB2序列核苷酸(右上部分)与氨基酸（左下部分）相似性对比1234567891011121314151***88.288.287.98787.688.288.887.688.287.987.986.710087.9CymMV-18-30294.7***10099.797.198.298.297.698.597.398.298.897.988.298.5CymMV-GDFS1394.7100***99.797.198.298.297.698.597.398.298.897.988.298.5CymMV-GDFS2493.899.199.1***96.897.997.997.398.297.197.998.597.687.998.2CymMV-GDFS3593.899.199.198.2***95.995.995.996.89595.996.596.28796.8CymMV-HNXL693.899.199.198.298.2***97.697.697.997.197.698.297.387.697.9CymMV-Japan793.898.298.297.397.397.3***97.397.997.397.698.297.388.297.9CymMV-M2893.899.199.198.298.298.297.3***97.997.197.397.696.888.897.3CymMV-NJ-1994.710010099.199.199.198.299.1***97.397.998.597.687.698.8CymMV-plm11094.710010099.199.199.198.299.1100***97.197.996.588.297.1CymMV-Singapore1194.710010099.199.199.198.299.1100100***98.297.387.997.9CymMV-SMi21294.710010099.199.199.198.299.1100100100***97.987.998.5CymMV-Taiwan1393.899.199.198.298.298.297.398.299.199.199.199.1***86.797.6CymMV-type21410094.794.793.893.893.893.893.894.794.794.794.793.8***87.9CymMV-18-11593.899.199.198.298.298.297.398.299.199.199.199.198.293.8***CymMV-18-2939 利用MEGA5.2对这15个CymMVTGB2序列进行近邻相连法（neighborjoining）分析，获得这15个序列氨基酸和核苷酸的系统进化树（图9）。从图中可以看出核苷酸序列之间CymMV-GDFS1、CymMV-GDFS2、CymMV-GDFS3单独构成一个亚组，与其它分离物亲缘关系较远（图9A）；氨基酸序列之间所有分离物间的亲缘关系都较远（图9B）。A亚组A亚组B40 B亚组A亚组B图9CymMV分离物TGB2序列与GenBank已知CymMVTGB2序列核苷酸（A）与氨基酸（B）进化树分析3.1.3.6CymMVTGB3序列相似性和进化树分析通过DNAStar软件分别分析15个分离物TGB3序列核苷酸与氨基酸的相似性。核苷酸相似性分析显示（表16），本实验中克隆的3个CymMVTGB3序列与已报导的其它12个CymMVTGB3序列相比较相似性在88.8%-98.9%之间，本实验获得的3个CymMVTGB1序列相似性在96.4%-99.3%之间。CymMV-GDFS1与CymMV-GDFS2相似性为97.7%，CymMV-GDFS1与CymMV-GDFS3源率都为96.4%，CymMV-GDFS2与CymMV-GDFS3相似性都为99.3%；与已报导的12个CymMVTGB3序列相比较，CymMV-GDFS3与来自Hawaii的CymMV-18-30相似性最低为88.8%，CymMV-GDFS2与来自Singapore的CymMV-Singapore相似性最高为98.9%。氨基酸相似性分析显示（表12），本实验中克隆的3个CymMVTGB3序列与已报导的其它12个CymMVTGB3序列相比较相似性在84.8%-97.8%之间，本实验获得的3个CymMVTGB3序列相似性在94.6%-100%之间。CymMV-GDFS2与CymMV-GDFS3相似性为100%，CymMV-GDFS1与CymMV-GDFS2、CymMV-GDFS1与CymMV-GDFS3相似性都为94.6%。与已报导的12个CymMVTGB3序列相比较，41 CymMV-GDFS1、CymMV-GDFS2、CymMV-GDFS3与来自Hawaii的CymMV-18-30相似性最低都为84.8%，CymMV-GDFS2、CymMV-GDFS3与CymMV-Singapore、CymMV-Taiwan相似性最高都为97.8%。表12CymMV分离物TGB3序列与GenBank已知CymMVTGB3序列核苷酸(右上部分)和氨基酸（左下部分）相似性对比1234567891011121314151***96.497.197.897.897.896.798.297.189.996.789.596.496.796CymMV-HNXL294.6***97.197.198.697.896.798.297.189.997.589.596.796.796CymMV-Japan395.794.6***98.298.698.697.598.997.190.697.590.297.597.596.7CymMV-M2496.795.797.8***98.698.697.598.997.191.397.590.997.597.596.7CymMV-NJ-1596.797.896.797.8***99.398.299.698.691.398.990.997.898.297.5CymMV-plm1697.896.797.898.998.9***98.299.697.890.998.290.697.898.998.2CymMV-Singapore795.794.696.796.796.797.8***98.696.791.797.191.396.797.196.4CymMV-SMi2897.896.797.898.998.910097.8***98.290.998.690.698.298.697.8CymMV-Taiwan995.795.793.594.696.795.793.595.7***89.997.589.596.496.796CymMV-type21085.985.98889.18888888884.8***90.999.689.589.989.1CymMV-18-11195.796.795.796.798.997.895.797.895.789.1***90.696.797.196.4CymMV-18-291284.884.887888787878783.798.988***89.189.588.8CymMV-18-301394.694.695.796.795.796.794.696.793.585.994.684.8***96.796.4CymMV-GDFS11495.794.695.796.796.797.895.797.893.585.995.784.894.6***99.3CymMV-GDFS21595.794.695.796.796.797.895.797.893.585.995.784.894.6100***CymMV-GDFS3利用MEGA5.2对这15个CymMVTGB3序列进行近邻相连法（neighborjoining）分析，获得这15个序列氨基酸和核苷酸的系统进化树（图10）。从图中可以看出核苷酸序列之间CymMV-GDFS1单独在一个亚组，CymMV-GDFS2、CymMV-GDFS3构成一个亚组，与分离物CymMV-Singapore亲缘关系最近（图10A）；氨基酸序列之间CymMV-GDFS1单独在一个亚组，CymMV-GDFS2、CymMV-GDFS3构成一个亚组（图10B），与核苷酸类似。42 A亚组A亚组BB亚组A亚组B图10CymMV分离物TGB3序列与GenBank已知CymMVTGB3序列核苷酸（A）与氨基酸（B）进化树分析43 3.2侵染性克隆构建3.2.1植物双元表达载体pCAMBIA2300-35S改造植物双元表达载体pCAMBIA2300-35S已含有CaMV35S双元启动子，并在XbaⅠ和SacⅠ之间插入hFLX基因。本实验首先对载体进行了改造，用XbaⅠ/SacⅠ切除hFLX基因，加入含有KpnⅠ和BamHⅠ酶切位点的接头。重组质粒经HindⅢ/KpnⅠ双酶切鉴定。酶切结果可以观察到大小为900bp和9000bp左右的两条带（图11），和预期结果一致。因载体本身不含有KpnⅠ酶切位点，表明载体已经改造成功。如图所示，有三个质粒改造成功，后续实验用8号质粒进行，标记为pCAMBIA2300-JT。图11改造后的pCAMBIA2300-JT双酶切鉴定M：15000Marker；8、9、12：改造成功的质粒；1-7、10、11、13-17：改造失败的质粒3.2.2CymMV分段连接到pCAMBIA2300-JT采用分段连接的方法分别将目的片段Ⅰ和目的片段Ⅱ分别连接到pCAMBIA2300-JT，用相同的内切酶KpnⅠ和BamHⅠ分别酶切pMD19T-Ⅰ与pCAMBIA2300-JT，分别回收2381bp和10000bp左右的目的条带，连接转化大肠杆菌。挑取单菌落揺菌，用引物CYⅠ-F/CYⅠ-R菌液PCR鉴定。鉴定结果为阳性的抽取质粒双酶切鉴定（图12A），获得连接有目的片段Ⅰ的表达载体。然后用相同的方法，用相同的内切酶SacⅠ和BamHⅠ分别酶切pMD19T-Ⅱ和连接有目的片段Ⅰ的表达载体，分别回收4039bp和12300bp左右的目的条带，连接转化大肠杆菌。挑取单菌落揺菌，用引物CYⅡ-F/CYⅡ-R菌液PCR鉴定。鉴定结果为阳性的抽取质粒双酶切鉴定（图12B），获得连接有CymMV全长的侵染性克隆。将连接有全长的侵染性克隆载体送测序验证。44 图12全长重组阳性质粒分段双酶切鉴定A、B分别为M：15000Marker；1：GDFS1；2：GDFS2；3：GDFS33.2.3CymMV全长重组质粒转化农杆菌GV3101测序结果正确的重组质粒用电击法转化到农杆菌GV3101，挑取同时抗卡那霉素、利福平的转化菌落揺菌，以扩增CP序列的引物CymMV-a/CymMV-b分别对菌液进行PCR鉴定，可扩增到670bp的目的条带（图13），与预期结果一致，表明已经获得了含有pCAMBIA-CymMV阳性转化子。图13含pCAMBIA-CymMV农杆菌GV3101的PCR鉴定M：2000Marker；1：pCAMBIA-CymMV-GDFS1；2：pCAMBIA-CymMV-GDFS2；3：pCAMBIA-CymMV-GDFS345 3.2.4侵染性克隆检测接种本生烟发病情况侵染性克隆转化植物后，转录出病毒的mRNA之后形成具有侵染性的病毒粒子，引起植物发病。目前侵染性克隆的活性判断主要根据寄主植物的症状表现、病毒基因的检测、病毒粒子观察等方法来实现。本研究主要通过接种植物的症状观察、PCR检测和血清学检测对所构建的CymMV的侵染性克隆的侵染能力进行验证。(1)症状表现将构建的CymMV-GDFS1、CymMV-GDFS2、CymMV-GDFS3通过农杆菌介导分别接种到4~6叶期的本生烟，同时以空载体pCAMBIA2300-JT为阴性对照，建兰花叶分离物摩擦接种为阳性对照。接种40d后，本生烟叶片表现出明显的白色局斑，与孙光荣等（1983）的描述一致（图14C、D、E），并且叶片部分皱折，与建兰花叶分离物摩擦接种本生烟类似（图14B），而空载体pCAMBIA2300-JT接种的本生烟生长健康没有症状（图14A）。图14三个分离物全长侵染性克隆农杆菌注射烟草后症状A：阴性对照，B：阳性对照，C-E：CymMV-GDFS1、CymMV-GDFS2、CymMV-GDFS3（2）RT-RCR检测CymMV-GDFS1、CymMV-GDFS2、CymMV-GDFS3侵染后分别取显症明显的本生烟叶片，以及空载体pCAMBIA2300-JT阴性和建兰花叶分离物摩擦接种本生46 烟阳性对照植株叶片，用试剂盒提取总RNA，以扩增CP序列的引物CymMV-a/CymMV-b进行RT-PCR扩增。检测结果表明从接种三种侵染性克隆的本生烟叶片与阳性对照的叶片都可扩出大小约为690bp的明亮条带，与预期结果一致，而阴性对照无目的条带（图15）。图15接种后本生烟中CymMVRT-RCR检测1：阳性对照；2：CymMV-GDFS1；3：CymMV-GDFS2；4：CymMV-GDFS3；M：2000Marker；5：阴性对照（3）ELISA检测本研究用实验室保存的以CymMVCP序列的原核表达蛋白为抗原制备的抗血清，采用间接ELISA法对接种侵染性克隆的本生烟进行检测。收集接种40d以上的症状明显的烟草叶片以包被缓冲液研磨后包被酶联板，抗血清分别以1：500与1:1000进行稀释，每个侵染性克隆侵染的植株检测两株（图16）。酶标仪读数显示三个分离物在不同血清稀释倍数下，样品OD492值均大于阴性对照OD492值的2倍，说明接种的烟草里有CymMV的存在。47 图16ELISA检测接种本生烟中CymMVCP蛋白A、B行：血清稀释1000倍，C、D行：血清稀释500倍。1列：阴性对照；2、3列：兰花病汁液阳性对照；4、5列：兰花病汁液接种烟草阳性对照；6、7列：GDFS1；8、9列：GDFS2；10、11列：GDFS3；12列：空白对照3.3瞬时表达3.3.1CymMV分离物全长表达载体的构建将从pCAMBIA1302上PCR扩增到的1039bp的目的条带（图17A）切胶回收后用内切酶EcorⅠ/SacⅠ双酶切，再次回收后分别连接到用同样酶双酶切后回收的pCAMBIA-CymMV-GDFS1、pCAMBIA-CymMV-GDFS2、pCAMBIA-CymMV-GDFS3后转化大肠杆菌、抽取质粒，双酶切验证，双酶切分别得到1039bp与约16000bp的目的条带（图17B），与预期相符，说明GFP序列已经分别连接到pCAMBIA-CymMV-GDFS1、pCAMBIA-CymMV-GDFS2、pCAMBIA-CymMV-GDFS3。分别标记为pCAMBIA-CymMV-GDFS1G、pCAMBIA-CymMV-GDFS2G、pCAMBIA-CymMV-GDFS3G48 图17PCR及双酶切验证GFP片段的获得与连接A为PCR扩增目的条带M：15000Marker；ck：空白对照；1、2：扩增的目的条带B为连接GFP后双酶切验证M：2000Marker；1、2：pCAMBIA-CymMV-GDFS1G；3、4：pCAMBIA-CymMV-GDFS2G；5、6：pCAMBIA-CymMV-GDFS3G3.3.2CymMV分离物全长瞬时表达观察病毒在本生烟的移动将三个连接有GPF序列的表达载体农杆菌介导接种本生烟3天后，用B-100A型高强度手提式长波紫外灯检测新叶GFP的表达及病毒移动情况并拍照记录（图18），如图所示空载体对照接种的烟草为暗红色（图18A），而三个处理接种的烟草叶片红色较浅淡并且中部嫩叶及叶脉处可以明显的见到绿色部分（图18C、D、E），说明连接到表达载体的GFP正常表达并且GFP的插入并没有影响到病毒的侵染性和移动。49 图18紫外灯下观察CymMV分离物全长表达载体接种本生烟GFP表达A：pCAMBIA2300-JT；B：pCAMBIA–GFP；C：pCAMBIA-CymMV-GDFS1G；D：pCAMBIA-CymMV-GDFS2G；E：pCAMBIA-CymMV-GDFS3G3.3.3CymMV分离物全长瞬时表达荧光观察为进一步验证GFP的表达位置，剪取注射点附近的烟草叶片激光扫描共聚焦显微镜观察绿色荧光的表达位置。如图19所示pCAMBIA2300-JT没有荧光，pCAMBIA–GFP在烟草叶片里均匀分布，三个处理的烟草叶片荧光显示主要积累在细胞壁与细胞核周围，并且细胞壁边缘分布着许多荧光亮点。50 GFP荧光白光GFP荧光/白光叠加图19共聚焦显微镜观察三个分离物全长表达位置51 3.3.4CymMV分离物全长与GFP序列连接侵染烟草症状观察40天后观察CymMV分离物全长与GFP序列连接后侵染烟草的症状表现，以及GFP序列的插入对病毒的侵染是否有影响。可以看出三个连接有GFP序列的全长分离物接种的烟草表现出白色局斑与皱缩（图20C、D、E），而pCAMBIA2300-JT与pCAMBIA–GFP对照接种的烟草没有症状(图20A、B)，三个处理的症状（图20）与没有插入GFP序列症状（图14）是一致的，说明GFP的插入对病毒序列的转录翻译没有影响。图20CymMV分离物全长与GFP序列连接后注射烟草症状A：pCAMBIA2300-JT；B：pCAMBIA–GFP；C：pCAMBIA-CymMV-GDFS1G；D：pCAMBIA-CymMV-GDFS2G；E：pCAMBIA-CymMV-GDFS3G3.3.5CymMV分离物全长与GFP序列连接侵染烟草RT-PCR验证40天后分别取显症明显的本生烟叶片，以及对照植株叶片，用试剂盒提取总RNA，以扩增CP序列的引物CymMV-a/CymMV-b进行RT-PCR扩增。检测结果表明接种三52 种侵染性克隆的本生烟叶片可以扩增出大小约为690bp的明亮条带，与预期结果一致，而接种有pCAMBIA2300-JT或pCAMBIA–GFP的对照无目的条带（图21）。图21CymMV分离物全长与GFP序列连接侵染烟草后扩增CP序列验证M：2000Marker；1：清水对照；2：pCAMBIA2300-JT；3：pCAMBIA–GFP；4：pCAMBIA-CymMV-GDFS1G；5：pCAMBIA-CymMV-GDFS2G；6：pCAMBIA-CymMV-GDFS3G4结论与讨论4.1CymMV遗传多样性分析本实验过TA克隆、测序、拼接获得了三个CymMV广东分离物GDFS1、GDFS2、GDFS3的全长，结果显示三个分离物分别由6227、6222、6224个碱基组成。三个分离物全基因组符合CymMV病毒的特点，即基因组全长6.3kb、包含5个开放阅读框，分别为4254bp的RdRp、702bp的TGB1、339bp的TGB2、276bp的TGB3以及672bp的CP序列。三个CymMV分离物CP序列核苷酸之间GDFS1与GDFS2、GDFS1与GDFS3、GDFS2与GDFS3相似性分别为97.6%、97.8%、99.9%，氨基酸序列之间GDFS1与GDFS2、GDFS1与GDFS3、GDFS2与CymMV-GDFS3的相似性分别为98.7%、98.7%、100%。核苷酸的相似性比氨基酸相似性略高可能是核苷酸的变异并没有影响氨基酸的翻译。与国内已报导CP序列相比核苷酸与氨基酸相似性分别为86%-99%与91%-100%；与国外已报导CP序列相比核苷酸与氨基酸相似性分别为88%-99%与90.5%-100%。53 本实验得到的三个CymMV分离物与国内外分离物之间的相似性差距不大，这与周国辉等（2004）报导一致，说明我国兰花上的CymMV是通过种苗的引进从国外传入的。有研究对比了89个国内外CymMVCP序列，分别从寄主因素与地理因素分析发现，这两个因素对相似性的影响不明显（Raoetal.,2014），这有可能是由于不断加强的兰花交流造成了不同兰花品种间CymMV的机械传播（Ajjikuttiraetal.,2002）。Moles等（2007）根据85个CP核苷酸序列以及37个RdRp部分核苷酸序列构建的进化树，将CymMV病毒序列分为A、B两个亚组，亚组A包括24个从香草兰、47个从观赏兰花获得的分离物，亚组B包括6个从香草兰、8个从观赏兰花获得的分离物。Zhen（2011）将获得的海南分离物归于亚组A。Vaughan等（2008）也将已报导的CymMV全长核苷酸序列划分为A、B两亚组，将获得的分离物CymMV-18-1、CymMV-18-30归于亚组B，分离物CymMV-18-29归于亚组A，亚组A还有已报导的CymMV-Taiwan、CymMV-plm1、CymMV-Japan等分离物。本实验得到的三个分离物全长核苷酸序列，RdRp核苷酸序列，TGB1核苷酸序列，TGB2核苷酸序列，TGB3核苷酸序列，CP核苷酸序列构建的进化树都可以分为A、B两个亚组，并且三个分离物与CymMV-Taiwan、CymMV-plm1、CymMV-Japan等同属于亚组A，与Vaughan等（2008）研究结果相似。但是本研究中CymMVCP核苷酸序列和TGB1核苷酸序列的分组却与其相应的氨基酸的分组不同，这与Moles等（2007）研究结果一致，说明氨基酸序列差异比核苷酸大。本研究根据根据CymMV5个ORF核苷酸序列构建进化树都可以分为A、B两个亚组，但是根据氨基酸序列构建的进化树却不能简单的分组，尤其是根据CP氨基酸序列和TGB1氨基酸序列构建的进化树与已报导的A、B亚组的分离物不相符。已报导许多植物病毒的分组都是根据分子遗传多样性进行划分（Callaghanetal.,2005；Roossincketal.,1999；Xuetal.,1998），核苷酸序列划分的亚组与氨基酸序列划分的亚组相符，并且分组方式反映了相应病毒分离物生物学或地理特点。而CymMV根据核苷酸序列划分的A、B亚组分离物间的差异在氨基酸序列间没有表现出来，这有可能是自然选择缩小了CymMV分离物间的差异（Molesetal.,2007）。根据CP核苷酸序列构建的进化树可以分为A、B两个亚组，在两个亚组里都有从香草兰和文心兰采集的分离物，这种分组方式不能反映寄主-植物特异性。此外，A、B两个亚组的分离物都采集自新加坡、法国、韩国、中国、印度、日本等地，说明这种分组方式也不能反映地理差异。然而，随着兰花贸易的不断加强，促使CymMV在54 世界范围内传播，这有可能是导致CymMV不能根据地理位置和寄主进行分组的原因（Molesetal.,2007；Vaughanetal.,2008）。本实验根据CymMV全长、CP、RdRp核苷酸序列构建的进化树都可以分为两个亚组，特别是114个CymMVCP可以明显的分为A、B两个亚组，这为抗CymMV的基因工程研究打下理论基础。通过观察CymMVCP核苷酸序列进化树可以发现，大部分的CP序列（84%）都聚集在A亚组，并且组间的地域差距较小，表明可以进一步研究A亚组核苷酸间的相同之处，构建抗大多数CymMV的转CymMVCP基因的兰花植株。Rubino等（1993）研究了转CymMVCP基因的烟草对CymMV的抗性，发现转基因烟草可以抗低于0.05mg/mL的病毒粒子接种。Liao等（2004）将包含CymMV-CP-cDNA、玉米泛素启动子及nos终止子的DNA组件转入蝴蝶兰中，尽管CP-mRNA转录信号水平比较低，也未在转基因兰花植株中检测到CP基因，但RT-PCR和ELISA却表明这些转基因兰花植株提高了对病毒的抗性。4.2建兰花叶病毒侵染性克隆构建根据目前国内外研究，大多数植物病毒的侵染性克隆是通过体外转录的方法来实现的，但该方法操作过程繁琐，容易降解，条件严格且成本高，不适合大规模进行遗传和基因突变等操作。本实验根据已报导的CymMV全序列CymMV-Taiwan设计合适的引物，利用分子生物学方法，将CymMV全序列分段克隆到携带有35S启动子的载体pCAMBIA2300上，构建了重组质粒pCAMBIA-CymMV，通过电转化法将其转化到农杆菌GV3101菌株，继而浸润接种至普通本氏烟，植物症状和分子检测结果均表明该侵染性克隆在本氏烟上具有侵染活性。载体构建过程中，选用植物双元表达载体pCAMBIA2300-2300。该载体稳定性好，可容纳较大的外源基因组序列，而且在农杆菌介导的遗传转化中有较高的转化效率。由于克隆的病毒基因组片段较长，内含多种酶切位点，载体上已有的酶切位点不能满足构建的需要，因此我们对载体进行了修饰，采用linker技术，加入了合适的酶切位点。另外其克隆位点上游含有来自花椰菜花叶病毒的35S强真核启动子，该启动子可促进下游基因的高效转录，是植物基因工程中应用最为广泛的启动子。接种方法选用的是农杆菌浸润的方法，农杆菌能够侵染植物后将其T-DNA随机整合到植物基因组内，而插入到T-DNA内的病毒cDNA克隆也能够在植物细胞内得到表达，这是植物转基因研究中常用的方法，目前利用该方法已成功低将病毒的侵染55 性克隆转移至众多的单子叶和双子叶植物上。本实验采用分段克隆连接的方式构建侵染性克隆并成功的侵染本生烟，显示的症状与兰花病汁液摩擦接种烟草症状一致，同时采用RT-PCR及ELISA进行了初步验证。有研究认为侵染性克隆接种到本生烟叶片病毒含量比兰花病株病毒含量低，这可能是由于摩擦接种及侵染性克隆转录病毒的侵染性本身就比兰花带病植株低（Hemenwayetal.,1990）。研究显示通过构建番茄丛矮病毒（Tomatobushystuntvirus，TBSV）的侵染性克隆不论添加5’末端帽子结构与否，侵染性克隆的侵染性都非常高（Hearneetal.,1990），而构建脊髓灰质炎病毒的侵染性克隆的侵染性只有病毒本身侵染性的5%（vanderWerfetal.,1986）。本研究中侵染性克隆的病毒含量高低有待进一步研究。影响侵染性克隆侵染性的因素有很多，如片段扩增过程中的突变，3’、5’末端非病毒序列，病毒基因组片段的克隆，内含子的插入以及接种方法都会对侵染性产生不同程度的影响。植物病毒在复制时也会产生一些没有侵染性的突变体，以此为模板构建的侵染性克隆同样不具有侵染性。本实验采取分段克隆连接的方法获得全长克隆，为了验证全长克隆序列的正确性，分别测序检测了两端及中间连接位置碱基的正确性，得到的结果与通过TA克隆测序得到的结果是一致的，说明克隆过程中没有碱基突变等，得到的全长克隆载体可以用于后续实验。但构建的侵染性克隆的侵染性还需要进一步验证，Lu等（2009）研究两个不同的CymMV分离物时发现，分离物M2可以导致兰花和本生烟的系统侵染，而分离物M1只能导致兰花的系统侵染。通过原生质体接种和原位杂交等实验发现两个分离物都可以在本生烟复制，但M2被限制在最初接种的细胞。构建全长表达载体时，将GFP序列连接在CP序列之后。构建的表达载体侵染的烟草通过长紫外灯与共聚焦显微镜观察均能观察到绿色荧光，共聚焦显微镜拍摄照片显示，病毒主要在细胞壁与细胞核周围。并且40天后烟草症状与没有连接GFP序列的侵染性克隆和兰花植株摩擦接种的烟草一致，说明GFP序列正常表达，并且没有影响病毒序列的转录翻译，但病毒蛋白聚集位置还需要进一步确定，Rong等（2014）通过与TMV-MP的共定位确定水稻条纹病毒（RiceStripeVirus，RSV）pc4蛋白一段跨膜区域与它定位在胞间连丝有很大关系，而TMV-MP已经被确定是定位在胞间连丝，Lu等（2011）通过质壁分离进一步确定p11-RFP通过胞间连丝在细胞间移动。56 4.3结论（1）本研究得到了兰花病株上三个建兰花叶病毒分离物的全基因组序列，并与已知序列分析他们核苷酸与氨基酸的多样性，与其它全长序列相似性在87.3%-97.3%之间；与国内其它CP序列相比核苷酸与氨基酸相似性分别为86%-99%与91%-100%；与国外其它CP序列相比核苷酸与氨基酸相似性分别为88%-99%与90.5%-100%。（2）成功构建了这三个分离物的侵染性克隆，侵染烟草症状与阳性对照一致，并通过ELISA与RT-PCR验证。（3）将绿色荧光蛋白（GFP）序列连接到病毒序列之后，转化烟草，通过共聚焦显微镜观察发现病毒蛋白主要聚集在细胞壁与细胞核周围。4.4进一步需要解决的问题本研究的下一步工作可以围绕以下几点开展（1）从接种侵染性克隆的植株中提取病毒粒子，通过扫描电镜观察获得CymMV病毒粒子照片，以进一步证实侵染性克隆的生物学活性；（2）采用实时荧光定量RT-PCR技术检测接种侵染性克隆植株中CymMV病毒与野生型CymMV侵染植株病毒含量差异。（3）将侵染性克隆成功侵染的烟草研磨接种兰花或其它植株，观察与野生型CymMV侵染性差异；（4）在构建野生型CymMV侵染性克隆的基础上，通过构建5个ORF的突变型克隆，及功能互补实验对这5个ORF的功能展开研究；（5）通过与荧光蛋白序列相连接进一步研究运动相关蛋白TGB1、TGB2、TGB3定位及在病毒粒子运动过程中的作用57 致谢本论文是在导师饶雪琴副教授的悉心指导下完成的，饶老师对本文的选题、设计及论文撰写倾注了大量的心血。通过三年的研究生学习，在导师的指导下，我学会了怎样去分析问题并解决问题，而不是一味的“请问”。在此论文完成之际，衷心感谢饶老师对我三年学习和生活上的关怀教诲。同时，本实验室的李华平教授、张曙光教授、周国辉教授、阮小蕾老师、王芳老师、冼学萍老师给予了中肯的指导和热心的帮助，我对他们的感谢无以言表。实验过程中还得到了博士研究生吴自林、谢晚彬、许东林、王明强、涂智、李舒、杨新、范会云，硕士研究生肖文超、孙洁、周翎、汪涵、胡兴万、钟婷、罗宝花、王婉，同窗包智丹、张岩、李晓颖、李梦寒、郝维佳、吕卡伦、陆光华，师弟师妹刘娟、叶景文、邹洁、董红红、冯文地、何园歌、马思琦、裴帆、麦桂婉，还有我宿舍的小伙伴凡春梅、吴嘉纯，在此感谢他们无私的陪伴和热情的帮助。此外，还得到广东省农科院植保所汤亚飞老师，本学院常长青副教授，王加峰老师及测试中心李华丽老师的热心帮助，在此表示感谢！同时，感谢我的父母、家人的鼓励和支持，是他们三年来一直默默的鼓励支持我，在我困难迷茫的时候是他们给予我信心和勇气，使我顺利完成学业。最后，感谢所有参与论文评审及答辩的各位老师！58 参考文献庇隆.花木病虫害[M].北京:中国建筑工业出版社,1987:1-478.常国权,杨盛华.免疫胶体金电镜技术在病毒抗原标记定位中的应用[J].中国兽医杂志,1992,18(5):38-39.旷野.花卉已成为我国出口农产品中一枝独秀的朝阳产业[J].中国花卉园艺,2011,(13):9.李梅,明艳林,陈青,等.蝴蝶兰病毒病的病原鉴定[J].福建农业科技,2001,6(06):11-12.李欲轲,洪鲲,张宇斌,等.建兰花叶病毒贵州分离物的分子鉴定[J].植物检疫,2014,25(5):67-70.梁敏国,刘光华.广东兰花病毒病调查和病原检测[J].江西植保,2004,27(3):97-100.刘沛然,王四清.建兰花叶病毒及齿兰环斑病毒的检测方法(综述)[J].热带作物学报,2009,30(01):99-103.孟春梅,洪健.应用免疫金标记电镜技术定位寄主细胞中的植物病毒:浙江省分析测试学术报告会[C],2007.孟春梅,徐颖,黎军英,等.感染CymMV和ORSV的蝴蝶兰细胞超微病变观察:全国农林系统电子显微镜学术交流会[C],中国西宁,2007.明艳林,郑国华.建兰花叶病毒厦门分离物的提纯及RT-PCR检测[J].植物保护,2006,32(01):101-103.潘俊松,刘志昕,吴豪,等.建兰花叶病毒外壳蛋白基因序列分析及病毒检测[J].农业生物技术学报,1999,7(4):325-328.潘俊松,刘志昕,郑学勤.建兰花叶病毒的分离、鉴定及检测研究[J].热带作物学报,1997,18(01):63-70.潘一山.白兰花、桅子花和水仙花香料成分的加工利用[J].福建热作科技,1991,(04):34-35.沈淑琳.兰花病毒的种类、检验和防治[J].植物检疫,1988,2(02):144-150.孙光荣,王顺德,王鸣岐.齿兰环斑病毒和建兰花叶病毒的鉴定[J].自然杂志,1983,6(10):798-799.王婷婷.兰花病毒病的诊断与防治[J].黑龙江科技信息,2013,262(19):279.王英强,陈邦余.广东山区兰科植物的野生花卉资源[J].亚热带植物科学,2001,30(1):9-14.吴竹妍,黎园,何晓盈,等.广东兰花两种主要病毒的检测[J].广东农业科学,2011,38(11):14-16.肖火根,郑冠标.广东兰花病毒病的鉴定和检测研究[J].华南农业大学学报,1996,17(1):21-24.许春英,李逢慧,罗超.环介导等温扩增技术检测建兰花叶病毒[J].现代农业科技,2009,3(8):11-12,14.杨翠云,于翠,郑建中,等.建兰花叶病毒检测标准方法的建立[J].上海交通大学学报(农业科学版),2006,24(03):250-255.余诚.兰花的食用和药用价值[J].花卉园艺,2006,(9):35-35.张昌伟,王静静,言燕华,等.建兰花叶病毒南京分离物基因组测定与侵染性克隆构建[J].南京农59 业大学学报,2013,36(04):13-17.张建军,谢为龙.兰花病毒病研究进展[J].植物检疫,1999,13(02):47-49.张健如,沈淑琳.花卉病毒鉴定手册[M].上海:上海科学技术,1984:148-149.郑平,刘荣维,徐明全,等.国内两种主要兰花病毒病的综合普查研究[J].广东农业科学,2001,18(6):37-40.周国辉,陈晓琴,李梅辉,等.广东地区两种兰花病毒病害的分子鉴定及检测[J].中国病毒学,2004,19(02):54-57.周国辉,陈晓琴,周洁浪,等.广东省兰花建兰花叶病毒分子鉴定及其外壳蛋白基因序列分析[J].华中农业大学学报,2004,23(04):381-384.朱留华.数字里的花卉业——1998-2001年全国花卉业统计资料分析[J].中国花卉园艺,2002,(14):5-7.庄西卿.中国兰产业化发展的问题与对策[J].福建热作科技,2004,29(01):23-25.NagyováA,SubrZ.Infectiousfull-lengthclonesofplantvirusesandtheiruseforconstructionofviralvectors[J].ActaVirologica,2007,51(4):223-237.AhlquistP,JandaM.cDNAcloningandinvitrotranscriptionofthecompleteBromemosaicvirusgenome[J].MolecularandCellularBiology,1984,4(12):2876-2882.AjjikuttiraPA,Lim-HoCL,WoonMH,etal..Geneticvariabilityinthecoatproteingenesoftwoorchidviruses:CymbidiummosaicvirusandOdontoglossumringspotvirus[J].ArchivesofVirology,2002,147(10):1943-1954.AliRN,DannAL,CrossPA,etal..MultiplexRT-PCRdetectionofthreecommonvirusesinfectingorchids[J].ArchivesofVirology,2014,159(11):3095-3099.BoyerJC,HaenniAL.InfectioustranscriptsandcDNAclonesofRNAviruses[J].Virology,1994,198(2):415-426.CallaghanB,DietzgenRG.NucleocapsidgenevariabilityrevealstwosubgroupsofLettucenecroticyellowsvirus[J].ArchivesofVirology,2005,150(8):1661-1667.DaglessEM,ShintakuMH,NelsonRS,etal..ACaMV35SpromoterdrivencDNAcloneofTobaccomosaicviruscaninfecthostplanttissuedespitebeinguninfectiouswhenmanuallyinoculatedontoleaves[J].ArchivesofVirology,1997,142(1):183-191.DunnJJ,StudierFW.CompletenucleotidesequenceofbacteriophageT7DNAandthelocationsofT7geneticelements[J].JournalofMolecularBiology,1983,166(4):477-535.FakhfakhH,VilaineF,MakniM,etal..Cell-freecloningandbiolisticinoculationofaninfectiouscDNAofpotatovirusY[J].JournalofGeneralVirology,1996,77(3):519-523.FornsX,BukhJ,PurcellRH,etal..HowEscherichiacolicanbiastheresultsofmolecularcloning:preferentialselectionofdefectivegenomesofHepatitisCvirusduringthecloningprocedure[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,1997,94(25):13909-13914.HeZ,JiangD,LiuA,etal..ThecompletesequenceofCymbidiummosaicvirusfromVanillafragransinHainan,China[J].VirusGenes,2011,42(3):440-443.60 HearnePQ,KnorrDA,HillmanBI,etal..ThecompletegenomestructureandsynthesisofinfectiousRNAfromclonesoftomatobushystuntvirus[J].Virology,1990,177(1):141-151.HeatonLA,CarringtonJC,MorrisTJ.TurnipcrinklevirusinfectionfromRNAsynthesizedinvitro[J].Virology,1989,170(1):214-218.HemenwayC,WeissJ,O'ConnellK,etal..CharacterizationofinfectioustranscriptsfromaPotatovirusXcDNAclone[J].Virology,1990,175(2):365-371.HolyS,AbouhaidarMG.Productionofinfectiousinvitrotranscriptsfromafull-lengthCloveryellowmosaicviruscDNAclone[J].JournalofGeneralVirology,1993,74(Pt4):781-784.HowardAR,HepplerML,JuH,etal..PotatovirusXTGBp1inducesplasmodesmatagatingandmovesbetweencellsinseveralhostspecieswhereasCPmovesonlyinN.benthamianaleaves[J].Virology,2004,328(2):185-197.HuJS,FerreiraS,WangM,etal..DetectionofCymbidiumMosaicVirus,OdontoglossumRingspotVirus,Tomatospottedwiltvirus,andPotyvirusesInfectingOrchidsinHawaii[J].PlantDisease,1993,77(5):464-468.HullR,MatthewsREF.Matthews'plantvirology[J].MatthewsPlantVirology,2002.JensenDD.MosaicorblackstreakdiseaseofCymbidiumOrchids[J].Phytopathology,1951,41(5):401-414.JohansenIE.IntroninsertionfacilitatesamplificationofclonedviruscDNAinEscherichiacoliwhilebiologicalactivityisreestablishedaftertranscriptioninvivo[J].ProcNatlAcadSciUSA,1996,93(22):12400-12405.JuHJ.ThePotatoVirusXTGBp2movementproteinassociateswithendoplasmicpeticulum-derivedvesiclesduringvirusinfection[J].PlantPhysiology,2005,138(4):1877-1895.KimJD,KooYB,ChangMU.GenomecharacterizationofaKoreanisolateofCymbidiummosaicvirus[J].MoleculesandCells,1998,8(2):181-188.KimSM,ChoiSH.SimultaneousdetectionofCymbidiummosaicvirusandOdontoglossumringspotvirusinorchidsusingmultiplexRT-PCR[J].VirusGenes,2015,51(3):417-422.KohKW,LuH,ChanM.Virusresistanceinorchids[J].PlantScience,2014,228:26-38.KondoH,MaedaT,ShirakoY,etal..Orchidfleckvirusisarhabdoviruswithanunusualbipartitegenome[J].JournalofGeneralVirology,2006,87(8):2413-2421.KondoH,TakemotoS,MaruyamaK,etal..Cymbidiumchloroticmosaicvirus,anewsobemovirusisolatedfromaspringorchid(Cymbidiumgoeringii)inJapan[J].ArchivesofVirology,2015,160(8):2099-2104.KostB,GalliA,PotrykusI,etal..HighefficiencytransientandstabletransformationbyoptimizedDNAmicroinjectionintoNicotianatabacumprotoplasts[J].JournalofExperimentalBotany,1995,46(9):1157-1167.KrishnamurthyK,HepplerM,MitraR,etal..ThePotatovirusXTGBp3proteinassociateswiththeERnetworkforviruscell-to-cellmovement[J].Virology,2003,309(1):135-151.LesemannDE.Long,Filamentousvirus-likeparticlesassociatedwithveinnecrosisofdendrobium61 phalaenopsis[J].JournalofPhytopathology,1977,89(4):330-339.LiaoLJ,PanI,ChanYL,etal.TransgenesilencinginPhalaenopsisexpressingthecoatproteinofCymbidiummosaicvirusisamanifestationofRNA-mediatedresistance[J].MolecularBreeding,2004,13(3):229-242.LiuL,LomonossoffG.AgroinfectionasarapidmethodforpropagatingCowpeamosaicvirus-basedconstructs[J].JournalofVirologicalMethods,2002,105(2):343-348.LuH,ChenC,TsaiM,etal..Cymbidiummosaicpotexvirusisolate-dependenthostmovementsystemsrevealtwomovementcontroldeterminantsandthecoatproteinisthedominant[J].Virology,2009,388(1):147-159.LuY,YanF,GuoW,etal..GarlicvirusX11-kDaproteingranulesmovewithinthecytoplasmandtrafficahostproteinnormallyfoundinthenucleolus[J].MolecularPlantPathology,2011,12(7):666-676.LucasWJ.Plantviralmovementproteins:agentsforcell-to-celltraffickingofviralgenomes[J].Virology,2006,344(1):169-184.MeltonDA,KriegPA,RebagliatiMR,etal..EfficientinvitrosynthesisofbiologicallyactiveRNAandRNAhybridizationprobesfromplasmidscontainingabacteriophageSP6promoter[J].NucleicAcidsResearch,1984,12(18):7035-7056.MitraR,KrishnamurthyK,BlancaflorE,etal..ThePotatovirusXTGBp2proteinassociationwiththeendoplasmicreticulumplaysaroleinbutisnotsufficientforviralcell-to-cellmovement[J].Virology,2003,312(1):35-48.MolesM,DelatteH,FarreyrolK,etal..EvidencethatCymbidiummosaicvirus(CymMV)isolatesdivideintotwosubgroupsbasedonnucleotidediversityofcoatproteinandreplicasegenes[J].ArchivesofVirology,2007,152(4):705-715.PaulHL,WetterC,WittmannHG,etal..UntersuchungenamOdontoglossumringspotVirus,einemverwandtendestabakmosaik-virus[J].MolecularandGeneralGenetics,1965,97(2):186-203.PérezJE,Cortés-MonllorA.Surveyforthepresenceoftobaccomosaic,cymbidiummosaic,andothervirusesinorchids[J].JournalofAgricultureoftheUniversityofPuertoRico,1960,44:138-149.RaoX,LiY,SunJ,etal..GeneticdiversitiesofCymbidiummosaicvirusandOdontoglossumringspotvirusisolatesbasedonthecoatproteingenesfromorchidsinguangdongprovince,China[J].JournalofPhytopathology,2014,163(4):324-329.RongL,LuY,LinL,etal..Atransmembranedomaindeterminesthelocalizationofricestripeviruspc4toplasmodesmataandisessentialforitsfunctionasamovementprotein[J].VirusResearch,2014,183(7):112-116.RoossinckMJ,ZhangL,HellwaldKH.Rearrangementsinthe5'nontranslatedregionandphylogeneticanalysesofcucumbermosaicvirusRNA3indicateradialevolutionofthreesubgroups[J].JournalofVirology,1999,73(8):6752-6758.RubinoL,CapriottiG,LupoR,etal.ResistancetoCymbidiumringspottombusvirusinfectionintransgenicNicotianabenthamianaplantsexpressingtheviruscoatproteingene[J].PlantMolecular62 Biology,1993,21(4):665-72.SherpaARHV,PathakP,ZaidiAA.CharacterizationofthecoatproteingeneofCymbidiummosaicvirusisolatesfromindia[J].JournalofPhytopathology,2006,154(5):275-280.SitTL,AbouhaidarMG.InfectiousRNAtranscriptsderivedfromclonedcDNAofPapayamosaicvirus:effectofmutationstothecapsidandpolymeraseproteins[J].JournalofGeneralVirology,1993,74(6):1133-1140.SkotnickiML,DingSW,MackenzieAM,etal..InfectiousEggplantmosaictymovirusandOnonisyellowmosaictymovirusfromclonedcDNA[J].ArchivesofVirology,1993,131(1-2):47-60.SriburiR,KeelapangP,DuangchindaT,etal..Constructionofinfectiousdengue2viruscDNAclonesusinghighcopynumberplasmid[J].JournalofVirologicalMethods,2001,92(1):71-82.TakahashiY,TakahashiT,UyedaI.AcDNAclonetoCloveryellowveinpotyvirusgenomeishighlyinfectiousJ].VirusGenes,1997,14(3):235-243.TaniguchiT,PalmieriM,WeissmannC.QβDNA-containinghybridplasmidsgivingrisetoQβphageformationinthebacterialhost[J].Nature,1978,274(274):223-228.ThompsonJR,LangenhanJL,FuchsM,etal..GenotypingofCucumbermosaicvirusisolatesinwesternNewYorkStateduringepidemicyears[J].VirusResearch,2015,210:169-177.TimpeU,KühneT.Invitrotranscriptsofafull-lengthcDNAofanaturallydeletedRNA2ofBarleymildmosaicvirus(BaMMV)replicateinBaMMV-infectedplants[J].JournalofGeneralVirology,1995,76(10):2619-2623.VanBH,VerverJ,WellinkJ,etal..Protoplaststransientlyexpressingthe200KcodingsequenceofCowpeamosaicvirusB-RNAsupportreplicationofM-RNA[J].JournalofGeneralVirology,1993,74(10):2233-2241.vanderWerfS,BradleyJ,WimmerE,etal..SynthesisofinfectiouspoliovirusRNAbypurifiedT7RNApolymerase[J].ProcNatlAcadSciUSA,1986,83(8):2330-2334.VancanneytG,SchmidtR,O'Connor-SanchezA,etal..Constructionofanintron-containingmarkergene:Splicingoftheintronintransgenicplantsanditsuseinmonitoringearlyevents[J].MolecularandGeneralGeneticsMGG,1990,220(2):245-250.VaughanSP,GrisoniM,KumagaiMH,etal..CharacterizationofHawaiianisolatesofCymbidiummosaicvirus(CymMV)co-infectingDendrobiumorchid[J].ArchivesofVirology,2008,153(6):1185-1189.Verchot-LubiczJ.Anewcell-to-celltransportmodelforpotexviruses[J].Molecularplant-microbeinteractions:MPMI,2005,18(4):283-290.Verchot-LubiczJ,YeCM,BamunusingheD.Molecularbiologyofpotexviruses:recentadvances[J].JournalofGeneralVirology,2007,88(6):1643-1655.VoinnetO,LedererC,BaulcombeDC.AviralmovementproteinpreventsspreadofthegenesilencingsignalinNicotianabenthamiana[J].Cell,2000,103(1):157-167.WertSLV,SaundersJA.Electrofusionandelectroporationofplants.[M].Wiley‐VCHVerlagGmbHandCo.KGaA,2006.63 WongSM,MahtaniPH,LeeKC,etal..CymbidiummosaicpotexvirusRNA:completenucleotidesequenceandphylogeneticanalysis[J].ArchivesofVirology,1997,142(2):383-391.XuZY,HigginsIM,ChenKR,etal..EvidenceforathirdtaxonomicsubgroupofPeanutstuntvirusfromChina[J].PlantDisease,1998,82(9):992-998.YoonJY,ChungBN,ChoiGS,etal..GeneticvariabilityinthecoatproteingenesofCymbidiummosaicvirusisolatesfromorchids[J].VirusGenes,2012,44(2):323-328.YoonJ,ChoI,ChoiG,etal..ConstructionofinfectiouscDNAcloneofaChrysanthemumstuntviroidKoreanisolate[J].ThePlantPathologyJournal,2014,30(1):68-74.YuHH,WongSM.SynthesisofbiologicallyactivecDNAclonesofCymbidiummosaicpotexvirususingapopulationcloningstrategy[J].ArchivesofVirology,1998,143(8):1617-1620.64 附录附录A：CymMV分离物CP序列与国内GenBank已知CP序列核苷酸相似性对比65 附录B：CymMV分离物CP序列与国外GenBank已知CP序列核苷酸相似性对比66 附录C：CymMV分离物CP序列与国内GenBank已知CP序列氨基酸相似性对比67 附录D：CymMV分离物CP序列与国外GenBank已知CP序列氨基酸相似性对比68 附录E：33CymMV-FS3/KF853248CymMV-SZ3/KF853264647CymMV-SMi2/AM055640CymMV-SZ1/KF853262ACymMV-CYK7/AB541540B640CymMV-SZ4/KF853265CymMV-CH/KF853252CymMV-AscocendaSingaChiba/AF4057190100CymMV-FS1/KF853246CymMV-Japan1/AB197937CymMV-Arundinagraminifolia/AF405725CymMV-SZ2/KF853263021CymMV-CS/AY429021CymMV-FS8/KF853259CymMV-Malaysia/AJ428273CymMV-FIJ01/AM236029080CymMV-ONK23/AB541564CymMV-C-LZ06/KP137369CymMV-DEK26/AB541558CymMV-ONK21/AB54156812CymMV-DEK28/AB541560CymMV-HNXL/HQ6819060CymMV-CK13/AB54152267CymMV-GDFS293CymMV-CK27/AB541536CymMV-CK15/AB54152413CymMV-CK15/AB541524CymMV-ZH2/KF853257CymMV-NIHHSK2/HQ644132CymMV-FS9/KF8532600CymMV-FPo05/AM236030CymMV-FS3/KF853248230CymMV-krl/AJ698947CymMV-C-LZ14/KP13737045CymMV-CK25/AB541534CymMV-GDFS361CymMV-gd1/AY360408CymMV-FS7/KF85325899CymMV-plm1/AJ581998CymMV-ZHD1/EU67282151CymMV-skt1/AJ581997CymMV-gd1/AY360408CymMV-CHN-FJZZ12/DQ067878CymMV-RUN03/AM23602314CymMV-M2/EU314803CymMV-Cs/AY429021017CymMV-DEK21/AB541554CymMV-NIHHSK2/HQ64413231CymMV-KC-3/AJ606104CymMV-Fujian/EF63229784CymMV-C-LZ14/KP137370CymMV-RUN01/AM23602232CymMV-Japan1/AB197937CymMV-CYK9/AB541542CymMV-KC-13/AJ606104CymMV-C-LZ18/KP13737198CymMV-GunungSindur/AB69398261CymMV-FS1/KF853246125CymMV-ONK19/AB541566CymMV-CH/KF853252CymMV-ArandaNasreenGayoonCymMV-18-29/EF12518040CymMV-DEK26/AB54155815CymMV-FIJ01/AM23602918CymMV-CYK7/AB54154000CymMV-CHN-FJZZ13/DQ067879CymMV-CK25/AB5415349912CymMV-CHN-HBWH22/DQ06788152CymMV-CK27/AB54153613CymMV-RUN03/AM23602363CymMV-CK13/AB5415224CymMV-RUN01/AM236022CymMV-KC-3/AJ60610347CymMV-BJKTLC3/AY57128965CymMV-FPo05/AM2360209512CymMV-GZKTLC6/GU295170CymMV-CP01/KF225473095CymMV-ZJXTHC1CymMV-SKP1/AJ58520216CymMV-KMMLC2/GU29517159CymMV-ZHP1/FJ35606150CymMV-SCDXZC4/GU29517230CymMV-Malang/AB693986CymMV-DEK30/AB541562CymMV-xm/GQ5070230CymMV-GDFS23513CymMV-MDG01/AM23602498CymMV-GDFS3CymMV-C-LZ21/KP137372CymMV-AscocendaSingaChiba/AF405719CymMV-SMi2/AM05564043CymMV-MDG01/AM236024CymMV-ONK23/AB541570CymMV-GZ1/KF853251CymMV-CYK11/AB54154498CymMV-FS2/KF85324758CymMV-USA3/EF125180亚组ACymMV-FS5/KF85325020CymMV-18-29/EF125180470CymMV-FS4/KF8532494CymMV-ArantheraAnneBlack/AF4057213780CymMV-GDFS1CymMV-Arundinagraminifolia/AF4057255119CymMV-FS6/KF85325535CymMV-ZH1/KF85325611CymMV-Taiwan/AY571289CymMV-FPo08/AM2360264715CymMV-GZ3/KF85325458CymMV-USA1/EF125178CymMV-ZHD1/EU672821CymMV-18-1/EF12517862CymMV-xm/GQ507023CymMV-USA2/EF1251798546CymMV-ZHP1/FJ356061CymMV-NHRIK1/EU683880031CymMV-C-LZ21/KP13737218CymMV-FPo10/AM236027029CymMV-FS9/KF853260CymMV-CYK15/AB541548CymMV-Malang/AB69398661CymMV-FPo04/AM23602034CymMV-FS7/KF853258CymMV-FPo01/AM236019990CymMV-FS8/KF853259CymMV-CYK13/AB54154656CymMV-SZ2/KF853263CymMV-CHN-HBWH21/DQ067880CymMV-SZ1/KF853262CymMV-GZ2/KF8532536370CymMV-SZ3/KF8532640CymMV-FS10/KF85326173CymMV-SZ4/KF853265CymMV-DEK32/AB54156440CymMV-Fujian/EF632297CymMV-18-30/EF125179CymMV-CHN-ZJHZ62/DQ067884CymMV-Onc/AY37639364CymMV-gd3/AY360410CymMV-Mok/AY3763927979CymMV-CHN-ZJHZ69/DQ06788740CymMV-Cat/AY3763917254CymMV-CHN-ZJHZ63/DQ067885CymMV-DEK30/AB54156272CymMV-CHN-ZJHZ67/DQ067886CymMV-C-LZ02/KP137368CymMV-type2/AF016914CymMV-type2/AF016914610CymMV-ZH2/KF853257CymMV-krl/AJ69894723CymMV-CHN-ZJHZ52/DQ067882CymMV-SKP2/AJ5852031006CymMV-CHN-ZJHZ61/DQ06788327CymMV-CyI1/AJ56456223CymMV-CYK11/AB541544CymMV-Orissa/AJ871374299CymMV-CYK5/AB54153824CymMV-Lembang-Bandung/AB6939848CymMV-C-LZ02/KP137368CymMV-gd3/AY360410CymMV-SKP1/AJ58520255CymMV-CYK5/AB5415387582CymMV-SKP2/AJ58520336CymMV-M2/EU314803777CymMV-Orissa/AJ87137426CymMV-DEK21/AB54155469CymMV-Cyl1/AJ56456208CymMV-DEK28/AB54156025CymMV-CYK9/AB541542CymMV-VandaPoepoeDiana/AF4057291CymMV-Lembang-Bandung/AB69398436CymMV-CHN-ZJHZ67/DQ06788620CymMV-HNXL/HQ681906CymMV-ArandaNasreenGayoon/AY04977018CymMV-18-1/EF125178CymMV-KC-13/AJ606104100031CymMV-USA1/EF12517864CymMV-skt1/AJ5819979573CymMV-18-29/EF125180CymMV-plm1/AJ5819984698CymMV-USA3/EF125180CymMV-CHN-HBWH22/DQ067881CymMV-C-LZ06/KP137369CymMV-CHN-FJZZ13/DQ0678796460CymMV-C-LZ18/KP137371CymMV-CHN-FJZZ12/DQ0678789934CymMV-CP01/KF225473CymMV-FS6/KF85325588CymMV-ONK21/AB541568CymMV-CHN-ZJHZ69/DQ067887CymMV-VandaPoepoeDiana/AF405729CymMV-GZ1/KF853251CymMV-ArantheraAnneBlack/AF40572151CymMV-ONK19/AB541566CymMV-Surabaya/AB69398751CymMV-GunungSindur/AB6939827CymMV-GZ3/KF853254CymMV-FS10/KF85326159CymMV-ZH1/KF85325666CymMV-GDFS1CymMV-FPo01/AM23601922CymMV-FS4/KF85324996100CymMV-FPo04/AM236020CymMV-Taiwan/AY571289CymMV-DEK32/AB541564CymMV-FS5/KF8532502321CymMV-18-30/EF125179CymMV-FS2/KF85324710030CymMV-USA2/EF125179CymMV-CHN-ZJHZ61/DQ0678838CymMV-FRA08/AM23602686CymMV-CHN-ZJHZ52/DQ067882CymMV-CYK13/AB541546亚组BCymMV-KMMLC27927CymMV-CYK15/AB541548CymMV-SCDXZC4/GU29517239CymMV-GZ2/KF853253CymMV-ZJXTHC1/GU29516749CymMV-FRA10/AM236027CymMV-GZKTLC6/GU295170CymMV-CHN-HBWH21/DQ067880CymMV-BJKTLC3/AY571289399CymMV-NHRIK1/EU683880CymMV-Surabaya/AB69398755CymMV-Onc/AY376393CymMV-CHN-ZJHZ62/DQ06788457CymMV-Cat/AY37639148CymMV-Malaysia/AJ42827399CymMV-Mok/AY37639365CymMV-CHN-ZJHZ63/DQ0678850.010.005CymMVCP序列与GenBank已知CP序列核苷酸(A)与氨基酸(B)系统进化树69 附录F：CymMV-GDFS1GGAAAACCAAACCTCACGTCTACTCAGCTATCCGAGCGAAATAGCAGCCCCAGCATAGGCAATATCGCGCTCCATGGCCCGAGTACGTGATACCCTTGACAGGCTCCGTGATCCGTCGGTCCTTACCTCAATTAACGAGGAAGCCCACCGGCATATCCGCCCTGTCCTTGCCTCGGCACTCGTAAACTGCCCTTACGCGTTGACCGAGGAAGAGGCCGACTGTCTCGAAAATCTCGGCGTGACAGTCAATTCCTTCGCCATCCAAACGCATACACATGCTGCAGCTAAAACTGTTGAAAATCGCATGTTGGAAATTGTTGGCACCCACCTTCCTAAAGAACCCTCCACCTTCATATTCCTTAAGCGAAGCAAGCTTCGCTACCTACGACGCGCCGCCAACAACAAAGACATATTTCAAAATCAACACATTGAGCCTAAAGACTTATTGCGTTACGATGACGAGTCTTGTGGAGCAATGCCAGAATGCTCCACAAGCACAGCCTACATCAGCGATGCTCTCCATTTCTTGAGCTACGCTCAGCTTGGGAAAATATTCCAGGATTCTCCCAAGCTGAAAATTCTGCTGGCAACCCTGGTCCTCCCCGTGGAAGCCCTCCATAGGCATCCATCTCTTTATCCTGCCATCTACACTTTGAACTACCATAAGGATGGCTTTGAATATATACCCGGCAATCACGCCGGAGGTGCCTACTTCCACGAGTACTCCACTCTGCAGTGGTTGGCTCTCGGGAAACTAATTATCAATGATCCTTTGAAAGTAAAGAAACCCCTTACTCTTACTGTACAGCTAATAGAAAGCCTAGGGGCCAACCATCTTTTACTTATCACCCGAGGGGATCTTCGCACACCCAAACTGCGGACATTCGCTAAAGATACCCATGTTCTACTACCACAAATATTCCATCCTAAGGGTATGAATGCGAATAAACCATTGTCCAAACGTAGAGCTATGCAGTTGTGGCTCTACGCCAAATCTGTTAAGGAGGTGAGCGAACGGGATCTTTATGCTAAGGTGAGGCAATTGATCCCGACTTCTGAGTTAGACCTTTTTGACCCTGTGGAGGTGACCCACTTGGTCAATTACTTACTATTCATCAGTCACCTTTCCTCCGTATCTTCGTATGACGACATCTTGTCGTCTAATATATTCCAACATTTTACCATCCCAATCAAGAACAAGATACGGGAATTGGTCCAGCTATTCACCGGAGCGGACCAATTTAATCAACTGCTCAAAGCTCTCGACTGGCAAACATTTTCGTACTCTATGCCAGTAGAGACCATCCATACACGTGCGGCCAATTATCAAGTCGCTAAAACGCTTCGCATGTGCAGAGACCTACCATGCGATGAATATGATCGTGTAAAGGATGTCCTCAGACAGCTCCCTGACGGAGTGACGTTGTTTGAGGAAAACGACAAGCAAGATCCCTCAAGCCCTGAAGCCGAGGACTCTGAGGATGACACTGACTCCGTCGACTTCACCCTTCCTCCCACTCATGACTTGCCCCCAAACTTTGATCCTCTAAACAAGGGTAAGTCCATTATCGCTGACACTGACAACCCCTCAACTTCTACGGCACCTGCCGTTACTTTTGCTGCCGGTATCAACTCCTCAGCCTCCACAAACATTTCATTTGGAAGCTTTACACCTGAGGCTGAGGCCACCCCCCCTCCTCCCATGGAAAAGTTACCATGGGGTCTTTGGATTCCCCTACTGGAACAACATGGCTTTAAAGGAAAGAGCAAGCTGTACAAGCCCACGGGTGAACTAATCTGCCCCATAACTGAAATCAAAACAGTTCCCCACTGCCCCTTTCCCGATAAAGTCCAGGATGGCTGTGTGCTTGCGCTTAAATCTATTAAGCGTTTCGCCACAAAAATGACTATGCTCAGTTCTCGAGCTTCTGCCTACACTTCTGACATTAAGAATAGTAGGACTGGGAAGCTCCTACCCGCCATGAACATGCCCTGGAAAGCCTCCCTCGCCTATGTCACTCAACATGGTGATAGAGAAATTCCTGGCGTCGTGATCCATGGTGCCGGTGGCTGTGGCAAATCTTATGCTATCCAAAGATGGTTGAGAAGCTGCTCTGATCCTTGTGCAGCTACTGTGGTATGCCCAACTCTAGAACTACGTAATGACTGGCTCAACAAAATCGGAAGCTACGAACAAACGAATATCAAAACTTTCGAGAAAGCTTTAATTCAGCCAGTCAACAACGTAGTTATCTTTGATGACTACACCAAGCTACCCCCTGGGTACATCGAGACCATGGTGTACCATCACCACAACCTCGACCTGATCATACTAACTGGGGATCCTATGCAGAGCGCCTACCATGAAACCAACAGAGATGCTTATATCTCTTTAATACCTGATGCCTCTGCCATTTTCAGTGAGTACTGTGAGTTCAACATCAACGCCACCCACCGTAATGTGGCTGAACTCGCTTGCCTCCTCGGCGTCTATTCCGAACGCCAAGGCAAACTCACTGTCTCCTTCAGCGCAGCCCCACTTTCTAAAGGTAAAGTACCCATTCTGGTACCCTCTAGAATGAAGCAAGAGGCTTTTGCTGATGTCGGCAACCGTTGCATGACTTATGCCGGTTGCCAGGGTCTCACTGCCCCTAAAATCCAAATTTTGATAGACAACCACACTACGTTCTGCTCTGAACAAACATTATACACTTGTCTATCACGAGCTGTGGACCAAATCCACTTTATTAATACTGGTCCCAACTCGCAGGCTTTCTGGACCAAATTGGAATCAACGCCGTACCTAAAAGCTTTCCTCGATAATTACCGTGAGGAACAAACTGAACGGCTAACATCTACCGCCCCAGAGCCTGTAATCCGTGAGCCAGCAGCCCCAAAAACGCATATCCCTGTCGAAAATACATCTGGCTTACGTATTTCTGCACTTGACCTGCCGGAAAAGCACTCTCGCGAAATTTTCAACAAGGCGCATGGCTTTTCCAATGCTATTCAGGGAGATGGCGTAGCTCCCATGTTCCAGCATCAACAGGCAAAGGACGAAACCCTTTTCAAGGCTACCATAGACGCTAGACTCTCTATAACACACCCTGATGAAAATAAAAGAGAGTTTGCCATGAAGAAAGACACTGGGGACGTCCTTTTTGTCAATTACAAAGCTATAATGAATCTACCTCATGAGCCTGTTCCTTTTGAACCTCGTCTCTGGAACATCTGCAAAGCTGAAGTGCAGAACACATACCTAGCCAAACCCATTGCAAATCTTATCAATGGTACTTTAAAGCAATCACCTGACTTTCCAGCCAATAAAATAGCCTTATTCCTGAAATCGCAATGGGTAAAGAAAATTGAGAAAATTGGAGCCATACCAGTTAAACCTGGACAGACTATTGCATCATTTATGCAAGAGACTGTTATGCTGT70 ATGGCACCATGGCACGCTACCTCCGTAAAATGCGGCAAAGATATCAACCCGCACATATATTTATCAATTGTGAAAAGACTCCGGAGGACTTCAATAAATTCATACTTGAACACTGGTCACACAAGCAAGTTGCCCACACTAACGATTTTACTGCTTTTGACCAGTCCCAAGACGCTGCCATGCTCCAATTTGAAGTTATTAAAGCTAGGTACTTCAATATCCCCGAGGATGTTATAGAAGGATACATCCAAATTAAGCTCACTGCTGAGATCTTCCTCGGGACACTTTCCATCATGCGCCTATCTGGTGAAGGGCCAACCTTCGACGCTAATACCGAATGCTCTATTGCCTACAACGCCACCAGATACCATATTAATGAAGACGTCACCCAAGTATACGCCGGTGACGACATGGCCATGGACCATGTGTGCCCTGAGAAGAAGAGCTTCAAAGCTTTGGAAAAGAAACTGAAATTAACCTCCAAACCTCTCTATCCAAAGCAAAAACCTGGAGACTGGGCCGATTTCTGCGGCTGGACTATAACACCTTATGGCATCATTAAGAATCCTAAGAAACTTGATGCATGCCTACAATTGCACACCCAACTGGGCGATGCCGATAAAGTCGCTAGGTCATACGCACTCGATGCCAAATATGCTTATGATCTGGGCGATCGCATTCATGAAGTTCTGAATGCTGATGAAATGACCAGTCACTTCAATGCTATAAGACAGTTGCACAAACTGCATCAACAAGATGTGCTGGTCCCACCCGAGACTACCGTAGCCACAGCGGTAAAGTCTCAACCTGACGTGGAGAATCTGTGGCTCCGTGCGCTTAGCTTCCCTGACTGGACGGACCGCGCCCAACTTTTAAAACGGGGTTAATTTCTGATGGAGCTAGCGTACTTAGTTAAATTACTAGAGCACAATAAATTCGAGCGCACTAATCTGCCCCTTTCCTCACCCTTAGTTGTACACGGAATCGCTGGCAGTGGAAAATCCACCATCCTCACAACTTTCCATCACCATTACCCGGCTCACCCTATCTTCTCACACAGTCCCACATTGCTTGACCCTAGCAACCGCATATACCAACAGTGCATCACTACTGATTCGGTGCCAGACGGTGCTATCGTAGACGAGTACAATTACAAAGCGCTCGACTACTCTCGCTGTCTGGCCCTCTTCGGTGATCCACTTCAGCTTCCACATTCACTTCAACCCCACTACCACTCTAGCCGCACTCACCGCTACGGCCCCAAGCTCACTAGCCTACTCAACGACCTCTTCCACCTCTCTATCACTTCCCTTGCCCCCATCGACAGCCTTGATTACGCTGATCCTTTTGCTGTCGACCCCTCTGGATTTATCATTGCTGACGAGGAAGTGTACAACTTTGTTTCCCAGCAGGTTCCCGGCACTTTGCTGCCGCTCGATACTGTAGGTTTAGAATATTCTAGTGTTAGCTTTTACTGCAGTGATCTCCGACGCTGTGTCGTACTAAGGCCACTCAGCACCTTCCATCGCTCTCACCCGCGCCAAGGGCAACCTCGCCATCTTCGATTTCAATGCCAGGTTTAGTTCCACCACCTGACCACTCTAAGTCACTCTTCGTCCTTGCTATTGGTATAACTGTGGTCTCCGCACTATTTGTGCTAAAGTCCCACACTTTTCCAATTGCAGGCGACAATATTCACCGCTTCCCCTCCGGCGGCCAATATAAAGACGGTACTAAGCAGATAAACTACTGTCCACCTACTCATGCTAGGTACCCGAAATATCCYGACYACAAGTGGCTTGCCGCYACCGCCGCCATCGTCATCCCTCTCTGCCTATATATTTCCTACCATCCTGGCAATAATATTCGCCGTATTTGCCCTTGTTGCAATACATATCACCACCCCTGAGCCCTTCTGTACCATACACATAGACGGGGCGTCTATTACTATCACTAACTGCCCCGATCCTGCAGCTATATTAAATAAAGTAGCCATAGGCCCCTGGCGAGGGTTAAGTTACCACAATGATCTGAAATAATCATGGGAGAGCCCACTCCAACTCCAGCTGCCACTTACTCCACTGCCGACCCCACTTCTGCACCCAAGTTGGCCGACCTGGCTGCCATTAAGTACTCACCTGTCACCTYCTCCATCGCCACCCCCGAAGAAATCAAGGCCATAACCCAATTGTGGGTTAGCAACCTTGGCCTCCCCGCCGACACAGTAGGTACCGCGGCCATTGACCTGGCCCGCGCCTACGCTGACGTCGGGGCGTCCAAGAGTGCTACCCTGCTCGGTTTCTGCCCTACGAAACCTGATGTCCGTCGCGCCGCTCTTGCCGCGCAGATCTTCGTGGCCAATGTCACCCCCCGCCAGTTTTGCGCTTACTACGCGAAAGTGGTGTGGAATCTGATGCTGGCCACTAACGATCCGCCCGCCAACTGGGCCAAGGCTGGTTTCCAGGAGGATACTCGGTTTGCCGCCTTTGACTTCTTCGATGCCGTCGATTCCACTGCCGCACTGGAACCTGCTGAATGGCAGCGCCGCCCTACTGACCGTGAACGTGCTGCGCACTCGATCGGGAAGTACGGCGCCCTTGCCCGTCAGCGTATCCAAAACGGCAACCTCATCACCAACATTGCCGAGGTCACTAAGGGCCATCTTGGCTCCACCAACACTCTCTATGCTCTGCCTGCACCCCCTACTGAATAACGCCAAACTTAATAAGGCGTGTGGTTTTCTAAAGTTTGTTTCCACTACTGGCATATATATTTAGCCAGATTATTCymMV-GDFS2GAAAACCAAACCTCACGTCTACTCCGCTATCCGAGCGAAATAGCAGCCCCAGCATAGGCAATATCGCGCTCCATGGCCCGAGTACGTGACACCCTTGACAGGCTCCGTGATCCGTCAGTCCTTACCTCAATTAACGAGGAAGCCCACCGACATATCCGCCCTGTCCTTGCCTCGGCACTCGTGAACTGCCCTTACGCGTTGACCGAGGAGGAGGCCGACTGTCTCGAAAATCTCGGCGTGACAGTCAATCCCTTCGCCATCCAAACGCATACACATGCTGCAGCTAAAACTGTTGAAAACCGTATGTTGGAAATTGTTGGCACCCACGTTCCTAAAGAACCCTCCAGCTTCATATTCCTTAAGCGGAGCAAGCTTCGCTACCTACGACGCGCCGCCAACAACAAAGACATTTTCAAAAACCAACACATTGAGCCTAAAGACTTATTGCGTTACGATGACGAGTCTTGTGGAGTAATGCCAGAATGCTCCACAAGCACAGCCTACATCAGCGATGCTCTCCATTTCTTGAGCTACGCTCAGCTTGGGAAAATATTCCAGGATTCTCCCAAACTGAAAATTCTGCTGGCAACCCTGGTCCTCCCCGTGGAAGCCCTCCATAGG71 CACCCATCTCTCTATCCTGCCATCTATACTTTGAACTACCATAAAGATGGCTTTGAATATATACCCGGCAATCACGCCGGAGGTGCCTACTTTCACGAGTACTCCACTCTGCAGTGGTTGACTCTCGGGAGACTAATTATCAATGATCCTTTGAAAGTAAAGAAACCCCTTACTCTTACTGTACAGCTAATAGAAAGTCTAGGGGCTAACCATCTTTTACTTATCACCCGAGGGGATCTTCGCACACCCAAACTACGGACATTCGCTAAAGATACCCATGTTCTACTACCACAAATATTCCACCCTAAGGGTATGAATGCGAACAAACCATTGTCCAAACGTAGAGCAATGCAGCTGTGGCTCTACGCCAAATCTGTTAAAGAGGTGAGCGAACGGGATCTTTATGCTAAGGTGAGGCAATTGATCCCAACTTCTGAGTTAGACCTTTTTGACCCTGTGGAAGTGACCCACTTGGTCAATTACTTACTATTCATCAGTCACCTTTCCTCCGTATCTTCGTATGACGATATCTTGTCGTCTAATATATTCCAACATTTCACCATTCCAATCAAGAACAAGATACGGGAATTGGTCCAGCTATTCACCGGAGCGGACCAATTTAATCAACTGCTTAAGGCTCTCGACTGGCAAACATTTTCGTACTCTATGCCAGTAGAGACCATCCATACACGTGCGGCCAATTATCAAGTCGCTGAAACGCTTCGCATGTGCAGAGACCTACCATGCGATGAATATGATCGTGTAAAGGATGTCCTCAGACAGCTCCCTGATGGAGTGACGTTGTTCGAGGAAAACGACAAGCAAGATCCCTCAAGCCCTGAAACCAAGGACTCTGAGGATGACACTGACTCCGTCGACTTCAACCTTCCCCCCACTCATGACTTGCCCCCAAACTTTGATCCTCTAGACAAGGGCAAGTCCATTATCGTTGACACTGACAGCCCCTCAACTTCCACGGCACCTGCCGTCACTTTTGCTGCCGGTATCAACTCCTCAGCCTGCACAAATATTTCATTCGGAAGCTTCGCACCTGAGGCTGAGGCCGCCCCCCTCCCTCCCATGGAAAAGTTACCATGGGATCTTTGGATTCCCCTACTGGAACAACATGGCTTTAAAGGAAAGAGTAAGCTGTACAAGCCCACAGGTGAACTGATCTGCCCCATAACTGAAATCAAAACAGTTCCCCACTGCCCCTTTCCCGATGAAGCCCCGGATGGCTGTGTGCTTGCGCTCAAATCTATCAAGCGTTTCGCCACAAAAATGACTATGCTCAGTTCTCGAGCTTCCGCCTACACTTCTGACATTAAGAATAGTAGGACTGGGAAGCTCCTACCCGCCATGAACATGCCCTGGAAAGCCTCTCTCGCCTATGTCACTCAACATGGTGATAGAGAAATTCCTGGTGTCGTGATCCATGGTGCCGGTGGCTGTGGCAAATCTTATGCCATCCAAAAATGGTTGAGAAGCTGCTCCGATCCTTGTGCAGCTACTGTGGTATGCCCAACTCTAGAACTACGTAATGACTGGCTCAATAAAATCGGAAGCTACGAACAAACGAATATCAAGACTTTCGAGAAAGCTTTAATTCAGCCAGTCAACAACGTAGTTATCTTTGATGACTACACCAAGCTACCCCCTGGGTACATCGAGGCCATGGTGTACCATCACCACAACCTCGACCTGATCATATTAACTGGGGATCCTATGCAGAGCGCCTACCATGAAACCAACAGAGATGCTTATATCTCTTTAATACCTGATGCCTCTGCCATTTTCAGTGAGTACTGTGAGTTCAACATCAACGCCACCCACCGTAATGTGGCTGAACTCGCTTGCCTCCTCGGCGTCTATTCCGAACGCCAAGGCAAACTCACTGTCTCCTTCAGCGCAGCCCCACTTTCTAAAGGTAAAGTACCCATTCTGGTACCCTCTAGAATGAAGCAAGAGGCTTTTGCTGATGTCGGCAACCGTTGCATGACTTATGCCGGTTGCCAGGGTCTCACTGCCCCTAAAATCCAAATTTTGATAGACAACCACACTACGTTCTGCTCTGAACAAACATTATACACTTGTCTATCACGAGCTGTGGACCAAATCCACTTTATTAATACTGGTCCCAACTCGCAGGCTTTCTGGACCAAATTGGAATCAACGCCGTACCTAAAAGCTTTCCTCGATAATTACCGTGAGGAACAAACTGAACGGCTAACATCTACCGCCCCAGAGCCTGTAATCCGTGAGCCAGCAGCCCCAAAAACGCATATCCCTGTCGAAAATACATCTGGCTTACGTATTTCTGCACTTGACCTGCCGGAAAAGCACTCTCGCGAAATTTTCAACAAGGCGCATGGCTTTTCCAATGCTATTCAGGGAGATGGCGTAGCTCCCATGTTCCAGCATCAACAGGCAAAGGACGAAACCCTTCTCAAGGCTACCATAGACGCTAGACTCTCTATAACACACCCTGATGAAAATAAAAGAGAGTTTGCCATGAAGAAAGACACTGGGGACGTCCTTTTTGTCAATTACAAAGCTATAATGAATCTACCTCATGAGCCTGTTCCTTTTGAACCTCGTCTCTGGAACATCTGCAAAGCTGAAGTGCAGAACACATACCTAGCCAAACCCATTGCAAATCTTATCAATGGTACTTTAAGGCAATCACCTGACTTTCCAGCCAATAAAATAGCCTTATTCCTGAAATCGCAATGGGTAAAGAAAATTGAGAAAATTGGAGCCATACCAGTTAAACCTGGACAGACTATTGCATCATTTATGCAAGAGACTGTTATGCTGTATGGCACCATGGCACGCTACCTCCGTAAAATGCGGCAAAGATATCAACCCGCACATATATTTATCAATTGTGAAAAAACTCCGGAGGACTTCAATAAATTCATACTTGAACACTGGTCACACAAGCAAGTTGCCCACACTAACGATTTTACTGCTTTTGACCAGTCCCAAGACGCTGCCATGCTCCAATTTGAAGTTATTAAAGCTAGGTACTTCAATATCCCCGAGGATGTTATAGAAGGATACATCCAAATTAAGCTCACTGCTGAGATCTTCCTCGGGACACTTTCCATCATGCGCCTATCTGGTGAAGGGCCAACCTTCGACGCTAATACCGAATGCTCTATTGCCTACAACGCCACCAGATACCATATTAATGAAGACGTCACCCAAGTATACGCCGGTGACGACATGGCCATGGACCATGTGTGCCCTGAGAAGAAGAGCTTCAAAGCTTTGGAAAAGAAACTGAAATTAACCTCCAAACCTCTCTATCCAAAGCAAAAACCTGGAGACTGGGCCGATTTCTGCGGCTGGACTATAACACCTTATGGCATCATTAAGAATCCTAAGAAACTTGATGCATGCCTACAATTGCACACCCAACTGGGCGATGCCGATAAAGTCGCTAGGTCATACGCACTCGATGCCAAATATGCTTATGATCTGGGCGATCGCATTCATGAGGTTCTGAATGCTGATGAAATGACCAGTCACTTCAATGCTATAAGACAGTTGCACAAACTGCATCAAC72 AAGATGTGCTGGTCCCACCCGAGACTACCGTAGCCACAGCGGTAAAGTCTCAACCTGACGTGGAGAATCTGTGGCTCCGTGCGCTTAGCTTCCCTGACTGGACGGACCGCGCCCAACTTTTAAAACGGGGTTAATTTCGATGGAGCTAGCGTACTTAGTTAAATTACTAGAGCACAATAAATTCGAGCGCACTAATCTGCCCCTTTCCTCACCCTTAGTTGTACACGGAATCGCTGGCAGTGGAAAGTCCACCACCCTCACAACTTTCCATCACCATTACCCGGCTCACCCTATCTTCTCATACAGTCCCACATTGCTTGACCCTAGCGACCGCATATACCAACAGTGCATCACTACTGATTCGGTGCCAGACGGTGCTATCGTAGACGAGTACAATTACAAAGCGCTCGACTACTCTCGCTGTCTAGCCCTCTTCGGTGATCCACTTCAGCTTCCACATTCACTTCAACCCCACTACTACTCTAGCCGCACTCACCGCTACGGCCCCAAGCTCACTAGCCTACTCAACGACCTCTTCCACCTCTCTATCACTTCCCTTGCCCCCATCGACAGCCTTGATTACGCTGATCCTTTTGCTGTCGACCCCTCTGGATTTACCATTGCTGACGAGGAAGTGTACAACTTTGTTTCCCAGCAGGTTCCCGGCACCTTGCTGCCGCTCGATACTGTAGGTTTAGAATATTCTAGTGTTAGCTTTTACTGCAGTGATCTCCGACGCTGTGTCGTACTAAGGCCACTCAGCACCTTCATCGCTCTCACCCGCGCCAAGGGCAACCTCGCCATCTTCGATTTCAATGCCAGGTTTAGTTCCACCACCTGACCACTCTAAGTCACTCTTCGTCCTTGCTATTGGTATAACTGTGGTCTCCGCACTATTTGTGCTAAAGTCCCACACTTTTCCAATTGCAGGCGACAATATTCACCGCTTCCCCTCCGGCGGCCAATATAAAGACGGTACTAAGCAGATAAACTACTGTCCACCTACTCATGCTAGGTACCCGAAATATCCTGACTACAAGTGGCTTGCCGCTACCGCCGCCATCGTCATCCCTCTCTGCCTATATATTTCCTACCATCCTGGCAATAATATTCGCCGTATTTGCCCTTGTTGCAATACATATCACCACCCCTGAGCCCTTCTGTACCGTATACATAGACGGGGCGTCTATTACTATCACTAACTGCCCCGATCCTGCAGCTATATTAAATAAAGTAGCTATAGGCCCCTGGAGAGGGTTAAGTTACCACAATAATTTGAAATAATCATGGGAGAGCCCACTCCAACTCCAGCTGCCACTTACTCCGCTGCCGACCCCACTTCCGCACCCAAGTTGGCCGACCTGGCTGCCATTAAATACTCACCTGTCACCTCCTCCATCGCCACCCCCGAAGAAATCAAGGCCATAACCCAATTGTGGGTTAACAACCTTGGCCTCCCCGCTGACACCGTAGGTACCGCGGCCATCGACCTGGCCCGCGCCTACGCCGACGTCGGGGCGTCCAAGAGTGCTACCCTGCTCGGTTTCTGCCCTACGAAACCTGATGTCCGTCGCGCCGCTCTTGCCGCGCAGATCTTCGTGGCCAACGTCACCCCCCGCCAGTTTTGCGCTTACTACGCAAAAGTGgTGTGGAATCTGATGCTGGCCACTAACGATCCGCCCGCCAACTGGGCCAAGGCTGGTTTCCAGGAGGATACCCGGTTTGCCGCCTTTGACTTCTTCGATGCCGTCGATTCCACTGCCGCGCTGGAGCCTGCTGAATGGCAGCGCCGCCCTACTGACCGTGAACGTGCTGCGCACTCGATTGGGAAGTATGGCGCCCTTGCCCGTCAGCGTATCCAAAACGGCAACCTCATCACCAACATTGCCGAGGTCACTAAGGGCCATCTTGGCTCCACCAACACTCTCTATGCTCTGCCTGCACCCCCTACTGAATAACGCCAAACTTAATAAGGCGTGTGGTTTTCTAAAGTTTGTTTCCACTACTGGCATAATAAGTTTAGCCAGATTCymMV-GDFS3GGAAAACCAAACCTCACGTCTACTCCGCTATCCGAGCGAAATAGCAGCCCCAGCATAGGCAATATCGCGCTCCATGGCCCGAGTACGTGATACCCTTGACAGGCTCCGTGATCCGTCGGTCCTTACCTCAATTAACGAGGAAGCCCACCGGCATATCCGCCCTGTCCTTGCCTCGGCACTCGTAAACTGCCCTTACGCGTTGACCGAGGAAGAGGCCGACTGTCTCGAAAATCTCGGCGTGACAGTCAATCCCTTCGCCATCCAAACGCATACACATGCTGCAGCTAAAACTGTTGAAAATCGCATGTTGGAAATTGTTGGCACCCACCTTCCCAAAGAACCCTCCACCTTCATATTCCTTAAGCGAAGCAAGCTTCGCTACCTACGACGCGCCGCCAACAACAAAGACATATTCCAAAATCAACACATTGAGCCTAAAGACTTATTGCGTTACGATGACGAGTCTTGTGGAGTAATGCCAGAATGCTCCACAAGCACTGCCTACATAAGCGATGCTCTCCATTTCTTGAGCTACGCTCAGCTTGGGAAAATATTCCAGGATTCTCCCAAGCTGAAAATTCTGCTGGCAACCCTGGTCCTCCCCGTGGAAGCCCTCCATAGGCACCCATCTCTTTATCCCGCCATCTACACTTTGAACTACCATAAAGATGGCTTTGAATATATACCCGGCAATCACGCCGGAGGCGCCTACTTCCACGAGTACTCCACTCTGCAGTGGTTGACTCTCGGGAAACTAATTATCAACGATCCTTTGAAAGTAAAGAAGCCCCTTACTCTTACTGTACAGCTAATAGAAAGTCTAGGGGCCAACCATCTTTTACTTATCACCCGAGGGGATCTTCGCACACCCAAACTGCGGACATTCGCTAAAGATACCCATGTTCTACTACCACAAATATTCCATCCTAAGGGTATGAATGCGAATAAACCATTGTCCAAACGTAGAGCTATGCAGTTGTGGCTCTACGCCAAATCTGTTAAGGAGGTGAGCGAACGGGATCTTTATGCTAAGGTGAGGCAATTGATCCCGACTTCTGAGTTAGACCTTTTTGACCCTGTGGAGGTGACCCACTTGGTCAATTACTTACTATTCATCAGTCACCTTTCCTCCGTATCTTCGTATGACGACATCTTGTCGTCTAATATATTCCAACATTTTACCATCCCAATCAAGAACAAGATACGGGAATTGGTCCAGCTATTCACCGGAGCGGACCAATTTAATCAACTGCTCAAAGCTCTCGACTGGCAAACATTTTCGTACTCTATGCCAGTAGAGACCATCCATACACGTGCGGCCAATTATCAAGTCGCTAAAACGCTTCGCATGTGCAGAGACCTACCATGCGATGAATAT73 GATCGTGTAAAGGATGTCCTCAGACAGCTCCCTGACGGAGTGACGTTGTTTGAGGAAAACGACAAGCAAGATCCCTCAAGCCCTGAAGCCGAGGACTCTGAGGATGACACTGACTCCGTCGACTTCACCCTTCCTCCCACTCATGACTTGCCCCCAAACTTTGATCCTCTAAACAAGGGTAAGTCCATTATCGCTGACACTGACAACCCCTCAACTTCTACGGCACCTGCCGTTACTTTTGCTGCCGGTATCAACTCCTCAGCCTCCACAAACATTTCATTTGGAAGCTTTACACCTGAGGCTGAGGCCACCCCCCCTCCTCCCATGGAAAAGTTACCATGGGGTCTTTGGATTCCCCTACTGGAACAACATGGCTTTAAAGGAAAGAGCAAGCTGTACAAGCCCACGGGTGAACTAATCTGCCCCATAACTGAAATCAAAACAGTTCCCCACTGCCCCTTTCCCGATAAAGTCCAGGATGGCTGTGTGCTTGCGCTTAAATCTATTAAGCGTTTCGCCACAAAAATGACTATGCTCAGTTCTCGAGCTTCTGCCTACACTTCTGACATTAAGAATAGTAGGACTGGGAAGCTCCTACCCGCCATGAACATGCCCTGGAAAGCCTCCCTCGCCTATGTCACTCAACATGGTGATAGAGAAATTCCTGGCGTCGTGATCCATGGTGCCGGTGGCTGTGGCAAATCTTATGCTATCCAAAGATGGTTGAGAAGCTGCTCTGATCCTTGTGCAGCTACTGTGGTATGCCCAACTCTAGAACTACGTAATGACTGGCTCAACAAAATCGGAAGCTACGAACAAACGAATATCAAAACTTTCGAGAAAGCTTTAATTCAGCCAGTCAACAACGTAGTTATCTTTGATGACTACACCAAGCTACCCCCTGGGTACATCGAGACCATGGTGTACCATCACCACAACCTCGACCTGATCATACTAACTGGGGATCCTATGCAGAGCGCCTACCATGAAACCAACAGAGATGCTTATATCTCTTTAATACCTGATGCCTCTGCCATTTTCAGTGAGTACTGTGAGTTCAACATCAACGCCACCCACCGTAATGTGGCTGAACTCGCTTGCCTCCTCGGCGTCTATTCCGAACGCCAAGGCAAACTCACTGTCTCCTTCAGCGCAGCCCCACTTTCTAAAGGTAAAGTACCCATTCTGGTACCCTCTAGAATGAAGCAAGAGGCTTTTGCTGATGTCGGCAACCGTTGCATGACTTATGCCGGTTGCCAGGGTCTCACTGCCCCTAAAATCCAAATTTTGATAGACAACCACACTACGTTCTGCTCTGAACAAACATTATACACTTGTCTATCACGAGCTGTGGACCAAATCCACTTTATTAATACTGGTCCCAACTCGCAGGCTTTCTGGACCAAATTGGAATCAACGCCGTACCTAAAAGCTTTCCTCGATAATTACCGTGAGGAACAAACTGAACGGCTAACATCTACCGCCCCAGAGCCTGTAATCCGTGAGCCAGCAGCCCCAAAAACGCATATCCCTGTCGAAAATACATCTGGCTTACGTATTTCTGCACTTGACCTGCCGGAAAAGCACTCTCGCGAAATTTTCAACAAGGCGCATGGCTTTTCCAATGCTATTCAGGGAGATGGCGTAGCTCCCATGTTCCAGCATCAACAGGCAAAGGACGAAACCCTTTTCAAGGCTACCATAGACGCTAGACTCTCTATAACACACCCTGATGAAAATAAAAGAGAGTTTGCCATGAAGAAAGACACTGGGGACGTCCTTTTTGTCAATTACAAAGCTATAATGAATCTACCTCATGAGCCTGTTCCTTTTGAACCTCGTCTCTGGAACATCTGCAAAGCTGAAGTGCAGAACACATACCTAGCCAAACCCATTGCAAATCTTATCAATGGTACTTTAAAGCAATCACCTGACTTTCCAGCCAATAAAATAGCCTTATTCCTGAAATCGCAATGGGTAAAGAAAATTGAGAAAATTGGAGCCATACCAGTTAAACCTGGACAGACTATTGCATCATTTATGCAAGAGACTGTTATGCTGTATGGCACCATGGCACGCTACCTCCGTAAAATGCGGCAAAGATATCAACCCGCACATATATTTTCAATTGTGAAAAGACTCCGGAGGACTTCAATAAATTCATACTTGAACACTGGTCACACAAGCAAGTTGCCCACACTAACGATTTTACTGCTTTTGACCAGTCCCAAGACGCTGCCATGCTCCAATTTGAAGTTATTAAAGCTAGGTACTTCAATATCCCCGAGGATGTTATAGAAGGATACATCCAAATTAAGCTCACTGCTGAGATCTTCCTCGGGACACTTTCCATCATGCGCCTATCTGGTGAAGGGCCAACCTTCGACGCTAATACCGAATGCTCTATTGCCTACAACGCCACCAGATACCATATTAATGAAGACGTCACCCAAGTATACGCCGGTGACGACATGGCCATGGACCATGTGTGCCCTGAGAAGAAGAGCTTCAAAGCTTTGGAAAAGAAACTGAAATTAACCTCCAAACCTCTCTATCCAAAGCAAAAACCTGGAGACTGGGCCGATTTCTGCGGCTGGACTATAACACCTTATGGCATCATTAAGAATCCTAAGAAACTTGATGCATGCCTACAATTGCACACCCAACTGGGCGATGCCGATAAAGTCGCTAGGTCATACGCACTCGATGCCAAATATGCTTATGATCTGGGCGATCGCATTCATGAAGTTCTGAATGCTGATGAAATGACCAGTCACTTCAATGCTATAAGACAGTTGCACAAACTGCATCAACAAGATGTGCTGGTCCCACCCGAGACTACCGTAGCCACAGCGGTAAAGTCTCAACCTGACGTGGAGAATCTGTGGCTCCGTGCGCTTAGCTTCCCTGACTGGACGGACCGCGCCCAACTTTTAAAACGGGGTTAATTTCTGATGGAGCTAGCGTACTTAGTTAAATTACTAGAGCACAATAAATTCGAGCGCACTAATCTGCCCCTTTCCTCACCCTTAGTTGTACACGGAATCGCTGGCAGTGGAAAATCCACCATCCTCACAACTTTCCATCACCATTACCCGGCTCACCCTATCTTCTCACACAGTCCCACATTGCTTGACCCTAGCAACCGCATATACCAACAGTGCATCACTACTGATTCGGTGCCAGACGGTGCTATCGTAGACGAGTACAATTACAAAGCGCTCGACTACTCTCGCTGTCTGGCCCTCTTCGGTGATCCACTTCAGCTTCCACATTCACTTCAACCCCACTACCACTCTAGCCGCACTCACCGCTACGGCCCCAAGCTCACTAGCCTACTCAACGACCTCTTCCACCTCTCTATCACTTCCCTTGCCCCCATCGACAGCCTTGATTACGCTGATCCTTTTGCTGTCGACCCCTCTGGATTTATCATTGCTGACGAGGAAGTGTACAACTTTGTTTCCCAGCAGGTTCCCGGCACTTTGCTGCCGCTCGATACTGTAGGTTTAGAATATTCTAGTGTTAGCTTTTACTGCAGTGATCTCCGACGCTGTGTCGTACTAAG74 GCCACTCAGCACCTTCCATCGCTCTCACCCGCGCCAAGGGCAACCTCGCCATCTTCGATTTCAATGCCAGGTTTAGTTCCACCACCTGACCACTCTAAGTCACTCTTCGTCCTTGCTATTGGTATAACTGTGGTCTCCGCACTATTTGTGCTAAAGTCCCACACTTTTCCAATTGCAGGCGACAATATTCACCGCTTCCCCTCCGGCGGCCAATATAAAGACGGTACTAAGCAGATAAACTACTGTCCACCTACTCATGCTAGGTACCCGAAATATCCTGACCACAAGTGGCTTGCCGCTACCGCCGCCATCGTCATCCCTCTCTGCCTATATATTTCCTACCATCCTGGCAATAATATTCGCCGTATTTGCCCTTGTTGCAATACATATCACCACCCCTGAACCCTTCTGTACCGTATACATAGACGGGGCGTCTATTACTATCACTAACTGCCCCGATCCTGCAGCTATATTAAATAAAGTAGCTATAGGCCCCTGGAGAGGGTTAAGTTACCACAATAATTTGAAATAATCATGGGAGAGCCCACTCCAACTCCAGCTGCCACTTACTCCGCTGCCGACCCCACTTCCGCACCCAAGTTGGCCGACCTGGCTGCCATTAAATACTCACCTGTCACCTCCTCCATCGCCACCCCCGAAGAAATCAAGGCCATAACCCAATTGTGGGTTAACAACCTTGGCCTCCCCGCTGACACCGTAGGTACCGCGGCCATCGACCTGGCCCGCGCCTACGCCGACGTCGGGGCGTCCAAGAGTGCTACCCTGCTCGGTTTCTGCCCTACGAAACCTGATGTCCGTCGCGCCGCTCTTGCCGCGCAGATCTTCGTGGCCAACGTCACCCCCCGCCAGTTTTGCGCTTACTACGCAAAAGTGGTGTGGAATCTGATGCTGGCCACTAACGATCCGCCCGCCAACTGGGCCAAGGCTGGTTTCCAGGAGGATACCCGGTTTGCCGCCTTTGACTTCTTCGATGCCGTCGATTCCACTGCCGCGCTGGAGCCTGCTGAATGGCAGCGCCGCCCTACTGACCGTGAACGTGCTGCGCACTCGATCGGGAAGTATGGCGCCCTTGCCCGTCAGCGTATCCAAAACGGCAACCTCATCACCAACATTGCCGAGGTCACTAAGGGCCATCTTGGCTCCACCAACACTCTCTATGCTCTGCCTGCACCCCCTACTGAATAACGCCAAACTTAATAAGGCGTGTGGTTTTCTAAAGTTTGTTTCCACGACTGGCATAATAAGTTTAGCCAGAT75
此文档下载收益归作者所有
